CN109666647A - 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109666647A
CN109666647A CN201811447628.0A CN201811447628A CN109666647A CN 109666647 A CN109666647 A CN 109666647A CN 201811447628 A CN201811447628 A CN 201811447628A CN 109666647 A CN109666647 A CN 109666647A
Authority
CN
China
Prior art keywords
igf
umbilical cord
stem cells
preparation
mesenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811447628.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109666647B (zh
Inventor
岳敏
田雨光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201811447628.0A priority Critical patent/CN109666647B/zh
Publication of CN109666647A publication Critical patent/CN109666647A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109666647B publication Critical patent/CN109666647B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。所述制备方法包括以下步骤：S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV‑IGF‑1重组质粒；S2.将S1所得pLV‑IGF‑1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF‑1的脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞经过表达IGF‑1基因后，细胞增殖速度加快，并且细胞IGF‑1的表达量增加；将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF‑1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果。

Description

一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程与生物医学工程技术领域，具体地，涉及一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是指局部脑组织包括神经细胞和胶质细胞及联系纤维由于供血障碍发生的病变、坏死或功能瞬态损耗。目前，缺血性脑血管疾病在全部脑血管病中約占80％，并且脑缺血疾病有着发生率高，死亡率高，复发率高，致残率高等特点。而我国是卒中高发的国家，每年新发脑卒中200万人，卒中死亡人数约250万人，年增长率达8.7％。临床上因大脑中动脉闭塞导致的缺血性脑血管病占绝大多数。目前，随着医疗水平和医疗服务条件的提高，特别是急救手段和治疗效果的提高，使得脑卒中患者的死亡率逐渐下降，而生存下来的脑卒中患者大约有75％的人遗留不同程序的致残，严重影响患者的日常生活活动能力和社交能力，给家庭和社会带来了巨大的负担，因此，研究脑缺血的治疗及康复，降低其死亡率和致残率，对提高患者的生活质量有着极大的意义。
干细胞是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞，主要存在于胚胎、骨髓、外周血、脐带血等处，而血液(外周血、脐带血)中的干细胞，目前发现有造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)两种。脐带血中干细胞含量丰富，明显超过外周血含量。MSCs是混合细胞群，不具备典型的形态特征，其表达的表面标志抗原具有非单一性，它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，目前没有找到MSCs的特异性抗原标记，鉴定MSCs主要是根据其形态、功能等。许多研究证明MSCs均标记为：SH2(+)、SH3 (+)、CD29(+)、CD44(+)、CD71(+)、CD90(+)、CD105(+)、CD106(+)、CD120a (+)、CD124(+)、CD166(+)。MSCs在体外可分化为神经样细胞。如在脑源性神经营养性因子、碱性成纤维生长因子的诱导或脑组织细胞共培养，MSCs能分化为具有神经元和神经胶质细胞标志的细胞。
脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞之一，其来源丰富、采集方便、安全、无伦理问题，且具有免疫调节作用等特点，决定了其在临床治疗方面具有很大的应用前景。目前干细胞的临床应用有两种方法：一是直接将脐带血间充质干细胞移植体内，通过体内的微环境诱导其为相应的细胞，发挥相应的作用；二是将脐带血间充质干细胞体外培养、定向诱导其分化为目的神经样细胞，然后通过一定的方法植入到体内，治疗相关神经系统疾病。脐带血间充质干细胞作为最有潜力的多潜能干细胞，具有多向分化潜能，在体外能够定向诱导分化为各种神经细胞，为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。
胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是由70个氨基酸组成的单链碱性多肽分子，分子量约为7649Da。IGF-1来源于体内许多细胞，通过自分泌、旁分泌和内分泌机制并与IGF-1受体(IGF-1R)结合发挥多种生理作用。大量的动物实验证明，IGF-1具有神经营养作用，不仅对大脑生长、发育、髓鞘的形成有重要的作用，而且是潜在的有丝分裂源，能够在颅脑损伤时能起到很好的神经保护作用以及抗凋亡作用。因此， IGF-1将来有可能作为ICVD的一种神经治疗药物而应用于临床。但是，目前尚未见有将 IGF-1作为外源基因对MSCs进行修饰，并用于治疗西藏小型猪脑损伤的相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，所述脐带间充质干细胞由IGF-1基因修饰，通过过表达IGF-1刺激细胞增殖速度加快，进而治疗小型猪脑损伤。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法中所述的pLV-IGF-1重组质粒、慢病毒颗粒和/或过表达IGF-1的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供IGF-1基因作为mir-338基因作用的靶点在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV-IGF-1重组质粒；
S2.将S1所得pLV-IGF-1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；
S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF-1 的脐带间充质干细胞。
本发明所述脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰后，细胞增殖速度加快，转染后的人脐带间充质干细胞用流式细胞仪检测，检测发现细胞表面抗原标志物CD90、CD105、CD146表达阳性，CD43、CD45表达阴性，处于未分化状态，并且转染后细胞IGF-1的表达量增加，转染后细胞形态由长梭形逐渐变为圆形或椭圆形，以后逐渐变为多角形；此外，发明人构建了西藏小型猪介入梗阻模型，将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF-1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果。行为学结果显示：缺血缺氧模型组西藏小型猪出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走；干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰组在治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走。综上，表明本发明所述过表达IGF-1的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。
优选地，所述慢病毒系统载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP_CD511B-1。
优选地，所述宿主细胞为293T细胞。
优选地，步骤S2中，所述慢病毒颗粒的MOI指数为10。
优选地，步骤S3中，转染时间为4h。
本发明还请求保护上述制备方法制备得到的基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。
本发明还请求保护上述pLV-IGF-1重组质粒、慢病毒颗粒和/或过表达IGF-1的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
此外，本发明人还构建了过表达mir-338的重组质粒，发现过表达mir338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后细胞中IGF-1的表达量降低，说明mir338和IGF-1是负向调节关系。因此，进一步构建了沉默mir-338的重组质粒，发现沉默mir-338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后细胞中IGF-1的表达量增加，对脑损伤有较好的治疗效果。
因此，本发明还请求保护IGF-1基因作为mir-338基因作用的靶点在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
优选地，所述制剂过表达IGF-1或沉默mir-338。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰后，细胞增殖速度加快，并且细胞IGF-1的表达量增加；将所述脐带间充质干细胞注射到脑损伤小型猪颅内，结果表明猪外周血及脑组织中IGF-1的表达水平上调，对脑损伤有较好的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的药物或制剂。此外，IGF-1基因还可作为mir-338基因作用的靶点，通过沉默 mir-338的表达进而促进IGF-1的表达，可有效治疗西藏小型猪的脑损伤情况。
附图说明
图1为人脐带血干细胞表面分子鉴定结果；其中，A为IgG，B为CD73，C为CD90， D为CD105，E为CD34。
图2为慢病毒转染结果，其中，A为pLV-IGF-1通过慢病毒转染脐带间充质干细胞后荧光显微镜镜下图，B为pLV-IGF-1通过慢病毒转染脐带间充质干细胞后普通显微镜的镜下图。
图3为实施例3中行为学检测结果；其中，A为正常对照组，B为模型组，C为干细胞治疗组治疗3d后，D为IGF-1干细胞治疗组治疗3d后，E为干细胞治疗组和IGF-1干细胞治疗组治疗7d后。
图4为实施例3中HE染色的病理结果。
图5为实施例3中Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果；其中，A为CD11b 免疫细胞化学染色的结果；B为GFAP免疫细胞化学染色的结果；C为Nestin免疫细胞化学染色的结果。
图6为过表达mir338的重组质粒转染脐带间充质干细胞后的显微镜图片；其中，A为荧光显微镜镜下图，B为普通显微镜镜下图。
图7为过表达mir338的重组质粒转染人脐带血间充质干细胞后细胞增殖情况。
图8为LentiCRISPR v2-mir338转染脐带间充质干细胞后的显微镜图片；其中，A为荧光显微镜镜下图；B为普通显微镜镜下图。
图9为实施例8中HE染色的病理结果。
图10为实施例8中Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果；其中，A为CD11b 免疫细胞化学的结果，B为GFAP免疫细胞化学的结果，C为Nestin免疫细胞化学的结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 IGF-1过表达慢病毒颗粒的构建及鉴定
1、目的质粒的获取及转化感受态细胞
采用慢病毒系统载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP_CD511B-1，将目的基因的cDNA序列连接到载体上，酶切位点：EcoRI/NotI，用基因合成的方法获得目的质粒pLV-IGF-1，重组质粒pLV-IGF-1的序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCAC CGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCA CTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCT GGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTT GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAG CGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTAC GCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGG GAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG TTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACT TAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATA GAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGG AGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAG AAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGAC GGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAA CTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGG GTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACG ACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATT CATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCA TTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACA GATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGT AGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGATACTAGTATTATGCCC AGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAA AATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAA GCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCTAGCGAAT TCTACAAGGTTAAGATGCACATCACATCCTCTTCGCATCTCTTCTACTTGGCCCTGTGCTTGCTCTCCTTCACCAGCTCTGCCACGGC TGGACCTGAGACCCTCTGTGGGGCTGAGCTGGTGGACGCTCTTCAGTTCGTGTGCGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACA GGGTACGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCACAGACGGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTGAGGAGGCTGGAGATGTACTGTGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCGGCCCGCTCCGTCCGTGCCCAGCGCCACACGGACATGCCCAAGGCTCAGAAGGAAGT ACATTTGAAGAACACAAGTAGAGGGAGTTCAGGAAACAAGAACTACAGAATGTAGGAAGACCTTCCTGAAGAGTGAAGAATGACATGC CGCTGGCAGGATCCTTCGCTCTGCACGAGTTACCTGTTAAACACCAGAAGACCTACCAAAAAAATAAGTTTGAAAACATTTCAAAAGA TGGGCATTCCCCCCAATGAAATACACAAGTAAACATTCCCGGCGGCCGCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGA GCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGG GAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCG CCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTC AGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTC AACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACGCTAGACGCCACCATGGAGAG CGACGAGAGCGGCCTGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGA GAGGGCACCCCCAAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACAC CAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGAC TTCAAGGTGGTGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGC ACCCCATGGGCGATAACGTGCTGGTGGGCAGCTTCGCCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTTCGTGGTGGACAG CCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGCTGCAC AGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCCATCGCCTTCGCCAGATCCCGCGCTCAGTCGTCCAATTCTGCCGTGGACGGCACCGCCGGACCCGGCTCCACCGGATCTCGCTAAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATT GACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATG GCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGT GCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCC TATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTG TCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCG GATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGA AAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATC TGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCT TATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATC ATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCA GAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAA ATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTG TAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGC CAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAA GAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGAC GAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCC TCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTC ACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCC TTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCT GCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGC AAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACT CACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTA AAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCC ATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTC CATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGC ATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGT GCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACT GCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATG CGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGC ATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGT TGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTT AGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAC CTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAG ACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCG CATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAA GGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG
重组质粒pLV-IGF-1加入预冷的感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μL L.B.液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200r/min 振荡培养45min；吸取100μL菌液涂布于Kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于LB液体培养基中培养(含 10μg/mL卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。
2、慢病毒颗粒的包装及MOI测定
采用pLV-IGF-1重组质粒与两个包装质粒(pMD2.G，pSPAX)对293T细胞进行共转染。经培养、富集后即得高滴度病毒浓缩液。病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI) 应用Lenti-X GoStix(Clontech，TaKaRa，CA)进行检测。未重组目的基因的空质粒pLV也同时被包装生产作为空载体对照组。
结果表明，慢病毒颗粒的MOI指数为10。
实施例2 IGF-1过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞(HUMSCs)
1、人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定
用含10％FBS的DMEM低糖培养基培养HUMSCs，将细胞置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。每日使用倒置显微镜观察细胞1次，隔2～4天换培养液一次。培养瓶中的细胞生长到80％～95％融合时进行细胞传代或收集细胞铺板培养。弃去旧培养液，加入 0.25％胰酶消化液2mL，细胞变圆﹑上浮后，加入4mL培养液终止消化，再转移至无菌离心管中，于1000r/min离心4min，弃上清液，以1:4～1:6比例转移至新的无菌培养瓶中培养。
弃培养瓶内旧培养基，PBS洗涤细胞三次，加入胰蛋白酶消化收集细胞。PBS洗涤细胞沉淀3次，用细胞染色缓冲液(含1％FBS的PBS)重悬细胞沉淀，并调整细胞密度为 3×106cells/mL。吸100μL细胞悬液加入到1.5mL管中，加入2μL抗体，轻轻混匀后，4℃孵育30min。加入1mL染色缓冲液洗涤细胞3次，于250×g离心5min，弃上清。加入400μL 染色缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测脐带血干细胞表面分子。
鉴定结果如图1所示，人脐带间充质干细胞低表达CD34、CD19、CD45、CD11b和 HLA-DR，表达率≤2％；高表达CD73、CD90、CD105，表达率≥95％。
2、慢病毒转染HUMSCs
HUMSCs于转染前一天以1×105cells/孔接种于6孔板，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养过夜。对于每一待转的6孔板的每孔，按如下准备：于一无菌的EP管中加入2μg 待转质粒，加入Opti-MEM无血清培养基至体积为200μL，轻轻吹打均匀，按转染试剂(μL) 与质粒(μg)1.5:1的比例加入3μL转染试剂到上述EP管内，轻轻吹打均匀，室温静置 20min。向6孔板每孔内加入200μL转染混合物，轻轻混匀，6孔板于37℃、5％CO2培养箱内继续培养。转染4h后，弃孔内液体，PBS冲洗一次后加入DMEM完全培养基继续培养48h，弃孔内培养基，收集细胞，提取细胞总RNA。
并在荧光显微镜和普通显微镜下观察慢病毒转染结果，结果如图2所示，表明pLV-IGF-1质粒在脐带间充质干细胞里高表达绿色荧光蛋白。
3、qPCR检测IGF-1的表达量
以细胞总RNA反转录产物为模板，采用荧光定量的方法，对经质粒转染后的HUCMSCs的IGF-1基因进行荧光定量分析。引物分别如下：
IGF-1 forward primer：5’-TCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAG-3’，
IGF-1 reverse primer：5’-GGGTGCGCAATACATCTCCAG-3’；
反应体系(10μL)：2μmol/L PCR forward primer 2μL，2μmol/L PCR reverseprimer 2μL， cDNA 2μL，50×Rox Reference Dye 0.4μL，加ddH2O至10.0μL。
扩增体系：95℃预变性10min；95℃10s，55℃20s，72℃35s，共40个循环；循环结束后升高到95℃。每个样本重复3次。相对表达量的结果用SPSS13.0统计软件的 One-WayAnova方法进行统计。
结果如表1所示，相比于空白对照组和PLv质粒(空载)转染组，pLV-IGF-1转染组和丹参注射液诱导组(阳性对照组)都能引起转染后的细胞IGF-1的表达量增加。
表1 IGF-1的表达量测定
4、MTT检测细胞增殖实验
收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度5.0～6.0×104Cells/mL，接种96孔板，每孔加100μL的细胞悬液约5000～6000个细胞，在37℃、5％CO2条件下孵育过夜。待细胞铺板孵育过夜后(16～24小时)，弃去原培养基，按以上分组及处理，置于37℃含5％CO2培养箱中孵育分别24、48、72小时后；分别向每孔中加入10μL5mg/mL MTT溶液，继续于细胞培养箱内培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养基，每孔加入200μL DMSO，置于摇床上室温低速振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪上测定OD490。以时间为横坐标，OD490为纵坐标绘制细胞生长曲线。
结果如表2所示，pLV-IGF-1质粒转染组和丹参注射液诱导组一样，细胞增殖较空白组和pLV质粒转染组快。
表2稳转细胞株增殖检测结果(MTT)
实施例3西藏小型猪介入梗阻模型的制备及IGF-1基因修饰的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗
1、西藏小型猪介入梗阻模型的制备
21只西藏小型猪(3～4月龄，体重10～15kg)，编号后，采用完全随机方法分成4组，放入半开放环境中饲养：对照组(3只)、介入梗阻模型组(5只)、MSC细胞治疗组(5只)、pUC-MSC-IGF-1治疗组(5只)、丹参注射液治疗组(3只)。室温28～30℃，监测心率、血压、血氧饱和度。颈外静脉内留置套管针作为静脉通道。
3％戊巴比妥钠(1mg/kg)，腹腔注射麻醉动物。新生猪仰卧位固定，钝性分离各层组织，暴露股动脉，仔细分离避免损神经，置线备用。于股动脉处用动脉夹夹闭，动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。全麻下经股动脉插管至小型猪的双侧咽升动脉进行血管造影，观察评估其脑血管解剖等的情况。实验过程中监测心率、血氧饱和度。
2、IGF-1基因修饰的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗
选择以西藏小型猪左侧尾状核为目标区进行穿刺注射。小型猪脑缺血后24小时，经 3％戊巴比妥钠(1mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，头皮正中切开，分离骨膜，暴露前囟，于颅骨背侧前囟后1.0mm，左旁开3.5mm处钻一直径为2.0mm的小孔，小型猪严格按照立体定位图谱及铸形标本测量，前囟后1.0mm，左旁开3.5mm，进针深度5.0mm位置进行穿刺。MSCs组、MSCs-IGF-1过表达和敲除组以0.2μL/min的速度恒速注射15mL脐带间充质干细胞，注射结束后，留针5min，缓缓移出针头。以同样方法注射等量PBS到对照组。
治疗后14天处死，通过行为学检测，Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色观察神经干细胞增殖、分化及在小型猪脑内分布情况，脑部HE染色的切片观察、脑部IGF-1 过表达的以及外周血中IGF-1含量的测定，通过荧光定量法检测IGF-1在间充质干细胞中的表达水平。
3、结果
(1)行为学检测
行为学结果显示(如图3所示)：缺血缺氧模型组西藏小型猪(图3B)出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走。干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经IGF-1基因修饰组在治疗3d后小型猪强直症状有所缓解(图3C、D)，治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走(图3E)。综上，表明本发明所述过表达IGF-1 的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。
(2)HE染色的病理结果
如图4所示，能够看出局部小脑皮层大面积坏死，残留组织松散，神经元大量减少，并伴有大量炎性细胞浸润，如黑色箭头所示。
(3)Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果
制备的细胞爬片培养约3d后，弃孔内旧培养基，PBS冲洗3次，预冷的4％多聚甲醛固定10min。分别加入Nestin、GFAP、CD11b抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，然后加入200μLFITC标记的二抗，于37℃、5％CO2、饱和湿度下孵育1h。PBS冲洗3次，然后加入DAPI染液，避光染核10min后用PBS冲洗，然后50％甘油封片后于荧光显微镜下观察。
结果如图5所示，阳性细胞数表达量明显增强。
(4)ELASA检测血液中IGF-1的含量
如表3所示，随着治疗时间的延长，血液中IGF-1的含量逐渐增加。
表3血液中IGF-1(ng/mL)的含量
第n天 1 2 3 Mean±SD
1 34.07 33.51 34.54 34.04±0.52
2 38.05 39.35 38.43 38.61±0.67
5 41.64 42.25 41.18 41.69±0.53
14 48.68 47.05 48.39 48.04±0.87
(5)荧光定量的方法检测脑组织的IGF-1的含量
如表4所示，相比于空白对照组，pLV-IGF-1转染组和丹参注射液诱导组(阳性对照组)都能引起脑组织中IGF-1的表达量增加。
表4脑组织中IGF-1的含量
综上所述，经IGF-1基因修饰的脐带间充质干细胞对西藏小型猪的脑损伤有显著的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的制剂或药物。
实施例4过表达mir-338慢病毒颗粒的构建及鉴定
1、目的质粒的获取
采用慢病毒系统载体pLVX-DsRed-Monomer-N1，将目的基因的cDNA序列连接到载体上，酶切位点：AsuII/BamHI，用基因合成的方法获得目的质粒 mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1，重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1的序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2：
TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAA CTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAG GCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGT TTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGG ACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCT TTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAA TAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAG TGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTT GCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATG GGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAA ATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAA ATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGC ATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGC GGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTG AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGG GTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAG CAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCC TTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTAC ACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAA GTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAAT AGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGA CCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCCTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAAT TACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATAAGCTTGGGAGTTCCG CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATA GTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTAC TTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTA ACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAT CGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAGGATCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCT CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGACAATGGTTTGACACCCACTTTGCAGGTTTAGACGAAGAGATGCGTACTGTCAAGCTGGCCTGTTCT CTGTCCCCGAGGCAGTCAGCCAGCACCCTGCAGCCCCGCGCCAACCCCACACTCTGCTAAGCCCTCGCTTTGGGGCTTGAGGGAGACA GACCCTGCTTCGAAGGACCCTGGAGGGAGGGTTCTGTCCTGCTTGGGCCAGGATGCCCAGCCCCTGGGGACCCCGGGGGGACATGCTGGAAGAAGTGGCGAAGGACACGTGGCCCCGTCAGCCCCAGACGCCGCACGGCTGTCCTCTCCAACAATATCCTGGTGCTGAGTGATGAC TCAGGCGACTCCAGCATCAGTGATTTTGTTGAAGAGGGCAGCTGCCAGCCTCCCGACCTGCCTGCCGGGCCCCAGCTGCCCTGCCCCC AACCCCAACCCACCCCACTCCACCCCCTAGGCCCAGGACACATGGCCCTGTAGCGATCCCCTGGCACGCAGACATGGGTTTTATGTGG GGAGGGACAGGCTGGGTTGGCCTCTGTCCCCACCCTGAGTCCTGAGCACAGAAGTAATACGGCAGCTGTGGTAATATCTACCCAGTAC CCTGTGCCTCCTCACACCCACGTGACCAGCCAGGCAGGGTTCAAAGCCAGCAGCCAAGGCAGGCTGGGTTGGGATCCACCGGTCGCCA CCATGGACAACACCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCAGTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACTACTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGCAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGG GACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACATGAAGCTGTCCTTCC CCGAGGGCTTCACCTGGGAGCGCTCCATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGGAGGTGCAGCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCAC CTTCATCTACAAGGTGAAGTTCAAGGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTGCCGGCTGGGAGCCCTCC ACCGAGAAGCTGTACCCCCAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCTCCCACGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTGCG ACTTCAAGACCGTGTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCAACCACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCAACCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAGCACGCCGAGGCCCGCCACTCCGGCTCCCAGTAGAGCGGCCGCGACTCTAGATAATTC TACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCC TCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCC CCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAG ATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGA GGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCTTACCATGA CCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCC CGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGAC ATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCG AGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAA GGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCG TCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGACCGCGTCTGGAACAATCAAC CTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCC TTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGG CCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCC TTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGC GGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGC GTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTAATTCTGCAGTCGAGACCTAGAAAAA CATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTC CAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGAGGGGACTGGA AGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCA ATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGA CAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGGACTT TCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTT GCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAA GCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGCCT TGACATTGCTAGCGTTTACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC TCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT GCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGT ATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGG TAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCG CCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGG CTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTA TCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACT ACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTG ATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCT AGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAG TGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGC TTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAA GGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGT TCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTA AGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGAC TGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCG CCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCA GTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAG GGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGC CACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAA ATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACTGGATAACTCA AGCTAACCAAAATCATCCCAAACTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGAT TCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAGT
2、重组质粒转化感受态细胞
重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1加入预冷的感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μL L.B.液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200r/min振荡培养45min；吸取100μL菌液涂布于Kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于 LB液体培养基中培养(含10μg/mL卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。
3、慢病毒颗粒的包装及MOI测定
采用mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1重组质粒与两个包装质粒(pMD2.G，pSPAX) 对293T细胞进行共转染。分别于第3天和第6天收集病毒液并使用Lenti-XConcentrator 慢病毒浓缩系统(Clontech，TaKaRa，CA)进行浓缩。病毒感染复数(multiplicity of infection， MOI)应用Lenti-X GoStix(Clontech，TaKaRa，CA)进行检测。未重组目的基因的空质粒pLVX-DsRed-Monomer-N也同时被包装生产作为空载体对照组。
结果表明，慢病毒颗粒的MOI指数为10。
实施例5 mir-338过表达慢病毒转染脐带间充质干细胞
1、参照实施例2所述方法进行人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定，以及转染HUMSCs，并采用qPCR检测IGF-1的表达量、MTT检测细胞增殖实验。
2、结果
(1)慢病毒质粒转染细胞
在荧光显微镜和普通显微镜下观察慢病毒转染结果，结果如图6所示，表明 mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1质粒在脐带间充质干细胞中高表达绿色荧光蛋白。
(2)qPCR检测IGF-1的表达量
如表5所示，过表达mir338的质粒转染脐带间充质干细胞后细胞中IGF-1的表达量降低，说明mir338和IGF-1是负向调节关系。
表5 IGF-1的表达量测定
(3)MTT检测细胞增殖实验结果
如表6和图7所示，过表达mir338的质粒转染人脐带血间充质干细胞后引起了细胞增殖减慢。
表6稳转细胞株增殖检测结果(MTT)
实施例6沉默mir-338慢病毒颗粒的构建及鉴定
1、目的基因获取
采用慢病毒系统载体LentiCRISPR v2，将目的基因的cDNA序列连接到载体上，酶切位点：BamHI/Apa I，用基因合成的方法获得目的质粒LentiCRISPR v2-mir338，重组质粒LentiCRISPR v2-mir338的序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:3：
TGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCA ATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGCGCGTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGG CTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGT AACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACC AGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATT TTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTC GGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGG CCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTA TATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGC AAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAAT TATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGC AGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCC AGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCT GGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGG AAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATG GAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAG AATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGAT AGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTT CAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTC GATTAGTGAACGGATCGGCACTGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTG GGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCA AAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGTTAATTAAGGTACCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATT TGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAG AAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTC GATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCAACAAAATCACTGATGCTGGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGAATTCGCTAGCTAGGTCTTGAAAGGAGT GGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCC GGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAG AAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCG AGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGA GATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATC TTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGA CAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTG GACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATG GCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCA GCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAG AACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGA CCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAG ATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCC ACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGA GAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAG GAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATA CGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAA GTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCA ACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGA AGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAA GTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAA AGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAG AAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGG CCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAG CCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATG TACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAA CTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAA CTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGA ACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGA TTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATC AAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGAT CCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTG CTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACA GCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGT GGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTC GAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGT GAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCAC AAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGT CCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCC TGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAG AGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAGCGACCTGCCGCCACAAAGAAGGCTGGACAGGCTAAGAAGAAGAAAGATTACAAAGACGATGACGATAAGGGATCCGGCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGA AGAGAATCCTGGACCGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCC GCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCA CGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGC GGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTG GCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGAGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGA GCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAACG CGTTAAGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTG GATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTC TCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATT GCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGT TGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCG GCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTTTAAGACC AATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAA GATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTA AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT TTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGT CTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGG ATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAG CGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTT CTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATT TCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAA GTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA GCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGC CCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCAC GTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGC CGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGAC GACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGG TGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGAC CGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGA TCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAG CATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGT ATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACA ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGC TTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCA CAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTT TTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATAC CAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAA GAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGC TGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGG TCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATT AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTC AGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAA GTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCG CAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGT TATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAAC CAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCA CTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAA GGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG AGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACG GATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCT TGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATC AATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAAC GACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATT TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGC CTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGG
2、重组质粒转化感受态细胞
重组质粒加入预冷的感受态细胞冰浴30min；42℃热敷90s(期间不要振荡)；再次冰浴2～3min；加入800μL L.B.液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200r/min振荡培养45min；吸取100μL菌液涂布于Kan抗性平板，并于培养箱中先正置培养1h，后倒置培养 12～16h。挑取抗性平板上的菌落，分别接种于LB液体培养基中培养(含10μg/mL卡那霉素)，于37℃、200r/min振荡培养过夜，用无内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒。
3、慢病毒颗粒的包装及MOI测定
采用LentiCRISPR v2-mir338重组质粒与两个包装质粒(pMD2.G，pSPAX)对293T细胞进行共转染。经培养、富集后即得高滴度病毒浓缩液。病毒感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)应用Lenti-X GoStix(Clontech，TaKaRa，CA)进行检测。未重组目的基因的空质粒LentiCRISPR v2也同时被包装生产作为空载体对照组。
结果表明，慢病毒颗粒的MOI指数为10。
实施例7 mir-338基因沉默慢病毒转染脐带间充质干细胞
1、参照实施例2所述方法进行人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定，以及转染HUMSCs，并采用qPCR检测IGF-1的表达量，MTT检测细胞增殖实验。
2、结果
(1)慢病毒质粒转染细胞
在荧光显微镜和普通显微镜下观察慢病毒转染结果，结果如图8所示，表明LentiCRISPR v2-mir338质粒在脐带间充质干细胞中高表达绿色荧光蛋白。
(2)qPCR检测IGF-1的表达量
结果如表7所示，LentiCRISPR v2-mir338转染组和丹参注射液诱导组都能引起转染后的细胞IGF-1的表达量增加。
表7 IGF-1的表达量测定
(2)MTT检测细胞增殖实验结果
结果如表8所示，LentiCRISPR v2-mir338质粒转染组和丹参注射液诱导组一样细胞增殖较空白组和LentiCRISPR v2质粒转染组快。
表8稳转细胞株增殖检测结果(MTT)
实施例8西藏小型猪介入梗阻模型的制备及基因修饰(沉默mir-338)的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗
1、西藏小型猪介入梗阻模型的制备
21只西藏小型猪(3～4月龄，体重10～15kg)，编号后，采用完全随机方法分成4组，放入半开放环境中饲养：对照组(3只)、介入梗阻模型组(5只)、MSC细胞治疗组(5只)、pUC-MSC-mir-338治疗组(5只)、丹参注射液治疗组(3只)。室温28～30℃，监测心率、血压、血氧饱和度。颈外静脉内留置套管针作为静脉通道。
3％戊巴比妥钠(1mg/kg)，腹腔注射麻醉动物。新生猪仰卧位固定，钝性分离各层组织，暴露股动脉，仔细分离避免损神经，置线备用。于股动脉处用动脉夹夹闭，动脉近心端及远心端结扎，中间剪断。全麻下经股动脉插管至小型猪的双侧咽升动脉进行血管造影，观察评估其脑血管解剖等的情况。实验过程中监测心率、血氧饱和度。
2、基因修饰(沉默mir-338)的脐带间充质干细胞对脑损伤的治疗
选择以左侧尾状核为目标区进行穿刺注射。小型猪脑缺血后24小时，经3％戊巴比妥钠(1mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪，头皮正中切开，分离骨膜，暴露前囟，于颅骨背侧前囟后1.0mm，左旁开3.5mm处钻一直径为2.0mm的小孔，小型猪严格按照立体定位图谱及铸形标本测量，前囟后1.0mm，左旁开3.5mm，进针深度5.0mm 位置进行穿刺。MSCs组和沉默mir-338组以0.2μL/min的速度恒速注射15mL脐带间充质干细胞，注射结束后，留针5min，缓缓移出针头。以同样方法注射等量PBS到对照组。
治疗后14天处死，通过行为学检测、Netin、CD116、GFAP免疫组织化学染色观察神经干细胞增殖、分化及在小型猪脑内分布情况，脑部HE染色的切片观察、脑部IGF-1 过表达的以及外周血中IGF-1含量的测定，通过荧光定量法检测IGF-1在间充质干细胞中的表达水平。
3、结果
(1)行为学检测
行为学结果显示：缺血缺氧模型组西藏小型猪出现明显的一侧偏瘫及抽搐的症状，无法站立行走。干细胞治疗组及脐带间充质干细胞经基因修饰组在治疗后7天小型猪出现明显的好转，抽搐停止，并可站立缓慢行走。综上，表明本发明所述沉默mir-338表达的脐带间充质干细胞可用于治疗西藏小型猪脑损伤，尤其对由脑缺血引起的脑损伤有较好的治疗效果。
(2)HE染色的病理结果
如图9所示，能够看出局部小脑皮层大面积坏死，残留组织松散，神经元大量减少，并伴有大量炎性细胞浸润，如黑色箭头所示。
(3)Netin、CD11b、GFAP免疫组织化学染色结果
制备的细胞爬片培养约3d后，弃孔内旧培养基，PBS冲洗3次，预冷的4％多聚甲醛固定10min。分别加入Nestin、GFAP、CD11b抗体，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，然后加入200μLFITC标记的二抗，于37℃、5％CO2、饱和湿度下孵育1h。PBS冲洗3次，然后加入DAPI染液，避光染核10min后用PBS冲洗，然后50％甘油封片后于荧光显微镜下观察。
结果如图10所示，阳性细胞数表达量明显增强。
(4)ELASA检测血液中IGF-1的含量
如表9所示，随着治疗时间的延长，血液中IGF-1的含量逐渐增加。
表9血液中IGF-1(ng/mL)的含量
第n天 1 2 3 Mean±SD
1 33.87 32.48 34.04 33.04±0.48
2 37.86 40.05 39.02 38.57±0.61
5 40.98 42.33 41.25 41.55±0.48
14 49.03 48.12 49.04 47.88±0.76
(5)荧光定量的方法检测脑组织的IGF-1的含量
如表10所示，相比于空白对照组，LentiCRISPR v2-mir338转染组和丹参注射液诱导组(阳性对照组)都能引起脑组织中IGF-1的表达量增加。
表10脑组织中IGF-1的含量
综上所述，经沉默mir338基因表达的脐带间充质干细胞对西藏小型猪的脑损伤有显著的治疗效果，可用于制备治疗脑损伤的制剂或药物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
<140> 2018114476280
<141> 2018-11-29
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8095
<212> DNA
<213> 重组质粒pLV-IGF-1(Recombinant plasmid)
<400> 1
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggttaacttt 1800
taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa agaatagtag acataatagc 1860
aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca aaaattcaaa attttatcga 1920
tactagtatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1980
gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 2040
tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 2100
ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 2160
caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 2220
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag attctagagc 2280
tagcgaattc tacaaggtta agatgcacat cacatcctct tcgcatctct tctacttggc 2340
cctgtgcttg ctctccttca ccagctctgc cacggctgga cctgagaccc tctgtggggc 2400
tgagctggtg gacgctcttc agttcgtgtg cggagacagg ggcttttatt tcaacaagcc 2460
cacagggtac ggctccagca gtcggagggc gccacagacg ggcatcgtgg atgagtgctg 2520
cttccggagc tgtgatctga ggaggctgga gatgtactgt gcacccctca agcctgccaa 2580
gtcggcccgc tccgtccgtg cccagcgcca cacggacatg cccaaggctc agaaggaagt 2640
acatttgaag aacacaagta gagggagttc aggaaacaag aactacagaa tgtaggaaga 2700
ccttcctgaa gagtgaagaa tgacatgccg ctggcaggat ccttcgctct gcacgagtta 2760
cctgttaaac accagaagac ctaccaaaaa aataagtttg aaaacatttc aaaagatggg 2820
cattcccccc aatgaaatac acaagtaaac attcccggcg gccgcaagga tctgcgatcg 2880
ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg 2940
aggggtcggc aattgaacgg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga 3000
tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt 3060
agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc tgaagcttcg 3120
aggggctcgc atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg 3180
gttgagtcgc gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta 3240
ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc 3300
tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt 3360
ttcgttttct gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta cgctagacgc 3420
caccatggag agcgacgaga gcggcctgcc cgccatggag atcgagtgcc gcatcaccgg 3480
caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc ccaagcaggg 3540
ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc cctacctgct 3600
gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg gctacgagaa 3660
ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg agaagtacga 3720
ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctac gaggccggcc gcgtgatcgg 3780
cgacttcaag gtggtgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca ccgacaagat 3840
catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg tgctggtggg 3900
cagcttcgcc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac tacagcttcg tggtggacag 3960
ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg gccccatgtt 4020
cgccttccgc cgcgtggagg agctgcacag caacaccgag ctgggcatcg tggagtacca 4080
gcacgccttc aagaccccca tcgccttcgc cagatcccgc gctcagtcgt ccaattctgc 4140
cgtggacggc accgccggac ccggctccac cggatctcgc taagtcgaca atcaacctct 4200
ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 4260
atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat 4320
tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 4380
caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat 4440
tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc 4500
ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga 4560
caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc 4620
cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga 4680
ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc 4740
tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga 4800
cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc 4860
taattcactc ccaacgaaaa taagatctgc tttttgcttg tactgggtct ctctggttag 4920
accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 4980
aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact 5040
agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc 5100
atcttattat tcagtattta taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggaact 5160
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 5220
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 5280
atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 5340
tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt 5400
ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctagacttt tgcagagacg gcccaaattc 5460
gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 5520
catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 5580
attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 5640
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 5700
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5760
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5820
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5880
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5940
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 6000
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 6060
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 6120
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6180
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6240
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 6300
ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 6360
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 6420
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 6480
tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 6540
atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 6600
aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 6660
ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 6720
tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 6780
ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 6840
tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 6900
aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 6960
gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 7020
tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 7080
cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 7140
tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 7200
ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 7260
cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 7320
actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 7380
ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 7440
aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 7500
ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 7560
atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 7620
tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 7680
gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 7740
ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 7800
gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt 7860
actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg 7920
catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc 7980
ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 8040
aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgcca agctg 8095
<210> 2
<211> 9393
<212> DNA
<213> 重组质粒mir-338p-pLVX-DsRed-Monomer-N1(Recombinant plasmid)
<400> 2
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 660
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 840
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 900
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 960
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1020
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1080
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1140
aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1200
tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1260
aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1320
gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1380
cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1440
gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500
ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560
actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620
gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680
aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740
ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800
tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860
actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920
cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980
cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040
gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100
aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160
acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2220
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2280
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2340
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2400
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2460
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2520
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2580
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2640
acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2700
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2760
tccatagaag acaccgactc tactagagga tcgctagcgc taccggactc agatctcgag 2820
ctcaagcttc gaattcgaca atggtttgac acccactttg caggtttaga cgaagagatg 2880
cgtactgtca agctggcctg ttctctgtcc ccgaggcagt cagccagcac cctgcagccc 2940
cgcgccaacc ccacactctg ctaagccctc gctttggggc ttgagggaga cagaccctgc 3000
ttcgaaggac cctggaggga gggttctgtc ctgcttgggc caggatgccc agcccctggg 3060
gaccccgggg ggacatgctg gaagaagtgg cgaaggacac gtggccccgt cagccccaga 3120
cgccgcacgg ctgtcctctc caacaatatc ctggtgctga gtgatgactc aggcgactcc 3180
agcatcagtg attttgttga agagggcagc tgccagcctc ccgacctgcc tgccgggccc 3240
cagctgccct gcccccaacc ccaacccacc ccactccacc ccctaggccc aggacacatg 3300
gccctgtagc gatcccctgg cacgcagaca tgggttttat gtggggaggg acaggctggg 3360
ttggcctctg tccccaccct gagtcctgag cacagaagta atacggcagc tgtggtaata 3420
tctacccagt accctgtgcc tcctcacacc cacgtgacca gccaggcagg gttcaaagcc 3480
agcagccaag gcaggctggg ttgggatcca ccggtcgcca ccatggacaa caccgaggac 3540
gtcatcaagg agttcatgca gttcaaggtg cgcatggagg gctccgtgaa cggccactac 3600
ttcgagatcg agggcgaggg cgagggcaag ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg 3660
caggtgacca agggcggccc cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc ccagttccag 3720
tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc gccgacatcc ccgactacat gaagctgtcc 3780
ttccccgagg gcttcacctg ggagcgctcc atgaacttcg aggacggcgg cgtggtggag 3840
gtgcagcagg actcctccct gcaggacggc accttcatct acaaggtgaa gttcaagggc 3900
gtgaacttcc ccgccgacgg ccccgtaatg cagaagaaga ctgccggctg ggagccctcc 3960
accgagaagc tgtaccccca ggacggcgtg ctgaagggcg agatctccca cgccctgaag 4020
ctgaaggacg gcggccacta cacctgcgac ttcaagaccg tgtacaaggc caagaagccc 4080
gtgcagctgc ccggcaacca ctacgtggac tccaagctgg acatcaccaa ccacaacgag 4140
gactacaccg tggtggagca gtacgagcac gccgaggccc gccactccgg ctcccagtag 4200
agcggccgcg actctagata attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct 4260
ggagcatgcg ctttagcagc cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct 4320
cgcacacatt ccacatccac cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc 4380
gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg 4440
tgcaggacgt gacaaatgga agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc 4500
gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc 4560
gctttctggg ctcagaggct gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc 4620
aggggcgggg cgggcgcccg aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag 4680
cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcagccca 4740
agcttaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca 4800
gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 4860
atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 4920
ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 4980
cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 5040
tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 5100
ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg 5160
gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 5220
ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 5280
tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 5340
gtgcctgacc gcgtctggaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact 5400
ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg 5460
tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg 5520
ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg 5580
tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg 5640
actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc 5700
tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaagctg 5760
acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc 5820
tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct 5880
ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc 5940
gcctccccgc ctggaattaa ttctgcagtc gagacctaga aaaacatgga gcaatcacaa 6000
gtagcaatac agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa gaggaggagg 6060
aggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg 6120
tagatcttag ccacttttta aaagaaaaga ggggactgga agggctaatt cactcccaac 6180
gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattagc 6240
agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc 6300
tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa aggagagaac accagcttgt 6360
tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtgtta gagtggaggt 6420
ttgacagccg cctagcattt catcacgtgg cccgagagct gcatccggag tacttcaaga 6480
actgctgata tcgagcttgc tacaagggac tttccgctgg ggactttcca gggaggcgtg 6540
gcctgggcgg gactggggag tggcgagccc tcagatcctg catataagca gctgcttttt 6600
gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta 6660
gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc 6720
cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa 6780
atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa 6840
tgaatatcag agagtgagag gccttgacat tgctagcgtt taccgtcgac ctctagctag 6900
agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 6960
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 7020
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 7080
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 7140
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 7200
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 7260
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 7320
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 7380
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 7440
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 7500
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 7560
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 7620
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 7680
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 7740
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 7800
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 7860
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 7920
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 7980
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 8040
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 8100
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 8160
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 8220
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 8280
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 8340
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 8400
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 8460
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 8520
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 8580
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 8640
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 8700
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 8760
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 8820
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 8880
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 8940
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 9000
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 9060
gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat caacttgttt attgcagctt ataatggtta 9120
caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 9180
ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcaact ggataactca 9240
agctaaccaa aatcatccca aacttcccac cccataccct attaccactg ccaattacct 9300
gtggtttcat ttactctaaa cctgtgattc ctctgaatta ttttcatttt aaagaaattg 9360
tatttgttaa atatgtacta caaacttagt agt 9393
<210> 3
<211> 13015
<212> DNA
<213> 重组质粒LentiCRISPR v2-mir338(Recombinant plasmid)
<400> 3
tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 60
caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 120
ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 180
gggaggtcta tataagcagc gcgttttgcc tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc 240
tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg 300
ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc 360
ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga 420
aagcgaaagg gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca 480
cggcaagagg cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct 540
agaaggagag agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat 600
gggaaaaaat tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat 660
gggcaagcag ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag 720
gctgtagaca aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta 780
gatcattata taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag 840
acaccaagga agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac 900
agcaagcggc cgctgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt 960
gaattatata aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca 1020
aagagaagag tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg 1080
ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc 1140
agacaattat tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg 1200
caacagcatc tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg 1260
gctgtggaaa gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 1320
ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag 1380
atttggaatc acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta 1440
atacactcct taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg 1500
gaattagata aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat 1560
ataaaattat tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta 1620
ctttctatag tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc 1680
ccaaccccga ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac 1740
agagacagat ccattcgatt agtgaacgga tcggcactgc gtgcgccaat tctgcagaca 1800
aatggcagta ttcatccaca attttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg 1860
ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat 1920
tacaaaaatt caaaattttc gggtttatta cagggacagc agagatccag tttggttaat 1980
taaggtaccg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 2040
gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 2100
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 2160
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 2220
tggaaaggac gaaacaccgc aacaaaatca ctgatgctgg agttttagag ctagaaatag 2280
caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt 2340
tttgaattcg ctagctaggt cttgaaagga gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg 2400
gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgatcc 2460
ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc 2520
ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt 2580
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gaccggttct agagcgctgc caccatggac 2640
aagaagtaca gcatcggcct ggacatcggc accaactctg tgggctgggc cgtgatcacc 2700
gacgagtaca aggtgcccag caagaaattc aaggtgctgg gcaacaccga ccggcacagc 2760
atcaagaaga acctgatcgg agccctgctg ttcgacagcg gcgaaacagc cgaggccacc 2820
cggctgaaga gaaccgccag aagaagatac accagacgga agaaccggat ctgctatctg 2880
caagagatct tcagcaacga gatggccaag gtggacgaca gcttcttcca cagactggaa 2940
gagtccttcc tggtggaaga ggataagaag cacgagcggc accccatctt cggcaacatc 3000
gtggacgagg tggcctacca cgagaagtac cccaccatct accacctgag aaagaaactg 3060
gtggacagca ccgacaaggc cgacctgcgg ctgatctatc tggccctggc ccacatgatc 3120
aagttccggg gccacttcct gatcgagggc gacctgaacc ccgacaacag cgacgtggac 3180
aagctgttca tccagctggt gcagacctac aaccagctgt tcgaggaaaa ccccatcaac 3240
gccagcggcg tggacgccaa ggccatcctg tctgccagac tgagcaagag cagacggctg 3300
gaaaatctga tcgcccagct gcccggcgag aagaagaatg gcctgttcgg aaacctgatt 3360
gccctgagcc tgggcctgac ccccaacttc aagagcaact tcgacctggc cgaggatgcc 3420
aaactgcagc tgagcaagga cacctacgac gacgacctgg acaacctgct ggcccagatc 3480
ggcgaccagt acgccgacct gtttctggcc gccaagaacc tgtccgacgc catcctgctg 3540
agcgacatcc tgagagtgaa caccgagatc accaaggccc ccctgagcgc ctctatgatc 3600
aagagatacg acgagcacca ccaggacctg accctgctga aagctctcgt gcggcagcag 3660
ctgcctgaga agtacaaaga gattttcttc gaccagagca agaacggcta cgccggctac 3720
attgacggcg gagccagcca ggaagagttc tacaagttca tcaagcccat cctggaaaag 3780
atggacggca ccgaggaact gctcgtgaag ctgaacagag aggacctgct gcggaagcag 3840
cggaccttcg acaacggcag catcccccac cagatccacc tgggagagct gcacgccatt 3900
ctgcggcggc aggaagattt ttacccattc ctgaaggaca accgggaaaa gatcgagaag 3960
atcctgacct tccgcatccc ctactacgtg ggccctctgg ccaggggaaa cagcagattc 4020
gcctggatga ccagaaagag cgaggaaacc atcaccccct ggaacttcga ggaagtggtg 4080
gacaagggcg cttccgccca gagcttcatc gagcggatga ccaacttcga taagaacctg 4140
cccaacgaga aggtgctgcc caagcacagc ctgctgtacg agtacttcac cgtgtataac 4200
gagctgacca aagtgaaata cgtgaccgag ggaatgagaa agcccgcctt cctgagcggc 4260
gagcagaaaa aggccatcgt ggacctgctg ttcaagacca accggaaagt gaccgtgaag 4320
cagctgaaag aggactactt caagaaaatc gagtgcttcg actccgtgga aatctccggc 4380
gtggaagatc ggttcaacgc ctccctgggc acataccacg atctgctgaa aattatcaag 4440
gacaaggact tcctggacaa tgaggaaaac gaggacattc tggaagatat cgtgctgacc 4500
ctgacactgt ttgaggacag agagatgatc gaggaacggc tgaaaaccta tgcccacctg 4560
ttcgacgaca aagtgatgaa gcagctgaag cggcggagat acaccggctg gggcaggctg 4620
agccggaagc tgatcaacgg catccgggac aagcagtccg gcaagacaat cctggatttc 4680
ctgaagtccg acggcttcgc caacagaaac ttcatgcagc tgatccacga cgacagcctg 4740
acctttaaag aggacatcca gaaagcccag gtgtccggcc agggcgatag cctgcacgag 4800
cacattgcca atctggccgg cagccccgcc attaagaagg gcatcctgca gacagtgaag 4860
gtggtggacg agctcgtgaa agtgatgggc cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa 4920
atggccagag agaaccagac cacccagaag ggacagaaga acagccgcga gagaatgaag 4980
cggatcgaag agggcatcaa agagctgggc agccagatcc tgaaagaaca ccccgtggaa 5040
aacacccagc tgcagaacga gaagctgtac ctgtactacc tgcagaatgg gcgggatatg 5100
tacgtggacc aggaactgga catcaaccgg ctgtccgact acgatgtgga ccatatcgtg 5160
cctcagagct ttctgaagga cgactccatc gacaacaagg tgctgaccag aagcgacaag 5220
aaccggggca agagcgacaa cgtgccctcc gaagaggtcg tgaagaagat gaagaactac 5280
tggcggcagc tgctgaacgc caagctgatt acccagagaa agttcgacaa tctgaccaag 5340
gccgagagag gcggcctgag cgaactggat aaggccggct tcatcaagag acagctggtg 5400
gaaacccggc agatcacaaa gcacgtggca cagatcctgg actcccggat gaacactaag 5460
tacgacgaga atgacaagct gatccgggaa gtgaaagtga tcaccctgaa gtccaagctg 5520
gtgtccgatt tccggaagga tttccagttt tacaaagtgc gcgagatcaa caactaccac 5580
cacgcccacg acgcctacct gaacgccgtc gtgggaaccg ccctgatcaa aaagtaccct 5640
aagctggaaa gcgagttcgt gtacggcgac tacaaggtgt acgacgtgcg gaagatgatc 5700
gccaagagcg agcaggaaat cggcaaggct accgccaagt acttcttcta cagcaacatc 5760
atgaactttt tcaagaccga gattaccctg gccaacggcg agatccggaa gcggcctctg 5820
atcgagacaa acggcgaaac cggggagatc gtgtgggata agggccggga ttttgccacc 5880
gtgcggaaag tgctgagcat gccccaagtg aatatcgtga aaaagaccga ggtgcagaca 5940
ggcggcttca gcaaagagtc tatcctgccc aagaggaaca gcgataagct gatcgccaga 6000
aagaaggact gggaccctaa gaagtacggc ggcttcgaca gccccaccgt ggcctattct 6060
gtgctggtgg tggccaaagt ggaaaagggc aagtccaaga aactgaagag tgtgaaagag 6120
ctgctgggga tcaccatcat ggaaagaagc agcttcgaga agaatcccat cgactttctg 6180
gaagccaagg gctacaaaga agtgaaaaag gacctgatca tcaagctgcc taagtactcc 6240
ctgttcgagc tggaaaacgg ccggaagaga atgctggcct ctgccggcga actgcagaag 6300
ggaaacgaac tggccctgcc ctccaaatat gtgaacttcc tgtacctggc cagccactat 6360
gagaagctga agggctcccc cgaggataat gagcagaaac agctgtttgt ggaacagcac 6420
aagcactacc tggacgagat catcgagcag atcagcgagt tctccaagag agtgatcctg 6480
gccgacgcta atctggacaa agtgctgtcc gcctacaaca agcaccggga taagcccatc 6540
agagagcagg ccgagaatat catccacctg tttaccctga ccaatctggg agcccctgcc 6600
gccttcaagt actttgacac caccatcgac cggaagaggt acaccagcac caaagaggtg 6660
ctggacgcca ccctgatcca ccagagcatc accggcctgt acgagacacg gatcgacctg 6720
tctcagctgg gaggcgacaa gcgacctgcc gccacaaaga aggctggaca ggctaagaag 6780
aagaaagatt acaaagacga tgacgataag ggatccggcg caacaaactt ctctctgctg 6840
aaacaagccg gagatgtcga agagaatcct ggaccgaccg agtacaagcc cacggtgcgc 6900
ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac 6960
taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg 7020
caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac 7080
ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc 7140
gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg 7200
gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcgga 7260
gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag 7320
gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc 7380
ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc 7440
acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgaacgcgtt aagtcgacaa tcaacctctg 7500
gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 7560
tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 7620
ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 7680
aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 7740
gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 7800
gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 7860
aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc 7920
acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 7980
cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 8040
cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcgtc gactttaaga ccaatgactt 8100
acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 8160
ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 8220
agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 8280
gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 8340
gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagggcccgt ttaaacccgc 8400
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 8460
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 8520
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 8580
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 8640
tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc 8700
gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 8760
ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 8820
cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 8880
gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 8940
gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 9000
ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 9060
tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt 9120
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 9180
aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 9240
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 9300
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 9360
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 9420
gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 9480
ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 9540
ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct 9600
caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg 9660
ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag 9720
cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct 9780
ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg 9840
gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc 9900
ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtgc tacgagattt 9960
cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg 10020
ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt 10080
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 10140
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 10200
ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 10260
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 10320
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 10380
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 10440
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 10500
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 10560
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 10620
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 10680
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 10740
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 10800
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 10860
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 10920
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 10980
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 11040
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 11100
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 11160
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 11220
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 11280
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 11340
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 11400
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 11460
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 11520
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 11580
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 11640
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 11700
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 11760
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 11820
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 11880
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 11940
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 12000
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 12060
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 12120
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 12180
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 12240
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 12300
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 12360
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc gacggatcgg gagatctccc 12420
gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat 12480
ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca 12540
acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg 12600
ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt gattattgac tagttattaa 12660
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 12720
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 12780
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 12840
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 12900
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 12960
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catgg 13015

Claims (9)

1.一种过表达IGF-1的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将目的基因插入慢病毒系统载体中，构建pLV-IGF-1重组质粒；
S2.将S1所得pLV-IGF-1重组质粒与包装质粒共转染宿主细胞，制备得到慢病毒颗粒；
S3.将S2所得慢病毒颗粒转染脐带间充质干细胞，即得到基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述慢病毒系统载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP_CD511B-1。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为293T细胞。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述慢病毒颗粒的MOI指数为10。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中，转染时间为4h。
6.权利要求1～5任一所述制备方法制备得到的基因工程化的过表达IGF-1的脐带间充质干细胞。
7.权利要求1中所述的pLV-IGF-1重组质粒、慢病毒颗粒和/或过表达IGF-1的脐带间充质干细胞在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
8.IGF-1基因作为mir-338基因作用的靶点在制备治疗脑损伤的制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述制剂过表达IGF-1或沉默mir-338。
CN201811447628.0A 2018-11-29 2018-11-29 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用 Active CN109666647B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811447628.0A CN109666647B (zh) 2018-11-29 2018-11-29 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811447628.0A CN109666647B (zh) 2018-11-29 2018-11-29 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109666647A true CN109666647A (zh) 2019-04-23
CN109666647B CN109666647B (zh) 2022-04-19

Family

ID=66143473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811447628.0A Active CN109666647B (zh) 2018-11-29 2018-11-29 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109666647B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113521102A (zh) * 2021-06-18 2021-10-22 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用
CN114058591A (zh) * 2021-11-17 2022-02-18 中国人民解放军空军军医大学 一种重组间充质干细胞及其应用
CN114317430A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 河北银丰鼎诚生物技术有限公司 一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090232782A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Yu-Show Fu Method for treating brain ischemic injury through transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells
CN106591226A (zh) * 2016-11-23 2017-04-26 昆明医科大学 一种适用于人脐带间充质干细胞的制备方法及应用
CN107875171A (zh) * 2017-12-08 2018-04-06 深圳市莱利赛生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090232782A1 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 Yu-Show Fu Method for treating brain ischemic injury through transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells
CN106591226A (zh) * 2016-11-23 2017-04-26 昆明医科大学 一种适用于人脐带间充质干细胞的制备方法及应用
CN107875171A (zh) * 2017-12-08 2018-04-06 深圳市莱利赛生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞药物在促进皮肤伤口愈合中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
方肇勤 等: "《分子生物学技术在中医药研究中的应用》", 30 April 2018, 上海科学技术出版社 *
王楸 等: "IGF-1对新生鼠低氧缺血性脑损伤的治疗作用", 《温州医学院学报》 *
田雨光 等: "西藏小型猪胰岛素样生长因子-1真核表达质粒在脐带间充质干细胞中的表达", 《黑龙江畜牧兽医》 *
范雪 等: "脑室内移植hUC-MSCs对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的保护作用", 《四川大学学报(医学版)》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113521102A (zh) * 2021-06-18 2021-10-22 北京臻溪谷医学研究中心（有限合伙） 一种可用于神经修复的干细胞凝胶及其制备方法和应用
CN114058591A (zh) * 2021-11-17 2022-02-18 中国人民解放军空军军医大学 一种重组间充质干细胞及其应用
CN114317430A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 河北银丰鼎诚生物技术有限公司 一种适用于脐血来源免疫细胞扩增的培养液

Also Published As

Publication number Publication date
CN109666647B (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200362011A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US7527966B2 (en) Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector
CN101918558B (zh) 流感的治疗及预防
CN109666647B (zh) 一种过表达igf-1的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
AU2013344512B2 (en) Recombinant adenoviruses and use thereof
CN101605899B (zh) 用于大量生产重组蛋白质的新载体和表达细胞系以及使用其生产重组蛋白质的方法
CA3112654A1 (en) Recombinant poxviruses for cancer immunotherapy
CN108348594A (zh) 犬科动物细小病毒(cpv)病毒样颗粒(vlp)疫苗及其用途
CN112175927B (zh) 一种碱基编辑工具及其用途
CN114181957B (zh) 一种基于病毒加帽酶的稳定t7表达系统及其在真核生物中表达蛋白质的方法
US7339030B2 (en) Human semaphorin L (H-SemaL) and corresponding semaphorins in other species
CA2443258A1 (en) Replicons derived from positive strand rna virus genomes useful for the production of heterologous proteins
CN114026242A (zh) 具有髓鞘蛋白零启动子的aav载体及其用于治疗雪旺细胞相关疾病如charcot-marie-tooth疾病的用途
CN112877292A (zh) 产生人抗体的细胞
US20030180740A1 (en) Differential expression screening method
CN109762846B (zh) 利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的galcc1586t突变的试剂和方法
CN111041027B (zh) 一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用
KR20230142712A (ko) 아데노-연관된 바이러스(aav) 생산
CN109609554B (zh) 一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
CN116549630A (zh) 一种由腺相关病毒载体介导表达的抗血管内皮生长因子基因药物及其制备方法和应用
CN110699381A (zh) 地中海贫血病基因治疗载体构建方法及其用途
CN111801422A (zh) 基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统
CN112442512A (zh) 基于tRNA-gRNA-cRNA进行日本青鳉胚胎和细胞的基因编辑系统
KR102335524B1 (ko) 뉴캐슬병 바이러스 벡터 기반 pten 유전자 삽입 재조합 뉴캐슬병 바이러스를 이용한 뇌종양 치료용 암용해바이러스 및 이를 이용한 뇌종양 치료용 조성물
KR20230072149A (ko) 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant