CN101002679A - 骨髓间充质干细胞的示踪方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的示踪方法，该方法包括如下过程为，通过转染剂对超顺磁性氧化铁进行修饰，使其带正电荷；利用经过修饰后的超顺磁性氧化铁标记经过体外扩增培养的骨髓间充质干细胞，将标记好的骨髓间充质干细胞接种到支架上，将磁标记骨髓间充质干细胞－支架复合体移植到动物体内，利用核磁共振成像仪示踪监测经磁标记的骨髓间充质干细胞在体内的存活、分布及迁徙情况。本发明为示踪植入活体及人体内的组织工程种子细胞提供了一种无创动态、直观简便的方法，对更深入地探讨和阐明种子细胞修复缺损的整个演变过程与修复机制，以及组织工程骨髓间充质干细胞在修复缺损中的广泛应用，奠定了技术基础和理论依据。

Description

骨髓间充质干细胞的示踪方法

技术领域

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞的示踪方法，用于对于外源性骨髓间充质干细胞在体内的存活、分布及迁徙等情况进行研究。

背景技术

近年来骨髓间充质干细胞(bone-marrow-derived mesenchymalstem cells，MSCs)因其体外经诱导能表达成骨细胞表型和成软骨细胞表型，且具有良好的体外扩增能力已成为目前骨/软骨组织工程最佳的种子细胞之一，在动物运用MSCs移植治疗骨/软骨缺损疾病中取得了重要进展，对骨/软骨缺损的改善有明确的疗效。然而，由于目前对在体在位移植细胞的研究缺乏有效的识别和追踪监测手段，目前对于外源性MSCs在骨软骨缺损修复中的作用和转归、对体内新形成的组织工程骨/软骨中的细胞来源存在争议。

现有常用鉴定细胞的方法均需要在移植后的一定时间内处死实验动物，在离体的情况下对骨软骨组织进行免疫组化切片来分析鉴定移植细胞的情况，这些侵袭性的方法不能动态、准确地观察同一移植细胞在活体宿主体内的迁徙、分布、增殖等生命过程，而且也不适于人体回植研究。因此需要探索一种有效的非侵袭方法对活体及人体在体在位的移植细胞进行追踪和监测，明确移植细胞所起的功能作用。磁性纳米材料超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)颗粒核心Fe₃O₄晶体粒径小，穿透能力强，MR磁场中具有强大的磁效应。很低浓度(nmol级)即能显著地造成局部磁场的不均匀，使邻近氢质子在弛豫中很快产生相散，加速了质子去相位过程，缩短了组织T2值，从而达到组织信号降低(负性强化)的T2负性对比效应效果，当外磁场撤消后磁性也迅速消失。SPIO具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合或用于其他代谢过程

发明内容

本发明的目的就在于，提供一种骨髓间充质干细胞的示踪方法，以对MSCs在体内的情况进行动态观察。

本发明采用如下技术方案：一种骨髓间充质干细胞的示踪方法，该方法包括如下过程为，通过转染剂对SPIO进行修饰，使其带正电荷；利用经过修饰后的SPIO标记经过体外扩增培养的MSCs，将标记好的MSCs种到支架上，将磁标记MSCs-支架复合体移植到动物体内，利用核磁共振成像仪示踪监测经磁标记的MSCs在体内的存活、分布及迁徙情况。

所述的用转染剂对SPIO进行修饰的过程，可以用无血清DMEM/F12稀释，同样将转染剂也用无血清DMEM/F12稀释，然后再将稀释后的SPIO与转染剂混合。

利用修饰后的SPIO标记MSCs的过程为：待MSCs长至培养瓶底85％左右的面积时，弃去原含血清的培养液，用PBS冲洗2遍，取修饰好的标记液予以等量换液，然后在培养箱孵育。

本发明将用转染剂修饰的SPIO对MSCs进行标记，用核磁共振成像仪进行成像示踪，因此可以对MSCs在动物体内的存活、分布及迁徙等情况进行准确示踪监测，而无需处死活体然后离体进行观察，有利于对组织工程骨或组织工程软骨的种子细胞进行有效研究和跟踪。对更深入地探讨和阐明MSCs修复关节软骨缺损的整个演变过程与修复机制，以及组织工程MSCs在修复关节软骨缺损中的广泛应用，奠定了技术基础和理论依据。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的MSCs的示踪方法作进一步说明。

实施例1  利用SPIO标记MSCs，用0.2T MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记MSCs分布和迁移

1.1材料和设备

超顺磁性氧化铁(SPIO)：由西南大学化工学院纳米材料实验室提供，核心直径(80±5)nm，浓度为17.4mg/ml；

硫酸鱼精蛋白(Pro)：Sigma公司产品，用蒸馏水稀释为10mg/ml母液，-20℃贮存；

实验动物：选择14只体重2～2.5kg的2～3个月龄雄性日本大耳白兔适应性喂养1周，随机分为3组，双下肢均纳入实验：

A组(实验组)：自体皮下移植SPIO/BrdU双标MSCs(n＝6)

B组(阴性对照组)：自体皮下移植BrdU标记MSCs(n＝6)

C组(对照组)：自体皮下移植单纯SPIO组(n＝2)

1.2试验方法

1.2.1磁标记液制备

将SPIO用无血清DMEM/F12稀释到50μg/ml；将Pro用无血清DMEM/F12稀释到6μg/ml，然后将等量稀释后的SIPO和Pro混合。

1.2.2.用SPIO标记MSCs

将经过体外扩增培养的MSCs在锥形瓶瓶底培养至85％面积时，弃去原含血清的培养液，PBS冲洗2遍，取磁标记液予以等量换液，37℃、5％CO2、100％饱和湿度培养箱孵育过夜12h。

1.2.3BrdU标记MSCs

标记方法：磁标记细胞孵育12h后弃去SPIO标记液，PBS洗2次，再用含肝素钠10U/ml的PBS液冲洗1次(清除胞外游离的SPIO粒子)，更换等量含BrdU终浓度为30μmol/L的无血清培养液培养2h。

1.2.4.SPIO/BrdU双标MSCs鉴定：

取部分SPIO/BrdU双重标记MSCs爬片行普鲁士染色和免疫组化BrdU FITC荧光素显色，胎盼蓝染色检测双标细胞活性。利用双标方式，其目的在于用BrdU标记来验证超顺磁性氧化铁标记的准确性。

1.2.5.体外磁标记细胞0.2T MR成像

方法：

为检测0.2T常导Artoscan C四肢关节专用扫描系统对磁标记细胞的敏感度，选择1×10⁶(标记细胞)、5×10⁵(标记细胞)、1×10⁶(未标记细胞)、琼脂组、培养液、蒸馏水组进行体外细胞MR成像。

GRET2*WI成像参数：

TR/TE＝420ms/10ms，slice thickness＝4.0mm，gap＝0.4mm，flipangle＝40°，matrix size＝286×192，FOV＝180×180

1.2.6.细胞-支架复合物自体皮下移植

方法：

MSCs经胰酶消化后获得细胞为1×10⁸个，加入壳聚糖和甘油磷酸钠4∶1复合物1ml在冰浴中重悬，14只日本大耳白兔经30g/L戊巴比妥麻醉后，左下肢剃毛，常规消毒后选取左大腿下段内侧髌上3cm皮下为注射部位(为避免MRI检查时动物呼吸引起噪音干扰MRI)A、B组注入1ml含1×108个细胞的壳聚糖-甘油磷酸钠复合物，等待约10分钟让其在37℃体温下自然凝固后，即刻进行MR皮下成像，C组注入5μl铁浓度为25μg/ml的SPIO溶液，术后分笼常规饲养和观察。

1.2.7.0.2T MRI活体成像

细胞移植后第1、3、5天及2、4、8周连续不同时相点分别进行兔膝MRI。0.2T常导Artoscan C四肢关节专用MR机，膝关节表面线圈。

兔仰卧位，分别固定双前肢和双后肢，将皮下移植部位置于线圈中心部位，选择GRET2*WI序列获取横断面和矢状面图像，成像参数：TR/TE＝500ms/18ms，slice thickness＝4.0mm，gap＝0.4mm，flipangle＝40℃，matrix size＝286×192，FOV＝180×180

1.2.8.组织学检查

细胞移植后第5天及第2、4、8周处死动物取材，用4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋切片，同一组织连续切片交叉行HE染色、普鲁士染色及BrdU兔疫组织化学FITC荧光素显色。

1.3.结果

SPIO/BrdU双标MSCs鉴定：显微镜下计数普鲁士染色阳性细胞，MSCs的磁化标记有效率为90.7±16％；BrdU免疫组化FITC荧光素显色呈绿色、清晰的梭状，胞核显色明显；胎盼蓝染色表明经磁标记和BrdU标记后的MSCs活性仍在90％以上。

1.4.体外磁标记细胞0.2T MR成像

结果显示1×10⁶、5×10⁵个标记细胞均在GRET2*WI序列MRI显示出特异性低信号影，其中1×10⁶个标记细胞比5×10⁵个标记细胞的信号强度强。

1.5.细胞-支架复合物自体皮下移植术后结果

全部动物的移植部位均未出现切口红肿和分泌物，无异常死亡。

1.6.0.2T MR活体成像检查结果

磁标记后自体皮下移植的兔MSCs在0.2T MR的GRET2*WI序列成像产生特征性的低信号改变至少8周，并观察到从移植部位发出低信号线进入宿主组织：

术后当天A组、C组MRI均观察到皮下注入部位形成特异性类圆形低信号区域，直径约1.5cm，边界清楚。B组在GRET2*WI序列未见低信号；

术后5天A组横断面MRI显示皮下距注射部位后侧0.5cm处出现孤立的特异性低信号影。C组皮下移植部位低信号区域消失，B组未见低信号。术后5天后B组和C组均未见低信号区域；

术后2周A组横断面MRI显示原孤立的特异性低信号影已与皮下注射部位形成的低信号区域融合，并呈线性延伸为0.6cm，矢状面显示皮下低信号区域直径扩大为2.0cm，侵及肌肉层；

术后8周A组横断面MRI显示皮下注射部位向周围发出的低信号线长达1.1cm，矢状面显示低信号区域直径扩大为2.6cm，低信号强度减弱；

术后2周至4周见植入物与宿主组织界面周围出现的普鲁士染色阳性细胞较前有所增加，但普鲁士染色阳性细胞主要聚集在植入物内；

术后8周植入物内普鲁士染色阳性细胞数局部较前减少，宿主组织皮下肌间隙内出现的普鲁士染色阳性细胞较前也明显增加，BrdU免疫组化提示类似结果。HE染色显示淋巴细胞散在浸润，绝大部分支架降解吸收；

B组BrdU免疫组化显示移植MSCs，但未见普鲁士染色阳性细胞。C组组织切片未见普鲁士染色阳性细胞或BrdU阳性细胞。

1.7.结论

MR检测磁标记细胞敏感性与磁场场强、线圈规格、成像参数和SPIO标记浓度、粒径等条件密切相关，25μg/ml浓度SPIO标记细胞时0.2TMR能检测到至少5×10⁵个细胞。

SPIO标记MSCs行皮下自体移植是研究活体MRI示踪移植细胞可行性的第一步。实验表明0.2T MR成功示踪活体内移植细胞成像至少可达8周，并观察到移植细胞从植入部位向宿主组织迁徙最远达到1.1cm。

移植术后第5天MR显示距注射部位后侧0.5cm处皮下出现孤立的特异性低信号影，我们认为这是移植细胞主动迁移所致。

注射移植时压力过大致细胞扩散出现的低信号影应与注射部位相连。

组织内积血或包含铁粒子的蛋白(血红蛋白、铁蛋白及含铁血黄素等)释放铁离子尚不足以引起MRI信号强度特异性改变。

结果表明，利用0.2T MR活体示踪自体皮下移植的磁标记MSCs分布和迁移是可行的

实施例2 MRI示踪磁标记MSCs修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

实验目的：

探讨用1.5T MRI活体示踪磁标记MSCs在软骨缺损模型兔关节腔内分布和迁移的可行性，并评估软骨修复效果

2.1.材料与方法

所用材料同实施例1

实验动物及分组：选择24只体重2～2.5kg的2～3个月龄雄性日本大耳白兔适应性喂养1周，随机分为3组，双下肢均纳入实验：

A组(实验组)：移植SPIO标记MSCs+支架复合物组(n＝6)

B组(阴性对照组)：自移植未标记MSCs+支架复合物组(n＝6)

C组(空白对照组)：损伤侧膝关节不做任何处理(n＝3)

2.2.实验方法

2.2.1.MSCs的培养和鉴定，按现有技术进行

2.2.2.SPIO磁标记MSCs  按实施例1的方法进行

2.2.3.BrdU标记MSCs  按实施例1中的方法进行

2.2.4.SPIO/BrdU双标MSCs鉴定  按实施例1中的方法进行

2.2.5.膝关节软骨损伤模型制作

兔双后肢备皮，消毒铺巾，采用髌内侧切口纵形切开兔双侧膝关节腔，暴露股骨滑车面，分别用直径4mm的转头制作一个圆柱形软骨缺损区，深达软骨下骨，平均深3mm，缝合密闭关节腔。其中6只兔右侧为实验组，左侧为对照组.另外3只双后肢均为对照组。

2.2.6.细胞-支架复合物关节腔内移植

关节软骨损伤模型制作成功术后1周(手术切口愈合，关节囊闭合，软组织消肿后)后注射细胞-支架复合物到软骨损伤关节腔中.

A组：注入1ml含5×10⁷个磁标记MSCs与C-GP支架混悬液

B组：注入1ml含5×10⁷个未标记MSCs与C-GP支架混悬液

C组：损伤侧膝关节不做任何处理

术后分笼常规饲养和观察

2.2.7.1.5T MR活体成像检查

细胞移植后第1、4、8、12周连续不同时相点分别进行兔膝MRI检查。常规临床型Simen 1.5T MR机，用膝关节表面线圈。

兔麻醉后仰卧位，分别固定四肢，将膝关节部分置于线圈中心部位。每个关节均选择GRET2*WI序列和Flash 3D SPGR序列获取横断面和矢状面的图像。

GRET2*WI成像参数：

TR/TE＝600ms/18ms，slice thickness＝4.0mm，gap＝1.0mm，flip angle＝40℃，matrix size＝256×230，FOV＝160×160

2.3.组织学检查

细胞移植后4、8、12周处死动物取材。标本依次进行大体观察、多聚甲醛固定、EDTA液脱钙、石蜡包埋，同一组织连续切片行HE染色、普鲁士染色、兔疫组织化学BrdU检查、番红O染色、兔疫组织化学II型胶原染色。

2.4.结果

2.4.1.细胞-支架复合物自体皮下移植术后结果

全部实验动物膝关节均未出现切口红肿和分泌物，无异常死亡。实验动物膝关节内无粘连、无游离体，无明显滑膜充血增生。术后12周标本大体观察见修复组织有别于周围软骨，表面尚平整。

2.4.2.  1.5T MR活体膝关节成像结果

膝GRET2*WI序列MRI：

移植后当天A组可见关节腔内出现弥漫性颗粒状异常低信号影，主要集中在髌上囊和月国窝部位，B、C对照组关节腔内轻度积液，未见异常低信号存在；

移植后1月A组观察到软骨缺损部位、周围软骨、软骨下骨处甚至骨髓腔出现明显信号减低改变，，信号改变区域范围大，但随着移植时间延长，信号减低程度逐渐减轻。而髌上囊和月国窝部位弥漫性散点状异常低信号影信号强度未见减弱；

至移植后3月软骨缺损处、周围软骨及软骨下骨处信号改变程度明显减弱，信号改变范围亦明显缩小，而关节腔内结节状低信号改变仍清晰存在。

2.5.讨论

术后1月后移植细胞在软骨的修复中逐渐消失可能与细胞主动迁移到滑液、软骨下骨及缺损邻近部位有关，但目前对活体内具体诱导细胞迁徙的内环境尚没有明确的研究结果；

MSCs虽然具有较强的迁移能力，但并没有参与软骨修复。移植细胞未参与软骨修复是否与磁标记本身影响MSCs成软骨分化、单纯提高外源性MSCs数量治疗方式或使用了不同的支架材料有关；

MRI示踪活体关节腔内移植的磁标记MSCs至少可达3月，术后3月观察到低信号强度明显较前减弱，组织切片提示移植细胞数量减少，推测可能为移植细胞分裂增殖、主动迁移、Fe粒子代谢及细胞被免疫排斥所致；

移植术后3月所有动物的手术关节均未出现切口红肿和分泌物，这说明移植的磁标记细胞在关节腔内未诱发明显的免疫反应。

结果表明，利用1.5T MRI动态示踪磁标记干细胞在活体关节腔内的分布和迁移是可行有效的。

本发明SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功地磁标记MSCs，磁标记对MSCs体外存活、增殖及潜在多向分化能力无影响，磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变。利用1.5TMRI活体示踪移植磁标记MSCs在兔膝关节软骨缺损模型关节内的迁移和分布可行，该技术能明确区分宿主细胞和移植细胞，可望为组织工程细胞在组织修复的功能作用的评估及其作为干细胞移植的可行性和有效性的判断提供一种直观有效的方法，提示在临床上具有潜在性应用前景，更深入地探讨和阐明MSCs修复关节软骨缺损的整个演变过程与修复机制。

本发明通过MRI成功地示踪了磁标记MSCs在活体内的存活、分布、迁徙、增殖等情况，建立了一种适用于活体及人体，可无创动态地示踪植入体内移植细胞的技术平台。为示踪植入活体及人体内的组织工程种子细胞提供了一种无创动态、直观简便的方法，对更深入地探讨和阐明MSCs修复关节软骨缺损的整个演变过程与修复机制，以及组织工程MSCs在修复关节软骨缺损中的广泛应用，奠定了技术基础和理论依据。

实施例3

实验方法

3.1.磁标记液(Fe-Pro)制备：

将SPIO用无血清DMEM/F12稀释到100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml；将Pro用无血清DMEM/F12稀释到6μg/ml，然后将等量稀释后的SIPO和Pro混合，可以得到标记液终浓度为Pro 3μg/ml，SIPO分别为50μg/ml、25μg/ml和12.5μg/ml三种标记液.

3.2.磁标记MSCs：

第三代MSCs长至培养瓶底85％面积时，弃去原含血清的培养液，PBS冲洗2遍，取Fe-Pro标记液予以等量换液，37℃、5％CO2、100％饱和湿度培养箱孵育过夜12h。

3.3.磁标记MSCs的鉴定

1.磁标记细胞Prussian blue染色：胞质内有阳性蓝染颗粒为普鲁士蓝染色阳性，显微镜下计数阳性细胞，测定MSCs的磁标记率

取部分磁标记细胞爬片贴壁1天，PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定，2％K₃Fe(CN)₆+6％HCl的Perl反应液孵育30min，核固红复染。

2.透射电镜检查：观察铁颗粒是否被吞噬进细胞胞质内

同时取约10⁶个磁标记MSCs经2.5％戊二醛溶液固定30min及系列处理后，常规超薄切片后透射电镜细胞超微形态。

3.4.磁标记对MSCs存活、增殖的影响

3.4.1.台盼蓝染色：计数蓝染死细胞比较各组细胞活性

3.4.2.绘制MSCs生长曲线：

取磁标记MSCs(SPIO终浓度为50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml)为试验组，同期培养未标记的MSCs为对照组。

分别调整细胞密度为5×10³/孔，接种9块96孔培养板，3组/板，6孔/组，150μl孔，每3天换液；每24h取出1板，每孔加入MTT 0.2mg/ml培养液150μl，37℃孵育4h，吸尽孔内液体，每孔加入150μlDMSO，震荡10min，选择490nm波长在自动酶联免疫检测仪测定吸光度(OD)值。

3.5.磁标记对MSCs多向分化能力的影响

磁标记MSCs分为3组，以约5×10⁵/ml接种到6孔培养板中贴壁，待MSCs长至培养孔底85％面积时分别进行成脂肪、成骨、成软骨定向分化诱导培养3周，同期培养的未标记MSCs作为对照组。

3.5.1.成脂肪诱导分化：

成脂诱导3w，倒置显微镜观察细胞形态和脂滴形成，3w后油红染色鉴定脂滴。

3.5.2.成骨诱导分化：

成骨分化诱导3w，倒置显微镜观察细胞形态，3w后进行钙结节茜素红染色。

3.5.3.成软骨诱导分化：

成软骨诱导3w，倒置显微镜观察细胞形态，3w后行Safranin-O染色观察胞外基质蛋白多糖(GAG)分泌和表达，免疫组化染色检测II型胶原的分泌和表达。

3.5.4.分化诱导培养液配制

成脂肪分化诱导培养液：

DMEM/F12+10％FBS+1，3-异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)(0.5mmol/L)+地塞米松(10^-6mol/L)+胰岛素(10μg/ml)+吲哚美辛(0.2mmol/L)

成骨分化诱导培养液：

DMEM/F12+10％FBS+地塞米松(10-7mol/L)+β-甘油磷酸钠(10mmol/L)+维生素C(50μmol/L)

成软骨分化诱导培养液：

DMEM/F12+10％FBS+TGF-β1(10ng/ml)+维生素C(0.1mmol/L)+胰岛素(6.25ug/ml)+地塞米松(1×10-7mol/L)

3.6.体外磁标记细胞MR影像

3.6.1.成像方法：

细胞离心后重悬于装有60℃1％琼脂0.5ml的EP管内，自然冷却固化后置于1.5TMR成像。成像序列：

GRET2*WI：TR/TE＝50/10，slice thhickness＝4mm，flip angle＝20℃，matrix size＝384×384，field of View＝260×260 SET2WI：TR/TE＝4500/95，matrix size＝256×128，slice thickness＝2mm，field of view＝350×350

3.6.2.计算信号强度衰减率(percentage of SI loss，ΔSI)：

利用1.5TMR自动测量系统测量每种扫描序列图像上标记细胞信号强度(SIl_abeled)和未标记细信号强度(SI_unlabelled)，计算每种序列信号强度衰减率：

ΔSI＝(SI_labeled-SI_unlabeled)/SI_unlabeled×100％

3.7.统计学处理

分析数据均以

表示，0D值应用SPSS13.0软件验证数据符合正态分布后，采用独立样本t检验。

标记细胞组与未标记细胞组间信号强度、不同浓度标记细胞间信号强度、序列间信号强度的比较采用单因素方差分析及两两均数比较(F检验)

P＜0.05为差异显著

3.8.结果

标记细胞行普鲁士蓝染色观察到基本上每个MSCs胞浆内可见阳性蓝色致密颗粒分布。显微镜下计数阳性细胞，MSCs的磁标记有效率为90.7±16％；而未标记MSCs普鲁士蓝染色阴性，未观察到蓝染颗粒。

电镜显示标记MSCs细胞膜下胞质中有高密度的铁粒子密集，胞质中存在的小囊泡状结构内摄入高密度的铁粒子。

3.9.磁标记对MSCs存活、增殖的影响

3.9.1.台盼蓝染色：

50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml不同浓度铁体外磁标记细胞的活性仍较高90±16％，标记组与未标记组细胞数量没有明显变化。

3.9.2.磁标记对生长曲线的影响

根据公式TD＝t×log2×(logN1-logN2)^-1，计算倍增时间

             未标记MSCs       (32.40±0.7)h，

12.5μg/ml磁标记MSCs          (29.05±1.5)h，

25μg/ml磁标记MSCs            (33.01±1.2)h，

50μg/ml磁标记MSCs            (39.05±0.5)h，

采用独立样本t检验，4组数据间无统计学差异(P＞0.05)

3.10.体外磁标记细胞MR成像结果

GRET2*WI的ΔSI显著性高于SET2WI序列(F＝349.45，P＜0.001)。1×10⁶(标记细胞)ΔSI均高于5×10⁵(标记细胞)ΔSI，但不具有统计学差异(P＞0.05)

应用25ug/ml浓度的SPIO联合Pro转染剂标记MSCs，磁标记有效率近100％，且Pro对细胞的生物特性影响更小。当SPIO终浓度在50μg/ml以下时，磁标记本身并不影响干细胞的存活、增殖及潜在多向分化能力，磁标记细胞是安全和有效的。标记细胞组在1.5T MR的GRET2*WI序列低信号改变最为明显，其中高数量标记细胞均比低数量标记细胞的信号强度大，提示SI与标记细胞数量有关，通过MR示踪标记细胞观察SI变化可大致判断移植细胞数量。

结论为：SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs，磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响，磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变，临床1.5TMR成像示踪标记细胞可行，以GRET2*WI序列成像最为敏感。

Claims (5)

1、一种骨髓间充质干细胞的示踪方法，该方法包括如下过程为，通过转染剂对超顺磁性氧化铁进行修饰，使其带正电荷；利用经过修饰后的超顺磁性氧化铁标记经过体外扩增和成骨诱导的骨髓间充质干细胞，将标记好的骨髓间充质干细胞接种到支架上，将磁标记骨髓间充质干细胞-支架复合体移植到动物体内，利用核磁共振成像仪示踪监测经磁标记的骨髓间充质干细胞在体内的存活、分布及迁徙情况。

2、如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞的示踪方法，其特征在于：所述的用转染剂对超顺磁性氧化铁进行修饰的过程，可以用无血清DMEM/F12稀释，同样将转染剂也用无血清DMEM/F12稀释，然后再将稀释后的超顺磁性氧化铁与转染剂混合。

3、如权利要求2所述的骨髓间充质干细胞的示踪方法，其特征在于：所述的转染剂为硫酸鱼精蛋白，或多聚赖氨酸。

4、如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞的示踪方法，其特征在于：用硫酸鱼精蛋白转染后的超顺磁性氧化铁液的以氧化铁计其浓度为25μg/ml。

5、如权利要求3所述的骨髓间充质干细胞的示踪方法，其特征在于：所述的利用经过修饰后的超顺磁性氧化铁标记经过体外扩增和成骨诱导的骨髓间充质干细胞的过程为，待骨髓间充质干细胞长至培养瓶底85％左右的面积时，弃去原含血清的培养液，用PBS冲洗2遍，取修饰好的标记液予以等量换液，然后在培养箱孵育。