JP6325443B2 - 磁化された幹細胞の凝集および分化方法 - Google Patents

磁化された幹細胞の凝集および分化方法

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Description

発明の分野
本発明は、細胞療法、再生医学および組織工学の分野に関する。それは、より具体的には、特に代替組織(tissue substitute)の形成に関して、細胞の組織化および有利には細胞の分化を促進する、細胞、典型的には幹細胞の最適な凝集を可能にする方法に関する。この方法は、前処理された幹細胞を磁場に曝露することを含み、分化した細胞を含む細胞凝集体、特に大きな細胞凝集体を得ることを可能にする。驚くべきことに、また現在の実務に反して、この凝集方法は、外因性の３次元細胞接着支持マトリックス(support matrix)および/または増殖因子の非存在下において有利に実行し得る。本発明はまた、かかる方法を用いて得ることができる細胞凝集体、およびインビトロ、エキソビボまたはインビボで対象とする組織構造を得ることを目的とした組織イニシエーター(tissue initiator)としてのその使用に関する。さらに、本発明は、得られる組織構造、および研究または治療における代替組織としてのその使用に関する。本願はまた、インビボで対象とする組織の発生(development)をモニターすることを有利に可能にする方法を提供する。
背景技術
組織工学において一般的に用いられる細胞凝集方法は、該細胞を遠心することにその本質がある。しかし、かかる方法は、限られた数の細胞(多くておよそ 250,000 個の細胞)を含む小さな凝集体(およそ 1 mm3)の取得を可能にするだけである。遠心する細胞の数を増大させたとしても、凝集体の中心に存在する細胞が(おそらくは栄養および酸素に対する制限されたアクセスが原因で)壊死するため、より体積の大きな凝集体を得ることは現時点では不可能である。
得られる凝集体の限定されたサイズは、通常の臨床的代替組織移植に関する問題を伴わない訳ではない。かかる制約は実際に、損傷(lesion)(関節軟骨の損傷の場合には通常 16 cm2 に達し得る変動する領域)を埋めるため、小さな細胞凝集体をエキソビボの培養に供すること又は非常に多数の細胞凝集体の移植により、移植の前に臨界的サイズを有する組織イニシエーターを再構築することを強いるものである。かかる移植は、外科医による処置(manipulation)をより困難なものにすることに加え、少数の移植細胞しか実際には組織再生に寄与しないという、移植部位における前記イニシエーターの保持(retention)に関する問題の原因となることが多い。この点において、移植部位において損傷を埋め、細胞凝集体の保持を促進するための支持マトリックスの使用が必須となることが非常に多い。
細胞凝集体の移植は、特に、病的な軟骨の状態を処置するために用いられる治療戦略である。軟骨は、衝撃抵抗性において重要な役割を果たすが、損傷(外傷性の衝撃、関節症など)の後に自発的に再生する能力は非常に限られている。軟骨は、機械的強度を与える細胞外マトリックス、およびかかるマトリックスの合成を担う軟骨細胞からなる。
病的な軟骨の状態、特に病的な関節軟骨の状態は、現時点では、純粋に外科的手法(マイクロフラクチャー(microfracture))によって、または軟骨細胞移植[骨軟骨移植(OATSまたはモザイクプラスティ)、自家軟骨細胞植込み/移植 ACI/ACT]を含む手法によって処置されている。
マイクロフラクチャーは、治癒応答を刺激する血液の流入を生じさせることを可能にする。しかし、得られる結果は入り混じっており、新たに形成される線維性の軟骨はその後分解する(多くの場合、６〜１２ヶ月以内に)。それにも関わらず、この方法は実施が容易であるため、多くの整形外科医によって用いられている。該方法は若い患者(特に運動競技者)に適用されるが、軟骨再生能力が低下している関節症の患者には適さない。
骨軟骨の移植は、軟骨およびその下にある骨の同種移植または自家移植からなる(骨移植片は別の骨片にごく自然に付着するが、脱離の危険性が小さくない軟骨については縫合する必要がある)。後者の場合、負荷の高い領域へ再移植するために、負荷の低い領域から軟骨を摘出する。遭遇する主な問題は、ドナー部位における病的状態(morbidity)(健康な軟骨の破壊)と、移植部位の機械的ストレスに適応しない移植片の変性に起因する不完全かつ一時的な再生である。
同種移植（移植片が死骸から摘出され、所望により凍結または凍結乾燥の後に保存される）の場合、長期間(10年間)、良好な臨床結果が得られている。軟骨は拒絶現象を受けにくい。主な制限は、移植片の入手可能性が低いこと、および病気の伝染のリスクである。
1968年以来可能となっている自家軟骨細胞の移植では、それに先行して健康な軟骨の生検が行われる(Genzyme 社の Carticel(登録商標)、Matricel 社の ACI Maix(登録商標))。軟骨細胞は摘出され、移植される前にインビトロで(2D)増幅される。欠損の位置(level)において縫合された組織片により、細胞が移植部位に位置し続けることが保障される。しかし、移植された組織は、自家移植の場合と同様に、最後には分解する。
軟骨組織の操作のためにより最近になって探索されたアプローチは、(i)患者に移植された後に該患者の天然の分化した細胞の遊走を促進することを目的とした多孔質マトリックスの使用(US 6,179,871; BioTissue Technologies 社の Chondrotissue(登録商標); Robert et al., Biomaterials 31, 2010)、または該細胞の 2D 細胞培養における増幅の後に組織再生を促進およびガイドすることをその作用とする、細胞と組み合わされたマトリックスの使用(Genzyme 社の MACI(登録商標))、(ii)懸濁培養の工程を含む方法の実行(US 2005/0074477)および(iii)間葉系幹細胞またはMSCの移植(臨床試験段階における)からなる。
後者のアプローチは、軟骨細胞移植のバリエーションを構成する。しかし、それは移植部位における細胞の保持という同じ問題を有し、MSC の分化に関連する問題がそこに加わる。
このタイプの手法において、MSC は、i) 前処理を行わずに移植されるか、ii) それらが分化した細胞になるようプログラムすることを役割とするタンパク質によって活性化された後に移植されるか、または iii) インビトロで分化させ、組織イニシエーターの形態で移植される。
この点に関し、“遠心分離による細胞凝集”の手法は、幹細胞、例えば間葉系幹細胞(MSC)の、軟骨組織の細胞外マトリックスを生産することができる軟骨細胞へのインビトロの分化を可能にする(この分化プロセスは軟骨形成とも称される)。200 g における 5 分間の MSC の遠心分離、およびその後の、得られた細胞凝集体の、特定の可溶性軟骨形成誘導因子の存在下における 14 日間 (Schaler et al., Radiology: vol. 211, No. 2, 2007 を参照) または 28 日間の培養、特に、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 または BMP-2 の存在下における培養が、遠心分離技術による細胞凝集の実施の例である。
しかし、軟骨細胞へ分化することを意図した幹細胞へ適用した場合、遠心分離による細胞凝集方法は、細胞凝集体の周囲における線維性のシェル(shell)の形成をもたらし、この事が、組織イニシエーターとしての該凝集体の臨床的使用に関して、レシピエントの天然の軟骨組織へ組み込まれる該凝集体の能力を制限し、その後の該凝集体の分解を促進する。
本発明の発明者らはここに、先行技術において開発された手法、例えば細胞療法において一般的に用いられる遠心分離による細胞凝集方法の実行において遭遇する多くの問題に対する解決を提案する。
本発明は、分化した細胞を含む細胞構造、特に大きな細胞構造を得ることを可能にし、それにより、限られた数のかかる構造を損傷の位置(level)に移植することを可能にし、外科医による該構造の操作を促進するものである。本発明は、任意の支持マトリックスの使用を省くことをも可能にする。
本発明の概要
本発明は、細胞、特に幹細胞および/または分化中の細胞(cells undergoing differentiation)もしくは分化の過程にある細胞の凝集方法であって、以下の工程を含む方法に関する:
a) 幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
b) 該磁化された細胞を磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程。
本発明の方法は、細胞、典型的には幹細胞の最適な凝集を可能にし、その組織化および有利にはその分化を促進するものである。
本発明はまた、かかる方法を用いて得ることができる細胞凝集体であって、磁化された細胞、例えば磁化された幹細胞、分化の過程にある磁化された幹細胞、分化の過程にある磁化された細胞、および/または分化した、磁化された細胞を含む、細胞凝集体に関する。本発明はまた、インビボで動物に注入または移植することが可能な組織イニシエーターとしての、これら細胞凝集体の１種以上または該凝集体の融合の結果物の使用に関する。
さらに、本発明は、本発明の細胞凝集方法の実行を含み、所望により、該凝集方法の終了時に得られる１種以上の細胞凝集体を培養する工程を含む組織構造の作成方法に関し、さらに、かかる方法を用いて得ることができる組織構造であって、(i)磁化された細胞、例えば磁化された幹細胞、分化の過程にある磁化された幹細胞、および/または分化の過程にある磁化された細胞、さらに所望により、分化した、磁化された細胞であって、成熟しているかまたは未熟なものであり、また、同一であるかまたは異なるものである磁化された細胞、ならびに(ii)細胞外マトリックスを含む、組織構造に関する。本発明はまた、代替組織としての該組織構造の使用であって、かかる代替組織がインビボで移植し得るものである、使用に関する。
本発明は、特に、組織イニシエーターの限定されたサイズという技術的障害を除去することを可能にするものであり、これは、本発明が既存の手法を用いて得られる凝集体よりも 10 倍多い細胞を含む凝集体を得ること、およびそれ故、臨床的に使用可能な、調節可能なサイズ、特に大きなサイズを有する移植可能な組織イニシエーターを得ることを可能にするためである。かかる分化した凝集体のサイズの増大は、おそらく、該凝集体と周囲の培地との間の交換に有利な、本発明の凝集方法によって得られる初期配置(initial geometry)に起因するものである。生存可能であることに加えて、得られる細胞凝集体は、既存の細胞凝集体とは対照的に、その長期の融合性質(fusion property)を失わない。従って、それらは、軟骨形成過程全体を通して互いに融合することができる。該細胞凝集体は、有利なことに、１凝集体あたり１つのチューブの使用を必要とする既存の小さな凝集体とは異なり、単一のバイオリアクターにおいて数多く培養することもできる。
本発明はまた、任意の形状、特に損傷部位の形状を得るよう間隔を空けた(in space)細胞凝集体の組織化、ならびにいくつかの組織化された細胞型、例えば軟骨細胞と骨細胞の共培養を可能にする。
ラージスケールにも適用可能な、本明細書に記載の方法は、支持マトリックス(通常、生体適合性および分解に関して問題がある)の併用を必要とせずに機能的組織を得ることをも可能にし、さらに高価な増殖因子の使用を部分的にまたは完全に省略することを可能にする。本発明において得られる代替組織は、細胞凝集体と同様、実際、早期に、即ち分化過程の終了前に、有利に移植することができる。
さらに、組織構造における磁性粒子の組み込みにより、本発明の方法は、例えば当業者に周知の磁気共鳴画像(MRI)技術を用いる、移植後のこの構造のインビボの成長(development)の非侵襲的モニタリングを可能にする。
磁気装置。図 1 は、本発明における細胞の磁気凝集(magnetic condensation)に用い得る装置の例を示す。左から右へ: 例えば各々の末端の上における 250,000 個の細胞の凝集体の形成をもたらす、切断された磁性針の末端の六角形ネットワーク; 4百万個の細胞の十字の形態の凝集体の形成をもたらす、永久磁石によって磁化される軟鉄の十字; 同じ配置(geometry)の 4百万個の細胞の細胞凝集体の形成をもたらす、環形の永久磁石。 3D バイオリアクター。図 2 は、細胞凝集体のバルク培養の例を提供する。ここで用いた配置は、このネットワークの下に位置する永久磁石(図 2A)によって磁化される、切断された針の末端の四角形ネットワークである(図 2B)。この例においては、各々が 250,000 個の細胞からなる 16 個の凝集体を同時に培養することができる(図 2C)。 大きな軟骨イニシエーターを得るための磁気凝集。この図は、幹細胞の分化によって軟骨組織を得るための磁気凝集の利点を示す。図 3A : 線状または十字配置の百万または数百万個の細胞の開始時沈着は、球状の凝集体の形成をもたらす。この配置遷移の間、細胞凝集体は、凝集体の中心への栄養および酸素の拡散に有利な、細胞外の培地との大きな交換面積を維持している(矢印は空の空間を示す)。図 3B : かかる手法により得られた凝集体の最終体積は、常套の遠心分離による限局(confinement)の手法によって得られた凝集体の体積よりもずっと大きい。図 3C : 幹細胞の分化は、I型コラーゲンコードする遺伝子の発現に対する、II型コラーゲンをコードする遺伝子の発現の定量によって評価することができる。このグラフ上において、遠心分離によって限局された細胞数の250,000個から百万個への増加が、軟骨マトリックスの遺伝子の発現の劇的な減少をもたらすことが観察される(対照と(1)との比較)。反対に、百万個の細胞を磁気凝集によって限局した場合には、これら同じ遺伝子の発現は、250,000個の細胞の遠心分離による限局の場合と同等なままであり(対照と(2)との比較)、百万個の細胞の遠心分離による限局の場合と比較して100倍よりも高い((1)と(2)の比較)。図 3D : 磁性線(１センチメートルに百万個の細胞)から得られた組織の組織学的解析は、軟骨マトリックスの陽性染色を示す(破線の円)。 融合による軟骨イニシエーターの集合(assembly)。図 4A : “組織架橋”(矢印)の形成によって示される通り、磁気凝集により形成された凝集体は、これらの凝集体を単純に接触させた後、融合する固有の(intrinsic)能力を有している。図 4B : この性質は、患者の欠損に適したサイズおよび配置を有する軟骨の代替組織を形成させようとする“ボトムアップ”アプローチにおいて有利であることが分かる。凝集体は、軟骨“スティック”を形成するよう融合によって集合させることができ、該スティックはそれ自身で集合してシートとなり、その後これらのシートが融合して厚い軟骨となる。図 4C : この画像は、16 単位の 200,000 個の細胞の融合を示し、最初の 16 個のうちの 4個の凝集体を矢印によって示す。図 4D : ２つの単位の融合によって得られた凝集体(軟骨のスティック)の組織学的解析により、軟骨マトリックスの陽性染色が明らかになっている(破線の円)。図 4E: １６単位の逐次融合は、大きな連続する組織(シート)を得ることを可能にする。さらに、形成された組織の組織学的解析により、軟骨マトリックスの陽性染色(破線によって区切られた領域)が明らかになっている。 磁気凝集によって得られた軟骨凝集体の可視化。凝集体内における磁性ナノ粒子の存在は、非侵襲的容積分析 MRI 画像化によって可視化される。画像は、Brucker 4.7T MRI 装置により、TR/TE = 20/5ms、フリップ角 = 25°、空間分解能 50x50x50μm で、3D グラジエントエコーシーケンス(磁化率強調)を用いて取得した。観察された軟骨凝集体は、磁性ナノ粒子により磁性(A : 標識 [Fe]=0.05mM、30分、細胞あたり 1 pg の鉄、および B : 標識 [Fe]=0.1mM、30分、細胞あたり 2 pg の鉄)を付与された 250,000 個の幹細胞から磁気凝集によって形成され、28 日間の培養に供されたものである。
本発明の詳細な説明
本願発明の発明者らは、“磁化による細胞凝集”技術を細胞に適用することにより、細胞の分化、特に分化中の細胞および/または幹細胞、典型的には間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹(ES)細胞または再プログラムされた細胞(本発明においても“誘導前駆細胞”の表現によって同定される人工多能性幹細胞または iPSC)の分化を非常に有利に促進することが可能な、細胞凝集方法において細胞の組織化を著しく改善する方法を開発した。この技術は、(i)細胞への磁性粒子の導入(自発的インターナリゼーションによる)、およびその後の(ii)磁化された細胞の外部磁場への曝露を介する、制御された幾何学的形状(geometric shape)を有する細胞凝集体の形成および組織化を含む。この方法の工程(i)は、インビトロまたはエキソビボで行うことができる。工程(ii)は、当業者の好みに応じて、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができ、好ましくは意図する細胞凝集体のその後の応用に適した条件下で、例えば、好ましくは細胞が存する分化プロセスの段階および/または細胞が到達することが望まれる細胞分化の段階に適した条件下で行うことができる。かかる方法は、これまでに説明した既存の方法に伴う技術的制約を考慮すると、これまでは予想できなかった臨床的視点(clinical perspective)を提供するものである。
したがって、本発明は、以下を含む細胞凝集方法に関する:
a) 細胞、特に幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
b) 該磁化された細胞を磁場、好ましくは集中した(focused)磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程。
本発明の凝集方法は、磁性を付与することができ、且つ好ましくは分化の経路をたどることができる全ての細胞型に適用される。用い得る細胞は、典型的には動物細胞、好ましくは哺乳類細胞、よりいっそう好ましくはヒトの細胞である。これらの細胞は、例えば、幹細胞、分化中の細胞または再プログラムされた細胞、典型的には誘導前駆細胞から選択し得る。それらは、胚、胎児(仔)、新生児(仔)および/または成人(成体)由来の細胞であり得、成熟した細胞であっても未熟な細胞であってもよい。それらは、例えば、血液、骨髄、胎盤、骨、軟骨、筋肉、皮膚または脂肪組織に由来する細胞であり得る。本発明において用い得る細胞の例は、(これらに限定されることなく)以下を含む: 間葉由来の成体幹細胞(典型的には骨髄または脂肪組織に由来する)、胚性幹細胞、誘導前駆細胞、末梢血前駆細胞、または臍帯血もしくは筋骨格系由来の前駆細胞(例えば筋前駆細胞または間葉系幹細胞)。
本発明において細胞療法のツールとして用い得る幹細胞は、胚由来のもの[胚性幹細胞(ESC)である幹細胞(SC)]または非胚由来のもの(胎児(仔)、新生児(仔)および成体の組織)であり、動物、典型的には哺乳類、好ましくはヒトに由来するものである。
胚性幹細胞(ESC)は、インビトロで無限の増殖能力を有しており、全ての細胞型を生じさせることができる。かかる細胞は、例えば Chung et al.(Cell Stem Cell. 2008 Feb 7; 2(2): 113-7 を参照)に記載される手法を用いて、それが由来する胚を破壊することなく得ることができる。かかる幹細胞の使用は、心筋細胞を得るために特に推奨される。
非胚性の幹細胞は、間葉系幹細胞(MSC)、誘導前駆細胞、神経幹細胞、内皮前駆細胞等であり得る。それらは、例えば、滑膜、骨膜、骨髄、脂肪組織、臍帯血、胎盤、ワルトン膠質等に由来するものである。
本発明において用い得る好ましい非胚性幹細胞は、間葉由来の成体幹細胞または MSC、および間質細胞から選択される(特に軟骨細胞、肝細胞または心筋細胞を得るために)。
特定の型の非胚性幹細胞は、容易に採取し、同じ個体に移植(自家移植)することができるという利点を有し、したがって、拒絶反応のリスクを除去することができる。したがって、MSC は、本発明において用いる前に、例えば、患者における骨髄穿刺によって採取し、次いでプラスチックの支持体への自発的付着によって単離することができる。MSC の他の源は、例えば、脂肪組織、滑膜および骨膜である。
分化した成体の細胞の遺伝的再プログラミング(Yu J, Vodyanik MA, et al. (2007). "Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells". Science 318 (5858): 1917-1920; Takahashi K, et al. (2007). "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors". Cell 131 (5): 861-872 を参照)も、胚性幹細胞と同じ増殖および分化能力を有する多能性細胞を得ることを可能にする。本発明において幹細胞のカテゴリーに分類されるこれらの細胞は iPSC (人工多能性幹細胞)または誘導前駆細胞と称され、上述の通り、本発明においても用いることができる。
細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させることにより、“磁性標識”または“磁化”技術によって“磁化された”細胞を得ることが可能となる。通常、細胞を磁性粒子と共にインキュベートすることによって行われるこの工程は、本願発明の方法の実行において必要な工程であり、凝集を望む細胞を磁場に曝露することを含む“磁気凝集”工程に先行するものである。
細胞の磁化は、磁化すべき細胞の表面への磁性粒子の結合、または該細胞による磁性粒子のインターナリゼーションに基づく。細胞によるナノ粒子のインターナリゼーションのメカニズムは、細胞膜の陥入およびその後の磁性粒子で満たされたエンドサイトーシス小胞の形成に基づく。これらの小胞は、その内容物を後期エンドソームまたはリソソームへ送達するために、該内容物を細胞質内へと輸送する。
磁性ナノ粒子のインターナリゼーションによる細胞の磁化方法の例は、文献 Wilhelm C. and Gazeau F. (Biomaterials. 2008; August 29(22):3161-3174)に記載されている。この場合、細胞の表面において最初に吸収された全てのナノ粒子の完全なインターナリゼーションを可能にするため、インキュベーション工程の後に、ナノ粒子を有さない細胞培養培地における“追跡”期間が続く。インキュベーションの開始から１〜２時間後に、該粒子は細胞の内部に濃縮され、その数が細胞あたりおよそ 105 からおよそ 108 個の範囲の粒子、例えば細胞あたり 107 個の粒子(およそ 10 pg の鉄に相当する)となることが観察される。
本発明において用い得る磁性粒子は、磁性微粒子(microparticle)または磁性ナノ粒子、好ましくは磁性ナノ粒子である。
ナノ粒子のサイズ(平均直径)は、1 μm 未満、典型的には 5 nm から 999 nm の間、好ましくは 5 から 250 nm の間、特に好ましくは 5 から 50 nm の間、よりいっそう好ましくは 5 から 15 nm の間であり、例えば 6、7、8、9 または 10 nm である。小さな粒子(通常、そのサイズは 50 nm 未満である)は、大きな粒子よりも容易に細胞内に移行する傾向がある。
微粒子のサイズ(平均直径)は、1 μm 以上、典型的には 1 μm から 4 μm の間であり、好ましくは 1 μm から 2 μm の間である。
本発明において用い得る粒子は、磁性粒子、即ち、少なくとも１種の磁性物質からなる粒子、数種の磁性物質を含む粒子、および所望により他の非磁性物質と組み合わされた少なくとも１種の磁性物質を含む粒子(ハイブリッド粒子)である。使用し得るハイブリッド粒子の例は、コアシェル型のナノ粒子、(Janus型の)非対称粒子、または多孔質構造もしくはメソ多孔質(mesoporous)構造(例えばシリカと組み合わせたもの)である。
磁性物質は、硬磁性または軟磁性であり得、即ち、強い磁気異方性を有してもよく、弱い磁気異方性を有してもよい。
本発明において用い得る磁性物質の例は、強磁性、フェリ磁性、超常磁性、反強磁性、または所望により常磁性の物質である。
本発明において用い得るフェリ磁性物質は、例えば、スピネル構造のフェライト、例えば磁赤鉄鉱、磁鉄鉱、ニッケルフェライト、コバルトフェライト等から選択されるものであり得る。
本発明において用い得る常磁性物質は、例えば、ガドリニウム添加物質、酸化ガドリニウムまたは酸化マンガンから選択し得る。
本発明において用い得る超常磁性物質からなる粒子の例は、フェライト(例えば酸化鉄、磁赤鉄鉱)ナノ粒子であり得、そのサイズは好ましくは 20 nm 未満である。
強磁性物質またはフェリ磁性物質の使用が好ましい。強磁性物質またはフェリ磁性物質の特に好ましい例は、酸化鉄、例えば磁鉄鉱(Fe3O4)または磁赤鉄鉱(γFe2O3)である。
選択される物質は、金属酸化物(酸化鉄、酸化コバルト、酸化ニッケル、酸化マンガン、酸化白金)、純金属(例えば鉄、コバルト、ニッケル)または金属合金(例えば CoPt、FePt)からなるものであり得、所望により非磁性金属(例えば銀または金)と組み合わせてもよい。
本発明において用い得る磁性粒子は、未精製の形態であってもよく、１種以上の配位子(例えばクエン酸(citrate))またはポリマー(例えばデキストランまたはポリエチレングリコール(PEG))と結合させてもよく、かかる配位子またはポリマーを用いて部分的にまたは完全にカバーまたは被覆してもよく、あるいは、当業者に周知の手法を用いて、例えばミセル、カーボンナノチューブもしくはチタンナノチューブ、リポソーム、細胞小胞もしくはウイルスベクターの中に封入してもよい。
当業者が容易に決定し得る、本発明において効果的な粒子の量(dose)は、例えば、細胞あたりおよそ 10 pg の鉄(即ち、およそ1000万個の細胞に対しておよそ 0.1 mg の鉄)である。かかる量は、画像化において用いられる量(20-50μmol/kg、即ち、１人の患者に対しておよそ 0.1 g の鉄)よりもおよそ千倍少ない。比較として、人体中の鉄の総量は約 3-4 g であり、毎日 1 から 2 mg が更新されている。
磁化手法において通常用いられる酸化鉄ナノ粒子について今日までに行われた研究からは、毒性は明らかになっていない。さらに、酸化鉄からなるナノ粒子は、臨床用の磁気共鳴画像(MRI)において用い得る造影剤として認可されている。
本発明者らは、実験において、用いる粒子について細胞毒性および機能性試験を体系的に行った。したがって、本発明者らは、該粒子の、特に細胞の増殖および分化に対する無害性を示すことができた。したがって、かかる粒子の使用は、動物、特に哺乳類、好ましくはヒトにおいて特に有利であることが分かる。
さらに、当業者は、本発明に関して記載される方法を実行する条件によって、細胞、特に幹細胞によりインターナライズされるナノ粒子の量を制御することができ、そのため、細胞のスケールに応じて制御可能な、調節可能な強度の外部磁場を適用することができる。
0.05 mM から 5 mM の範囲の鉄濃度で酸化鉄ナノ粒子(直径およそ 8 nm)を含有する培地を用いる、例えばヒト間葉系幹細胞の、例えば 30 分間のインキュベーションは、細胞あたりおよそ 1 から 31 pg の細胞内鉄重量をもたらす。わずか 1 分間のインキュベーションも可能である。この時間は、実際、細胞膜上へのナノ粒子の吸着を可能にするのに十分なものである。追跡期間が無い場合、これらのナノ粒子は基本的に細胞膜の表面に局在化する。
磁性細胞からの密な細胞凝集体の形成は、本発明において、有利に集中した磁場、または、好ましくは集中し且つ/またはかなり大きな磁場勾配(例えばおよそ 0.1 nN からおよそ 10 nN の間の強い細胞磁力)によって特徴付けられるいくつかの磁場を用いて得られる。
これらの磁場は、通常、磁石または磁化可能な部品によって生成される。特に、強い磁場は、例えば、永久磁石(例えばネオジム、ニッケル、鉄等からなる硬磁性物質)、近くに配置された永久磁石によって磁化された部品、または電磁石(例えば銅または金製の部品)によって生成させることができる。
これらの磁石は、所望の次元および配置に機械加工できる。毎回、これらの磁石のいくつかを組み合わせてより多様な形状またはパターンを作成することができる。
当業者に公知の常套の微細加工手法を用いて、制御された様式で、基板(substrate)上に、(i)例えば永久磁石を作成するために強磁性物質を、または(ii)電磁石を作成するために導電性材料(典型的には金または銅等の金属)を、積層(deposit)させることができる。後者の態様において、磁気特性は該導電性材料における電流の通過に依存する。経時的に電流の強さを制御することにより、適用される磁力の強さを調節することが可能になる。
したがって、磁化された細胞の磁場への曝露に対応する本発明の凝集方法の工程 b) は、典型的には、１種以上の磁石形状(magnetic shape)への前記細胞の曝露からなる。
前記形状は、スポット、切断された針の先端または末端、直線、十字、星、環、ディスク、円、または、これらの形状の１つおよび/または他の形状のいくつか、例えばスポットの集まり又は直線の集まりから選択することができ、好ましくはネットワークに組織化されたものである(例えば、１セットのスポットとしての切断された針の末端のネットワーク、または１セットの直線としてのメッシュ)。該形状は、切断された針の末端のネットワーク、１つ以上の直線、十字、および例えば同心円状に配置された１つ以上の環から有利に選択される。
１つの特定の態様において、上述の適切な磁性物質からなるかまたは永久磁石によって磁化された、針の先端または切断された針の末端(例えば直径およそ 1 mm)を用いて、半球の形状を有する凝集体を作成することができる。同じ支持体または基板上にいくつかの凝集体を得るために、次いで“分離された”磁気源となるこれらの切断された針の末端のいくつかを組み合わせることができる。次いで、細胞凝集体の組織化は、磁性針の先端または切断された磁性針の末端の組織化によって規定される。
これらの針の末端の集合または組合せは、上述の通り、規則的な組織化(例えば四角形または六角形のネットワーク、らせん等)または不規則な組織化(例えば患者の欠損の配置を反映するもの)を反映し得る。実際、磁石の間隔は、当業者が容易に調節できる。
選択される磁石間の間隔は、細胞凝集体間のより近いまたはより遠い接触を誘導することにより得られる細胞凝集体の融合を制御することを可能にする。したがって、例えば、切断された磁性針のネットワークの場合、針の末端間の間隔は、例えば 1 から 20 mm の間である。この間隔は、好ましくは、少なくとも 1 mm、例えば 2、3、4、5、10 または 15 mm である。
別の特定の態様において、直線配置の磁石または磁化可能な部品を用いる。部品、例えば軟鉄製の部品を用いて、調節可能な幅および長さを有する細胞の“直線”を形成させることができる。典型的な長さは、例えば 0.5 cm から 2 cm の間、または 1 cm から 2 cm の間であり、厚さは 0.1 mm から 1 mm の間、典型的にはおよそ 0.5 mm、例えば 0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8 または 0.9 mm である。分離された磁石については、これらの磁石の直線のいくつかを組み合わせて、例えば、十字、星、メッシュ、またはより小さくもしくは大きく間隔を空けた直線の組合せ(0.5 mm から 2 cm の間、典型的には 1 mm から 2 mm の間、好ましくは 1 mm から 1.5 mm の間、例えば 1.1、1.2、1.3 または 1.4 mm)を形成させることができる。
さらに別の特定の態様において、環形状の磁石の使用は、同じ配置の細胞凝集体を得ることを可能にする。これらの環のいくつかを、上述の通り、例えば同心円状に集合させることができる。
したがって、本発明の方法は、その配置および空間的組織化を調節可能で且つ完全に決定できる三次元(3D)パターン(分離された又は分岐した細胞凝集体、直線形状または四角形ネットワーク形状の細胞凝集体、十字形の細胞凝集体、六角形ネットワーク形状の細胞凝集体等)を作成することを可能にするものである。磁気凝集により得られる直線状配置は、それが周囲の培地との交換の面積を増大させ、栄養および酸素の拡散を促進することを可能にする点で特に効果的である。
細胞凝集の密度は、適用する磁力の強さを変えることによって当業者が容易に制御することができ、該磁力の強さは 1 から 5000 ピコニュートン(pN)の間、例えば 1 からおよそ 1000 pN の間、好ましくはおよそ 100 からおよそ 900 pN の間、好ましくはおよそ 200、300、400、500、600、700 または 800 pN であり得る。これらの力の強さは、特に軟骨細胞への分化を意図した幹細胞について試験されているが、他の細胞型、例えば単球、マクロファージ、内皮前駆細胞、内皮細胞、リンパ球および間葉系幹細胞についても試験されている。
本発明の凝集方法は、例えばガラス等の細胞と弱く相互作用するものから、細胞接着を促進することにより強く相互作用するものまで、あらゆる型の支持体または基板上において実行することができる。
また、細胞との相互作用は、該基板の選択された構成材料の性質によって、または該材料の事前調製もしくは処理、例えば細胞接着を促進する物質を用いるその部分的または全体的な被覆によって、生成または促進することができる。かかる物質は、例えばゼラチン、フィブロネクチン、RGD 配列、および細胞から選択し得る。
あるいは、該基板は、インキュベーション、例えば血清中におけるインキュベーションにより“前処理”することもできる。
その上で磁石もしくは磁化可能な部品の組合せまたはネットワークを組織化し得る支持体または基板は、好ましくは二次元の基板、典型的には、例えばガラス、プラスチック、細胞培養用に処理された市販のプラスチック、有機ポリマーおよび無機ポリマーならびに無機化マトリックスから選択される材料からなる表面である。
この表面は、好ましくは平坦なものである。それは、例えば培養皿、例えば細胞接着を促進する物質を用いて前処理されていない培養皿である。
“２相”の(即ち、２種類の細胞型、例えば骨細胞および軟骨細胞を含む)移植片または代替組織の組織工学の特定の場合において、この基板は、骨細胞の１種以上のシート、または骨誘導性(osteoinductive)マトリックス、例えばリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトを取り込んだマトリックスに相当し得る。
本発明の凝集方法は、支持マトリックス(三次元基板、3D基板または外因性の三次元細胞接着支持体)の存在下で実行することもできる。通常用いられる三次元の支持マトリックスは、一般的に、多孔質ゲル、例えばハイドロゲルまたは多糖に基づくゲル; 合成ポリマー; 部分的に無機化されたマトリックス; 生物学的ポリマー、例えばコラーゲン; および骨、所望により脱細胞化(decellularise)した骨から選択される。この場合、細胞凝集体は、好ましくは、支持マトリックスの表面ではなく、その場所(in situ)で、即ち該支持マトリックスの中で形成される。しかし、本発明の方法は、有利に、且つ好ましくは、かかる 3D 支持マトリックスの非存在下で実行され、それにより、動物における移植の場合における不適合性のリスクを限定する。
基板、典型的には二次元の基板は、本発明の凝集方法において、磁気源(磁石、または永久磁石と組み合わせた磁化可能な部品)の近くに、例えば磁気源の上または下に有利に配置される。次いで、磁化された細胞は磁気源の近くに、典型的には希釈懸濁液の形態で、基板の全てまたは部分、好ましくは基板の全体に積層されるか、あるいは濃縮懸濁液の形態で基板の１つ以上の部分に積層される。当然、磁化された細胞は、本発明の別の態様において、磁気源への基板の曝露の前に、基板上または基板の近くに積層させることもできる。
凝集体を形成させようと意図する、用いる細胞の数は、およそ 10 万 からおよそ 4 百万個の範囲の細胞、例えばおよそ 300,000 個の細胞から 3 百万個の細胞の範囲、典型的には 400,000、500,000、600,000、700,000、800,000 または 900,000 個の細胞であり、これらの凝集体のいくつかをその後に組み合わせてもよい。用いる細胞の数は、例えば、0.2、0.5、1 および 2 百万個（20万個、50万個、百万個および2百万個）の細胞、好ましくは百万個の細胞である。
細胞が希釈懸濁液の形態で積層されるか濃縮懸濁液の形態で積層されるかに関わらず、細胞が磁場へ曝露された瞬間に、細胞が密な領域および細胞が疎らな領域の事実上瞬間的な形成を観察することができる。
特に臨床的に利用できる細胞密度を有する凝集体を作成するための、磁場への幹細胞の曝露の時間は、用いる細胞の性質、所望する細胞分化の程度および/または所望する凝集体の形状に応じて、およそ 1 分から数十日の間である。例えば、軟骨形成の場合、この時間は 1 分から分化サイクルの完全な期間(28日)の間、有利には 1 分から 1 時間の間、好ましくは 20 分から 1 時間の間であり得る。
選択された時間の磁場への幹細胞の曝露は、継続的であっても一過的であってもよい。それは、例えば一過的なもの、特に、本発明の方法の工程 b)が１時間より長く続く場合、該工程 b)の実行の最初の 10 から 20 分間であり得る。
分化因子(増殖因子)は、例えばインビトロで軟骨形成を刺激するために現在用いられている従来技術の方法において必須の、高価な要素である。それらは、とりわけ、細胞の凝集が成熟および分化のプロセスに必要な場合に、細胞の凝集を促進する。しかし、本発明の凝集方法は、かかる因子、例えば典型的には TGFβ1、TGFβ3 および/または BMP-2 の使用を部分的にまたは完全に省くことを可能にする。
本発明の方法は、磁気凝集により、分化することができ、長期間持続する高い融合能力を有し、且つ高いインビボの組み込み能力(integration potential)を示す密な細胞集合体(assembly)を作成することを可能にする。本発明によって得られる分化した凝集体(例えば軟骨組織イニシエーター)は、既知の手法を用いて得られる凝集体よりもずっとサイズが大きいものである。したがって、本発明によって得られる分化した細胞凝集体の最終体積は、既知の手法を用いて得られる凝集体の体積と比較しておよそ10倍である。例えば、およそ 4 百万個の細胞を用いると、従来技術の条件下ではおよそ 1 mm3 であるのに対し、本発明の凝集方法を用いて得られる細胞凝集体の最終体積は 10 mm3 に達するかまたはこれを超え得る。予想外なことに、本発明者らは、実際に、初期の広がった配置が維持されず、且つ、自発的および系統的に球状の配置へと成長することを発見した(図 3 を参照)。
本発明はまた、上述の方法を用いて得ることができ、(i)細胞、好ましくは幹細胞、所望により且つ有利には分化した細胞、および/または分化中の細胞(例えば幹細胞)、ならびに所望により且つ有利にはさらに(ii)細胞外マトリックス(分化した細胞により分泌される)、有利には壊死性のコア(core)を欠く細胞外マトリックスからなる細胞凝集体、典型的には球状の細胞凝集体に関する。典型的には、該凝集体中に存在する細胞は、磁化された細胞であるか又はこれを含むものである。
得られる凝集体の形状およびサイズは、上述の通り、用いる磁気源の性質および/または形状もしくは配置、および/または磁場へ曝露する磁化された細胞の数を変えることによって、当業者が調節することができる。
凝集体の細胞密度は、凝集体を形成する細胞の数および/または細胞に及ぼす磁力の強さを変えることにより、当業者が調節することができる。この強さは、それ自体、細胞と組み合わせる磁性物質の性質および量、磁気源の性質および形状、および該細胞と該磁気源の距離を必要に応じて選択することができる当業者によって、容易に調節され得る。該強さは、例えば、磁性標識の実験条件を変えることによって、上述の通りに調節することができる。
本発明はまた、動物、特に哺乳類、好ましくはヒトにインビボで注入可能(懸濁状態で)または移植可能な組織イニシエーターとしての、本明細書に記載の細胞凝集体の使用に関する。懸濁状態で注入し得る凝集体の最大サイズは、それ自身が注入部位と結合する用いる針の直径に依存する。
これらの細胞凝集体は、制御された形状および大きなサイズを有する細胞構造へと有利に集合(融合)させることもできる。本発明により、異なる細胞型(例えば骨細胞および軟骨細胞)からなるという点で異なる細胞凝集体の融合をもたらすことも可能である。
したがって、本発明はまた、本発明の細胞凝集方法の実行を含む、組織構造を作成する方法に関する。本発明者らは、特に、上述の通り、磁気凝集方法と称される本発明の方法によって、磁場への細胞の曝露の後、調節可能なサイズおよび形状(または配置)、好ましくは大きなサイズを有する細胞凝集体を得るための細胞の遠心分離工程を省くことが可能になることを実証した。したがって、i) 組織構造の厚みを増大させるため、または ii) 異なる細胞型(例えば、骨もしくは軟骨、軟骨細胞および幹細胞、または骨細胞および幹細胞)を含む構造を組み立てるために、それ自身で集合することができる(その大きな融合能力のため)棒(rod)(例えば図 4A を参照)または細胞/組織シートを得ることが可能である。
組織構造を作成するための本発明の方法は、本発明の細胞凝集体を培養する工程、またはこれらの細胞凝集体(同一の又は異なる細胞からなる)のいくつかを共培養する工程を含み得る。
分離された微小磁石によって作成される磁場への曝露の後に得られる凝集体は、遠心分離による凝集方法(遠心分離による凝集と称する)を用いて得られる凝集体と同様のサイズのものであり得る(図 2 を参照)。本発明の方法の有利な貢献は、同様のサイズを有する凝集体に関しても、同じバイオリアクター内における非常に多数の凝集体の所望の段階への同時細胞分化を可能にすることであり(図 2C を参照)、他方、遠心分離を含む手法は、遠心分離チューブにつき単一の凝集体の使用を強いるものである。したがって、本発明の凝集方法は、遠心分離工程を伴わずに実行することが可能であり、且つそれが有利である。
さらに、これらの凝集体のいくつかを融合させてより大きな構造とすることができる。
したがって、本発明の方法の培養工程は、１つの細胞凝集体または同時にいくつかの細胞凝集体を、１時間から数日の間、あるいは数ヶ月であり得る期間の間、インキュベーター中で培養することを含み得る。したがって、軟骨形成の場合、培養工程は １日から 28 日の間継続し得る。この培養工程は、通常、増殖因子および/または物理的刺激の存在下で行われる。したがって、例えば、軟骨組織構造を得ることを望む場合には、１種以上の増殖因子、例えば上記のもの、好ましくは TGFβ3 を含む軟骨形成培地における細胞凝集体のインキュベーションが望ましい。
分化プロセスの最初の数日の間、１種以上の軟骨形成誘導性増殖因子の存在下で培養された凝集体と、かかる因子の非存在下で培養された凝集体が同様の挙動を示すことから、組織構造を作成するための本発明の方法は、少なくとも凝集工程の間、および有利には培養工程の最初の数日間または最初の 2、3、4、5、6、7 または 8 日間の間も、増殖因子の非存在下、好ましくは TGFβ1、TGFβ3 および/または BMP-2 の非存在下で実行できることが実証される。
本発明の一つの特定の態様において、第一の凝集体培養段階は増殖因子の非存在下で行われ、有利には、対象とする細胞型および得ることを望む組織構造の性質に応じて、当業者に通常用いられる１種のおよび/または他の増殖因子の存在下における第二の培養段階が後に続く。
第二の培養段階は、第一の培養段階に供された凝集体の注入または移植を含むか、または該注入または移植からなるものであってもよい。この場合、インビボの環境が、培養培地に導入された増殖因子の代わりとなる。
凝集した細胞は、所望により、培養工程の全てまたは部分、例えば 1、3、7、14 または 28 日の間において、これまでに定義した磁場に連続的または逐次的に曝露し得る。
凝集した細胞または凝集体が得られる、本発明に関して記載される培養段階は、これまでに定義した磁場の存在下で、連続的または逐次的に行うことができる。この磁場は、１種以上の磁気源を用いて作成することができ、該磁気源は、本明細書において上述した通り、凝集体の融合を促進して所望の形状を有するより大きな組織構造を形成させるために、互いにより近くへ移動させることができる。
凝集方法と同様に、組織構造を作成するための本発明の方法は、三次元(3D)支持マトリックスの非存在下において有利に実行することができる。
さらに、本発明は、本明細書に記載される方法を用いて得られた又は得ることができる組織構造に関する。
かかる構造は、(i) 分化した細胞、例えば軟骨細胞、典型的には分化した磁化された細胞、および (ii) 細胞外マトリックス、例えば、存在する分化した細胞が軟骨細胞である場合、軟骨性の細胞外マトリックス(II型コラーゲン線維および/またはアグリカン(aggregan)等のプロテオグリカンにより構成される)を含む。それは、幹細胞および/または分化の過程にある細胞をも含み得る。これらの細胞は、典型的には磁化された細胞である。
本発明はまた、本発明のかかる組織構造の、代替組織としての有利な使用に関する。かかる代替物は、動物、特に哺乳類、好ましくはヒトにおいてインビボで移植することができる。
組織構造は、上述の通り、組織の棒(rod)、シート、パッチもしくはスティックの形態であるか又は興味の対象であるあらゆる他の形態であり得る。
かかる組織構造は、インビボ、エキソビボまたはインビトロで、研究において有利に用いることもできる。
本発明はまた、かかる組織構造のインビボの成長をモニターする方法に関する。
本発明の細胞凝集体および細胞構造または組織構造は、上述の通り、画像化、例えば MRI 装置を用いる画像化によりその可視化および局在化が可能となるよう、磁化された細胞を含むものである(図 5)。
本発明は、初めて且つ非常に有利に、宿主の組織へ移植された細胞の分化および結果(outcome)を制御することを可能にするものである。
実施例
実施例 1 - ヒト間葉系幹細胞(hMSC)から軟骨細胞を得るために適用される凝集方法 - 基準条件(reference conditions)
材料および方法
・ 凝集体の形成
用いるヒト間葉系幹細胞(hMSC)は市販のもの(commercial aliquots)である(Lonza)。これらの細胞を、0.1mM の鉄濃度における酸化鉄(磁赤鉄鉱)ナノ粒子の懸濁液と共に 30 分間インキュベートする。ナノ粒子を含有しない培養培地中における終夜の追跡の後、250,000、500,000 または 1,000,000 個の細胞を、磁性針の上に位置するガラス基板(厚さ100μm)上に堆積(deposit)させる。この方法は、球形状の細胞凝集体の形成をもたらす。凝集体の細胞に対して及ぼす磁力は 70 から 400 pN の範囲である。
Figure 0006325443
・ 細胞の分化
軟骨組織工学の場合、間葉系幹細胞の凝集体を、インキュベーター(37℃、5% CO2)中において 28 日間、特に増殖因子 TGFβ3 を含む軟骨形成誘導培地中で有利に培養する。この培地を１週間に２回更新する。
・ 形成される組織の解析
軟骨形成培地中における 28 日間の培養の後、軟骨マトリックスの存在を実証するため、凝集体を組織学および定量 PCR によって解析した。このマトリックスは II型コラーゲン線維とプロテオグリカンから構成され、該プロテオグリカンはタンパク質コアとグリコサミノグリカン鎖が結合したものである。軟骨中に豊富に見出されるプロテオグリカンの例は、アグリカン(aggregan)である。
定量 PCR は、該マトリックスの２つの主要な構成要素である II型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子の発現を評価することを可能にする。さらに、II型コラーゲンをコードする遺伝子と I型コラーゲンをコードする遺伝子の発現レベルの比は、軟骨形成性分化経路に沿った進行の指標となる： 未分化である間葉系細胞が I型コラーゲンを優勢に(predominantly)合成するのに対し、軟骨細胞は II型コラーゲンを大量に生産する。
トルイジンブルーおよびサフラニン-O を用いる組織学的染色の役割は、それぞれ、青からバイオレットへの異染性(metachromatism)またはオレンジ色の呈色を介してグリコサミノグリカンの存在を明らかにすることである。
組織学
最初に、液体窒素で冷却したイソペンタン浴において OCT(最適切削温度化合物(Optimal Cutting Temperature compound))マトリックス中で凍結させる前に、サンプルをホルマリン中で固定する(4℃における12時間のインキュベーション)。次いで、ミクロトームクライオスタットを用いて 6 μm の切片を切り出し、後前処理されたスライド上に載せる。実際の染色の前に、該切片を再度、周囲温度で 10 分間、1% ホルマリン中で固定し、その後、水道水浴においてリンスする。
トルイジンブルー染色
- 0.5% トルイジンブルー溶液 (20 ml の 95% エタノールおよび 80 ml の蒸留水中における 500 mg)を用いる 1 から 2 分間のスライドの染色。
- 水道水浴におけるリンス。
- 脱水: 連続する３回の 100% エタノール浴 (2 分; 2 分; 5 分) および連続する３回のトルエン浴 (2 分; 2 分; 5 分)。
- Eukit を用いるスライドのマウント。
サフラニン-O 染色
- ヘマトキシリン染色
o 蒸留水中に希釈した 0.2×溶液を用いる 3 分間の染色。
o 水道水浴における 2 分間のリンス。
o 酸アルコール(70% エタノール中における 1% 塩酸 HCl)浴における 15 秒間の分別。
- ファストグリーン(Fast Green)染色
o 1:5000 水溶液(200 ml の水における 40 mg)を用いる 3 分間の染色。
o 1% 酢酸浴における迅速リンス。
- サフラニン-O 染色
o 0.1% サフラニン-O 水溶液中における最大 3 分間の染色。
o 95% エタノール浴におけるリンス。
- 脱水: 連続する３回の 100% エタノール浴(2 分; 2 分; 5 分)および連続する３回のトルエン浴(2 分; 2 分; 5 分)。
- Eukit を用いるスライドのマウント。
定量 PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)
分化段階の後の細胞に含まれる全 RNA を、Machery-Nagel キットを用い、供給者の指示するプロトコールに従って抽出する。ゲノム DNA の混入を避けるため、得られた RNA を DNAse で処理する。次いで、100 μl につき 1 μg の全 RNA の終濃度で SuperScript II 逆転写酵素(Invitrogen)を用いて相補 DNA (cDNA) を合成する。供給者の指示するプロトコールを参照し、ABIPRISM 7900 装置の配列決定システムおよび SYBR Green 色素(Applied-Biosystems)を用いてリアルタイム定量 PCR を行う。PCR プライマーを、Primer Express プログラム(Applied Biosystems)を用いて構築する。mRNA の転写レベルを、基準遺伝子: RPLP0 (酸性リボソームリンタンパク質(phosphoprotein)P0)の発現レベルに対して標準化する。PCR の終了時に形成される融解曲線によって、転写産物の特異性を確認する。確立された蛍光検出閾値は、閾値サイクル(Ct)を検出することおよび特定の遺伝子の相対的発現を定量することを可能にする。対象とする遺伝子(Rと表す)に対応する mRNA のレベルは、基準遺伝子 RPLP0 のレベルと比較して表される: ΔＣｔ＝ＣｔＲ−ＣｔＲＰＬＰ0。各々の遺伝子 R について、分化培地を用いずに培養された陰性対照サンプルを参照する。遺伝子 R に対応する mRNA の量は、この陰性対照と比較して表され、２（−ΔΔＣｔ）に等しい（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔサンプル−ΔＣｔ陰性対照）。
用いるプライマーの配列: 特定の３つの遺伝子の発現レベルによって、hMSC の軟骨形成を測定する:
o AGN : 軟骨マトリックスの構成要素であるアグリカンをコードする遺伝子;
Fwd : TCTACCGCTGCGAGGTGAT (配列番号 1)
Rev : TGTAATGGAACACGATGCCTTT (配列番号 2)
o Col2A : 硝子軟骨に存在する II 型コラーゲンのα鎖をコードする遺伝子
Fwd : ACTGGATTGACCCCAACCAA (配列番号 3)
Rev : TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA (配列番号 4)
o Col1A : 線維性軟骨に存在し、分化していない間葉系細胞によって合成される I 型コラーゲンのα鎖をコードする遺伝子
Fwd : GCTACCCAACTTGCCTTCATG (配列番号 5)
Rev : TTCTTGCAGTGGTAGGTGATGTTC (配列番号 6)。
分化の進行を評価するために、Col2A/Col1A の発現比および AGN の発現を測定する。
結果
250,000、500,000 または 1,000,000 個の間葉系幹細胞の凝集体は、28 日間の軟骨形成の終了時において、対照、即ち遠心分離(文献における標準的な条件)により形成される 250,000 個の細胞の凝集体に匹敵する、軟骨マトリックスに特徴的な遺伝子(AGN および Col2A/Col1A)の発現を示す。
実施例 2 − ヒト間葉系幹細胞(hMSC)から軟骨細胞を得るために適用される凝集方法 − 凝集体のコンパクトさ(compactness)におけるバリエーション
材料および方法
細胞凝集体のコンパクトさのバリエーションは、実施例 1 において示した標準的条件に関して、凝集体形成の間に細胞に適用される磁力を増大または減少させることによって得られる。この力は、細胞の磁性標識のバリエーションによって、又はより厚いガラス基板上への堆積によって調節される。試験した実験条件を、以下の表に再現する。
Figure 0006325443
実施例 1 において記載した通りに凝集体を形成させ、TGFβ3 を含む軟骨形成誘導培地中で 2 日間培養する。この２日間の間に、該凝集体の収縮動態(contraction dynamics)をモニターする。
結果
凝集体は同じ収縮動態を有する。
実施例 3 − ヒト間葉系幹細胞(hMSC)から軟骨細胞を得るために適用される凝集方法 − “広がった(spread out)”配置における堆積
材料および方法
実施例 1 について、厚さ 0.5μm の直線または十字の形態に加工(machined)された磁化可能な軟鉄部品の使用によって最初の配置を改変する。用いた実験条件を以下の表に再現する。堆積、凝集、凝集体培養および解析の方法は実施例 1 と同一である。
Figure 0006325443
結果:
・ 条件 3.6 は、陰性対照(遠心分離によって限局され、TGFβ3 を含まない軟骨形成培地中で培養された 250,000 個の細胞)と同様のマトリックス遺伝子発現をもたらす。
・ 条件 3.4 は、条件 3.5 よりも軟骨マトリックスの形成に有益である。
・ 条件 3.1、3.2、3.3 および 3.4 は、陽性対照(遠心分離によって限局され、TGFβ3 を含む軟骨形成培地中で培養された 250,000 個の細胞)に匹敵する軟骨マトリックスの合成をもたらす。
実施例 4 − 軟骨形成が行われている過程におけるヒト間葉系幹細胞(hMSC)の凝集体の融合 − 制御された形態および配置を有する代替組織の形成への応用
材料および方法
実施例 1 に記載した通りに、ヒト間葉系幹細胞の凝集体を磁気凝集によって形成させ、軟骨形成培地中で培養する。
凝集体を形成させるために用いる磁石の型は、磁性針(実施例 1 と同様)または磁性直線(実施例 2 と同様)である。これらの凝集体のいくつか(例えば 2個、4個、7個、16個)を軟骨形成過程の様々な時点(例えば 0日目、1日目、4日目、7日目、10日目または16日目)において接触させ、単一の密接した(cohesive)凝集体へのそれらの自発的融合を開始させる。例えば凝集体が互いに近接している場合(条件 4.1、4.4、4.6、4.7)、この接触は自発的なものであり得る。下部の磁石(凝集条件に応じて磁性針または磁性直線)の存在によって手動で該接触を誘導し、維持してもよい。誘導される融合の例は、条件 4.2、4.3、4.5、4.9、4.10、4.11、4.12 によって提供される。多数の単位の融合に関しては、逐次的融合方法を用いることもできる。例えば、最終的に 16 個の単位の融合に関する条件 4.12 においては、D7 において最初に 2 つの単位を融合させる(8 つの対(doublet)の形成)。次いで、形成された対を、D11 において融合させて四つ組(quadruplet)を得る(4つの四つ組の形成)。最後に、D16 において該４つの四つ組を融合させてシートを得る。このシートは、最初の 16 個の単位の逐次的融合の産物である。
試験した実験条件を以下の表にまとめる。融合の時点は、軟骨形成の開始後、融合の時点までに経過した日数を意味する。
Figure 0006325443
結果
・ 細胞凝集体の形成を誘導する磁石の近接は、これらの凝集体の自発的かつ早期の融合をもたらす。
・ 初期の融合(0日目、1日目、4日目)の場合、均質な単一の凝集体への凝集体の全体融合が観察される。
・ 後期の融合(7日目、10日目、16日目)の場合、密接しているが、その構造が別個の単位の存在によって特徴付けられる集合体への凝集体の融合が観察される。
・ 凝集体を接触させる時点は完全に制御することができる。
・ 後期の融合の場合、最終的な凝集体のサイズはそれを構成する単位のサイズの合計と同等であるが、初期の融合の場合には、凝集体のさらなる緊密化(compaction)が観察される。
・ 条件 4.4 および 4.12 は、豊富な軟骨マトリックスを有する代替組織の形成をもたらす。
・ 条件 4.1、4.2、4.3、4.9、4.10 および 4.11 は、軟骨マトリックスを有する代替組織の形成をもたらす。
・ 全ての条件において、連続する組織が形成される。
・ 条件 4.9、4.10 および 4.11 は、有意差のないII型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子の発現レベルをもたらす。
・ 磁気融合(条件 4.9、4.10、4.11)により形成される 106 個の細胞の凝集体のII型コラーゲン発現レベルと、遠心分離により形成される 106 個の細胞の凝集体のII型コラーゲン発現レベルとの比較により、通例の遠心分離手法によって形成される凝集体(880±291)よりも磁気融合によって得られる凝集体(3473±654)の方がこの発現レベルが有意に高いことが示される(統計学的検定: スチューデントの t 検定)。
軟骨形成を誘導する増殖因子(TGFβ3、TGFβ1、BMP-2 等)または該因子の混合物の存在は、凝集体の持続的培養(7-28日間)についてのみ有用であると考えられる。この場合、細胞凝集から分化および軟骨マトリックスの生成までに及ぶ全過程にとって有利な環境をインビトロで作ることが望ましい。
間葉系幹細胞凝集体の早期の移植に関し、細胞凝集の最初の工程は、イニシエーターの移植もしくは注入前にインビトロで、または直接的にインビボで、誘導することができる。過程の残りの部分(分化、マトリックス生産)は、天然の(native)細胞によってインビボで分泌される因子によって刺激され得る。かかる早期の移植は、2 または 3 日間のインビトロの培養の後、好ましくは１日間の培養の後に行い得る。
実施例 5 − マウス胚性幹細胞の培養および球状凝集体の取得
[Fe]=0.1 mM から [Fe]=2 mM の範囲の濃度の酸化鉄ナノ粒子と共に 30 分間のインキュベーションにより DMEM (必須アミノ酸および多能性を維持するための LIF タンパク質を有する)中で培養されたマウス胚性幹細胞。胚性細胞あたりの細胞取り込みは、細胞あたり 1 pg から 4 pg の範囲の鉄である(下記の曲線を参照されたい)。50,000 から 250,000 個の細胞を、磁気アトラクタ(attractor)から 100 μm にあるガラス基板上に堆積させた。該細胞に適用した磁力は 50 から 200 pN の範囲である。全ての条件において、球形状の密接した凝集体が得られる。

Claims (16)

  1. インビボで動物に移植することが可能な組織構造の作成方法であって、該作成方法は、外因性の三次元支持マトリックスの非存在下で行われ、幹細胞または分化中の細胞の凝集方法を行うことを含み、該凝集方法は、
    a) 幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が、表面に磁化された粒子が結合されているか、または磁化された粒子がインターナライズされている磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
    b) 該磁化された細胞を磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程
    を含む、作成方法。
  2. 幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹細胞(ESC)または誘導前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 磁場が、集中した磁場である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 磁化された細胞を磁場に曝露する工程 b) が、１種以上の磁石形状への前記細胞の曝露からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 磁化された細胞が磁石形状に曝露され、該形状がスポット、切断された針の先端または末端、直線、十字、星、環、ディスク、円、またはこれらの形状の１つおよび/または他の形状のいくつかから選択されるものである、請求項４に記載の方法。
  6. 該凝集方法が遠心分離工程を伴わずに行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 該凝集方法が分化因子の非存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
  8. 50万個、百万個または２百万個の幹細胞または分化中の細胞を使用する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記凝集方法の終了時に得られる同一のまたは異なる細胞からなる１種以上の細胞凝集体を培養する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 凝集方法の実行に続く培養工程の初日または最初の 2、3、4、5、6、7 または 8 日の間、増殖因子の非存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
  11. 軟骨構造の作成を可能にするものであり、且つ、凝集工程の間、増殖因子の非存在下で実行される、請求項９に記載の方法。
  12. 培養工程が１種以上の磁気源を用いて作成される磁場の存在下で行われる、請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
  13. 外因性の三次元支持マトリックスを欠き、(i)表面に磁化された粒子が結合されているか、または磁化された粒子がインターナライズされている分化した磁化された細胞および(ii)前記分化した磁化された細胞により分泌される細胞外マトリックスを含む、代替組織。
  14. 分化した磁化された細胞が磁性軟骨細胞であり、細胞外マトリックスが軟骨性細胞外マトリックスである、請求項１３に記載の代替組織。
  15. 組織のスティック、パッチ、シートまたは棒の形態であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の代替組織。
  16. 画像化によって請求項１３〜１５のいずれかに記載の代替組織を可視化する方法。
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