WO2023090772A1

WO2023090772A1 - 강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 a형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물

Info

Publication number: WO2023090772A1
Application number: PCT/KR2022/017807
Authority: WO
Inventors: 이민자; 김현미; 신세희; 김수미; 박종현
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2023-05-25
Also published as: WO2023090771A1

Abstract

본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 백신 접종 초기, 강력한 세포성 면역반응의 유도를 통해 체액성 면역반응을 동시에 유도하는 한편, 모체이행항체 (MDA, maternally-derived antibody) 존재 시 B 세포 수용체의 자극을 통해 모치이행항체의 간섭 극복 및 능동면역이 가능하게 한 백신 조성물과 상기 조성물을 이용한 구제역의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

Description

강력한 적응성 면역반응 유도 및 모체이행항체의 간섭을 극복하는 재조합 구제역 A형 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물

본 발명은 강력한 적응성(세포성·체액성) 면역반응의 유도를 통해 모체이행항체의 간섭을 극복하기 위해, 구제역 A형 백신주에 ‘C3d 유전자(B 세포 에피토프)’를 삽입한 면역증강 재조합 구제역 바이러스, 면역원성이 증가된 구제역 바이러스 불활화 항원의 분리·정제 방법 및 모체이행항체(maternally-derived antibody, MDA) 간섭 극복용 구제역 백신 조성물로서의 용도에 관한 것이다.

구제역(foot-and-mouth disease, FMD) 백신은 소와 돼지 모두에서 정기적, 반복적인 백신 접종이 요구되며, 이러한 백신 접종에 의해 모체에서 유도된 항체가 태반 또는 초유 섭취를 통해 모체이행항체의 형태로 송아지 또는 자돈에게 전달되어 수동면역(passive immunity)을 형성한다. 모체이행항체는 송아지 및 자돈에서 초기 구제역 바이러스 감염 시, 숙주(host) 방어효과를 나타내는 반면, 지속력이 짧고 어린 주령의 동물에 구제역 백신 조기 접종 시, 수동면역에 의한 간섭(plasma cell, 기억 B 세포로부터 항원-특이적인 항체 생산을 억제함으로써 면역학적 관용 기작을 초래)을 유발하여, 백신의 효능 저해 및 능동면역(active immunity) 형성을 억제하는 부정적인 영향을 미친다. 현재 구제역 백신 예방접종 프로그램은 송아지 및 자돈의 경우, 모체이행항체 수준이 감소하는 시점인 2개월 령 이후에 접종하도록 권고하고 있다.

개체에 따라 모체이행항체 수준, 역가 및 반감기 등이 다르므로, 현장에서 적절한 구제역 백신 접종 시기를 결정하는데 어려움이 따른다. 또한 상업적으로 이용되고 있는 현 구제역 백신은 일반적으로 모체이행항체에 의한 간섭의 극복이 어려워, 백신 접종에 의한 능동면역 형성이 저해되는 한계점이 있다.

한편 구제역 바이러스(FMD virus, FMDV)는 Aphthovirus 속(Family: Picornaviridae)에 속하며 O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 및 SAT3의 7가지 혈청형으로 분류된다. VP1 단백질에 해당하는 FMDV 게놈 영역에서 85% 이상의 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 바이러스는 단일 혈청형을 형성한다. 이들은 일반적으로 지리적으로 제한되어 있으며 토포타입으로 구분된다. FMDV는 높은 유전적, 항원적 변이를 보여 하나의 혈청형에 의해 유도된 항체가 다른 혈청형을 중화할 수 없어 백신 접종 시 교차 방어가 되지 않는다. 그럼에도 불구하고 백신 접종은 구제역 발생 국가에서 질병을 예방하고 통제하기 위해 널리 사용되고 있다.

B 세포의 활성화 경로는 다음과 같이 크게 세 가지로 나뉜다: 1) T 세포 의존성 경로, 2) T 세포 비-의존성 type I 경로, 3) T 세포 비-의존성 type II 경로. 이 중 T 세포 의존성 경로는 TCR/MHC, CD40L/CD40 등을 통해 B 세포가 활성화되는 전형적인 경로이며, T 세포 비-의존성 경로 type I은 pathogen-associated molecular pattern (PAMP)이 패턴 인식 수용체(Pattern-recognition receptors, PRRs)를 자극하여 B 세포를 직접적으로 활성화시키는 경우로 숙주 내에서 드물게 일어나는 경로로 알려져 있다. 마지막으로 T 세포 비-의존성 type II 경로는 B 세포 수용체(receptor)인 CD21, CD19, 및 CD81 등을 항원 또는 C3d와 같은 B 세포 에피토프가 자극함으로써 B 세포를 활성화시키는 경로이다. 숙주 내 모체이행항체 존재 시, 면역 내성 및 관용(immune tolerance) 기작에 의해 T 세포로의 항원 제시, 세포성 면역반응 유도 및 T 세포 의존성 경로를 통한 B 세포의 활성화가 어려우므로, T 세포 비-의존적 경로를 통해 B 세포를 직접적으로 활성화시키거나, 강력한 세포성 면역반응 유도를 통해 T 세포를 지속적으로 자극해야 한다.

따라서, 본 발명에서는 현재 시판 중인 구제역 백신의 주요 한계점으로 지적되고 있는 모체이행항체의 간섭 현상을 극복하기 위해, B 세포 에피토프인 C3d를 통해 B 세포 표면의 수용체를 자극함으로써 모체이행항체 간섭을 극복하고자 후보 물질로 C3d의 활성 부위를 선정하였고, O PA2 P1 backbone (VP1 부위)에 이를 삽입하여 FMDV O형의 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주, 이로부터 분리·정제한 면역증강 항원 및 이를 포함하는 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 조성물을 개발하였다.

{선행기술문헌}

[특허문헌]

등록특허공보 제10-2234754호

[비특허문헌]

Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).

Lee, M. J. et al. Advanced foot-and-mouth disease vaccine platform for stimulation of simultaneous cellular and humoral immune responses. Vaccines (Basel) 8, 254 (2020).

상기와 같은 배경 하에 본 발명은 현재 시판 중인 구제역 백신의 한계점인 모체이행항체의 간섭 현상을 극복하기 위해, B 세포 에피토프인 C3d를 통해 B세포 표면의 수용체를 직접적으로 자극함으로써 모체이행항체 간섭을 극복하고자 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 현재 상용되고 있는 구제역 백신의 한계점으로 지적되고 있는 모체이행항체의 간섭 현상에 의한 구제역 백신-매개 면역반응 유도의 어려움을 극복하기 위해, 구제역 A형 백신주에 ‘C3d 유전자(B 세포 에피토프)’를 삽입한 면역증강 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 하며, 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 재조합 구제역 바이러스에서 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 구제역 바이러스의 제조방법 및 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 항원을 분리·정제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스는 구제역 바이러스의 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있으며, 상기 재조합 구제역 바이러스는 제한되는 것은 아니지만, 구제역 바이러스 O형 또는 A형일 수 있다.

구제역 O형 재조합 바이러스는 서열번호 8의 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있으며, 구제역 A형 재조합 바이러스는 서열번호 11의 재조합 플라스미드를 통해 제조될 수 있다.

상기 재조합 구제역 바이러스를 제조하기 위해 백본(backbone)에 삽입하는 후보 물질로 C3d의 활성 부위(active site) (13 a.a)를 선정하였고, 상기 C3d의 활성 부위는 서열번호 4(이를 코팅하는 염기서열은 서열번호 5)를 갖는다.

이를 O PA2 또는 A22 P1 backbone (VP1 부위)에 삽입하여 FMDV O형인 O PA2-C3d, FMDV A형인 A22-C3d와 같은 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신용 조성물을 제공한다.

또한, 이로부터 분리·정제한 면역증강 항원 및 이를 포함하는 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물을 이용하여 구제역을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트 또는 구제역 진단 키트 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 상기 구제역 진단 키트 또는 구제역 진단 키트 조성물을 이용한 구제역 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 재조합 구제역 바이러스는 O형 또는 A형을 기초로 한다.

O형은 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 일 실시예에서 O1-Manisa일 수 있다.

A형은 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 일 실시예에서 아형인 A22일 수 있고, 바람직하게는 A22/Iraq/24/64일 수 있다.

본 발명에서 용어 "플라스미드(plasmid)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 플라스미드는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker) 등을 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터 및 재조합 구제역 바이러스는 통상의 유전자조작법, 형질전환법에 의해 제조될 수 있으며, 적은 양으로 형성된 바이러스를 세포배양을 통한 연속 계대로 적절한 양의 바이러스를 수득할 수 있다.

상기 세포는 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과, 설치류 및 영장류의 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포에서 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 염소 혀 세포(ZZ-R) 및 햄스터 신장 세포 (BHK-21), 흑염소 신장세포(BGK), 돼지 신장세포 (IBRS-2) 및 소 신장세포 (LFBK)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 구제역 백신 조성물은 본 발명의 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리, 정제된 항원을 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서의 구제역 백신 조성물, 구제역 진단 키트, 구제역 진단 키트 조성물에 포함되는 재조합 구제역 바이러스는 재조합 구제역 바이러스 O형, A형 각각 또는 이들의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명에서의 구제역 백신 조성물, 구제역 진단 키트, 구제역 진단 키트 조성물에 포함되는 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원은 재조합 구제역 바이러스 O형, A형으로부터 각각 유래된 것 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물을 포함하는 백신은 생백신, 약독화된 백신, 또는 사백신일 수 있다.

상기 재조합 구제역 바이러스 또는 상기 재조합 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 백신 조성물은 1/640 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 1/40 내지 1/10 dose의 용량으로 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 사람을 제외한 돼지, 양, 염소, 사슴 및 야생 반추류 등의 우제류에 투여될 수 있다.

또한, 상기 백신조성물은 당 업계에서 통상적으로 허용 가능한 담체, 충진제，증량제，결합제，습윤제，붕해제，계면활성제 등의 희석제 또는 부형제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 다양한 형태로 개체에 투여(또는 주입)될 수 있다. 투여는 피하주사，근육내 주사，피하내 주사，복막내 주사，비강투여，구강투여，경피투여 또는 경구투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명은 재조합 구제역 바이러스, 상기 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물에 관한 것으로, 백신 접종 초기, 강력한 세포성 면역반응의 유도를 통해 체액성 면역반응을 동시에 유도하는 한편, MDA 존재 시 B 세포 수용체의 자극을 통해 MDA의 간섭 극복 및 능동면역이 가능하게 한 백신 조성물을 제공할 수 있다.

도 1a는 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.

도 1b는 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 A형 바이러스의 유전자 모식도를 나타낸 것이다.

도 2a 및 도 2b는 각각 O PA2, A22에서 분리 및 정제된 항원의 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 O PA2 및 A22에서 분리 및 정제된 항원의 병용 투여 시, 면역원성 평가 전략 및 결과를 나타낸 것이다.

도 4a는 본 발명에 따른 재조합 구제역 O형 바이러스의 실험 전략(A)과 생존율(B), 체중 변화(C)를 나타낸 것이다.

도 4b는 본 발명에 따른 재조합 구제역 A형 바이러스의 실험 전략(D)과 생존율(E), 체중 변화(F)를 나타낸 것이다.

도 5는 마우스에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종 및 면역반응 유도 평가 결과를 나타낸 것이다.

도 6a는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종 전략을 나타낸 것이다.

도 6b는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(SP O, A ELISA에 의한 항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종에 따른 초기, 중기, 장기면역(중화항체가 유도) 평가 결과를 나타낸 것이다.

도 8a 내지 도 8c는 돼지에 본 발명에 따른 재조합 면역증강 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종에 따른 세포성 면역반응 유전자(사이토카인, 공동 자극 분자 등) 발현 평가 결과를 나타낸 것이다.

도 8d는 돼지에서 본 발명에 따른 재조합 면역증강 재조합 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원을 포함하는 백신 접종에 의해 매개되는 체액성 면역 반응(IgG, IgM 및 IgA와 같은 면역글로불린 아형) 유도 평가 결과를 나타낸 것이다.

도 8e는 본 발명에 따른 면역증강 재조합 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 분리·정제한 항원 처리에 의해 유도된 뮤린(murine) 복막 삼출액 세포(peritoneal exudate cells, PECs) 및 돼지(porcine) 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)에 대한 세포 면역 반응 결과를 나타낸 것이다.

도 9은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스로부터 분리·정제된 항원을 포함하는 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 본 발명에 따른 재조합 구제역 바이러스를 이용하여 정제된 항원(146s particle)의 전자현미경(TEM) 관찰 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명의 O PA2-C3d 및 A22-C3d의 VP1 서열을 도시한 것으로, 1번째(Sus. 1) 및 4번째(Sus. 4) 현탁 세포(BHK) 계대 시, O PA2-C3d 및 A22-C3d의 VP1 서열을 SnapGene을 사용하여 정렬하였다; (a) O PA-C3d 뉴클레오티드 서열; (b) A22-C3d 뉴클레오티드 서열; (c) O PA2-C3d 아미노산 서열; (d) A22-C3d 아미노산 서열.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

1. 재조합 플라스미드 제조

재조합 플라스미드는 Lee et al.(Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).)에 의해 기술된 바와 같이 제조되었다. 전체 FMD- O1-Manisa 바이러스 게놈(GenBank Accession No. AY593823.1)을 PCR로 증폭하였다.

(1) 재조합 구제역 O형 바이러스 제조를 위한 재조합 플라스미드 제작

증폭된 O1-Manisa 게놈(서열번호 1)을 플라스미드(pBluescript SK II)에 삽입하여 pO1-Manisa (pO1 M) 플라스미드를 제조하였다. 제조된 pO1 M에서 P1 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 O-혈청형 FMDV O PA2(서열번호 2)(GenBank Accession No. GU384682.1)의 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 pO1 M-O PA2 P1(서열번호 3) 플라스미드를 제조하였다.

상기와 같이 제조된 플라스미드(pO1 M-O PA2 P1)를 이용하여 아미노산 잔기 서열(GKQLYNVEATSYA, 서열번호 5)에 해당하는 B 세포 에피토프 서열(C3d 서열(GGTAAGCAGCTCTACAACGTGGAGGCCACATCCTATGCC, 서열번호 4)을 VP1 서열의 [PA2-C3d: 456 및 457 염기쌍 위치(152 및 153 아미노산 위치, 즉 pO1 M-O PA2 P1 서열의 2025 및 2026번째 염기) 사이에 삽입하였다. 그런 다음, PCR 템플릿으로 pO1 M-A22 P1 300 ng/μL, 10pmole/μL 프라이머 C3d F(5'- GGAGGCCACATCCTATGCCCGCGAGAGGCCCTAGGTCGC-3', 서열번호 6) 1μL, 10pmole/μL 프라이머 C3d R(5') 1μL - ACGTTGTAGAGCTGCTTACCGCGAGGGTCGCCGCTCAGCT-3', 서열번호 7)는 이전 연구에서 사용한 것과 동일한 자가 결찰(self-ligating) 방법으로 표적 플라스미드를 제조하는 데 사용되었다. 최종적으로 제조된 재조합 플라스미드는 서열번호 8과 같다.

(2) 재조합 구제역 A형 바이러스 제조를 위한 재조합 플라스미드 제작

증폭된 O1-Manisa 게놈(서열번호 1)을 플라스미드(pBluescript SK II)에 삽입하여 pO-Manisa (pO1 M) 플라스미드를 제조하였다. 제조된 pO1 M에서 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 A-혈청형 FMDV A22/Iraq/24/64 (GenBank Accession No. AY593764.1)(서열번호 9)의 구조 단백질을 코딩하는 유전자로 치환하여 O1 M-A22 P1 플라스미드(서열번호 10)를 제조하였다.

상기와 같이 제조된 플라스미드(O1 M-A22 P1)를 이용하여 아미노산 잔기 서열(GKQLYNVEATSYA, 서열번호 5)에 해당하는 B 세포 에피토프 서열(C3d 서열(GGTAAGCAGCTCTACAACGTGGAGGCCACATCCTATGCC, 서열번호 4)을 VP1 서열의 [PA2-C3d: 453 및 454 염기쌍 위치(151 및 152 아미노산 위치, 즉 pO1 M-O PA2 P1 서열의 2025 및 2026번째 염기), 사이에 삽입하였다. 그런 다음, PCR 템플릿으로 O1 M-A22 P1 300 ng/μL, 10 pmole/μL 프라이머 C3d F(5'- GGAGGCCACATCCTATGCCCGCGAGAGGCCCTAGGTCGC-3', 서열번호 6) 1μL, 10 pmole/μL 프라이머 C3d R(5') 1 μL - ACGTTGTAGAGCTGCTTACCGCGAGGGTCGCCGCTCAGCT-3', 서열번호 7)는 이전 연구에서 사용한 것과 동일한 자가 결찰(self-ligating) 방법으로 표적 플라스미드를 제조하는 데 사용되었다. 최종적으로 제조된 재조합 플라스미드는 서열번호 11과 같다.

도 1a 및 1b는 각각 O PA2-C3d 및 A22-C3d에 대한 최종 플라스미드의 개략도를 나타낸다.

PCR 조건은 다음과 같다: 10 μL의 5x Phusion HF 완충액(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 1 μL의 10 mM dNTP(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 μL의 2 U/μL Phusion DNA 중합효소 (Thermo Scientific) 및 35 μL의 멸균 증류수를 98℃에서 30초, 98℃에서 10초, 65℃에서 20초, 72℃에서 2분 및 30초 동안 25 사이클 간 증폭했고, 최종 사이클은 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 다음으로, 1 μL의 Dpnl(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 25 μL의 PCR 생성물에 첨가하고 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 35 μL의 멸균 증류수, 5 μL의 Ligation High(TOYOBO, 오사카, 일본) 및 1 μL의 5 U/μL T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(TOYOBO, 오사카, 일본)를 4 μL의 DpnI 처리 제품에 첨가하였다. 혼합물을 16℃ 수조에서 1시간 동안 결찰시켰다.

결찰 후, 플라스미드는 제조업체의 프로토콜에 따라 100 μL의 DH5

세포(Yeast Biotech, Taipei, Taiwan)로 형질전환되었다. 형질전환된 세포를 암피실린을 함유한 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다.

피펫 팁이 있는 플레이트에서 콜로니를 선택하고 18 μL의 멸균 증류수, 1 μL의 10 pmol 포워드 유니버설 프라이머 VP1(5'- AGNGCNGGNAARTTTGA-3')(서열번호 12) 및 1 μL의 10 pmol/μL 역방향 유니버설 프라이머와 혼합하였다. 프라이머 VP1(5'- CATGTCNTCCATCTGGTT-3')(서열번호 13)을 콜로니 PCR 튜브에 넣고 94℃에서 5분, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분, 마지막 사이클은 72℃에서 5분간 수행하여 총 25 사이클의 PCR 증폭을 수행하였다. 상기 범용(universal) 프라이머에서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 5 μL의 PCR 샘플을 1 μL의 6x 로딩 버퍼(DYNE BIO, 경기도, 한국)와 혼합한 후 아가로스 겔에 로딩하였다. 그런 다음, 5 μL의 100 bp 마커(DYNE BIO)도 겔에 로딩되었다. 100V에서 30분 동안 전기영동한 후 밴드를 Gel Doc으로 평가하였다. 밴드 평가 후, 5 μL의 PCR 산물을 2 μL의 ExoSAP(Thermo Scientific)와 혼합하고 37℃에서 15분 및 85℃에서 15분 동안 PCR로 증폭하였다. VP1에 대한 에피토프의 삽입은 전체 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 염기서열을 확인한 후, 콜로니를 암피실린이 함유된 LB 배지 200 mL에 넣고 37℃에서 밤새도록 흔들어 주면서 배양하였다. Midi prep (MACHEREYNAGEL, Duren, Germany)을 사용하여 플라스미드를 제조하였다.

2. 면역증강 재조합 구제역 바이러스 준비

재조합 구제역 바이러스는 Lipofectamine 3000 Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 위에서 제조한 재조합 플라스미드로 BHKT7-9 (T7 RNA 중합효소를 발현하는 세포주)를 형질감염 시킨 후 2-3일 동안 배양하여 회수하였다. 이후 준비된 바이러스는 바이러스 증식을 위해 태아 염소 혀(ZZ-R) 세포 또는 아기 햄스터 신장-21(BHK-21) 세포에 계대되었다.

3. 표면에 C3d-에피토프를 제시하는 재조합 구제역 O형 및 A형 바이러스로부터 항원(불활화 바이러스)의 정제

정제된 항원은 변형된 Lee et al.(비특허문헌 2)에 의해 기술된 방법에 따라 역유전학에 의해 P1의 신속한 표현형(참조된 서열)에 대해 구성된 재조합 면역자극 FMDV O PA2-C3d 및 A22-C3d로 감염된 BHK-21 세포에서 제조되었다.

바이러스 감염을 위해 배양 배지를 무혈청 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM; HyClone, Logan, UT, USA)로 교체하고 세포를 5% CO₂, 37℃에서 1시간 동안 배양하여 바이러스를 접종하였다. 그런 다음 세포 외 바이러스를 제거하였다. 감염 24시간 후, 진탕 인큐베이터에서 24시간 동안 0.003N 바이너리(binary) 에틸렌이민을 2회 처리하여 바이러스를 불활성화시킨 다음 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 농축시켰다. 바이러스 농축액은 15%-45% 자당 밀도 구배에 적층되고 원심분리되었다. 초원심분리 후, 원심분리 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 1 mL 분획을 수집하였다. 각 분획의 샘플에서 FMDV 입자의 존재는 측면 유동 장치(BioSign FMDV Ag; Princeton BioMeditech, Princeton, NJ, USA)를 사용하여 광학 밀도에 의해 확인되었다. 현장 실험에 사용하기 전에 사전 PEG 처리된 상층액을 ZZ-R 및 BHK-21 세포에 두 번 이상 통과시켜 세포변성 효과(CPE)가 발생하지 않았는지 확인하여 상층액에 살아있는 바이러스가 없음을 확인하였다.

4. 정제된 항원을 이용한 구조 및 비구조 단백질 확인 및 TEM을 이용한 146S 입자 검사

면역증강 재조합 FMDV O PA2-C3d 및 A22-C3d에 감염된 세포의 정제된 항원 발현의 구조 단백질(SP)은 SP에 대한 밴드 형성을 나타내는 Rapid 항원 키트(PBM 키트, PBM Co Ltd., Princeton, NJ, USA)로 확인되었다. FMDV의 비구조 단백질(NSP)에 대한 밴드 형성이 없었다. 바이러스 입자(146S)는 투과전자현미경(TEM) 이미징으로 특징을 확인하였다. 또한, 재조합 바이러스를 계대 시에, 시퀀스가 변하는 현상이 빈번하여, 첫 번째, 4번째 계대 시, 시퀀스가 변하지 않았다는 것을 증명하기 위해 'C3d'의 특정 에피토프가 삽입된 FMDV가 세포에 계대된 후에도 바이러스의 유전적 안정성을 유지하는지 확인하고, 최종적으로 4번째 계대까지 서열 변화가 없음을 확인하였다(도 11).

5. 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d의 실험동물(마우스)에서의 면역원성 평가

(1) 쥐(Mice)

마우스 실험은 Lee et al.(비특허문헌 2)에 기술된 방법에 따라 수행되었다. 연령 및 성별이 일치하는 야생형 C57BL/6 마우스(6-7주령 암컷)는 KOSA BIO Inc.(경기, 한국)에서 구입하였다. 모든 마우스는 농림축산검역본부의 특정 무병원체(SPF) 생물안전성 수준 3(ABSL3) 동물 시설에서 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 마이크로아이솔레이터 케이지에 수용되었다. 모든 동물은 실험에 사용하기 전에 적어도 1주일 동안 적응하도록 하였다. 사육실은 12시간의 명암 주기, 약 22℃의 온도, 약 50%의 상대 습도로 설정되었다. 시험은 기관 지침과 농림축산검역본부 동물실험윤리위원회의 승인(인증 번호 IACUC-2021-584)에 따라 수행되었다.

(2) 마우스에 백신 접종 및 FMDV 투여

면역원성이 강한 FMDV O PA2-C3d와 A22-C3d에서 분리·정제한 항원의 면역원성과 단기 면역 유도 효과를 검증하고, 구제역 백신 개발을 위한 종독주(master seed virus, MSV)로서의 가능성을 확인하기 위해 다음과 같이 동물 실험을 진행하였다.

실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다: O PA2-C3d 및 A22-C3d(15 μg/dose/mL, 돼지의 경우 1/10-1/640 용량), ISA 206(Seppic, Paris, 프랑스, 50%, w/w), 10% Al(OH)₃및 15 μg/마우스 Quil-A(InvivoGen, San Diego, CA, USA). 마우스를 허벅지 근육에 근육내(IM) 주사하고(백신 접종 후 0일(dpv)), FMDV(O/VET/2013의 100 LD₅₀ME-SA 토포타입 또는 100 LD₅₀A/Malay/97, SEA 토포타입)를 7 dpv에 복강내(IP) 주사하여 투여하였다. 음성 대조군의 마우스에는 동일한 경로를 통해 동일한 부피의 인산완충식염수(PBS, pH 7.0)가 투여되었다. 단기 면역원성을 평가하기 위해 투여 후(dpc) 최대 7일 동안 생존율 및 체중 변화를 모니터링하였다.

목적동물(돼지)에서의 실험을 위한 예비실험으로 O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 시험백신의 면역원성 확인을 위해 PD₅₀ test를 진행하였고, 면역증강 백신주의 backbone으로 사용한 O PA2 항원+A22 항원을 포함하는 시험백신 투여군을 함께 비교하였다. 실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다; O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원 (15 μg+15 μg/dose/ml, 1/10~1/640 dose) 또는 O PA2 항원+A22 항원 (15 μg+15 μg/dose/ml, 1/10~1/640 dose), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)₃, 15 μg Quil-A/mouse. 음성대조군의 경우 동일 볼륨의 PBS를 동일 경로로 투여받았다.

마우스는 0 dpv에 I.M.으로 백신 접종 후, 7일(days post vaccination, dpv) 째, FMDV (100 LD_50,O/VET/2013, ME-SA topotype 또는 100 LD₅₀A/Malay/97, SEA topotype)를 마우스 복강으로 투여하여, 7일 후(days post challenge, dpc)까지 생존율과 체중 변화를 모니터링하였다.

6. 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d의 목적동물(돼지)에서의 면역원성 평가

(1) 돼지

돼지(8~9 주령, 총 n=32)는 SP O ELISA, SP A ELISA를 통해 항체가(PI 값: 50% 기준) 및 VN titers (1.6 Log₁₀기준)를 통해 스크리닝 하여, MDA(+), MDA(-)그룹(각 그룹당 n=16,)으로 구분하였다.

MDA(+), MDA(-) 그룹에 해당하는 각 그룹별 돼지는 세 그룹 (n = 4 또는 6/그룹): NC (negative control), O PA2+A22 (양성 대조군, PC)-처리 및 O PA2-C3d+A22-C3d-처리 그룹으로 무작위로 나누었다.

동물은 실험기간 동안 폐쇄된 격리실(ABSL3)에서 격리되었다. ABSL에 도착한 후, 모든 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근(ad libitum)할 수 있는 우리에 보관되었으며 최소 1주일 적응 후에 실험에 사용되었다. 사육실은 12시간의 명암 주기, 약 22℃의 온도, 약 50%의 상대 습도로 설정되었다. 이 발명은 농림축산검역본부 동물실험윤리위원회(인증번호 IACUC-2021-584)의 승인을 받은 기관 지침에 따라 수행되었다.

(2) 백신 접종을 통한 면역반응 유도 및 샘플링

목적동물인 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복을 위해 제작한 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원의 면역원성을 평가하고 적응성 면역반응 유도 효과 및 모체이행항체 간섭 회피 극복 효과를 관찰하기 위해 모체이행항체 양성(MDA(+), FMD-seropositive), 음성(MDA(-), FMD-seronegative)-야외 돼지를 이용하여 실험을 수행하였고 백신 조성은 다음과 같다; 총 1 ml 부피의 백신을 1 dose로 하여 15 μg O PA2 항원+15 μg A22 항원(양성대조군, positive control group, PC군) 또는 15 μg O PA2-C3d 항원+15 μg A22-C3d 항원(실험군, experimental group, 실험군), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)₃, 150 μg Quil-A가 포함되도록 제조하였다. 음성대조군(negative control group, NC군)의 경우 동일 볼륨의 PBS를 동일 경로로 투여받았다.

8~9주령 돼지, 모체이행항체 양성, 음성 동물을 스크리닝하여 MDA(+)군 (n=16)과 MDA(-)군 (n=16)의 두 분류로 구분하였다. MDA(+)군, MDA(-)군 개체들을 각각 세 그룹으로 나누어, NC군(PBS 투여군, n=4/group), PC군(O PA2+A22 투여군, n=6/group), 실험군(O PA2-C3d+A22-C3d 투여군, n=6/group)으로 구분하였고, 28일 간격으로 2회(0 dpv, 28 dpv), 1 mL 백신을 I.M. 경로로 투여하였다. 백신 접종 돼지 혈액 샘플을 0, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 dpv에 수집하여 SP O, A ELISA 및 VN titer 확인과 같은 혈청학적 분석에 사용하였다. SP O, A ELISA의 경우, 항원의 특성에 따른 항체 양성율을 고려하여, FMDV O형, A형 각각 PrioCHECK^TMkit, VDPro^® kit를 이용하여 비교하였다. 또한 모든 샘플링 일정에 채취한 혈액 샘플로부터 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)을 분리하여, 시험백신 매개-세포성·체액성 면역반응 관련 유전자 발현 변화를 분석하였다.

(3) 혈청학적 분석

혈청 내 SP 항체를 검출하기 위해 PrioCHECK^TM FMDV type O 또는 FMDV type A (Prionics AG, Switzerland)와 VDPro^® FMDV type O 또는 FMDV type A (Median Diagnostics, 한국 강원도)를 사용하였다. ELISA 플레이트의 흡광도를 억제율(PI) 값으로 변환하였다. PI 값이 PrioCHECK^TM FMDV 키트의 경우 50% 또는 VDPro^® FMDV 키트의 경우 40% 이상이면 동물은 항체 양성으로 간주되었다.

바이러스 중화 시험(VNT)은 세계 동물 보건 기구(OIE) 매뉴얼에 따라 수행되었다. 혈청을 수조에서 30분 동안 56℃에서 열 불활성화시켰다. 세포 밀도를 조정하여 70% 단층을 형성하고 혈청 샘플의 2배 연속 희석액(1:8-1:1024)을 준비하였다. 그런 다음 희석된 혈청 샘플을 100-조직 배양 감염 용량(TCID)₅₀/0.5 mL상동 바이러스와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후, LF-BK(소 신장) 세포 현탁액을 모든 웰에 첨가하였다. 2~3일 후, CPE는 역가를 결정하기 위해 평가되었으며, 이는 바이러스의 100 TCID₅₀을 중화하는 데 필요한 역 항체 희석의 Log₁₀값으로 계산되었다. FMDV O/PA2 및 FMDV A22/IRAQ는 VNT에 사용되었다.

(4) PECs 분리 및 세포 배양

Naive 마우스는 CO₂를 사용하여 마취되었고 희생되었다. Ca²⁺/Mg²⁺/phenol-red가 없는 냉각된 Hank의 균형 염 용액(HBSS, Gibco, Waltham, MA, USA) 완충액 5mL로 복강을 세척하였다. 복막 세척액을 4℃에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 펠릿화된 PECs를 재현탁하고 Bio-Rad TC20 자동 세포 계수기(Bio-Rad)를 사용하여 계수하였다. 모든 세포는 사용 전에 새로 분리되었다. 어떤 실험에서도 동결보존된 세포를 사용하지 않았다. 그런 다음 정제된 PECs를 10% 송아지 태아 혈청(HyClone), 3mM L-글루타민(Sigma-Aldrich), 10mM HEPES(Sigma-Aldrich), 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich) 및 0.05mM 2-베타-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich)이 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640(Gibco, Carlsbad, CA, USA)으로 구성된 완전 배지에서 배양하였다. 인큐베이션은 37℃ 및 5% CO₂에서 수행되었다.

(5) PBMCs 분리 및 세포 배양

돼지 PBMCs는 Lee et al.(비특허문헌 2)에 의해 유도된 방법에 따라 앞서 언급한 특정 시점(n = 4 또는 6/그룹)에 백신 접종된 돼지의 전혈에서 분리되었다. 전혈(20 mL/개체)은 BD Vaccutainer 헤파린 튜브(BD, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 독립적으로 수집되었고 PBMCs는 Ficoll-Paque^TM PLUS (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) 구배 원심분리를 사용하여 PBMCs를 분리하였다. 잔류 적혈구는 염화암모늄-칼륨(ACK) 용해 완충액(Gibco, Carlsbad, CA, USA)으로 처리하여 용해되었다. PBMC를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 Dulbecco의 PBS (Gibco)에 현탁시키고 2% 소 태아 혈청(FBS) (Gibco)을 보충하고 체적 유세포분석기(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 계수하였다. 모든 세포는 사용 전에 새로 분리되었다. 어떤 실험에서도 동결보존된 세포를 사용하지 않았다. 그런 다음 정제된 PBMC를 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA), 3 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich)이 보충된 RPMI1640 (Gibco) 배지에 재현탁하였다.

PBMCs를 Ca²⁺/Mg²⁺가 없는 DPBS(Gibco)에 현탁하고 Bio-Rad TC20 자동 세포 계수기(Bio-Rad)를 사용하여 계수하였다. 모든 세포는 사용 전에 새로 분리되었고, 어떤 실험에서도 동결보존된 세포를 사용하지 않았다. 그런 다음 정제된 PBMCs를 10% FBS(Gibco), 3mM L-글루타민(Sigma-Aldrich), 10mM HEPES(Sigma-Aldrich) 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신(Sigma-Aldrich)이 보충된 RPMI-1640(Gibco) 배지에 재현탁하였다. 배양(incubation)은 37℃ 및 5% CO₂에서 수행되었다.

(6) 시험관 내 PEC 및 PBMC에 대한 항원 유도 IFNγ ELISpot 분석

O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원 매개 IFNγ 분비는 제조업체의 지침에 따라 상업용 ELISpot 분석 키트(마우스 및 돼지용 카탈로그 번호 EL485 및 EL985, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 분석되었다. 분리된 뮤린 PEC 또는 돼지 PBMC(5 x 10⁵ cells/well)를 마우스 또는 돼지 IFNγ에 대해 특이적인 단일클론 포획 항체를 함유하는 96-웰 PVDF 지지 마이크로플레이트에서 배양하고, 비활성화된 FMDV(O PA2, O PA2-C3d, A22, A22-C3d) 항원을 4㎍/mL(최종 농도) 각 농도에서 37℃, 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 18시간 동안 자극하였다. 음성대조군과 양성대조군으로 각각 PBS와 5μg/mL의 phorbol myristate acetate(PMA, Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고 비오티닐화된(biotinylated) 항-마우스 IFNγ 항체(1:119) 또는 항-돼지 항체(1:119)와 함께 4℃에서 밤새 배양한 다음, RT에서 AP-접합된(conjugated) 스트렙타비딘(1:119)으로 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 5-브로모-4-클로로-3'인돌리포스페이트 p-톨루이딘 염(BCIP)/니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT)로 현상하고 ImmunoSpot ELISpot 판독기(AID iSpot 판독기 시스템; Autoimmune Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 계수하였다. 결과는 스폿 형성 단위(SFU)로 표시되었다.

(7) RNA 분리, cDNA 합성, 및 정량적 Real-Time PCR

정제된 돼지 PBMC에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen) 및 RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 제조업체의 지침에 따라 GoScript 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 역전사하여 준비하였다. 합성된 cDNA는 iQ SYBR Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 Bio-Rad iCycler에서 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 증폭되었다.

유전자 발현 수준을 hprt 수준으로 정규화하고 대조군과 비교한 상대적 비율로 제시하였다. 이 발명에 사용된 프라이머 목록은 표 1에 기재하였다.

qRT-PCR용 프라이머 서열 목록

타겟	정방향(Forward)/역방향(Reverse)	서열 (5'- 3')	길이(mer)	서열번호
IFNα	IFNα F	CATCTGCTCTCTGGGCTGTG	20	14
IFNα	IFNα R	TGAGGGGATCCAAAGTCCCT	20	15
IFNβ	IFNβ F	TGCAACCACCACAATTCCAGA	21	16
IFNβ	IFNβ R	GGTTTCATTCCAGCCAGTGC	20	17
IFNγ	IFNγ F	GCCATTCAAAGGAGCATGGAT	21	18
IFNγ	IFNγ R	CTGATGGCTTTGCGCTGGAT	20	19
IL-1β	IL-1β F	AGCCAGTCTTCATTGTTCAGGT	22	20
IL-1β	IL-1β R	TCATCTCTTTGGGGCCATCAG	21	21
IL-17A	IL-17A F	CTCGTGAAGGCGGGAATCAT	20	22
IL-17A	IL-17A R	GGTGTGCTCCGGTTCAAGAT	20	23
IL-23p19	IL-23p19 F	CCATATCCAGTGCGGGGATG	20	24
IL-23p19	IL-23p19 R	AGGCCTTGGTGGATCCTTTG	20	25
IL-23R	IL-23R F	TCCCTCATTGCAAAGCACAA	20	26
IL-23R	IL-23R R	GCATCTCCTCTTGCAAGCAAAT	22	27
IL-2	IL-2 F	AAGCTCTGGAGGGAGTGCTA	20	28
IL-2	IL-2 R	CAACAGCAGTTACTGTCTCATCA	23	29
IL-10	IL-10 F	CGGCCCAGTGAAGAGTTTCT	20	30
IL-10	IL-10 R	TGCCTTCGGCATTACGTCTT	20	31
TGFβ	TGFβ F	GGCTGTCCTTTGATGTCACC	20	32
TGFβ	TGFβ R	GGCCAGAATTGAACCCGT	18	33
IL-4	IL-4 F	CTCACCTCCCAACTGATCCC	20	34
IL-4	IL-4 R	TGTGTCCGTGGACGAAGTTG	20	35
IL-6	IL-6 F	CTGCAGTCACAGAACGAGTG	20	36
IL-6	IL-6 R	CGGCATCAATCTCAGGTGCC	20	37
CD40	CD40 F	GTCATCAGCACAAATACTGC	20	38
CD40	CD40 R	CACAAGTGGTGTCTGTTTTC	20	39
CD80	CD80 F	TCAGGCATCGTTCAGGTGAC	20	40
CD80	CD80 R	TGACAGCCAGCACCATTTCA	20	41
CD86	CD86 F	TGGGACTGAGTAACATTCTCTTTGT	25	42
CD86	CD86 R	CCAGCTCATCCAGGCTTAGG	20	43
MHC Class I	MHC Class I F	TGAGCTATTTCTACACCGCCG	21	44
MHC Class I	MHC Class I R	TCGTCCACGTAGCCGACTT	19	45
MHC Class II	MHC Class II F	CTCCAGTGATGCTGGGTCAG	20	46
MHC Class II	MHC Class II R	TGACAGAGTGCCCGTTCTTC	20	47
CD21	CD21 F	TGCCATGCCTACAAAGCTGA	20	48
CD21	CD21 R	GTAGTAACCAGGGCGGCATT	20	49
CD28	CD28 F	TCAAAGGAGTTCCGGGCATC	20	50
CD28	CD28 R	CTGAAGCAGGCGGGAGTAAT	20	51
ICOS	ICOS F	GGATGTGCAGCCTTTGTTGT	20	52
ICOS	ICOS R	CAGAGCGTACCAAATTGCGG	20	53
CTLA4	CTLA4 F	GAGTATGGGTCTGCAGGCAA	20	54
CTLA4	CTLA4 R	ATATGTCGCGGCACAGACTT	20	55
AHNAK	AHNAK F	CACCATCACCGTGACTCGAA	20	56
AHNAK	AHNAK R	AGTTCGTGCCGTGGAATCTT	20	57
HPRT	HPRT F	CCCAGCGTCGTGATTAGTGA	20	58
HPRT	HPRT R	GCCGTTCAGTCCTGTCCATA	20	59

7. 통계

모든 정량적 데이터는 달리 명시되지 않는 한 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되었다. 그룹 간에 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정 또는 일원 ANOVA에 이어 Tukey 사후 검정을 사용하여 평가되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 및; ****p < 0.0001. 다른 그룹을 비교하기 위해 매개변수 테스트가 사용되었다. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 작성하고 로그 순위 합 테스트를 사용하여 차이를 분석하였다. 모든 통계 분석에는 GraphPad Prism 9.1.2 (GraphPad, San Diego, CA, USA) 소프트웨어 및 IBM SPSS 소프트웨어 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)가 사용되었다.

<실시예> 모체이행항체 간섭 극복을 위한 면역증강 구제역 백신주의 제작, O PA2-C3d 및 A22-C3d를 이용한 불활화 항원 생산 및 정제

모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주 개발을 위해, 역유전학(reverse genetics)을 이용하여 기 개발된 O1 Manisa-O PA2 (O1 M-O PA2) 및 O1 Manisa-A22/Iraq/24/64 (O1 M-A22) strain의 P1 backbone을 이용하였다. O형의 경우 주변 발생상황에 대한 백신 매칭률 및 바이러스의 부유세포에서의 증식성, 특히, 실험동물(마우스) 및 목적동물(돼지)에서의 항원 매개-면역원성을 확인한 선행 연구 결과를 바탕으로, O PA2가 가장 강력한 후보 백신주로 판단되었으며, A형의 경우에도 세계적 발생 상황을 볼 때, 매칭률은 대체적으로 낮은 경향을 보이고는 있으나 그 중에서도 A22가 적합한 백신주로 분류되었다.

본 발명에서 B 세포 에피토프인 C3d의 활성 부위를 O PA2 및 A22 P1 backbone에 이를 삽입하여 FMDV O형 및 FMDV A형의 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신주 제조 전략은 도 1a, 1b와 같고 자세한 방법은 재료 및 방법에 기술하였다.

<실험예 1> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신의 마우스에서의 면역원성 평가

B 세포의 활성화를 위해 B 세포 에피토프인 C3d가 삽입된 O PA2-C3d 및 A22-C3d, O PA2 및 A22로부터 분리·정제한 항원의 마우스에서의 면역원성 확인, 구제역 백신 종독주(master seed virus, MSV)로써의 가능성 및 FMDV 감염에 대한 방어 효과를 평가하기 위해 O PA2-C3d 및 A22-C3d는 각각 도 4a의 (A), 및 도 4b의 (D)와 같은 전략으로 실험을 수행하였고, O PA2 및 A22는 도 2a (A), 도 2b (D)와 같은 전략으로 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 백신 조성은 다음과 같다; O PA2-C3d 또는 A22-C3d 항원, O PA2 또는 A22 항원 (15 μg/dose/mL, 1/10~1/640 dose), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)₃,15 μg Quil-A/mouse.

마우스는 0 dpv (days post vaccination)에 I.M. (intramuscular, 근육 내 접종)으로 백신 접종 후, 7일(dpv)째, FMDV O형 (100 LD_50,O/VET/2013, ME-SAtopotype) 또는 FMDV A형 (100 LD₅₀, A/Malay/97, SEA topotype)를 마우스 복강으로 투여하여, 7일 후(dpc)까지 생존율(도 4a의 (B), (C))과 체중 변화(도 4b의 (E), (F))를 모니터링 하였다.

실험 결과, O PA2-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 마우스에서 97.01 PD₅₀(Log₄)으로 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 100%, 1/640 dose에서 80%의 생존율을 보였으며, 체중 감소도 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 거의 관찰되지 않았다(도 4a의 (B), (C)). 또한 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원을 이용한 시험백신은 마우스에 접종 시, 73.52 PD₅₀(Log₄)으로 1/10, 1/40, 1/160 dose에서 100%의 생존율을 보였으며, 1/640 dose에서는 60% 생존율을 나타내었다. 체중 감소에 있어서도 1/10, 1/40, 1/160 dose에서는 체중 변화가 거의 관찰되지 않았다(도 4b의 (E), (F)).

그러나 O PA2 항원을 포함하는 백신은 55.72 PD₅₀(log₄)으로 나타났다(도 2a의 (B)). O PA2의 체중 변화는 O PA2-C3d에 비해 낮은 수준으로 감소하였다(도 2a의 (C)).

A22-C3d 항원을 함유하는 백신은 1/10, 1/40 및 1/160 용량에 대해 100% 생존율을 나타내고 73.52 PD₅₀ (Log₄)으로 1/640 용량에 대해 60% 생존율을 나타냈다. 1/10, 1/40 및 1/160 용량에 대한 체중의 변화는 없었다.

그러나 A22 항원을 포함하는 백신은 6.06 PD₅₀(Log₄)을 나타냈다(도 2b의 (E)). A22의 체중 변화는 A22-C3d에 비해 낮은 수준으로 감소하였다(도 2b의 (F)).

PD50 시험은 돼지에서 2가 연구 백신(O PA2-C3d+A22-C3d 항원 함유, O PA2-C3d와 A22-C3d의 병용 투여)의 면역원성을 확인하기 위해 수행되었습니다. 결과는 면역증강 백신 균주의 백본으로 사용된 연구 백신(O PA2+A22 항원 포함, O PA2와 A22의 병용 투여)을 받은 그룹의 결과와 비교하였다(도 5 및 도 3).

도 5의 (A) 및 도 3의 (A)와 같은 실험 전략으로 생쥐에서 백신 접종은 0 dpv에 I.M.으로 투여되었고 FMDV (O/VET/2013의 100 LD₅₀, ME-SA 토포타입 또는 A/Malay/97의 100 LD₅₀, SEA 토포타입)는 7 dpv에 I.P.로 챌린지 되었다. 생존율과 체중 변화는 0 days post challenge (0 dpc)부터 7 dpc까지 모니터링하였다.

O PA2+A22 항원을 포함하는 2가 백신은 마우스에서 O/VET/2013 및 A/Malay/97로 각각 공격했을 때 PD₅₀(Log₄) 값이 5.66 및 4인 것으로 나타났다(도 3의 (B), 도 3의 (D)).

O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 백신은 O/VET/2013 및 A/Malay/97로 각각 접종했을 때 PD₅₀(Log₄) 값이 90.5 및 >128 PD₅₀(Log₄)으로 높은 면역원성을 나타냈다(도 5의 (B), 도 5의 (D)).

<실험예 2> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신은 목적동물(돼지)에서의 면역효과(초기, 중기, 장기) 평가

목적동물인 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복을 위해 제작한 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d로부터 분리·정제한 항원의 면역원성을 평가하고 적응성 면역반응 유도 효과 및 모체이행항체 간섭 회피 극복 효과를 관찰하기 위해 모체이행항체 양성(MDA(+), FMD-seropositive), 음성(MDA(-), FMD-seronegative)-야외 돼지를 이용하여 실험을 수행하였다(도 6a).

그 결과, 모체이행항체 간섭 극복 효과를 확인하기 위해 MDA(+)군의 돼지에 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 이용한 시험백신 투여 시, 14 dpv부터 SP O ELISA에 의한 항체가가 O PA2+A22 항원을 포함하는 시험백신을 접종한 PC군에 비해 유의적으로 증가하였고(p < 0.001, PrioCheck^TMkit, VDPro^®kit), 28dpv에도 p < 0.05 (PrioCheck^TMkit), p < 0.01 (VDPro^®kit)의 유의성을 나타내었다(도 6b의 (A), (B)). 특히, 28 dpv에 2차 시험백신 접종(boosting) 이후, 실험군에서 항체가가 매우 높게 나타난 반면, NC군의 경우, 모체이행항체가 지속적으로 감소하는 경향을 보였는데, 56, 70, 84 dpv에 두 그룹 간의 항체가는 p < 0.0001 또는 p < 0.001 수준의 차이를 보였다. 또한 MDA(+)군에서 SP A ELISA의 경우, 42 dpv에 실험군의 항체가가 PC군에 비해 높게 나타났고(p < 0.001, PrioCheck^TM kit), 56, 70, 84 dpv에 실험군과 NC군 간의 유의성 차이는 각각 p < 0.5, p < 0.0001, p < 0.001 (PrioCheck^TM kit), p < 0.0001 (VDPro^® kit) 수준에서 관찰되었다(도 6b의 (C), (D)).

한편, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신의 목적동물(돼지)에서의 면역원성 및 초기, 중기, 장기면역 유도를 확인하기 위해 MDA(-)군에 백신 투여 시, SP O ELISA에 의한 항체가가 7 dpv (PrioCheck^TMkit),14dpv (VDPro^®kit)에 p < 0.05 수준에서 NC군에 비해 유의적으로 증가하였고, 28 dpv부터 84 dpv까지 NC군과 비교하여 유의성을 나타내었다(p < 0.0001) (도 6b의 (E), (F)). MDA(-)군에서의 각 그룹별 SP A ELISA에 의한 항체가도 SP O ELISA에서의 결과와 마찬가지로 실험군과 NC군 간에 7 dpv (PrioCheck^TMkit), 14dpv (VDPro^®kit)에서 유의적인 차이를 나타내었고(p < 0.01, p < 0.05), 28~84 dpv에 각각 실험군이 NC군에 비해 항체가가 더 높게 나타났다(p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05). 또한 실험군에서의 항체가는 PC군에서의 항체가에 비해 지속적으로 더 높았으며 두 그룹 간의 유의성은 14, 84 dpv에 p < 0.01, p<0.05 (VDPro^® kit) 수준에서 관찰되었다 (도 6b의 (G), (H)).

백신 접종 전(0 dpv), MDA(+)/MDA(-) 그룹에서의 O1 Campos, A2001 Argentina, A24 Cruzeiro에 대한 중화항체가는 도 7의 A와 같다. MDA(+) 군에서는 모두 > 1.6 Log₁₀수준을 보였고, MDA(-) 그룹에서는 < 1.2 Log₁₀수준을 나타내었다. PC군에서 항원으로 사용한 backbone 바이러스인 O PA2, A22에 대한 상동성 바이러스(homologous virus)를 이용하여 중화항체가를 확인하였다(도 7의 (B), (C)). MDA(+)군의 경우, 0 dpv에 SP O, A ELISA에 의한 항체가는 높은 수치를 나타내었으나, O PA2, A22에 대한 중화항체가는 방어 수준 이하로 낮게 나타났다(도 7의 (B)). 이는 모체이행항체가 높은(MDA(+)) 자돈의 모돈이 B사의 백신을 접종했으므로 O PA2 및 A22와 같은 이종 바이러스(heterologous virus)에 대해 낮은 항체가를 나타낸 것으로 판단된다.

MDA(-)군의 경우, O PA2에 대한 중화항체가(도 7의 (C))는 7 dpv부터 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신을 투여한 실험군에서 NC군과 PC군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며(p < 0.05), 14, 28 dpv까지 지속적으로 증가하였고(p < 0.01, p < 0.05), 28 dpv에 부스팅(boosting) 이후 42~84 dpv에 NC군에 비해 높게 증가되었다(p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05). 또한 부스팅 이후에도 실험군에서 PC군에 비해 중화항체가가 높게 나타났는데, 두 그룹 간의 유의성은 42, 84 dpv에 관찰되었다(p < 0.001, p < 0.01).

MDA(+)군과 MDA(-)군에서 A22에 대한 중화항체가(도 7의 (D), (E))는 28 dpv에 실험군에서 NC군과 PC군에 비해 높게 나타났고(p < 0.01), 부스팅 이후 42~84 dpv에 dpv에 NC군에 비해 높은 수준으로 증가되었다(p < 0.0001, p < 0.001). 실험군과 PC군 간의 차이는 42~84 dpv에 유의성이 관찰되었다(p < 0.0001, p < 0.001).

<실험예 3> 모체이행항체 간섭 극복용 면역증강 구제역 백신주, O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 FMD 백신의 돼지에서의 세포성 면역반응 유도 평가

3-1. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 목적동물인 돼지에 O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신을 접종 후, 각 샘플링 시간별, 전혈로부터 PBMCs를 분리하여, qRT-PCR을 통해 세포성 면역반응 유도와 관련된 사이토카인 (IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-1β, IL-17A, IL-23p19, IL-23R, IL-2, IL-10, TGFβ, IL-4, IL-6) 및 공동-자극 분자 (CD40, CD80, CD86, MHC class I, MHC class II, CD21, CD28, CTLA4, ICOS, AHNAK)과 같은 유전자의 발현 변화를 관찰하였다(도 8a 내지 도 8c).

그 결과 전염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokine) 유전자의 발현이 전체적으로 매우 높게 관찰되었다. 특히, Type I IFN인 IFNα와 IFNβ의 발현은 7 dpv에 MDA(+)/MDA(-) 조건의 개체들에서 실험군에서 NC군에 비해 p < 0.0001, p < 0.001 수준의 매우 높은 증가를 보였다. 한편, PC군 vs NC군 간의 차이는 IFNα의 경우 MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 PC군에서 NC군에 비해 높게 나타났으나(p < 0.01), IFNβ의 경우 MDA(+) 조건에서만 NC군에 비해 유의적인 증가를 보였다(p < 0.01). IFNγ의 발현 수준은 IFNα와 IFNβ의 발현에 비해 다소 낮았으나, MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 실험군에서 NC에 비해 유의적으로 높은 수준이 관찰되었다(p < 0.05).

IL-1β는 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 현저히 높은 발현을 보였으며(p < 0.0001, p < 0.001), 특히, PC군과 비교하여 실험군에서 p < 0.0001 수준의 유의적인 차이를 나타내었다. IL-17A는 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 매우 높은 발현량을 보였고(p < 0.0001, p < 0.01), MDA(+) 상태에서 PC군과 NC군 간의 유의성이 관찰되었다 (p < 0.01). IL-23p19의 발현 또한 MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 현저히 높게 나타났고(p < 0.01, p < 0.001), 특히, MDA(-) 조건에서 실험군과 PC군 간의 유의적으로 차이를 보였다(p < 0.05). IL-23R의 발현도 다른 사이토카인 발현과 마찬가지로 매우 높게 나타났고, MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 실험군 vs NC군 간의 유의적 차이를 보였다(p < 0.05). IL-4, IL-6의 경우, MDA(+) 조건에서 MDA(-) 조건에 비해 발현량이 높았고, MDA(+) 조건에서 실험군 vs NC군 간의 유의성은 p < 0.01, IL-4, IL-6에 대한 PC군 대 NC군 간의 유의성은 각각 p < 0.01, p < 0.01으로 나타났다. MDA(-) 조건에서는 IL-4에서 실험군 vs NC군의 유의차가 p < 0.05로 관찰되었다. 한편, 항-염증성 사이토카인인 IL-10의 경우, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군에서 NC군에 비해 높게 발현되는 것으로 나타났다(p < 0.05). IL-2, TGFβ의 경우, 실험군> PC군 > NC군의 순으로 발현량이 높게 나타났으나, 각 그룹간 유의성은 관찰되지 않았다.

공동-자극 분자의 발현량은 전반적으로 사이토카인의 발현량에 비해서는 다소 낮았으나, 실험군에서 PC군 또는 NC군에 비해 유의적으로 발현량이 증가됨을 확인하였다. CD80, CD21, CD28, CTLA4, ICOS의 발현은 MDA(+) 조건에 비해 MDA(-) 조건에서 백신 투여 시 증가되는 경향을 보였고, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 실험군 vs NC군 간의 비교에서 유의성을 나타내었고 (p < 0.0001, p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05), PC군 대 NC군 간의 유의성은 ICOS를 제외한 나머지 유전자의 발현에 대해 p < 0.01, p < 0.01 수준으로 관찰되었다. 이들 중, CD80, CD21과 CD28은 시험백신 투여에 의해 매우 높은 유전자 발현 변화를 나타내었고, ICOS의 경우, 실험군 vs PC군 간의 유의성이 MDA(+) 조건에서 p < 0.01, MDA(-) 조건에서 p < 0.0001로 C3d가 삽입된 균주에서 backbone strain에 비해 높은 유전자 발현을 보였다.

CD86, AHNAK의 경우, MDA(-) 조건에서 실험군과 NC군 간의 유의성이 관찰되었고(p < 0.0001, p < 0.001), 특히, CD86은 실험군 대 PC군(p < 0.0001) 간의 현저한 유의성이 관찰되었다. 한편, MHC class I은 MDA(+) 조건에 비해 MDA(-) 조건에서 유전자의 발현이 감소된 것으로 나타났고, CD40, MHC class II의 경우, 각 그룹 간 유의성은 관찰되지 않았다.

3-2. 돼지에서 IgG, IgM 및 IgA와 같은 면역글로불린 아형으로 측정한 본 발명에 따른 면역 증강 구제역 바이러스 O형 및 A형(O PA2-C3d 및 A22-C3d)에 의해 매개되는 체액성 면역 반응은 바와 같다.

FMD 항체-음성(MDA(+), n = 16) 또는 FMD 항체-음성(MDA(-), n = 16)인 돼지(8-9주령) 동물을 각각 3개의 그룹으로 나누었다. 음성대조군(NC, n = 4/그룹), 양성대조군(PC, n = 6/그룹) 및 실험군(Exp., n = 6/그룹).

실험군에는 O PA2-C3d + A22-C3d 항원과 ISA 206(오일 기반 에멀젼, 50%, w/w), 10% Al(OH)₃ 및 150μg Quil-A가 포함된 15μg(소 및 돼지용 1회 용량)이 포함된 테스트 백신이 투여되었다. 양성대조군(PC)은 O PA2 + A22 항원과 ISA 206(오일 기반 에멀젼, 50%, w/w), 10% Al(OH)3 및 150μg Quil-A가 포함된 15μg(소 및 돼지용 1회 용량)을 투여받았다. 음성대조군(NC) 그룹에는 동일한 부피의 PBS를 주입하였다. 백신 접종은 28일 간격으로 두 번 수행되었으며 동물의 목에 깊은 근육 내 경로를 통해 1mL 백신(1회 용량)을 주입하였다. 혈청학적 검정을 위해 돼지에서 백신 접종 후 0, 7, 14, 28, 42, 56, 70 및 84일에 혈액 샘플을 수집하였고, 실험 결과는 도 8d에 도시하였다.

도 8d에서 (a) IgG 농도; (b) IgM 농도; (c) IgA 농도를 나타낸다. 데이터는 3중 측정의 평균 ± SEM을 나타냅니다(n = 4 또는 6/그룹). 통계적 분석은 양방향 ANOVA에 이어 Tukey의 테스트를 사용하여 수행되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; 및 ****p < 0.0001.

실험 결과, O PA2-C3d와 A22-C3d는 MDA(+)/MDA(-) 동물에서 SP 특이적 항체가(SP ELISA를 통해)뿐만 아니라 IgG(중화항체의 지표), IgM(병원체 감염 또는 백신 접종 중에 유도된 최초의 천연 항체) 및 IgA(점막 면역을 유도하는 핵심 요소) 수준을 포함하는 SP-비특이 항체에서도 효과적으로 유도되었다. 모체 IgG 및 IgA는 초기 유아기(infancy)에 점막 보조 세포 반응을 약화시킬 수 있으며, 모체 IgG 조절 T 세포 에피토프는 면역원성보다는 면역 관용을 유도한다. 상기 결과를 바탕으로 면역증강 재조합 구제역 백신 균주인 O PA2-C3d 및 A22-C3d는 MDA(+) 동물에서 MDA 간섭 매개 면역 내성을 극복함으로써 숙주에서 활성 면역을 효과적으로 유도할 수 있으며, 또한 MDA(-) 동물 또는 2~3개월령(현재 백신 프로그램에 따라 MDA 역가가 더 낮은 기간) 동물에서 백신을 접종할 때 강력한 세포 및 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 결과는 항원에 대한 C3d 스파이크(항원 표면에 C3d의 삽입)가 B 세포 표면 수용체를 지속적으로 자극하여 B 세포를 직접 활성화시키고, 면역원성이 높은 O PA2-C3d 및 A22-C3d 항원이 강력한 T 세포 매개 면역 반응을 제공하여 보다 효율적인 고역가 항체 및 중화 항체를 생성함을 시사한다(도 8d).

이상의 결과로부터 O PA2-C3d와 A22-C3d는 면역증강 구제역 백신주로써 항원 자체의 면역원성이 우수하며, 단기 면역 유도와 숙주 초기 방어에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다. 또한 O PA2-C3d 항원+A22-C3d 항원을 포함하는 2가 시험백신은 목적동물에 백신 접종 시, 초기에 강력한 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응의 동시 유도로 모체이행항체 간섭 극복에 보다 더 효과적일 것으로 기대된다.

<실험예 4> 돼지에서 모체이행항체 간섭 극복 및 세포성 면역반응과 체액성 면역반응의 동시 유도 효과 평가

돼지에서 모체이행항체 간섭 극복 및 세포성 면역반응과 체액성 면역반응의 동시 유도 효과를 평가하기 위해, MDA(+)- 또는 MDA(-)-돼지를 이용하여 실험을 수행하였다(도 6a). MDA(+)-개체들에서 O PA2-C3d+A22-C3d는 특히 SP O ELISA에 의한 항체가에 있어 강력한 모체이행항체 극복 효과를 나타내었고, SP A ELISA에 의한 항체가의 경우, 항체가 자체는 백신 접종 초기에 다소 감소하다가 부스팅 이후 증가하는 경향을 보였는데, 이는 FMDV A형 항원의 특성 상 SP 부위가 SP A ELISA plate에 코팅된 항원과 다르기 때문에 검출 자체가 낮게 나타나 percent inhibition (PI) value에 영향을 미치는 것으로 판단되며, 보다 더 정확한 평가를 위해 VN 역가를 통해 모체이행항체 간섭 극복이 가능한지에 대한 검토가 필요한 것으로 사료되었다.

반면, MDA(-)-개체들에서 O PA2-C3d+A22-C3d는 SP O ELISA, SP A ELISA에 의한 강력한 항체가의 증가를 유도하였고, backbone으로 사용한 O PA2+A22에 비해 항체가 유도능이 유의적으로 높았다(도 8b).

또한 실제 바이러스 중화 효과를 확인하기 위해 O PA2, A22에 대한 VN 역가를 확인하였다. 해당 개체들은 B사(회사의 권익보호 및 분쟁 억제를 위해 사용화 백신 출처는 기재하지 않음) 백신을 접종하였으므로, 모체이행항체의 유무를 확인하기 위해 백신 접종 전, 0 dpv에 혈청을 이용하여 O1 Campos, A2001 Argentina, A24 Cruzeiro에 대한 VN titer를 확인하였다. 그 결과 MDA(+) 그룹 및 MDA(-) 그룹에 대한 VN 역가는 각각 양성(positive)과 음성(negative)으로 정확히 구분되었고 이러한 동물들을 이용하여 각각의 그룹에 대한 백신 접종을 실시하였다.

0~84 dpv의 각각 채혈 시간별 혈청을 이용하여 O PA2, A22에 대한 VN titers를 확인한 결과, 모돈이 접종한 백신 내 백신주 항원과 본 발명에서 접종한 백신 내 항원이 서로 상이하므로, MDA(+)/MDA(-) 그룹에 상관없이 O PA2, A22에 대한 VN titers는 초기(0 dpv)에 방어수준 이하인 <1.2 Log₁₀으로 나타났으며, O PA2-C3d+A22-C3d의 2가 시험백신 투여에 의해 모체이행항체 양성/음성 그룹에서 모두 O PA2+A22 2가 시험백신 투여 시 보다 유의적으로 높은 VN 역가를 나타내었다(도 7).

이상의 결과로부터 모체이행항체 간섭 극복을 위해 개발된 면역증강 구제역 백신주인 O PA2-C3d와 A22-C3d는 모체이행항체 존재 시에도 면역 관용 등의 간섭 현상을 극복하여 숙주 내에서 효과적으로 능동면역을 유도할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 현재 이용되고 있는 백신 프로그램에 따라 모체이행항체가 감소되는 시기인 8~12주령의 목적동물(돼지)에 접종 시에도 강력한 체액성 면역반응 유도가 가능한 것으로 판단된다. 이는 항원에 spiking 되어 있는 C3d가 B 세포 표면 수용체를 지속적으로 자극하여 B 세포를 직접적으로 활성화시키는 한편, 면역원성이 높은 O PA2-C3d 항원과 A22-C3d 항원이 강력한 T 세포 매개-세포성 면역반응을 유도하여, 보다 더 효율적인 고역가 항체 및 중화항체가의 생산이 가능하기 때문인 것으로 판단된다.

이를 증명하기 위하여, MDA(+)/MDA(-) 돼지에서의 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 함유하는 2가 시험백신-매개 세포성 면역반응을 확인하였다. 양성대조군(PC)의 경우 backbone strain인 O PA2+A22 항원을 함유하는 2가 시험백신을, 음성대조군(NC)의 경우 PBS를 투여받았다. O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 MDA(+)/MDA(-) 조건 모두에서 백신 접종 초기(7 dpv)에 항바이러스 효과를 가지는 type I IFN의 발현을 매우 높은 수준으로 증가시키는 것으로 나타나, FMDV 감염에 대해 백신 접종 초기 숙주를 효과적으로 방어할 수 있을 것으로 기대되었다. T helper (Th) 1 세포 관련 사이토카인인 IFNγ의 경우, IFNα, IFNβ에 비해서는 발현량이 낮지만 > 2 fold-change 이상의 유의적인 발현을 보여(p < 0.05), T cell-매개 세포성 면역반응을 효과적으로 유도하는 것으로 판단되었다. 염증소체(Inflammasome)의 활성에 관여하는 IL-1β와 Th17 세포, 비전통적인(unconventional) T 세포 (γδ T 세포)-유래 IL-17A의 발현 역시 C3d가 삽입된 백신주로부터 분리, 정제한 항원을 투여한 실험군에서 매우 높게 나타났다. 우리의 선행연구를 통해 IL-23p19와 IL-23R의 발현이 숙주의 초기 방어에 있어 매우 중요한 것으로 밝혀졌는데, 본 발명에서도 이들의 발현은 초기에 ‘사이토카인 폭풍’ 수준으로 발현되었고 이후 정상화 되는 것으로 나타났다.

수지상세포(Dendritic cells, DCs), 대식세포 (M

s) 등 선천성 면역세포에서 병원체 인식 수용체 (PRRs)의 자극을 통해, IL-23A가 분비되면 선천성-유사 (innate-like) 면역세포인 비전통적인 T 세포 표면의 IL-23R에 결합하여 세포를 자극하게 되고 IL-17A를 생산한다. 생산된 IL-17A는 병원체의 감염 부위에 호중구를 모집하여 NET (neutrophil extracellular trap)를 형성하여 병원체를 NETosis 시킴으로써 숙주의 초기 방어에 결정적인 역할을 한다.

또한 IL-23/IL-17A axis는 선천성 면역과 적응성 면역을 연결(link)하는 것으로 알려져 있어, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신이 이러한 전염증성 사이토카인의 분비를 통해 선천성 면역반응과 적응성 면역반응을 동시에 유도하는 것으로 사료된다.

CD4⁺Th subsets과 CD4⁺T regulatory cells (T_regs)의 분화와 생존에 있어 중심적인 역할을 하며 기억 세포의 생성에 필수적인 T 세포 성장 인자인 IL-2와 T_regs의 발달과 DCs에서 면역학적 내성(immunological tolerance)의 유도에 관여하는 것으로 알려져 있는 TGFβ의 경우 실험군에서 다소 높게 나타났으나 각 그룹 간의 유의성은 관찰되지 않았다. 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 또한 실험군에서 유의적으로 증가되었는데(p < 0.05),이는 염증성 사이토카인의 ‘사이토카인 폭풍’을 조절하기 위한 숙주의 항상성에 의한 것으로 추측된다. Th2 세포-유래 사이토카인인 IL-4, IL-6의 발현은 MDA(+) 그룹에서 MDA(-)그룹에 비해 높게 나타나, 모체이행항체에 의한 수동면역 존재 시 이들 사이토카인 발현 수준이 증가하는 것으로 판단되었다.

T 세포 수용체 (TCR) 신호와 협력하여 T 세포의 활성화를 촉진하는 CD80 및 CD86 공동 자극 신호 전달은 O PA2-C3d+A22-C3d 투여군에서 증가하여 이들 면역증강 구제역 백신주가 항원을 효과적으로 T 세포에 제시하여 T 세포를 효과적으로 자극할 수 있을 것으로 판단된다.

MHC class I의 경우 MDA(+) 그룹에서 MDA(-) 그룹에 비해 유전자 발현이 높았고 백신 접종 그룹에서 오히려 NC군에 비해 더 낮은 것으로 나타났는데, 수동면역 존재 시 유전자의 발현이 낮게 나타나 백신 접종 초기 cytotoxic CD8⁺T cells에 의한 항원의 인식이 저해되는 것으로 보인다. 반면, MHC class II는 MDA(+) 그룹에 비해 MDA(-) 그룹에서 높은 발현을 보였고, 그룹간 유의성은 없었으나 실험군에서 증가되는 경향을 나타내었다. 이로부터 C3d 삽입 면역증강 백신주 항원이 APC (DCs, M

s, B cells 등)에 의한 MHC class II의 제시를 통해 효과기(effector) 세포의 협동과 조절을 유도하는 CD4⁺T cells을 활성화시키는 것으로 보여지며 MHC 복합체와의 상호작용을 통해 지속적인 세포-세포 접촉 형성 및 T 세포의 활성화를 유도할 수 있을 것으로 판단된다.

한편, 직접적인 C3d의 수용체인 CD21의 발현은 C3d가 융합된 구제역 백신주 항원을 포함하는 시험백신 접종에 의해, MDA(+)/(MDA(-) 조건에서 모두 유의적으로 증가하여(p < 0.01, p < 0.0001), FMDV 표면의 C3d의 자극 및 CD21의 결합에 의해 B cell의 활성화가 가능한 것으로 보여진다.

T 세포 활성 시 공동-자극되고, 기억 T 세포의 유도에 중요한 역할을 하는 공동-자극 신호인 CD28과 ICOS의 발현은 O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신 투여 시, MDA(+)/MDA(-) 조건에서 현저히 높게 증가하였다(CD28: p < 0.0001; p < 0.05; ICOS: p < 0.01; p < 0.00001). 특히, ICOS의 발현은 실험군과 PC군 간의 유의적인 차이를 유도하였는데(MDA(+): p < 0.05; MDA(-): p < 0.0001), C3d 융합 구제역 백신주 항원이 T 세포, 림프구의 공동-자극을 증가시켜, IFNγ의 유의적인 발현을 유도한 것으로 보인다. 또한 ICOS는 면역글로불린 도메인으로써 IgA 생성을 위한 장간 면역(intestinal immune) 관계에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, 향후 전신 면역·점막 면역 동시 유도를 위한 구제역 백신주로의 사용이 가능할 것으로 기대된다. CTLA4 발현 또한 ICOS의 발현과 유사한 경향을 나타내어, ICOS의 발현에 의해 CTLA pathway가 유도된 것으로 생각되며, 유도된 CTLA4는 세포질 도메인에서 모체이행항체 간섭 극복용 구제역 백신 접종 시, ‘사이토카인 폭풍’ 수준의 전염증성 사이토카인의 발현에 의한 자가면역을 억제하기 위한 조절(regulatory) T 세포의 전환을 야기하는 것으로 추측된다.

한편, 본 발명에서 AHNAK의 발현은 MDA(-) 조건에서 O PA2-C3d+A22-C3d 투여군에서 현저히 증가되었고(p < 0.001), MDA(+) 조건에서도 실험군에서 다소 높았으나 각 그룹간 유의성은 관찰되지 않았다. AHNAK은 이전에 구조적 스캐폴드(scaffold) 단백질로 확인된 700 kDa의 큰 단백질로, 세포 구조, 세포 내 trafficking, 세포막 재생, 조절된 세포외 배출 작용, T 세포 분화 및 T 세포 활성화 과정 중 칼슘 신호경로와 같은 다양한 세포 과정에 관여되어 왔다.

Cytolytic CD8⁺T cells (CTL)은 칼슘-의존적 방식으로 바이러스에 감염된 세포를 사멸시킨다. AHNAK은 성숙한 CTL에서는 발현되지만, naive CD8⁺T cell에서는 발현되지 않으며, 면역반응 유도를 위한 적절한 기능에 필요한 칼슘 도입은 매우 중요한 것으로 보고되었다. 실제 ANHAK-결핍(Ahnak1^-/-) CTL은 TCR 자극 후 Granzyme B 생산, cytolytic activity, IFNγ 분비의 현저한 감소를 보인 바 있다.

따라서, O PA2-C3d+A22-C3d 항원을 포함하는 시험백신은 AHNAK의 발현을 통해 T 세포의 활성 및 CTL 반응을 유도할 수 있을 것으로 생각된다.

또한, 본 발명에 따른 면역 증강 구제역 바이러스 항원은 세포성 면역반응의 지표인 IFNγ 분비를 유도하며, C3d가 삽입된 FMDV 항원에 의해 유도된 특정 세포 면역 반응을 입증하기 위해, 'C3d' 삽입 FMDV(O PA2-C3d, A22-C3d) Ag 매개 IFNγ 분비를 마우스 복막 세척액에서 분리한 복막 삼출 세포(PEC)와 돼지의 전혈에서 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용한 시험관 내 ELISpot 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, O PA2-C3d 및 A22-C3d에서 파생된 비활성화된 FMDV 항원은 마우스 PEC 및 돼지 PBMC에 대한 대조군보다 훨씬 더 높은 수준의 IFNγ 분비를 유도하였다(도 8e). 종합하면, 이러한 결과는 O PA2-C3d 및 A22-C3d가 Th1형 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한 것이다.

<실험예5> 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 가능 여부 평가

본 발명에 따라 제조된 재조합 구제역 바이러스 2종, O PA2-C3d 및 A22-C3d과 양성대조군(Positive control, PC)인 backbone 바이러스 2종, O PA2 및 A22를 이용하여, 불활화 항원을 생산 및 정제하였다. 이들을 이용하여, 간이 키트에서의 항원량 측정 및 야외주와의 감별 시험을 실시한 결과, 2.34 ng (1/640 dose)의 소량으로도 SP 양성밴드를 확인하였고, NSP 밴드가 미형성된 것을 통해 야외주와의 감별이 가능한 것으로 나타났다(도 9). 수크로즈 밀도구배(Sucrose gradient)를 통해 정제된 항원(146s particle)의 전자현미경(TEM) 관찰 결과, 146s particle 형성에 문제가 없는 것을 확인하여 이를 구제역 시험백신 항원으로 이용하고자 하였다(도 10).

Claims

서열번호 11의 서열을 갖는 재조합 플라스미드.
제1항의 재조합 플라스미드로부터 제조된 면역증강 재조합 구제역 A형 바이러스.
제2항의 면역증강 재조합 구제역 바이러스를 정제, 분리하여 수득한 면역증강 재조합 구제역 A형 바이러스 항원.
제2항의 면역증강 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 면역증강 재조합 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 백신 조성물.
제2항의 면역증강 재조합 구제역 바이러스 또는 제3항의 면역증강 재조합 구제역 바이러스 항원을 포함하는 구제역 진단 키트.
제5항의 구제역 진단 키트를 이용한 구제역 진단 방법.
제4항의 구제역 백신 조성물을 이용한 구제역 예방 또는 치료 방법.