CN108699561A - 重组乳酸菌及其在口服通用流感疫苗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种口服通用流感疫苗，包括一种重组乳酸菌，该重组乳酸菌表达的蛋白包括但不限于铁蛋白以及在所有已知的流感病毒中表达的高度保守的血凝素（HA）基底部。本发明还涉及一种重组蛋白，包括该高度保守的血凝素基底部和该铁蛋白。

Description

重组乳酸菌及其在口服通用流感疫苗中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年11月19日提交的美国临时专利申请序列号62/257,242的优先权；该专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及重组乳酸菌及其在口服通用流感疫苗中的使用。特别的是，本发明涉及一种对于高度保守的血凝素(HA)蛋白(在所有已知的流感病毒中)进行表达的重组乳酸菌及其在通用流感疫苗口服制剂中的使用。

背景技术

全球爆发的流感疫情一直导致相当高的发病率和死亡率。根据美国疾病控制与预防中心(CDC)的数据，季节性流感每年在全世界导致超过200,000人住院，36,000人死亡。另外，在家禽当中的死亡率和相关经济代价是很大的，因为如果在同一个农场以及临近区域有一只家禽被检查感染病毒，那么所有家禽都会被感染致死。目前，预防流感病毒感染的最好方法是通过接种疫苗。鉴于有很多种流感病毒和抗原结构，特别是其头部区域范围总在变化之中，因此季节性流感疫苗的成分必须经常随之更新和改变，从而预防新出现的病毒株。流感疫苗是以流感病毒表层血凝素(HA)的头部区域作为目标，但目前可用的流感疫苗并非通用疫苗。众所周知的是，流感病毒血凝素(HA)的球状头部区域因为突变速率高而具有高变异性。这明显限制了目前所使用针对突变型、变异性流感病毒的流感疫苗疗效。

其头部区域每年具有很高的变异性，这就是为什么需要新型疫苗应对每个流行季节不断变化的病毒株。确定所选的特定类型流感疫苗的相似性可以预防感染流感的相关疾病，因此流感病毒和用以预防的流感疫苗之间的相似性是非常关键的。目前所使用的传统流感疫苗的开发是预测某种用于注射疫苗的病毒，这需要很多个月的时间，以便生产疫苗和及时发出以应对每年不断变异的流感病毒(称为抗原漂移)。每年，世界卫生组织(WHO)预测何种流感病毒的毒株最有可能在下一年流行，允许医药公司开发疫苗以对这些毒株提供最好的免疫性和预防。每季要针对一些流感病毒株重新配制疫苗，但是并不包括当前和下个季节或年份里世界上流行的所有毒株。药品制造商大约需要6个月时间配制和生产数以百万计的剂量以应对季节性流感。偶然情况下，某种新型或被忽视的毒株会在当季流行。如果所开发的流感疫苗不能匹配流行性病毒，这样用于注射的流感疫苗可能没有益处和预防作用。同样可能的是会感染病毒和生病，因为疫苗通常需要大约两周产生效果。如果病毒自身发生变异并能够感染和传播，那么可能会出现全球爆发流感。没有人能够肯定预测何时会爆发流感疫情。由医药公司持续寻找和发明“新型”注射疫苗用以应对每年的流感疫情是有必要的。尽管如此，预测和估计流感疫情的类型是明显不可靠的，因为血凝素结构以及流感类型的不断变异，这一过程是很繁琐的。一次错误的预测可能就会造成巨大的经济损失和生命代价。最为重要的是，对于接种疫苗的错误预测不能为人、家禽以及其它牲畜提供免受流感病毒感染的保护。

目前用于家禽和人的流感接种疫苗是通常以注射形式(液态)通过进入肌肉的灭活抗原。虽然这是接种疫苗的最普遍方式，但这一接种疫苗程序需要专业人员(即护士、医生、受过训练的农民)。一旦注射剂量失误将会明显减小流感接种疫苗的整体效果。同样，用于家禽的传统接种疫苗非常耗费劳力，也非常繁琐。另一方面，液态形式的传统流感疫苗需要冷冻在2-8℃的环境下，这在一些地区明显不方便，比如撒哈拉以南非洲的热带沙漠区以及中国的贫穷地区(那些地方用电紧缺和交通不便是普遍问题)。除此之外，目前的疫苗是病原微生物，这会带来的危险是对载体疫苗产生免疫排斥反应并降低其效用。另外，液态形式包含有防腐剂，有些人认为这些防腐剂会有健康危害，比如在注射疫苗后产生神经错乱。例如，自闭症儿童就是疑似注射了含有防腐剂的液态疫苗。最后但同样重要的是，液态形式的疫苗储存期是相当短的，即通常少于3个月，这明显是一个缺陷。

比较而言，在已知的各种流感病毒株群中，血凝素(HA)的基底部是高度保守的(图6)。因此，它们能够产生广泛中和的抗体，并针对各种流感病毒株群提供相应的保护。

铁蛋白是一种球状蛋白质复合体，包含24种蛋白质亚基，是原核生物和真核生物中主要的细胞内储铁蛋白质，以可溶的和无毒的形式储藏铁元素。这种蛋白质几乎是由所有的生物体产生，包括藻类、细菌、高等植物和动物。作为一种细胞溶质蛋白，大多数组织中都包含铁蛋白，但是很少量分泌进入血清中，其作用是作为一种铁元素载体。已有报道称，向抗原中引入铁蛋白能够提高该抗原的抗原性。这将会比传统流感疫苗产生更为广泛和更强的免疫力。

综合以上所述，一种流感疫苗的药物载体是有需要的，其应包含与高度保守的HA蛋白基底部结合的铁蛋白。乳酸菌(LAB)是最为适合的一种菌类，因为其被公认为是安全级(GRAS)，对于口服疫苗是非病原的载体。转化乳酸菌的技术非常发达，在市场上可以买到各种控制和调配所需蛋白质的质粒。保存和储藏乳酸菌既安全又方便。因为有很多作为食品的安全记录，乳酸菌被认为对人和动物无害。乳酸菌，特别是干酪乳杆菌，是食品级的微生物，对于人和动物是安全的。

发明内容

因此，本发明的第一方面涉及一种用表达载体所转化的重组乳酸菌，其中包含一种DNA序列，即高度保守的流感血凝素基底部、铁蛋白以及其它区域的编码序列。所述其它区域可能包括但不限于能够提高免疫原性的橙色荧光蛋白(OFP)，该橙色荧光蛋白与高度保守的流感血凝素基底部之间的连接器，以及高度保守的流感血凝素基底部与铁蛋白之间的连接器。在一个示范的实施例中，对该橙色荧光蛋白和流感血凝素基底部的编码序列进行了修改，以提高所述蛋白质对于人和动物的免疫原性或在宿主细胞中的表达效率。因此，由所述DNA序列表达的橙色荧光蛋白、流感血凝素基底部和铁蛋白中是被相应的所述连接器连在一起。

本发明中所述修改的橙色荧光蛋白和流感血凝素基底部的编码序列更加适合乳酸菌株，包括但不限于干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及胚芽乳杆菌。其同样适合其它乳酸菌，例如乳酸乳球菌。

可用于本发明的表达载体最好是革兰氏阳性的表达载体，包括但不限于pTRKH3、pMSP3535、pDL378以及其它革兰氏阳性的表达载体。在优选实施例中使用的是pTRKH3。

该重组乳酸菌能够在人和其它动物中产生免疫原性的流感类型包括但不限于H1、H3和H5，因为流感血凝素基底部在流感病毒中高度保守，能够针对各种流感病毒株产生广泛中和的抗体。

该重组乳酸菌能够按配方制成各种药品形式，包括但不限于粉末、药丸、胶囊、液体和片剂。在优选实施例中，该重组乳酸菌是被人或其它动物口服。但是，其它方式可能导致对该重组乳酸菌的免疫排斥，因此应该避免使用其它方式，例如，通常所熟知的是直接通过皮下或静脉注射乳酸菌会导致接受者的过敏反应。

本发明的第二方面涉及高度保守的流感血凝素基底部和铁蛋白的DNA编码序列所表达的重组蛋白以及本发明第一方面的其他区域。应该理解的是，能够用于将表达载体转化为革兰氏阳性宿主细胞的传统方法(例如电穿孔法)都可以用到。还应理解的是本发明DNA序列所表达的高度保守的流感血凝素基底部能够在接受者身体中产生抗体，甚至是在没有铁蛋白和重组蛋白质其它区域的情况下也可以。换言之，本发明的重组蛋白可以只是高度保守的流感血凝素基底部本身。

本发明的第三方面涉及使用依据本发明的第一方面的重组乳酸菌或依据本发明的第二方面的重组蛋白制造药剂，例如疫苗，通过诱导在受治目标中针对各种流感病毒所产生的抗体作为治疗流感的用途。本发明第三方面所述药剂是一种包含重组乳酸菌或重组蛋白质的口服药剂。该包括本发明重组蛋白质的口服药剂还包括医药学上可接受的载体，例如胶囊、片剂、盐水、酯类等。该包括本发明重组乳酸菌的口服药剂包括粉末、药丸、胶囊、液体或缓冲剂等。可与由该重组乳酸菌或重组蛋白质诱导产生的抗体结合或被其靶向的流感病毒包括H1型、H3型、H5型以及其它H型流感病毒。在一优选实施例中，对是有需求的受治目标施用包含有效数量的本发明重组乳酸菌的口服制剂。所述受治目标包括人和其它动物。如果受治目标是小动物，例如老鼠，那么在所述口服制剂中的重组乳酸菌有效数量大约为1x10⁹cfu，口服的剂量是每日一次，每周连服三天，连续两周服用。

这些和其它实施例以及本发明的特点和方法将在之后的详细描述中进行阐述。发明内容旨在对本发明进行概述，并不是提供独有的、全面的阐释。以下的详细描述将提供更多有关目前的披露情况和方法的信息。

附图说明

图1是根据本发明一个优选实施例中所描述的用于将乳酸菌株转化的表达载体中的DNA插入部分的设计示意图：区域1表示改良的橙色荧光蛋白(OFP)DNA序列；区域2表示改良的流感血凝素基底部DNA序列；区域3表示铁蛋白的DNA序列；两个小括号表示连接橙色荧光蛋白和流感血凝素基底部之间以及连接流感血凝素基底部和铁蛋白之间的两个连接器的DNA序列。

图2显示了对经转化的干酪乳杆菌克隆品的琼脂糖胶分析结果，包括图1中所述DNA插入部分的表达载体：(M)DNA标记；(L)对经转化的干酪乳杆菌进行的聚合酶链式反应扩增的产物以确认克隆。

图3显示了根据本发明一个实施例中从转化的干酪乳杆菌克隆品中分离出并经限制酶消化的质粒的琼脂糖胶分析结果：(M)DNA标记；(1-4)从转化的干酪乳杆菌克隆品中分离出并经消化的质粒。

图4显示了对本发明一个实施例中从转化的干酪乳杆菌中提取的具有流感血凝素基底部的重组蛋白质(OFP-H1HA10-Foldon-铁蛋白)进行的免疫印迹分析的结果：(C)从野生型干酪乳杆菌中提取的蛋白质作为对照物；(1)-(2)从转化的干酪乳杆菌中提取的蛋白质。

图5显示了对被经口服施用转化的干酪乳杆菌两周后的小鼠中的血清进行的免疫印迹分析的结果：(1)只施用PBS；(2)施用野生型干酪乳杆菌(每只鼠1×10⁹cfu)；(3)施用转化的干酪乳杆菌(每只鼠1×10⁹cfu)。

图6是流感血凝素结构的示意图。

图7显示了本发明一个优选实施例中用于转化干酪乳杆菌的表达载体的质粒结构，其中包含所需的DNA插入部分。

具体实施方式

在详述中“一个实施例”的指代表示，该所述实施例可能包括一种特定的特征、结构或特点，但是不是每个实施例都必须包括该特定的特征、结构或特点。另外，这类措辞并非一定指代同样的实施例。再次，当一种特定的特征、结构或特点被描述为与某个实施例相关时，则对于所属技术领域的专业人员来说，无论是否明确进行描述，这都会对与其它实施例相关的此种特征、结构或特点产生影响。

以一个范围表示的值应该以一种灵活的方式进行阐释，不仅包括明确指出的该范围上下限的数值，而且还包括该范围内的所有数值或该范围内的子区间，每个数值和子区间都当作是明确列出的。例如，“大约0.1％至大约5％”这一浓度范围应该被阐述为不仅包括明确指出的0.1％和5％的浓度限值，还包括该范围内单独的浓度值(例如，1％、2％、3％和4％)以及子区间(例如，0.1％至0.5％，1.1％至2.2％，以及3.3％至4.4％)。

按照本文所述，“某个”或“某种”一词在使用时包括一个或多个，“或者”一词在使用时指代“并非单独存在”，除非是另有说明。另外，应该理解的是本文中所使用的措辞或术语，除非另有指代，都是为了进行描述，没有进行限制。再次，本文件中援引的所有出版物、专利和专利文件都是以其整体进行援引。如果本文件和以参考文献引用的文件出现不一致的使用，那么这些参考文献的用法应该视为本文件的补充；如果出现难以调和的不一致情况，以本文中的用法为准。

在本文所述的制造方法中，可以任何顺序进行步骤的操作，只要不背离本发明的原则，但明确指出临时的或操作性顺序除外。在某项权利要求中所述某个步骤首先执行，之后执行其它几个步骤，这应该是指第一步骤的执行先于任何其它步骤，但是其它步骤可以任何适合的顺序执行，除非是进一步阐述了以某一顺序执行其它步骤。例如，权利要求要素中所述“步骤A、步骤B、步骤C、步骤D、步骤E”应该被阐述为先执行步骤A，最后执行步骤E，步骤B、步骤C、步骤D能以步骤A和步骤E之间的任何顺序执行，这一顺序仍然属于权利要求过程中的字面所述范围。一个规定的步骤或是分步骤也能够重复执行。

另外，规定的各步骤可以同时执行，除非是权利要求中明文规定必须单独执行。例如，做X事的权利要求步骤和做Y事的权利要求步骤可以在一个单独的操作中同时执行，这一过程属于权利要求过程中的字面所述范围。

定义

单数形式可能包括复数的指代对象，除非上下文有明确描述。

“大约”一词能够表示一个数值或范围的可变性程度，例如，所述数值或范围限值的10％以内或5％以内。

“分别地选自”指的是所参照的组群是相同的、不同的或是混合的，除非上下文有明确描述。因此，在本定义下，“X1、X2和X3是从稀有气体中独立筛选出来”这一表述包括多种情况，例如，X1、X2和X3是一样的，X1、X2和X3是不同的，X1、X2是一样的而X3是不同的，以及其它类似的排列情况。

优选实施方式的详细描述

本发明不会因为以下的任何描述而限制范围。以下的实施例或实施方式仅供进行举例。

实施例

本发明的实施方式可以通过引用以下实施例进行实例说明。本发明不局限于在此所引用的实施例。

实施例1–DNA插入部分的设计以及包括其的表达载体在宿主细胞中的转化

图1显示了DNA插入部分的设计，包括改良的橙色荧光蛋白(OFP)编码序列(区域1)。这一序列的源自Cerianthus sp.：(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/31616579？report＝genbank&log$＝protalign&blast_rank＝1&RID＝4NXR513S01R)。从这一改良的橙色荧光蛋白编码序列中表达的蛋白质能够提高本发明重组蛋白质对于接受者的免疫原性。改良的橙色荧光蛋白编码序列通常还与乳酸菌的编码偏好匹配。尽管如此，其它在市场上可买到的具有上述特性的荧光蛋白也可以用于该DNA插入部分。

图1的DNA插入部分还包括改良的流感血凝素基底部的编码序列(区域2)，这是参考“Mallajosyula et al.”(2014年)中所披露的蛋白质序列(http://www.pnas.org/content/111/25/E2514.short)。与所披露的序列不同的是，本发明从所披露的一个序列中进行了反转录，之后进行了针对干酪乳杆菌的密码子优化，然后在DNA序列中进行了一些修改以达到最优化目的。图1还显示了区域2中以底线突显的序列编码T4噬菌体纤维蛋白折叠子(Fibritinfoldon)。

图1的DNA插入部分还包括铁蛋白的编码序列(区域3)，源自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/446871934？report＝genbank&log$＝protalign&blast_rank＝1&RID＝4KH8G6K0016)。

在区域1和区域2之间，图1的DNA插入部分还包括第一个连接器，是一个多组氨酸。该连接器包含一个Xa蛋白酶编码序列以及一个KpnI限制位点，位于多组氨酸编码序列之前。

在区域2和区域3之间，图1的DNA插入部分还包括第二个连接器。该连接器包含TEV蛋白酶编码序列以及一个AgeI限制位点。

图1的DNA插入部分的序列还通过SEQ ID NO:1表现。可选地，一个序列至少包括一个限制位点，该点在DNA插入部分的起始密码子和终止密码子之前和/或之后可以插入。例如，NcoI和NdeI限制位点能够在起始密码子之前进行插入；BamHI限制位点能够在终止密码子之后进行插入。

图1所示的DNA序列(或SEQ ID NO:1)是在pTRKH3表达载体中克隆的，是为了在转化的干酪乳杆菌中进行蛋白质表达。图7显示了插入了DNA序列(SEQ ID NO:1)的上述pTRKH3表达载体的质粒构建图。

应该理解的是，本发明中所述的DNA插入部分各区域的顺序是可以改变的，只要是从经具有不同区域组合的DNA插入部分的表达载体所转化的干酪乳杆菌表达出的蛋白，都能在接受包含该转化的干酪乳杆菌的药剂的受治主体内产生针对H型流感病毒的抗体。例如，不同的插入部分可能具有以下各区域的组合：

区域1(OFP)之后是区域3(铁蛋白)，然后是区域2(流感血凝素基底部)，其编码序列由SEQ ID NO:2表示；

区域2(流感血凝素基底部)之后是区域1(OFP)，然后是区域3(铁蛋白)，其编码序列由SEQ ID NO:3表示；

区域2(流感血凝素基底部)之后是区域3(铁蛋白)，然后是区域1(OFP)，其编码序列由SEQ ID NO:4表示；

区域3(铁蛋白)之后是区域1(OFP)，然后是区域2(流感血凝素基底部)，其编码序列由SEQ ID NO:5表示；

区域3(铁蛋白)之后是区域2(流感血凝素基底部)，然后是区域1(OFP)，其编码序列由SEQ ID NO:6表示。

同样可能的是只将区域2的编码序列包括进该表达载体，这样表达的蛋白仍然能够在所述受治主体内对所述H型流感病毒产生抗体。

为了确保阳性克隆，采用聚合酶链式反应扩增来筛选和鉴定是否成功转化干酪乳杆菌，其中的pTRKH3表达载体包含DNA插入部分(SEQ ID NO:1)，即OFP-H1HA10-Foldon-铁蛋白的编码序列。在图2中，来自阳性克隆的聚合酶链式反应扩增产物是通过凝胶电泳法在1％琼脂糖胶中进行分析的。使用一组正向和反向引物进行扩增，即SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9。PCR产物的预期长度为1,766bp，对应紧靠在承载有该PCR产物的跑道旁的DNA标记，由承载有该产物的跑道在糖胶中跑出的位段长度为1,650-2,000bp。结果显示，包含由所述改良的OFP编码序列、改良的流感血凝素基底部编码序列以及铁蛋白编码序列组成的DNA插入部分(SEQ ID NO:1)的表达载体pTRKH3，具有很高的转化效能。经筛选得出的阳性克隆有待进一步确定和研究。

流感血凝素基底部DNA编码序列(H1HA10-Foldon)是从图2中确认转化的阳性克隆中的表达载体提取而来。在双酶切反应下，通过使用两种限制酶(KpnI和AgeI)，对从阳性克隆中提取的并经消化的表达载体样品以琼脂糖胶(1％)电泳法进行分析。图3显示，四个样品中都得出两个不同的位段，可以确定的是在本实施例中使用的表达载体在宿主菌体中得到成功转化。

实施例2–对包括流感血凝素基底部的重组蛋白的表达

实施例1中成功被筛选出经转化的干酪乳杆菌克隆品能够对流感血凝素基底部进行表达。为了进一步确认相应的目标蛋白片段在转化的干酪乳杆菌中得到表达，采用蛋白质印迹法评价在转化的干酪乳杆菌内血凝素基底部的表达效率。阳性克隆品是在MRS培养基进行培育的，补充条件包括100μg/ml红霉素，并于37℃以及在缺氧条件下以250rpm转速摇动72小时。

之后是收集细菌细胞悬液，所收集的细胞进行裂解后得到胞液蛋白。在图4中，两个样品在SDS凝胶电泳中进行测试，之后是蛋白质印迹分析。重点位段显示出流感血凝素基底部从转化的干酪乳杆菌中的表达。重组蛋白包含改良的OFP、改良的流感血凝素基底部(H1HA10-Foldon)以及铁蛋白(OFP-H1HA10-Foldon-铁蛋白)，其氨基酸序列由SEQ ID NO:7表示。

实施例3–对重组乳酸菌在体内免疫原性的研究

BALB/c小鼠(6-8周)(n＝7)被随机分成3组。对3组小鼠分别经口服施用3种不同的药剂：PBS(第1组)，在200μl PBS中含再悬浮的野生型干酪乳杆菌(每只鼠1×10⁹cfu)(第2组)；在200μl PBS中含实施例1和实施例2中确认的再悬浮转化的干酪乳杆菌(每只鼠1×10⁹cfu)(第2组)。口服的剂量是每日一次，每周连服三天，连续两周服用。血样是从尾静脉进行提取，时间分别在口服三种不同药剂后的第3周、第5周、第7周、第9周和第15周，在测试是否存在有关抗体之前血样储存在-80℃环境下。同样，在喂食药物期间，每周对每只小鼠的体重记录一次，以对每只小鼠在喂食干酪乳杆菌后的健康状况进行监控。经观察没有减轻体重，所有小鼠在上文所述的喂食药物过程中全部存活。

用包含编码OFP-H1HA10-Foldon-铁蛋白的序列的表达载体的阳性克隆品转化DH5α细胞以产生抗体。产生的抗体可用溴离子柱进行纯化。纯化的抗体被载入SDS-PAGE中，以小鼠血清中的抗体为探针，并以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000)进行检测，并用ECL免疫印迹试剂进行观察。在向小鼠喂食转化的干酪乳杆菌后两周时间，收集小鼠血清，检测小鼠血清中针对流感血凝素基底部所产生的抗体，其中喂食PBS或野生型干酪乳杆菌的小鼠未产生相应抗体。这些结果表明，被口服施用转化的干酪乳杆菌的小鼠产生了针对流感血凝素基底部的抗体。

工业实用性

该重组乳酸菌有用于制成一种可供人和其它动物(例如牲畜)安全口服用的疫苗。将经该含有改良的流感血凝素的编码序列的表达载体转化的宿主所表达的重组蛋白分离出和纯化可用于制造该疫苗。该疫苗并不仅限于口服药剂，其还包括其它形式，例如注射药剂，前提是不会引起免疫排斥。

微生物保藏

根据微生物保藏规定(PCT Rule 13bis)，当前改良的重组干酪乳杆菌储存在以下的国际保藏机构：

保藏机构名称：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，广东省微生物研究所

保藏机构地址：中国广州市(510070)先烈中路100号第59号楼

保藏日期：2016年11月18日

GDMCC号：60113

SEQUENCE LISTING

<110> 创嘉生物科技有限公司

<120> 重组乳酸菌及其在口服通用流感疫苗中的用途

<130> P8791PC00

<150> US 62/257,242

<151> 2015-11-19

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 改性 OFP 和 H1HA10 基底部加上铁蛋白

<400> 1

atgaacctga gcaagaatgt tagcgttagc gtttatatga aaggcaatgt taataatcac 60

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<211> 1749

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<223> OFP-铁蛋白-H1HA10-Foldon

<400> 2

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ccagttcaat tgaccagtat ttcagcccca gaacataagt tcgaaggttt gacacaaatt 960

tttcaaaaag cctatgaaca tgaacaacat atcagtgaat caatcaacaa cattgttgat 1020

catgccatca agtcaaagga tcatgctacc ttcaactttt tacaatggta tgttgcagaa 1080

caacatgaag aagaagtttt atttaaagat attttggata aaattgaatt aattggcaat 1140

gaaaatcacg gtttgtattt agcggaccag tatgtcaagg gtattgcgaa gtcacgaaag 1200

tctgaaaact tgtattttca aggcaccggc gataccgttg atacagtttt agaaaagaat 1260

gttactgtta cccattcagt taacttattg gaagatagtc atggttcagc aaatagttca 1320

ttaccatatc aaaacacaca tccaacaact aatggcgaaa gtccaaaata tgttcgttca 1380

gcaaaattgc gcatggttac aggtttacgc aatggcagtg caggttcagc cactcaaaat 1440

gccattaatg gcattactaa caaggttaac accgttatcg aaaagatgaa tattcaagat 1500

acagccactg gcaaggaatt taacaaggat gaaaaacgta tggaaaactt gaacaagaaa 1560

gttgatgatg gctttttaga tatttggacc tataacgcag aattattggt tttattggaa 1620

aacgaacgca ccttggatgc ccatgatagt caaggcacag gtggcggtta tattccagaa 1680

gctccacgtg atggccaagc ctatgttcgc aaagatggtg aatgggtttt gttaagtacc 1740

tttttataa 1749

<210> 3

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1HA10-Foldon-OFP-铁蛋白

<400> 3

atggataccg ttgatacagt tttagaaaag aatgttactg ttacccattc agttaactta 60

ttggaagata gtcatggttc agcaaatagt tcattaccat atcaaaacac acatccaaca 120

actaatggcg aaagtccaaa atatgttcgt tcagcaaaat tgcgcatggt tacaggttta 180

cgcaatggca gtgcaggttc agccactcaa aatgccatta atggcattac taacaaggtt 240

aacaccgtta tcgaaaagat gaatattcaa gatacagcca ctggcaagga atttaacaag 300

gatgaaaaac gtatggaaaa cttgaacaag aaagttgatg atggcttttt agatatttgg 360

acctataacg cagaattatt ggttttattg gaaaacgaac gcaccttgga tgcccatgat 420

agtcaaggca caggtggcgg ttatattcca gaagctccac gtgatggcca agcctatgtt 480

cgcaaagatg gtgaatgggt tttgttaagt acctttttaa ttgaaggccg tggtacccat 540

catcatcatc atcatatgaa cctgagcaag aatgttagcg ttagcgttta tatgaaaggc 600

aatgttaata atcacgaatt tgaatatgac ggcgaaggcg gtggcgatcc atataccggt 660

aagtatagta tgaagatgac tttgcgtggt caaaatagtt tgccattcag ttatgatatt 720

atcaccacag ccttccaata tggctttcgc gtttttacaa aatatccaga aggtatcgtt 780

gattatttca aggattcatt gccagatgct tttcaatgga atcgtcgcat tgtttttgaa 840

gatggtggcg ttttgaatat gagttcagat attacatata aggataacgt tttacatggc 900

gatgttaaag ctgaaggtgt taattttcca ccaaatggcc cagttatgaa gaacgaaatc 960

gttatggaag aaccaactga agaaaccttt acaccaaaaa atggcgtttt ggttggtttc 1020

tgtccaaaag catatttgtt gaaggatggc agttattatt atggtaacat gactaccttc 1080

tatcgtagta aaaaatcagg ccaagcacca ccaggttatc atttcgttaa gcatcgcttg 1140

gttaagacta acgttggtca tggtttcaag actgttgaac aaaccgaata tgccacagct 1200

catgttagtg atttgccaaa agaaaacttg tattttcaag gcaccggcat gttgtcaaag 1260

gatattatca aattgttgaa tgaacaagtt aataaagaaa tgaatagttc aaatttgtat 1320

atgagtatga gttcatggtg ctatacacat tcattagatg gcgctggttt atttttgttt 1380

gatcatgctg cagaagaata tgaacatgct aaaaaattaa tcattttctt aaacgaaaat 1440

aatgttccag ttcaattgac cagtatttca gccccagaac ataagttcga aggtttgaca 1500

caaatttttc aaaaagccta tgaacatgaa caacatatca gtgaatcaat caacaacatt 1560

gttgatcatg ccatcaagtc aaaggatcat gctaccttca actttttaca atggtatgtt 1620

gcagaacaac atgaagaaga agttttattt aaagatattt tggataaaat tgaattaatt 1680

ggcaatgaaa atcacggttt gtatttagcg gaccagtatg tcaagggtat tgcgaagtca 1740

cgaaagtctt aa 1752

<210> 4

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1HA10-Foldon-铁蛋白-OFP

<400> 4

atggataccg ttgatacagt tttagaaaag aatgttactg ttacccattc agttaactta 60

ttggaagata gtcatggttc agcaaatagt tcattaccat atcaaaacac acatccaaca 120

actaatggcg aaagtccaaa atatgttcgt tcagcaaaat tgcgcatggt tacaggttta 180

cgcaatggca gtgcaggttc agccactcaa aatgccatta atggcattac taacaaggtt 240

aacaccgtta tcgaaaagat gaatattcaa gatacagcca ctggcaagga atttaacaag 300

gatgaaaaac gtatggaaaa cttgaacaag aaagttgatg atggcttttt agatatttgg 360

acctataacg cagaattatt ggttttattg gaaaacgaac gcaccttgga tgcccatgat 420

agtcaaggca caggtggcgg ttatattcca gaagctccac gtgatggcca agcctatgtt 480

cgcaaagatg gtgaatgggt tttgttaagt acctttttaa ttgaaggccg tggtacccat 540

catcatcatc atcatatgtt gtcaaaggat attatcaaat tgttgaatga acaagttaat 600

aaagaaatga atagttcaaa tttgtatatg agtatgagtt catggtgcta tacacattca 660

ttagatggcg ctggtttatt tttgtttgat catgctgcag aagaatatga acatgctaaa 720

aaattaatca ttttcttaaa cgaaaataat gttccagttc aattgaccag tatttcagcc 780

ccagaacata agttcgaagg tttgacacaa atttttcaaa aagcctatga acatgaacaa 840

catatcagtg aatcaatcaa caacattgtt gatcatgcca tcaagtcaaa ggatcatgct 900

accttcaact ttttacaatg gtatgttgca gaacaacatg aagaagaagt tttatttaaa 960

gatattttgg ataaaattga attaattggc aatgaaaatc acggtttgta tttagcggac 1020

cagtatgtca agggtattgc gaagtcacga aagtctgaaa acttgtattt tcaaggcacc 1080

ggcatgaacc tgagcaagaa tgttagcgtt agcgtttata tgaaaggcaa tgttaataat 1140

cacgaatttg aatatgacgg cgaaggcggt ggcgatccat ataccggtaa gtatagtatg 1200

aagatgactt tgcgtggtca aaatagtttg ccattcagtt atgatattat caccacagcc 1260

ttccaatatg gctttcgcgt ttttacaaaa tatccagaag gtatcgttga ttatttcaag 1320

gattcattgc cagatgcttt tcaatggaat cgtcgcattg tttttgaaga tggtggcgtt 1380

ttgaatatga gttcagatat tacatataag gataacgttt tacatggcga tgttaaagct 1440

gaaggtgtta attttccacc aaatggccca gttatgaaga acgaaatcgt tatggaagaa 1500

ccaactgaag aaacctttac accaaaaaat ggcgttttgg ttggtttctg tccaaaagca 1560

tatttgttga aggatggcag ttattattat ggtaacatga ctaccttcta tcgtagtaaa 1620

aaatcaggcc aagcaccacc aggttatcat ttcgttaagc atcgcttggt taagactaac 1680

gttggtcatg gtttcaagac tgttgaacaa accgaatatg ccacagctca tgttagtgat 1740

ttgccaaaat aa 1752

<210> 5

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 铁蛋白-OFP-H1HA10-Foldon

<400> 5

atgttgtcaa aggatattat caaattgttg aatgaacaag ttaataaaga aatgaatagt 60

tcaaatttgt atatgagtat gagttcatgg tgctatacac attcattaga tggcgctggt 120

ttatttttgt ttgatcatgc tgcagaagaa tatgaacatg ctaaaaaatt aatcattttc 180

ttaaacgaaa ataatgttcc agttcaattg accagtattt cagccccaga acataagttc 240

gaaggtttga cacaaatttt tcaaaaagcc tatgaacatg aacaacatat cagtgaatca 300

atcaacaaca ttgttgatca tgccatcaag tcaaaggatc atgctacctt caacttttta 360

caatggtatg ttgcagaaca acatgaagaa gaagttttat ttaaagatat tttggataaa 420

attgaattaa ttggcaatga aaatcacggt ttgtatttag cggaccagta tgtcaagggt 480

attgcgaagt cacgaaagtc tattgaaggc cgtggtaccc atcatcatca tcatcatatg 540

aacctgagca agaatgttag cgttagcgtt tatatgaaag gcaatgttaa taatcacgaa 600

tttgaatatg acggcgaagg cggtggcgat ccatataccg gtaagtatag tatgaagatg 660

actttgcgtg gtcaaaatag tttgccattc agttatgata ttatcaccac agccttccaa 720

tatggctttc gcgtttttac aaaatatcca gaaggtatcg ttgattattt caaggattca 780

ttgccagatg cttttcaatg gaatcgtcgc attgtttttg aagatggtgg cgttttgaat 840

atgagttcag atattacata taaggataac gttttacatg gcgatgttaa agctgaaggt 900

gttaattttc caccaaatgg cccagttatg aagaacgaaa tcgttatgga agaaccaact 960

gaagaaacct ttacaccaaa aaatggcgtt ttggttggtt tctgtccaaa agcatatttg 1020

ttgaaggatg gcagttatta ttatggtaac atgactacct tctatcgtag taaaaaatca 1080

ggccaagcac caccaggtta tcatttcgtt aagcatcgct tggttaagac taacgttggt 1140

catggtttca agactgttga acaaaccgaa tatgccacag ctcatgttag tgatttgcca 1200

aaagaaaact tgtattttca aggcaccggc gataccgttg atacagtttt agaaaagaat 1260

gttactgtta cccattcagt taacttattg gaagatagtc atggttcagc aaatagttca 1320

ttaccatatc aaaacacaca tccaacaact aatggcgaaa gtccaaaata tgttcgttca 1380

gcaaaattgc gcatggttac aggtttacgc aatggcagtg caggttcagc cactcaaaat 1440

gccattaatg gcattactaa caaggttaac accgttatcg aaaagatgaa tattcaagat 1500

acagccactg gcaaggaatt taacaaggat gaaaaacgta tggaaaactt gaacaagaaa 1560

gttgatgatg gctttttaga tatttggacc tataacgcag aattattggt tttattggaa 1620

aacgaacgca ccttggatgc ccatgatagt caaggcacag gtggcggtta tattccagaa 1680

gctccacgtg atggccaagc ctatgttcgc aaagatggtg aatgggtttt gttaagtacc 1740

tttttataa 1749

<210> 6

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 铁蛋白-H1HA10-Foldon-OFP

<400> 6

atgttgtcaa aggatattat caaattgttg aatgaacaag ttaataaaga aatgaatagt 60

tcaaatttgt atatgagtat gagttcatgg tgctatacac attcattaga tggcgctggt 120

ttatttttgt ttgatcatgc tgcagaagaa tatgaacatg ctaaaaaatt aatcattttc 180

ttaaacgaaa ataatgttcc agttcaattg accagtattt cagccccaga acataagttc 240

gaaggtttga cacaaatttt tcaaaaagcc tatgaacatg aacaacatat cagtgaatca 300

atcaacaaca ttgttgatca tgccatcaag tcaaaggatc atgctacctt caacttttta 360

caatggtatg ttgcagaaca acatgaagaa gaagttttat ttaaagatat tttggataaa 420

attgaattaa ttggcaatga aaatcacggt ttgtatttag cggaccagta tgtcaagggt 480

attgcgaagt cacgaaagtc tattgaaggc cgtggtaccc atcatcatca tcatcatgat 540

accgttgata cagttttaga aaagaatgtt actgttaccc attcagttaa cttattggaa 600

gatagtcatg gttcagcaaa tagttcatta ccatatcaaa acacacatcc aacaactaat 660

ggcgaaagtc caaaatatgt tcgttcagca aaattgcgca tggttacagg tttacgcaat 720

ggcagtgcag gttcagccac tcaaaatgcc attaatggca ttactaacaa ggttaacacc 780

gttatcgaaa agatgaatat tcaagataca gccactggca aggaatttaa caaggatgaa 840

aaacgtatgg aaaacttgaa caagaaagtt gatgatggct ttttagatat ttggacctat 900

aacgcagaat tattggtttt attggaaaac gaacgcacct tggatgccca tgatagtcaa 960

ggcacaggtg gcggttatat tccagaagct ccacgtgatg gccaagccta tgttcgcaaa 1020

gatggtgaat gggttttgtt aagtaccttt ttagaaaact tgtattttca aggcaccggc 1080

atgaacctga gcaagaatgt tagcgttagc gtttatatga aaggcaatgt taataatcac 1140

gaatttgaat atgacggcga aggcggtggc gatccatata ccggtaagta tagtatgaag 1200

atgactttgc gtggtcaaaa tagtttgcca ttcagttatg atattatcac cacagccttc 1260

caatatggct ttcgcgtttt tacaaaatat ccagaaggta tcgttgatta tttcaaggat 1320

tcattgccag atgcttttca atggaatcgt cgcattgttt ttgaagatgg tggcgttttg 1380

aatatgagtt cagatattac atataaggat aacgttttac atggcgatgt taaagctgaa 1440

ggtgttaatt ttccaccaaa tggcccagtt atgaagaacg aaatcgttat ggaagaacca 1500

actgaagaaa cctttacacc aaaaaatggc gttttggttg gtttctgtcc aaaagcatat 1560

ttgttgaagg atggcagtta ttattatggt aacatgacta ccttctatcg tagtaaaaaa 1620

tcaggccaag caccaccagg ttatcatttc gttaagcatc gcttggttaa gactaacgtt 1680

ggtcatggtt tcaagactgt tgaacaaacc gaatatgcca cagctcatgt tagtgatttg 1740

ccaaaataa 1749

<210> 7

<211> 582

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改性 OFP 和 H1HA10 基底部加上铁蛋白蛋白

<400> 7

Met Asn Leu Ser Lys Asn Val Ser Val Ser Val Tyr Met Lys Gly Asn

1 5 10 15

Val Asn Asn His Glu Phe Glu Tyr Asp Gly Glu Gly Gly Gly Asp Pro

20 25 30

Tyr Thr Gly Lys Tyr Ser Met Lys Met Thr Leu Arg Gly Gln Asn Ser

35 40 45

Leu Pro Phe Ser Tyr Asp Ile Ile Thr Thr Ala Phe Gln Tyr Gly Phe

50 55 60

Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Gly Ile Val Asp Tyr Phe Lys Asp

65 70 75 80

Ser Leu Pro Asp Ala Phe Gln Trp Asn Arg Arg Ile Val Phe Glu Asp

85 90 95

Gly Gly Val Leu Asn Met Ser Ser Asp Ile Thr Tyr Lys Asp Asn Val

100 105 110

Leu His Gly Asp Val Lys Ala Glu Gly Val Asn Phe Pro Pro Asn Gly

115 120 125

Pro Val Met Lys Asn Glu Ile Val Met Glu Glu Pro Thr Glu Glu Thr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Asn Gly Val Leu Val Gly Phe Cys Pro Lys Ala Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asn Met Thr Thr Phe Tyr

165 170 175

Arg Ser Lys Lys Ser Gly Gln Ala Pro Pro Gly Tyr His Phe Val Lys

180 185 190

His Arg Leu Val Lys Thr Asn Val Gly His Gly Phe Lys Thr Val Glu

195 200 205

Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ala His Val Ser Asp Leu Pro Lys Ile Glu

210 215 220

Gly Arg Gly Thr His His His His His His Asp Thr Val Asp Thr Val

225 230 235 240

Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp

245 250 255

Ser His Gly Ser Ala Asn Ser Ser Leu Pro Tyr Gln Asn Thr His Pro

260 265 270

Thr Thr Asn Gly Glu Ser Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg

275 280 285

Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Gly Ser Ala Gly Ser Ala Thr Gln Asn

290 295 300

Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu Lys Met

305 310 315 320

Asn Ile Gln Asp Thr Ala Thr Gly Lys Glu Phe Asn Lys Asp Glu Lys

325 330 335

Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile

340 345 350

Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr

355 360 365

Leu Asp Ala His Asp Ser Gln Gly Thr Gly Gly Gly Tyr Ile Pro Glu

370 375 380

Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val

385 390 395 400

Leu Leu Ser Thr Phe Leu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Thr Gly Met

405 410 415

Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu

420 425 430

Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr

435 440 445

His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu

450 455 460

Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn

465 470 475 480

Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu

485 490 495

Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile

500 505 510

Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp

515 520 525

His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu

530 535 540

Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly

545 550 555 560

Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile

565 570 575

Ala Lys Ser Arg Lys Ser

580

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于PCR扩增的正向引物

<400> 8

atgaacctga gcaagaat 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于PCR扩增的反向引物

<400> 9

ttaagacttt cgtgacttcg 20

Claims (32)

1.一种重组乳酸菌细胞，被一种具有改良的荧光蛋白、改良的流感血凝素基底部、铁蛋白和两个连接器的编码序列的表达载体所转化。

2.根据权利要求1的重组乳酸菌细胞，其中所述改良的荧光蛋白为橙色荧光蛋白。

3.根据权利要求1的重组乳酸菌细胞，其中所述改良的流感血凝素基底部包括 H1HA10基底部和T4噬菌体纤维蛋白折叠子。

4.根据权利要求1的重组乳酸菌细胞，其中所述铁蛋白源自幽门螺杆菌。

5.根据权利要求1-4任一项的重组乳酸菌细胞，其中所述编码序列是SEQ ID NOs：1-6中其中之一。

6.根据权利要求5的重组乳酸菌细胞，其中所述编码序列为SEQ ID NO:1。

7.根据权利要求1的重组乳酸菌细胞，其中所述乳酸菌细胞选自包括乳酸杆菌和乳球菌的菌株。

8.根据权利要求1的重组乳酸菌细胞，其中所述表达载体是用于在革兰氏阳性细菌宿主细胞中表达蛋白的表达载体。

9.根据权利要求1或7的重组乳酸菌细胞，其中所述乳酸菌细胞来自干酪乳杆菌。

10.根据权利要求1或8的重组乳酸菌细胞，其中所述表达载体是pTRKH3。

11.根据权利要求6的重组乳酸菌细胞，其中所述两个连接器包括置于所述改良的荧光蛋白与所述改良的流感血凝素基底部之间的第一个连接器，以及置于所述改良的流感血凝素基底部和所述铁蛋白之间的第二个连接器。

12.根据权利要求11的重组乳酸菌细胞，其中所述第一个连接器包含一个Xa 蛋白酶的编码序列、一个KpnI限制位点以及多组氨酸的编码序列。

13.根据权利要求11的重组乳酸菌细胞，其中所述第二个连接器包含TEV蛋白酶的编码序列以及一个AgeI限制位点。

14.根据权利要求11-13任一项的重组乳酸菌细胞，其中所述改良的荧光蛋白和改良的流感血凝素基底部由第一个连接器偶合在一起，所述改良的流感血凝素基底部和所述铁蛋白由第二个连接器偶合在一起。

15.根据权利要求6的重组乳酸菌细胞，其中所述表达载体所表达的重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。

16.一种用于在宿主中诱导针对各类流感病毒产生抗体的重组蛋白，其包括氨基酸序列SEQ ID NO:7 或由SEQ ID NO:2-6中任一个所编码的。

17.根据权利要求16的重组蛋白，其中所述流感病毒包括H1、H3、H5以及其它H类型。

18.根据权利要求16的重组蛋白，其中所述宿主包括细菌、人和动物细胞。

19.使用根据权利要求1-15中任一项的重组乳酸菌细胞制备一种药物的用途，该药物用于治疗受治主体因各种类型流感病毒所导致的流感。

20.根据权利要求19的用途，其中所述药物是经口服向所述受治主体施用。

21.根据权利要求19或20的用途，其中所述药物是经口服向所述受治主体施用，每周连服三天，连续两周服用。

22.根据权利要求21的用途，其中所述主体是小鼠，所述药物包含1 x 10⁹ cfu的所述重组乳酸菌细胞。

23.根据权利要求19或20的用途，其中所述药物是针对所述各种类型的流感病毒包括H1、 H3、 H5其它H型流感病毒的疫苗。

24.根据权利要求19或20的用途，其中所述药物被配制成包括粉末、药丸、胶囊和片剂的剂型。

25.使用根据权利要求16-18中任一项的重组蛋白制备一种药物的用途，该药物用于治疗受治主体因各种类型流感病毒所导致的流感。

26.根据权利要求25的用途，其中所述药物是经口服向所述受治主体施用。

27.根据权利要求25或26的用途，其中所述药物是针对所述各种类型的流感病毒包括H1、 H3、 H5其它H型流感病毒的疫苗。

28.根据权利要求25或26的用途，其中所述药物还包含一种医药学上可接受的载体。

29.使用一种由SEQ ID NO:1-6中任何一个编码的流感血凝素基底部的蛋白质片段以制备一种药物的用途，该药物用于治疗受治主体因各种类型流感病毒所导致的流感。

30.根据权利要求29的用途，其中所述药物是经口服向所述受治主体施用。

31.根据权利要求29或30的用途，其中所述药物是针对所述各种类型的流感病毒包括H1、 H3、 H5其它H型流感病毒的疫苗。

32.根据权利要求29或30的用途，其中所述药物还包含一种医药学上可接受的载体。