CN105219705A - 超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用。本发明研究发现,通过改变氧化铁纳米粒子表面电荷,使其带正电或0电荷有助于简化其对干细胞的标记程序,并能显著提高标记效率。PEG/PEI修饰的SPIO和PEG/PVP修饰的SPIO,孵育时间为12h,可以相对安全有效的标记大鼠脂肪干细胞ADSCs。本发明的超顺磁性氧化铁纳米粒子效果比商用的超顺磁性氧化铁纳米粒子快速有效,可作为一种优势的新型的磁性标记物用于干细胞示踪成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用。
背景技术
分子影像学为活体状态下检测干细胞迁徙、归巢、存活、增殖及定向分化等状况提供了可行的解决平台。
在各种影像手段中,MRI有着极精细的空间分辨率和极佳的组织分辨率,可高分辨地显示组织解剖结构的同时,对深部组织的分子影像学特征进行精细、准确的定位、定量分析,是最理想的分子影像学分析技术之一。目前,不少学者采用超顺磁性氧化铁(Superparamagneticironoxide,SPIO)体外标记干细胞,使用MRI能够无创、在体、动态、准确地对移植细胞进行活体示踪成像,根据靶器官MRI信号改变来判断移植细胞情况。
SPIO是由分子式为Fe2 3+O3M2+O氧化铁微晶组成,当M2+为Fe2+时,SPIO具有顺磁性。在不存在外加磁场时,SPIO内部的磁场无取向,净磁场为零;而在外加磁场存在时,磁偶极子发生取向,从而使静磁矩急剧提高,大大缩短周围质子的T1、T2/T2*弛豫时间,使SPIO所处局部在MR图像中与周边部位产生显著对比,SPIO的这种MR信号对比增强作用取决于离子的成分、粒径、离子本身的饱和磁化、在单位成像体积内离子的浓度以及采集MR数据时所用的物理参数。
常用的氧化铁纳米粒子合成方法有共沉淀法、微乳液法、超声空化法等。共沉淀法是将摩尔比2∶1的Fe3+与Fe2+盐在水溶液中同时水解沉淀,或Fe2+盐在氧化剂存在条件下部分氧化沉淀实现Fe3O4纳米粒子的合成。共沉淀法具有方法简单、成本低廉的优点。但是共沉淀方法存在粒度分布宽、易团聚的缺点,而且由于氧化铁与水之间反应较为复杂,可生成多种化合物,因此产物中常混入其它相杂质,而不能充分发挥纳米氧化铁在生物体系中的作用。经过改进的微乳液法及超声空化法制备的纳米氧化铁,普遍存在结晶度差、磁性能低,及其粒度、形貌难以控制的缺点。目前商业化的氧化铁纳米粒子Resovist(Shering)是由共沉淀方法制备的,由葡聚糖包裹,用其标记干细胞时需使用转染剂,如常用的左旋多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL)介导干细胞进行SPIO标记,以提高细胞对SPIO颗粒的摄入。
发明内容
本发明的目的在于提供超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用。
本发明所采取的技术方案是:
超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用,所述超顺磁性氧化铁纳米粒子表面的Zeta电位为正或者0。
优选的,超顺磁性氧化铁纳米粒子的表面有PEG/PEI或PEG/PVP修饰。
优选的,超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~33nm。
优选的,PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为21~33nm。
优选的,PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~28nm。
优选的,超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12μg/ml~25μg/ml,孵育时间为10h~20h。
优选的,PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12μg/ml~25μg/ml,孵育时间为10~14h。
优选的,PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为25μg/ml,孵育时间为10~14h。
本发明的有益效果是:
本发明公开了超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的新应用。研究发现,通过改变氧化铁纳米粒子表面电荷,使其带正电或0电荷有助于简化其对干细胞的标记程序,并能显著提高标记效率。
无需使用任何转染剂,PEG/PEI修饰的SPIO(12μg/ml、25μg/ml)和PEG/PVP修饰的SPIO(25μg/ml),孵育时间为12h,可以相对安全有效的标记大鼠脂肪干细胞(ADSCs)。
本发明多元醇法合成的SPIO的T2负性效应可以随着细胞内铁含量的增加而增强,呈明显的负相关,说明其可作为铁类对比剂应用于活体示踪成像。
体外条件下MRI成像(T2-mapping序列)可敏感显示SPIO标记的细胞,PEG/PEI修饰的SPIO要远远比商用的SPIO快速有效,并随着孵育浓度的增加,细胞对SPIO吸收增加,可作为一种优势的新型的磁性标记物用于干细胞示踪成像。
附图说明
图1为SPIO纳米粒子的TEM照片;
图2为SPIO纳米粒子的磁滞回线图;
图3为PEG/PEI修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图;
图4为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图;
图5为流式细胞仪对细胞表面抗原表达的检测结果图;
图6为PEG/PEI修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图;
图7为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图;
图8为透射电子显微镜TEM观察细胞超微结构;
图9为PEG/PEI修饰的SPIO标记率;
图10为PEG/PVP修饰的SPIO标记率;
图11为PEG/PEI修饰的SPIO标记持久性;
图12为PEG/PVP修饰的SPIO标记持久性;
图13为细胞内铁含量与MRI成像的相关性。
具体实施方式
英文缩略词如下:
聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)为PVP,聚醚酰亚胺(Polyetherimide)为PEI,聚乙二醇(polyethyleneglycol)为PEG。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1超顺磁性氧化铁纳米粒子的制备
多元醇法制备磁性标记物:称取15gPEG-1000和0.3g的PEI(分子量为1800)至50ml三口烧瓶中,称取20g的PEG-1000和0.3g的PVP(分子量为58000)至另一个50ml三口烧瓶中,在80℃搅拌至澄清,随后向两个烧瓶中加入0.7gFe(acac)3,保持此温度搅拌10min,在氩气保护下逐渐加热至180、200、220、240、260℃一共反应1h,然后停止加热冷却至60℃。将反应生成物与甲苯以1:3的体积比混合于烧杯中,超声分散后在烧杯底部进行磁性分离,使黑色物质沉淀。弃去上清液,将黑色物质充分清洗,用丙酮再次清洗后在60℃真空干燥,得到黑色粉末,置入透析袋中透析2~3d,每12h更换一次去离子水,直到烧杯内去离子水颜色澄清,分别制备得到PEG/PEI修饰的SPIO和PEG/PVP修饰的SPIO。
性能检测:采用透射电子显微镜观察样品的形貌、粒径以及分散状态;zeta电势分析仪测定样品在水中的zeta电势;超导量子干涉仪测定样品的磁性能。
结果分析如下:
1)TEM表征:上述合成的PEG/PEI修饰的SPIO(见图1a)以及PEG/PVP修饰的SPIO(见图1b)均能形成粒度均一、单分散性的球形粒子,基本没有出现粒子之间相互抱团的现象。取TEM照片中100个粒子,测量其平均粒径,结果与谢乐公式计算所得的平均粒径基本一致,表明合成的Fe3O4纳米粒子是单个晶体。
2)水合动力学粒径:PEG/PEI修饰的SPIO的水合动力学粒径平均值为25nm,PEG/PVP修饰的SPIO的水合动力学粒径平均值为20nm。上述两种Fe3O4纳米粒子放置90d后测得的水合动力学粒径平均值无变化,说明合成的磁性标记物在水溶液中能够长时间稳定分散。
3)去离子水中的zeta电位及稳定性:zeta电位是表明胶体分散体系稳定性的一个重要指标。合成的氧化铁纳米粒子分散在去离子水中,其中PEG/PEI修饰的SPIO的zeta电位为35mV,PEG/PVP修饰的SPIO的zeta电位为0mV;在室温放置30天以上没有沉淀产生,说明该方法制备的磁性标记物具有良好的水分散性。
4)SPIO纳米粒子的弛豫效能:磁滞回线显示剩磁和矫顽力均为零,说明制备的两种Fe3O4纳米粒子均具有超顺磁性(见图2)。
综上所述:多元醇法合成的SPIO(包括PEG/PEI修饰的SPIO以及PEG/PVP修饰的SPIO)粒径均一、结晶度好和磁性强,在溶液中表现出良好的水分散性及稳定性,能更好的进行造影成像。
实施例2超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记SD大鼠脂肪干细胞中的应用
一、SD大鼠脂肪干细胞的分离、纯化和鉴定
取4周龄以内的SD大鼠,无菌条件下取腹股沟处的脂肪组织,反复冲洗,剪碎成大约1mm3细小组织块;加入I型胶原酶进行恒温振荡消化,中止消化后进行离心,种植在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养瓶中,标记为原代细胞P0,37℃、5%CO2培养箱中静置培养;待细胞长至80%-90%融合时(约7-8d),纯化提取出的ADSCs,以1:2的比例传代至P1代,重复上述步骤,将ADSCs传代至P3~P7代备用。
二、超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记SD大鼠脂肪干细胞中的应用
(1)有效标记率测定:取6孔板,细胞铺板。设置三组细胞,分别为不加任何磁性标记物的未标记组、PEG/PEI修饰的SPIO为标记组1、PEG/PVP修饰的SPIO为标记组2。其中标记组1和标记组2,设置不同浓度(0μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)和不同时间(6h、12h、24h、48h)对细胞进行孵育,然后进行普鲁士蓝染色,初步选定细胞染色达到95%以上的标记率,并且细胞形态无明显改变的孵育浓度和时间。未标记组中不加任何磁性标记物,重复上述孵育及后续步骤。结果见表1和表2。
表1、不同浓度PEG/PEI修饰的SPIO孵育不同时间后ADSCs的形态变化和铁标记率测定
表2、不同浓度PEG/PVP修饰的SPIO孵育不同时间后ADSCs的形态变化和铁标记率测定
由表1和表2可知:标记组1中PEG/PEI修饰的SPIO安全有效的标记浓度为12μg/ml以及25μg/ml,标记时间为12h;标记组2中PEG/PVP修饰的SPIO标记浓度为25μg/ml和50μg/ml,标记时间为12h。而既往商用SPIO与转染剂结合后要达到有效标记率的孵育浓度为25-50μg/ml,孵育时间是18-24h,说明这种新型SPIO包括PEG/PEI修饰的SPIO和PEG/PVP修饰的SPIO均能更快速有效的标记干细胞。
(2)标记安全性检测:选择不影响细胞形态的前提下,达到95%以上铁染色率的孵育浓度和孵育时间进行安全性检测,包括细胞活力、细胞增殖力、细胞表面抗原表达、成神经诱导性。
①细胞活力:将未标记组和标记组的单细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以1:1比例混匀,三分钟内,用计数板计数后计算活细胞率(%),结果见表3。
表3、SPIO孵育不同时间后ADSCs的台盼蓝染色拒染率结果()
(注:标记组1是PEG/PEI修饰的SPIO标记组;标记组2是PEG/PVP标记组;*表示P<0.05)
从表3中可以得知,标记组1中PEG/PEI修饰的SPIO在12μg/ml、25μg/ml浓度中各个标记时间细胞活力无明显抑制;标记组2中PEG/PVP修饰的SPIO标记浓度在25μg/ml,标记时间为12h时无明显抑制,而在50μg/ml浓度和12~48h标记时间下细胞活力受到抑制。
②细胞增殖力:将未标记组和标记组1、2(SPIO孵育细胞的时间均为12h)的细胞继续培养,分别在1、3、5天进行MTT试验。实验时,每孔吸去20μl培养液,加入MTT20μl,同上条件继续孵育4h后弃上清,加入DMSO150μl/孔,室温下圆周震荡器震荡10min,酶标仪选用双波长(570、630nm)测量各孔的光密度(OD值),绘制出生长曲线。结果见图3和图4。
图3为PEG/PEI修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图。从图3中可以看出在12μg/ml、25μg/ml浓度和12h时间下,PEG/PEI修饰的SPIO标记细胞后继续培养,第1、3、5天后的增殖情况良好,和未标记的细胞(即0μg/ml)的细胞增殖趋势无明显差异。而在50μg/ml的孵育浓度下,细胞的增殖趋势受到一定程度的抑制,和未标记组趋势曲线具有差异。
图4为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的生长曲线图。从图4中可以看出,12μg/ml的浓度和12h时间下,PEG/PVP修饰的SPIO标记的细胞继续培养1、3、5天后的增殖趋势与未标记组无明显差异;而当标记物浓度增大到50μg/ml时,细胞增殖受到一定程度的抑制,和未标记组趋势曲线具有明显差异。
③细胞表面抗原表达:将未标记组和标记组的细胞加入荧光标记的大鼠来源CD29、CD45、CD44、CD106抗体,应用FACScan流式细胞仪进行细胞表面抗原表达的检测。结果见图5。
图5中,a未标记组,b为标记组1,c为标记组2。显示三组ADSCs表面抗原表达无差异:APC-CD29的表达为强阳性,接近100%;PE-CD44的表达为阳性,大约30%-40%;PE/Cy-CD106、FITC-CD45表达为阴性,表达小于5%。说明磁性标记物不影响细胞的生物活性,不影响其表面抗原的表达。
④成神经诱导性:将未标记组和标记组的细胞加入预诱导培养液(DMEM+20%FBS+1mMβ-巯基乙醇),预培养24h,然后更换为诱导培养液(DMEM+5mMβ-巯基乙醇)培养5h-5d,观察细胞的形态学变化,然后进行神经标志物NSE、Nestin的检测。结果见图6和图7。其中图6为PEG/PEI修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图,图7为PEG/PVP修饰的SPIO标记细胞的成神经诱导图。
图6中,镜下第一张图是直接显微镜下观察的细胞形态,可见脂肪干细胞呈梭形,标记组1(PEG/PEI修饰的SPIO)细胞诱导后细胞胞体变圆,周围数条树突样结构,细胞类似锥体神经元的形态,经免疫细胞荧光染色见NSE、Nestin表达明显。图7为镜下见标记组2(PEG/PVP修饰的SPIO)细胞诱导后细胞胞体变圆,周围数条树突样结构,细胞类似锥体神经元的形态,经免疫细胞荧光染色见NSE、Nestin表达明显。
(3)透射电子显微镜(TEM)观察细胞的超微结构
结果见图8。图8为透射电子显微镜TEM观察细胞超微结构(×20000),其中a为标记组1,b为标记组2。从图8中可见,细胞结构基本完整,胞核不规则,染色质较均匀,细胞器结构基本完整;内吸收的氧化铁纳米颗粒均位于细胞质区域内,主要位于溶酶体内,呈囊泡样聚集改变(见图8中a、b的白色箭头)。
(4)标记细胞的MRI成像、标记率、标记持久性
对上述未标记组和标记组的细胞进行体外MRI成像,体外MRI成像参数T2WI序列(TR/TE=2000ms/85ms,FOV=220×220mm,矩阵=318×448,层厚=1.5mm)T2-mapping(TR=1000ms,TE=13.8-69.0ms,FOV=85.2mm×120mm,矩阵=318×448,层厚=1.5mm)取106个ADSCs用示踪剂标记12h后为标记组(其中标记组1为PEG/PEI修饰的SPIO,标记组2为PEG/PVP修饰的SPIO),对照组为未标记的106个ADSCs,胰酶消化为单细胞悬液至0.8mlEP管中,离心,弃上清,加入5%明胶200μl重悬细胞沉淀,然后进行T2WI信号和T2值的测量,以上操作均重复18次;
将标记组的ADSCs单细胞悬液按106个/管、5×105个/管、105个/管、104个/管、103个/管至0.8mlEP管中,用5%明胶水溶液重悬沉淀,对照组EP管内分别为106个未标记细胞组和明胶水溶液组;进行T2WI、T2-mapping成像,确定MRI检查能显示的最低标记细胞数量。结果见图9~10。
取标记后的106个ADSCs,用PBS液洗涤3次,加入新鲜培养基继续培养、正常传代,每传1代分别再取106个ADSCs进行MRI成像,了解标记细胞的持久性,结果见图11~12;并设立相同的实验组进行ICP-MS检测,对细胞内的铁含量与相应的MRI信号进行相关性分析,结果见表4~5。
图9为PEG/PEI修饰的SPIO标记率:信号随细胞数的增多而减低明显,T2弛豫时间逐渐缩短,可显示的标记细胞的最低数量为103个(粗白箭头指示,其下方为未标记组,左下方为空白对照组,顺时针方向各管细胞数量逐渐增加)。
图10为PEG/PVP修饰的SPIO标记率:信号随细胞数的增多而减低明显,T2弛豫时间逐渐缩短,可显示的标记细胞的最低数量为103个(粗白箭头指示,其上方的分别为未标记组和空白对照组,逆时针方向各管细胞数量逐渐增加)。
图11为PEG/PEI修饰的SPIO(25μg/ml)标记持久性:标记细胞后进行传代,随着细胞生长增殖的时间的延长,同等数量细胞在T2中的信号逐渐增高,弛豫时间亦逐渐增加,在P7代(20d)时,标记组与未标记组相比较,T2信号和弛豫时间无明显差异。
图12为PEG/PVP修饰的SPIO(25μg/ml)标记持久性:标记细胞后进行传代,随着细胞生长增殖的时间的延长,同等数量细胞在T2中的信号逐渐增高,弛豫时间亦逐渐增加,在P6代(15d)时,标记组与未标记组相比较,T2信号和弛豫时间无明显差异。
体外MRI成像显示本研究的氧化铁纳米材料标记后具有明显的T2弛豫效果,还具有良好的标记持久性。
体外MRI成像结果见表4。
表4体外MRI成像结果
不同标记浓度 | T2信号强度 | p | T2弛豫时间 | p |
标记组 | 1872.50±10.72 | 327.17±2.50 | ||
12μg/ml标记组1 | 930.51±4.33 | 0.000 | 111.87±0.50 | 0.000 |
25μg/ml标记组1 | 646.91±4.54 | 0.000 | 54.33±0.14 | 0.000 |
25μg/ml标记组2 | 1447.39±4.13 | 0.000 | 285.15±1.50 | 0.000 |
由表4可知:本发明多元醇法合成的SPIO标记后,细胞在T2WI扫描中的信号强度比未标记细胞组的明显减低,T2弛豫时间明显缩短,标记组与未标记组相比较有明显统计学差异。
ICP-MS检测结果见表5。
表5本发明多元醇法合成的SPIO和既往商用的SPIO的对比
磁性标记物 | 表面涂层 | 动力学粒径(nm) | Zeta电位(mv) | 铁含量(pg/cell) |
Feridex | 葡聚糖 | 50~180 | -32.29±0.60 | 0.6~1.5 |
Feridex-PLL | 葡聚糖 | 24.00±1.68 | 10 | |
Resovist | 羧基葡聚糖 | 17~65 | -10±3.65 | 0.92~4 |
Resovist-PLL | 羧基葡聚糖 | 13±3.71 | 5~17.9 | |
标记组1(25μg/ml) | PEG、PEI | 21~33 | 25~43 | 35.4 |
标记组1(12μg/ml) | PEG、PEI | 21~33 | 25~43 | 20.16 |
标记组2(25μg/ml) | PEG、PVP | 17~28 | 0 | 6.96 |
由表5可知:标记组1中PEG/PEI修饰的SPIO在25μg/ml中孵育12h后,测定细胞内的铁含量达到35.4pg/cell,即使在12μg/ml中孵育12h,细胞内的铁含量也可达到20.16pg/cell;而既往商用SPIO即使与转染剂结合后,细胞内的铁含量最高也仅达到17.9pg/cell;说明PEG/PEI修饰的SPIO比商用的SPIO能更加有效的标记细胞。然而,PEG/PVP修饰的SPIO细胞内铁含量仅达到6.96pg/cell,标记效果与既往商用的SPIO持平。
此外,在使用商用SPIO(Resovist)标记脂肪干细胞时发现使用PLL的标记效率明显高于不使用PLL;分析发现,Resovist表面带负电荷,与干细胞表面的负电荷相排斥,需要加入诱导剂对颗粒外层进行修饰,使其既能与细胞膜表面结合,又能够诱导细胞内吞颗粒进入细胞质。而本发明的SPIO无需任何诱导剂,无需使用任何转染剂,可以相对安全有效的标记大鼠脂肪干细胞,而且效果更优。因此,改变氧化铁纳米粒子表面电荷,使其带正电或0电荷有助于简化其对干细胞的标记程序与提高标记效率。
(5)铁含量与MRI成像的相关性分析
实验结果见表6和图13。
表6铁含量与MRI成像的相关性
由表6和图13可知,随着细胞内铁含量的增加,细胞T2弛豫时间逐渐减小,两者之间呈明显的负相关。
结论:
综上所述,有效标记浓度和时间下,本发明多元醇法合成的SPIO标记后对细胞的活力、增殖力、细胞抗原表达和成神经诱导性无明显抑制,并可在体外MRI成像中敏感显示;其中PEG/PEI修饰的SPIO要远远比商用的SPIO快速有效,T2负性效应并随着铁含量增加而增强,可作为一种优势的新型的磁性标记物用于干细胞标记;而PEG/PVP修饰的SPIO与商用的SPIO的效果持平。
Claims (8)
1.超顺磁性氧化铁纳米粒子在标记干细胞中的应用,其特征在于:超顺磁性氧化铁纳米粒子表面的Zeta电位为正或者0。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:超顺磁性氧化铁纳米粒子的表面有PEG/PEI或PEG/PVP修饰。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~33nm。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为21~33nm。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子的动力学粒径为17~28nm。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12μg/ml~25μg/ml,孵育时间为10h~20h。
7.根据权利要求2或4所述的应用,其特征在于:PEG/PEI修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为12μg/ml~25μg/ml,孵育时间为10~14h。
8.根据权利要求2或5所述的应用,其特征在于:PEG/PVP修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记干细胞时的浓度为25μg/ml,孵育时间为10~14h。
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