WO2020189840A1 - 오일 에멀젼과 병용 투여 가능한 면역증강용 보조물질 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 - Google Patents

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박종현
김수미
조현동
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    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an auxiliary material for enhancing immunity of a foot-and-mouth disease vaccine and a vaccine composition comprising the same. Specifically, it relates to an auxiliary material for enhancing immunity of a foot-and-mouth disease vaccine that can be administered in combination with an oil emulsion and a vaccine composition comprising the same.
  • Foot-and-mouth disease is a highly contagious viral disease that primarily affects cloven hoofed livestock, resulting in significant economic losses for the livestock industry due to its rapid spread, high mortality and decreased productivity.
  • the susceptible species consists of over 70 species of wildlife, including ruminants (livestock ruminants) such as cattle, pigs, water buffalo, camels, sheep, and goats. This disease is accompanied by high fever and is known to cause blistering in the mouth, tongue, snout, nose, nipples, hooves and other hairless areas of the skin.
  • Vaccination is used as a means to control disease in countries with foot-and-mouth disease, and plays an important role in establishing contingency plans in countries with foot-and-mouth disease.
  • Foot-and-mouth disease vaccines worldwide use dead poison (inactivated) vaccines, and most of them have improved in terms of effectiveness by vaccination with oil adjuvants (Double Oil Emulsion, DOE or Single Oil Emulsion, SOE). Late antibody induction period, low antibody titer, short persistence of antibodies and low immunogenicity in pigs are pointed out as disadvantages.
  • Foot-and-mouth disease vaccines to date have focused on inducing humoral immune responses rather than cellular immune responses, but their protective performance is not perfect.
  • the induction period of humoral immune response (main neutralizing antibody IgG) by foot-and-mouth disease vaccine takes 4 to 7 days, whereas cellular immune response is induced within several hours to 3 days. At this stage, it seems to be more effective in defending the host.
  • the current foot-and-mouth disease vaccine requires regular vaccination every 4 to 6 months as the antibody maintenance period is short after vaccination.
  • fibrosis and granuloma are inoculated at the inoculation site.
  • There are disadvantages of low safety and local side effects such as the formation of muscle lesions.
  • Vaccine delivery systems such as oil emulsion, surfactant, liposome, virosome, ISCOMs, etc.
  • Immunity enhancers such as Saponin, Alumium hydroxide, and Potassium Phosphate
  • TLRs Toll-like receptors
  • RLRs RIG-I-like receptors
  • NOD nucleotide-binding oligomerization domain
  • NLRs nucleotide-binding oligomerization domain
  • CLRs C-type lectin receptors
  • various cytokines such as IL-1, IL-2, IL-6, IL-18, TNF ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , and GM-CSF Etc. have been studied and used as adjuvants.
  • Patent Document 1 Unexamined Patent Publication No. 10-2017-0097116
  • Patent Document 2 Unexamined Patent Publication No. 10-2018-0024030
  • the present invention aims to provide a safe and optimized adjuvant and a vaccine composition containing the same, as well as protective antibody induction in cows, such as mice, cattle, and pigs, for the prevention and treatment of foot-and-mouth disease.
  • the present invention provides an adjuvant composition comprising a pattern recognition receptor ligand (PRRs ligand) as an active ingredient.
  • PRRs ligand pattern recognition receptor ligand
  • the adjuvant composition may contain cytokines as an active ingredient, and may be included together with a pattern recognition receptor ligand.
  • Cattle in the present invention collectively refers to a group of animals with two hoofs such as cows, pigs, sheep, goats, reindeer, water buffalo, and camels, and may preferably be cattle or pigs.
  • Foot-and-mouth disease virus antigens in the present invention include foot-and-mouth disease virus O serotype, foot-and-mouth disease virus A serotype, foot-and-mouth disease virus Asian 1 serotype, foot-and-mouth disease virus C serotype, foot-and-mouth disease virus SAT1 serotype, foot-and-mouth disease virus SAT2 serotype and/or foot-and-mouth disease virus SAT3 It may be a serotype or the like.
  • Cytokine is a generic term for biologically active factors that are secreted by cells and are involved in intercellular signal transduction, cell behavior regulation, and immune response regulation. Refers to.
  • the cytokines in the present invention are IL-1 beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-12/23p40, IL-15/ 15R, IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23 (IL-12p40/IL-23p19), IL-33, TNF-alpha, IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, etc., but are not limited thereto. Does not.
  • the cytokine is meant to be commonly used, and includes recombinant cytokines expressed in E. Coli , Baculovirus, HEK 293 cells, and the like.
  • the pattern recognition receptor serves to recognize conserved molecular patterns that distinguish viruses, bacteria, fungi and parasites, and the ligand is an agonist of the receptor, that is, the receptor It refers to a substance that binds and activates a receptor.
  • the PRRs ligand is R848 (TLR-7/8 agonist), TDB (Mincle agonist), Curdlan (Dectin-1 agonist), Furfurman (Dectin-2 agonist), MDP (NOD-2 ligand), MPLA-SM (TLR- 4), Zymosan (Dectin-2/TLR-2), Chitosan (NLRP inflammasome inducer, MR), Poly(I:C) (TLR-3), Poly(dA:dT) (RIG-1/CDS agonist, AIM -2 inflammasome inducer), may be a STING-based ligand, but is not limited thereto.
  • the STING-based ligand may be DNA, RNA, protein, peptide fragments, compounds, etc. that can activate STING signaling, and preferably c-di-GMP (cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c -di-GAMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 10-(carboxymethyl)9(10H)acridone (CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA)), 5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid-DMXAA, methoxyvone, 6,4'-dimethoxyflavone (6,4'-dimethoxyflavone) , 4'-methoxyflavone, 3',6'-dihydroxyflavone (3',6'-dihydroxyflavone), 7,2'-dihydroxyflavone (7,2'-dihydroxyflavone)
  • the poly (I:C) refers not only to naturally occurring polymers of polyinosinic acid:polycytidylic acid, but also synthetic forms thereof.
  • composition of the present invention may contain one or more components optionally selected from the PRRs.
  • any one PRRs ligand may be included in a weight ratio of 1: 1 to 3, and preferably 1: 1 to 2 weight ratio.
  • the dosage of the present invention is not limited to the PRRs ligand or cytokine, but may preferably include 1 to 100 ⁇ g/ml.
  • each ligand may be included in a range of 1/2 or less compared to the dose contained alone, preferably 1 to 30 ⁇ g/ml, preferably 5 to 15 ⁇ g/ml, more preferably May contain 7-10 ⁇ g/ml.
  • oils or oil emulsions
  • emulsifiers gels, etc. well known in the art may be further included.
  • the oil may be ISA 201, ISA 61, ISA 50, or ISA 206, but is not limited thereto.
  • the emulsifiers are substances generally recognized as emulsifiers, such as other products of the TWEEN® or SPAN® product line (respectively fatty acid esters of polyethoxylated sorbitol, and fatty acid-substituted sorbitan surfactants) and PEG-40 Other solubility improving agents such as castor oil or other PEGylated hydrogenated oil may be included, but are not limited thereto.
  • the present invention can provide a safe and optimized adjuvant composition and a vaccine composition comprising the same, induction of protective antibodies of cattle, pigs, etc. for the prevention and treatment of picona viruses including foot-and-mouth disease.
  • the present invention can be used to effectively cope with emergency vaccines in the field, and effective and stabilized vaccines can be provided as constant vaccines to cattle-like animals.
  • 2A shows the results of induction of innate immunity and cellular immune response of DCs according to serotype-specific antigens.
  • Figure 2b shows the results of induction of innate immunity and cellular immune response of M ⁇ s according to serotype antigens.
  • Figure 3 shows the cytokine expression profile induced by foot-and-mouth disease virus (O TWN 97-R) antigen in mice and a strategy for time kinetics studies in vivo.
  • O TWN 97-R foot-and-mouth disease virus
  • Figure 4 shows the cytokine expression profile and in vivo time kinetics results induced by foot-and-mouth disease virus (O TWN 97-R) antigen in mice (Time points; 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h).
  • O TWN 97-R foot-and-mouth disease virus
  • O TWN 97-R foot-and-mouth disease virus
  • 6A to 6C are time of foot-and-mouth disease virus (O TWN 97-R) antigen-mediated cytokine in DCs, M ⁇ s, iNK T cells, ⁇ T cells and T cells isolated from mouse peritoneal effusion cells (PEC) and splenocytes. It shows the expression result according to (Time point; 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h).
  • O TWN 97-R foot-and-mouth disease virus
  • Figure 7 is in the expression of cytokine mediated by the foot-and-mouth disease virus (O TWN 97-R) antigen when co-culturing DCs, iNK T cells, ⁇ T cells and T cells isolated from mouse peritoneal secretory cells (PEC) and splenocytes. It shows the strategy for in vitro characterization, (A) strategy for in vitro study (B) schematic diagram for co-cultured cells.
  • O TWN 97-R foot-and-mouth disease virus
  • FIG. 8 shows the results of antigen-mediated cytokine expression in cells co-cultured in mice, DCs, iNK T cells, ⁇ T cells, and T cells.
  • Figure 9 shows a strategy for confirming the antigen O TWN 97-R mediated in vivo defense effect in the early stages of FMDV infection.
  • Figure 10 shows the effect on the antigen O TWN 97-R-mediated biological defense effect (mouse survival rate, body weight change) in the early stages of FMDV infection.
  • FIG. 11 shows a strategy for cell depletion, cytokine neutralization, and antigen-mediated biological defense effects.
  • 12A and 12B show the in vivo defense effect (viability, weight loss) by antigen upon depletion of DCs and M ⁇ s and neutralization of cytokines on host protection against FMDV infection.
  • FIG. 13 is an antigen-mediated stimulatory molecule CD40, CD80 in DCs treated with O TWN 97-R antigen and stimulants (R848, Chitosan, Zymosan, ODN 2395, TDB, Furfuman and c-di-GMP). , CD86 expression and cell proliferation results are shown.
  • FIG. 15 shows a strategy for evaluating the potential as a vaccine adjuvant and the short-term immune memory effect against FMDV infection when administered alone or in combination with PRRs ligand and cytokine.
  • Figure 16 shows the short-term immune memory effect and the biological defense effect (viability, weight change) when administered alone or in combination with PRRs ligand and cytokines as adjuvants for host protection against FMDV infection.
  • FIG. 17 shows a strategy for evaluating the long-term memory response and its protective effect of cytokines, HSP70 protein and PRRs ligand mediated in mice against FMDV infection (long-term immunity).
  • 18A to 18D show the results of long-term immune memory responses mediated by cytokines, HSP70 protein and PRRs ligand, and protective effects against FMDV infection in mice.
  • 19A to 19G show the results of cytokine, HSP70 protein and PRRs ligand mediated immune cell expansion in mice.
  • FIG. 20 shows a strategy for confirming IFN ⁇ and IL-23 mediated protective effects against infection with various FMDV serotypes (type O, type A, and Asia1).
  • FIG. 21 shows the results of IFN ⁇ and IL-23 mediated memory responses and a wide range of protective effects against infection with various FMDV serotypes (type O, A, and Asia1).
  • Figure 22 shows the LDH release (cytotoxicity, 96 hours later) in PRRs ligand-treated bovine PBMCs.
  • Figure 27 shows the results of PRRs ligand-mediated cell proliferation (after 96 hours) in pig PBMCs.
  • Figure 28 shows a strategy for evaluating the PRRs ligand-mediated adjuvant effect and memory response in pigs.
  • Antigens were purified and inactivated according to the following method.
  • FMDV O TWN 97-R GenBank AY593823 for P1
  • BHK-21 cells For virus infection, the culture medium was replaced with serum-free Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) and incubated for 1 hour in 5% CO 2 gas at 37° C. to inoculate the virus. Extracellular virus was removed. After 24 hours of infection, the virus was inactivated by treatment with 0.003N binary ethylenimine twice for 24 hours in a shaking incubator and polyethylene glycol (PEG) 6000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Concentrated. The virus concentrate was layered on a 15-45% sucrose density gradient and centrifuged.
  • PEG polyethylene glycol
  • PRRs ligand was used as Invivogen (SanDiego, CA, USA), and cytokine was used as a product of MitenyiBiotec (MiltenyiBiotec, BergischGladbach, Germany).
  • Oil emulsion in ISA 206 is Seppic Corporation (Seppic Inc., Paris, France) , aluminium hydroxide gel (Alhydrogel ®) and Quil-A was used as purchased from Invivogen.
  • Wild-type C57BL/6 mice (7 weeks old female) with matching age and sex were purchased (KOSA BIO Inc, Gyeonggi-do, Korea). All mice were housed in micro-quarantine cages in a specific sterile pathogen (SPF) animal facility with Biosafety Level 3 (ABSL3) of the Agriculture, Forestry and Livestock Quarantine Division.
  • SPF sterile pathogen
  • a characteristic feature of the expression of IL-23 is the expression pattern of similar pattern in the serotype O O PA-2-R and O TWN 97-R, i.e., the expression rapidly increased from 6 to 12 h and slightly increased at 24 h. Although it shows a low level, it was re-boosted at 48-72h and approached the 12h level, and then significantly decreased at 96h (Fig. 1).
  • DCs and M ⁇ s were separated from naive mice and treated with respective antigens, 0, 12, 24, 48, 72, 96 h Inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ , IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-12/23p40, IL-23 and TNF ⁇ in culture supernatant, anti-inflammatory cytokine expression patterns and time of expression of these cytokines The kinetics were analyzed. As a result, the expression in DCs is as follows.
  • IL-23 and IL-10 by serotype were almost the same in SAT1-BOT-R, SAT2-ZIM-R, SAT3-ZIM-R, C3-Resende-R and Asia1-MOG-R treatment groups. While similar levels were shown, in the case of A22-R, O PA-2-R and O TWN 97-R, the expression level of IL-23 was significantly higher than that of IL-10. In addition, the maximum expression level of IL-6 was 593 ⁇ 753pg/mL, and the rest of the cytokines showed about 50 ⁇ 200pg/mL.
  • cytokine expression levels were high in the order of IL-6> IL-23, IL-10 until 12h, and these cytokines were expressed at 12-24h. After the amount was crossover, the expression pattern was changed in the order of IL-23> IL-6, and IL-10 from 24h later (Fig. 2b).
  • the test method is as shown in FIG. 3, and it was attempted to confirm stimulation of immune cells by measuring changes in cytokines.
  • the initial reactions were IL-1 ⁇ (IL-1 beta) and IL-6, and most of them were stimulated over time.
  • the stimulations between 12 and 24 h are IL-12/23p40, IL-17A, TNF ⁇ (TNF alpha), IL-1 ⁇ (IL-1 beta), IL-2, IL-10, IL15/15R, IL-
  • stimulation was completed by 72h, and the response of IL-4, IL-9, IL-12p70, IL-21, IL-22, and IFN ⁇ (IFN gamma) increased up to 96h. Since the cytokines to be stimulated in each cell are different, it was confirmed that it is possible to estimate which cells work (FIG. 4).
  • each immune cell (DCs, M ⁇ s, iNK T cells, ⁇ T cells and T cells) is isolated from mouse peritoneal effusion cells (PEC) and splenocytes to measure changes in cytokine expression.
  • PEC mouse peritoneal effusion cells
  • splenocytes to measure changes in cytokine expression.
  • O TWN 97-R (2 ⁇ g) was treated as an antigen, and cells (DCs, M ⁇ s, iNK T cells, ⁇ T cells and T cells) were sorted from PECs and spleens for time (0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h).
  • test method cells were sorted as in Preliminary Experimental Example 2, and each immune cell (DCs, M ⁇ s, iNK T cells, ⁇ T cells and T cells) was separated and mixed, and then O TWN 97-R antigen-mediated cytokine changes It was attempted to confirm stimulation of immune cells by measuring (Fig. 7). Specifically, antigen O TWN 97-R (2 ⁇ g) was treated, and the results were measured 48 hours after antigen stimulation.
  • FIG. 9 A research strategy for confirming whether the O TWN 97-R antigen, which activates the innate immune response and the cellular immune response, actually exhibits a protective effect upon infection with the FMD virus is shown in FIG. 9.
  • 2 ⁇ g of the antigen was injected into the mouse intraperitoneally, virus was infected at 1, 3, 5, and 7 dpi, and the survival rate and body weight change were monitored up to 7 dpc.
  • 2, 5, and 10 ⁇ g of antigens were injected into the same route, virus was infected at 5dpi, and the survival rate and body weight change were monitored up to 7dpc.
  • the 5dpi group showed a 40% defense rate
  • the group increased the dose to 5 showed a 100% survival rate
  • Antibodies were used to deplete cells or neutralize cytokines, and antigens were injected 24 h later, and virus was infected 5 days later (5dpi) to confirm protective performance. As a result, it was confirmed that IL-23p19, TNF ⁇ , and IL-10 play an important role. All mice died on day 5 (5dpc) in the group administered with the antibody against the inflammatory cytokine IL-23p19, while all mice died on the 6th day (6dpc) in the group administered with the TNF ⁇ antibody, whereas the anti-inflammatory cytokine IL In the group administered the antibody against -10, the survival rate was 100% and no weight loss was observed.
  • IL-23 of the cytokines plays the most important role in the defense of the host against FMDV attacks.
  • IL-1 ⁇ and TNF ⁇ are also weaker than IL-23, but they are used to defend the host at the beginning of virus infection. It was judged to be able to partially contribute.
  • IL-10 an anti-inflammatory cytokine
  • IL-10 and antigen were simultaneously injected at 5 ⁇ g to compare the survival rate and body weight changes.
  • IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF ⁇ expressed at high levels by the antigen In order to inhibit IL-23, IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF ⁇ expressed at high levels by the antigen, it was neutralized with a specific mouse monoclonal antibody, and the virus was infected at 24h after simultaneous injection of IL-10 and antigen. Made it. The isotype control antibody for each antibody was injected and compared to the control group. As a result, as in the IL-10 treatment group, on the 4th day after FMDV infection (4dpc), the survival rate decreased to 20%, and all animals died on the 6th day (6dpc), and the weight change also decreased by about 30%. Fig. 10 appeared to deteriorate host defense by increasing susceptibility to viruses by inhibiting the immune response within the host in the early stage of FMDV infection.
  • IL-23 exhibits immunostimulatory activity as an adjuvant (vaccine adjuvant)
  • 2.5 ⁇ g of IL-23 was administered in combination with the same amount of antigen.
  • mice in the group administered with 2.5 ⁇ g of antigen alone showed a survival rate of 40%, whereas in the group administered with IL-23 and antigen together, the survival rate was 80% or more, and weight loss was also 2 to 3 days (2dpc ) It was found that the defense effect against FMDV infection was improved by the adjuvant effect of IL-23, showing a tendency to slightly decrease and then recover again.
  • the results of examining the expression of antigen-mediated co-stimulatory molecules in DCs are as follows (Fig. 13).
  • Fig. 13 The results of examining the expression of CD40, CD80, and CD86 after treatment with the antigen alone or by adding the PRRs ligand to the antigen as an adjuvant, it showed high expression in the treatments to which R848, Zymosan, TDB, and c-di-GMP were added.
  • the antigen alone stimulates DCs to increase the expression of co-stimulatory molecules, but if the PRRs ligand is treated as an adjuvant, it is expected that DCs can be stimulated more strongly and effectively present the antigen to T cells. do.
  • dectin1 , dectin2 , tlr7 , and tlr8 were high in DCs, whereas the expression of mincle and sting was high in M ⁇ s , and the expression of tlr2 , tlr4 , and nlrp3 was also relatively high.
  • O TWN 97-R Ag stimulates cell-intrinsic PRRs ligands tlr7 , tlr8 , sting, and cell-extrinsic PRRs ligands dectin1 , dectin2 , mincle at the same time, thereby innate immune response in APCs such as DCs and M ⁇ s. And not only can amplify the cellular immune response, but also promote the differentiation process of Th cells into Th1, Th2 or Th17 cells, and eventually contribute to the activation of T cells, thereby inducing a cellular immune response to FMDV. It is expected to play a decisive role in the defense of the host in the early stage of infection.
  • FIG. 16(A), and FIG. 16(B) In the case of IFN ⁇ in BW (body weight, body weight change), almost no body weight change was observed.
  • (C) of Figure 16 shows the survival rate when administered in combination with the PRRs ligand.
  • the survival rate was high in the order of R848+TDB> TDB+c-di-GMP> Furfurman+TDB, and only weight loss was observed in the range of less than about 20% in weight change (Fig. 16(D)).
  • mice were more effectively protected from FMDV infection.
  • combinations of TLR-7/8, Mincle, Dectin-2, Sting, etc. It was judged that the possibility as a Vant would be high.
  • mice were subjected to 1 st vaccination with IM (intramuscular, intramuscular inoculation) at 0 dpv (days post vaccination), followed by 2 nd vaccination (boosting) 28 days (28 days post vaccination, dpv). After that, on the 56th day (56days post vaccination, dpv), FMDV (100LD 50 of O VET 2013, ME-SA topotype) was administered intraperitoneally to the mouse, and the survival rate and weight change until 7 days (days post challenge, dpc) were monitored. Monitored.
  • mouse serum and peritoneal exudate cells were sampled at 0, 28, and 56dpv, and SP ELISA and virus neutralization titers (VN titers, neutralizing antibodies) were tested. ), etc.
  • mice in the negative control group died 100% on the 4th day, and the positive control group died. Mice showed a tendency to survive 40%.
  • mice in the group administered with PRRs ligand and cytokine adjuvant survived 100%, and no weight loss was observed.
  • FIG. 19a the number of CD3 + CD4 + T cells was confirmed, and expansion of cells was observed in the group to which IFN ⁇ , HSP70, R848+TDB, TDB+c-di-GMP, etc. were added.
  • Figure 19b shows the population of CD3 + CD8 + T cells. Compared to CD4 + T cells, the overall number of cells appeared to be lower, and significance was observed in the IFN ⁇ -treated group at 28dpv.
  • Fig. 19c expansion of CD4 + CD8 + T cells was confirmed.
  • all cytokines and PRRs ligand addition groups except HSP70 showed a significant increase in cell number, but a significant decrease in 56dpv.
  • the population rapidly increased at 56 dpv compared to 28 dpv, and PRRs ligands were more significant than cytokines at 28 dpv.
  • T cell expansion was induced, but at 56dpv, the number of cells increased in all adjuvant-added groups, and these adjuvants are expected to promote stimulation of cellular and humoral immune responses by effectively inducing memory T cells.
  • Fig. 19E expression of CD44 high CD27 low ⁇ T cells, which are memory ⁇ T cells, was observed. It is known that about 5% of ⁇ T cells exist in mice in general, but the number of these cells was increased to about 8-10% by addition of adjuvant, and no significant difference between 28 and 56 dvp was observed. It has been shown to be effective not only for inducing cellular immune responses but also for induction of mid-term and long-term cellular immune responses.
  • 19F shows the expansion of memory B cells (CD3 - CD44 + CD27 + B cells).
  • IL-23, R848+TDB, TDB+c-di-GMP showed a significant increase in the number of cells, and 56dpv overall increased the number of cells compared to 28dpv, and memory B cells in all cytokines and PRRs ligand added groups was confirmed to be significantly expanded.
  • IFN ⁇ +IL-2+TNF ⁇ , IL-15+IL-18, R848+TDB, and R848+c-di-GMP showed a significance of p ⁇ 0.001 or less.
  • Figure 19g shows the results of confirming the expansion of CD3 - CD335 (NKp46) + CD27 + cells known as memory like NK cells.
  • the IFN ⁇ -administered group showed a significantly high number of cells, and from this, IFN ⁇ appears to effectively stimulate NK cells involved in the innate immune response, and it is thought to have an excellent effect on inducing a memory response.
  • cytokines particularly IFN ⁇ and IL-23 as vaccine adjuvants, memory responses, and protective effects against FMDV infection by various serotypes.
  • mice Based on the experimental results in the above mice, experiments were performed using the adjuvant composition of Table 2 below in order to observe PRRs ligand, HSP70, and cytokine mediated cell proliferation and cytotoxicity in bovine and pig immune cells.
  • PBMCs Purified PBMCs were treated with 10% fetal bovine serum (FBS) (HyClone, Logan, Utah, USA), 3mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, USA), 100 U/ml penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplemented with RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) in St. Louis, Missouri) and cultured at 37° C., 5% CO 2 to attach 1 ⁇ 10 4 cells per well to a 96 well plate. Made it. After incubation for 3 hours, the culture medium was replaced with serum-free medium before stimulation with various PRR ligands and cytokines.
  • FBS fetal bovine serum
  • 3mM L-glutamine Sigma-Aldrich, USA
  • penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, USA
  • Pig and bovine PBMCs were treated with PRR ligand and cytokines as shown in Table 2. After 96 hours, the cell culture medium (supernatant) was collected, and cytotoxicity by secretion of lactic acid dehydrogenase (LDH) and cell proliferation by incorporation of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) were observed. .
  • LDH lactic acid dehydrogenase
  • BrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine
  • cytotoxicity in the supernatant of treated pig and bovine PBMCs are as described above. LDH secretion analysis was performed according to the manufacturer's protocol using CytoTox 96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay (Promega).
  • the cells were lysed using the kit provided lysis buffer and the supernatant from the lysis buffer treated cells was to determine the maximum LDH release control.
  • a BrdU cell proliferation assay kit (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) was used to evaluate the effect of PRRs ligands and cytokines on the proliferation of pig and bovine PBMCs based on the incorporation of BrdU during DNA synthesis.
  • PrioCHECK FMDV type O (Prionics, Switzerland) was used to detect structural protein (SP) antibodies in serum. The absorbance of the ELISA plate was converted to a percentage inhibition (PI) value. If the PI value was 50% or higher, the animal was considered antibody positive.
  • Virus neutralization tests were performed according to the OIE manual. It was activated by bathing in serum at 56° C. for 30 minutes. By adjusting the cell density to form a 70% monolayer, a 2-fold dilution of the serum samples from 1:4 to 1:512 was prepared. The diluted serum samples were incubated at 37°C for 1 hour with 100 tissue culture infection dose (TCID) 50/0.5ml homolog virus. After 1 hour, LF-BK (bovine kidney) cell suspension was added to all wells. After 2-3 days, CPE was measured to determine the titer to neutralize 100TCID 50 of the virus as log 10 of the titer antibody dilution.
  • TCID tissue culture infection dose
  • LF-BK bovine kidney
  • cytotoxicity of the treatment group itself was found to be low. There appeared to be no toxicity (FIG. 22(A)).
  • Fig. 22(B) shows the results of observing cytotoxicity after treating the cells by mixing PRRs ligand and cytokines with the vaccine adjuvant Oil+Gel+Saponin, respectively, in bovine-derived PBMCs. Even at this time, cytotoxicity by the adjuvant mixture was not observed when compared to the control.
  • FIG. 23 shows the results of observing cell proliferation by BrdU incorporation after treatment with each PRRs ligand and cytokine, Oil, Gel, Saponin and Oil+Gel+Saponin in bovine-derived PBMCs, and 96 hours later.
  • Cell proliferation was increased in all PRRs ligand-treated groups compared to the control group, and in particular, the effects of Curdlan, TDB, c-di-GMP, R848 and Furfurman were found to be greater.
  • Figure 23 (C) shows the result of observing cell proliferation by combining the PRRs ligand.
  • Cell proliferation was increased in all treatments compared to the control, and in particular, R848+TDB, Furfurman+TDB, and TDB+c-di-GMP treatment showed higher values. From this, it is shown that the combination of these PRRs ligands effectively stimulates bovine PBMCs, thereby enhancing cell proliferation and stimulating the immune response.
  • the immune response of bovine-derived PBMCs by these adjuvants is significantly higher than that of pig-derived PBMCs, and it seems that bovine immune cells respond more sensitively than porcine immune cells.
  • the PRRs ligand added group showed significantly higher antibody titer than the control group, and at 140 days after boosting (140dpv) The high level was maintained until (Fig. 25 (A)).
  • the PRRs ligand-added group showed a significantly higher value than the 14dpv control group ( p ⁇ 0.01 ), and a very high level ( p ⁇ 0.001 ) was maintained from then to 140dpv. (FIG. 25(B)).
  • R848+TDB, Curdlan+c-di-GMP when added as an adjuvant to a vaccine, effectively stimulates innate and cellular immune responses, and continuously stimulates humoral immune responses, thereby preventing FMDV infection. It is expected to contribute to the defense of the host.
  • LDH Lactate Dehydrogenase
  • FIG. 26 shows the results of observing cytotoxicity after treatment of cells by mixing PRRs ligand and cytokines in pig-derived PBMCs with Oil+Gel+Saponin, a vaccine adjuvant. Even at this time, cytotoxicity by the adjuvant mixture was not observed when compared to the control.
  • Figure 27 (A) is a result of observing cell proliferation by BrdU incorporation in pig-derived PBMCs with each PRRs ligand and cytokine, Oil, Gel, Saponoin and Oil+Gel+Saponin, compared to the control.
  • Cell proliferation was increased in the PRRs ligand-treated group, and in particular, the effects of TDB and c-di-GMP were found to be the greatest.
  • the effect of Gel and Saponin was insignificant at 96h.
  • Pig-derived PBMCs were treated by mixing each PRRs ligand and cytokine with Oil+Gel+Saponin, and cell proliferation was observed at 96h. Compared to the control, all PRRs ligands were mixed with Oil+Gel+Saponin and the cells were proliferated. It was increased, but the value was lower than that of the oil+Gel+Saponin-free (W/O) (FIG. 27(B)).
  • Figure 27 (C) shows the results of observing cell proliferation by combining the PRRs ligand. Cell proliferation was increased in all treatment groups compared to the control group, and in particular, R848+TDB, Furfurman+TDB, TDB+c-di-GMP treatment showed higher values.
  • the TDB+c-di-GMP added group maintained high neutralizing antibody titers up to 84dpv
  • the R848+TDB added group showed excellent immunity enhancing effects from early (14dpv) to mid-term (42dpv). B, thereafter showed a tendency to decrease somewhat.
  • the PRRs ligand + added group showed significantly higher levels from 14dpv than the control group, and even up to 84dpv maintained a significantly higher level compared to the control group (FIG. 29(B)).
  • R848+TDB, Furfurman+TDB, TDB+c-di-GMP when added as adjuvants to vaccines, effectively stimulates innate and cellular immune responses, and by continuously stimulating humoral immune responses.
  • it is expected to contribute significantly to the defense of the host from FMDV infection, and to be used for the development of a new strategy of FMDV vaccine.

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Abstract

본 발명은 구제역 백신용 아쥬반트 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 구제역 발생 예방 및 치료를 위한 마우스를 비롯한 소, 돼지 등의 우제류에서의 세포성·체액성 면역반응 동시유도를 통한 강력한 메모리 반응 유도와 안전하고 최적화된 아쥬반트 조성물 및 이를 포함하는 백신조성물을 제공할 수 있다. 또한, 구제역 발생시 본 발명을 이용하여 현장에서 긴급백신으로써 효과적인 대처를 할 수 있으며, 우제류 동물에 안정화된 상시백신을 제공할 수 있다.

Description

오일 에멀젼과 병용 투여 가능한 면역증강용 보조물질 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물
본 발명은 구제역 백신의 면역증강을 위한 보조물질 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는 오일 에멀젼과 병용 투여 가능한 구제역 백신의 면역증강을 위한 보조물질 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
구제역(foot-and-mouth disease, FMD)은 주로 cloven hoofed livestock에 영향을 미치는 매우 전염성이 강한 바이러스성 질환으로 빠른 전파력, 높은 치사율 및 생산성 저하로 인해 가축 산업에 있어 심각한 경제적 손실을 가져온다. 감수성이 있는 종(species)은 소, 돼지, 물소, 낙타, 양, 염소 등의 ruminants(가축 반추동물)를 비롯하여 약 70여 종 이상의 야생 생물 종으로 구성된다. 이 질환은 고열을 동반하며, 입과 혀, 주둥이, 코, 젖꼭지, 발굽 및 기타 피부의 털이 없는 부분에서 수포 생성을 유발하는 것으로 알려져 있다.
백신 접종은 구제역 발생국가에서 질환을 통제하기 위한 수단으로 이용되며, 구제역 청정 국가에서 긴급 사태에 대비한 정책(contingency plan)을 수립하는데 있어 중요한 비중을 차지한다. 구제역 백신은 전 세계적으로 사독(불활화) 백신을 사용하고 있으며, 대부분 오일 아쥬반트 (Double Oil Emulsion, DOE 또는 Single Oil Emulsion, SOE)를 이용한 백신을 접종함으로써 효과적 측면에서 개선되었으나, 아직도 방어 수준의 항체 유도 기간이 늦음, 낮은 항체가, 항체의 짧은 지속성 및 돼지에서의 낮은 면역원성 등이 단점으로 지적되고 있다.
현재까지의 구제역 백신은 세포성 면역반응 보다는 체액성 면역반응 유도에 중점을 두고 있으나 그 방어능이 완벽하지 않다. 구제역 백신에 의한 체액성 면역반응(주요한 중화항체인 IgG) 유도 기간은 4~7일이 소요되는 반면, 세포성 면역반응은 수시간~3일 이내에 유도되므로 세포성 면역반응의 유도는 구제역 감염 초기 단계에서 host 방어에 있어 보다 더 효과적일 것으로 보인다. 또한 현재의 구제역 백신은 접종 후 항체 유지기간이 짧아 4~6개월 간격으로 정기적인 백신 접종이 요구되고, 특히, 돼지에 근육 접종 시 접종 부위에 섬유증(fibrosis), 육아종(granuloma) 등의 접종된 근육에 병변이 형성되는 등의 국소 부작용 및 안전성이 낮다는 단점이 있다. 한편, 지금까지 구제역 백신 관련 연구는 축종 별로 돼지 보다는 소에서의 백신 효능 평가 연구가 많이 이루어져 왔으나, 백신 접종에 의한 면역원성은 소에 비해 돼지에서 낮게 나타나는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 이러한 현재 상용백신의 한계를 극복하기 위한 이상적 백신 디자인(ideal vaccine design)은 세포성·체액성 면역반응의 동시 유도, 메모리 반응 유도에 의한 고역가 항체 유지, 국소 부작용을 줄이기 위한 안전성 확보, 축종 별로 최적화된 새로운 전략의 아쥬반트 개발 등과 같은 요건을 만족해야 한다.
국외에서는 일반적으로 구제역 상용화된 백신에서 아쥬반트로서 대부분 Marcoll 52, ISA 206, ISA 50을 사용하고 있다. 구제역의 효과적인 방어를 위한 아쥬반트 관련 연구로, R848, Poly(I:C), MDP, MPL, β-glucan 등의 pattern recognition receptors (PRRs) ligand, rapeseed oil과 ginseng root saponin 등의 면역증강제, 일반 시판 아쥬반트 (ISA 201, ISA 206, Emulsigen-D, Carbigen 등)를 이용하여 돼지 및 염소에서 구제역 백신 효능 평가 등 다양한 연구가 시도되고 있지만, 아직 완벽한 면역을 유도하지 못한 상태이다.
구제역 백신 외에 인체용 백신을 중심으로 세포성·체액성 면역반응을 유도하여 면역원성을 증대시키기 위한 노력으로, 1) 오일 emulsion, 계면활성제, liposome, virosome, ISCOMs 등의 백신 전달 시스템 (vaccine delivery systems), 2) Saponin, Alumium hydroxide, Potassium Phosphate 등의 면역 증강제, 3) Toll-like receptors (TLRs), RIG-I-like receptors (RLRs), nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors (NLRs) 및 C-type lectin receptors (CLRs) ligand와 같은 리셉터-특이적인 면역활성제, 4) IL-1, IL-2, IL-6, IL-18, TNFα, IFNα, IFNγ, GM-CSF와 같은 다양한 cytokine 등이 아쥬반트로 연구되어 활용되고 있다. 이들 중 일부는 현재 암, 결핵, B형 간염, 말라리아, 인플루엔자, HIV 및 HSV와 같은 다양한 인체 질환의 예방 및 치료용 백신 아쥬반트로 사용 중, 또는 임상 시험 중에 있으나, 구제역 백신 조성물로는 활용되지 않고 있다. 또한 다양한 아쥬반트는 서로 다른 작용 방식(mode of action)을 가지고 있으므로, 강력한 세포성·체액성 면역반응을 유도할 수 있는 새로운 전략의 FMD 백신 개발을 위해 아쥬반트의 면역학적 기전을 이해하는 것은 매우 중요하다.
따라서, 본 발명에서는 마우스에서 다양한 PRRs ligand 및 사이토카인의 아쥬반트로써의 효능, 세포성·체액성 면역반응 유도를 통한 메모리 면역반응의 유도, 축종별 (소 및 돼지와 같은 우제류)로 최적화된 아쥬반트 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물의 개발을 통해 새로운 전략의 FMD 백신 개발 가능성을 제시하고자 하였다.
한편 이와 관련된 선행기술로는 공개특허공보 제10-2017-0097116호 구제역 백신, 공개특허공보 제10-2018-0024030호 유성 아쥬반트 등이 있으나 구제역 백신에 사용될 수 있는 면역증강용 보조물질 또는 아쥬반트 및 이를 포함하는 백신 조성물로써의 효과는 구체적으로 기재되어 있지 않다.
{선행기술문헌}
{특허문헌}
(특허문헌 1) 공개특허공보 제10-2017-0097116호
(특허문헌 2) 공개특허공보 제10-2018-0024030호
상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명은 구제역 예방 및 치료를 위해 마우스를 비롯하여 소, 돼지 등 우제류에서 방어 항체유도와 안전하고 최적화된 아쥬반트 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 패턴인식수용체 리간드(PRRs 리간드)를 유효성분으로 포함하는 아쥬반트 조성물을 제공한다.
또한, 상기 조성물을 포함하는 구제역 백신 조성물을 제공한다.
상기 아쥬반트 조성물은 사이토카인을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 패턴인식수용체 리간드와 함께 포함할 수 있다.
본 발명에서의 우제류는 소, 돼지, 양, 염소, 순록, 물소, 낙타 등 발굽이 둘로 갈라진 동물군을 통칭하며, 바람직하게는 소, 돼지일 수 있다.
본 발명에서의 구제역 바이러스 항원은 구제역 바이러스 O 혈청형, 구제역 바이러스 A 혈청형, 구제역 바이러스 아시아1 혈청형, 구제역 바이러스 C 혈청형, 구제역 바이러스 SAT1 혈청형, 구제역 바이러스 SAT2 혈청형 및/또는 구제역 바이러스 SAT3 혈청형 등일 수 있다.
사이토카인(Cytokine)은 세포에서 분비되어 세포 간 신호 전달, 세포의 행동 조절, 면역반응 조절 등에 관여하는 생물활성인자의 총칭하는 것으로 인터류킨, 림포카인, 인터페론, 세포증식과 분화인자 등의 저분자 단백질을 지칭한다.
본 발명에서의 사이토카인은 IL-1 베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-12/23p40, IL-15/15R, IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23 (IL-12p40/IL-23p19), IL-33, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마 등 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 사이토카인은 통상적으로 사용할 수 있는 것을 의미하며, E. Coli, Baculovirus, HEK 293 cell 등에서 발현시킨 재조합 사이토카인을 포함한다.
본 발명의 PRRs(Pattern recognition receptors; 패턴인식수용체) 리간드에서 패턴인식수용체는 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 기생충들을 구별하는 보존된 분자 패턴들을 인식하는 역할을 하며, 상기 리간드는 수용체의 작용제, 즉 수용체에 결합하고, 수용체를 활성화시키는 물질을 의미한다.
상기 PRRs 리간드는 R848 (TLR-7/8 agonist), TDB (Mincle agonist), Curdlan (Dectin-1 agonist), Furfurman (Dectin-2 agonist), MDP (NOD-2 ligand), MPLA-SM (TLR-4), Zymosan (Dectin-2/TLR-2), Chitosan (NLRP inflammasome inducer, MR), Poly(I:C) (TLR-3), Poly(dA:dT) (RIG-1/CDS agonist, AIM-2 inflammasome inducer), STING계 리간드 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 STING계 리간드는 STING 신호전달을 활성화시킬 수 있는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드 단편, 화합물 등 일수 있으며, 바람직하게는 c-di-GMP(cyclic diguanylate), cGAMP, 3'3'-cGAMP, c-di-GAMP, c-di-AMP, 2'3'-cGAMP, 10-(카복시메틸)9(10H)아크리돈(CMA)(10-(carboxymethyl)9(10H)acridone(CMA)), 5,6-디메틸크산테논-4-아세트산(5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acidㅡDMXAA), 메톡시본(methoxyvone), 6,4'-디메톡시플라본(6,4'-dimethoxyflavone), 4'-메톡시플라본(4'-methoxyflavone), 3',6'-디하이드록시플라본(3',6'-dihydroxyflavone), 7,2'-디하이드록시플라본(7,2'-dihydroxyflavone), 다이드제인(daidzein), 포르모노네틴(formononetin), 레투신 7-메틸에터(retusin 7-methyl ether) 및 크산톤(xanthone) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 Poly (I:C)는 폴리이노신산:폴리시티딜산의 자연발생 폴리머뿐만 아니라, 이들의 합성 형태들을 의미한다.
본 발명의 조성물은 상기 PRRs 에서 임의로 선택되는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
상기 PRRs 리간드 중 두 개의 성분이 포함될 경우, 어느 하나의 PRRs 리간드 : 나머지 PRRs 리간드는 1 : 1 내지 3의 중량비로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 : 1 내지 2 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 투여량은 상기 PRRs 리간드 또는 사이토카인은 제한되지는 않으나 바람직하게는 1~100μg/ml 포함될 수 있다.
상기 PRRs 리간드가 둘 이상 포함될 경우, 각 리간드는 단독으로 포함되는 용량 대비 1/2이하의 범위에서 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1~30μg/ml, 바람직하게는 5~15μg/ml, 더욱 바람직하게는 7~10μg/ml 포함될 수 있다.
상기 범위는 in vivo에서 독성이 없는 범위 내이므로, 상기 범위를 벗어날 경우, 동물에 투여할 경우 체내에서 독성이 발생할 위험이 있다.
상기 성분 이외에 당업계에서 널리 알려진 오일(또는 오일 에멀젼) 및 유화제, 겔 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 오일(또는 오일 에멀젼)은 ISA 201, ISA 61, ISA 50, ISA 206 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 유화제는 유화제로 일반적으로 인정되는 물질들, 예를 들면 TWEEN® 또는 SPAN® 생성물 라인의 다른 생성물(각각 폴리에톡시화 소르비톨의 지방산 에스테르, 및 지방산-치환된 소르비탄 계면활성제) 및 PEG-40 피마자유 또는 다른 페길화(PEGylated) 수소화 오일과 같은 다른 용해도 개선제들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 구제역을 포함하는 피코나 바이러스의 예방 및 치료를 위해 소, 돼지 등의 우제류의 방어 항체유도와 안전하고 최적화된 아쥬반트 조성물 및 이를 포함하는 백신조성물을 제공할 수 있다. 또한, 구제역 발생 시 본 발명을 이용하여 현장에서 긴급백신으로서 효과적인 대처를 할 수 있으며, 우제류 동물에 상시백신으로서 효과적이고 안정화된 백신을 제공할 수 있다.
도 1은 혈청형별 항원에 따른 생체 내 초기 세포성 면역반응 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 혈청형별 항원에 따른 DCs의 선천성 면역 및 세포성 면역 반응 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 혈청형별 항원에 따른 MΦs의 선천성 면역 및 세포성 면역 반응 유도 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 마우스에서 구제역 바이러스(O TWN 97-R) 항원에 의해 유발된 사이토카인 발현 프로파일 및 생체 내 시간 동역학 연구를 위한 전략을 도시한 것이다.
도 4는 마우스에서 구제역 바이러스(O TWN 97-R) 항원으로 유도된 사이토카인 발현 프로파일 및 생체 내 시간 동역학 결과를 나타낸 것이다(Time point; 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h).
도 5는 마우스 복막 삼출 세포(PEC) 및 비장세포로부터 분리한 DCs, MΦs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포에서 구제역 바이러스(O TWN 97-R) 항원으로 매개된 사이토카인 발현의 in vitro 특성 규명을 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 마우스 복막 삼출 세포(PEC) 및 비장세포로부터 분리한 DCs, MΦs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포에서 구제역 바이러스(O TWN 97-R) 항원으로 매개된 사이토카인의 시간에 따른 발현 결과를 나타낸 것이다 (Time point; 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h).
도 7은 마우스 복막 분비세포(PEC) 및 비장세포로부터 분리한 DCs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포의 공동 배양 시 구제역 바이러스(O TWN 97-R) 항원으로 매개된 사이토카인 발현의 in vitro 특성 규명을 위한 전략을 나타낸 것으로, (A) in vitro 연구를 위한 전략 (B) 공동 배양 세포에 대한 도식 다이어그램이다.
도 8은 마우스에서 공동 배양된 세포, DCs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포에서 항원으로 매개된 사이토카인 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 FMDV 감염의 초기 단계에서 항원 O TWN 97-R 매개 생체 방어 효과 확인을 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 10은 FMDV 감염의 초기 단계에서 항원 O TWN 97-R 매개 생체 방어효과(마우스 생존율, 체중 변화)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 세포 고갈, 사이토카인 중화 및 항원 매개 생체 방어 효과를 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 12a 및 12b는 FMDV 감염에 대한 숙주 보호에 대한 DCs, MΦs 고갈 및 사이토카인 중화 시 항원에 의한 생체 방어 효과(생존율, 체중 감소)를 나타낸 것이다.
도 13은 O TWN 97-R 항원과 자극제(R848, Chitosan, Zymosan, ODN 2395, TDB, Furfuman 및 c-di-GMP)로 처리한 DCs에서 항원 매개 자극 분자(co-stimulatory molecule)인 CD40, CD80, CD86의 발현 및 세포 확산 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 DCs와 MΦs에서 Dectin-1과 Mincle의 동시 활성화를 통한 IL-23의 활성을 나타낸 것이다.
도 15는 PRRs 리간드, 사이토카인의 단독 또는 병용 투여 시, 백신 아쥬반트로서의 가능성 및 FMDV 감염에 대한 단기 면역 기억 효과를 평가하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 16은 FMDV 감염에 대한 숙주 보호에 대한 보조제로서의 PRRs 리간드 및 사이토카인의 단독 또는 병용 투여 시, 단기 면역 기억 효과 및 생체 방어효과(생존율, 체중 변화)를 나타낸 것이다.
도 17은 FMDV 감염 (장기 면역)에 대한 마우스에서의 사이토카인, HSP70 단백질 및 PRRs 리간드 매개의 장기간 기억 반응 및 그 보호 효과를 평가하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 18a 내지 18d는 사이토카인, HSP70 단백질과 PRRs 리간드에 의해 매개된 장기면역 기억 반응 및 마우스에서의 FMDV 감염에 대한 보호 효과 결과를 나타낸 것이다.
도 19a 내지 도 19g는 마우스에서 사이토카인, HSP70 단백질과 PRRs 리간드 매개 면역 세포 확장 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 다양한 FMDV 혈청형(O형, A형, Asia1형) 감염에 대한 IFNα 및 IL-23 매개 보호 효과를 확인하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 21은 IFNα 및 IL-23 매개 된 기억 반응 및 다양한 FMDV 혈청형(O형, A형, Asia1형) 감염에 대한 광범위한 보호 효과 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 PRRs 리간드 처리된 소의 PBMCs에서 LDH 방출(세포독성, 96시간 후)을 나타낸 것이다.
도 23은 소의 PBMCs에서 PRRs 리간드로 매개된 세포 증식 결과(96시간 후)를 나타낸 것이다.
도 24는 소에서의 PRRs 리간드 매개 아쥬반트 효과 및 기억 반응을 평가하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 25는 소에서의 PRRs 리간드 매개 아쥬반트 효과 및 기억 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 PRRs 리간드 처리된 돼지 PBMCs에서 LDH 방출(세포독성, 96시간 후) 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 돼지의 PBMCs에서 PRRs 리간드 매개 세포 증식(96시간 후) 결과를 나타낸 것이다.
도 28는 돼지에서 PRRs 리간드 매개의 아쥬반트 효과와 기억 반응을 평가하기 위한 전략을 나타낸 것이다.
도 29는 돼지에서 PRRs 리간드 매개의 아쥬반트 효과 및 기억 반응 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예, 실험예 등에 공통적으로 사용된 실험재료는 하기와 같다;
<항원>
항원은 다음과 같은 방법에 따라 정제 및 불활성화 시킨 것을 사용하였다;
FMDV O TWN 97-R (P1에 대한 GenBank AY593823) 및 BHK-21 세포로부터 제조하였다. 바이러스 감염을 위해 배양 배지를 혈청이 없는 Dulbecco Modified Eagle 배지(DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA)로 교체하고 37℃의 5% CO2 기체상에서 1시간 동안 배양하여 바이러스를 접종하였다. 세포 외 바이러스는 제거되었다. 감염 24시간 후, 진탕배양기에서 0.003N 바이너리 에틸렌이민(binary ethylenimine)으로 24시간 동안 2회 처리하여 바이러스를 불활성화 시키고 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6000(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 농축시켰다. 바이러스 농축액을 15-45% 슈크로스 밀도 구배에 층을 쌓고 원심 분리하였다. 초원심 분리 후, 원심 분리 관의 바닥을 뚫고, 1mL 분획물을 수집하였다. 각 분획물 샘플에서 FMDV 입자의 존재는 측면 유동 장치(BioSign FMDV Ag, Princeton BioMeditech, Princeton, NJ, USA)를 사용하여 광학 밀도에 의해 확인하였다. 실험에 사용하기 전에 pre-PEG 처리 상등액을 ZZ-R 및 BHK-21 세포에 적어도 2회 통과시켜 세포 변성 효과(CPE)가 발생하지 않았는지 확인하여 상층액에 살아있는 바이러스가 없음을 확인하였다.
<패턴인식 수용체 리간드(PRRs ligands) 및 사이토카인(Cytokine)>
PRRs 리간드는 Invivogen(SanDiego, CA, USA), 사이토카인은 MitenyiBiotec (MiltenyiBiotec, BergischGladbach, Germany)의 제품을 사용하였다. Oil emulsion인 ISA 206은 Seppic사(Seppic Inc., Paris, France), aluminium hydroxide gel (Alhydrogel®) 및 Quil-A는 Invivogen에서 구매하여 사용하였다.
<쥐>
연령과 성별이 일치하는 야생형 C57BL/6 마우스(7 주령의 암컷)를 구입하였다(KOSA BIO Inc, 경기도, 한국). 모든 쥐는 농림축산검역본부의 생물 안전성 수준 3(ABSL3)의 특정 무균 병원균(SPF) 동물 시설에 있는 마이크로 격리 케이지에 수용되었다.
<예비실험예> 구제역 항원의 숙주 면역학적 기전 확인시험
1. 혈청형별 항원에 따른 내재 면역 반응 유도 확인
1-1. 8종의 항원이 in vivo상에서 내재 면역 반응을 유도하는지 확인하기 위해 각각의 항원 2μg을 쥐의 복강내로 주입하고, 복강 내를 2 mL의 냉각된 PBS로 세척하여 수집한 복강 세척액을 원심 분리하여 상등액에서의 사이토카인 발현 양상 및 시간 동역학을 분석하였다.
각 혈청형별 항원에 의한 사이토카인 발현 양상 및 일시적 변화를 살펴본 결과, 대부분의 항원에 의해 전-항염증 사이토카인인 IL-23 및 항염증 사이토카인인 IL-10의 발현이 경쟁적으로 ‘cytokine storm'을 유발할 정도로 높게 나타났는데, SAT1-BOT-R, SAT2-ZIM-R, SAT3-ZIM-R을 주입한 그룹에서는 48h 이후부터 72, 96h에 이들 두 사이토카인의 발현이 비슷하게 관찰된 반면, O PA-2-R, O TWN 97-R, A22-R, C3-Resende-R및 Asia1-MOG-R그룹에서는 IL-23의 발현이 IL-10에 비해 현저히 높았다. IL-23의 발현에 있어 특징적인 사항은 혈청형 O형인 O PA-2-R, O TWN 97-R에서 비슷한 양상의 발현 패턴, 즉, 6~12h까지 급격하게 발현이 증가되었다가 24h에는 약간 낮은 수준을 보이지만, 48~72h에 re-boosting 되어 12h 수준에 근접한 뒤, 96h에 유의적으로 감소되었다(도 1).
1-2. 혈청형별 FMDV 항원에 의한 DCs 및 MΦs에서의 선천성, 세포성 면역 반응을 탐색하기 위해 naive mice로부터 DCs와 MΦs를 분리하여, 각각의 항원을 처리, 0, 12, 24, 48, 72, 96h 후에 세포 배양 상층액에서 IL-1α, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-12/23p40, IL-23 및 TNFα와 같은 염증성 사이토카인, 항염증 사이토카인 발현 양상 및 이들 사이토카인 발현의 시간 동역학을 분석하였다. 그 결과, DCs에서의 발현은 다음과 같다.
혈청형별 IL-23 및 IL-10의 발현은 SAT1-BOT-R, SAT2-ZIM-R, SAT3-ZIM-R, C3-Resende-R 및 Asia1-MOG-R 처리구에 있어 사이토카인의 발현량이 거의 비슷한 수준을 보인 반면, A22-R, O PA-2-R 및 O TWN 97-R의 경우, IL-23의 발현량이 IL-10의 발현량에 비해 현저히 높게 나타났다. 또한 IL-6의 발현량도 최대치가 593~753pg/mL 수준으로 높았고, 나머지 사이토카인의 경우에는 50~200pg/mL정도의 발현량을 보였는데 대부분의 항원 처리구에서 12h에 IL-23, IL-10 및 IL-6의 발현량이 서로 crossover 되면서 초기에 증가하던 IL-6의 발현이 항염증 사이토카인인 IL-10에 의해 하향 조절되는 경향을 나타낸 반면, IL-23는 지속적으로 상향 조절되는 경향을 보였다(도 2a).
MΦs에서의 전체적인 사이토카인 발현은 도 2a에 나타낸 바와 같이 DCs에서와 유사하였으며, 혈청형별 사이토카인의 발현 변화는 Asia1-MOG-R을 제외한 대부분의 항원 처리구에서 IL-23의 발현량이 IL-10에 비해 48h 이후 현저히 높게 나타났으며, SAT1-BOT-R, SAT2-ZIM-R, SAT3-ZIM-R, C3-Resende-R 처리구에서는 12h까지 IL-10> IL-6> IL-23의 순으로 발현량이 높았으나, 12~48h까지 crossover 된 후, 48h 이후부터는 IL-23> IL-10> IL-6의 순으로 변화되었다. 반면, A22-R, O PA-2-R 및 O TWN 97-R에서는 12h까지 IL-6> IL-23, IL-10의 순으로 사이토카인 발현량이 높았고, 12~24h에 이들 사이토카인의 발현량이 crossover 된 이후, 24h 이후부터 IL-23> IL-6, IL-10의 순으로 발현 패턴이 변화하였다(도 2b).
이상의 결과로부터, 혈청형별 항원 처리시, 초기에 DCs와 MΦs를 효과적으로 자극 시킨다는 사실을 확인할 수 있었으며, 자극된 이들 세포로부터 염증성 사이토카인인 IL-23 및 IL-6, 항염증 사이토카인인 IL-10이 주요하게 발현됨을 알 수 있었다.
2. In vivo에서 항원 매개 사이토카인의 변화 측정
시험 방법은 도 3과 같으며, 사이토카인의 변화를 측정하여 면역세포의 자극을 확인하고자 하였다.
실험결과, 초기에 반응하는 것은 IL-1β (IL-1 beta)와 IL-6이었으며, 시간이 지나면서 대부분 자극되었다. 12∼24h 사이에 자극이 되는 것은 IL-12/23p40, IL-17A, TNFα(TNF alpha)이며, IL-1β (IL-1 beta), IL-2, IL-10, IL15/15R, IL-33의 경우 72h까지 자극이 완료되며, IL-4, IL-9, IL-12p70, IL-21, IL-22, IFNγ(IFN gamma)는 96h까지 반응이 상승하였다. 각 세포에서의 자극되는 사이토카인이 다르기 때문에 어느 세포가 작동하는지 추정이 가능함을 확인하였다(도 4).
3. 마우스 복막 삼출 세포(PEC) 및 비장세포로부터 분리한 면역 세포에서 항원 매개 in vitro 사이토카인의 변화 측정
시험 방법은 도 5와 같으며, 마우스 복막 삼출 세포(PEC) 및 비장세포로부터 각각의 면역 세포(DCs, MΦs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포)를 분리하여 사이토카인의 발현 변화를 측정함으로써 특정 면역세포의 자극을 확인하고자 하였다. 구체적으로 항원으로 O TWN 97-R (2μg)를 처리하였고, PEC와 비장에서 세포(DCs, MΦs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포)를 분류하여 시간(0, 6, 12, 24, 48, 72, 96h)에 따른 변화를 측정하였다.
실험 결과, DCs와 반응하는 사이토카인인 IL-12p70, IL12/23 total p40, IL-10, IL-5, TNFα의 반응성이 초기 6∼12h에 높은 경향성을 보였으며, 24-48h에는 IL-12/23 p40, IL-23의 발현이 증가하는 양상을 확인할 수 있었다(도 6a 내지 6c).
4. 분류된 세포에서의 동시 배양을 통한 O TWN 97-R 항원 매개 사이토카인의 in vitro 변화 측정
시험 방법은 예비실험예 2와 같이 세포 분류하였으며, 각 면역 세포(DCs, MΦs, iNK T 세포, γδ T 세포 및 T 세포)를 분리하여 혼합한 후, O TWN 97-R 항원 매개 사이토카인의 변화를 측정하여 면역세포의 자극을 확인하고자 했다(도 7). 구체적으로 항원 O TWN 97-R (2μg)를 처리하였고, 항원자극 48시간 후에 결과를 측정하였다.
실험결과 DCs가 들어가야 반응성을 보이는 것은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-12/23 p40, IL-15/15R, IL-21, IL-23, IFNγ 등이며, DCs가 없어도 반응성이 보이는 것은 IL-β, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IL-22, IL-33, TNFα 등으로 확인되었다(도 8).
5. 선천면역반응을 통한 항원자극의 방어기전 분석
5-1. 선천성 면역반응 및 세포성 면역반응을 활성화시키는 O TWN 97-R 항원이 실제로 FMD 바이러스 감염 시에 방어효과를 나타내는지 확인하기 위한 연구 전략은 도 9와 같다. 먼저 항원의 vaccination period를 결정하기 위해, 항원 2μg을 마우스 복강 내로 주입, 1, 3, 5, 7dpi에 바이러스를 감염시켰고, 7dpc까지 생존율 및 체중 변화를 모니터링 하였다. 이후, 항원의 용량별 반응을 확인하기 위해, 항원 2, 5, 10μg을 동일 루트로 주입하여, 5dpi에 바이러스를 감염, 7dpc까지 생존율 및 체중 변화를 모니터링하였다.
그 결과, 5dpi 그룹에서 40%의 방어율을 보였고, 용량을 5, 10μg 으로 증가시킨 그룹에서 100%의 생존율을 보였으며, 체중 감소도 관찰되지 않았다(도 10).
5-2. 구제역 감염으로부터 host를 방어하는데 있어, DCs, MΦs 중 어떤 세포가 중요한지, 또는 어떤 사이토카인이 중요한 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다(도 11).
항체를 이용하여 세포를 고갈시키거나 사이토카인을 중화하고 24h 뒤 항원을 주입하였고, 5일 후(5dpi) 바이러스를 감염시켜 방어능을 확인하였다. 그 결과, IL-23p19, TNFα, IL-10이 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 염증성 사이토카인인 IL-23p19에 대한 항체를 투여한 그룹에서 5일 째(5dpc) 모든 마우스가 폐사, TNFα 항체 투여 그룹에서 6일 째(6dpc) 모든 마우스가 폐사된 반면, 항염증성 사이토카인인 IL-10에 대한 항체를 투여한 그룹에서는 100% 생존율을 보였고 체중 감소 또한 관찰되지 않았다. 특이 항체에 의한 항원 유도 사이토카인 중화 실험에서 FMDV 공격으로부터 host를 방어하는데 있어 중요한 것으로 확인된 IL-23, TNFα, IL-1β, IL-6 및 IL-10에 대해 이들 사이토카인 각각에 의한 방어효과를 확인하였다. 먼저, 각 사이토카인을 5μg/100μL PBS를 마우스 복강 내로 주입, 6h 후 O VET (ME-SA)를 감염시켜 7dpc까지 생존율 및 체중 변화를 모니터링 하였고, 음성 대조군 그룹은 100μl의 PBS를 동일한 루트로 투여하여 비교하였다. 그 결과, IL-23를 주입한 후, FMDV를 감염시킨 그룹에서 마우스 생존율이 100%로 완벽하게 방어되는 것을 확인하였고, 체중 변화에 있어서도 감염 전과 비교하여 변화가 관찰되지 않았다.
IL-1α, TNFα 처리 그룹의 경우 생존율이 낮게 나타났고, 체중 변화의 경우에 있어서도 약 30% 감소하였으나 폐사가 지연되는 경향을 보였다. 반면, IL-6 및 IL-10 처리 그룹에서는 감염 초기에 마우스 폐사가 일어나, 방어효과가 전혀 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터 FMDV 공격에 대한 host의 방어에 있어 사이토카인 중 IL-23가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 사료되었으며, IL-1α 및 TNFα 또한 IL-23에 비해 약하지만, virus 감염 초기에 host를 방어하는데 있어 부분적으로 기여할 수 있을 것으로 판단되었다.
한편, 항염증 사이토카인인 IL-10의 경우, IL-10 단독 주입 외에, IL-10과 항원을 5μg씩 동시 주입하여 생존율 및 체중 변화를 비교하였다.
항원에 의해 높은 수준으로 발현되는 IL-23, IL-1α, IL-6 및 TNFα를 억제하기 위해 특이적 마우스 단일 클론 항체로 중화시키고, IL-10 및 항원을 동시 주입한 뒤 24h 째 바이러스를 감염시켰다. 각각의 항체에 대한 isotype 대조 항체를 주입하여 대조군 그룹으로 비교하였다. 그 결과, IL-10 처리 그룹과 마찬가지로 FMDV 감염 후 4일 째(4dpc), 생존율이 20%까지 감소하여 6일 째(6dpc) 모든 동물이 폐사하였고 체중 변화 또한 약 30%까지 감소한 것으로 나타나 IL-10은 FMDV 감염 초기 host 내 면역반응을 저해함으로써 바이러스에 대한 감수성을 증가시켜 host 방어능을 악화시키는 것으로 보였다.
이상의 결과로부터 FMDV 감염 초기에 염증성 사이토카인인 IL-23의 발현을 증가시키는 한편, 항염증 사이토카인인 IL-10의 생산을 억제할 수 있다면, 체내 세포 면역 반응을 활성화시킴으로써 보다 더 효율적으로 host를 방어할 수 있을 것으로 사료된다.
또한 IL-23가 아쥬반트(백신보조제)로써 면역 자극 활성을 나타내는지 확인하기 위해, 2.5μg의 IL-23를 동량의 항원과 병용 투여하였다.
그 결과, 2.5μg의 항원을 단독 투여한 그룹의 마우스는 40%의 생존율을 보인 반면, IL-23와 항원을 병용 투여한 그룹에서 80% 이상의 생존율을 보였으며 체중 감소 또한 2∼3일째(2dpc) 미미하게 감소되었다가 이후 다시 회복되는 경향을 나타내어 IL-23의 아쥬반트 효과에 의해 FMDV 감염에 대한 방어효과가 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 항원에 의해 자극된 DCs 및 MΦs가 실제로 FMDV 감염 초기에 host 방어에 있어 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해, 항원 투여 후 6시간 째, 활성된 DCs 및 MΦs를 분리하여 naive 마우스에 이식, 1시간 후 바이러스를 감염시켜 7 dpc까지 생존율 및 체중 변화를 관찰하였다.
그 결과, 활성된 DCs 및 MΦs 이식 그룹에서 모든 마우스들이 100% 생존하는 것을 확인하였고, 체중 변화 또한 관찰되지 않았다(도 12a 및 도 12b).
이상의 결과로부터, 항원에 의한 DCs 및 MΦs의 자극은 FMDV 감염 초기에 이들 세포로부터 염증성 사이토카인, 케모카인 및 동시 자극 분자 등의 분비를 촉진하고, T 세포에 항원을 제시함으로써 host를 방어하는데 있어 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
DCs에서 항원 매개 동시-자극 분자의 발현을 살펴본 결과는 다음과 같다(도 13). 항원 단독, 또는 항원에 PRRs 리간드를 아쥬반트로 첨가하여 세포에 처리 후, CD40, CD80, CD86의 발현을 살펴본 결과, R848, Zymosan, TDB, c-di-GMP를 첨가한 처리구에서 높은 발현을 보였다. 이로써 항원 단독으로도 DCs를 자극하여 동시-자극 분자의 발현을 증가시키지만, PRRs 리간드를 아쥬반트로써 함께 처리할 경우, 보다 더 강하게 DCs를 자극하여, T 세포에 항원을 효과적으로 제시할 수 있을 것으로 기대된다.
앞서 DCs 및 MΦs에서 O TWN 97-R Ag 유래 사이토카인의 변화를 관찰하였고, 이러한 사이토카인의 발현이 어떤 PRRs 리간드 신호를 통해 개시되는지 규명하기 위해, naive mice의 PECs으로부터 DCs와 MΦs를 분리, O TWN 97-R Ag 처리 후 6시간 째 세포를 샘플링하고 RNA를 준비하여 qRT-PCR을 통해 PRRs 리간드의 유전자 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 DCs에서는 dectin1, dectin2, tlr7, tlr8 등의 발현이 높게 나타난 반면, MΦs에서는 mincle, sting의 발현이 높았으며, tlr2 , tlr4 , nlrp3 등의 발현도 비교적 높았다. DCs와 MΦs에서의 전체 유전자 발현 수준을 살펴보았을 때, dectin1> mincle> dectin2> tlr7> sting> tlr8 등의 순으로 PRRs 리간드 유전자 발현 수준이 높게 나타났다.
이상의 결과로부터, O TWN 97-R Ag은 cell-intrinsic PRRs 리간드인 tlr7, tlr8, sting 등과 cell-extrinsic PRRs 리간드인 dectin1, dectin2, mincle 등을 동시에 자극함으로써, DCs 및 MΦs와 같은 APCs에서 선천성 면역반응 및 세포성 면역반응을 증폭시킬 수 있을 뿐만 아니라, Th1, Th2 또는 Th17 세포로의 Th 세포의 분화과정(differentiation process)을 촉진하며, 결국 T 세포의 활성화에 기여함으로써 세포성 면역반응을 유도하여 FMDV 감염 초기 host의 방어에 있어 결정적인 역할을 할 것으로 기대된다.
<실시예 1> 아쥬반트 후보물질의 마우스 면역성 평가를 통한 스크리닝
1-1. PRRs 리간드 및 사이토카인의 백신 아쥬반트로서의 가능성 및 기억 효과분석
PRRs 리간드 및 재조합 사이토카인의 백신 아쥬반트로서의 가능성 및 FMDV 감염에 대한 기억 효과를 평가하기 위해 하기 표 1의 물질을 도 15와 같이 실험을 수행하였다.
PRRs 리간드 및 마우스 사이토카인의 평가를 위한 실험 디자인
그룹 백신 조합 아쥬반트(Adjuvants) 용량
PRRs 리간드 또는 사이토카인
NC - - -
PC O TWN 97-R - -
PC+Adjuvant 11.7ng (1/1280 dose for cattle or pig use) of O TWN 97 R Ag+ ISA 206 (50%, w/w)+10%Al(OH)3+15μgQuil-A® R848 (TLR-7/8) 100μg
Curdlan (Dectin-1) 45μg
Zymosan (Dectin-2/TLR-2) 50μg
Furfurman (Dectin-2) 50μg
TDB (Mincle) 50μg
c-di-GMP (Sting) 50μg
MDP (NOD-2) 30μg
MPLA-SM (TLR-4) 20μg
Chitosan (NLRP3 inflammasome inducer, MR) 100μg
rmIL-23 5μg
rmIFNα 2.5x106IU
Poly(I:C) (TLR-3/MDA-5)+c-di-GMP (Sting) 50μg+50μg
Poly(dA:dT) (RIG-I/CDS agonist)+c-di-GMP (Sting) 25μg+50μg
R848 (TLR-7/8)+Zymosan (Dectin-2/TLR-2) 50μg+25μg
R848 (TLR-7/8)+Furfuman (Dectin-2) 50μg+25μg
R848 (TLR-7/8)+TDB (Mincle) 50μg+25μg
Zymosan (Dectin-2/TLR-2)+TDB (Mincle) 25μg+25μg
Furfuman (Dectin-2)+TDB (Mincle) 25μg+25μg
TDB (Mincle)+c-di-GMP (Sting) 25μg+25μg
MDP (NOD-2)+MPLA (TLR-4)+Curdlan (Dectin-1) 30μ+20μg+45μg
PRRs 리간드, 사이토카인의 단독 투여시, 도 16의 (A)에 나타낸 바와 같이 생존율은 IFNα> IL-23> c-di-GMP 투여군의 순으로 높았고, 도 16의 (B) BW(body weight, 체중변화)에서도 IFNα의 경우 체중변화가 거의 관찰되지 않았다. 도 16의 (C)는 PRRs 리간드의 병용 투여시 생존율을 나타낸다.
R848+TDB> TDB+c-di-GMP> Furfurman+TDB의 순으로 생존률이 높았고, 체중변화(도 16의 (D))에 있어서도 약 20% 미만의 범위에서 체중감소만 관찰되었다.
이상의 결과로부터, PRRs 리간드 단독 투여에 비해 사이토카인과 병용 투여 시, FMDV 감염으로부터 마우스를 더 효과적으로 방어하는 것으로 보여지며 특히, TLR-7/8, Mincle, Dectin-2, Sting 등의 조합이 백신 아쥬반트로서의 가능성이 높을 것으로 판단되었다.
1-2. 마우스에서 PRRs 리간드 및 사이토카인 매개 기억 면역반응
PRRs 리간드 및 재조합 사이토카인의 백신 아쥬반트로서의 가능성 및 FMDV 감염에 대한 기억 효과를 평가하기 위해 도 17과 같은 전략으로 실험을 수행하였다. 구제역 항원은 O TWN 97-R을 사용하였으며, 양성대조군(positive control group; PC)의 백신 조성은 다음과 같다; O TNW 97-R Ag(15μg/dose/ml, 1/160 dose), ISA 206 (50%, w/w), 10% Al(OH)3, 15 μg/mouse of Quil-A.
마우스는 0 dpv(days post vaccination)에 I.M.(intramuscular, 근육 내 접종)으로 1st 백신접종 후, 28일 후(28days post vaccination, dpv) 2nd 백신접종(boosting)을 실시하였다. 이후 56일(56days post vaccination, dpv)째, FMDV(100LD50 of O VET 2013, ME-SA topotype)를 마우스 복강으로 투여하여, 7일 후까지(days post challenge, dpc)까지 생존율과 체중변화를 모니터링 하였다. 또한 세포성·체액성 면역반응 유도능을 확인하기 위해 0, 28, 56dpv에 마우스 혈청 및 복막 삼출 세포(peritoneal exudate cells, PECs)를 샘플링하여, SP ELISA 및 virus neutralization titer (VN titers, 중화항체가) 등의 분석에 사용하였다.
실험결과, 도 18a에 나타낸 것과 같이 28dpv에서는 IFNα, IFNγ+IL-2+TNFα, IL-15+IL-18, TDB+c-di-GMP, R848+c-di-GMP를 투여한 군에서 대조군에 비해 항체가가 유의하게 증가하였고, 56dpv에서는 모든 사이토카인 및 PRRs 리간드 아쥬반트 투여군에서 항체가가 현저히 높게 나타났다. 특히, IFNα의 경우, 56dpv까지 높은 수준의 항체가를 유지하였다. 앞선 실험들에서 세포성 면역반응을 탁월하게 증가시켰던 IL-23 투여군의 경우에도 항체가가 높게 관찰되어 체액성 면역반응도 효과적으로 유도하는 것으로 보였다.
한편, T 세포의 활성 및 T 세포 매개 세포성·체액성 면역반응에 관여하는 IFNγ+IL-2+TNFα 투여군의 경우에도 28dpv 이후 꾸준히 높은 항체가를 유지하였고, 점막면역에 관여하는 IL-15+IL-18를 아쥬반트로 투여한 군에서도 높은 항체가를 보였다. 장기 면역에 관여하는 것으로 알려진 HSP70을 투여하였을 때, 다른 아쥬반트 투여군에 비해서는 다소 낮으나, 비교적 항체가가 높은 수준으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, PRRs 리간드 투여군의 경우, 모든 군에서 높은 항체가를 나타내었다.
백신접종 자체에 의한 체중변화를 관찰하기 위해, 백신접종 후, 8주(56dpv)간 매주 1회씩 체중변화를 모니터링한 결과(도 18b), IFNγ+IL-2+TNFα의 조합을 투여한 그룹에서 7dpv에 약간의 체중 감소가 있었으나 유의적인 차이는 없었으며, 다른 그룹(총 5∼10μg)에 비해 재조합 사이토카인의 투여 용량(총 15μg)이 다소 높았기 때문인 것으로 추측된다.
백신접종 후 56일 째(56dpv)에 O VET 2013으로 감염시켜 생존율(도 18c)과 체중변화(BW) (도 18d)를 관찰한 결과, 음성대조군의 마우스가 4일째 100% 폐사하였고 양성대조군의 마우스는 40% 생존하는 경향을 보였다. 반면, PRRs 리간드 및 사이토카인 아쥬반트를 투여한 군의 마우스는 100% 생존하였으며, 체중 감소도 전혀 관찰되지 않았다.
이로써, 이들 사이토카인 및 PRRs 리간드를 아쥬반트로 활용하였을 때, 백신 유도 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응 모두를 효과적으로 유도함으로써 host의 방어에 있어 크게 기여할 것으로 기대되었다.
사이토카인 및 PRRs 리간드에 의한 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응의 유도를 관찰하기 위해 이들 면역반응에 관여하는 세포의 확장을 FACS 분석하였다. 도 19a에서는 CD3+CD4+ T 세포 수를 확인하였고, IFNα, HSP70, R848+TDB, TDB+c-di-GMP 등을 첨가한 군에서 세포의 확장이 관찰되었다. 도 19b는 CD3+CD8+ T 세포의 population을 나타낸다. CD4+ T cells에 비해 세포 수가 전반적으로 낮은 것으로 보이며, 28dpv에 IFNα 투여군에서 유의성이 관찰되었다.
도 19c에서는 CD4+CD8+ T 세포의 확장을 확인하였다. 28dpv에 HSP70을 제외한 모든 사이토카인 및 PRRs 리간드 첨가군에서 세포수가 유의적으로 증가하였다가, 56dpv에는 현저히 감소되는 경향을 나타내었다. 기억 T 세포의 marker로 알려진 CD44highCD62low T 세포의 확장을 관찰한 결과(도 19d), 28dpv에 비해 56dpv에서 population이 급격히 증가하였고, 28dpv에서는 사이토카인에 비해 PRRs 리간드가 더 유의적으로 이들 기억 T 세포의 확장을 유도하였으나, 56dpv에서는 모든 아쥬반트 첨가군에서 세포 수가 증가되어 이들 아쥬반트가 기억 T 세포를 효과적으로 유도함으로써 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응의 자극을 촉진할 것으로 기대된다.
도 19e에서는 기억 γδ T 세포인 CD44highCD27low γδ T 세포의 발현을 관찰하였다. 마우스에서는 일반적으로 약 5% 범위의 γδ T 세포가 존재하는 것으로 알려져 있으나, 아쥬반트 첨가에 의해 이들 세포 수가 약 8∼10%까지 그 발현이 증가되었고, 28, 56dpv 간의 큰 차이는 관찰되지 않아 초기 세포성 면역반응뿐만 아니라, 중기, 장기 세포성 면역반응의 유도에도 효과적인 것으로 나타났다.
도 19f는 기억 B 세포(CD3-CD44+CD27+ B cells)의 확장을 보여준다. 28dpv에 IL-23, R848+TDB, TDB+c-di-GMP에서 유의적인 세포 수 증가를 확인하였고, 56dpv에서는 전체적으로 28dpv에 비해 세포 수가 증가하였으며, 모든 사이토카인 및 PRRs 리간드 첨가군에서 기억 B 세포가 유의적으로 확장되는 것을 확인하였다. 특히, IL-23, IFNγ+IL-2+TNFα, IL-15+IL-18, R848+TDB, R848+c-di-GMP 첨가군에서 p<0.001 이하의 유의성을 나타내었다.
도 19g는 memory like NK cells로 알려진 CD3-CD335 (NKp46)+CD27+ cells의 확장을 확인한 결과를 보여준다. 특이적으로 IFNα 투여군에서 유의적으로 높은 세포 수를 나타내었으며, 이로부터 IFNα가 선천성 면역반응에 관여하는 NK 세포를 효과적으로 자극하는 것으로 보여지고 기억 반응의 유도에도 우수한 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
1-3. 사이토카인의 아쥬반트로서의 가능성과 마우스에서 다양한 혈청형별 FMDV 감염에 대한 방어효과
사이토카인, 특히 IFNα 및 IL-23의 백신 아쥬반트로서의 가능성, 기억 반응 및 다양한 혈청형별 FMDV 감염에 대한 방어효과를 관찰하기 위해 도 20과 같은 동물실험을 수행하였다.
상기 효과를 확인하기 위해 O VET(O Vet 2013), O JC(O Jincheon 2014), A Malay(A Malay97), Asia Shamir-R(Asia1 Shamir의 전체 게놈 재조합 클론), PC 그룹에는 ISA 206 오일 면역 보강제만 주입되었으며, NC는 음성대조군이다.
실험 결과, IFNα 및 IL-23를 아쥬반트로 함께 투여한 그룹에서 O VET2013, O JC, A Malay 97, Asia1 Shamir 공격에 대해 거의 완벽한 방어를 보였으며 체중변화도 바이러스 공격 전과 비교하여 거의 감소되지 않았다(도 21).
이로써 IFNα와 IL-23의 in vivo에서의 기억 기능을 확인하였고, 다양한 혈청형별 FMDV 공격에 대해 백신 내 함유된 항원-바이러스 간의 특이성에 관계없이 효과적으로 host를 방어할 수 있을 것으로 기대되었다.
<실시예 2> 축종별 아쥬반트 후보물질의 반응성 평가
상기의 마우스에서의 실험결과를 바탕으로 소, 돼지의 면역세포에서 PRRs 리간드, HSP70 및 사이토카인 매개 세포증식 및 세포독성을 관찰하기 위해 하기 표 2의 아쥬반트 조성물을 이용하여 실험을 수행하였다.
그룹 아쥬반트 용량 (μg/ml) 그룹 아쥬반트 용량 (μg/ml)
1 Con 　 13 Poly(I:C)(TLR-3)+c-di-GMP (Sting) (5μg+2μg)/ml
2 R848 (TLR-7/8) 10μg/ml 14 Poly (dA:dT) (RIG-I&CDS agonist)+ c-di-GMP (Sting) (5μg+2μg)/ml
3 Curdlan (Dectin-1) 100μg/ml 15 R848(TLR-7/8)+Zymosan (Dectin-2/TLR-2) (5μg+5μg)/ml
4 Zymosan (Dectin-2/TLR-2) 10μg/ml 16 R848(TLR-7/8)+Furfuman(Dectin-2) (5μg+5μg)/ml
5 Furfurman(Dectin-2) 10μg/ml 17 R848 (TLR-7/8)+TDB (Mincle) (5μg+5μg)/ml
6 TDB (Mincle) 10μg/ml 18 Zymosan(Dectin-2/TLR-2)+TDB(Mincle) (5μg+5μg)/ml
7 c-di-GMP (Sting) 4μg/ml 19 Furfurman(Dectin-2)+TDB (Mincle) (5μg+5μg)/ml
8 MDP (NOD-2) 10μg/ml 20 TDB(Mincle)+c-di-GMP (Sting) (5μg+2μg)/ml
9 MPLA-SM (TLR-4) 1μg/ml 21 MDP (NOD-2)+MPLA-SM (TLR-4)+Curdlan (Dectin-1)) 10μg+1μg+100μg/ml
10 Chitosan(NLRP3 inflammasome, MR) 100μg/ml 22 Oil (ISA206) 25%
11 Poly(I:C) 10μg/ml 23 Gel (Alum) 10%
12 Poly(dA:dT) 10μg/ml 24 Saponin (Quil-A) 2.5μg/ml
25 Oil(ISA206)+Gel(Alum)+Saponin (Quil-A) (25%+10%+2.5μg)/ml
PBMCs 분리
돼지와 소의 전혈은 경기도 동물위생시험소에서 기증받았다. BD Vaccutainer 헤파린 튜브(BD, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 전혈 15ml를 수집하고, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 Ficoll-PaqueTM PLUS(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA) 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 분리하였다. 잔여 적혈구는 ACK(Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer(Gibco, Carlsbad, CA, USA)로 처리하여 용해시켰다.
2% FBS(Gibco, Carlsbad, CA, USA)가 보충된 Ca2 + 및 Mg2 +(Gibco, Carlsbad, CA, USA)-free Dulbecco's PBS에 현탁하고 용적 유량계(MACSQuant Analyzer, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 사용하여 계수하였다. 모든 세포는 사용 직전에 신선하게 분리되었고 저온 보존된 세포는 사용하지 않았다.
정제된 PBMCs를 10% 소 태아 혈청 (FBS) (HyClone, Logan, Utah, USA), 3mM L-글루타민(Sigma-Aldrich, USA), 100U/ml 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 보충한 RPMI-1640(Gibco, Carlsbad, CA, USA) 미국 미주리 주 세인트 루이스)에 재현탁시켜 37℃, 5% CO2 상에서 배양한 후 96 웰 플레이트에 웰당 1x104cells을 부착시켰다. 3시간 동안 배양 후, 다양한 PRR 리간드 및 사이토카인으로 자극하기 전에 배양 배지를 무혈청 배지로 대체하였다.
PRRs 리간드 및 사이토카인 처리
표 2에 나타낸 바와 같이 돼지 및 소 PBMCs를 PRR 리간드 및 사이토카인으로 처리하였다. 96시간 후, 세포 배양 배지(상층액)를 수거하고, 락트산 탈수소 효소(LDH) 분비에 의한 세포 독성 및 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 혼입에 의한 세포 증식을 관찰하였다.
돼지와 소 PBMCs에서 PRRs 리간드와 사이토카인 매개 LDH 분비 측정
처리된 돼지 및 소 PBMCs의 상등액에서의 세포 독성 수준은 상기에서 기재된 바와 같다. LDH 분비 분석은 CytoTox 96 NonRadioactive Cytotoxicity Assay (Promega)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
LDH 분비 백분율은 다음과 같이 계산되었다 : LDH 분비의 백분율 = 100 x (처리되지 않은 대조군의 흡광도 판독 값)/(최대 LDH 방출 대조군의 흡광도-비 흡광도 대조군의 흡광도)
키트 제공 용해 버퍼를 사용하여 세포를 용해시켰고 용해 완충액 처리 세포로부터의 상등액은 최대 LDH 방출 제어를 결정하는 것이었다.
돼지와 소 PBMC에서의 BrdU 혼입 분석
BrdU 세포 증식 분석 키트(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 사용하여 DNA 합성 동안 BrdU의 혼입에 기초하여 PRRs 리간드 및 사이토카인이 돼지 및 소 PBMC의 증식에 미치는 영향을 평가하였다.
10μM BrdU를 세포 배양액에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 고정시키고 항-BrdU 마우스 모노클로날 항체와 horseradish peroxidase(HRP)-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체와 함께 배양시켰다. 발색 기질 테트라메틸 벤지딘은 색을 발달시키기 위해 사용하였다. 흡광도는 450/550nm의 이중 파장에서 측정하였다.
백신 접종 및 샘플링(vaccination and sampling)
돼지와 소에서 PRRs 리간드의 아쥬반트로서의 가능성 및 세포성·체액성 면역반응 유도, 장기면역효과를 관찰하기 위해 실험을 수행하였다. 구제역 항원은 O TWN 97-R을 사용하였으며, positive control group의 백신 조성은 다음과 같다; O TNW 97-R Ag(15μg/dose/ml), ISA 206(50%, w/w), 10% Al(OH)3, 150μg/dose/ml Quil-A.
28일 간격으로 2회(0dpv, 28dpv), 동물의 목 부위 깊은 근육 내 경로를 통해 1ml 백신을 투여하였다. 혈액 샘플을 돼지의 0, 14, 28, 42, 56, 70, 84dpv 및 소의 0, 14, 28, 56, 84, 112, 140, 168dpv에서 수집하였다.
동물들은 체온 및 식욕에 대해 매일 모니터링 하였다. 혈청 검체는 검사가 시행 될 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
혈청 검사
1) 구조 단백질 항체 검출용 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)
혈청에서 구조 단백질(structural protein, SP) 항체의 검출을 위해 PrioCHECK FMDV type O(Prionics, Switzerland)를 사용하였다. ELISA 플레이트의 흡광도는 백분율 저해 (PI) 값으로 변환되었다. PI 값이 50% 이상인 경우, 동물을 항체 양성으로 간주하였다.
2) 바이러스 중화 시험
바이러스 중화 시험은 OIE manual에 따라 수행되었다. 혈청에서 56℃, 30 분간 중탕하여 활성화시켰다. 세포 밀도를 70% 단층을 형성하도록 조절하여, 1 : 4에서 1 : 512까지의 혈청 샘플의 2 배 단계 희석액을 제조하였다. 희석된 혈청 시료를 100 조직 배양 감염 선량 (TCID) 50/0.5ml homolog virus와 함께 37℃에서 1시간 배양 하였다. 1 시간 후, LF-BK (소 신장) 세포 현탁액을 모든 웰에 첨가하였다. 2 내지 3일 후, CPE를 측정하여 역가 항체 희석물의 log10으로서 바이러스의 100TCID50을 중화시키는 역가를 결정하였다.
2-1. 소에서의 아쥬반트 후보물질의 반응성 평가결과
소 유래 PBMCs에서 각각 PRRs 리간드 및 사이토카인, Gel, Saponin 등에 의한 세포독성을 관찰하기 위해 LDH (Lactate Dehydrogenase) 분비를 확인한 결과, 처리구 자체의 세포독성은 낮은 것으로 나타나 본 실험에서 사용한 아쥬반트 농도에서 세포독성은 없는 것으로 보였다(도 22의 (A)). 도 22의(B)는 소 유래 PBMCs에 각각 PRRs 리간드 및 사이토카인을 백신 아쥬반트인 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 세포에 처리 후, 세포독성을 관찰한 결과를 나타낸다. 이때에도 아쥬반트 혼합물에 의한 세포독성은 대조구와 비교하였을 때 관찰되지 않았다.
한편, PRRs 리간드를 조합하여 병용 처리 후에도 이들 아쥬반트에 의한 세포독성은 관찰되지 않았으며(도 22의 (C)), PRRs 리간드를 조합하여 백신 아쥬반트인 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 세포에 처리 후에도 세포독성은 관찰되지 않았다(도 22의 (D)).
도 23의 (A)는 소 유래 PBMCs에 각각의 PRRs 리간드 및 사이토카인, Oil, Gel, Saponin 및 Oil+Gel+Saponin을 처리하고, 96시간 후에 BrdU incorporation에 의한 세포증식을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드 처리구에서 세포증식이 증가되었고, 특히 Curdlan, TDB, c-di-GMP, R848 및 Furfurman에 의한 효과가 큰 것으로 나타났다.
한편, Gel 및 Saponin에 의한 효과는 96h에서는 미미하였다. 또한 각각의 PRRs 리간드 및 사이토카인을 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 처리한 뒤, 세포증식을 관찰하였다. 실험결과, 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드를 Oil+Gel+Saponin과 혼합 처리구에서 세포증식이 증가되었으나, Oil+Gel+Saponin 무첨가 (W/O) 시에 비해 그 값이 낮았다(도 23의 (B)).
도 23의 (C)는 PRRs 리간드를 조합하여 세포증식을 관찰한 결과를 나타낸다. 대조구에 비해 모든 처리구에서 세포증식이 증가되었고, 특히, R848+TDB, Furfurman+TDB, TDB+c-di-GMP 처리구에서 높은 값을 나타내었다. 이로부터 이들 PRRs 리간드의 조합은 소 PBMCs를 효과적으로 자극하여, 세포증식을 증대시키고 면역반응을 자극할 것으로 보여진다. 또한 이들 아쥬반트에 의한 소 유래 PBMCs에서의 면역반응은 돼지 유래 PBMCs에 비해 유의적으로 높아 소 면역세포가 돼지 면역세포에 비해 보다 더 민감하게 반응하는 것으로 보인다.
한편, 소 유래 PBMCs에 PRRs 리간드 조합을 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 처리, 96h에 세포증식을 관찰한 결과, 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드를 Oil+Gel+Saponin과 혼합 처리구에서 그 값이 증가되었으나, Oil+Gel+Saponin 무첨가 (W/O) 시에 비해 그 값이 낮았다(도 23의 (D)). 이상의 결과로부터 돼지 면역세포에서의 결과와 마찬가지로, 소 면역세포에 PRRs 리간드를 직접 처리 시, Oil+Saponin+Gel과 함께 처리시보다 더 빨리 세포를 자극하여 증식을 촉진하고, 면역반응을 개시할 수 있을 것으로 사료된다.
소의 PBMCs를 이용한 PRRs 리간드 스크리닝 실험에서 유의한 결과를 나타낸 후보물질들에 대해, 실제 야외 필드 소에서 PRRs 리간드 매개 아쥬반트 효과 및 기억 반응을 관찰하기 위해 도 24에 나타낸 전략으로 동물실험을 수행하였다. 현장 실험을 위해, 5 개월령 소(FMD 항체 혈청 음성)를 사용하였고, 소는 3그룹으로 분류되었다(n=5/group). 백신을 접종하지 않은 동물을 음성 대조군으로 사용하였으며, 소들은 실험동안 밀폐된 공간에 격리하였다.
SP O ELISA에 의한 Ab titers(항체가)를 확인한 결과, 백신접종 후 28일 째(28dpv), PRRs 리간드 첨가군에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 항체가를 보였고, boosting 이후 140일 째(140dpv)까지 높은 수준을 유지하였다(도 25의 (A)). 또한 VN titer(중화항체가)를 확인하였을 때, PRRs 리간드 첨가군에서 14dpv 대조군에 비해 유의적으로 높은 수치를 보였고(p<0.01), 이후부터 140dpv까지도 매우 높은 수준(p<0.001)을 유지하였다(도 25의 (B)).
이상의 결과로부터, R848+TDB, Curdlan+c-di-GMP는 백신에 아쥬반트로 첨가 시, 선천성 면역반응 및 세포성 면역반응을 효과적으로 자극하여, 지속적으로 체액성 면역반응을 자극함으로써, FMDV 감염으로부터 host의 방어에 기여할 것으로 기대된다.
2-2. 돼지에서의 아쥬반트 후보물질의 반응성과 안전성 평가
돼지 유래 PBMCs에서 각각 PRRs 리간드 및 사이토카인, Oil, Gel, Saponin 및 Oil+Gel+Saponin에 의한 세포독성을 관찰하기 위해 LDH(Lactate Dehydrogenase) 분비를 확인하였다. 그 결과, 처리구 자체의 세포독성은 낮은 것으로 나타나 본 실험에서 사용한 아쥬반트 농도에서 세포독성은 없는 것으로 보였다(도 26의 (A)).
도 26의 (B)는 돼지 유래 PBMCs에 각각 PRRs ligand 및 사이토카인을 백신 아쥬반트인 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 세포에 처리 후, 세포독성을 관찰한 결과를 나타낸다. 이때에도 아쥬반트 혼합물에 의한 세포독성은 대조구와 비교하였을 때 관찰되지 않았다.
한편, 돼지 유래 PBMCs에 PRRs 리간드를 조합하여 처리 후 세포독성을 확인하였을 때에도 이들 아쥬반트에 의한 세포독성은 관찰되지 않았고(도 26의 (C)), PRRs 리간드를 조합하여 백신 아쥬반트인 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 세포에 처리 후에도 비슷한 경향을 나타내었다(도 26의 (D)).
도 27의 (A)는 돼지 유래 PBMCs에 각각의 PRRs 리간드 및 사이토카인, Oil, Gel, Saponoin 및 Oil+Gel+Saponin을 처리, 96h에 BrdU incorporation에 의한 세포증식을 관찰한 결과, 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드 처리구에서 세포증식이 증가되었고, 특히 TDB와 c-di-GMP에 의한 효과가 가장 큰 것으로 나타났다. 한편, Gel 및 Saponin에 의한 효과는 96h에서는 미미하였다.
돼지 유래 PBMCs에 각각의 PRRs 리간드 및 사이토카인을 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 처리, 96h에 세포증식을 관찰한 결과, 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드를 Oil+Gel+Saponin과 혼합 처리구에서 세포증식이 증가되었으나, Oil+Gel+Saponin 무첨가 (W/O) 시에 비해 그 값이 낮았다(도 27의 (B)). 도 27의 (C)는 PRRs 리간드를 조합하여 세포증식을 관찰한 결과를 나타낸다. 대조구에 비해 모든 처리구에서 세포증식이 증가되었고, 특히 R848+TDB, Furfurman+TDB, TDB+c-di-GMP 처리구에서 높은 값을 나타내었다. 이로부터 이들 PRRs 리간드의 조합은 돼지 PBMCs를 효과적으로 자극하여, 세포증식을 증대시키고 면역반응을 자극할 것으로 보여진다. 한편, 돼지 유래 PBMCs에 PRRs 리간드 조합을 Oil+Gel+Saponin과 혼합하여 처리, 96h에 세포증식을 관찰한 결과, 대조구에 비해 모든 PRRs 리간드를 Oil+Gel+Saponin과 혼합 처리구에서 그 값이 증가되었으나, Oil+Gel+Saponin 무첨가 (W/O) 시에 비해 그 값이 낮았다 (도 27의 (D)). 이상의 결과로부터 돼지 면역세포에 PRRs 리간드를 오일 아쥬반트(오일 에멀젼) 없이 단독 처리 시, Oil+Saponin+Gel과 함께 처리시보다 더 빨리 세포를 자극하여 확산을 촉진하고, 면역반응을 개시할 수 있을 것으로 보여진다.
돼지의 PBMCs를 이용한 PRRs 리간드 스크리닝 실험에서 유의한 결과를 나타낸 후보물질들에 대해, 실제 야외 필드 돼지에서의 PRRs 리간드 매개 아쥬반트 효과 및 기억 반응을 관찰하기 위해 다음과 같이 동물실험을 수행하였다(도 28). 현장 실험을 위해, 10 주령 돼지(FMD 항체 혈청 음성)를 사용하였으며 4그룹으로 분류하였다(n=5 /group). 백신을 접종하지 않은 동물을 음성 대조군으로 사용하였으며, 돼지들은 연구 동안 밀폐된 공간에 격리하였다.
백신접종에 의한 항체가를 확인하기 위해, 돼지 혈청을 이용하여 SP O ELISA를 진행하였다. 그 결과, 도 29의 (A)에 보여지는 바와 같이 14dpv에서 대조군에 비해 TDB+c-di-GMP 투여군에서 유의적으로 항체가가 증가되었고(p<0.001), 28dpv에서는 모든 PRRs 리간드 투여군에서 대조군에 비해 항체가가 현저히 증가되었다(p<0.001). 특히, TDB+c-di-GMP 첨가군의 경우, 84dpv까지 지속적으로 대조군에 비해 유의적으로 높은 수준의 항체가를 유지하는 것으로 나타났다. 돼지에서 1차 백신접종에 의해 항체가가 이러한 수준으로 높게 나타난 것은 PRRs 리간드들이 효과적으로 선천성 면역반응 및 세포성 면역반응을 활성화시키고 체액성 면역반응 또한 강력하게 유도한 것으로 해석된다.
또한, 28dpv에 2차 백신접종(boosting)을 할 경우, 1차 백신 접종에 의해 자극된 면역세포들의 ‘recall stimulation’을 효과적으로 유도하는 한편, 장기면역을 유지하게 하는 것으로 생각된다. 또한 VN titer를 확인하였을 때, 14dpv에 TDB+c-di-GMP (p<0.001), R848+TDB (p<0.01) 첨가군에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 중화 항체가를 나타내었고, 28dpv에는 모든 PRRs 첨가군에서 대조군에 비해 현저히 높은 중화 항체가를 보였다(p<0.001). 특히, TDB+c-di-GMP 첨가군은 84dpv까지 지속적으로 높은 중화 항체가를 유지하였고, R848+TDB 첨가군의 경우에는 초기(14dpv)부터 중기(42dpv)까지 면역증강효과가 우수한 것으로 나타났으나, 이후 다소 감소하는 경향을 나타내었다.
또한 Furfurman+TDB 첨가군의 경우에는 초기 14dpv까지는 다소 천천히 중화항체가가 증가하나, 28dpv부터 84dpv까지 대조군에 비해 현저히 높은 중화 항체가를 유지하였다.
PRRs 리간드+ 첨가군에서 14dpv부터 대조군에 비해 현저히 높은 수치를 보였고, 84dpv까지도 대조군에 비해 유의적으로 높은 수준을 유지하였다(도 29의 (B)). 이상의 결과로부터, R848+TDB, Furfurman+TDB, TDB+c-di-GMP는 백신에 아쥬반트로 첨가 시, 선천성 면역반응 및 세포성 면역반응을 효과적으로 자극하여, 지속적으로 체액성 면역반응을 자극함으로써, FMDV 감염으로부터 host의 방어에 크게 기여하는 한편, 새로운 전략의 FMDV 백신의 개발에도 활용 가능할 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 패턴인식수용체 리간드(PRRs 리간드) 또는 사이토카인을 유효성분으로 포함하는 아쥬반트 조성물.
  2. 패턴인식수용체 리간드(PRRs 리간드) 및 사이토카인을 유효성분으로 포함하는 아쥬반트 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서 패턴인식수용체 리간드는 R848 (TLR-7/8 agonist), TDB (Mincle agonist), Curdlan (Dectin-1 agonist), Furfurman (Dectin-2 agonist), MDP (NOD-2 ligand), MPLA-SM (TLR-4), Zymosan (Dectin-2/TLR-2), Chitosan (NLRP inflammasome inducer, MR), c-di-GMP, c-di-AMP, cGAMP (STING ligand), Poly(I:C) (TLR-3), Poly(dA:dT) (RIG-1/CDS agonist, AIM-2 inflammasome inducer) 중 어느 하나 이상을 포함하는 아쥬반트 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-1 베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-12/23p40, IL-15/15R, IL-17A, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33, TNF-알파, IFN-감마 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 패턴인식수용체 리간드는 1~100μg/ml 포함하는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 패턴인식수용체 리간드가 두 개 포함되고 어느 하나의 패턴인식수용체 리간드 : 나머지 패턴인식수용체 리간드는 1 : 1 내지 3의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 패턴인식수용체 리간드는 1~30μg/ml 포함되는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 사이토카인은 1~100μg/ml 포함하는 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항의 조성물은 구제역용인 것을 특징으로 하는 아쥬반트 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 백신 조성물.
PCT/KR2019/005243 2019-03-15 2019-05-02 오일 에멀젼과 병용 투여 가능한 면역증강용 보조물질 및 이를 포함하는 구제역 백신 조성물 WO2020189840A1 (ko)

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