CN114317423B - 一种间充质干细胞培养基和基于doe实验设计的培养基优化方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及干细胞培养的技术领域，具体公开了一种间充质干细胞培养基和基于DOE实验设计的培养基优化方法。间充质干细胞培养基包括以下组分：基础培养基，所述基础培养基中至少添加启动水QDS和启动水QDY中的一种，所述启动水QDS在所述基础培养基中的体积百分含量为3%~12%，所述启动水QDY在所述基础培养基中的体积百分含量为3%~12%。本申请的间充质干细胞培养基可用于间充质干细胞培养，其具有获得的活细胞数量更多的优点。
Description
技术领域
本申请涉及干细胞培养的技术领域，更具体地说，它涉及一种间充质干细胞培养基和基于DOE实验设计的培养基优化方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新能力，且可在特定的培养条件下分化为造血细胞、骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等，也可跨越胚层界限分化为神经细胞、肝细胞、胰岛细胞等。间充质干细胞最初主要在骨髓中分离得到，而后从骨、脂肪、羊膜、胎盘、脐带、脐血、牙髓、肌腱和骨骼肌等组织中也可获得。间充质干细胞具有来源广泛、容易分离、能快速扩增等优点，以及具有较低免疫原性和免疫调节能力，因此成为组织工程、再生医学和免疫抑制治疗领域重要的种子细胞来源。由于间充质干细胞是成体干细胞，在体内原始含量很少，为满足临床治疗的应用，需要在体外进行快速有效地扩增培养，同时还需保持其多向分化潜能和未分化状态。
目前，体外扩增间充质干细胞最常使用添加胎牛血清的基础培养基；还有部分是不添加胎牛血清的人脐带间充质干细胞无血清培养；采用该类培养基进行间充质干细胞时，还存在间充质干细胞扩增效果差，例如活细胞数量低的问题。
发明内容
为了提高相关间充质干细胞培养基培养得到的间充质干细胞的活细胞数量，本申请提供一种间充质干细胞培养基和基于DOE实验设计的培养基优化方法。
第一方面，本申请提供一种间充质干细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种间充质干细胞培养基，包括以下组分，基础培养基，所述基础培养基中至少添加启动水QDS和启动水QDY中的一种，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%。
通过采用上述技术方案，本申请在配置间充质干细胞培养基时，通过在其基础培养基中添加有一定含量的启动水QDS和启动水QDY中的至少一种，能够提高培养得到的间充质干细胞的活细胞数。在该方案中，当基础培养基是无血清培养基时，其中，当启动水QDS和启动水QDY共同添加，且添加量均为10%时，启动水QDS和启动水QDY的共同添加将会对间充质干细胞的活细胞数量有负面影响。因此“基础培养基是无血清培养基且于基础培养基中同时添加10%启动水QDS和10%启动水QDY”的方案是不包含在本申请中的；进一步的，“基础培养基是无血清培养基且于基础培养基中同时添加7%~12%启动水QDS和7%~12%启动水QDY”的方案也是不包含在本申请中的。此外，当基础培养基是无血清培养基时，仅仅添加5%的启动水QDY，也将会对间充质干细胞的活细胞数量有负面影响。因此“基础培养基是无血清培养基且仅添加5%的启动水QDY”的方案是不包含在本申请中的；进一步的，“基础培养基是无血清培养基且仅添加3%~7%的启动水QDY”的方案也是不包含在本申请中的。
水在常温时因正负电荷的不均衡作用，单分子水易聚成液态水（聚集态）；当水温升高到100℃时，水呈气态（即单分子水的状态）。其中，单个水分子的氢氧原子之间的共价键，是通过分享一对电子形成的，而由于氧比氢更需要电子，因此，单分子水的一对电子的共享程度并不均衡。基于水分子的基础结构H2O，其氢原子半径79pm，氧原子半径70pm，当两个氢原子和氧原子键合成一个分子时，氢核与氧核的键合间距为96pm，氢原子和氧原子的外层电子间距在室温状态下为240pm。而启动水是一种单分子状态的粒子能多功能水，其是将普通单分子水经能量处理后，使得其在分子层面上有所变化，原子核内部的质子和中子配对达到稳定状态，从而保持水分子的活性，并具有磁性；进而使得单个水分子在室温条件下能够长期保持稳定的单分子状态。和普通水相比，启动水的粘度降低，溶解能力、通透能力、分散能力均得以提高，分子活性增强且不会衰减。
可选的，所述基础培养基为有血清培养基或无血清培养基。
可选的，所述基础培养基为有血清培养基，所述有血清培养基中添加有启动水QDS，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%。
在该实施方案中，有血清培养基内仅仅添加有启动水QDS，即该培养基中是不添加启动水QDY的。当基础培养基为有血清培养基时，且有血清培养基中添加有体积百分含量为3%~7%的启动水QDS，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达37496~38300个/cm2，远高于不添加任何启动水的培养基获得的28793个/cm2间充质干细胞的细胞数量。
可选的，所述基础培养基为有血清培养基，所述有血清培养基中添加有启动水QDY，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%。
在该实施方案中，有血清培养基内仅仅添加有启动水QDY，即该培养基中是不添加启动水QDS的。当基础培养基为有血清培养基时，且有血清培养基中添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDY，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达34684~41381个/cm2，远高于不添加任何启动水的培养基获得的28793个/cm2间充质干细胞的细胞数量。
进一步可选的，所述基础培养基为有血清培养基，所述有血清培养基中添加有启动水QDY，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的7%~12%。可选的，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的10%。
在该实施方案中，有血清培养基内仅仅添加有启动水QDY，即该培养基中是不添加启动水QDS的。当基础培养基为有血清培养基时，且有血清培养基中添加有体积百分含量为7%~12%的启动水QDY，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达41381个/cm2。
可选的，所述有血清培养基的组分包括：8~12Vol.%的胎牛血清和余量的MEM培养基。
可选的，所述无血清培养基为人脐带间充质干细胞无血清培养基。
在有血清培养基中，其添加有胎牛血清。而胎牛血清属异种蛋白，可能含有动物携带的细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒，因此用胎牛血清培养的间充质干细胞输入人体后，可能导致这些病原体的传播产生感染，具有潜在的危险。虽然扩增培养的细胞经洗涤可以减少异种蛋白的残留量，但是细胞内化的异种蛋白难以去除。为了解决培养基中的动物源性成分，在培养间充质干细胞时，选用人脐带间充质干细胞无血清培养基进行间充质干细胞的培养，更加安全。
可选的，所述基础培养基为无血清培养基，所述无血清培养基中添加有启动水QDS，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%。
通过采用上述技术方案，无血清培养基内仅仅添加有启动水QDS，即该培养基中是不添加启动水QDY的。当基础培养基为无血清培养基时，且无血清培养基中添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDS，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达38300~45265个/cm2，远高于不添加任何启动水的培养基获得的37362个/cm2间充质干细胞的细胞数量。
可选的，所述基础培养基为无血清培养基，所述无血清培养基中添加有启动水QDS，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%。可选的，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的5%。
可选的，所述基础培养基为无血清培养基，所述无血清培养基中添加有启动水QDY，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的7%~12%。
通过采用上述技术方案，无血清培养基内仅仅添加有启动水QDY，即该培养基中是不添加启动水QDS的。当基础培养基为无血清培养基时，且无血清培养基中添加有体积百分含量为7%~12%的启动水QDY，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达42050个/cm2，远高于不添加任何启动水的培养基获得的37362个/cm2间充质干细胞的细胞数量。
进一步可选的，所述基础培养基为无血清培养基，所述无血清培养基中添加有启动水QDY，所述启动水QDY在所述无血清培养基中的体积百分含量为10%。
可选的，所述基础培养基中添加有启动水QDS和启动水QDY，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%；或者基础培养基中添加有启动水QDS和启动水QDY，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~12%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%。
可选的，所述基础培养基中添加有启动水QDS和启动水QDY，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的3%~7%。
可选的，所述基础培养基中添加有启动水QDS和启动水QDY，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的5%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的5%。
通过采用上述技术方案，采用该培养基得到的间充质干细胞的细胞数量高达52362个/cm2，远高于不添加任何启动水的培养基获得的37362个/cm2间充质干细胞的细胞数量。
第二方面，本申请提供一种基于DOE实验设计的培养基优化方法，采用如下的技术方案：
一种基于DOE实验设计的培养基优化方法，包括以下步骤：
S1、选择变量因子，所述变量因子包括启动水QDS，启动水QDY和基础培养基；
S2、对每个变量因子设计不同水平，所述启动水QDS的不同水平至少包括3个不同的浓度，所述启动水QDY的不同水平至少包括3个不同的浓度，所述基础培养基的不同水平至少包括2个不同的培养基类型；
S3、对不同变量因子的不同水平做全因子实验并记录结果，并录入软件中进行分析，以得到上述的间充质干细胞培养基。
通过采用上述技术方案，巧妙创新地使用DOE实验设计优化MSC培养基，可以节约时间和生产成本，让实验设计更加的科学。通过DOE实验设计，首次证明了启动水QDS和启动水QDY可以作为MSC培养基的添加剂，大大提高了MSC的培养效果，并以适当的添加比例添加不同启动水，使培养效果得到进一步优化。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请在培养间充质干细胞的培养基中至少添加启动水QDS和启动水QDY中的一种，且启动水QDS和启动水QDY在基础培养基中的体积百分含量为3%~12%；以此提高培养得到的间充质干细胞的活细胞数量。
2、本申请中优选采用基础培养基为有血清培养基，且有血清培养基中添加有体积百分含量为3%~7%的启动水QDS；或者基础培养基为有血清培养基，且有血清培养基中添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDY，以进一步提高以有血清培养基培养间充质干细胞时，得到的间充质干细胞的活细胞数量。
3、本申请中优选采用基础培养基为有血清培养基或无血清培养基，且基础培养基中添加有3%~7%的启动水QDS和3%~12%的启动水QDY，或者基础培养基中添加有3%~12%的启动水QDS和3%~7%的启动水QDY时，以进一步提高以有血清培养基培养间充质干细胞时，得到的间充质干细胞的活细胞数量。
4、本申请中优选采用基础培养基为无血清培养基，且无血清培养基中添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDS或7%~12%的启动水QDY，以进一步提高以无血清培养基培养间充质干细胞时，得到的间充质干细胞的活细胞数量；同时更加安全。
附图说明
图1是本申请中DOE全因子实验的主效应结果图；
图2是本申请中DOE全因子实验的交互作用分析图；
图3是本申请培养基优化器结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。
1. 本申请基于DOE实验设计进行间充质干细胞培养基优化。
其中的实验原料和试剂见表1，仪器设备见表2。
表1实验材料与试剂
其中的启动水QDS和启动水QDY，均由景焕粒子能科技发展有限公司赠予。启动水QDS的产品型号为Q/SHTM0001S，其产品性能参数为PH:7.3，能量较低，所用复合材料的制备时磁化强度为7A/m，磁化时间为120h，水的密度1.002g/cm3，小分子水团直径1.2nm。启动水QDY的产品型号为Q/XGTS01S-2012，其产品性能参数为PH:7.5，能量较高，所用复合材料的制备时磁化强度为8A/m，磁化时间为200h，水的密度1.004g/cm3，小分子水团直径1.4nm。
表2 实验中使用的设备信息
2. 实验步骤
2.1实验因子确定
MSC培养基的种类对细胞培养效果有影响，因此可作为重要的影响因子。目前市场上主要存在两种不同的培养基，一种是传统的含胎牛血清的有血清培养基，另一种是添加人血小板裂解物的无血清培养基；因此，培养基种类作为第一实验因子。通过本申请的进一步研究发现，启动水可作为MSC培养基添加物，促进细胞生长，因此，启动水QDS和启动水QDY这两款启动水可作为两种重要的实验因子。
2.2确定水平
每个影响因子取不同的水平。其中，基础培养基的种类包括两个水平：有血清培养基，无血清培养基；其中有血清培养基是将市售获得的胎牛血清（添加量50mL）加入到市售获得的αMEM培养基（用量450mL）中得到，其中的无血清培养基是市售获得的人脐带间充质干细胞无血清培养基。启动水QDS含有3个添加量水平（基础培养基为添加标准，体积百分比）：0，5%，10%；启动水QDY含有3个添加量水平（基础培养基为添加标准，体积百分比）：0，5%，10%。
2.3列出全因子实验设计表
使用Minitab软件，并根据DOE实验设计的方法，列出3因子不同水平的全因子实验设计表，具体见表3。
表3全因子实验设计表
2.4全因子实验结果
采用表3的设计表，以DOE全因子实验设计方案进行MSC培养基优化实验，按照表4的运行序分别进行DOE全因子实验。将培养状态良好的MSC细胞消化收集，以8000/cm2的密度接种于T175培养瓶中，细胞培养3天后，消化收集并计数，完成DOE设计的全因子实验设计后，将得到的不同培养条件下的细胞数。不同培养条件下得到的细胞数如表4所示。
表4全因子实验方案
从表4实验结果可以看出，选择不同的培养基种类、不同QDS和QDY的添加量，都会对MSC活细胞数产生一定的影响。
其中，通过比较实验号1、实验号2和实验号16的结果看出，对于有血清培养基，和完全不添加启动水的培养基相比，其仅仅添加有3%~12%的启动水QDS时，培养得到的间充质干细胞的活细胞数量多30.23%~33.02%；这说明在有血清培养基内单独添加启动水QDS，能够显著提高间充质干细胞培养效果。
通过比较实验号1、实验号14和实验号18的结果看出，对于有血清培养基，和完全不添加启动水的培养基相比，其仅仅添加有3%~12%的启动水QDY时，培养得到的间充质干细胞的活细胞数量多20.46%~43.72%；这说明在有血清培养基内单独添加启动水QDY，能够显著提高间充质干细胞培养效果。
从实验号2、实验号18和实验号11的结果看出，对于有血清培养基，其同时添加有3%~7%的启动水QDS和3%~7%的启动水QDY（即实验号11）时，启动水QDS和启动水QDY对间充质干细胞的活细胞数量的增加作用表现为协同增效的结果，以该培养基培养得到的间充质干细胞的活细胞数量远高于实验号2和实验号18的。但是通过比较实验号11、实验号12、实验号6和实验号4时发现：当启动水QDS和启动水QDY共同添加时，只要其中一种的添加量大于5%时，其二者的协同增效的效果都将有所降低。由此也可看出，启动水虽然对间充质干细胞的增殖有促进作用，但是同时过量使用也会对间充质干细胞的增殖带来抑制作用。
对于无血清培养基，通过比较实验号5、实验号9和实验号17的结果看出，和完全不添加启动水的培养基相比，其仅仅添加有3%~12%的启动水QDS时，培养得到的间充质干细胞的活细胞数量多2.51%~21.15%；这说明在无血清培养基内单独添加启动水QDS，能够显著提高间充质干细胞培养效果。
对于无血清培养基，通过比较实验号5、实验号8和实验号15的结果看出，和完全不添加启动水的培养基相比，其仅仅添加有7%~12%的启动水QDY（即实验号15对应的方案）时，培养得到的间充质干细胞的活细胞数量多12.55%；这说明在有血清培养基内单独添加一定量的启动水QDY，能够显著提高间充质干细胞培养效果。
从实验号15、实验号9和实验号7的结果看出，对于无血清培养基，其同时添加有3%~7%的启动水QDS和3%~7%的启动水QDY（即实验号7）时，启动水QDS和启动水QDY对间充质干细胞的活细胞数量的增加作用表现为协同增效的结果，以该培养基培养得到的间充质干细胞的活细胞数量远高于实验号15和实验号9的，其间充质干细胞的活细胞数量多出15.68%~24.52%。但是通过比较实验号7、实验号10、实验号13和实验号3时发现：当启动水QDS和启动水QDY共同添加时，只要其中一种的添加量大于5%时，其二者的协同增效的效果都将有所降低；甚至当启动水QDS和启动水QDY共同且二者添加量均为10%时，其表现为对间充质干细胞的增殖抑制作用。由此也可看出，启动水虽然对间充质干细胞的增殖有促进作用，但是同时过量使用也会对间充质干细胞的增殖带来抑制作用。
此外，从实验号7和实验号11的结果看出，当启动水QDS和启动水QDY共同且二者添加量均为5%时，基础培养基为无血清培养基时，比有血清培养基表现出更加优异的对间充质干细胞的增殖促进作用（间充质干细胞的数量多12.68%）。因此无论是从对间充质干细胞的扩增促进能力，还是安全性角度的考虑，无血清培养基均更具有竞争力。
3.实验结果
3.1主效应及交互作用分析
从DOE全因子实验结果分析，包括培养基种类、QDS添加量、QDY添加量都对培养细胞数存在影响。从图1所示的主效应及图2所示的交互作用分析图中可知，无血清培养基培养效果高于有血清培养基，当启动水QDS和启动水QDY添加量各加基础培养基总体积的5%时，培养效果最佳。
4.2 实现最优化
图3为培养基优化器结果图，从该图可以看出，采用DOE实验设计方案可以得到在所给定的三个因子中，以及因子之间的交互作用，确定MSC培养基的最佳优化条件为：无血清培养基，5Vol.%启动水QDS，5Vol.%启动水QDY，采用该配比的培养基，活细胞数可达到52362/cm2。根据DOE的实验设计方法能够方便的从复杂的MSC培养基配方中找到最优的配比方案，不需要进行大量的实验。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (3)
1.一种间充质干细胞培养基，其特征在于，包括以下组分，基础培养基，所述基础培养基中添加启动水QDS和/或启动水QDY；
所述基础培养基为有血清培养基时，所述基础培养基内添加有体积百分含量为3%~7%的启动水QDS和/或体积百分含量为3%~12%的启动水QDY，或者所述基础培养基内添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDS和体积百分含量为3%~7%的启动水QDY；
所述基础培养基为无血清培养基时，所述基础培养基内添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDS或体积百分含量为7%~12%的启动水QDY，或者所述基础培养基内添加有体积百分含量为3%~12%的启动水QDS和体积百分含量为3%~7%的启动水QDY，或者所述基础培养基内添加有体积百分含量为3%~7%的启动水QDS和体积百分含量为3%~12%的启动水QDY；
启动水QDS的制备方法为：将水以磁化方法处理，磁化强度为7A/m，磁化时间为120h；启动水QDS的性能为：水的密度1.002g/cm3，小分子水团直径1.2nm；
启动水QDY的制备方法为：将水以磁化方法处理，磁化强度为8A/m，磁化时间为200h；启动水QDY的性能为：水的密度1.004g/cm3，小分子水团直径1.4nm。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述有血清培养基的组分包括：8~12Vol.%的胎牛血清和余量的MEM培养基。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基中添加有启动水QDS和启动水QDY，所述启动水QDS的添加量为所述基础培养基体积百分含量的5%，所述启动水QDY的添加量为所述基础培养基体积百分含量的5%。
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