KR20230072149A - 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 - Google Patents
강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 백신 접종 초기, 강력한 세포성 면역반응의 유도를 통해 체액성 면역반응을 동시에 유도하는 한편, 모체이행항체 (MDA, maternally-derived antibody) 존재 시 B 세포 수용체의 자극을 통해 모치이행항체의 간섭 극복 및 능동면역이 가능하게 한 백신 조성물과 상기 조성물을 이용한 구제역의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 강력한 적응성(세포성·체액성) 면역반응의 유도를 통해 모체이행항체의 간섭을 극복하기 위해, 구제역 O형 백신주 O1 Manisa-O PanAsia2 (O1 M-O PA2)에 ‘C3d 유전자(B 세포 에피토프)’를 삽입한 면역증강 재조합 구제역 바이러스, 면역원성이 증가된 구제역 바이러스 불활화 항원의 분리·정제 방법 및 모체이행항체(maternally-derived antibody, MDA) 간섭 극복용 구제역 백신 조성물로서의 용도에 관한 것이다.
구제역(foot-and-mouth disease, FMD) 백신은 소와 돼지 모두에서 정기적, 반복적인 백신 접종이 요구되며, 이러한 백신 접종에 의해 모체에서 유도된 항체가 태반 또는 초유 섭취를 통해 모체이행항체의 형태로 송아지 또는 자돈에게 전달되어 수동면역(passive immunity)을 형성한다. 모체이행항체는 송아지 및 자돈에서 초기 구제역 바이러스 감염 시, 숙주(host) 방어효과를 나타내는 반면, 지속력이 짧고 어린 주령의 동물에 구제역 백신 조기 접종 시, 수동면역에 의한 간섭(plasma cell, 기억 B 세포로부터 항원-특이적인 항체 생산을 억제함으로써 면역학적 관용 기작을 초래)을 유발하여, 백신의 효능 저해 및 능동면역(active immunity) 형성을 억제하는 부정적인 영향을 미친다. 현재 구제역 백신 예방접종 프로그램은 송아지 및 자돈의 경우, 모체이행항체 수준이 감소하는 시점인 2개월 령 이후에 접종하도록 권고하고 있다.
개체에 따라 모체이행항체 수준, 역가 및 반감기 등이 다르므로, 현장에서 적절한 구제역 백신 접종 시기를 결정하는데 어려움이 따른다. 또한 상업적으로 이용되고 있는 현 구제역 백신은 일반적으로 모체이행항체에 의한 간섭의 극복이 어려워, 백신 접종에 의한 능동면역 형성이 저해되는 한계점이 있다.
한편 구제역 바이러스(FMD virus, FMDV)는 Aphthovirus 속(Family: Picornaviridae)에 속하며 O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 및 SAT3의 7가지 혈청형으로 분류된다. VP1 단백질에 해당하는 FMDV 게놈 영역에서 85% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 바이러스는 단일 혈청형을 형성한다. 이들은 일반적으로 지리적으로 제한되어 있으며 토포타입으로 구분된다. FMDV는 높은 유전적, 항원적 변이를 보여 하나의 혈청형에 의해 유도된 항체가 다른 혈청형을 중화할 수 없어 백신 접종 시 교차 방어가 되지 않는다. 그럼에도 불구하고 백신 접종은 구제역 발생 국가에서 질병을 예방하고 통제하기 위해 널리 사용되고 있다.
B 세포의 활성화 경로는 다음과 같이 크게 세 가지로 나뉜다: 1) T 세포 의존성 경로, 2) T 세포 비-의존성 type I 경로, 3) T 세포 비-의존성 type II 경로. 이 중 T 세포 의존성 경로는 TCR/MHC, CD40L/CD40 등을 통해 B 세포가 활성화되는 전형적인 경로이며, T 세포 비-의존성 경로 type I은 pathogen-associated molecular pattern (PAMP)이 패턴 인식 수용체(Pattern-recognition receptors, PRRs)를 자극하여 B 세포를 직접적으로 활성화시키는 경우로 숙주 내에서 드물게 일어나는 경로로 알려져 있다. 마지막으로 T 세포 비-의존성 type II 경로는 B 세포 수용체(receptor)인 CD21, CD19, 및 CD81 등을 항원 또는 C3d와 같은 B 세포 에피토프가 자극함으로써 B 세포를 활성화시키는 경로이다. 숙주 내 모체이행항체 존재 시, 면역 내성 및 관용(immune tolerance) 기작에 의해 T 세포로의 항원 제시, 세포성 면역반응 유도 및 T 세포 의존성 경로를 통한 B 세포의 활성화가 어려우므로, T 세포 비-의존적 경로를 통해 B 세포를 직접적으로 활성화시키거나, 강력한 세포성 면역반응 유도를 통해 T 세포를 지속적으로 자극해야 한다.
따라서, 본 발명에서는 현재 시판 중인 구제역 백신의 주요 한계점으로 지적되고 있는 모체이행항체의 간섭 현상을 극복하기 위해, B 세포 에피토프인 C3d를 통해 B 세포 표면의 수용체를 자극함으로써 모체이행항체 간섭을 극복하고자 후보 물질로 C3d의 활성 부위를 선정하였고, O PA2 P1 backbone (VP1 부위)에 이를 삽입하여 FMDV O형의 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주, 이로부터 분리·정제한 면역증강 항원 및 이를 포함하는 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 조성물을 개발하였다.
Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).
Lee, M. J. et al. Advanced foot-and-mouth disease vaccine platform for stimulation of simultaneous cellular and humoral immune responses. Vaccines (Basel) 8, 254 (2020).
상기와 같은 배경 하에 본 발명은 현재 시판 중인 구제역 백신의 한계점인 모체이행항체의 간섭 현상을 극복하기 위해, B 세포 에피토프인 C3d를 통해 B세포 표면의 수용체를 직접적으로 자극함으로써 모체이행항체 간섭을 극복하고자 하였다.
따라서 본 발명의 목적은 현재 상용되고 있는 구제역 백신의 한계점으로 지적되고 있는 모체이행항체의 간섭 현상에 의한 구제역 백신-매개 면역반응 유도의 어려움을 극복하기 위해, 구제역 O형 백신주 O1 Manisa-O PA2-R (O1 M-O PA2, 이하 ‘O PA2’로 표기함)에 ‘C3d 유전자(B 세포 에피토프)’를 삽입한 면역증강 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 하며, 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 재조합 구제역 바이러스에서 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법 및 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 항원을 분리·정제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스의 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있으며, 상기 재조합 구제역 바이러스는 제한되는 것은 아니지만, 구제역 바이러스 O형 또는 A형일 수 있다.
구제역 O형 재조합 바이러스는 서열번호 8의 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있으며, 구제역 A형 재조합 바이러스는 서열번호 11의 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있다.
상기 재조합 구제역 바이러스를 제조하기 위해 백본(backbone)에 삽입하는 후보 물질로 C3d의 활성 부위(active site) (13 amino acids)를 선정하였고, 상기 C3d의 활성 부위는 서열번호 4(이를 코딩하는 염기서열은 서열번호 5)를 갖는다.
이를 O PA2 또는 A22 P1 backbone (VP1 부위)에 삽입하여 FMDV O형인 O PA2-C3d, FMDV A형인 A22-C3d와 같은 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신용 조성물을 제공한다.
또한, 이로부터 분리·정제한 면역증강 항원 및 이를 포함하는 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트 또는 구제역 진단 키트 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 상기 구제역 진단 키트 또는 구제역 진단 키트 조성물을 이용한 구제역 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 O형 또는 A형을 기초로 한다.
O형은 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 일 실시예에서 O1-Manisa일 수 있다.
A형은 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 일 실시예에서 아형인 A22일 수 있고, 바람직하게는 A22/Iraq/24/64일 수 있다.
본 발명에서 용어 "플라스미드(plasmid)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 플라스미드는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker) 등을 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.
상기 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LFBK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 구제역 백신 조성물은 본 발명의 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리, 정제된 항원을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서의 구제역 백신 조성물, 구제역 진단 키트, 구제역 진단 키트 조성물에 포함되는 재조합 구제역 바이러스는 재조합 구제역 바이러스 O형, A형 각각 또는 이들의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명에서의 구제역 백신 조성물, 구제역 진단 키트, 구제역 진단 키트 조성물에 포함되는 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원은 재조합 구제역 바이러스 O형, A형으로부터 각각 유래된 것 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물을 포함하는 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.
상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물은 1/640 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 1/40 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 사람을 제외한 돼지, 양, 염소, 사슴 및 야생 반추류 등의 우제류에 투여될 수 있다.
또한, 상기 백신조성물은 당 업계에서 통상적으로 허용 가능한 담체, 충진제，증량제，결합제，습윤제，붕해제，계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 투여(또는 주입)될 수 있다. 투여는 피하주사，근육내 주사，피하내 주사，복막내 주사，비강투여，구강투여，경피투여 또는 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 백신 접종 초기, 강력한 세포성 면역반응의 유도를 통해 체액성 면역반응을 동시에 유도하는 한편, MDA 존재 시 B 세포 수용체의 자극을 통해 MDA의 간섭 극복 및 능동면역이 가능하게 한 백신 조성물을 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 A형 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 O PA2, A22에서 분리 및 정제된 항원의 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 O PA2 및 A22에서 분리 및 정제된 항원의 병용 투여 시, 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명에 따른 재조합 구제역 O형 바이러스의 실험 전략(A)과 생존율(B), 체중 변화(C)를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명에 따른 재조합 구제역 A형 바이러스의 실험 전략(D)과 생존율(E), 체중 변화(F)를 나타낸 것이다.
도 5은 마우스에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종 및 면역반응 유도 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종 전략을 나타낸 것이다.
도 6b는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(SP O, A ELISA에 의한 항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(중화항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 면역반응 유전자(사이토카인, 공동 자극 분자 등) 발현 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스를 이용하여 정제된 항원(146s particle)의 전자현미경(TEM) 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 A형 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 O PA2, A22에서 분리 및 정제된 항원의 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 O PA2 및 A22에서 분리 및 정제된 항원의 병용 투여 시, 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명에 따른 재조합 구제역 O형 바이러스의 실험 전략(A)과 생존율(B), 체중 변화(C)를 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명에 따른 재조합 구제역 A형 바이러스의 실험 전략(D)과 생존율(E), 체중 변화(F)를 나타낸 것이다.
도 5은 마우스에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종 및 면역반응 유도 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종 전략을 나타낸 것이다.
도 6b는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(SP O, A ELISA에 의한 항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(중화항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스를 포함하는 백신 접종에 따른 면역반응 유전자(사이토카인, 공동 자극 분자 등) 발현 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스를 포함하는 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스를 이용하여 정제된 항원(146s particle)의 전자현미경(TEM) 관찰 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
1. 재조합 플라스미드 제조
재조합 플라스미드는 Lee et al.(Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).)에 의해 기술된 바와 같이 제조되었다. 전체 FMD- O1-Manisa 바이러스 게놈(GenBank Accession No. AY593823.1)을 PCR로 증폭하였다.
(1) 재조합 구제역 O형 바이러스 제조를 위한 재조합 플라스미드 제작
증폭된 O1-Manisa 게놈(서열번호 1)을 플라스미드(pBluescript SK II)에 삽입하여 pO1-Manisa (pO1 M) 플라스미드를 제조하였다. 제조된 pO1 M에서 P1 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 O-혈청형 FMDV O PA2(서열번호 2)(GenBank Accession No. AY593829.1)의 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환되었고 (GenBank 수탁 번호 AY593764.1)에서 pO1 M-O PA2 P1(서열번호 3)을 사용하여 플라스미드를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 플라스미드(pO1 M-O PA2 P1)를 이용하여 아미노산 잔기 서열(GKQLYNVEATSYA, 서열번호 5)에 해당하는 B 세포 에피토프 서열(C3d 서열(GGTAAGCAGCTCTACAACGTGGAGGCCACATCCTATGCC, 서열번호 4)을 VP1 서열의 [PA2-C3d: 456 및 457 염기쌍 위치(152 및 153 아미노산 위치, 즉 pO1 M-O PA2 P1 서열의 2025 및 2026번째 염기) 사이에 삽입하였다. 그런 다음, PCR 템플릿으로 pO1 M-A22 P1 300 ng/μL, 10pmole/μL 프라이머 C3d F(5'- GGAGGCCACATCCTATGCCCGCGAGAGGCCCTAGGTCGC-3', 서열번호 6) 1μL, 10pmole/μL 프라이머 C3d R(5') 1μL - ACGTTGTAGAGCTGCTTACCGCGAGGGTCGCCGCTCAGCT-3', 서열번호 7)는 이전 연구에서 사용한 것과 동일한 자가 결찰(self-ligating) 방법으로 표적 플라스미드를 제조하는 데 사용되었다. 최종적으로 제조된 재조합 플라스미드는 서열번호 8과 같다.
(2) 재조합 구제역 A형 바이러스 제조를 위한 재조합 플라스미드 제작
증폭된 O1-Manisa 게놈(서열번호 1)을 플라스미드(pBluescript SK II)에 삽입하여 pO-Manisa (pO1 M) 플라스미드를 제조하였다. 제조된 pO1 M에서 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 A-혈청형 FMDV A22/Iraq/24/64 (GenBank Accession No. AY593764.1)(서열번호 9)의 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환되었고 (GenBank 수탁 번호 AY593764.1)에서 O1 M-A22 P1을 사용하여 플라스미드(서열번호 10)를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 플라스미드(O1 M-A22 P1)를 이용하여 아미노산 잔기 서열(GKQLYNVEATSYA, 서열번호 5)에 해당하는 B 세포 에피토프 서열(C3d 서열(GGTAAGCAGCTCTACAACGTGGAGGCCACATCCTATGCC, 서열번호 4)을 VP1 서열의 [PA2-C3d: 453 및 454 염기쌍 위치(151 및 152 아미노산 위치, 즉 pO1 M-O PA2 P1 서열의 2025 및 2026번째 염기), 사이에 삽입하였다. 그런 다음, PCR 템플릿으로 O1 M-A22 P1 300 ng/μL, 10 pmole/μL 프라이머 C3d F(5'- GGAGGCCACATCCTATGCCCGCGAGAGGCCCTAGGTCGC-3', 서열번호 6) 1μL, 10 pmole/μL 프라이머 C3d R(5') 1 μL - ACGTTGTAGAGCTGCTTACCGCGAGGGTCGCCGCTCAGCT-3', 서열번호 7)는 이전 연구에서 사용한 것과 동일한 자가 결찰(self-ligating) 방법으로 표적 플라스미드를 제조하는 데 사용되었다. 최종적으로 제조된 재조합 플라스미드는 서열번호 11과 같다.
도 1a 및 1b는 각각 O PA2-C3d 및 A22-C3d에 대한 최종 플라스미드의 개략도를 나타낸다.
PCR 조건은 다음과 같다: 10 μL의 5x Phusion HF 완충액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1 μL의 10 mM dNTP(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 μL의 2 U/μL Phusion DNA 중합효소 (Thermo Scientific) 및 35 μL의 멸균 증류수를 98℃에서 30초, 98℃에서 10초, 65℃에서 20초, 72℃에서 2분 및 30초 동안 25 사이클 간 증폭했고, 최종 사이클은 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 다음으로, 1 μL의 DpnI(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 25 μL의 PCR 생성물에 첨가하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 35 μL의 멸균 증류수, 5 μL의 Ligation High(TOYOBO, 오사카, 일본) 및 1 μL의 5 U/μL T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(TOYOBO, 오사카, 일본)를 4 μL의 DpnI 처리 제품에 첨가하였다. 혼합물을 16℃ 수조에서 1시간 동안 결찰시켰다.
결찰 후, 플라스미드는 제조업체의 프로토콜에 따라 100 μL의 DH5α 세포(Yeast Biotech, Taipei, Taiwan)로 형질전환되었다. 형질전환된 세포를 암피실린을 함유한 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.
피펫 팁이 있는 플레이트에서 콜로니를 선택하고 18 μL의 멸균 증류수, 1 μL의 10 pmol 포워드 유니버설 프라이머 VP1(5'- AGNGCNGGNAARTTTGA-3')(서열번호 12) 및 1 μL의 10 pmol/μL 역방향 유니버설 프라이머와 혼합하였다. 프라이머 VP1(5'- CATGTCNTCCATCTGGTT-3')(서열번호 13)을 콜로니 PCR 튜브에 넣고 94℃에서 5분, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분, 마지막 사이클은 72℃에서 5분간 수행하여 총 25 사이클의 PCR 증폭을 수행하였다. 상기 범용(universal) 프라이머에서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 5 μL의 PCR 샘플을 1 μL의 6x 로딩 버퍼(DYNE BIO, 경기도, 한국)와 혼합한 후 아가로스 겔에 로딩하였다. 그런 다음, 5 μL의 100 bp 마커(DYNE BIO)도 겔에 로딩되었다. 100V에서 30분 동안 전기영동한 후 밴드를 Gel Doc으로 평가하였다. 밴드 평가 후, 5 μL의 PCR 산물을 2 μL의 ExoSAP(Thermo Scientific)와 혼합하고 37℃에서 15분 및 85℃에서 15분 동안 PCR로 증폭하였다. VP1에 대한 에피토프의 삽입은 전체 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 염기서열을 확인한 후, 콜로니를 암피실린이 함유된 LB 배지 200 mL에 넣고 37℃에서 밤새도록 흔들어 주면서 배양하였다. Midi prep (MACHEREYNAGEL, Duren, Germany)을 사용하여 플라스미드를 제조하였다.
2. 면역증강 재조합 구제역 바이러스 준비
재조합 구제역 바이러스는 Lipofectamine 3000 Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 위에서 제조한 재조합 플라스미드로 BHKT7-9 (T7 RNA 중합효소를 발현하는 세포주)를 형질감염 시킨 후 2-3일 동안 배양하여 회수하였다. 이후 준비된 바이러스는 바이러스 증식을 위해 태아 염소 혀(ZZ-R) 세포 또는 아기 햄스터 신장-21(BHK-21) 세포에 계대되었다.
3. 표면에 C3d-에피토프를 제시하는 재조합 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 항원(불활화 바이러스)의 정제
정제된 항원은 변형된 Lee et al.(비특허문헌 2)에 의해 기술된 방법에 따라 역유전학에 의해 P1의 신속한 표현형(참조된 서열)에 대해 구성된 재조합 면역자극 FMDV O PA2-C3d 및 A22-C3d로 감염된 BHK-21 세포에서 제조되었다.
바이러스 감염을 위해 배양 배지를 무혈청 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM; HyClone, Logan, UT, USA)로 교체하고 세포를 5% CO2, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 바이러스를 접종하였다. 그런 다음 세포 외 바이러스를 제거하였다. 감염 24시간 후, 진탕 인큐베이터에서 24시간 동안 0.003N 바이너리(binary) 에틸렌이민을 2회 처리하여 바이러스를 불활성화시킨 다음 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 농축시켰다. 바이러스 농축액은 15%-45% 자당 밀도 구배에 적층되고 원심분리되었다. 초원심분리 후, 원심분리 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 1 mL 분획을 수집하였다. 각 분획의 샘플에서 FMDV 입자의 존재는 측면 유동 장치(BioSign FMDV Ag; Princeton BioMeditech, Princeton, NJ, USA)를 사용하여 광학 밀도에 의해 확인되었다. 현장 실험에 사용하기 전에 사전 PEG 처리된 상층액을 ZZ-R 및 BHK-21 세포에 두 번 이상 통과시켜 세포변성 효과(CPE)가 발생하지 않았는지 확인하여 상층액에 살아있는 바이러스가 없음을 확인하였다.
4. 정제된 항원을 이용한 구조 및 비구조 단백질 확인 및 TEM을 이용한 146S 입자 검사
면역증강 재조합 FMDV O PA2-C3d 및 A22-C3d에 감염된 세포의 정제된 항원 발현의 구조 단백질(SP)은 SP에 대한 밴드 형성을 나타내는 Rapid 항원 키트(PBM 키트, PBM Co Ltd., Princeton, NJ, USA)로 확인되었다. FMDV의 비구조 단백질(NSP)에 대한 밴드 형성이 없었다. 바이러스 입자(146S)는 투과전자현미경(TEM) 이미징으로 특징을 확인하였다.
5. 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d의 실험동물(마우스)에서의 면역원성 평가
(1) 쥐(Mice)
마우스 실험은 Lee et al.(비특허문헌 2)에 기술된 방법에 따라 수행되었다. 연령 및 성별이 일치하는 야생형 C57BL/6 마우스(6-7주령 암컷)는 KOSA BIO Inc.(경기, 한국)에서 구입하였다. 모든 마우스는 농림축산검역본부의 특정 무병원체(SPF) 생물안전성 수준 3(ABSL3) 동물 시설에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 마이크로아이솔레이터 케이지에 수용되었다. 모든 동물은 실험에 사용하기 전에 적어도 1주일 동안 적응하도록 하였다. 사육실은 12시간의 명암 주기, 약 22℃의 온도, 약 50%의 상대 습도로 설정되었다. 시험은 기관 지침과 농림축산검역본부 동물실험윤리위원회의 승인(인증 번호 IACUC-2021-584)에 따라 수행되었다.
(2) 마우스에 백신 접종 및 FMDV 투여
면역원성이 강한 FMDV O PA2-C3d와 A22-C3d에서 분리·정제한 항원의 면역원성과 단기 면역 유도 효과를 검증하고, 구제역 백신 개발을 위한 종독주(master seed virus, MSV)로서의 가능성을 확인하기 위해 다음과 같이 동물 실험을 진행하였다.
실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다: O PA2-C3d 및 A22-C3d(15 μg/dose/mL, 돼지의 경우 1/10-1/640 용량), ISA 206(Seppic, Paris, 프랑스, 50%, w/w), 10% Al(OH)3 및 15 μg/마우스 Quil-A(InvivoGen, San Diego, CA, USA). 마우스를 허벅지 근육에 근육내(IM) 주사하고(백신 접종 후 0일(dpv)), FMDV(O/VET/2013의 100 LD50 ME-SA 토포타입 또는 100 LD50 A/Malay/97, SEA 토포타입)를 7 dpv에 복강내(IP) 주사하여 투여하였다. 음성 대조군의 마우스에는 동일한 경로를 통해 동일한 부피의 인산완충식염수(PBS, pH 7.0)가 투여되었다. 단기 면역원성을 평가하기 위해 투여 후(dpc) 최대 7일 동안 생존율 및 체중 변화를 모니터링하였다.
목적동물(돼지)에서의 실험을 위한 예비실험으로 O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 시험백신의 면역원성 확인을 위해 PD50 test를 진행하였고, 면역증강 백신주의 backbone으로 사용한 O PA2 항원+A22 항원을 포함하는 시험백신 투여군을 함께 비교하였다. 실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다; O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원 (15 μg+15 μg/dose/ml, 1/10~1/640 dose) 또는 O PA2 항원+A22 항원 (15 μg+15 μg/dose/ml, 1/10~1/640 dose), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)3, 15 μg Quil-A/mouse. 음성대조군의 경우 동일 볼륨의 PBS를 동일 경로로 투여받았다.
마우스는 0 dpv에 I.M.으로 백신 접종 후, 7일(days post vaccination, dpv) 째, FMDV (100 LD50, O/VET/2013, ME-SA topotype 또는 100 LD50 A/Malay/97, SEA topotype)를 마우스 복강으로 투여하여, 7일 후(days post challenge, dpc)까지 생존율과 체중 변화를 모니터링하였다.
6. 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d의 목적동물(돼지)에서의 면역원성 평가
(1) 돼지
돼지(8~9 주령, 총 n=32)는 SP O ELISA, SP A ELISA를 통해 항체가(PI 값: 50% 기준) 및 VN titers (1.6 Log10 기준)를 통해 스크리닝 하여, MDA(+), MDA(-)그룹(각 그룹당 n=16,)으로 구분하였다.
MDA(+), MDA(-) 그룹에 해당하는 각 그룹별 돼지는 세 그룹 (n = 4 또는 6/그룹): NC (negative control), O PA2+A22 (양성 대조군, PC)-처리 및 O PA2-C3d+A22-C3d-처리 그룹으로 무작위로 나누었다.
동물은 실험기간 동안 폐쇄된 격리실(ABSL3)에서 격리되었다. ABSL에 도착한 후, 모든 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근(ad libitum)할 수 있는 우리에 보관되었으며 최소 1주일 적응 후에 실험에 사용되었다. 사육실은 12시간의 명암 주기, 약 22℃의 온도, 약 50%의 상대 습도로 설정되었다. 이 발명은 농림축산검역본부 동물실험윤리위원회(인증번호 IACUC-2021-584)의 승인을 받은 기관 지침에 따라 수행되었다.
(2) 백신 접종을 통한 면역반응 유도 및 샘플링
목적동물인 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복을 위해 제작한 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원의 면역원성을 평가하고 적응성 면역반응 유도 효과 및 모체이행항체 간섭 회피 극복 효과를 관찰하기 위해 모체이행항체 양성(MDA(+), FMD-seropositive), 음성(MDA(-), FMD-seronegative)-야외 돼지를 이용하여 실험을 수행하였고 백신 조성은 다음과 같다; 총 1 ml 부피의 백신을 1 dose로 하여 15 μg O PA2 항원+15 μg A22 항원(양성대조군, positive control group, PC군) 또는 15 μg O PA2-C3d 항원+15 μg A22-C3d 항원(실험군, experimental group, 실험군), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)3, 150 μg Quil-A가 포함되도록 제조하였다. 음성대조군(negative control group, NC군)의 경우 동일 볼륨의 PBS를 동일 경로로 투여받았다.
8~9주령 돼지, 모체이행항체 양성, 음성 동물을 스크리닝하여 MDA(+)군 (n=16)과 MDA(-)군 (n=16)의 두 분류로 구분하였다. MDA(+)군, MDA(-)군 개체들을 각각 세 그룹으로 나누어, NC군(PBS 투여군, n=4/group), PC군(O PA2+A22 투여군, n=6/group), 실험군(O PA2-C3d+A22-C3d 투여군, n=6/group)으로 구분하였고, 28일 간격으로 2회(0 dpv, 28 dpv), 1 mL 백신을 I.M. 경로로 투여하였다. 백신 접종 돼지 혈액 샘플을 0, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 dpv에 수집하여 SP O, A ELISA 및 VN titer 확인과 같은 혈청학적 분석에 사용하였다. SP O, A ELISA의 경우, 항원의 특성에 따른 항체 양성율을 고려하여, FMDV O형, A형 각각 PrioCHECKTM kit, VDPro® kit를 이용하여 비교하였다. 또한 모든 샘플링 일정에 채취한 혈액 샘플로부터 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)을 분리하여, 시험백신 매개-세포성·체액성 면역반응 관련 유전자 발현 변화를 분석하였다.
(3) 혈청학적 분석
혈청 내 SP 항체를 검출하기 위해 PrioCHECKTM FMDV type O 또는 FMDV type A (Prionics AG, Switzerland)와 VDPro® FMDV type O 또는 FMDV type A (Median Diagnostics, 한국 강원도)를 사용하였다. ELISA 플레이트의 흡광도를 억제율(PI) 값으로 변환하였다. PI 값이 PrioCHECKTM FMDV 키트의 경우 50% 또는 VDPro® FMDV 키트의 경우 40% 이상이면 동물은 항체 양성으로 간주되었다.
바이러스 중화 시험(VNT)은 세계 동물 보건 기구(OIE) 매뉴얼에 따라 수행되었다. 혈청을 수조에서 30분 동안 56℃에서 열 불활성화시켰다. 세포 밀도를 조정하여 70% 단층을 형성하고 혈청 샘플의 2배 연속 희석액(1:8-1:1024)을 준비하였다. 그런 다음 희석된 혈청 샘플을 100-조직 배양 감염 용량(TCID)50/0.5 mL상동 바이러스와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후, LF-BK(소 신장) 세포 현탁액을 모든 웰에 첨가하였다. 2~3일 후, CPE는 역가를 결정하기 위해 평가되었으며, 이는 바이러스의 100 TCID50을 중화하는 데 필요한 역 항체 희석의 Log10 값으로 계산되었다. FMDV O/PA2 및 FMDV A22/IRAQ는 VNT에 사용되었다.
(4) PBMC 분리
돼지 PBMC는 Lee et al.(비특허문헌 2)에 의해 유도된 방법에 따라 앞서 언급한 특정 시점(n = 4 또는 6/그룹)에 백신 접종된 돼지의 전혈에서 분리되었다. 전혈(20 mL/개체)은 BD Vaccutainer 헤파린 튜브(BD, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 독립적으로 수집되었고 PBMC는 Ficoll-PaqueTM PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) 구배 원심분리를 사용하여 PBMC를 분리하였다. 잔류 적혈구는 염화암모늄-칼륨(ACK) 용해 완충액(Gibco, Carlsbad, CA, USA)으로 처리하여 용해되었다. PBMC를 Ca2+ 및 Mg2+가 없는 Dulbecco의 PBS (Gibco)에 현탁시키고 2% 소 태아 혈청(FBS) (Gibco)을 보충하고 체적 유세포분석기(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 계수하였다. 모든 세포는 사용 전에 새로 분리되었다. 어떤 실험에서도 동결보존된 세포를 사용하지 않았다. 그런 다음 정제된 PBMC를 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA), 3 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich)이 보충된 RPMI1640 (Gibco) 배지에 재현탁하였다.
(5) RNA 분리, cDNA 합성, 및 정량적 Real-Time PCR
정제된 돼지 PBMC에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen) 및 RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 제조업체의 지침에 따라 GoScript 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 역전사하여 준비하였다. 합성된 cDNA는 iQ SYBR Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Bio-Rad iCycler에서 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 증폭되었다.
유전자 발현 수준을 hprt 수준으로 정규화하고 대조군과 비교한 상대적 비율로 제시하였다. 이 발명에 사용된 프라이머 목록은 표 1에 기재하였다.
| 타겟 | 정방향(Forward)/역방향(Reverse) | 서열 (5'- 3') | 길이(mer) | 서열번호 |
| IFNα | IFNα F | CATCTGCTCTCTGGGCTGTG | 20 | 14 |
| IFNα R | TGAGGGGATCCAAAGTCCCT | 20 | 15 | |
| IFNβ | IFNβ F | TGCAACCACCACAATTCCAGA | 21 | 16 |
| IFNβ R | GGTTTCATTCCAGCCAGTGC | 20 | 17 | |
| IFNγ | IFNγ F | GCCATTCAAAGGAGCATGGAT | 21 | 18 |
| IFNγ R | CTGATGGCTTTGCGCTGGAT | 20 | 19 | |
| IL-1β | IL-1β F | AGCCAGTCTTCATTGTTCAGGT | 22 | 20 |
| IL-1β R | TCATCTCTTTGGGGCCATCAG | 21 | 21 | |
| IL-17A | IL-17A F | CTCGTGAAGGCGGGAATCAT | 20 | 22 |
| IL-17A R | GGTGTGCTCCGGTTCAAGAT | 20 | 23 | |
| IL-23p19 | IL-23p19 F | CCATATCCAGTGCGGGGATG | 20 | 24 |
| IL-23p19 R | AGGCCTTGGTGGATCCTTTG | 20 | 25 | |
| IL-23R | IL-23R F | TCCCTCATTGCAAAGCACAA | 20 | 26 |
| IL-23R R | GCATCTCCTCTTGCAAGCAAAT | 22 | 27 | |
| IL-2 | IL-2 F | AAGCTCTGGAGGGAGTGCTA | 20 | 28 |
| IL-2 R | CAACAGCAGTTACTGTCTCATCA | 23 | 29 | |
| IL-10 | IL-10 F | CGGCCCAGTGAAGAGTTTCT | 20 | 30 |
| IL-10 R | TGCCTTCGGCATTACGTCTT | 20 | 31 | |
| TGFβ | TGFβ F | GGCTGTCCTTTGATGTCACC | 20 | 32 |
| TGFβ R | GGCCAGAATTGAACCCGT | 18 | 33 | |
| IL-4 | IL-4 F | CTCACCTCCCAACTGATCCC | 20 | 34 |
| IL-4 R | TGTGTCCGTGGACGAAGTTG | 20 | 35 | |
| IL-6 | IL-6 F | CTGCAGTCACAGAACGAGTG | 20 | 36 |
| IL-6 R | CGGCATCAATCTCAGGTGCC | 20 | 37 | |
| CD40 | CD40 F | GTCATCAGCACAAATACTGC | 20 | 38 |
| CD40 R | CACAAGTGGTGTCTGTTTTC | 20 | 39 | |
| CD80 | CD80 F | TCAGGCATCGTTCAGGTGAC | 20 | 40 |
| CD80 R | TGACAGCCAGCACCATTTCA | 20 | 41 | |
| CD86 | CD86 F | TGGGACTGAGTAACATTCTCTTTGT | 25 | 42 |
| CD86 R | CCAGCTCATCCAGGCTTAGG | 20 | 43 | |
| MHC Class I | MHC Class I F | TGAGCTATTTCTACACCGCCG | 21 | 44 |
| MHC Class I R | TCGTCCACGTAGCCGACTT | 19 | 45 | |
| MHC Class II | MHC Class II F | CTCCAGTGATGCTGGGTCAG | 20 | 46 |
| MHC Class II R | TGACAGAGTGCCCGTTCTTC | 20 | 47 | |
| CD21 | CD21 F | TGCCATGCCTACAAAGCTGA | 20 | 48 |
| CD21 R | GTAGTAACCAGGGCGGCATT | 20 | 49 | |
| CD28 | CD28 F | TCAAAGGAGTTCCGGGCATC | 20 | 50 |
| CD28 R | CTGAAGCAGGCGGGAGTAAT | 20 | 51 | |
| ICOS | ICOS F | GGATGTGCAGCCTTTGTTGT | 20 | 52 |
| ICOS R | CAGAGCGTACCAAATTGCGG | 20 | 53 | |
| CTLA4 | CTLA4 F | GAGTATGGGTCTGCAGGCAA | 20 | 54 |
| CTLA4 R | ATATGTCGCGGCACAGACTT | 20 | 55 | |
| AHNAK | AHNAK F | CACCATCACCGTGACTCGAA | 20 | 56 |
| AHNAK R | AGTTCGTGCCGTGGAATCTT | 20 | 57 | |
| HPRT | HPRT F | CCCAGCGTCGTGATTAGTGA | 20 | 58 |
| HPRT R | GCCGTTCAGTCCTGTCCATA | 20 | 59 |
7. 통계
모든 정량적 데이터는 달리 명시되지 않는 한 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되었다. 그룹 간에 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정 또는 일원 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정을 사용하여 평가되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 및; ****p < 0.0001. 다른 그룹을 비교하기 위해 매개변수 테스트가 사용되었다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 작성하고 로그 순위 합 테스트를 사용하여 차이를 분석하였다. 모든 통계 분석에는 GraphPad Prism 9.1.2 (GraphPad, San Diego, CA, USA) 소프트웨어 및 IBM SPSS 소프트웨어 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)가 사용되었다.
<실시예> 모체이행항체 간섭 극복을 위한 면역증강 구제역 백신주의 제작, O PA2-C3d 및 A22-C3d를 이용한 불활화 항원 생산 및 정제
모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주 개발을 위해, 역유전학(reverse genetics)을 이용하여 기 개발된 O1 Manisa-O PA2 (O1 M-O PA2) 및 O1 Manisa-A22/Iraq/24/64 (O1 M-A22) strain의 P1 backbone을 이용하였다. O형의 경우 주변 발생상황에 대한 백신 매칭률 및 바이러스의 부유세포에서의 증식성, 특히, 실험동물(마우스) 및 목적동물(돼지)에서의 항원 매개-면역원성을 확인한 선행 연구 결과를 바탕으로, O PA2가 가장 강력한 후보 백신주로 판단되었으며, A형의 경우에도 세계적 발생 상황을 볼 때, 매칭률은 대체적으로 낮은 경향을 보이고는 있으나 그 중에서도 A22가 적합한 백신주로 분류되었다.
본 발명에서 B 세포 에피토프인 C3d의 활성 부위를 O PA2 및 A22 P1 backbone에 이를 삽입하여 FMDV O형 및 FMDV A형의 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주 제조 전략은 도 1a, 1b와 같고 자세한 방법은 재료 및 방법에 기술하였다.
<실험예 1> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신의 마우스에서의 면역원성 평가
B 세포의 활성화를 위해 B 세포 에피토프인 C3d가 삽입된 O PA2-C3d 및 A22-C3d, O PA2 및 A22로부터 분리·정제한 항원의 마우스에서의 면역원성 확인, 구제역 백신 종독주(master seed virus, MSV)로써의 가능성 및 FMDV 감염에 대한 방어 효과를 평가하기 위해 O PA2-C3d 및 A22-C3d는 각각 도 4a의 (A), 및 도 4b의 (D)와 같은 전략으로 실험을 수행하였고, O PA2 및 A22는 도 2a (A), 도 2b (D)와 같은 전략으로 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다; O PA2-C3d 또는 A22-C3d 항원, O PA2 또는 A22 항원 (15 μg/dose/mL, 1/10~1/640 dose), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)3,15 μg Quil-A/mouse.
마우스는 0 dpv (days post vaccination)에 I.M. (intramuscular, 근육 내 접종)으로 백신 접종 후, 7일(dpv)째, FMDV O형 (100 LD50, O/VET/2013, ME-SAtopotype) 또는 FMDV A형 (100 LD50, A/Malay/97, SEA topotype)를 마우스 복강으로 투여하여, 7일 후(dpc)까지 생존율(도 4a의 (B), (C))과 체중 변화(도 4b의 (E), (F))를 모니터링 하였다.
실험 결과, O PA2-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 마우스에서 97.01 PD50 (Log4)으로 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 100%, 1/640 dose에서 80%의 생존율을 보였으며, 체중 감소도 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 거의 관찰되지 않았다(도 4a의 (B), (C)). 또한 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원을 이용한 시험백신은 마우스에 접종 시, 73.52 PD50 (Log4)으로 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 100%의 생존율을 보였으며, 1/640 dose에서는 60% 생존율을 나타내었다. 체중 감소에 있어서도 1/10, 1/40, 1/160 dose에서는 체중 변화가 거의 관찰되지 않았다(도 4b의 (E), (F)).
그러나 O PA2 항원을 포함하는 백신은 55.72 PD50 (log4)으로 나타났다(도 2a의 (B)). O PA2의 체중 변화는 O PA2-C3d에 비해 낮은 수준으로 감소하였다(도 2a의 (C)).
A22-C3d 항원을 함유하는 백신은 1/10, 1/40 및 1/160 용량에 대해 100% 생존율을 나타내고 73.52 PD50 (Log4)으로 1/640 용량에 대해 60% 생존율을 나타냈다. 1/10, 1/40 및 1/160 용량에 대한 체중의 변화는 없었다.
그러나 A22 항원을 포함하는 백신은 6.06 PD50 (Log4)을 나타냈다(도 2b의 (E)). A22의 체중 변화는 A22-C3d에 비해 낮은 수준으로 감소하였다(도 2b의 (F)).
PD50 시험은 돼지에서 2가 연구 백신(O PA2-C3d+A22-C3d 항원 함유, O PA2-C3d와 A22-C3d의 병용 투여)의 면역원성을 확인하기 위해 수행되었습니다. 결과는 면역증강 백신 균주의 백본으로 사용된 연구 백신(O PA2+A22 항원 포함, O PA2와 A22의 병용 투여)을 받은 그룹의 결과와 비교하였다(도 5 및 도 3).
도 5의 (A) 및 도 3의 (A)와 같은 실험 전략으로 생쥐에서 백신 접종은 0 dpv에 I.M.으로 투여되었고 FMDV (O/VET/2013의 100 LD50, ME-SA 토포타입 또는 A/Malay/97의 100 LD50, SEA 토포타입)는 7 dpv에 I.P.로 챌린지 되었다. 생존율과 체중 변화는 0 days post challenge (0 dpc)부터 7 dpc까지 모니터링하였다.
O PA2+A22 항원을 포함하는 2가 백신은 마우스에서 O/VET/2013 및 A/Malay/97로 각각 공격했을 때 PD50 (Log4) 값이 5.66 및 4인 것으로 나타났다(도 3의 (B), 도 3의 (D)).
O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 백신은 O/VET/2013 및 A/Malay/97로 각각 접종했을 때 PD50 (Log4) 값이 90.5 및 >128 PD50 (Log4)으로 높은 면역원성을 나타냈다(도 5의 (B), 도 5의 (D)).
<실험예 2> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신은 목적동물(돼지)에서의 면역효과(초기, 중기, 장기) 평가
목적동물인 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복을 위해 제작한 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원의 면역원성을 평가하고 적응성 면역반응 유도 효과 및 모체이행항체 간섭 회피 극복 효과를 관찰하기 위해 모체이행항체 양성(MDA(+), FMD-seropositive), 음성(MDA(-), FMD-seronegative)-야외 돼지를 이용하여 실험을 수행하였다(도 6a).
그 결과, 모체이행항체 간섭 극복 효과를 확인하기 위해 MDA(+)군의 돼지에 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 이용한 시험백신 투여 시, 14 dpv부터 SP O ELISA에 의한 항체가가 O PA2+A22 항원을 포함하는 시험백신을 접종한 PC군에 비해 유의적으로 증가하였고(p < 0.001, PrioCheckTM kit, VDPro® kit), 28dpv에도 p < 0.05 (PrioCheckTM kit), p < 0.01 (VDPro® kit)의 유의성을 나타내었다(도 6b의 (A), (B)). 특히, 28 dpv에 2차 시험백신 접종(boosting) 이후, 실험군에서 항체가가 매우 높게 나타난 반면, NC군의 경우, 모체이행항체가 지속적으로 감소하는 경향을 보였는데, 56, 70, 84 dpv에 두 그룹 간의 항체가는 p < 0.0001 또는 p < 0.001 수준의 차이를 보였다. 또한 MDA(+)군에서 SP A ELISA의 경우, 42 dpv에 실험군의 항체가가 PC군에 비해 높게 나타났고(p < 0.001, PrioCheckTM kit), 56, 70, 84 dpv에 실험군과 NC군 간의 유의성 차이는 각각 p < 0.5, p < 0.0001, p < 0.001 (PrioCheckTM kit), p < 0.0001 (VDPro® kit) 수준에서 관찰되었다(도 6b의 (C), (D)).
한편, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신의 목적동물(돼지)에서의 면역원성 및 초기, 중기, 장기면역 유도를 확인하기 위해 MDA(-)군에 백신 투여 시, SP O ELISA에 의한 항체가가 7 dpv (PrioCheckTM kit),14dpv (VDPro® kit)에 p < 0.05 수준에서 NC군에 비해 유의적으로 증가하였고, 28 dpv부터 84 dpv까지 NC군과 비교하여 유의성을 나타내었다(p < 0.0001) (도 6b의 (E), (F)). MDA(-)군에서의 각 그룹별 SP A ELISA에 의한 항체가도 SP O ELISA에서의 결과와 마찬가지로 실험군과 NC군 간에 7 dpv (PrioCheckTM kit), 14dpv (VDPro® kit)에서 유의적인 차이를 나타내었고(p < 0.01, p < 0.05), 28~84 dpv에 각각 실험군이 NC군에 비해 항체가가 더 높게 나타났다(p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05). 또한 실험군에서의 항체가는 PC군에서의 항체가에 비해 지속적으로 더 높았으며 두 그룹 간의 유의성은 14, 84 dpv에 p < 0.01, p<0.05 (VDPro® kit) 수준에서 관찰되었다 (도 6b의 (G), (H)).
백신 접종 전(0 dpv), MDA(+)/MDA(-) 그룹에서의 O1 Campos, A2001 Argentina, A24 Cruzeiro에 대한 중화항체가는 도 7의 A와 같다. MDA(+) 군에서는 모두 > 1.6 Log10 수준을 보였고, MDA(-) 그룹에서는 < 1.2 Log10 수준을 나타내었다. PC군에서 항원으로 사용한 backbone 바이러스인 O PA2, A22에 대한 상동성 바이러스(homologous virus)를 이용하여 중화항체가를 확인하였다(도 7의 (B), (C)). MDA(+)군의 경우, 0 dpv에 SP O, A ELISA에 의한 항체가는 높은 수치를 나타내었으나, O PA2, A22에 대한 중화항체가는 방어 수준 이하로 낮게 나타났다(도 7의 (B)). 이는 모체이행항체가 높은(MDA(+)) 자돈의 모돈이 B사의 백신을 접종했으므로 O PA2 및 A22와 같은 이종 바이러스(heterologous virus)에 대해 낮은 항체가를 나타낸 것으로 판단된다.
MDA(-)군의 경우, O PA2에 대한 중화항체가(도 7의 (C))는 7 dpv부터 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신을 투여한 실험군에서 NC군과 PC군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(p < 0.05), 14, 28 dpv까지 지속적으로 증가하였고(p < 0.01, p < 0.05), 28 dpv에 부스팅(boosting) 이후 42~84 dpv에 NC군에 비해 높게 증가되었다(p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05). 또한 부스팅 이후에도 실험군에서 PC군에 비해 중화항체가가 높게 나타났는데, 두 그룹 간의 유의성은 42, 84 dpv에 관찰되었다(p < 0.001, p < 0.01).
MDA(+)군과 MDA(-)군에서 A22에 대한 중화항체가(도 7의 (D), (E))는 28 dpv에 실험군에서 NC군과 PC군에 비해 높게 나타났고(p < 0.01), 부스팅 이후 42~84 dpv에 dpv에 NC군에 비해 높은 수준으로 증가되었다(p < 0.0001, p < 0.001). 실험군과 PC군 간의 차이는 42~84 dpv에 유의성이 관찰되었다(p < 0.0001, p < 0.001).
<실험예 3> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신의 돼지에서의 세포성 면역반응 유도 평가
도 6a에 나타낸 바와 같이, 목적동물인 돼지에 O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신을 접종 후, 각 샘플링 시간별, 전혈로부터 PBMCs를 분리하여, qRT-PCR을 통해 세포성 면역반응 유도와 관련된 cytokines (IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-1β, IL-17A, IL-23p19, IL-23R, IL-2, IL-10, TGFβ, IL-4, IL-6) 및 공동-자극 분자 (CD40, CD80, CD86, MHC class I, MHC class II, CD21, CD28, CTLA4, ICOS, AHNAK)과 같은 유전자의 발현 변화를 관찰하였다(도 8a 내지 도 8c).
그 결과 전염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokine) 유전자의 발현이 전체적으로 매우 높게 관찰되었다. 특히, Type I IFN인 IFNα와 IFNβ의 발현은 7 dpv에 MDA(+)/MDA(-) 조건의 개체들에서 실험군에서 NC군에 비해 p < 0.0001, p < 0.001 수준의 매우 높은 증가를 보였다. 한편, PC군 vs NC군 간의 차이는 IFNα의 경우 MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 PC군에서 NC군에 비해 높게 나타났으나(p < 0.01), IFNβ의 경우 MDA(+) 조건에서만 NC군에 비해 유의적인 증가를 보였다(p < 0.01). IFNγ의 발현 수준은 IFNα와 IFNβ의 발현에 비해 다소 낮았으나, MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 실험군에서 NC에 비해 유의적으로 높은 수준이 관찰되었다(p < 0.05).
IL-1β는 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 현저히 높은 발현을 보였으며(p < 0.0001, p < 0.001), 특히, PC군과 비교하여 실험군에서 p < 0.0001 수준의 유의적인 차이를 나타내었다. IL-17A는 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 매우 높은 발현량을 보였고(p < 0.0001, p < 0.01), MDA(+) 상태에서 PC군과 NC군 간의 유의성이 관찰되었다 (p < 0.01). IL-23p19의 발현 또한 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 현저히 높게 나타났고(p < 0.01, p < 0.001), 특히, MDA(-) 조건에서 실험군과 PC군 간의 유의적으로 차이를 보였다(p < 0.05). IL-23R의 발현도 다른 사이토카인 발현과 마찬가지로 매우 높게 나타났고, MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 실험군 vs NC군 간의 유의적 차이를 보였다(p < 0.05). IL-4, IL-6의 경우, MDA(+) 조건에서 MDA(-) 조건에 비해 발현량이 높았고, MDA(+) 조건에서 실험군 vs NC군 간의 유의성은 p < 0.01, IL-4, IL-6에 대한 PC군 대 NC군 간의 유의성은 각각 p < 0.01, p < 0.01으로 나타났다. MDA(-) 조건에서는 IL-4에서 실험군 vs NC군의 유의차가 p < 0.05로 관찰되었다. 한편, 항-염증성 사이토카인인 IL-10의 경우, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 높게 발현되는 것으로 나타났다(p < 0.05). IL-2, TGFβ의 경우, 실험군> PC군 > NC군의 순으로 발현량이 높게 나타났으나, 각 그룹간 유의성은 관찰되지 않았다.
공동-자극 분자의 발현량은 전반적으로 사이토카인의 발현량에 비해서는 다소 낮았으나, 실험군에서 PC군 또는 NC군에 비해 유의적으로 발현량이 증가됨을 확인하였다. CD80, CD21, CD28, CTLA4, ICOS의 발현은 MDA(+) 조건에 비해 MDA(-) 조건에서 백신 투여 시 증가되는 경향을 보였고, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군 vs NC군 간의 비교에서 유의성을 나타내었고 (p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05), PC군 대 NC군 간의 유의성은 ICOS를 제외한 나머지 유전자의 발현에 대해 p < 0.01, p < 0.01 수준으로 관찰되었다. 이들 중, CD80, CD21과 CD28은 시험백신 투여에 의해 매우 높은 유전자 발현 변화를 나타내었고, ICOS의 경우, 실험군 vs PC군 간의 유의성이 MDA(+) 조건에서 p < 0.0 1, MDA(-) 조건에서 p < 0.0001로 C3d가 삽입된 균주에서 backbone strain에 비해 높은 유전자 발현을 보였다.
CD86, AHNAK의 경우, MDA(-) 조건에서 실험군과 NC군 간의 유의성이 관찰되었고(p < 0.0001, p < 0.001), 특히, CD86은 실험군 대 PC군(p < 0.0001) 간의 현저한 유의성이 관찰되었다. 한편, MHC class I은 MDA(+) 조건에 비해 MDA(-) 조건에서 유전자의 발현이 감소된 것으로 나타났고, CD40, MHC class II의 경우, 각 그룹 간 유의성은 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터 O PA2-C3d와 A22-C3d는 면역증강 구제역 백신주로써 항원 자체의 면역원성이 우수하며, 단기 면역 유도와 숙주 초기 방어에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다. 또한 O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 시험백신은 목적동물에 백신 접종 시, 초기에 강력한 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응의 동시 유도로 모체이행항체 간섭 극복에 보다 더 효과적일 것으로 기대된다.
<실험예 4> 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복 및 세포성 면역반응과 체액성 면역반응의 동시 유도 효과 평가
돼지에서 모체이행항체 간섭 극복 및 세포성 면역반응과 체액성 면역반응의 동시 유도 효과를 평가하기 위해, MDA(+)- 또는 MDA(-)-돼지를 이용하여 실험을 수행하였다(도 6a). MDA(+)-개체들에서 O PA2-C3d+A22-C3d는 특히 SP O ELISA에 의한 항체가에 있어 강력한 모체이행항체 극복 효과를 나타내었고, SP A ELISA에 의한 항체가의 경우, 항체가 자체는 백신 접종 초기에 다소 감소하다가 부스팅 이후 증가하는 경향을 보였는데, 이는 FMDV A형 항원의 특성 상 SP 부위가 SP A ELISA plate에 코팅된 항원과 다르기 때문에 검출 자체가 낮게 나타나 percent inhibition (PI) value에 영향을 미치는 것으로 판단되며, 보다 더 정확한 평가를 위해 VN 역가를 통해 모체이행항체 간섭 극복이 가능한지에 대한 검토가 필요한 것으로 사료되었다.
반면, MDA(-)-개체들에서 O PA2-C3d+A22-C3d는 SP O ELISA, SP A ELISA에 의한 강력한 항체가의 증가를 유도하였고, backbone으로 사용한 O PA2+A22에 비해 항체가 유도능이 유의적으로 높았다(도 8b).
또한 실제 바이러스 중화 효과를 확인하기 위해 O PA2, A22에 대한 VN 역가를 확인하였다. 해당 개체들은 B사(회사의 권익보호 및 분쟁 억제를 위해 사용화 백신 출처는 기재하지 않음) 백신을 접종하였으므로, 모체이행항체의 유무를 확인하기 위해 백신 접종 전, 0 dpv에 혈청을 이용하여 O1 Campos, A2001 Argentina, A24 Cruzeiro에 대한 VN titer를 확인하였다. 그 결과 MDA(+) 그룹 및 MDA(-) 그룹에 대한 VN 역가는 각각 양성(positive)과 음성(negative)으로 정확히 구분되었고 이러한 동물들을 이용하여 각각의 그룹에 대한 백신 접종을 실시하였다.
0~84 dpv의 각각 채혈 시간별 혈청을 이용하여 O PA2, A22에 대한 VN titers를 확인한 결과, 모돈이 접종한 백신 내 백신주 항원과 본 발명에서 접종한 백신 내 항원이 서로 상이하므로, MDA(+)/MDA(-) 그룹에 상관없이 O PA2, A22에 대한 VN titers는 초기(0 dpv)에 방어수준 이하인 <1.2 Log10으로 나타났으며, O PA2-C3d+A22-C3d의 2가 시험백신 투여에 의해 모체이행항체 양성/음성 그룹에서 모두 O PA2+A22 2가 시험백신 투여 시 보다 유의적으로 높은 VN 역가를 나타내었다(도 7).
이상의 결과로부터 모체이행항체 간섭 극복을 위해 개발된 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d는 모체이행항체 존재 시에도 면역 관용 등의 간섭 현상을 극복하여 숙주 내에서 효과적으로 능동면역을 유도할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 현재 이용되고 있는 백신 프로그램에 따라 모체이행항체가 감소되는 시기인 8~12주령의 목적동물(돼지)에 접종 시에도 강력한 체액성 면역반응 유도가 가능한 것으로 판단된다. 이는 항원에 spiking 되어 있는 C3d가 B 세포 표면 수용체를 지속적으로 자극하여 B 세포를 직접적으로 활성화시키는 한편, 면역원성이 높은 O PA2-C3d 항원과 A22-C3d 항원이 강력한 T 세포 매개-세포성 면역반응을 유도하여, 보다 더 효율적인 고역가 항체 및 중화항체가의 생산이 가능하기 때문인 것으로 판단된다.
이를 증명하기 위하여, MDA(+)/MDA(-) 돼지에서의 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 함유하는 2가 시험백신-매개 세포성 면역반응을 확인하였다. 양성대조군(PC)의 경우 backbone strain인 O PA2+A22 항원을 함유하는 2가 시험백신을, 음성대조군(NC)의 경우 PBS를 투여받았다. O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 백신 접종 초기(7 dpv)에 항바이러스 효과를 가지는 type I IFN의 발현을 매우 높은 수준으로 증가시키는 것으로 나타나, FMDV 감염에 대해 백신 접종 초기 숙주를 효과적으로 방어할 수 있을 것으로 기대되었다. T helper (Th) 1 세포 관련 사이토카인인 IFNγ의 경우, IFNα, IFNβ에 비해서는 발현량이 낮지만 > 2 fold-change 이상의 유의적인 발현을 보여(p < 0.05), T cell-매개 세포성 면역반응을 효과적으로 유도하는 것으로 판단되었다. 염증소체(Inflammasome)의 활성에 관여하는 IL-1β와 Th17 세포, 비전통적인(unconventional) T 세포 (γδ T 세포)-유래 IL-17A의 발현 역시 C3d가 삽입된 백신주로부터 분리, 정제한 항원을 투여한 실험군에서 매우 높게 나타났다. 우리의 선행연구를 통해 IL-23p19와 IL-23R의 발현이 숙주의 초기 방어에 있어 매우 중요한 것으로 밝혀졌는데, 본 발명에서도 이들의 발현은 초기에 ‘사이토카인 폭풍’ 수준으로 발현되었고 이후 정상화 되는 것으로 나타났다.
수지상세포(Dendritic cells, DCs), 대식세포 (MΦs) 등 선천성 면역세포에서 병원체 인식 수용체 (PRRs)의 자극을 통해, IL-23A가 분비되면 선천성-유사 (innate-like) 면역세포인 비전통적인 T 세포 표면의 IL-23R에 결합하여 세포를 자극하게 되고 IL-17A를 생산한다. 생산된 IL-17A는 병원체의 감염 부위에 호중구를 모집하여 NET (neutrophil extracellular trap)를 형성하여 병원체를 NETosis 시킴으로써 숙주의 초기 방어에 결정적인 역할을 한다.
또한 IL-23/IL-17A axis는 선천성 면역과 적응성 면역을 연결(link)하는 것으로 알려져 있어, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신이 이러한 전염증성 사이토카인의 분비를 통해 선천성 면역반응과 적응성 면역반응을 동시에 유도하는 것으로 사료된다.
CD4+ Th subsets과 CD4+T regulatory cells (Tregs)의 분화와 생존에 있어 중심적인 역할을 하며 기억 세포의 생성에 필수적인 T 세포 성장 인자인 IL-2와 Tregs의 발달과 DCs에서 면역학적 내성(immunological tolerance)의 유도에 관여하는 것으로 알려져 있는 TGFβ의 경우 실험군에서 다소 높게 나타났으나 각 그룹 간의 유의성은 관찰되지 않았다. 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 또한 실험군에서 유의적으로 증가되었는데(p < 0.05),이는 염증성 사이토카인의 ‘사이토카인 폭풍’을 조절하기 위한 숙주의 항상성에 의한 것으로 추측된다. Th2 세포-유래 사이토카인인 IL-4, IL-6의 발현은 MDA(+) 그룹에서 MDA(-)그룹에 비해 높게 나타나, 모체이행항체에 의한 수동면역 존재 시 이들 사이토카인 발현 수준이 증가하는 것으로 판단되었다.
T 세포 수용체 (TCR) 신호와 협력하여 T 세포의 활성화를 촉진하는 CD80 및 CD86 공동 자극 신호 전달은 O PA2-C3d+A22-C3d 투여군에서 증가하여 이들 면역증강 구제역 백신주가 항원을 효과적으로 T 세포에 제시하여 T 세포를 효과적으로 자극할 수 있을 것으로 판단된다.
MHC class I의 경우 MDA(+) 그룹에서 MDA(-) 그룹에 비해 유전자 발현이 높았고 백신 접종 그룹에서 오히려 NC군에 비해 더 낮은 것으로 나타났는데, 수동면역 존재 시 유전자의 발현이 낮게 나타나 백신 접종 초기 cytotoxic CD8+ T cells에 의한 항원의 인식이 저해되는 것으로 보인다. 반면, MHC class II는 MDA(+) 그룹에 비해 MDA(-) 그룹에서 높은 발현을 보였고, 그룹간 유의성은 없었으나 실험군에서 증가되는 경향을 나타내었다. 이로부터 C3d 삽입 면역증강 백신주 항원이 APC (DCs, MΦs, B cells 등)에 의한 MHC class II의 제시를 통해 효과기(effector) 세포의 협동과 조절을 유도하는 CD4+ T cells을 활성화시키는 것으로 보여지며 MHC 복합체와의 상호작용을 통해 지속적인 세포-세포 접촉 형성 및 T 세포의 활성화를 유도할 수 있을 것으로 판단된다.
한편, 직접적인 C3d의 수용체인 CD21의 발현은 C3d가 융합된 구제역 백신주 항원을 포함하는 시험백신 접종에 의해, MDA(+)/(MDA(-) 조건에서 모두 유의적으로 증가하여(p < 0.01, p < 0.0001), FMDV 표면의 C3d의 자극 및 CD21의 결합에 의해 B cell의 활성화가 가능한 것으로 보여진다.
T 세포 활성 시 공동-자극되고, 기억 T 세포의 유도에 중요한 역할을 하는 공동-자극 신호인 CD28과 ICOS의 발현은 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신 투여 시, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 현저히 높게 증가하였다(CD28: p < 0.0001; p < 0.05; ICOS: p < 0.01; p < 0.00001). 특히, ICOS의 발현은 실험군과 PC군 간의 유의적인 차이를 유도하였는데(MDA(+): p < 0.05; MDA(-): p < 0.0001), C3d 융합 구제역 백신주 항원이 T cells, lymphocytes의 co-stimulation을 증가시켜, IFNγ의 유의적인 발현을 유도한 것으로 보인다. 또한 ICOS는 면역글로불린 도메인으로써 IgA 생성을 위한 장간 면역(intestinal immune) 관계에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, 향후 전신 면역·점막 면역 동시 유도를 위한 구제역 백신주로의 사용이 가능할 것으로 기대된다. CTLA4 발현 또한 ICOS의 발현과 유사한 경향을 나타내어, ICOS의 발현에 의해 CTLA pathway가 유도된 것으로 생각되며, 유도된 CTLA4는 세포질 도메인에서 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 접종 시, ‘사이토카인 폭풍’ 수준의 전염증성 사이토카인의 발현에 의한 자가면역을 억제하기 위한 조절(regulatory) T 세포의 전환을 야기하는 것으로 추측된다.
한편, 본 발명에서 AHNAK의 발현은 MDA(-) 조건에서 O PA2-C3d+A22-C3d 투여군에서 현저히 증가되었고(p < 0.001), MDA(+) 조건에서도 실험군에서 다소 높았으나 각 그룹간 유의성은 관찰되지 않았다. AHNAK은 이전에 구조적 스캐폴드(scaffold) 단백질로 확인된 700 kDa의 큰 단백질로, 세포 구조, 세포 내 trafficking, 세포막 재생, 조절된 세포외 배출 작용, T 세포 분화 및 T 세포 활성화 과정 중 칼슘 신호경로와 같은 다양한 세포 과정에 관여되어 왔다.
Cytolytic CD8+ T cells (CTL)은 칼슘-의존적 방식으로 바이러스에 감염된 세포를 사멸시킨다. AHNAK은 성숙한 CTL에서는 발현되지만, naive CD8+ T cell에서는 발현되지 않으며, 면역반응 유도를 위한 적절한 기능에 필요한 칼슘 도입은 매우 중요한 것으로 보고되었다. 실제 ANHAK-결핍(Ahnak1-/-) CTL은 TCR 자극 후 Granzyme B 생산, cytolytic activity, IFNγ 분비의 현저한 감소를 보인 바 있다.
따라서, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 AHNAK의 발현을 통해 T 세포의 활성 및 CTL 반응을 유도할 수 있을 것으로 생각된다.
<실험예5> 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 가능 여부 평가
본 발명에 따라 제조된 재조합 구제역 바이러스 2종, O PA2-C3d 및 A22-C3d과 양성대조군(Positive control, PC)인 backbone 바이러스 2종, O PA2 및 A22를 이용하여, 불활화 항원을 생산 및 정제하였다. 이들을 이용하여, 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 시험을 실시한 결과, 2.34 ng (1/640 dose)의 소량으로도 SP 양성밴드를 확인하였고, NSP 밴드가 미형성된 것을 통해 야외주와의 감별이 가능한 것으로 나타났다(도 9). 수크로즈 밀도구배(Sucrose gradient)를 통해 정제된 항원(146s particle)의 전자현미경(TEM) 관찰 결과, 146s particle 형성에 문제가 없는 것을 확인하여 이를 구제역 시험백신 항원으로 이용하고자 하였다(도 10).
<110> Animal and Plant Quarantine Agency
<120> Recombinant foot-and-mouth disease type O virus that induces
strong adaptive immune response and overcomes maternally-derived
antibody and foot-and-mouth disease vaccine composition
comprising the same
<130> 21-12088
<160> 59
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 11097
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pO1 Manisa(pO1 M)
<400> 1
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080
gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140
ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200
cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260
ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320
aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380
actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440
tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500
accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560
gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620
cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680
agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740
actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800
atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860
gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920
ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980
aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040
ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100
actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160
tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220
aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280
gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340
cagaaaaggc tcaagggagc cgggcaatcc agcccggcaa ccgggtcaca gaaccaatca 2400
ggcaacactg ggagcatcat caacaattac tacatgcagc agtaccaaaa ctccatggac 2460
acacaacttg gtgacaacgc tacaagcgga ggctcaaacg aggggtccac ggacacaacc 2520
tccacccaca caaccaacac tcagaacaac gactggttct cgaagctggc cagttccgct 2580
ttcagcggtc ttttcggcgc tcttctcgcc gacaagaaaa ccgaggagac cactcttctc 2640
gaggaccgca tcctcactac tcgtaacgga cacaccacct cgacaaccca gtcgagcgtt 2700
ggagtcacgt acgggtatgc aacagctgag gatttcgtga gcgggccaaa cacctctggt 2760
ctcgagacca gggttgccca ggcagagcgg ttctttaaaa cccacctgtt cgactgggtc 2820
accagtgacc cattcggacg gtgccacctg ctggaacttc caactgacca caaaggtgtc 2880
tacggcagcc tgaccgactc gtatgcttat atgaggaacg gctgggatgt tgaagtcact 2940
gcagtgggaa accagttcaa tggaggatgc ctgttggtgg ccatggtgcc agaactttgc 3000
tccatacaga agagggagct gtaccagctc acgctctttc ctcaccagtt catcaaccct 3060
cggacgaaca tgacagcaca catcactgtg ccctttgttg gcgtcaaccg ttatgaccag 3120
tacaaggtac acaaaccttg gaccctcgtg gttatggttg tagcccccct gactgtcaac 3180
agtgaaggtg ccccgcaaat caaggtgtat gccaacatcg cacctaccaa cgtacacgtc 3240
gcgggtgagt tcccttccaa agaggggatc ttccctgtgg cttgcagcga tggttatggc 3300
ggtctggtga ccactgaccc gaaaacggct gaccccgctt acgggaaagt gtttaacccc 3360
ccccgcaaca tgttgccggg gcggttcacc aattttcttg acgtggctga ggcgtgcccc 3420
acgtttctcc acttcgaggg tgacgtgcca tacgtgacca cgaagacgga ttcagacagg 3480
gtgctcgctc agttcgactt gtctttggca gcaaagcaca tgtcgaacac cttccttgca 3540
ggtctcgccc agtactacac acagtacagc ggcaccatca acctgcactt catgttcaca 3600
gggcctactg acgcgaaggc gcgttacatg attgcgtatg ctcctcctgg catggaacca 3660
cctaaaacgc cagaggcggc tgcccactgc attcatgctg aatgggacac agggttgaac 3720
tcaaaattca cattttcaat cccttacctt tcggcggctg attacgctta cacagcgtct 3780
gacactgctg agaccacaaa tgtacaggga tgggtttgcc tgtttcaaat aacacacggg 3840
aaagctgacg gcgacgcact ggtcgttttg gctagcgccg gaaaggactt tgagctgcgc 3900
ctgccggtgg atgctcgcac acagactacc tccgcgggcg agtcagctga ccccgtgacc 3960
gccaccgttg agaattacgg tggcgagaca caggtccaga ggcgccaaca cacggacgtc 4020
tcatttatat tagacagatt tgtgacagtg acaccaaaag accaaattaa tgtattggac 4080
ctgatgcaaa cccctgctca cactttggtg ggagcactcc ttcgtactgc cacttactat 4140
ttcgctgact tagaggtggc agtgaagcac aagggaaacc tcacctgggt cccgaacggg 4200
gcgcctgaag cggcgttgga caacaccacc aacccaacag cttaccacaa ggcaccactc 4260
acccgacttg cactgcctta cacggcgcca caccgcgtgt tggctactgt ttacaacggg 4320
aactgcaagt atggtgacgg cacggtggcc aatgtgagag gtgacctgca agtgttggcc 4380
cagaaggcgg cgagagcgct gcctacctcc ttcaactacg gtgccattaa agctactcgg 4440
gtgactgaac tgctttaccg catgaagagg gctgagacat actgcccccg gcctcttttg 4500
gccattcacc cggaccaggc tagacacaag cagaagattg tggcaccggt ggaacagctt 4560
ctaaattttg acctgctcaa attggcggga gatgtggagt ccaaccctgg gcccttcttc 4620
ttctccgacg tcaggtcaaa tttctcaaaa ctggtagaaa ccatcaatca gatgcaggag 4680
gacatgtcaa caaaacacgg gcctgacttt aaccggttgg tgtccgcatt tgaggaattg 4740
gccactggag tgaaggctat cagggccggt ctcgacgagg ccaaaccctg gtacaaactc 4800
atcaagctcc tgagccgctt gtcgtgcatg gccgctgtag cagcacggtc aaaggaccca 4860
gtccttgtgg ccatcatgct ggctgacacc ggtcttgaga ttctggacag cacctttgtc 4920
gtgaagaaga tctccgactc gctctccagt ctctttcacg tgccggcccc cgtcttcagt 4980
ttcggagccc cgattctgtt ggccgggttg gtcaaagtcg cctcgagttt cttccggtcc 5040
acacccgaag accttgagag agcagaaaaa cagctcaaag cacgtgacat taacgacata 5100
ttcgccattc tcaagaacgg cgagtggctg gtcaagctga tccttgccat ccgcgactgg 5160
atcaaagcgt ggatcgcctc agaagaaaag tttgtcacca tgacggactt ggtgcctggt 5220
atccttgaaa agcagcggga tctcaacgac ccgagtaagt acaaggaagc caaggagtgg 5280
ctcgacaacg cgcgccaggc gtgtttgaag agcgggaacg ttcacattgc caatttgtgc 5340
aaagtggtcg ccccggcacc cagcaagtcg agacccgaac ccgtggtcgt ttgcctccgc 5400
ggcaaatccg gccaggggaa gagtttcctt gcgaacgtgc tcgcgcaagc aatctccacc 5460
cacttcaccg gcagaactga ttcggtttgg tactgcccgc ctgaccctga ccacttcgac 5520
ggttacaacc agcagaccgt tgtcgtgatg gacgatttgg gccagaaccc cgatggcaag 5580
gacttcaagt acttcgccca gatggtttcg accacggggt tcatcccgcc catggcctcg 5640
cttgaggaca aaggcaagcc tttcaacagc aaagtcatca ttgctaccac caacctgtac 5700
tcgggtttca ccccgagaac aatggtgtgt cctgacgcgc tgaaccggag gttccacttt 5760
gacatcgacg tgagtgccaa ggacgggtac aaagttaaca acaaattgga cataatcaaa 5820
gctcttgaag acacccacac caacccagtg gcgatgttcc aatacgactg tgcccttcta 5880
aacggtatgg cagttgaaat gaagagaatg caacaggata tgttcaagcc tcaaccaccc 5940
ctccagaacg tgtaccaact cgttcacgag gtgattgaac gggtcgagct ccacgagaag 6000
gtgtcgagcc acccgatttt caaacagata tcaattcctt cccaaaagtc tgtgttgtac 6060
ttcctcattg agaaaggcca acacgaagca gcaattgaat tctttgaggg aatggtgcat 6120
gactccatca aggaagagct ccggcccctc atccaacaga cctcatttgt gaaacgcgct 6180
tttaagcgcc tgaaggaaaa ctttgagact gttgccctgt gtttgactct tttggcaaac 6240
atagtgatca tgatccgcga gactcgcaag agacaacaga tggtggacga tgcagtgaat 6300
gactacattg agaaggcaaa catcaccaca gatgacaaga ctcttgacga ggcggaaaag 6360
aaccctctag agaccagcgg tgccagcact attggtttca gagagagaac tctcccgggg 6420
cacaaggcga gcgatgacgt gagctccgag cccgccaaac ccgtggagga ccgaccacaa 6480
gctgaagggc cctacgccgg accacttgag cgtcagaaac ctctgagagt gaaaaccaag 6540
ttgccacaac aggagggacc ctacgctggc ccgatggata gacagaaacc gttgaaagtg 6600
agagcaagag ccccggtcgt gaaggaggga ccctacgagg gaccggtgaa gaagcctgtc 6660
gctttgaaag tgaaagccaa gaacttgatt gtcactgaga gtggtgcccc accgaccgac 6720
ttgcagaaga tggtcatggg caacactaag cctgttgagc tcatcctcga cgggaagacg 6780
gtagccatct gctgtgctac cggagtgttt ggcactgcct acctcgtacc tcgtcacctc 6840
ttcgcggaga agtacgacaa gataatgttg gacggtagag ccatgacaga cagtgactac 6900
agagtgtttg agtttgagat taaagtaaaa ggacaggaca tgctctcaga cgctgcactc 6960
atggtgcttc accgtgggaa ccgcgtgaga gacatcacga aacattttcg tgacacagca 7020
agaatgaaga aaggcacccc cgttgtcggt gtgatcaaca acgccgacgt tgggagactg 7080
attttctctg gagaggccct tacctacaaa gacattgtag tgtgcatgga tggagacacc 7140
atgccgggcc tgtttgccta cagagccgcc accaaggctg gttactgcgg gggagccgtt 7200
ctcgccaagg acggagccga cacattcatc gttggcaccc actccgcagg tggtaacgga 7260
gttggatact gctcgtgcgt gtccaggtcc atgctcctga aaatgaaggc acacattgac 7320
cctgaaccac accacgaggg gttgattgtt gataccagag atgtggaaga gcgcgtgcat 7380
gtcatgcgta aaaccaagct tgcacccacc gtggcacacg gtgtgtttaa ccctgaattt 7440
ggtcccgctg ccttgtccaa caaggacccg cggctgaacg aaggggttgt cctcgatgaa 7500
gtcatcttct ccaaacacaa gggagacacg aaaatgtctg aggaggacaa agcgctgttc 7560
cgccgctgcg ctgccgacta cgcgtcgcac ttgcacagcg tgctggggac ggcaaatgcc 7620
ccattgagca tctatgaggc catcaaaggc gtcgacgggc tcgatgccat ggagccggac 7680
accgcgcccg gcctcccctg ggccctccag gggaaacgcc gtggtgcgtt gattgacttc 7740
gagaacggca cggtcggacc cgaagtcgag gctgccctaa agctcatgga gaaaagagag 7800
tacaaatttg cttgccagac cttcctgaaa gacgagattc gtccgatgga aaaagtacgt 7860
gctggcaaga ctcgcattgt cgacgttttg cccgtggaac acattcttta caccaggatg 7920
atgattggca gattctgtgc tcaaatgcac acaaacaatg gaccgcagat tggctcagcg 7980
gtcggttgca atcctgatgt tgattggcaa agatttggca cacattttgc tcagtacaga 8040
aacgtgtggg atgtggacta ttcggccttt gatgctaacc actgcagtga cgcaatgaac 8100
atcatgtttg aggaggtatt tcgcacagac ttcggtttcc acccaaatgc tgagtggatt 8160
ctgaagactc ttgtgaacac ggagcacgcc tatgagaaca aacgtatcac tgttgagggc 8220
gggatgccgt ctggctgttc cgcgacaagc atcatcaaca caattttgaa caacatttat 8280
gtgctctacg ctcttcgtag acactatgag ggagttgagc tggacaccta caccatgatc 8340
tcctacggag atgacatcgt ggttgcaagt gactacgatc tggattttga ggctctcaaa 8400
ccccacttca aatctcttgg tcaaaccatc actccagctg acaaaagcga caaaggtttt 8460
gttcttggtc actccattac cgatgtcact ttcctcaaaa gacacttcca catggactat 8520
ggaactgggt tttacaaacc tgtgatggcc tcaaagaccc tcgaggccat tctctccttt 8580
gcacgccgtg ggaccataca ggagaagttg atctccgtgg caggactcgc cgtccactca 8640
ggacctgacg agtaccggcg tctctttgag cccttccagg gtctcttcga gattccaagc 8700
tacagatcac tttacctgcg ttgggtgaac gccgtgtgcg gtgacgcata atccctcaga 8760
tgtcacaatt ggcagaaaga ctctgaggcg agcgacgccg taggagtgaa aagcccgaaa 8820
gggcttttcc cgcttcctat tccaaaaaaa aaaaaaaaaa actagttcta gagcggccgc 8880
caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg cgcttggcgt 8940
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 9000
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 9060
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 9120
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 9180
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 9240
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 9300
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 9360
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 9420
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9480
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9540
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 9600
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9660
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 9720
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 9780
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 9840
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9900
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9960
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 10020
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 10080
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 10140
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 10200
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 10260
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 10320
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 10380
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 10440
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10500
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10560
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10620
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10680
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10740
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10800
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10860
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10920
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10980
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 11040
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccac 11097
<210> 2
<211> 2202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> O PA2 P1
<400> 2
ggcgccgggc aatccagccc ggcgactggg tcacagaacc agtcaggcaa cactggaagc 60
atcatcaaca actactacat gcagcagtac cagaactcca tggacacaca acttggtgac 120
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actacccgca acggacatac aacctcgaca acccagtcga gcgttggagt cacttacggg 360
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gaagcaagac acaaacaaaa gatagtggca cctgtgaaac ag 2202
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<211> 11100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pO1 M-O PA2 P1
<400> 3
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
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caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
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cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080
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ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200
cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260
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actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440
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gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620
cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680
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aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040
ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100
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gacactgctg agaccacaaa tgtacaggga tgggtttgcc tgtttcagat cacacacggg 3840
aaggctgacg gtgacgcact tgtcgttctg gctagcgccg gtaaggactt cgagctgcgg 3900
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ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 10560
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aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 10860
actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 10920
aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 10980
tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 11040
aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 11100
11100
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3d
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ggtaagcagc tctacaacgt ggaggccaca tcctatgcc 39
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3d amino acid
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Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for C3d
<400> 6
ggaggccaca tcctatgccc gcgagaggcc ctaggtcgc 39
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for C3d
<400> 7
acgttgtaga gctgcttacc gcgagggtcg ccgctcagct 40
<210> 8
<211> 11139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant plasmid(pO1 M-O PA2 P1-C3d)
<400> 8
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080
gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140
ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200
cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260
ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320
aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380
actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440
tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500
accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560
gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620
cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680
agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740
actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800
atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860
gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920
ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980
aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040
ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100
actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160
tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220
aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280
gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340
cagaaaaggc tcaagggcgc cgggcaatcc agcccggcga ctgggtcaca gaaccagtca 2400
ggcaacactg gaagcatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 2460
acacaacttg gtgacaacgc tatcagcgga ggctccaacg aggggtccac ggacaccact 2520
tccacccaca caaccaacac tcagaacaac gactggtttt caaagctggc cagttccgct 2580
tttagcggcc ttttcggcgc tcttctcgcc gacaagaaaa ccgaggagac cactcttctc 2640
gaggaccgca tcctcactac ccgcaacgga catacaacct cgacaaccca gtcgagcgtt 2700
ggagtcactt acgggtacgc aacagctgag gactttgtga gcgggccaaa cacatccggt 2760
cttgagacca gggttgtgca agcagagcgg ttcttcaaaa cccacttgtt cgactgggtc 2820
actagcgacc cgttcggacg gtgccacctg ctggaacttc caactgacca caaaggtgtc 2880
tacggcagcc tgaccgattc ttatgcttac atgagaaacg gttgggatgt tgaggtcact 2940
gcagtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgttggtag ccatggtgcc agaactttgc 3000
tctattgaca aaagagagct gtaccagctc acgctctttc cccaccaatt catcaacccc 3060
cggacgaaca tgacggcgca catcaccgtg ccctttgttg gcgtcaatcg ctacgaccag 3120
tacaaggtac acaagccttg gaccctcgtg gtcatggtcg tggccccgct gactgtcaac 3180
actgaaggtg ctccacagat caaggtttat gccaacatcg cccctaccaa cgtgcacgtc 3240
gcgggtgagt tcccttccaa ggaagggatc ttccccgtgg catgtagcga cggttatggc 3300
ggtcttgtga ccactgaccc aaagacggct gaccccgcct acgggaaagt tttcaatccc 3360
cctcgcaaca tgttgccagg gcggttcacc aacttccttg acgtggctga ggcgtgccct 3420
acgtttctgc actttgaggg tgacgtgcca tacgtgacca caaagacgga ttcggacagg 3480
gttcttgctc agtttgactt gtctttggca gcgaagcaca tgtcgaacac ctttctggca 3540
ggtctcgccc agtactacac acagtacagc ggcaccatca acctgcactt catgttcaca 3600
gggcccactg acgcgaaagc gcgttacatg attgcatacg ccccccctgg catggaaccg 3660
cccagaacac ctgaggcggc cgctcactgc attcatgcgg agtgggacac tgggttgaat 3720
tcaaaattca cattttcaat cccttacctt tcggcggctg actacgcgta caccgcgtct 3780
gacactgctg agaccacaaa tgtacaggga tgggtttgcc tgtttcagat cacacacggg 3840
aaggctgacg gtgacgcact tgtcgttctg gctagcgccg gtaaggactt cgagctgcgg 3900
ttgccagttg acgctcgcac gcagaccacc tccacaggtg agtcagctga ccccgtgact 3960
gccactgttg agaactacgg tggcgagacg caggtccaga gacgccagca cacggacgtc 4020
tcgttcatac tggacagatt tgtgaaagtg acaccaaaag accaaattaa tgtgttggac 4080
ctgatgcaga cccccgccca cactttggta ggtgcgcttc tccgcaccgc cacctactac 4140
ttcgcagacc tagaggtggc agtgaaacac gaggggaacc ttacctgggt cccgaatggg 4200
gcgcccgaga cagcgttgga taacaccacc aatccaacgg cttaccacaa ggcacctctc 4260
acccggcttg cgctgcctta cacggcacca caccgtgtct tggctactgt ttacaacggg 4320
aactgcaagt atggcgagag ctccacaacc aacgtgagag gtgacctgca agtgttggcc 4380
ggtaagcagc tctacaacgt ggaggccaca tcctatgccc agaaagcggc gagagcgctg 4440
cctacctcct ttaactacgg tgccattaag gccactcggg tgactgaact gctttaccgc 4500
atgaagaggg ctgaaacata ctgcccccgg cctcttttgg ctattcaccc gagcgaagca 4560
agacacaaac aaaagatagt ggcacctgtg aaacagcttc taaattttga cctgctcaaa 4620
ttggcgggag atgtggagtc caaccctggg cccttcttct tctccgacgt caggtcaaat 4680
ttctcaaaac tggtagaaac catcaatcag atgcaggagg acatgtcaac aaaacacggg 4740
cctgacttta accggttggt gtccgcattt gaggaattgg ccactggagt gaaggctatc 4800
agggccggtc tcgacgaggc caaaccctgg tacaaactca tcaagctcct gagccgcttg 4860
tcgtgcatgg ccgctgtagc agcacggtca aaggacccag tccttgtggc catcatgctg 4920
gctgacaccg gtcttgagat tctggacagc acctttgtcg tgaagaagat ctccgactcg 4980
ctctccagtc tctttcacgt gccggccccc gtcttcagtt tcggagcccc gattctgttg 5040
gccgggttgg tcaaagtcgc ctcgagtttc ttccggtcca cacccgaaga ccttgagaga 5100
gcagaaaaac agctcaaagc acgtgacatt aacgacatat tcgccattct caagaacggc 5160
gagtggctgg tcaagctgat ccttgccatc cgcgactgga tcaaagcgtg gatcgcctca 5220
gaagaaaagt ttgtcaccat gacggacttg gtgcctggta tccttgaaaa gcagcgggat 5280
ctcaacgacc cgagtaagta caaggaagcc aaggagtggc tcgacaacgc gcgccaggcg 5340
tgtttgaaga gcgggaacgt tcacattgcc aatttgtgca aagtggtcgc cccggcaccc 5400
agcaagtcga gacccgaacc cgtggtcgtt tgcctccgcg gcaaatccgg ccaggggaag 5460
agtttccttg cgaacgtgct cgcgcaagca atctccaccc acttcaccgg cagaactgat 5520
tcggtttggt actgcccgcc tgaccctgac cacttcgacg gttacaacca gcagaccgtt 5580
gtcgtgatgg acgatttggg ccagaacccc gatggcaagg acttcaagta cttcgcccag 5640
atggtttcga ccacggggtt catcccgccc atggcctcgc ttgaggacaa aggcaagcct 5700
ttcaacagca aagtcatcat tgctaccacc aacctgtact cgggtttcac cccgagaaca 5760
atggtgtgtc ctgacgcgct gaaccggagg ttccactttg acatcgacgt gagtgccaag 5820
gacgggtaca aagttaacaa caaattggac ataatcaaag ctcttgaaga cacccacacc 5880
aacccagtgg cgatgttcca atacgactgt gcccttctaa acggtatggc agttgaaatg 5940
aagagaatgc aacaggatat gttcaagcct caaccacccc tccagaacgt gtaccaactc 6000
gttcacgagg tgattgaacg ggtcgagctc cacgagaagg tgtcgagcca cccgattttc 6060
aaacagatat caattccttc ccaaaagtct gtgttgtact tcctcattga gaaaggccaa 6120
cacgaagcag caattgaatt ctttgaggga atggtgcatg actccatcaa ggaagagctc 6180
cggcccctca tccaacagac ctcatttgtg aaacgcgctt ttaagcgcct gaaggaaaac 6240
tttgagactg ttgccctgtg tttgactctt ttggcaaaca tagtgatcat gatccgcgag 6300
actcgcaaga gacaacagat ggtggacgat gcagtgaatg actacattga gaaggcaaac 6360
atcaccacag atgacaagac tcttgacgag gcggaaaaga accctctaga gaccagcggt 6420
gccagcacta ttggtttcag agagagaact ctcccggggc acaaggcgag cgatgacgtg 6480
agctccgagc ccgccaaacc cgtggaggac cgaccacaag ctgaaggacc ttacgaggga 6540
ccggtgaaga agcctgtcgc tttgaaagtg aaagctaaga acttgattgt cactgagggg 6600
ccatatgaag gaccagtgaa gaaacctgtc gctttgaaag tgaaagcaaa agccccgatt 6660
gtcactgaag gaccctacga gggaccggtg aagaagcctg tcgctttgaa agtgaaagcc 6720
aagaacttga ttgtcactga gagtggtgcc ccaccgaccg acttgcagaa gatggtcatg 6780
ggcaacacta agcctgttga gctcatcctc gacgggaaga cggtagccat ctgctgtgct 6840
accggagtgt ttggcactgc ctacctcgta cctcgtcacc tcttcgcgga gaagtacgac 6900
aagataatgt tggacggtag agccatgaca gacagtgact acagagtgtt tgagtttgag 6960
attaaagtaa aaggacagga catgctctca gacgctgcac tcatggtgct tcaccgtggg 7020
aaccgcgtga gagacatcac gaaacatttt cgtgacacag caagaatgaa gaaaggcacc 7080
cccgttgtcg gtgtgatcaa caacgccgac gttgggagac tgattttctc tggagaggcc 7140
cttacctaca aagacattgt agtgaccatg gatggagaca ccatgccggg cctgtttgcc 7200
tacagagccg ccaccaaggc tggttactgc gggggagccg ttctcgccaa ggacggagcc 7260
gacacattca tcgttggcac ccactccgca ggtggtaacg gagttggata ctgctcgtgc 7320
gtgtccaggt ccatgctcct gaaaatgaag gcacacattg accctgaacc acaccacgag 7380
gggttgattg ttgataccag agatgtggaa gagcgcgtgc atgtcatgcg taaaaccaag 7440
cttgcaccca ccgtggcaca cggtgtgttt aaccctgaat ttggtcccgc tgccttgtcc 7500
aacaaggacc cgcggctgaa cgaaggggtt gtcctcgatg aagtcatctt ctccaaacac 7560
aagggagaca cgaaaatgtc tgaggaggac aaagcgctgt tccgccgctg cgctgccgac 7620
tacgcgtcgc acttgcacag cgtgctgggg acggcaaatg ccccattgag catctatgag 7680
gccatcaaag gcgtcgacgg gctcgatgcc atggagccgg acaccgcgcc cggcctcccc 7740
tgggccctcc aggggaaacg ccgtggtgcg ttgattgact tcgagaacgg cacggtcgga 7800
cccgaagtcg aggctgccct aaagctcatg gagaaaagag agtacaaatt tgcttgccag 7860
accttcctga aagacgagat tcgtccgatg gaaaaagtac gtgctggcaa gactcgcatt 7920
gtcgacgttt tgcccgtgga acacattctt tacaccagga tgatgattgg cagattctgt 7980
gctcaaatgc acacaaacaa tggaccgcag attggctcag cggtcggttg caatcctgat 8040
gttgattggc aaagatttgg cacacatttt gctcagtaca gaaacgtgtg ggatgtggac 8100
tattcggcct ttgatgctaa ccactgcagt gacgcaatga acatcatgtt tgaggaggta 8160
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acggagcacg cctatgagaa caaacgtatc actgttgagg gcgggatgcc gtctggctgt 8280
tccgcgacaa gcatcatcaa cacaattttg aacaacattt atgtgctcta cgctcttcgt 8340
agacactatg agggagttga gctggacacc tacaccatga tctcctacgg agatgacatc 8400
gtggttgcaa gtgactacga tctggatttt gaggctctca aaccccactt caaatctctt 8460
ggtcaaacca tcactccagc tgacaaaagc gacaaaggtt ttgttcttgg tcactccatt 8520
accgatgtca ctttcctcaa aagacacttc cacatggact atggaactgg gttttacaaa 8580
cctgtgatgg cctcaaagac cctcgaggcc attctctcct ttgcacgccg tgggaccata 8640
caggagaagt tgatctccgt ggcaggactc gccgtccact caggacctga cgagtaccgg 8700
cgtctctttg agcccttcca gggtctcttc gagattccaa gctacagatc actttacctg 8760
cgttgggtga acgccgtgtg cggtgacgca taatccctca gatgtcacaa ttggcagaaa 8820
gactctgagg cgagcgacgc cgtaggagtg aaaagcccga aagggctttt cccgcttcct 8880
attccaaaaa aaaaaaaaaa aaactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca 8940
gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 9000
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 9060
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tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 9180
cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 9240
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 9300
ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 9360
ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 9420
atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 9480
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ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 9660
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acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 9780
gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat 9840
ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 9900
ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 9960
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ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 10080
agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 10140
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 10200
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gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 10620
tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 10680
gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 10740
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gagaaagctg cacactgcat ccatgctgag tgggacacag ggttgaactc caagtttact 1380
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caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080
gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140
ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200
cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260
ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320
aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380
actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440
tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500
accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560
gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620
cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680
agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740
actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800
atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860
gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920
ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980
aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040
ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100
actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160
tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220
aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280
gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340
cagaaaaggc tcaagggagc cgggcaatcc agtccggcga ctgggtcgca gaaccagtca 2400
ggcaacactg ggagtattat taacaactac tacatgcaac agtaccagaa ctccatggac 2460
acccaattag gtgacaacgc tataagcgga ggctccaatg agggatccac ggacacaact 2520
tccacccaca caaccaacac tcagaacaac gactggtttt caaagcttgc cagttctgct 2580
ttcagcggtc ttttcggcgc ccttctcgcc gataagaaga ccgaggagac cactctcctc 2640
gaggaccgca ttctcaccac ccgcaacggg cacaccacct ccacaaccca atcgagtgtg 2700
ggagtcacgt acgggtactc cacccaggaa gatcatgttt ccggacctaa cacatctggt 2760
ttggagacgc gggtggtgca ggcagaaaga tttttcaaga agcacctgtt tgattggaca 2820
ccggacaaag cttttgggca cttagagaag ttggaacttc ccactgacca caagggagtc 2880
tacggacact tggtggactc atttgcatac atgagaaatg gctgggacgt ggaggtgtcc 2940
gctgttggca accagtttaa cggcgggtgt ctcctggtgg ccatggtccc tgaatggaaa 3000
gagttcaccc cgcgtgagaa gtaccagctc actttgtttc cacaccagtt catcagcccc 3060
agaaccaaca tgactgccca catcgtagtc ccgtaccttg gtgtgaacag gtacgaccag 3120
tataagaagc acaaaccctg gacgctggtt gtgatggtgg tctcaccgct caccaccaac 3180
actgttagtg caggacaaat caaggtttat gccaacattg ccccgactca cgttcacgtg 3240
gccggcgagc tcccctcgaa agaggggatt gtaccggtcg cttgttcgga cgggtacggt 3300
ggcttggtga caacagaccc aaaaacagct gaccctgttt atggtatggt gtacaacccc 3360
cccaggacaa actaccccgg gcggttcaca aacctgttgg atgtggctga ggcctgcccc 3420
acctttctct gtttcgacga agggaaaccg tacgttgtga caagaacgga cgagcagcgt 3480
cttctggcca agttcgacgt ctctcttgct gcaaagcaca tgtcaaacac ctacctttca 3540
gggatagcac agtactacgc acagtactct ggtaccatca acctgcactt catgtttacc 3600
ggctccacgg attcaaaagc ccgctacatg gtggcgtacg ttccacccgg tgtggagaca 3660
ccgccggaca cgcctgagaa agctgcacac tgcatccatg ctgagtggga cacagggttg 3720
aactccaagt ttactttctc tatcccgtac gtgtctgccg cagattacgc gtacactgcg 3780
tctgatgtgg cagaaacaac aaacgtacag ggatgggtct gcatatacca aattacacac 3840
gggaaagctg aacaagacac tctggttgtg tcggctagcg ccggcaagga ctttgagttg 3900
cgcctcccga ttgacccccg ctcacaaacc actaccaccg gggagtctgc agaccctgtc 3960
accaccactg ttgaaaacta cggcggtgag acacaagtcc aacgacgtca gcacaccgac 4020
gttactttca taatggacag atttgtaaag atacaaaact tgaaccccac acatgtcatt 4080
gacctcatgc aaacccacca acacgggttg gtaggtgccc tgttacgtgc tgctacgtac 4140
tacttctctg acctggagat tgtggtacgc catgacggta acctaacctg ggtacccaat 4200
ggagcacccg aggcagctct gtctaacacg ggcaacccca ccgcctacct caaggcacca 4260
tttacgaggc tcgcgctccc ctacaccgcg ccacaccgcg tgttggcaac agtgtacaac 4320
gggacgagca agtactccgc aggtggtacg ggcagacggg gcgacctagg gcctctcgcg 4380
gcgagggtcg ccgctcagct tcctgcttct ttcaactttg gtgcaattca agccacgacc 4440
atccacgagc tcctcgtgcg catgaagcgt gccgaactct actgccccag accactgttg 4500
gcagtggagg tgtcgtctca agacagacac aaacagaaga tcattgcacc tgcaaaacaa 4560
cttctaaatt ttgacctgct caaattggcg ggagatgtgg agtccaaccc tgggcccttc 4620
ttcttctccg acgtcaggtc aaatttctca aaactggtag aaaccatcaa tcagatgcag 4680
gaggacatgt caacaaaaca cgggcctgac tttaaccggt tggtgtccgc atttgaggaa 4740
ttggccactg gagtgaaggc tatcagggcc ggtctcgacg aggccaaacc ctggtacaaa 4800
ctcatcaagc tcctgagccg cttgtcgtgc atggccgctg tagcagcacg gtcaaaggac 4860
ccagtccttg tggccatcat gctggctgac accggtcttg agattctgga cagcaccttt 4920
gtcgtgaaga agatctccga ctcgctctcc agtctctttc acgtgccggc ccccgtcttc 4980
agtttcggag ccccgattct gttggccggg ttggtcaaag tcgcctcgag tttcttccgg 5040
tccacacccg aagaccttga gagagcagaa aaacagctca aagcacgtga cattaacgac 5100
atattcgcca ttctcaagaa cggcgagtgg ctggtcaagc tgatccttgc catccgcgac 5160
tggatcaaag cgtggatcgc ctcagaagaa aagtttgtca ccatgacgga cttggtgcct 5220
ggtatccttg aaaagcagcg ggatctcaac gacccgagta agtacaagga agccaaggag 5280
tggctcgaca acgcgcgcca ggcgtgtttg aagagcggga acgttcacat tgccaatttg 5340
tgcaaagtgg tcgccccggc acccagcaag tcgagacccg aacccgtggt cgtttgcctc 5400
cgcggcaaat ccggccaggg gaagagtttc cttgcgaacg tgctcgcgca agcaatctcc 5460
acccacttca ccggcagaac tgattcggtt tggtactgcc cgcctgaccc tgaccacttc 5520
gacggttaca accagcagac cgttgtcgtg atggacgatt tgggccagaa ccccgatggc 5580
aaggacttca agtacttcgc ccagatggtt tcgaccacgg ggttcatccc gcccatggcc 5640
tcgcttgagg acaaaggcaa gcctttcaac agcaaagtca tcattgctac caccaacctg 5700
tactcgggtt tcaccccgag aacaatggtg tgtcctgacg cgctgaaccg gaggttccac 5760
tttgacatcg acgtgagtgc caaggacggg tacaaagtta acaacaaatt ggacataatc 5820
aaagctcttg aagacaccca caccaaccca gtggcgatgt tccaatacga ctgtgccctt 5880
ctaaacggta tggcagttga aatgaagaga atgcaacagg atatgttcaa gcctcaacca 5940
cccctccaga acgtgtacca actcgttcac gaggtgattg aacgggtcga gctccacgag 6000
aaggtgtcga gccacccgat tttcaaacag atatcaattc cttcccaaaa gtctgtgttg 6060
tacttcctca ttgagaaagg ccaacacgaa gcagcaattg aattctttga gggaatggtg 6120
catgactcca tcaaggaaga gctccggccc ctcatccaac agacctcatt tgtgaaacgc 6180
gcttttaagc gcctgaagga aaactttgag actgttgccc tgtgtttgac tcttttggca 6240
aacatagtga tcatgatccg cgagactcgc aagagacaac agatggtgga cgatgcagtg 6300
aatgactaca ttgagaaggc aaacatcacc acagatgaca agactcttga cgaggcggaa 6360
aagaaccctc tagagaccag cggtgccagc actattggtt tcagagagag aactctcccg 6420
gggcacaagg cgagcgatga cgtgagctcc gagcccgcca aacccgtgga ggaccgacca 6480
caagctgaag gaccttacga gggaccggtg aagaagcctg tcgctttgaa agtgaaagct 6540
aagaacttga ttgtcactga ggggccatat gaaggaccag tgaagaaacc tgtcgctttg 6600
aaagtgaaag caaaagcccc gattgtcact gaaggaccct acgagggacc ggtgaagaag 6660
cctgtcgctt tgaaagtgaa agccaagaac ttgattgtca ctgagagtgg tgccccaccg 6720
accgacttgc agaagatggt catgggcaac actaagcctg ttgagctcat cctcgacggg 6780
aagacggtag ccatctgctg tgctaccgga gtgtttggca ctgcctacct cgtacctcgt 6840
cacctcttcg cggagaagta cgacaagata atgttggacg gtagagccat gacagacagt 6900
gactacagag tgtttgagtt tgagattaaa gtaaaaggac aggacatgct ctcagacgct 6960
gcactcatgg tgcttcaccg tgggaaccgc gtgagagaca tcacgaaaca ttttcgtgac 7020
acagcaagaa tgaagaaagg cacccccgtt gtcggtgtga tcaacaacgc cgacgttggg 7080
agactgattt tctctggaga ggcccttacc tacaaagaca ttgtagtgac catggatgga 7140
gacaccatgc cgggcctgtt tgcctacaga gccgccacca aggctggtta ctgcggggga 7200
gccgttctcg ccaaggacgg agccgacaca ttcatcgttg gcacccactc cgcaggtggt 7260
aacggagttg gatactgctc gtgcgtgtcc aggtccatgc tcctgaaaat gaaggcacac 7320
attgaccctg aaccacacca cgaggggttg attgttgata ccagagatgt ggaagagcgc 7380
gtgcatgtca tgcgtaaaac caagcttgca cccaccgtgg cacacggtgt gtttaaccct 7440
gaatttggtc ccgctgcctt gtccaacaag gacccgcggc tgaacgaagg ggttgtcctc 7500
gatgaagtca tcttctccaa acacaaggga gacacgaaaa tgtctgagga ggacaaagcg 7560
ctgttccgcc gctgcgctgc cgactacgcg tcgcacttgc acagcgtgct ggggacggca 7620
aatgccccat tgagcatcta tgaggccatc aaaggcgtcg acgggctcga tgccatggag 7680
ccggacaccg cgcccggcct cccctgggcc ctccagggga aacgccgtgg tgcgttgatt 7740
gacttcgaga acggcacggt cggacccgaa gtcgaggctg ccctaaagct catggagaaa 7800
agagagtaca aatttgcttg ccagaccttc ctgaaagacg agattcgtcc gatggaaaaa 7860
gtacgtgctg gcaagactcg cattgtcgac gttttgcccg tggaacacat tctttacacc 7920
aggatgatga ttggcagatt ctgtgctcaa atgcacacaa acaatggacc gcagattggc 7980
tcagcggtcg gttgcaatcc tgatgttgat tggcaaagat ttggcacaca ttttgctcag 8040
tacagaaacg tgtgggatgt ggactattcg gcctttgatg ctaaccactg cagtgacgca 8100
atgaacatca tgtttgagga ggtatttcgc acagacttcg gtttccaccc aaatgctgag 8160
tggattctga agactcttgt gaacacggag cacgcctatg agaacaaacg tatcactgtt 8220
gagggcggga tgccgtctgg ctgttccgcg acaagcatca tcaacacaat tttgaacaac 8280
atttatgtgc tctacgctct tcgtagacac tatgagggag ttgagctgga cacctacacc 8340
atgatctcct acggagatga catcgtggtt gcaagtgact acgatctgga ttttgaggct 8400
ctcaaacccc acttcaaatc tcttggtcaa accatcactc cagctgacaa aagcgacaaa 8460
ggttttgttc ttggtcactc cattaccgat gtcactttcc tcaaaagaca cttccacatg 8520
gactatggaa ctgggtttta caaacctgtg atggcctcaa agaccctcga ggccattctc 8580
tcctttgcac gccgtgggac catacaggag aagttgatct ccgtggcagg actcgccgtc 8640
cactcaggac ctgacgagta ccggcgtctc tttgagccct tccagggtct cttcgagatt 8700
ccaagctaca gatcacttta cctgcgttgg gtgaacgccg tgtgcggtga cgcataatcc 8760
ctcagatgtc acaattggca gaaagactct gaggcgagcg acgccgtagg agtgaaaagc 8820
ccgaaagggc ttttcccgct tcctattcca aaaaaaaaaa aaaaaaacta gttctagagc 8880
ggccgccacc gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct 8940
tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac 9000
acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac 9060
tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 9120
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg 9180
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 9240
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 9300
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 9360
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 9420
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 9480
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 9540
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 9600
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 9660
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 9720
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 9780
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 9840
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 9900
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 9960
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 10020
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 10080
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 10140
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 10200
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 10260
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 10320
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 10380
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 10440
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 10500
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 10560
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 10620
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 10680
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 10740
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 10800
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 10860
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 10920
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 10980
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 11040
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 11100
cac 11103
<210> 11
<211> 11142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant plasmid(O1 M-A22 P1-C3d)
<400> 11
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc atatgtaata cgactcacta tagggttgaa agggggcgct 660
agggtctcac ccctagcatg ccaacgacag ctcctacgtc gcactccaca ctaacgtttg 720
tgtgcgcgcg ggaaccgatg gacttttgtt cacccaccta cagttggact cacggcaccg 780
cgtggccatt ttagctgggt tgtgcggacg aacactgctt gcgcatctcg cgtgaccggt 840
tagtactctt accactatcc gcctacttgg tcgttagcgc tgtcctgggc actcttgttg 900
ggggctgttc aacgctctac ggtctcccct gcgtaacaga ctacggtgtt ggggccgctt 960
cgtgcgagcc gatcgcttgg tgtgcctcgg ctgtcgcccg aagcccgcct ttcacccccc 1020
cccccccccc ccccctaggt tttaccgtcg ttcccgacgt taatggggaa acaaccacaa 1080
gcttaacacc gtcttgcccg acgtaaaagg gctgcaacca aaaagcttgt gccgcctttc 1140
ccggcgttaa tgggaggtaa ccacaagaca aaccttcacc cggaagtaaa acggcaactt 1200
cacacagttt tgcccgtttt cgtgagaaat gggccgtcaa cgcacgaaac gcgccgtcgc 1260
ttgaggagga cttgtacaaa cacgatctat gcaggtttcc acaactgaca caaaccgtgc 1320
aacttgaaac cccgcctggt ctttccaggt ctagaggggc gacattttgt actgtgcttg 1380
actccacgct cggtccacta gcgagtgtta gtagtagcac tgttgcttcg tagcggagca 1440
tgatggccgt gggagcttcc ccttggtaac aaggacccac ggggccaaaa gccacgtcct 1500
accggaccca tcatgtgtgc aaacccagca cggcaacttt actgcgaaaa ccactttaag 1560
gtgacactga tactggtact caatcactgg tgacaggcta aggatgccct tcaggtaccc 1620
cgaggtaaca cgcgacactc gggatctgag aaggggactg gggcttcttt aaaagtgccc 1680
agtttaaaaa gcttctatgc ctgaataggc gaccggaggc cggcgccttt tcactgtttt 1740
actactgttt tcatgaatac aactgactgt ttcaccgccc tgttacacgc tctcagagag 1800
atcaaaacac tgtttctttt acggacacaa ggaaagatgg aattcacact ttacaacggt 1860
gagaagaaaa ccttctactc cagacccaac aaccacgaca actgctggct taacaccatt 1920
ctccagttgt tcaggtatgt tgatgagcct ttctttgact gggtctacga ctcgcctgaa 1980
aacctcactc ttgaggcaat caaacagttg gaagagacaa ccggtcttga gctgcacgag 2040
ggtggaccac ccgctctcgt catctggaac atcaaacact tgcttcacac cggaatcggc 2100
actgcctcac gccctagcga ggtgtgtatg gtggacggaa cggacatgtg tttagctgat 2160
tttcatgctg gcattttcct gaaaggacag gaacatgctg tgttcgcctg tgtcacctcc 2220
aacgggtggt acgcgattga tgacgaggac ttttaccctt ggacaccgga cccgtccgac 2280
gttctggtgt ttgtcccgta cgatcaagaa ccgcttaacg gagagtggaa aacaaaggtc 2340
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ccggacaaag cttttgggca cttagagaag ttggaacttc ccactgacca caagggagtc 2880
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gctgttggca accagtttaa cggcgggtgt ctcctggtgg ccatggtccc tgaatggaaa 3000
gagttcaccc cgcgtgagaa gtaccagctc actttgtttc cacaccagtt catcagcccc 3060
agaaccaaca tgactgccca catcgtagtc ccgtaccttg gtgtgaacag gtacgaccag 3120
tataagaagc acaaaccctg gacgctggtt gtgatggtgg tctcaccgct caccaccaac 3180
actgttagtg caggacaaat caaggtttat gccaacattg ccccgactca cgttcacgtg 3240
gccggcgagc tcccctcgaa agaggggatt gtaccggtcg cttgttcgga cgggtacggt 3300
ggcttggtga caacagaccc aaaaacagct gaccctgttt atggtatggt gtacaacccc 3360
cccaggacaa actaccccgg gcggttcaca aacctgttgg atgtggctga ggcctgcccc 3420
acctttctct gtttcgacga agggaaaccg tacgttgtga caagaacgga cgagcagcgt 3480
cttctggcca agttcgacgt ctctcttgct gcaaagcaca tgtcaaacac ctacctttca 3540
gggatagcac agtactacgc acagtactct ggtaccatca acctgcactt catgtttacc 3600
ggctccacgg attcaaaagc ccgctacatg gtggcgtacg ttccacccgg tgtggagaca 3660
ccgccggaca cgcctgagaa agctgcacac tgcatccatg ctgagtggga cacagggttg 3720
aactccaagt ttactttctc tatcccgtac gtgtctgccg cagattacgc gtacactgcg 3780
tctgatgtgg cagaaacaac aaacgtacag ggatgggtct gcatatacca aattacacac 3840
gggaaagctg aacaagacac tctggttgtg tcggctagcg ccggcaagga ctttgagttg 3900
cgcctcccga ttgacccccg ctcacaaacc actaccaccg gggagtctgc agaccctgtc 3960
accaccactg ttgaaaacta cggcggtgag acacaagtcc aacgacgtca gcacaccgac 4020
gttactttca taatggacag atttgtaaag atacaaaact tgaaccccac acatgtcatt 4080
gacctcatgc aaacccacca acacgggttg gtaggtgccc tgttacgtgc tgctacgtac 4140
tacttctctg acctggagat tgtggtacgc catgacggta acctaacctg ggtacccaat 4200
ggagcacccg aggcagctct gtctaacacg ggcaacccca ccgcctacct caaggcacca 4260
tttacgaggc tcgcgctccc ctacaccgcg ccacaccgcg tgttggcaac agtgtacaac 4320
gggacgagca agtactccgc aggtggtacg ggcagacggg gcgacctagg gcctctcgcg 4380
ggtaagcagc tctacaacgt ggaggccaca tcctatgccg cgagggtcgc cgctcagctt 4440
cctgcttctt tcaactttgg tgcaattcaa gccacgacca tccacgagct cctcgtgcgc 4500
atgaagcgtg ccgaactcta ctgccccaga ccactgttgg cagtggaggt gtcgtctcaa 4560
gacagacaca aacagaagat cattgcacct gcaaaacaac ttctaaattt tgacctgctc 4620
aaattggcgg gagatgtgga gtccaaccct gggcccttct tcttctccga cgtcaggtca 4680
aatttctcaa aactggtaga aaccatcaat cagatgcagg aggacatgtc aacaaaacac 4740
gggcctgact ttaaccggtt ggtgtccgca tttgaggaat tggccactgg agtgaaggct 4800
atcagggccg gtctcgacga ggccaaaccc tggtacaaac tcatcaagct cctgagccgc 4860
ttgtcgtgca tggccgctgt agcagcacgg tcaaaggacc cagtccttgt ggccatcatg 4920
ctggctgaca ccggtcttga gattctggac agcacctttg tcgtgaagaa gatctccgac 4980
tcgctctcca gtctctttca cgtgccggcc cccgtcttca gtttcggagc cccgattctg 5040
ttggccgggt tggtcaaagt cgcctcgagt ttcttccggt ccacacccga agaccttgag 5100
agagcagaaa aacagctcaa agcacgtgac attaacgaca tattcgccat tctcaagaac 5160
ggcgagtggc tggtcaagct gatccttgcc atccgcgact ggatcaaagc gtggatcgcc 5220
tcagaagaaa agtttgtcac catgacggac ttggtgcctg gtatccttga aaagcagcgg 5280
gatctcaacg acccgagtaa gtacaaggaa gccaaggagt ggctcgacaa cgcgcgccag 5340
gcgtgtttga agagcgggaa cgttcacatt gccaatttgt gcaaagtggt cgccccggca 5400
cccagcaagt cgagacccga acccgtggtc gtttgcctcc gcggcaaatc cggccagggg 5460
aagagtttcc ttgcgaacgt gctcgcgcaa gcaatctcca cccacttcac cggcagaact 5520
gattcggttt ggtactgccc gcctgaccct gaccacttcg acggttacaa ccagcagacc 5580
gttgtcgtga tggacgattt gggccagaac cccgatggca aggacttcaa gtacttcgcc 5640
cagatggttt cgaccacggg gttcatcccg cccatggcct cgcttgagga caaaggcaag 5700
cctttcaaca gcaaagtcat cattgctacc accaacctgt actcgggttt caccccgaga 5760
acaatggtgt gtcctgacgc gctgaaccgg aggttccact ttgacatcga cgtgagtgcc 5820
aaggacgggt acaaagttaa caacaaattg gacataatca aagctcttga agacacccac 5880
accaacccag tggcgatgtt ccaatacgac tgtgcccttc taaacggtat ggcagttgaa 5940
atgaagagaa tgcaacagga tatgttcaag cctcaaccac ccctccagaa cgtgtaccaa 6000
ctcgttcacg aggtgattga acgggtcgag ctccacgaga aggtgtcgag ccacccgatt 6060
ttcaaacaga tatcaattcc ttcccaaaag tctgtgttgt acttcctcat tgagaaaggc 6120
caacacgaag cagcaattga attctttgag ggaatggtgc atgactccat caaggaagag 6180
ctccggcccc tcatccaaca gacctcattt gtgaaacgcg cttttaagcg cctgaaggaa 6240
aactttgaga ctgttgccct gtgtttgact cttttggcaa acatagtgat catgatccgc 6300
gagactcgca agagacaaca gatggtggac gatgcagtga atgactacat tgagaaggca 6360
aacatcacca cagatgacaa gactcttgac gaggcggaaa agaaccctct agagaccagc 6420
ggtgccagca ctattggttt cagagagaga actctcccgg ggcacaaggc gagcgatgac 6480
gtgagctccg agcccgccaa acccgtggag gaccgaccac aagctgaagg accttacgag 6540
ggaccggtga agaagcctgt cgctttgaaa gtgaaagcta agaacttgat tgtcactgag 6600
gggccatatg aaggaccagt gaagaaacct gtcgctttga aagtgaaagc aaaagccccg 6660
attgtcactg aaggacccta cgagggaccg gtgaagaagc ctgtcgcttt gaaagtgaaa 6720
gccaagaact tgattgtcac tgagagtggt gccccaccga ccgacttgca gaagatggtc 6780
atgggcaaca ctaagcctgt tgagctcatc ctcgacggga agacggtagc catctgctgt 6840
gctaccggag tgtttggcac tgcctacctc gtacctcgtc acctcttcgc ggagaagtac 6900
gacaagataa tgttggacgg tagagccatg acagacagtg actacagagt gtttgagttt 6960
gagattaaag taaaaggaca ggacatgctc tcagacgctg cactcatggt gcttcaccgt 7020
gggaaccgcg tgagagacat cacgaaacat tttcgtgaca cagcaagaat gaagaaaggc 7080
acccccgttg tcggtgtgat caacaacgcc gacgttggga gactgatttt ctctggagag 7140
gcccttacct acaaagacat tgtagtgacc atggatggag acaccatgcc gggcctgttt 7200
gcctacagag ccgccaccaa ggctggttac tgcgggggag ccgttctcgc caaggacgga 7260
gccgacacat tcatcgttgg cacccactcc gcaggtggta acggagttgg atactgctcg 7320
tgcgtgtcca ggtccatgct cctgaaaatg aaggcacaca ttgaccctga accacaccac 7380
gaggggttga ttgttgatac cagagatgtg gaagagcgcg tgcatgtcat gcgtaaaacc 7440
aagcttgcac ccaccgtggc acacggtgtg tttaaccctg aatttggtcc cgctgccttg 7500
tccaacaagg acccgcggct gaacgaaggg gttgtcctcg atgaagtcat cttctccaaa 7560
cacaagggag acacgaaaat gtctgaggag gacaaagcgc tgttccgccg ctgcgctgcc 7620
gactacgcgt cgcacttgca cagcgtgctg gggacggcaa atgccccatt gagcatctat 7680
gaggccatca aaggcgtcga cgggctcgat gccatggagc cggacaccgc gcccggcctc 7740
ccctgggccc tccaggggaa acgccgtggt gcgttgattg acttcgagaa cggcacggtc 7800
ggacccgaag tcgaggctgc cctaaagctc atggagaaaa gagagtacaa atttgcttgc 7860
cagaccttcc tgaaagacga gattcgtccg atggaaaaag tacgtgctgg caagactcgc 7920
attgtcgacg ttttgcccgt ggaacacatt ctttacacca ggatgatgat tggcagattc 7980
tgtgctcaaa tgcacacaaa caatggaccg cagattggct cagcggtcgg ttgcaatcct 8040
gatgttgatt ggcaaagatt tggcacacat tttgctcagt acagaaacgt gtgggatgtg 8100
gactattcgg cctttgatgc taaccactgc agtgacgcaa tgaacatcat gtttgaggag 8160
gtatttcgca cagacttcgg tttccaccca aatgctgagt ggattctgaa gactcttgtg 8220
aacacggagc acgcctatga gaacaaacgt atcactgttg agggcgggat gccgtctggc 8280
tgttccgcga caagcatcat caacacaatt ttgaacaaca tttatgtgct ctacgctctt 8340
cgtagacact atgagggagt tgagctggac acctacacca tgatctccta cggagatgac 8400
atcgtggttg caagtgacta cgatctggat tttgaggctc tcaaacccca cttcaaatct 8460
cttggtcaaa ccatcactcc agctgacaaa agcgacaaag gttttgttct tggtcactcc 8520
attaccgatg tcactttcct caaaagacac ttccacatgg actatggaac tgggttttac 8580
aaacctgtga tggcctcaaa gaccctcgag gccattctct cctttgcacg ccgtgggacc 8640
atacaggaga agttgatctc cgtggcagga ctcgccgtcc actcaggacc tgacgagtac 8700
cggcgtctct ttgagccctt ccagggtctc ttcgagattc caagctacag atcactttac 8760
ctgcgttggg tgaacgccgt gtgcggtgac gcataatccc tcagatgtca caattggcag 8820
aaagactctg aggcgagcga cgccgtagga gtgaaaagcc cgaaagggct tttcccgctt 8880
cctattccaa aaaaaaaaaa aaaaaactag ttctagagcg gccgccaccg cggtggagct 8940
ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc 9000
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 9060
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 9120
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 9180
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 9240
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 9300
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 9360
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 9420
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 9480
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 9540
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 9600
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 9660
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 9720
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 9780
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 9840
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 9900
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 9960
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 10020
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 10080
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 10140
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 10200
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 10260
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 10320
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 10380
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 10440
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 10500
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 10560
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 10620
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 10680
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 10740
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 10800
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 10860
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 10920
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 10980
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 11040
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 11100
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 11142
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward universal primer for VP1
<400> 12
agngcnggna artttga 17
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse universal primer for VP1
<400> 13
catgtcntcc atctggtt 18
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IFN-alpha
<400> 14
catctgctct ctgggctgtg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IFN-alpha
<400> 15
tgaggggatc caaagtccct 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IFN-beta
<400> 16
tgcaaccacc acaattccag a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IFN-beta
<400> 17
ggtttcattc cagccagtgc 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IFN-gamma
<400> 18
gccattcaaa ggagcatgga t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IFN-gamma
<400> 19
ctgatggctt tgcgctggat 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-1beta
<400> 20
agccagtctt cattgttcag gt 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-1beta
<400> 21
tcatctcttt ggggccatca g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-17A
<400> 22
ctcgtgaagg cgggaatcat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-17A
<400> 23
ggtgtgctcc ggttcaagat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-23p19
<400> 24
ccatatccag tgcggggatg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-23p19
<400> 25
aggccttggt ggatcctttg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-23R
<400> 26
tccctcattg caaagcacaa 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-23R
<400> 27
gcatctcctc ttgcaagcaa at 22
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-2
<400> 28
aagctctgga gggagtgcta 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-2
<400> 29
caacagcagt tactgtctca tca 23
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-10
<400> 30
cggcccagtg aagagtttct 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-10
<400> 31
tgccttcggc attacgtctt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for TGF-beta
<400> 32
ggctgtcctt tgatgtcacc 20
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for TGF-beta
<400> 33
ggccagaatt gaacccgt 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-4
<400> 34
ctcacctccc aactgatccc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-4
<400> 35
tgtgtccgtg gacgaagttg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IL-6
<400> 36
ctgcagtcac agaacgagtg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IL-6
<400> 37
cggcatcaat ctcaggtgcc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CD40
<400> 38
gtcatcagca caaatactgc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CD40
<400> 39
cacaagtggt gtctgttttc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CD80
<400> 40
tcaggcatcg ttcaggtgac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CD80
<400> 41
tgacagccag caccatttca 20
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CD86
<400> 42
tgggactgag taacattctc tttgt 25
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CD86
<400> 43
ccagctcatc caggcttagg 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for MHC Class I
<400> 44
tgagctattt ctacaccgcc g 21
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for MHC Class I
<400> 45
tcgtccacgt agccgactt 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for MHC Class II
<400> 46
ctccagtgat gctgggtcag 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for MHC Class II
<400> 47
tgacagagtg cccgttcttc 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CD21
<400> 48
tgccatgcct acaaagctga 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CD21
<400> 49
gtagtaacca gggcggcatt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CD28
<400> 50
tcaaaggagt tccgggcatc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CD28
<400> 51
ctgaagcagg cgggagtaat 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for ICOS
<400> 52
ggatgtgcag cctttgttgt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for ICOS
<400> 53
cagagcgtac caaattgcgg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for CTLA4
<400> 54
gagtatgggt ctgcaggcaa 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for CTLA4
<400> 55
atatgtcgcg gcacagactt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for AHNAK
<400> 56
caccatcacc gtgactcgaa 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for AHNAK
<400> 57
agttcgtgcc gtggaatctt 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for HPRT
<400> 58
cccagcgtcg tgattagtga 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for HPRT
<400> 59
gccgttcagt cctgtccata 20
Claims (7)
- 서열번호 8의 서열을 갖는 재조합 플라스미드.
- 제1항의 재조합 플라스미드로부터 제조된 재조합 면역증강 구제역 O형 바이러스.
- 제2항의 재조합 구제역 바이러스를 정제, 분리하여 수득한 면역증강 구제역 O형 바이러스 항원.
- 제2항의 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 면역증강 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물.
- 제2항의 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 면역증강 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트.
- 제5항의 구제역 진단 키트를 이용한 구제역 진단 방법.
- 제4항의 구제역 백신 조성물을 이용한 구제역 예방 또는 치료 방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210158591A KR20230072149A (ko) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
| PCT/KR2022/017801 WO2023090771A1 (ko) | 2021-11-17 | 2022-11-11 | 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
| PCT/KR2022/017807 WO2023090772A1 (ko) | 2021-11-17 | 2022-11-11 | 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 a형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210158591A KR20230072149A (ko) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230072149A true KR20230072149A (ko) | 2023-05-24 |
Family
ID=86540663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210158591A KR20230072149A (ko) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 o형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230072149A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102234754B1 (ko) | 2019-10-28 | 2021-04-01 | 대한민국 | T 세포 에피토프가 삽입된 구제역 a형 재조합 바이러스 및 이로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신조성물 |
-
2021
- 2021-11-17 KR KR1020210158591A patent/KR20230072149A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102234754B1 (ko) | 2019-10-28 | 2021-04-01 | 대한민국 | T 세포 에피토프가 삽입된 구제역 a형 재조합 바이러스 및 이로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신조성물 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Lee, M. J. et al. Advanced foot-and-mouth disease vaccine platform for stimulation of simultaneous cellular and humoral immune responses. Vaccines (Basel) 8, 254 (2020). |
| Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017). |
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