CN107875171A - 一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,属于生物医药技术领域。利用脐带间充质干细胞及其诱导分化的人类纤维母细胞作为药物主体,通过小分子活性肽与载药的脂质体粘合,并且通过在脂质体内加入磁性粒子,以此来调高药物的靶向性,并且还可为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长;注射前再将注射液进行磁化,通过其中的复方电解质增加注射液的磁化率,磁化的注射液既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。总之,本发明适用于伤口愈合不易的慢性伤口,且无毒性安全的顾虑。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用。
背景技术
皮肤伤口修复是一个复杂的编排过程,其在受伤时被激活,它包括发炎时的多细胞重叠和协调阶段、血管生成和肉芽组织的形成、再上皮化和纤维增生或基质形成和修复。促炎细胞因子减少、新血管形成受阻或白细胞募集减损,都可能扰乱并延缓伤口的愈合。尽管目前使用的有效伤口敷料、软膏和器械都非常广泛,但伤口愈合仍然是临床的挑战。其中慢性伤口代表着越来越普遍和代价高昂的公共健康问题,随着紧急护理的改善,人们的寿命越来越长,继而患有糖尿病和其他与衰老相关的慢性疾病的患者数量日益增长。与衰老相关的疾病和创伤难愈有一定的联系。
据报道,皮肤间充质干细胞能填充正常皮肤的凹陷处,保持静止,并且在损伤后保持活跃,有助于伤口闭合。研究表明,间充质干细胞旁分泌信号是增强伤口修复的主要基础机制。据报道,骨髓间充质干细胞(BM-MSC)能促进伤口愈合,但是提取它们需要开刀手术和人工方法。提取脂肪干细胞(ADSC)也需要进行外科手术。随后,我们专注于一个更有优势的间充质干细胞来源,即从脐带提取的华顿氏胶。WJ-MSCs可以自然分离,可以出生后从丢弃的脐带中剖离,不需要额外手术。所以提取WJ-MSCs是无创的,没有痛苦的。事实上,研究表明山羊WJ-MSCs可以促进伤口修复,形成的瘢痕最小。但据我们所知,没有关于人类WJ-MSCs对人类皮肤伤口作用的报道。研究表明,WJ-MSCs代表一种非常有效的干细胞来源,在动物模型中具有免疫豁免、抗癌、抗纤维化的特性。对于已经遭受顽固性难愈合皮肤创伤的患者而言,由于WJ-MSCs的免疫豁免性和普遍持久的可用性,同种异体移植作为现有的治疗方式,可能是一种适当的治疗策略。
目前,较多的干细胞制剂均单纯采用PBS或生理盐水作为细胞制剂的溶剂,在复杂的体内环境中,很大程度上限制了干细胞修复创伤愈合的能力,使治疗效果不尽人意。
发明内容
本发明提供一种一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,来解决在复杂的体内环境干细胞修复创伤愈合能力较低的技术问题。
本发明的技术方案为:一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,所述脐带间充质干细胞药物按照重量百分比计包括:8-10%脐带间充质干细胞、1-3%人类纤维母细胞、7-9%磷脂、7-9%胆固醇、2-4%纳米磁体、2-4%复方电解质、6-8%小分子活性肽、3-5%中药提取物、2-4%营养复合物、0.5-1%烟酰胺单核苷酸(NMN)、0.4-1.8%低氧诱导因子、0.3-1.2%人纤溶酶原激活物抑制因子1、0.8-1.5%转化生长因子、1-2%人体血小板、0.5-1.5%透明质酸钠、5-7%磷酸缓冲液、8-10%生理盐水、0.3-0.5%稳定剂、0.2-0.4%抗氧化剂、0.3-0.5%抗菌剂、0.5-1%渗透压调节剂、余量为重蒸馏水。
进一步地,所述脐带间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤:
S1:将人脐带间充质干细胞经原代分离培养后,进行传代培养,取传代培养的P5-P20代人脐带间充质干细胞,在细菌培养皿中培养7-10天,至细胞达到70-80%的融合度,然后再加入体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶与0.1%胶原酶的混合酶液,消化30-60min,再利用涡流混合器进行震荡5-10min,剥离吸附在细菌培养皿壁的细胞膜层;
S2:将所述细胞膜层转移到含有细胞诱导培养液中的培养瓶内,诱导生成人类纤维母细胞,传代培养3-5代,离心分离后得到人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的混合细胞,用流式细胞仪进行实时监测,控制人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的比例达到8-10:1-3范围内时,即放入4℃冰箱内待用;
S3:将所述中药提取物用所述磷酸缓冲液进行溶解,再将所述纳米磁体与营养复合物分别用1/3的所述生理盐水进行溶解,分别得到中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,待用;
S4:将所述磷脂与胆固醇溶解于8-10倍二者混合体积比的乙醚中,再将所述乙醚减压完全汽化,然后依次加入所述中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,在37℃水浴恒温下,通过超声波进行融合后,再放入磁化器内进行磁化,磁场为500-1000高斯,得到磁化载药脂质体;
S5:将所述小分子活性肽加入到所述磁化载药脂质体内,在20-25℃水浴下,利用搅拌器搅拌4-6h,搅拌速度为20-40r/min,使小分子活性肽完全黏附在磁化载药脂质体表面,然后在磁化器内放置1-3min,磁场为600-700高斯,得到中间体悬浮液;
S6:将S2中的所述混合细胞加入到所述中间体悬浮液内,在5-10℃下,利用搅拌器搅拌90-120min,搅拌速度为10-30r/min,使其发生抗原抗体反应,并最终将混合细胞通过小分子活性肽结合在磁化载药脂质体上,得到细胞-脂质体;
S7:将所述烟酰胺单核苷酸(NMN)、低氧诱导因子、人纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子、人体血小板、透明质酸钠混合后用余下的1/3生理盐水进行溶解,得到微环境培养液,并将所述微环境培养液加入到所述细胞-脂质体内,静置活化20-60min;
S8:最后加入所述复方电解质、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、渗透压调节剂,并利用所述重蒸馏水进行定容,既得到含有脐带间充质干细胞药物的注射液。
进一步地,所述中药提取物是由黄芩苷、花青素、姜黄素、没食子鞣质、白藜芦醇以质量百分比为4:2:1:3:1配比而成,利用黄岑根部位萃取出的黄岑苷,可明显促进慢性伤口愈合时成纤维母细胞的增长;花青素是羟基供体,同时也是一种自由基清除剂,它能和蛋白质结合防止过氧化,还可以增强动脉、静脉和毛细血管弹性、保护动脉血管内壁、保持血细胞正常的柔韧性从而帮助血红细胞通过细小的毛细血管,因此增强了全身的血液循环、为身体各个部分的器官和系统带来直接的益处,并增强细胞活力;姜黄素可以通过阻断NF-kB、STAT3介导的炎症反应信号通路发挥抗炎的功能,有效缓解炎症损伤,预防炎症相关的慢性疾病的发生;没食子鞣质具有与蛋白质强烈结合的能力,并易于金属离子反应,具有较强的表面活性,同时具有收敛、止血、消炎的功效;白藜芦醇白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂,可降低血液粘稠度,抑制血小板凝结和血管舒张,保持血液畅通。
进一步地,所述营养复合物是由维生素E、维生素C、维生素B3、海洋多糖、α-亚麻酸以质量百分比为2:1:1:2:3配比而成,维生素E因能延长细胞寿命、防止体内脂质沉积和过氧化脂质的产生、维持细胞膜的稳定性、增强免疫功能、减少脑细胞脂褐质形成及减轻性腺萎缩等作用而作为抗衰老剂使用。维生素C具有促进新陈代谢、有助于真皮层的胶原蛋白增生,维生素B3可深层滋润、抗衰老及促进皮肤细胞更生。海洋多糖具有活化细胞、清除体内多余自由基、抗衰老的功效。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质,对人体健康起决定性作用。
进一步地,所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括:10-15%胎牛血清、2-4%抗坏血酸-2-磷酸盐、3-5%胰岛素-转铁蛋白-硒离子、1-2%丙酮酸钠、4-6%血管内皮生长因子、1-3%血小板衍生生长因子、2-4%胰岛素样生长因子、0.5-1.5%白细胞介素-6、2-3%抗生素-抗真菌素,余量为DMEM-高糖培养液,脐带间充质干细胞在细胞诱导培养液中培养,能上调正常皮肤纤维母细胞中TGF-β2,HIF-1-α和PAI-1(p≤0.05)的mRNA(信使核糖核酸)转录表达。
进一步地,所述复方电解质按照重量百分比计包括15-23%氯化钠、12-21%氯化镁、23-27%葡萄糖酸锌、10-12%氨基酸钠、5-9%木糖醇、4-8%免疫球蛋白;加入既能电解质能够为人体补充微量元素,又能增加注射液的极性,利于磁化。
进一步地,所述纳米磁铁为Fe3O4、Fe2O3、γ-Fe2O3、NiO、Co2O3中任意一种或几种组合,其中,纳米磁铁的粒径为20-80nm,纳米磁体既能够进行靶向给药,还能够为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长。
进一步地,在注射前先将所述注射液放入到磁化器内磁化1-3min,将注射液进行磁化,既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。
本发明的有益效果为:本发明用脐带间充质干细胞及其诱导分化的人类纤维母细胞作为药物主体,通过小分子活性肽与载药的脂质体粘合,从而合为一体,其中,中药提取物具有收敛、止血、消炎的功效,还能够增强毛细血管通透性,提高细胞活力;营养复合物能够延长细胞寿命、维持细胞膜的稳定性、增强免疫功能;并且通过在脂质体内加入磁性粒子,以此来调高药物的靶向性,并且还可为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长;注射前再将注射液进行磁化,通过其中的复方电解质增加注射液的磁化率,磁化的注射液既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。总之,本发明不但能达到促进血管增生、成纤维母细胞的增生,使糖尿病等因为末梢血管循环不良,伤口愈合不易的慢性伤口,得到完整的愈合效果,且无毒性安全的顾虑。
具体实施方式
实施例1
一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,所述脐带间充质干细胞药物按照重量百分比计包括:8%脐带间充质干细胞、1%人类纤维母细胞、7%磷脂、7%胆固醇、2%纳米磁体、2%复方电解质、6%小分子活性肽、3%中药提取物、2%营养复合物、0.5%烟酰胺单核苷酸(NMN)、0.4%低氧诱导因子、0.3%人纤溶酶原激活物抑制因子1、0.8%转化生长因子、1%人体血小板、0.5%透明质酸钠、5%磷酸缓冲液、8%生理盐水、0.3%稳定剂、0.2%抗氧化剂、0.3%抗菌剂、0.5%渗透压调节剂、余量为重蒸馏水;其中,所述营养复合物是由维生素E、维生素C、维生素B3、海洋多糖、α-亚麻酸以质量百分比为2:1:1:2:3配比而成,维生素E因能延长细胞寿命、防止体内脂质沉积和过氧化脂质的产生、维持细胞膜的稳定性、增强免疫功能、减少脑细胞脂褐质形成及减轻性腺萎缩等作用而作为抗衰老剂使用。维生素C具有促进新陈代谢、有助于真皮层的胶原蛋白增生,维生素B3可深层滋润、抗衰老及促进皮肤细胞更生。海洋多糖具有活化细胞、清除体内多余自由基、抗衰老的功效。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质,对人体健康起决定性作用;其中,所述复方电解质按照重量百分比计包括15%氯化钠、12%氯化镁、10%氨基酸钠、5%木糖醇、4%免疫球蛋白,余量为葡萄糖酸锌;加入既能电解质能够为人体补充微量元素,又能增加注射液的极性,利于磁化。其中,所述纳米磁铁为Fe3O4,纳米磁铁的粒径为20nm,纳米磁体既能够进行靶向给药,还能够为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长。
本实施例的脐带间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤:
S1:将人脐带间充质干细胞经原代分离培养后,进行传代培养,取传代培养的P5代人脐带间充质干细胞,在细菌培养皿中培养7天,至细胞达到70%的融合度,然后再加入体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶与0.1%胶原酶的混合酶液,消化30min,再利用涡流混合器进行震荡5min,剥离吸附在细菌培养皿壁的细胞膜层;
S2:将所述细胞膜层转移到含有细胞诱导培养液中的培养瓶内,诱导生成人类纤维母细胞,传代培养3代,离心分离后得到人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的混合细胞,用流式细胞仪进行实时监测,控制人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的比例达到8:1时,即放入4℃冰箱内待用;其中,所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括:10%胎牛血清、2%抗坏血酸-2-磷酸盐、3%胰岛素-转铁蛋白-硒离子、1%丙酮酸钠、4%血管内皮生长因子、1%血小板衍生生长因子、2%胰岛素样生长因子、0.5%白细胞介素-6、2%抗生素-抗真菌素,余量为DMEM-高糖培养液,脐带间充质干细胞在细胞诱导培养液中培养,能上调正常皮肤纤维母细胞中TGF-β2,HIF-1-α和PAI-1(p≤0.05)的mRNA(信使核糖核酸)转录表达。
S3:将所述中药提取物用所述磷酸缓冲液进行溶解,再将所述纳米磁体与营养复合物分别用1/3的所述生理盐水进行溶解,分别得到中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,待用;
S4:将所述磷脂与胆固醇溶解于8倍二者混合体积比的乙醚中,再将所述乙醚减压完全汽化,然后依次加入所述中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,在37℃水浴恒温下,通过超声波进行融合后,再放入磁化器内进行磁化,磁场为500高斯,得到磁化载药脂质体;
S5:将所述小分子活性肽加入到所述磁化载药脂质体内,在20℃水浴下,利用搅拌器搅拌4h,搅拌速度为20r/min,使小分子活性肽完全黏附在磁化载药脂质体表面,然后在磁化器内放置1min,磁场为600高斯,得到中间体悬浮液;
S6:将S2中的所述混合细胞加入到所述中间体悬浮液内,在5℃下,利用搅拌器搅拌90min,搅拌速度为10r/min,使其发生抗原抗体反应,并最终将混合细胞通过小分子活性肽结合在磁化载药脂质体上,得到细胞-脂质体;
S7:将所述烟酰胺单核苷酸(NMN)、低氧诱导因子、人纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子、人体血小板、透明质酸钠混合后用余下的1/3生理盐水进行溶解,得到微环境培养液,并将所述微环境培养液加入到所述细胞-脂质体内,静置活化20min;
S8:最后加入所述复方电解质、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、渗透压调节剂,并利用所述重蒸馏水进行定容,既得到含有脐带间充质干细胞药物的注射液。
本实施例在注射前先将所述注射液放入到磁化器内磁化1min,将注射液进行磁化,既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。
实施例2
一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,所述脐带间充质干细胞药物按照重量百分比计包括:9%脐带间充质干细胞、2%人类纤维母细胞、8%磷脂、8%胆固醇、3%纳米磁体、3%复方电解质、7%小分子活性肽、4%中药提取物、3%营养复合物、0.8%烟酰胺单核苷酸(NMN)、1.1%低氧诱导因子、0.75%人纤溶酶原激活物抑制因子1、1.2%转化生长因子、1.5%人体血小板、1%透明质酸钠、6%磷酸缓冲液、9%生理盐水、0.4%稳定剂、0.3%抗氧化剂、0.4%抗菌剂、0.8%渗透压调节剂、余量为重蒸馏水;其中,所述营养复合物是由维生素E、维生素C、维生素B3、海洋多糖、α-亚麻酸以质量百分比为2:1:1:2:3配比而成,维生素E因能延长细胞寿命、防止体内脂质沉积和过氧化脂质的产生、维持细胞膜的稳定性、增强免疫功能、减少脑细胞脂褐质形成及减轻性腺萎缩等作用而作为抗衰老剂使用。维生素C具有促进新陈代谢、有助于真皮层的胶原蛋白增生,维生素B3可深层滋润、抗衰老及促进皮肤细胞更生。海洋多糖具有活化细胞、清除体内多余自由基、抗衰老的功效。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质,对人体健康起决定性作用;其中,所述复方电解质按照重量百分比计包括19%氯化钠、16.5%氯化镁、11%氨基酸钠、7%木糖醇、6%免疫球蛋白,余量为葡萄糖酸锌;加入既能电解质能够为人体补充微量元素,又能增加注射液的极性,利于磁化。其中,所述纳米磁铁为Fe2O3,其中,纳米磁铁的粒径为60nm,纳米磁体既能够进行靶向给药,还能够为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长。
本实施例的脐带间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤:
S1:将人脐带间充质干细胞经原代分离培养后,进行传代培养,取传代培养的P10代人脐带间充质干细胞,在细菌培养皿中培养9天,至细胞达到75%的融合度,然后再加入体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶与0.1%胶原酶的混合酶液,消化45min,再利用涡流混合器进行震荡8min,剥离吸附在细菌培养皿壁的细胞膜层;
S2:将所述细胞膜层转移到含有细胞诱导培养液中的培养瓶内,诱导生成人类纤维母细胞,传代培养4代,离心分离后得到人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的混合细胞,用流式细胞仪进行实时监测,控制人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的比例达到9:2时,即放入4℃冰箱内待用;其中,所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括:12%胎牛血清、3%抗坏血酸-2-磷酸盐、4%胰岛素-转铁蛋白-硒离子、1.5%丙酮酸钠、5%血管内皮生长因子、2%血小板衍生生长因子、3%胰岛素样生长因子、1%白细胞介素-6、2.5%抗生素-抗真菌素,余量为DMEM-高糖培养液,脐带间充质干细胞在细胞诱导培养液中培养,能上调正常皮肤纤维母细胞中TGF-β2,HIF-1-α和PAI-1(p≤0.05)的mRNA(信使核糖核酸)转录表达。
S3:将所述中药提取物用所述磷酸缓冲液进行溶解,再将所述纳米磁体与营养复合物分别用1/3的所述生理盐水进行溶解,分别得到中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,待用;
S4:将所述磷脂与胆固醇溶解于9倍二者混合体积比的乙醚中,再将所述乙醚减压完全汽化,然后依次加入所述中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,在37℃水浴恒温下,通过超声波进行融合后,再放入磁化器内进行磁化,磁场为750高斯,得到磁化载药脂质体;
S5:将所述小分子活性肽加入到所述磁化载药脂质体内,在22℃水浴下,利用搅拌器搅拌5h,搅拌速度为30r/min,使小分子活性肽完全黏附在磁化载药脂质体表面,然后在磁化器内放置2min,磁场为650高斯,得到中间体悬浮液;
S6:将S2中的所述混合细胞加入到所述中间体悬浮液内,在8℃下,利用搅拌器搅拌110min,搅拌速度为20r/min,使其发生抗原抗体反应,并最终将混合细胞通过小分子活性肽结合在磁化载药脂质体上,得到细胞-脂质体;
S7:将所述烟酰胺单核苷酸(NMN)、低氧诱导因子、人纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子、人体血小板、透明质酸钠混合后用余下的1/3生理盐水进行溶解,得到微环境培养液,并将所述微环境培养液加入到所述细胞-脂质体内,静置活化40min;
S8:最后加入所述复方电解质、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、渗透压调节剂,并利用所述重蒸馏水进行定容,既得到含有脐带间充质干细胞药物的注射液。
本实施例在注射前先将所述注射液放入到磁化器内磁化2min,将注射液进行磁化,既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。
实施例3
一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,所述脐带间充质干细胞药物按照重量百分比计包括:10%脐带间充质干细胞、3%人类纤维母细胞、9%磷脂、9%胆固醇、4%纳米磁体、4%复方电解质、8%小分子活性肽、5%中药提取物、4%营养复合物、1%烟酰胺单核苷酸(NMN)、1.8%低氧诱导因子、1.2%人纤溶酶原激活物抑制因子1、1.5%转化生长因子、2%人体血小板、1.5%透明质酸钠、7%磷酸缓冲液、10%生理盐水、0.5%稳定剂、0.4%抗氧化剂、0.5%抗菌剂、1%渗透压调节剂、余量为重蒸馏水;其中,所述营养复合物是由维生素E、维生素C、维生素B3、海洋多糖、α-亚麻酸以质量百分比为2:1:1:2:3配比而成,维生素E因能延长细胞寿命、防止体内脂质沉积和过氧化脂质的产生、维持细胞膜的稳定性、增强免疫功能、减少脑细胞脂褐质形成及减轻性腺萎缩等作用而作为抗衰老剂使用。维生素C具有促进新陈代谢、有助于真皮层的胶原蛋白增生,维生素B3可深层滋润、抗衰老及促进皮肤细胞更生。海洋多糖具有活化细胞、清除体内多余自由基、抗衰老的功效。α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质,对人体健康起决定性作用;其中,所述复方电解质按照重量百分比计包括23%氯化钠、21%氯化镁、12%氨基酸钠、9%木糖醇、8%免疫球蛋白,余量为葡萄糖酸锌;加入既能电解质能够为人体补充微量元素,又能增加注射液的极性,利于磁化。其中,所述纳米磁铁为γ-Fe2O3,其中,纳米磁铁的粒径为80nm,纳米磁体既能够进行靶向给药,还能够为细胞补磁,提高细胞活性,延缓衰老,有利于表皮细胞增长。
本实施例的脐带间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤:
S1:将人脐带间充质干细胞经原代分离培养后,进行传代培养,取传代培养的P20代人脐带间充质干细胞,在细菌培养皿中培养10天,至细胞达到80%的融合度,然后再加入体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶与0.1%胶原酶的混合酶液,消化60min,再利用涡流混合器进行震荡10min,剥离吸附在细菌培养皿壁的细胞膜层;
S2:将所述细胞膜层转移到含有细胞诱导培养液中的培养瓶内,诱导生成人类纤维母细胞,传代培养5代,离心分离后得到人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的混合细胞,用流式细胞仪进行实时监测,控制人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的比例达到10:3时,即放入4℃冰箱内待用;其中,所述细胞诱导培养液按重量百分比计包括:15%胎牛血清、4%抗坏血酸-2-磷酸盐、5%胰岛素-转铁蛋白-硒离子、2%丙酮酸钠、6%血管内皮生长因子、3%血小板衍生生长因子、4%胰岛素样生长因子、1.5%白细胞介素-6、3%抗生素-抗真菌素,余量为DMEM-高糖培养液,脐带间充质干细胞在细胞诱导培养液中培养,能上调正常皮肤纤维母细胞中TGF-β2,HIF-1-α和PAI-1(p≤0.05)的mRNA(信使核糖核酸)转录表达。
S3:将所述中药提取物用所述磷酸缓冲液进行溶解,再将所述纳米磁体与营养复合物分别用1/3的所述生理盐水进行溶解,分别得到中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,待用;
S4:将所述磷脂与胆固醇溶解于10倍二者混合体积比的乙醚中,再将所述乙醚减压完全汽化,然后依次加入所述中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,在37℃水浴恒温下,通过超声波进行融合后,再放入磁化器内进行磁化,磁场为1000高斯,得到磁化载药脂质体;
S5:将所述小分子活性肽加入到所述磁化载药脂质体内,在25℃水浴下,利用搅拌器搅拌6h,搅拌速度为40r/min,使小分子活性肽完全黏附在磁化载药脂质体表面,然后在磁化器内放置3min,磁场为700高斯,得到中间体悬浮液;
S6:将S2中的所述混合细胞加入到所述中间体悬浮液内,在10℃下,利用搅拌器搅拌120min,搅拌速度为30r/min,使其发生抗原抗体反应,并最终将混合细胞通过小分子活性肽结合在磁化载药脂质体上,得到细胞-脂质体;
S7:将所述烟酰胺单核苷酸(NMN)、低氧诱导因子、人纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子、人体血小板、透明质酸钠混合后用余下的1/3生理盐水进行溶解,得到微环境培养液,并将所述微环境培养液加入到所述细胞-脂质体内,静置活化60min;
S8:最后加入所述复方电解质、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、渗透压调节剂,并利用所述重蒸馏水进行定容,既得到含有脐带间充质干细胞药物的注射液。
本实施例在注射前先将所述注射液放入到磁化器内磁化3min,将注射液进行磁化,既能够激活药物内部的细胞,又能激活人体内部细胞,提高药效及自身愈合能力。
本发明脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用:
选取患有慢性伤口的患者共100人,男女各50人,按照随机方法分为实验组1、实验组2、实验组3和对照组,每组25例,年龄均在35-70岁之间,其中实验组1、实验组2、实验组3为使用本发明药物进行治疗,对照组为普通方法治,症状改善疗效对比如下表所示。
组别 | 人数/人 | 显效/人 | 有效/人 | 无效/人 | 总有效率/% |
对照组 | 25 | 5 | 11 | 10 | 64 |
实验组1 | 25 | 7 | 14 | 4 | 84 |
实验组2 | 25 | 12 | 12 | 1 | 96 |
试验组3 | 25 | 13 | 9 | 3 | 88 |
从表1和表2可以看出,本发明药物组合物对于慢性伤口的治疗效果明显优于对照组。
尽管已参照其具体实施方案描述和阐明了本发明,但本领域技术人员会认识到,可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其作出各种改变、修改和取代。例如,由于被治疗特定病症的人的响应能力的变化,如上阐述的优选剂量以外的有效剂量可能适用。同样地,观察到的药理学响应可能根据和依赖所选特定活性化合物或是否存在药用载体以及制剂类型和所用给药模式而变,根据本发明的目的和实践预想到结果中的这类预期变化或差异。因此,本发明意在仅受下列权利要求的范围限制且这些权利要求应在合理的程度上尽可能广义地解释。
Claims (8)
1.一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述脐带间充质干细胞药物按照重量百分比计包括:8-10%脐带间充质干细胞、1-3%人类纤维母细胞、7-9%磷脂、7-9%胆固醇、2-4%纳米磁体、2-4%复方电解质、6-8%小分子活性肽、3-5%中药提取物、2-4%营养复合物、0.5-1%烟酰胺单核苷酸(NMN)、0.4-1.8%低氧诱导因子、0.3-1.2%人纤溶酶原激活物抑制因子1、0.8-1.5%转化生长因子、1-2%人体血小板、0.5-1.5%透明质酸钠、5-7%磷酸缓冲液、8-10%生理盐水、0.3-0.5%稳定剂、0.2-0.4%抗氧化剂、0.3-0.5%抗菌剂、0.5-1%渗透压调节剂、余量为重蒸馏水。
2.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述脐带间充质干细胞药物的制备方法包括以下步骤:
S1:将人脐带间充质干细胞经原代分离培养后,进行传代培养,取传代培养的P5-P20代人脐带间充质干细胞,在细菌培养皿中培养7-10天,至细胞达到70-80%的融合度,然后再加入体积比为1:1的0.25%胰蛋白酶与0.1%胶原酶的混合酶液,消化30-60min,再利用涡流混合器进行震荡5-10min,剥离吸附在细菌培养皿壁的细胞膜层;
S2:将所述细胞膜层转移到含有细胞诱导培养液中的培养瓶内,诱导生成人类纤维母细胞,传代培养3-5代,离心分离后得到人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的混合细胞,用流式细胞仪进行实时监测,控制人脐带间充质干细胞与人类纤维母细胞的比例达到8-10:1-3范围内时,即放入4℃冰箱内待用;
S3:将所述中药提取物用所述磷酸缓冲液进行溶解,再将所述纳米磁体与营养复合物分别用1/3的所述生理盐水进行溶解,分别得到中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,待用;
S4:将所述磷脂与胆固醇溶解于8-10倍二者混合体积比的乙醚中,再将所述乙醚减压完全汽化,然后依次加入所述中药提取物溶液、纳米磁体溶液、营养复合物溶液,在37℃水浴恒温下,通过超声波进行融合后,再放入磁化器内进行磁化,磁场为500-1000高斯,得到磁化载药脂质体;
S5:将所述小分子活性肽加入到所述磁化载药脂质体内,在20-25℃水浴下,利用搅拌器搅拌4-6h,搅拌速度为20-40r/min,使小分子活性肽完全黏附在磁化载药脂质体表面,然后在磁化器内放置1-3min,磁场为600-700高斯,得到中间体悬浮液;
S6:将S2中的所述混合细胞加入到所述中间体悬浮液内,在5-10℃下,利用搅拌器搅拌90-120min,搅拌速度为10-30r/min,使其发生抗原抗体反应,并最终将混合细胞通过小分子活性肽结合在磁化载药脂质体上,得到细胞-脂质体;
S7:将所述烟酰胺单核苷酸(NMN)、低氧诱导因子、人纤溶酶原激活物抑制因子1、转化生长因子、人体血小板、透明质酸钠混合后用余下的1/3生理盐水进行溶解,得到微环境培养液,并将所述微环境培养液加入到所述细胞-脂质体内,静置活化20-60min;
S8:最后加入所述复方电解质、稳定剂、抗氧化剂、抗菌剂、渗透压调节剂,并利用所述重蒸馏水进行定容,既得到含有脐带间充质干细胞药物的注射液。
3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述中药提取物是由黄芩苷、花青素、姜黄素、没食子鞣质、白藜芦醇以质量百分比为4:2:1:3:1配比而成。
4.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述营养复合物是由维生素E、维生素C、维生素B3、海洋多糖、α-亚麻酸以质量百分比为2:1:1:2:3配比而成。
5.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述复方电解质按照重量百分比计包括15-23%氯化钠、12-21%氯化镁、10-12%氨基酸钠、5-9%木糖醇、4-8%免疫球蛋白,余量为葡萄糖酸锌。
6.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述纳米磁铁为Fe3O4、Fe2O3、γ-Fe2O3、NiO、Co203中任意一种或几种组合,其中,纳米磁铁的粒径为20-80nm。
7.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,在注射前先将所述注射液放入到磁化器内磁化1-3min。
8.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用,其特征在于,所述纳米磁铁为Fe3O4、Fe2O3、γ-Fe2O3、NiO、Co203中任意一种。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180406 |
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