CN100361708C - 激发机体产生fmdv抗体的融合蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白及其编码基因与应用。该融合蛋白及其编码基因可以作为预防和/或治疗口蹄疫的疫苗。融合蛋白由口蹄疫病毒的VP1蛋白、连接肽和细胞因子GM-CSF组成，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。融合蛋白的编码基因由口蹄疫病毒VP1蛋白的编码基因、连接肽的编码基因和细胞因子GM-CSF的编码基因组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。该融合蛋白稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产。本发明在动物医学领域具有重要的应用前景和实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是一种人畜共患的急性、热性和烈性的接触性传染病。该病流行于猪、牛、羊等偶蹄目动物，常给畜牧业造成巨额损失。
口蹄疫病毒(FMDV)属小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。它是迄今为止人类发现最小的动物病毒，直径约22nm，分子量8.08×106KDa。该病毒含30％RNA，70％蛋白质。单股RNA(ss-RNA)呈线状，是正链侵染型病毒(+RNA)，核酸分子量约2.6-2.8×106，碱基组成为A∶G∶U∶C＝26∶24∶22∶28。主要包含VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白。其中，VP1、VP2、VP3组成衣壳蛋白亚单位。VP4与RNA紧密结合，是病毒粒子内部成分。
VP1是口蹄疫病毒主要的功能抗原之一，颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素(IL)等细胞因子是良好的分子免疫佐剂。以往的口蹄疫基因工程疫苗多建立在一种抗原的基础上，免疫保护效果往往不理想。
发明内容
本发明的目的是提供一种激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的融合蛋白，是由口蹄疫病毒的VP1蛋白和GM-CSF、IFN-γ中至少一种细胞因子组成。所述细胞因子优选为GM-CSF。
在该融合蛋白中可以是口蹄疫病毒的VP1蛋白处于氨基端，细胞因子处于羧基端，也可以是细胞因子处于氨基端，口蹄疫病毒的VP1蛋白处于羧基端。
所述融合蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1)序列表中的SEQ ID NO：1；
2)序列表中的SEQ ID NO：2；
3)将序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体产生FMDV抗体作用的蛋白质。
序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列是由359个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-143位为细胞因子GM-CSF蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第149-359口蹄疫病毒的VP1位为的氨基酸残基序列，自氨基端第144-148位为连接肽的氨基酸残基序列，编码5个甘氨酸，将具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为GM-CSF/VP1；序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列是由382个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-166位为细胞因子IFN-γ的氨基酸残基序列，自氨基端第172-382位为口蹄疫病毒的VP1蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第167-171位为连接肽的氨基酸残基序列，编码5个甘氨酸，将具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为IFN-γ/VP1。
编码所述融合蛋白的基因，是下述DNA序列之一：
3)序列表中的SEQ ID NO：3；
4)序列表中的SEQ ID NO：4；
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列由1077个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第1077位碱基；自5’端第1到第429位碱基为编码GM-CSF的序列，编码143个氨基酸；自5’端第445到第1077位碱基为口蹄疫病毒的VP1蛋白的编码序列，编码211个氨基酸；自5’端第430到第444位碱基为连接肽的编码序列，编码5个氨基酸。
序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列由1146个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第1146位碱基；自5’端第1到第498位，碱基为细胞因子IFN-γ的编码序列，编码166个氨基酸；自5’端第514到第1146位碱基为编码口蹄疫病毒的VP1蛋白的序列，编码211个氨基酸；自5’端第499到第513位，碱基为连接肽的编码序列，编码5个氨基酸。
含有所述激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白编码基因的表达载体，转基因细胞系和工程菌也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种表达上述激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白的方法。
本发明所提供的融合蛋白的表达方法，是构建含有所述融合蛋白编码基因的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离出融合蛋白。
本发明的激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白及其编码基因可用于制备预防和/或治疗性口蹄疫疫苗。
本发明将口蹄疫病毒的蛋白VP1作为抗原与GM-CSF、IFN-γ中的至少一种细胞因子作为免疫佐剂形成的融合蛋白及其编码基因，可激发动物机体产生FMDV抗体，对FMDV具有较好的免疫保护效果，可用于FMD的预防和治疗中。该融合蛋白稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产。本发明在动物医学领域具有重要的应用前景和实际意义。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、含口蹄疫病毒的VP1蛋白和GM-CSF的融合蛋白GM-CSF/VP1的获得
一、含GM-CSF/VP1融合蛋白基因的重组质粒的构建
1、VP1与GM-CSF基因的克隆
1)VP1基因的克隆
提取FMDV的总RNA，反转录为cDNA并以其为模板，在上游引物：5’-ACCACCTCTGCGGGTGAGTCT-3’和下游引物：5’-CAGAAGCTGTTTTGCGGGT-3’的引导下，用常规PCR方法进行扩增，PCR反应条件为：先95℃ 5分钟，94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，5个循环；再94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，28个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，将633bp的VP1基因的目的片段克隆入载体pGEM-TEasy(购于北京新经科公司)中，得到含有VP1基因的克隆载体，命名为pGEM-T Easy/VP1。
2)GM-CSF基因的克隆
提取牛抗凝血的总RNA，反转录为cDNA并以其为模板，在上游引物：5’-TCCTGCCAGCCCAAACATGAG-3’和下游引物：5’-CTGGGCTTCAGACTTCAGATGTTAG-3’的引导下，用常规PCR方法进行扩增，PCR反应条件为：先95℃ 5分钟，94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，5个循环；再94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，28个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，将429bp的GM-CSF基因的目的片段克隆入载体pGEM-T Easy中，得到含有VP1基因的克隆载体，命名为pGEM-T Easy/GM-CSF。
2、含GM-CSF/VP1融合蛋白基因的重组质粒的获得
1)以步骤1构建的含VP1基因的克隆载体pGEM-T Easy/VP1为模板，在引物5’-GCAGAATTCACCACCTCTGCGGGTGAGTCT-3’和引物5’-GACCTCGAGCAGAAGCTGTTTTGCGGGT-3’的引导下，用ExTaq PCR试剂盒(购于北京新经科公司)亚克隆VP1基因；以步骤1构建的含GM-CSF基因的克隆载体pGEM-T Easy/GM-CSF为模板，在引物5’-CTAGAATTCGGTGGCGGTGGCGGTGCACCTACTCGCCCACCCAA-3’和引物5’-TTACTCGAGCTTCTGGGCTGGTTCCCAG-3’的引导下，用ExTaq PCR试剂盒亚克隆GM-CSF基因。PCR扩增条件为：先98℃ 5分钟，94℃ 1分钟，62℃ 1分钟，72℃1分钟，5个循环；再94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，28个循环；最后72℃10分钟。
2)将VP1基因用限制性内切酶BamH I与EcoR I进行酶切，将GM-CSF基因用限制性内切酶BamH I与EcoR I进行酶切，再用限制性内切酶BamH I与EcoR I对载体pGEX-6p-I(购于Phamacia公司)酶切后，将三种酶切产物用T4 DNA连接酶连接，连接反应时间为16小时。
3)将步骤2)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、提质粒，用限制性内切酶BamH I与EcoR I进行双酶切鉴定，经酶切，得到633bp和429bp酶切片段的为阳性克隆质粒，再对该阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步的鉴定，PCR所用的引物序列为5’-GCAGAATTCACCACCTCTGCGGGTGAGTCT-3’和5’-TTACTCGAGCTTCTGGGCTGGTTCCCAG-3’，可扩增出1077bp片段的为阳性克隆质粒，再对其进行测序分析，得到正确的含有GM-CSF/VP1融合蛋白基因的重组质粒，命名为pGEX-GM-CSF/VP1。
3、重组质粒的共表达
将步骤2构建的含VP1/GM-CSF融合蛋白基因的重组质粒pGEX-GM-CSF/VP1用CaCl2法转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取转化子，在37℃条件下，诱导共表达蛋白，诱导物为IPTG，使用剂量为100mg/L，诱导结束后，用尿素复性包涵体方法对表达的蛋白进行纯化，得到分子量为65KD的融合蛋白GM-CSF/VP1。
实施例2、pGEX-GM-CSF/VP1和GM-CSF/VP1的鼠疫保护实验
将实施例1获得的重组质粒pGEX-GM-CSF/VP1和融合蛋白GM-CSF/VP1分别免疫鼠，以非免疫鼠为对照，免疫剂量为500μg/只，每隔两周免疫一次，共免疫3次，并于每次免疫后2周采血分离血清，用ELISA法测定血清抗体效价，用口蹄疫灭活疫苗(购于北京中牧公司)包板，二抗为酶标羊抗鼠抗体(购于北京新经科公司)，测定结果表明GM-CSF/VP1免疫血清的抗体效价最高可达到1∶200；再用中和抗体阻断试剂盒(购于中国农业科学院兰州兽医研究所)测定中和抗体滴度，测定结果表明GM-CSF/VP1可刺激产生高水平的中和抗体，抗体滴度可达1∶48；末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞，用MTT法进行T细胞增殖实验，结果表明T细胞增殖反应显著增强，刺激指数为0.348；结束前三天进行迟发型超敏反应实验，结果表明抗原特异性迟发型超敏反应强烈，脚掌肿胀程度明显。将实验组检测结果与对照组进行比较，结果由含VP1/GM-CSF融合蛋白基因的重组质粒pGEX-GM-CSF/VP1疫苗组及其共表达蛋白GM-CSF/VP1疫苗组的小鼠血清IgG抗体水平显著提高，T细胞增殖反应显著增强，抗原特异性迟发型超敏(DHT)强烈，Th1与Th2型细胞因子表达量有不同程度的升高，中和抗体水平显著增高，表明用pGEX-GM-CSF/VP1和GM-CSF/VP1免疫鼠后，其免疫保护效果显著提高。
序列表
<160>4
<210>1
<211>359
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Pro Pro Asn Thr Ala Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn His Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Asp Ala Val Met Asn Asp Thr Glu Val Val Ser Glu Lys Phe Asp
50 55 60
Ser Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Met Gly Ser Leu Thr Met Met
85 90 95
Ala Thr His Tyr Glu Lys His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
100 105 110
Gly Thr Gln Phe Ile Ser Phe Lys Asn Phe Lys Glu Asp Leu Lys Glu
115 120 125
Phe Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Ala Gln Lys Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr
145 150 155 160
Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln
165 170 175
His Thr Asp Ile Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Lys Pro
180 185 190
Lys Glu Gln Val Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr
195 200 205
Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu
210 215 220
Glu Leu Ala Val Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly
225 230 235 240
Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His
245 250 255
Lys Glu Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg
260 265 270
Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser
275 280 285
Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu
290 295 300
Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg
305 310 315 320
Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro
325 330 335
Arg Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Arg
340 345 350
Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln
355
<210>2
<211>382
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
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35 40 45
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100 105 110
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Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys His Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr
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Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Glu Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu
275 280 285
Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Ser
290 295 300
Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln
305 310 315 320
Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Phe
325 330 335
Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys
340 345 350
Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile Gln Pro Ser
355 360 365
Asp Ala Arg His Lys Gln Arg Ile Val Ala Pro Ala Lys Gln
370 375 380
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
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cgcccaccca acactgccac ccggccctgg cagcatgtgg atgccatcaa ggaggccctg 120
agccttctga accacagcag tgacactgat gctgtgatga atgacacaga agtcgtctct 180
gaaaagtttg actcccagga accaacgtgc ctgcagactc gcctgaagct gtacaagaac 240
ggcctgcagg gcagcctcac tagtctcatg ggctccttga ccatgatggc cacccactac 300
gagaaacact gcccacccac cccggaaact tcctgtggaa cccagtttat cagcttcaaa 360
aatttcaaag aggacctgaa ggagttcctt tttatcattc cctttgactg ctgggaacca 420
gcccagaagg gtggcggtgg cggtaccacc tctgcgggtg agtctgcgga ccccgtgact 480
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gccattcaac cgagtgacgc tagacacaag cagaggattg tggcacccgc aaaacag 1077
<210>4
<211>1146
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
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tcttatggcc agggccaatt ttttagagaa atagaaaact taaaggagta ttttaatgca 120
agtagcccag atgtagctaa gggtgggcct ctcttctcag aaattttgaa gaattggaaa 180
gatgaaagtg acaaaaaaat tattcagagc caaattgtct ccttctactt caaactcttt 240
gaaaacctca aagataacca ggtcattcaa aggagcatgg atatcatcaa gcaagacatg 300
tttcagaagt tcttgaatgg cagctctgag aaactggagg acttcaaaaa gctgattcaa 360
attccggtgg atgatctgca gatccagcgc aaagccataa atgaactcat caaagtgatg 420
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ggccggagag catcaacggg tggcggtggc ggtaccacct ctgcgggtga gtctgcggac 540
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Claims (2)
1.激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白在制备预防和/或治疗口蹄疫的疫苗中的应用；所述激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白由口蹄疫病毒的VP1蛋白、连接肽和细胞因子GM-CSF组成，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白编码基因在制备预防和/或治疗口蹄疫的疫苗中的应用；所述激发机体产生FMDV抗体的融合蛋白编码基因由口蹄疫病毒VP1蛋白的编码基因、连接肽的编码基因和细胞因子GM-CSF的编码基因组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
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| CNB2005101083394A CN100361708C (zh) | 2005-10-12 | 2005-10-12 | 激发机体产生fmdv抗体的融合蛋白的应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子基因的融合表达. 张灿等.中国兽医科技，第35卷第7期. 2005 * |
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