CN110381992A - 组合了肺炎球菌表面蛋白A的选择的α螺旋结构域和脯氨酸富集结构域的肺炎球菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明的实施方案提供了涉及新的重组蛋白免疫原的组合物和方法，所述重组蛋白免疫原包含肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的α螺旋结构域(aHD)和脯氨酸富集区(PRD)的特定部分，这些部分被连接以提供aHD‑PRD构建体。选择构成aHD‑PRD构建体的aHD和PRD蛋白，以使交叉反应性最大化并提供针对广谱的肺炎球菌血清型的保护。包含至少一种aHD PRD构建体的免疫原性组合物，包括疫苗，还可以包含非连接的aHD部分。还提供了编码aHD‑PRD构建体的重组核酸分子、包含这样的分子的载体和重组宿主细胞、aHD‑PRD表达产物、这样的核酸分子通过重组技术表达aHD‑PRD构建体的用途、以及表达产物在合适的宿主中引发针对肺炎球菌疾病的免疫应答或保护性应答的用途。

Description

组合了肺炎球菌表面蛋白A的选择的α螺旋结构域和脯氨酸富 集结构域的肺炎球菌疫苗
相关申请
本申请要求2016年12月3日提交的美国临时专利申请第62/429,782号的优先权权益，该临时专利申请通过引用全部并入本文以用于所有目的。
政府许可权
本发明根据由NIH/NIAID授予的第R01AI118805号和第2R56AI021548号基金在政府支持下进行。政府具有本发明中的某些权利。
序列表
本申请包括序列表，所述序列表已经以ASCII格式同时提交并以其整体并入作为本说明书的一部分。
领域
本发明的实施方案涉及重组肺炎球菌蛋白、表达这些重组肺炎球菌蛋白的重组基因构建体以及包含这些蛋白的抗原、免疫原和疫苗。
背景
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，也被称为肺炎球菌，是全世界细菌性肺炎死亡的主要原因。它也是脑膜炎和细菌性血液感染(脓毒症)的主要原因，脑膜炎和细菌性血液感染(脓毒症(sepsis))是被归类为侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的状况。其受害者主要是年幼儿童和年长的成年人。即使在广泛使用疫苗的今天，在美国每年发生约50,000例肺炎球菌菌血症(pneumococcal bacteremia)和5000例脑膜炎。这些患者中超过25％的患者死亡，并且脑膜炎幸存者通常永久受损；并且每年有超过120,000名美国人因未确认脓毒症的肺炎球菌肺炎入院。此外，肺炎球菌是儿童中耳炎(otitis media)的主要原因。
目前批准的疫苗包括数种缀合到蛋白载体(肺炎球菌缀合物疫苗：PCV)或非缀合(肺炎球菌多糖疫苗：PPSV)的肺炎球菌表面多糖(也被称为荚膜抗原)。存在超过八十种肺炎球菌血清型，每种以荚膜抗原为特征；因此，尽管目前的PVC针对数种血清型有效，但它们通常不提供针对疾病的广泛的保护，因为绝大多数荚膜抗原根本未被包括在疫苗中。来自数个国家的数据表明，在引入PCV后，IPD的发病率显著下降至小于前PCV时代(pre-PCV-era)水平的10％；但是最近，婴儿中的IPD率已经超过了前PCV时代水平的一半，并且年长的成年人中的IPD率已经超过了前PCV时代水平。这种增加几乎完全是由于未被PCV覆盖的肺炎球菌血清型。因此，对于具有比目前提供的疫苗更广泛的针对肺炎球菌疾病的覆盖的疫苗存在巨大且增加的需要。最后，关于PPSV，这些疫苗在儿童中不诱导保护性免疫应答，并且在年长的成年人中仅诱导针对被包括在该疫苗中的23种荚膜抗原的弱至中度的应答。
概述
本发明的实施方案提供了一种新的蛋白免疫原，该蛋白免疫原使交叉反应性最大化并提供针对广谱的肺炎球菌血清型的保护。更具体地，本文描述的重组构建体提供经选择的、连接的肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的部分，该部分可以提供针对肺炎球菌疾病的广泛免疫，所述肺炎球菌疾病包括由肺炎链球菌(S.pneumoniae)引起的肺炎、脑膜炎和脓毒症。特别地，这些实施方案提供了新的重组的抗原性和免疫原性蛋白，所述新的重组的抗原性和免疫原性蛋白包含α螺旋结构域(aHD)或其一部分，和脯氨酸富集结构域(PRD)或其一部分，每个结构域来源于不同的肺炎球菌菌株的PspA蛋白；所述重组的蛋白在本文中被称为aHD-PRD构建体。本发明的实施方案还提供了疫苗，所述疫苗包含至少一种aHD-PRD构建体，诸如一种、两种、三种或四种aHD-PRD构建体。所述疫苗还可以包含不与PRD多肽连接的重组aHD蛋白。在包含多于一种aHD-PRD构建体的疫苗中，每种构建体的各自的PRD部分可以选自一种、两种或三种不同的PRD组，所述组先前未被表征过。此外，本发明的实施方案提供了编码构成aHD-PRD构建体的氨基酸的核酸分子(例如DNA)；包含这样的核酸分子的载体；包含这样的核酸分子或载体的重组宿主细胞；这样的核酸分子的表达产物；这样的核酸分子通过重组技术表达aHD-PRD构建体的用途；和表达产物在合适的宿主中引发针对肺炎球菌疾病的免疫应答或保护性应答的用途。
本发明的实施方案的一个方面提供了一种由抗原性aHD蛋白和抗原性PRD多肽的组合组成的人工嵌合蛋白：aHD-PRD构建体。换言之，特定实施方案提供了与PspA的脯氨酸富集结构域或其部分(PRD)连接的PspA的α螺旋结构域或其部分(aHD)(即融合或嵌合蛋白)，其能够诱导针对肺炎球菌疾病的免疫应答(下文，aHD-PRD构建体)。在一些实施方案中，aHD通过直接的末端-到-末端(end-to-end)肽键连接到PRD；即aHD的C末端通过肽键直接连接到PRD的N末端。在一些实施方案中，aHD和PRD通过肽“接头”连接。在其他实施方案中，aHD和PRD经由化学部分连接或缀合。在一些实施方案中，当用作疫苗的组分时，免疫原性aHD-PRD构建体或aHD-PRD构建体的组合提供针对肺炎球菌疾病的保护性免疫。在其他实施方案中，当用作疫苗的组分时，aHD-PRD构建体和非连接的aHD的组合提供针对肺炎球菌疾病的保护性免疫。
另一方面提供了一种用于选择用于包含在多于一种aHD-PRD构建体中的aHD和PRD的方法，所述选择方法使针对病原性肺炎球菌的保护性交叉反应性的可能性最大化。特别地，包含三种不同的PRD组中的一种的aHD-PRD构建体可以基于将这些PRD表征为组的氨基酸序列的模式来选择。在一个实施方案中，所述方法包括(a)从肺炎球菌血清型的第一家族内的第一分支中选择第一aHD以用于包含在第一aHD-PRD构建体中，并从PRD血清型的第一组中选择第一PRD以用于包含在第一aHD-PRD构建体中；和(b)从肺炎球菌血清型的第一家族内的第二分支中或第二家族内选择第二aHD以用于包含在第二aHD-PRD构建体中，并从PRD血清型的第二组中选择第二PRD以用于包含在第二aHD-PRD构建体中。这个方法可以被重复，以选择另外的、不同的aHD和PRD的配对以设计多于一种aHD-PRD构建体。
另外的实施方案提供了用于选择至少一种另外的aHD以用于补充包含至少一种aHD-PRD构建体的组合物的方法，其中aHD不连接到PRD，并且其中非连接的aHD以增加免疫原性交叉反应性的方式进行选择，以用于扩大肺炎球菌菌株的覆盖范围。例如，补充性aHD可以选自在aHD-PRD构建体中未代表的分支或家族。
一个具体实施方案提供了包含多于一种aHD-PRD构建体的抗原性组合物、免疫原性组合物或疫苗，其中aHD和PRD根据本文描述的方法选择。另外的具体实施方案提供了包含三种aHD-PRD构建体的免疫原性组合物或疫苗，其中aHD和PRD根据本文描述的方法选择。
至少一个实施方案提供了免疫原性组合物或疫苗，所述免疫原性组合物或疫苗包含本文描述的至少一种蛋白或构建体，例如至少一种aHD-PRD构建体，和至少一种佐剂。所述疫苗还可以包含至少一种补充性、非连接的aHD。
本发明的实施方案的另一方面提供了如本文描述的疫苗的制剂和递送方法，例如，适用于施用的制剂和施用这样的疫苗制剂的方法。一个实施方案提供了被配制用于肌内(IM)注射的如本文描述的疫苗，即包含至少一种aHD-PRD构建体的疫苗。另一个实施方案提供了被配制用于粘膜施用的如本文描述的疫苗；并且一个具体实施方案提供了可以鼻内(IN)、口服(例如舌下[SL])或通过喷雾到肺支气管中进行施用的制剂。一个具体实施方案提供了一种疫苗，所述疫苗包含被诱捕在纳米凝胶(nanogel)中的至少一种aHD-PRD构建体，所述疫苗用于粘膜表面施用。例如，纳米凝胶可以包含阳离子型具有胆固醇基基团的普鲁兰多糖(a cationic cholesteryl-group-bearing pullulan；cCHP)。
本发明的实施方案的另外的方面涉及包含其他抗原的抗原性组合或免疫原性组合。至少一个实施方案提供了包含至少一种aHD-PRD构建体和至少一种其他抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述其他抗原增强针对肺炎链球菌的免疫应答。一个具体实施方案提供了针对肺炎链球菌的疫苗，所述疫苗包含至少一种aHD-PRD构建体和至少一种其他肺炎链球菌抗原，诸如肺炎球菌溶血素或神经氨酸酶。
本发明的实施方案的另一方面提供了一种表达aHD-PRD构建体的方法，所述方法使用遗传修饰的细胞，包括遗传修饰的微生物来进行。因此，实施方案提供了编码抗原性或免疫原性aHD-PRD构建体的重组核酸(多核苷酸)(诸如DNA分子)。实施方案提供了编码本文描述的aHD-PRD构建体的分离的合成的DNA分子或重组DNA分子(包括cDNA和半合成的cDNA)。
本文描述的重组aHD-PRD构建体提供了可以提供针对肺炎球菌疾病的广泛免疫的选择的PspA的部分，所述肺炎球菌疾病包括由肺炎链球菌引起的肺炎、脑膜炎和脓毒症。特别地，这些实施方案提供了包含PspA的α螺旋结构域(aHD)和脯氨酸富集结构域(PRD)的抗原和免疫原；编码构成aHD-PRD构建体的氨基酸序列的基因或基因的部分，这些基因或基因的部分通过重组技术来表达aHD-PRD构建体的用途，以及它们在疫苗中的用途。本发明的实施方案还涉及包含这些aHD-PRD免疫原性构建体中的一种或更多种的疫苗。
附图简述
图1示出了PspA结构域的结构和PspA与肺炎球菌细菌表面的示意性关系；示出了aHD、PRD和胆碱结合区的位置和相对尺寸，以及PspA与肺炎链球菌的表面结构的关系。
图2A是树形结构图的一个实施方案，绘制了被分析并根据它们的PspA蛋白的aHD中的分支定义区(clade defining region；CDR)的氨基酸同源性进行分组的136个肺炎球菌菌株。还示出了家族组。构建了树形图，使得连接任何两个菌株的垂直线的长度之和(或任何两个分支的平均值)与沿CDR序列的任何位置处的氨基酸取代的可能性成比例，即与CDR同源性的差异程度成比例。图例条(key bar)的长度对应于对于136个分析的物种中的任何物种之间的相同长度的垂直隔距(vertical separation)，每个位点平均0.2个单对氨基酸取代(single-pair amino acid substitution)。参见实施例2。箭头指示在aHD-PRD构建体的四个实施例实施方案中使用的aHD/CDR肽来源于其的菌株。图2B是图2A的分解图，示出了在其PspA蛋白中具有组1PRD(浅灰色字体)的菌株(参见图3A-图3D)；图2C示出了具有组2PRD(黑色字体)的菌株；并且图2D示出了具有组3PRD(灰色字体)的菌株。
图3是根据它们的PspA蛋白的PRD之间的氨基酸同源性进行分组的136个肺炎球菌菌株(与图2A中相同的菌株)的新树形图的实施方案。据我们所知，这是首次以这种方式表征PRD：揭示三个PRD组。组1：粗斜体字体；组2：粗体字体；组3：普通字体；箭头指示提供了如示出的aHD-PRD构建体的四个实施方案的PRD组分的菌株。图3B是图3A的分解图，示出了PRD组1的成员；图3C示出了PRD组2的成员；图3D示出了PRD组3的成员。图3A中的字体表明了PRD之间的多样性可以如何进行分组；并且该信息可以用于设计覆盖每个组并至少在该组内提供交叉反应性的疫苗组分。因为每个PRD组内的大量重复基序以及PRD长度的变化，连接菌株/组的垂直线的总长度没有可靠地估算物种/组之间的位点特异性单对氨基酸取代的可能性，这在图2中对于CDR则是可能的。
图4示出了来自宿主细菌的三种表达产物的高纯度分析(LDS-PAGE)，所述宿主细菌经基因工程化以产生重组aHD-PRD融合蛋白的实施例实施方案。泳道M：蛋白标准品；泳道1：1μg/泳道；泳道2：5μg/泳道；泳道3：10μg/泳道。
图5示出了由每种构建体的抗原特异性血清的浓度表征的交叉反应性。三种aHD-PRD构建体(PspA 01.1、PspA 02或pspA 03)中的每一种的血清抗原特异性IgG ELISA滴度(倒数log2)通过用单一aHD-PRD构建体IM免疫接种兔(每种构建体两只兔，每只根据构建体和后缀“R1”或“R2”命名)来确定。针对非免疫接种的构建体产生的滴度表明了针对不相似的PspA抗原的交叉反应性的程度。参见实施例4。
图6A和图6B示出了在用单独的示例性aHD-PRD构建体进行初次IM免疫接种(白色)和加强IM免疫接种(黑色)后，小鼠(n＝5/组)中的抗原特异性血清IgG应答(n＝5/组，条(bar)表示标准偏差，对于三种构建体中的每一种，两个剂量水平[图6A：3μg/剂量，图6B：10μg/剂量])。y轴：倒数log2ELISA滴度；条表示标准偏差。这些数据说明IM免疫接种引发强烈的抗原特异性全身性IgG应答的能力。
图7A和图7B示出了在用单独的示例性cCHP-aHD-PRD构建体进行初次IN免疫接种(白色)和加强IN免疫接种(黑色)(经鼻施用的纳米凝胶制剂)后，小鼠(n＝5/组)中的抗原特异性血清IgG应答。纳米凝胶复合物(即cCHP-aHD-PRD)通过在两个不同的温度热处理来配制(图7A：40℃；图7B：50℃)。y轴：倒数log2ELISA滴度；条表示标准偏差；根据免疫抗原。这些数据说明了每种经鼻施用的纳米凝胶配制的抗原引发强烈的全身性抗原特异性IgG应答的能力。
图8A和图8B示出了在用三种实施例aHD-PRD构建体一起施用进行IM免疫接种(包括加强免疫)(图8A)或IN免疫接种(包括加强免疫)(图8B)后，小鼠中的抗原特异性血清IgG应答(n＝60/组，IM剂量用明矾(alum)配制，IN剂量用纳米凝胶配制)。y轴：倒数log2ELISA滴度；条表示标准偏差；根据IM组或IN组中的免疫接种的抗原。这些数据表明，aHD-PRD抗原的组合施用引发强烈的全身性抗原特异性IgG应答，并且通过IN纳米凝胶施用产生的应答与通过IM施用产生的应答是等同的。
图9示出了在对照小鼠(非免疫接种的)和针对三种示例性aHD-PRD构建体的混合物进行免疫接种的小鼠中(IM或IN；n＝10/组)在用五种肺炎球菌菌株进行鼻内攻击后的存活曲线。y轴：存活百分比；x轴：用以下菌株的菌落形成单位(CFU)/小鼠进行鼻内感染后的天数：菌株BG8838：1×108CFU；A66.1：1×105CFU；BG12730：1×108CFU；3JYP2670：1×106CFU；ATCC6303 1×107CFU。○对照；▲IN；■IM；*被PCV13和PPSV23不良覆盖；**不被PPSV23覆盖。这些数据表明，用三种aHD-PRD构建体进行IM免疫接种或IN纳米凝胶免疫接种保护抵抗肺炎球菌疾病。保护甚至延伸抵抗具有疫苗抗原中未代表的PspA aHD分支的菌株，以及抵抗不被目前疫苗覆盖的荚膜类型。
详细描述
应当理解，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
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所有值都是近似的，因为在载体分子(例如纳米凝胶)或佐剂(例如明矾)与抗原的比、这些载体分子、佐剂和抗原的精确组成以及配制过程中存在一些波动。因此，除了在操作实施例中，或者在另外指出处，否则在所有情况下，本文使用的表示量或反应条件的所有数字都应当理解为由术语“约(about)”修饰，除非相反地陈述；“约(about)”通常是指指定值的±1％，但是可以考虑到指定值的±5％或±10％是本领域技术人员在相关上下文中接受的。
重组DNA技术可以根据本领域已知的标准方案进行。参见例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:LAB.MANUAL(第二版，Cold Spring Harbor Lab.Press,NY,1989)；Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS MOLEC.BIOL.(1994及更新)；DNA CLONING:PRACTICALAPPROACH,第1-4卷(Glover&Hames编辑,IRL Press 1995,1996),Croy,PLANTMOLEC.BIOL.LABFAX(BIOS Sci.Pub.Ltd.&Blackwell Sci.Pub.,UK,1993)；WO2015089587。
标题仅为方便而提供，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的那些术语具有相同含义。本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。为了可以更容易地理解本公开内容，定义了某些术语；另外的定义在整个详细描述中陈述。
抗原是被免疫应答的产物识别的物质。在适当的条件下，抗原能够充当免疫原：在体内诱导特异性免疫应答；并且因此，抗原能够与该应答的产物反应。一般而言，特异性免疫应答产物可以是特异性结合抗原的抗体，或者是被敏化以对抗原反应的T淋巴细胞。抗原包括外来物质，诸如细菌、病毒、真菌或其他微生物的蛋白或其部分(多肽或肽)、核酸或多糖。
交叉反应性通常是指对特定抗原的免疫应答还覆盖其他抗原的程度。引发最具保护性的应答的抗原或病原体通常趋于是结构上可变的。在疫苗旨在产生针对传染性微生物的保护性应答的情况下，交叉反应性通常是指对疫苗中特定抗原的免疫应答产生不仅与免疫抗原反应，而且还与病原生物的不同菌株中的相同抗原的更广泛系列的变体反应的抗体的程度。因为商业上生产包含这样的抗原的所有变体的疫苗通常是不现实的，所以从有限数量的菌株中仔细选择高度交叉反应的一定数量的抗原变体可以诱导针对具有抗原的许多不同变体的菌株反应的抗体。在肺炎球菌的情况下，荚膜多糖抗原(即目前疫苗中的抗原)具有低交叉反应性。一些蛋白抗原，特别是PspA，具有高交叉反应性。
免疫应答(免疫原性应答)是受免疫系统的成分(element)影响的对抗原的宿主应答。免疫系统的元件中最常参与免疫应答的是白细胞(leukocyte)(白细胞(white cell))，由嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞及其子代和淋巴细胞组成。淋巴细胞继而可以分为自然杀伤细胞；产生抗体的b细胞；和T细胞，其中存在调节或增强免疫应答的各个方面的各种类型。大多数疫苗被设计为引发适应性免疫应答，包括将疫苗抗原识别为“外来的”，随后产生与这些抗原反应的抗体分子或T细胞。有效的抗体和T细胞反应可以导致展示这种抗原的病原体的破坏。有效的抗体应答还可以干扰在病原体的表面上或由病原体释放的毒力分子的功能。
免疫原是能够产生免疫应答的物质，通常是抗原。更具体地，免疫原是指能够引发生物的免疫系统免疫应答的分子，而抗原是指能够结合该免疫应答的产物的分子(半抗原)。因此，免疫原通常是抗原，但抗原可能不一定是免疫原。因此，免疫原性是诱导体液或细胞介导的免疫应答的能力。例如，当B细胞被免疫原活化时，它分化成产生与抗原结合的抗体的血浆B细胞。在肺炎球菌疫苗的情况下，荚膜多糖是抗原，但在婴儿中不用作免疫原，除非缀合到蛋白载体。
疫苗是用于诱导免疫应答的组合物，通常用于提供针对特定疾病的特异性和保护性免疫，而不引起该疾病的严重形式。在针对传染性疾病的疫苗的情况下，疫苗通常包含与引起疾病的病原体的抗原相似的剂。通常，这种剂是弱化的(减毒的)或灭杀的形式的病原体、其类毒素(无毒形式的毒素)或其表面蛋白或表面多糖中的一种。该剂模拟病原性免疫原，并刺激机体的免疫系统，将病原体识别为外来的(即抗原)并将其破坏，或破坏包含病原体的细胞。理想地，疫苗还引起免疫系统“记住”免疫原和产生免疫原的病原体，因此免疫系统将来将更容易地识别并中和病原体的抗原。疫苗组合物可以以任何适当的形式配制，并且可以包括药学上可接受的赋形剂，诸如稀释剂或载体或其他成分。赋形剂通常不有助于本发明的实施方案的免疫原在施用后引发的效果；但是预见了有助于或调节本发明的免疫原性构建体的效果的成分或化合物：特别是佐剂。本领域技术人员可以确定这样的合适的赋形剂，这些赋形剂是熟知的，并且在人和动物疫苗的情况下，是FDA批准的。疫苗可以以适当的剂型经由注射、摄入、涂覆至皮肤或涂覆至粘膜表面施用。
如上所述，本发明的实施方案提供了针对肺炎链球菌的新的抗原、免疫原和疫苗，肺炎链球菌是全世界细菌性肺炎死亡的主要原因，是IPD的主要原因，并且是儿童中耳炎的主要原因。
基于覆盖细菌细胞壁的抗原性荚膜多糖，已经鉴定出近100种肺炎球菌血清型。目前的肺炎球菌疫苗包含数种荚膜多糖的混合物。最早批准的肺炎球菌多糖疫苗(称为PPSV14或疫苗，于1977年由FDA批准)包含来自十四种常见肺炎球菌血清型的荚膜多糖。这些抗原是非缀合的，意思是多糖未附接(缀合)到用作免疫系统共刺激剂的蛋白。后来，引入了PPSV23疫苗(23疫苗，于1983年由FDA批准)，包含另外九种非缀合的多糖荚膜抗原。然而，年龄在2岁以下的儿童通常对这些疫苗中的非缀合的荚膜抗原无反应。Wald,40Clin.Pediatr.601(2001)。此外，在具有存在的医疗状况的更大的儿童中保护较低。在年龄超过65岁的成年人中，PPSV23将发展与脓毒症相关的肺炎的风险减少了约45％；但是不减少肺炎的总体风险，并且可能不减少疫苗接种三年内的总体死亡风险。Jackson等人，348N.Engl.J.Med.(2003)；Ladhani等人，58Clin.Infect.Dis.517(2014)。
较新的疫苗包含缀合到共刺激免疫系统的蛋白分子的荚膜多糖。这些肺炎球菌缀合物疫苗(PCV)活化T细胞免疫应答和产生抗体的B细胞(体液)应答两者。已经显示，由于覆盖的血清型，PCV将婴儿中IPD的风险减少了超过95％。在年龄超过66岁的成年人中的一项大型研究表明，PCV免疫将疫苗覆盖的血清型引起的脓毒症相关肺炎的风险减少了75％，同时由于覆盖的血清型，将不具有脓毒症的肺炎的风险减少了约45％。Bonten等人，372N.Engl.J.Med.1114(2015)。
尽管第一种PCV疫苗(PCV7或疫苗，于2000年由FDA批准)中的七种血清型被选择来覆盖当时最常见和毒力最强的血清型，但由于未覆盖的血清型的疾病的发病率很快开始在疫苗增强的人口免疫中增加，该现象被称为血清型替代。作为回应，又多添加了六种血清型来制备PCV13(疫苗，于2010年由FDA批准)，PCV13已经替代PCV7在大多数发达国家中作为护理标准。尽管由于新覆盖的六种血清型，疾病下降，但血清型替代持续不减，并且疾病率可能因为除了由PCV13覆盖的十三种之外的血清型而上升。更具体地，来自数个国家的数据表明，尽管IPD的发病率在引入PCV7后显著下降——降至小于前PCV时代的发病率的10％——但那些发病率最近在婴儿中已经超过前PCV疫苗时代水平的一半，并且在年长的成年人中已经超过了前PCV时代水平。这种增加几乎完全是由于非PCV-13覆盖的血清型。CDC,PINK BOOK第13版(2015)；Leputre等人，33Vaccine 359(2015)；Public Health England(2016年3月4日)。
因此，对于具有比PCV13更广泛的覆盖的肺炎球菌疫苗存在巨大且增加的需要。从长远来看，简单地向PCV13添加许多另外的荚膜多糖抗原可能会失败，因为：(1)缀合多糖抗原的过程技术复杂；并且(2)随着更多抗原被添加，针对现有的十三种荚膜抗原中的每一种的免疫应答可能减弱，该现象被称为抗原竞争。Paton&Bosiego,PROTEIN VACCINES 421(Siber编辑,ASM Press,2008)；Andrews等人，14Lancet Infect.Dis.839(2014)。
肺炎球菌蛋白可以提供对常规PPSV和PCV疫苗的免疫原性替代物。已经鉴定出肺炎球菌表面附近的数种抗原性蛋白(参见图1)。肺炎球菌表面蛋白A(PspA)在抗原性、表面暴露、免疫原性、其各种菌株间的交叉反应性、以及作为疫苗的一些开发已经发生的程度的方面是其中最有希望的。参见美国专利第6,592,876号(Briles等人，2003)和第5,997,882号(Briles等人，1999)；Ginsberg等人，11Expert Rev.Vaccines 279(2012)；Moreno等人，17Clin.Vaccine Immunol.439(2010)；Daniels等人，40Microbial Path.228(2006)。在其天然状态下，PspA功能为减少肺炎球菌诱导的补体活化，并且因此是被感染的宿主中肺炎球菌的存活和毒力的主要因素。PspA距离肺炎球菌表面的最远端的延伸部分(即PspA的N末端区域)由被称为α螺旋结构域(aHD)的280个至380个氨基酸组成(参见图1)。PspA的所有区域中，aHD在作为疫苗抗原的安全性和功效方面已经被最多地研究。美国专利第6,592,876号、第6,638,516号(Briles等人，2003)；Briles等人，18Vaccine1707(2000a)；Hollingshead等人，68Infect.Immun.5889(2000)；Nabors等人，18Vaccine 1743(2000)。
最近，PspA的脯氨酸富集结构域(PRD)也已经被显示是免疫原性的，所述脯氨酸富集结构域(PRD)从aHD的近端的C末端延伸至细菌细胞膜。美国专利第8,808,704号(Hollingshead&Briles,2014)；Daniels等人，78Infect.Immun.2163(2010)。然而，先前的研究未完全鉴定或表征PRD的多样性，未检查PRD交叉反应性，也未试图将PRD整合到如本文描述的基于免疫原性aHD-PRD构建体的疫苗中。
关于开发有效的PspA疫苗的一个挑战是，诱导针对病原性肺炎球菌上发现的大多数形式的PspA的强交叉反应性；同时使用相对小的数量的不同的PspA蛋白的抗原性区域来避免抗原竞争，并提供易于制备的疫苗。这些设计挑战不是基于PspA的疫苗独有的，而是对于大多数疫苗的设计和制备仍然具有挑战性。
已经报道了aHD的近端(C末端)30％是其免疫原性最强的区域。Hollingshead等人，2000。aHD的这个部分被称为PspA的分支定义区(CDR)。基于其分支定义区(CDR)的氨基酸序列，aHD可以分组为两个主要家族，共占已知的病原性亚型的约98％。取决于它们的氨基酸序列，这些家族可以继而分组为五个分支(分支1和分支2构成家族1；分支3、分支4和分支5构成家族2)。第三个家族仅由分支6组成，并且仅占从患者分离的肺炎链球菌的约2.2％(Hollingshead等人，2000；Vela Coral等人，7Emerging Infect.Dis.823(2001)；Hotomi等人，PloS one 8:e58124(2013)，并且136个独特的肺炎链球菌菌株中仅3个菌株的PspA基因序列在本文中被表征(参见实施例2)。来自相同分支的aHD共有相似的氨基酸序列，而来自不同家族中的分支的aHD共有最少的同源性。Hollingshead&Briles,2000。图2是我们分析了其PspA基因序列的136个肺炎球菌菌株的树形图。它示出了这些菌株根据构成其CDR的氨基酸之间的同源性来绘图。这证实了将CDR聚类为三个家族(其中两个具有临床意义)和六个分支(其中五个具有临床意义)的早期研究。
意外地，该研究还表明，同一分支中许多菌株的CDR是相同的，并且甚至更大数量是相似的。这表明，包含在一定数量的临床上重要的菌株中共有的CDR的aHD可能是疫苗抗原的主要候选。此外，图2能够近似量化任何肺炎球菌家族、分支或表征的菌株的CDR之间的同源性的程度(参见实施例2)。因此，图2A-图2D中的树形图及其中的细节图为策略性选择有限数量的aHD(及其高抗原性CDR)提供了新的和有利的指导，以包括aHD(及其高抗原性CDR)作为疫苗抗原从而使所选择的aHD和疫苗中未包括的肺炎球菌菌株的aHD之间的交叉反应性最大化。
与具有低免疫交叉反应性的多糖荚膜抗原不同，通过暴露于特定aHD引发的抗体通常显示出交叉反应性；不仅针对来自同一PspA分支的肺炎球菌，还针对来自同一家族中的不同分支的肺炎球菌(美国专利第6,638,516号；McDaniel等人，59Infect.Immun.222(1991)；Nabors等人，2000；Vela Coral等人，2001，Darrieux等人，75Infect.Immun.5930(2007)；并且甚至，在一些免疫aHD的情况下，针对来自不同PspA家族的肺炎球菌(Roche等人，71Infect.Immun.1033(2003),Darrieux等人，57J.Med.Micro.273(2008)，Moreno等人，2010，Fukuyama等人，2015)。使用来自图2的新指导，这种针对具有不同aHD的肺炎球菌的交叉反应性支持目前的策略，选择可以保护抵抗广泛范围的病原性肺炎球菌的相对少量的aHD作为疫苗的组分。
重要且相当意外地，对许多肺炎球菌菌株中的PRD的氨基酸序列的分析揭示了PRD可以基于包含PRD的氨基酸的序列被表征为三种不同的组中的一种(图3A-图3D)。在这些组中的每个组中，不仅序列同源性高，而且重复的氨基酸序列的特征基序也经常出现(表1-表4)。意外地，来自每组内不同肺炎球菌菌株的许多PRD是相同的，这有助于缩小包含在疫苗中的可能的PRD抗原的范围。这些PRD(或其部分)中的至少一些是抗原性的(下文实施例4-6)(还参见美国专利第8,808,704号；Daniels等人，2010)。因为PRD组内的重复基序的高度相似性，PRD组内的交叉反应性可能被证明较高。因此，包含来自三组中的每个组的至少一种PRD的疫苗具有诱导覆盖病原性肺炎球菌的许多菌株的免疫应答的更高的可能性。图3A-图3D为我们分析了其PRD的136个肺炎球菌菌株提供了新的树形图及其细节。因此，图3A-图3D中的树形图为作为疫苗抗原包含的有限数量的PRD的策略性选择提供了新的和有利的指导，因此使所选择的PRD和疫苗中未包括的肺炎球菌菌株的PRD之间的交叉反应性最大化。
本发明的实施方案还能够证实某些PRD特征是增强还是减弱免疫原性。例如，PRD组2多肽的长PKPAPA(SEQ ID NO:7)重复特征可能比组1和组3中发现的更多样的基序，特别是表征组3的非脯氨酸嵌段(NPB)的免疫原性更小。Daniels,2010。如指出的，PRD的选择还可以通过图3来指导，图3提供了一种新的方法，表明在特定的PRD组内如何选择与同一组中的其他PRD的同源性相对接近的特定PRD作为疫苗候选。在其他因素(诸如长度)相同的情况下，这可以使与至少其他同组PRD的广泛的交叉反应性的可能性最大化。
通过将从三个PRD组中的每个组中选择PRD(或PRD的部分)与从aHD家族中的每个家族中选择高度免疫原性和交叉反应性的aHD(或其部分)组合来提供单一疫苗，我们可以产生保护抵抗几乎所有病原性肺炎球菌菌株的强的、冗余的(redundant)、交叉反应性免疫。
根据这个推理，至少一个实施方案提供了重组蛋白构建体，所述重组蛋白构建体组合了分别是高度免疫原性和交叉反应性的单一aHD(或其部分)和单一PRD(或其部分)(实施例4和实施例5，图6-图7)。此外，至少一个实施方案在一个疫苗程序中提供了多于一种aHD-PRD构建体的组合：在实验动物中，无论全身施用(例如IM)还是使用本文描述的纳米凝胶制剂鼻内施用(IN)，相对少量的aHD-PRD构建体，例如三种aHD-PDR构建体，针对广泛范围的攻击菌株保护测试受试者。在保护性攻击中使用的菌株不仅代表不同的PspA分支和PRD组，而且代表不同的荚膜多糖菌株。具体地，例如，本发明的实施方案提供了一种疫苗，所述疫苗保护针对PCV13或PPCV23不良地覆盖的菌株(实施例6)。因此，用约三种不同的aHD-PRD构建体的混合物进行免疫接种可以保护抵抗大多数病原性肺炎球菌。
此外，每种疫苗构建体中的aHD和PRD亚区段不必来自同一肺炎球菌菌株，而是可以为了最佳交叉保护来更广泛地选择。例如，一些最具抗原性的aHD-PRD构建体组合了来自不同的PspA分支或有时来自不同的PspA家族的aHD和PRD。
尽管已经表明肺炎球菌疫苗可以包括如PspA蛋白中的aHD连同其天然存在的PRD(专利公布US20150320851；Piao等人，32Vaccine 5607(2014)；Darrieux等人，2007)，这些出版物并没有提及表征不同的PRD组的概念，或从所述三种不同的PRD组中尽可能多地适当地选择PRD。实际上，据我们所知，PDR同源性先前未被如图3A中提供的表征或绘图。这些出版物也未教导或表明本发明的aHD-PDR构建体的嵌合融合蛋白。这些出版物也未提及相对简单并容易制造的疫苗：包含相对少量的还使抗原竞争的风险最小化的嵌合抗原性蛋白的组合物。简言之，这些出版物未教导或表明从少至三种易于制造的重组aHD-PRD构建体中产生有效的(且通用的)肺炎球菌疫苗，其中每种重组aHD-PRD构建体大小不超过60千道尔顿(kDa)。
本文描述的疫苗实施方案不仅当全身注射(即肌内(IM)，如同大多数疫苗的情况)时诱导保护，而且当应用于鼻和口腔粘膜表面时诱导保护。先前的研究已经表明，IM施用aHD的人产生保护小鼠抵抗原本致命的肺炎球菌攻击的抗体。Briles等人，182J.Infect.Dis.1694(2000b)。还已经表明，使用Al(OH)3作为佐剂的aHD抗原的IM制剂在人类中是安全的。Briles等人，2000a；Nabors等人，2000。
关于IN免疫，本发明的实施方案的IN粘膜制剂包括已经添加有疏水性胆固醇侧链的亲水性多糖作为递送分子。这样的递送分子的实施方案还在其表面上或附近包括带正电荷的官能团，诸如阳离子氨基基团。这使抗原递送分子复合物能够在带负电荷的鼻粘膜表面上保留更长时间。该递送分子的另一个实施方案包含亲水性多糖普鲁兰多糖，普鲁兰多糖是一种麦芽三糖单元的聚合物。普鲁兰多糖已经被用作化妆品和药物包衣中的抗氧化剂，用作食品添加剂和防腐剂，以及在漱口水诸如漱口水或LISTERINE呼吸条(breath strip)中使用。因此，鼻递送分子的具体实施方案是阳离子型具有胆固醇基基团的普鲁兰多糖(cCHP或纳米凝胶)。参见美国专利第8,961,983号(Akiyoshi等人，2015)；WO 2015/122518(Kiyono等人，2015)。cCHP的制造实施方案在实施例5中描述。
先前的报道表明，包含被诱捕在cCHP分子中的单一aHD抗原的鼻制剂在小鼠和非人类灵长动物中引发了强烈的保护性免疫应答。Kong等人，81Infect.Immun.1625(2013)；Fukuyama等人，8Mucosal Immun.1144(2015)。除了保护抵抗致命攻击之外，IN免疫接种引发了有助于整体的长期免疫的T细胞免疫应答，并且还防止了小鼠的鼻道中的细菌定植。基于cCHP的IN免疫接种的成功可能是因为纳米凝胶显然既保护了蛋白免疫原，又延长了其在鼻粘膜表面上的存在，因此使其能够逐渐吸收到粘膜中并被粘膜基底膜处的树突细胞吸收。Nochi等人，9Nat.Mats.572(2010)；Kong等人，2013；Fukuyama等人，2015。无论cCHP中隔离的抗原是aHD-PRD构建体还是非连接的aHD，这个特征都适用。向非人类灵长动物施用这种IN制剂未与任何不良影响相关。特别地，未观察到纳米凝胶或抗原渗透到嗅球或中枢神经系统的其他部分。Fukuyama等人，2015。
当在重组宿主细胞中产生时，本文描述的aHD-PRD构建体是稳定的。aHD-PRD构建体可以在无细胞表达系统或重组宿主细胞中表达，诸如细菌(例如大肠杆菌(Escherichiacoli)B菌株、大肠杆菌(E.coli)K12菌株、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))；杆状病毒(Baculovirus)；真菌，诸如卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)或酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris))；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或其他哺乳动物表达系统；植物表达系统；和本领域已知的其他重组表达系统。这样的表达所需的基因工程的方法是本领域技术人员已知的。在细菌表达系统的情况下，细菌被基因工程化以包含编码期望的aHD-PRD构建体的载体(质粒)(参见实施例3)。本文公开了以高纯度和高产量获得的在重组细菌中表达的特定aHD-PRD构建体的四个实施方案(参见例如图4)。除了在重组表达系统中产生之外，本发明的实施方案的免疫原可以通过完全合成的手段或者通过重组和化学合成技术的组合来产生。
为了通过在重组宿主中表达产生构建体，基于参考图2A-图3E、本文提供的氨基酸序列和遗传密码的知识，本领域技术人员可以设计编码这样的融合蛋白的核酸分子(例如DNA)；任选地针对在期望的宿主细胞系统中的表达进行优化。例如，编码PspA01.1的基因可以通过从头合成来获得：通过参考SEQ ID NO.1的氨基酸序列，技术人员可以将所选择的序列反向翻译为核酸序列，并相应地合成该分子。技术人员还可以引入一个或更多个突变，包括对所选氨基酸序列或对应的核酸序列的插入、取代和缺失。对于反向翻译，技术人员通常可以使用反映旨在用于表达的宿主系统的密码子频率的核酸密码子。“密码子优化的”在本领域中被充分理解：密码子优化的核酸(多核苷酸)与该序列来源于其的生物中的核酸序列相比被修饰，使其适合在一种或更多种宿主物种中的密码子使用。通常，多核苷酸，特别是编码区，通过用计划的宿主生物的基因中更经常地使用的至少一个密码子替换至少一个密码子，来适合于在给定生物(诸如细菌菌株)中表达。
参考核酸分子或多核苷酸还包括本文讨论的特定多核苷酸的变体或衍生物，包括多核苷酸的直系同源物、旁系同源物或其他同源物、或其变体或衍生物。核酸变体或衍生物与给定参考多核苷酸的区别在于至少一个核苷酸取代、添加或缺失。这样的变体是可获得的，例如通过基于PCR的技术，诸如基于混合寡核苷酸引物的DNA扩增，即，使用针对aHD蛋白或PRD多肽的保守结构域的简并引物。当参考多核苷酸编码抗原性或免疫原性蛋白，特别是嵌合aHD-PDR构建体或其部分时，所编码的多肽的抗原性性质应当在变体或衍生多核苷酸中保守，使得变体核酸编码具有如本文讨论的抗原性或免疫原性特征的多肽。本发明的实施方案的多肽的保守结构域在本文中详细讨论，并且可以通过它们的核酸或氨基酸序列的序列比较来鉴定，特别是使用图2和图3作为参考，用于选择交叉反应性免疫原性结构域。
变体或衍生物还包括互补物和其他多核苷酸，所述其他多核苷酸包括通常在严格杂交条件下能够与本文描述的具体核酸分子杂交的核酸分子。严格条件是熟知的，并且技术人员知晓如何通过参考标准文本诸如上文引用的那些来确定杂交条件。
此外，变体包括包含与序列表中示出的核酸至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或其间任何％相同的序列或者从序列表中提供的氨基酸序列可获得的序列的多核苷酸；并且注意可接受的抗原性或免疫原性被保留。相似地，如本文描述的多肽或蛋白的功能性同源物可以与本文描述的肽、多肽或蛋白至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或其间任何％相同。这些百分比同一性值通常在整个蛋白或核酸分子上计算。使用各种算法的许多计算机程序是本领域技术人员可得的，用于比较不同的核酸或多肽的序列。
此外，不考虑在其他多肽的序列中的氨基酸的发生率(occurrence)，取代例如选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的一个的蛋白的氨基酸，以下适用，其中字母表示L-氨基酸，使用它们的常见缩写(替换通常按优选顺序列出)：A可以被S或C、G、T或V替换；C可以被A替换；D可以被E或N、Q或S替换；E可以被D或Q，或被K、H、N、R或S替换；F可以被Y或被W、I、L或M替换；G可以被A、N或S替换；H可以被Y、或被N、E、Q或R替换；I可以被V或L、或被M或F替换；K可以被R、或被E、Q、N或S替换；L可以被I或M、或被V或F替换；M可以被L、或被I、V、F或Q替换；N可以被D、H、S、E、G、K、Q、R或T替换；Q可以被E或被K、R、D、H、M、N或S替换；R可以被K、或被Q、E、H或N替换；S可以被A、N、T、D、E、G、K或Q替换；T可以被S、A、N或V替换；V可以被I、或被L、M、A或T替换；W可以被Y或F替换；并且Y可以被F、H或W替换。然而，必须理解，本文描述的蛋白构建体的抗原性或免疫原性特征对于在其中引入这样的取代的任何多肽或蛋白仍然至关重要。实际上，这样的取代策略将可能通过参考诸如图2A-图3D中示出的本文呈现的共同基序或模式而获益。因此，本发明的实施方案的蛋白可以包括增强免疫原性的氨基酸取代、缺失或添加。
为了在重组宿主中表达，表达盒包括在载体中，所述表达盒包含编码感兴趣的特定蛋白例如aHD-PDR构建体的核酸分子，和适当的调节控制区(例如启动子、终止子)，所述载体可以是噬菌体、质粒、或病毒载体、或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体可以是表达载体，其包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的可操作地连接到表达控制序列的感兴趣的多核苷酸(表达盒)。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；即使克隆载体被设计用于在一种宿主中复制，而表达盒被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
aHD-PDR构建体的数个实施方案已经在动物中进行了测试(图6至图10)，并且是用于包含在人类疫苗中的免疫原性候选。在以下特定构建体的讨论中，它们的指示物、aHD分支和PRD组起源以及氨基酸序列如下(PRD组为粗体。对于每种构建体，aHD序列终止于PRD开始处)：
PspA01.1(aHD来自分支2[家族1]，PRD来自组2)，长度：384个氨基酸，分子量：41kDa：
PspA01.2(aHD来自分支2(家族1)，PRD来自组2)，长度：356aa，分子量：39kDa：
PspA01.3(aHD来自分支2(家族1)，PRD来自组3(部分的))，长度：302aa，分子量：33kDa：
PspA02(aHD来自分支3(家族2)，PRD来自组1)，长度：495aa，分子量：55kDa：
PspA03(aHD来自分支4(家族2)，PRD来自组3)，长度：430aa，分子量：48kDa：
关于表达程序和抗原产量的细节在实施例3中讨论。包含其他aHD(包括来自分支1(家族1)和分支5(家族2)的aHD)和其他PRD的另外的aHD-PRD构建体适用于包含在aHD-PDR构建体中。
用aHD-PRD构建体的三个单独的实施方案免疫接种兔诱导了强烈的免疫原性，如通过抗原特异性血清IgG应答示出的。此外，具有家族2aHD的两种构建体引发了彼此交叉反应良好的抗体，尽管所述构建体来自不同的aHD分支(图5)。
使用本领域技术人员已知的程序，我们使用铝化合物作为佐剂制备用于IM施用的制剂。更具体地，这样的制备通常涉及在铝凝胶诸如氢氧化铝(Al(OH)3)或磷酸铝(AlPO4)上吸附aHD-PRD构建体，或者在硫酸铝钾(AlK(SO4)2)上沉淀aHD-PRD构建体。参见例如，Lindblad,2004。本文描述的并用AlK(SO4)2或Al(OH)3制备的单独的aHD-PRD构建体在小鼠中引发了强烈的抗原特异性血清IgG应答，包括在施用加强剂量后持续的强烈的记忆应答(图6；实施例4；实施例6)。
本文描述的实例aHD-PRD构建体还使用在别处描述(Nochi等人，2010；Kong等人，2013；Fukuyama等人，2015)并在实施例5中概述的程序配制用于鼻内递送。每种制剂包括被诱捕在阳离子型具有胆固醇基基团的普鲁兰多糖(cCHP或纳米凝胶)分子的交联结构中的aHD-PRD构建体的实施方案。制剂被用作疫苗，通过将制剂滴加到小鼠或其他实验动物的鼻子中施用。这种IN递送制剂在小鼠中引发了强烈的抗原特异性血清IgG应答，包括在用加强剂量进行疫苗接种后的持续的记忆应答(图7；实施例5和实施例6)。
迄今为止，使用实验动物的研究中没有一项指示对cCHP纳米凝胶制剂的显著的不良反应。特别地，对IN施用至非人类灵长动物的放射性标记的cCHP-aHD的PET研究示出了未吸收到嗅球或其他CNS结构中。Fukuyama等人，2015。这提供了保证，即IN施用不具有过去注意到的CNS炎症的类型的风险：当将包含佐剂诸如不耐热的肠毒素的疫苗向人类IN施用时(Mutsch等人，350N.Engl.J.Med.896(2004))，或者将具有霍乱毒素佐剂的抗原向小鼠IN施用时(van Ginkel等人，165J.Immunol.4778(2000))。
由本文描述的aHD-PRD构建体诱导的免疫应答在IM和IN制剂两者中都是保护性的，不仅针对具有与免疫aHD-PRD构建体的那些相同的aHD或PRD的肺炎链球菌菌株，而且针对具有不同的aHD或PRD的攻击菌株。换言之，我们已经示出了aHD-PRD构建体产生交叉反应性保护性免疫(实施例6)。此外，这种免疫延伸至未被当前的疫苗覆盖的肺炎球菌菌株。
实施例
用于实施本文公开的方法的以下成分、制剂、方法和程序对应于上文描述的成分、制剂、方法和程序。根据本公开内容，其他实施方案和用途对本领域技术人员而言将是明显的。以下实施例仅作为各种实施方案的说明提供并且不应被解释为以任何方式限制本发明。
实施例1：三个PRD组的表征和PRD抗原选择
PRD是一种相对短的多肽，长度通常在60和100个氨基酸之间。认为PRD在aHD的末端处以一系列脯氨酸的首个脯氨酸起始，在所述一系列脯氨酸中散布有其他氨基酸，这些氨基酸形成若干基序，所述基序在PRD内和PRD之间重复，并且PRD通常(但不是唯一地)以氨基酸残基PKT结束。参见图1。我们从美国国家医学图书馆(U.S.National Library ofMedicine)在线提供的BLAST服务器上发布的208个完整的PspA序列中鉴定并分析了124个独特的PspA序列。这些PspA序列占据公共数据库上可得的大多数独特的PspA基因组序列。我们向这124个多肽序列添加了先前已经分析过(Hollingshead等人，2000)，但未包括在从国家医学图书馆在线BLAST服务器获得的那些序列中的12个PspA多肽序列。我们从这总计136个PspA氨基酸序列中提取了PRD序列，并使用Blosum30氨基酸矩阵在Geneious v7.1.7中对它们进行比对。这之后，我们使用邻接(Neighbor Joining)(NJ)法构建了系统树图。
出乎意料地，这个方法鉴定出三个不同的PRD“组”，如图3A-图3D和表1-表3中示出的。我们还鉴定出短重复基序，每个短重复基序长度约6-8个氨基酸，所述短重复基序连同22个氨基酸的非脯氨酸区(non-proline block)(NPB)一起表征每个PRD多肽的大部分。五个短重复基序是PKPEQP(SEQ ID NO:5)、QPAPAP(SEQ ID NO:6)、PKPAPA(SEQ ID NO:7)、EKPAPAP(SEQ ID NO:8)和PEKPAE(SEQ ID NO:9)，并且这些基序在表1-表4中示出。NPB通常是QQAEEDYARRSEEEYNRLPQQQ(SEQ ID NO:10)或QQAEEDYARRSEEEYNRLTQQQ(SEQ ID NO:11)。NPB还具有高度保守的侧翼区，所述侧翼区通常由PRD内的每侧四个氨基酸组成。
三个PRD组中的每个组都具有这些基序的不同模式。这可以从表1、表2和表3中看出，它们分别提供了组1、组2和组3的PRD的氨基酸序列和基序。这些序列中的绝大多数先前都未被鉴定过；已知的氨基酸序列仅在它们被包括在新的重组aHD-PRD构建体中或提供新的免疫原性肽的程度上被本文的实施方案所包含。表1呈现了许多组1PRD多肽的氨基酸序列，其中不同的重复基序通过不同的字体来示出：
如从表1中可以看出的，组1中的五十个序列中的每个序列都显示出两个基序的特征性重复：PKPEQP(SEQ ID NO:5)和QPAPAP(SEQ ID NO:6)，它们彼此邻近并通常重叠。还参见表4。
PRD组2多肽中的二十一种氨基酸序列(表2)显示出PKPAPA(SEQ ID NO:7)的特征性的多于一个重复，除了两个序列代替地以EKPAPAP(SEQ ID NO:8)的多于一个重复为特征。在其他十九种组2多肽的氨基酸序列中，PKPAPA(SEQ ID NO:7)通常示出为线性串联重复，从而也重复了基序KPAPAP(SEQ ID NO:8的残基2-残基7)——其他组2序列的串联重复特征。这解释了以EKPAPAP(SEQ ID NO:8)或PKPAPA(SEQ ID NO:7)重复为特征的序列如何可以被容易地认为属于单一组。还参见表4。PRD组2多肽和指示的基序在表2中示出：
PRD组3中的六十五种序列(表3)具有最大的基序多样性；其中没有一个基序被串联重复。此外，组3序列中的每种序列都包含单一的NPB，并且NPB仅在组3多肽中可见：
表4总结了三个PRD组中的每个组中的每种PRD中的共同基序及其出现频率(至少一次)；因此，表4示出了每个基序在每个PRD组中的每种多肽中出现至少一次的可能性：
先前报道了NPB多肽趋于是高度免疫原性的，参见美国专利第8,808,704号。还报道了针对PKPEQP(SEQ ID NO:5)基序(经常可见于组1PRD中)的单克隆抗体保护小鼠抵抗肺炎球菌攻击。Daniels等人，2010。本文特别是实施例4-实施例6提供的信息，提供了部分和完整PRD多肽的其他部分的免疫原性的证据。本发明的实施方案支持表征各种基序、基序的组合和完整多肽的免疫原性的另外的和正在进行的研究。
将PRD明确分为三个组以及每组内共同基序的频率表明，掺入来自每个组的一种PRD的疫苗应当能够生成针对大多数肺炎球菌菌株的交叉保护性免疫。这是因为来自特定组的PRD应当能够产生针对具有来自同一组的其他PRD——换言之，具有和疫苗PRD共有许多相同基序的PRD——的肺炎球菌的交叉保护性免疫。因此，包含来自如本文定义的每个组的PRD的疫苗应当产生针对几乎所有PRD的交叉反应性免疫。这构成了目前产生组合了来自每个PRD组的至少一种PRD抗原的疫苗的策略的基础；特别是构成了开发包括三种aHD-PRD构建体，其中PRD包括选自每个PRD组中的一种PRD的疫苗的策略的基础。
PRD抗原的另一种选择策略通过一些PRD的完全相同或几乎相同的同源性来表明，如表1-表3中示出的，并且由图3中连接一些菌株的水平线指示。因此，选择数种临床上相关的菌株之间共有的PRD作为疫苗抗原增加了针对所有这些菌株的保护性免疫应答的可能性。例如，DBL1代表组3PRD抗原的一个实施方案(掺入到PspA03中)。该PRD与其他六种分析的菌株的PRD相同。
例如，aHD-PRD构建体的一个实施方案，PspA01.1(参见SEQ ID NO:1)，其包含来自菌株GA47439的组2PRD，在动物模型中刺激了保护性免疫原性应答；并且PRD拓宽了这种应答的交叉反应性(实施例4-实施例6)。该PRD的氨基酸序列是：
aHD-PRD构建体的另一个实施方案，PspA01.2(参见SEQ ID NO:2)，其包含来自菌株ND6012的组2PRD，刺激了保护性免疫原性应答并且该PRD拓宽了它的应答。该PRD的氨基酸序列是：
相似地，aHD-PRD构建体的另一个实施方案，PspA01.3(参见SEQ ID NO:158)，其包含以下组3PRD菌株共有的PRD片段：GA47597、SPN072838、GA19101、70585、R6、RX1/D39、GA16242、GA17545、NP112、GA13856、2071247、GA17971、SP18-BS74、GA13224和GA60132，刺激了保护性免疫原性应答。该PRD的氨基酸序列是：
aHD-PRD构建体的另一个实施方案，PspA02(参见SEQ ID NO:3)，其包含来自组1菌株EF3296的PRD，在动物模型中刺激了保护性免疫原性应答(实施例4-实施例6)。该PRD拓宽了这种应答的交叉反应性。该PDR的氨基酸序列是：
其他六个菌株GA19923、SPN034183、GA47628、GA18523、GA16833和GA18068的PRD彼此相同，并且与EF3296PRD共有高同源性(仅缺少APAPKPEQ)(例如，SEQ ID NO:14的残基19-残基26)。因此，来自这些组1菌株中的所有七个菌株的PRD可能是抗原性的，并且可能是用于包含在基于PspA的肺炎球菌疫苗中的有力的候选对象。这六个菌株的PRD的氨基酸序列为：
aHD-PRD构建体的另一个实施方案，PspA03(参见SEQ ID NO:4)，其包含来自菌株DBL1的组3PRD，在动物模型中刺激了保护性免疫原性应答。该PRD还拓宽了对PspA03的免疫应答的交叉反应性。六种肺炎球菌菌株具有与DBL1完全相同的PRD：EU-NP04、gamPNI0373、P1031、PNI0153、GA11304和PCS70012(还参见表3)。该PRD的氨基酸序列是：
本文提供的数据表明，该序列的免疫原性可能部分地由于该序列中的非脯氨酸区(NPB)：
如表3中示出的，具有经分析的PspA的其他十四种肺炎球菌菌株也包含该NPB(SEQID NO:10)。这些菌株是：670-6B、GA47373、Hungary19A-6、GA47210、GA05245、GA41301、SPAR95、GA49138、ATCC6303、SP14-BS69、G54、GA17484、CCRI_1974和GA41538。这些菌株的PRD是用于包含在包含至少一种aHD-PDR构建体的基于PspA的疫苗中的有力的候选对象。这十四种菌株中的每种的PRD氨基酸序列在SEQ ID NO:17至SEQ ID NO:24中示出。
aHD-PRD构建体的另一个实施方案，PspA01.3(参见SEQ ID NO:158)，其包含十五种组3PRD共有的片段，也在动物模型中刺激了保护性免疫原性应答。Fukuyama等人，2015。该PRD片段的氨基酸序列是：PEKPAPAPETPAPE(SEQ ID NO:157)。具有被分析的包含该PRD片段的PspA的十五个肺炎球菌菌株是：GA47597、SPN072838、GA19101、70585、R6、RX1/D39、GA16242、GA17545、NP112、GA13856、2071247、GA17971、SP18-BS74、GA13224和GA60132，如表3中示出的。因此，这个片段的包含也可以增强针对在其PRD中具有相同或相似氨基酸序列的菌株的交叉反应性。
尽管在特定PRD组和特定PspA aHD分支之间不存在明确关联，但在关联中存在高度非随机性(图2)，这一点是相关的(参见实施例2)。
实施例2：aHD分支定义区的五个主要组和aHD抗原选择
通常由aHD中的约最后100个氨基酸组成的分支定义区(CDR)被认为是aHD内最具抗原性的结构域。McDaniel等人，17Microb.Pathog.323(1994)；Roche等人，2003；Vadesilho等人，21Clin.Vaccine Immunol.940(2014)。使用如实施例1中描述的鉴定的124种独特的PspA基因组序列，我们从每个序列中提取了aHD。针对该信息，我们添加了先前分析的12种aHD序列的信息(参见Hollingshead等人，2000)。我们部分地使用Geneious比对(使用Blosum62矩阵的Global比对)在Geneious软件平台(v7.1.7,Biomatters Ltd.,NewZealand)中比对了总计136种独特的aHD的CDR；然后我们使用Geneious Tree生成器插件创建了系统树图(如图2中的树形结构)。系统树图是使用邻接(NJ)方法与Jukes Cantor遗传距离模型完成的。
这不是一种自动化或直接的(straightforward)过程。尽管特征性氨基酸序列通常标志CDR的起始(例如，约70％的分支1CDR和分支2CDR以LKEID(例如SEQ ID NO:25的残基1-残基5)或LKEIG(SEQ ID NO:86)起始，大多数分支3CDR以LAKKQ(例如SEQ ID NO:32的残基1-残基5)起始，并且大多数分支4CDR以LEK起始)，但是许多CDR不以特征性序列开始。代替地，CDR的起始以每个分支特征性的氨基酸同源性模式的起始为标志。同源性通常在相同分支菌株之间在CDR之前出现。然而，在这种情况中，菌株间的同源性模式通常在CDR起始处转换。因此，从aHD的CDR区之前到CDR区之后的转变通常以同源性模式的转变为标志。确定每个CDR的起始需要高超的技巧和判断力。主要标准是选择示出与来自其他菌株的相似定位的区域的高同源性的区域的起始，并且以对于最大百分比的PspA，任意性将是最少的方式这样做。
所得的新树形图(图2)能够估算个体肺炎球菌菌株、分支和家族之间的相对CDR序列同源性。构建了该图，使得连接任何两个菌株的垂直线的长度之和(或任何两个分支的平均值)与沿CDR序列的任何位置处的氨基酸取代的可能性成比例，即与CDR同源性差异的程度成比例。此外，该可能性可以通过将该长度与图2中示出的垂直图例条(vertical keybar)的长度相比较来近似获得，垂直图例条的长度对应于对于该垂直隔距的长度，每个位点平均0.2个单对氨基酸取代。
因此，例如，将该图例条的长度与连接平均分枝4菌株和平均分枝5菌株的垂直线的总长度进行比较，表明分枝4菌株的CDR中的任何氨基酸与分枝5菌株中相似定位的氨基酸的差别在于一个特定氨基酸取代的可能性为约0.35。允许值超过1.0，因为概率针对单对取代。例如，如果在同一CDR位置，同一分支中的一些菌株具有亮氨酸(L)，一些菌株具有甘氨酸(G)，而其他菌株具有酪氨酸(Y)，则当在同一分支中的一般菌株之间进行比较时，认为这个位点具有两个单对取代。当在不同分支中的菌株之间进行比较时，每个位点多于一个单对取代的可能性增加，并且当在不同家族中的菌株之间进行比较时，更加如此。
图2A示出了CDR(并且因此整个aHD的抗原相似性)明确分为三个家族。两个主要家族，家族1和家族2，分别由两个分支和三个分支组成。在家族1内，分支1和分支2比家族2中的分支3、分支4和分支5共有略微更大的同源性。家族3仅包含一个分支，分支6，其仅包含136个分析过序列的菌株中的三个。迄今为止，全世界的研究表明，由具有家族3PspA的肺炎球菌引起的疾病是罕见的。Hollingshead等人，2000；Vela Coral等人，2001；Hotomi等人，2013。该分析的一个意想不到的结果是，分配在每个分支中的许多菌株之间的高度CDR同源性。在图2A中，连接个体菌株的直的水平线意指它们的CDR之间的完全同源性。
因此，图2A-图2D CDR树形图表明了用于选择包括在aHD-PRD疫苗抗原构建体中的aHD的策略。例如，树形图表明从分支1或分支2选择aHD可能引发针对大多数家族1肺炎球菌PspA亚型的交叉反应性。此外，家族2中稍微更大的多样性表明至少两种aHD抗原可以选自不同的家族2分支，诸如一种选自大的分支3，并且一种选自分支4或分支5。这些策略指导了aHD的选择，我们将所述aHD与PRD重组连接以提供aHD-PRD免疫原性构建体的三个实施例实施方案：来自分支2、分支3和分支4中的每个的aHD(参见实施例3)。
动物数据表明，PspA01.1、PspA01.2、PspA02和PspA03的aHD是免疫原性的(参见实施例4-实施例6)。存在另外的证据，一些aHD抗原的交叉反应性高。Nabors等人，2000；Darrieux等人，2007&2008；Moreno等人，2010年，Fukuyama等人，2015。
在PspA01.1(SEQ ID NO:1)、PspA01.2(SEQ ID NO:2)和PspA01.3(SEQ ID NO:158)的情况中，这意指来源于菌株D39的分支2CDR序列是免疫原性的。该菌株的变体Rx1缺少多糖荚膜，但是具有相同的PspA。该CDR的氨基酸序列是：
D39/Rx1aHD的完整氨基酸序列在SEQ ID NO:159中提供。
然而，作为可选择的分支2抗原，可以从以下菌株中的一个选择aHD：DBL5、CGSP14、GA47439，它们共有以下CDR序列：
或者从菌株ND6012中选择aHD，该aHD具有以下几乎同源的CDR序列：
这四个菌株的CDR与其他经分析的分支2CDR序列共有密切的同源性(参见图2)。此外，他们全部具有组2PRD。引发针对该CDR的免疫提供了针对通过用PRD组2抗原免疫接种可能不足以覆盖的菌株的另外的覆盖。DBL5、CGSP14、GA47439和ND6012的完整的aHD氨基酸序列在SEQ ID NO:28至SEQ ID NO:31中提供。
我们的动物数据表明，来源于分支3菌株EF3296的PspA02(参见SEQ ID NO:3)中的aHD的CDR也是免疫原性的；该CDR氨基酸序列是：
二十六个分支3肺炎球菌菌株，GA47628、GA17301、GA54644、2070531、CDC1873-00、GA02270、GA02714、2070109、GA47283、EF3296、GA18068、GA19923、3063-00、7533-05、GA16833、SP9-BS68、GA08780、GA17570、SPAR55、GA47751、CDC1087-00、NP141、GA16531、GA13637、GA49447和GA40028(超过本文分析的四十六个分支3菌株的一半)与该CDR共有实质同一性(substantial identity)。因此，包含该CDR的aHD应当提供针对许多肺炎球菌菌株的直接免疫。这二十六个菌株的完整的aHD氨基酸序列在SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:58中提供。
动物模型数据还表明了来源于分支4菌株EF5668的构建体PspA03(参见SEQ IDNO:4)中的aHD的CDR的免疫原性。该CDR的氨基酸序列是：
并且它的完整的EF5668aHD的氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示。
作为可选择的分支4aHD抗原，可以选择具有与彼此具有甚至更高同源性的CDR的aHD，以增加与尽可能多的临床上重要的菌株的强交叉反应性的可能性。三个实例是菌株CDC0288-04、Netherlands15B-37和GA47522，它们全部具有这样的CDR，所述CDR具有以下氨基酸序列：
因此，用于aHD蛋白的可选择的菌株可以是具有在SEQ ID NO:62中示出的完整的aHD氨基酸序列的CDC0288-04。
分支4菌株G54、GA17484、CCRI_1974、SP14-BS69、SP19-BS75和GA41538也具有这样的CDR，所述CDR具有相同氨基酸序列：
因此，具有SEQ ID NO:64中示出的完整氨基酸序列的G54的aHD为分支4aHD抗原提供了另一个可选择的来源。
图2提供了选择可以不被缀合到PRD的另外的aHD抗原的其他指导。例如，在至少一个实施方案中，除三种aHD-PRD构建体外，疫苗组合物包含至少一种非缀合的aHD，诸如一种或两种非缀合的aHD。考虑到特定aHD-PRD构建体中的aHD具有图2中示出的同源性差异，并且考虑到特定的临床重要性，非缀合的aHD可以选自分支1和分支5，诸如一种非缀合的aHD来自分支1且一种非缀合的aHD来自分支5。
至于分支1菌株，另一个实施方案提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种非缀合的选自以下肺炎球菌菌株的分支1aHD：BG8743、NP070、2061376、SP23-BS72、2080913、GA58981、GA56348、GA14688、GA44128或2071004。这些菌株全部具有相同的CDR序列：
这个区域(SEQ ID NO:65)与其他分析的分支1区域的CDR共有密切的同源性，并且因此可以引发针对其他分支1PspA的强烈的交叉反应性。
此外，前面的分支1菌株全部具有组2PRD。它们一起构成了分布在所有分支中具有组2PRD的所有分析的菌株的几乎一半。如果PspA01.1和PspA01.2中的组2PRD抗原没有提供针对具有组2PRD的肺炎球菌菌株的足够的交叉反应性，则具有上述CDR(SEQ ID NO:65)的另外的aHD可以提供针对这样的菌株的保护。菌株BG8743、NP070、2061376、SP23-BS72、2080913、GA58981、GA56348、GA14688、GA44128和2071004的完整的aHD氨基酸序列分别在SEQ ID NO:66至SEQ ID NO:75中示出。
具有与其他分支1CDR具有密切同源性的CDR的可选择的分支1aHD抗原包括来自菌株SP18-BS74、GA47597、SPN072838、GA19101、GA13224、GA16242、GA17545、NP112、GA13856、GA17971或2071247的那些aHD抗原；其在具有以下氨基酸序列的CDR中共有实质同一性：
其他可选择的分支1aHD抗原包括来源于菌株670-6B、EU-NP04、gamPNI0373、P1031、PNI0153、GA11304或PCS70012的那些aHD抗原，它们也共有具有以下氨基酸序列的共同CDR：
因此，菌株NP112和670-6B的aHD提供了分支1aHD抗原的两个具体的可选择的实施方案：来自以上CDR组中的每个组中的aHD抗原。它们的完整氨基酸序列分别显示为SEQ IDNO:78和SEQ ID NO:79。
关于可以被包含在包含至少一种aHD-PRD构建体的组合物中的可能的分支5非缀合的(非连接的)aHD，在至少一个实施方案中，这可以选自肺炎球菌菌株GA47373、GA05245、GA41301、GA47210或Hungary19A-6。这些菌株构成了分析的分支5菌株的大部分，并且它们的CDR几乎完全同源。例如，以下是GA47373的CDR(GA47373的完整aHD氨基酸序列在SEQ IDNO:81中示出)：
实施例3：使用大肠杆菌表达系统产生纯的、稳定的aHD-PRD构建体
根据实施例1和实施例2中描述的实施方案设计重组aHD-PRD构建体的氨基酸序列。选择三种特定aHD-PRD构建体用于表达：一种构建体包含家族1的来自分支1或分支2的aHD；两种构建体包含来自家族2的aHD，其中一个aHD来自分支3，并且其余的aHD可以来自分支4或分支5。
一个实施方案包括被报道为高度免疫原性的分支2aHD(来自菌株D39)。Fukuyama等人，2015。另一个实施方案包括被报道与针对PspA的人类抗体具有反应性的分支3aHD(来自菌株EF3296)。Nabors等人，2000；Roche等人，2003。另外的实施方案包括先前的研究表明为在小鼠中高度免疫原性的来自菌株EF5668的分支4aHD。
为了完成aHD-PRD构建体，添加了三种不同的完整PRD的序列或其片段，每个序列或其片段被添加到三种最初选择的aHD中的每一种的每个C末端。添加的PRD(或其片段)可以与aHD从其来源的天然存在的肺炎球菌菌株中可见的相同，或者它可以来自不同的肺炎球菌菌株，在来自不同的肺炎球菌菌株的情况中，aHD-PRD构建体将是人工融合蛋白。在一个实施方案中，每一种PRD(或其片段)来自不同的PRD组(一种PRD来自三个PRD组中的一个组)。在另一个实施方案中，两种或者甚至三种PRD(或其片段)来自同一PRD组(参见实施例7)。
另外的aHD-PRD疫苗抗原构建体可以包括选自显示出高免疫原性和交叉反应性的组的PRD，或者包含显示出高免疫原性和交叉反应性的特定基序(或其组合)。
如实施例2中表明的，疫苗的一个实施方案可以仅包含三种aHD-PRD构建体，并且还包含至少一种未连接到任何PRD的aHD。这些aHD可以选自在三种主要aHD-PRD构建体中未代表的分支。此外，疫苗的另一个实施方案可以仅包含两种aHD-PRD构建体和至少一种未连接到任何PRD的aHD，因为单独这些可以提供足够的交叉反应性来保护抵抗大多数病原性肺炎球菌菌株(参见实施例7)。实际上，疫苗的另一个实施方案可以包含仅一种aHD-PRD构建体和两种或更多种未连接到任何PRD的aHD。
本文示出了最初的aHD-PRD构建体的氨基酸序列。这些可以使用本领域技术人员已知的标准基因工程技术在细菌表达系统中表达。作为实例，编码PspA01.1、PspA01.2、PspA01.3、PspA02和PspA03的DNA分子可以使用针对大肠杆菌表达系统优化的翻译密码子作为病毒质粒DNA分子单独合成。
能够编码PspA01.1(SEQ ID NO:1)的核酸分子(特别是DNA)的实例在SEQ ID NO:82中示出。编码PspA01.2(SEQ ID NO:2)的DNA分子的实例在SEQ ID NO:83中示出。编码PspA01.03(SEQ ID NO:158)的DNA分子的实例在SEQ ID NO:160中示出。编码PspA02(SEQID NO:3)的DNA分子的实例在SEQ ID NO:84中示出。最后，编码PspA03(SEQ ID NO:4)的DNA分子的实例在SEQ ID NO:85中示出。
将这些质粒DNA分别克隆到pET17b中的HindIII和EcoRI位点之间。然后将质粒分别转染到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。培养转染的大肠杆菌后，将经过声处理的细胞上清液装载到DEAE-Sepharose离子交换层析柱和SP-Sepharose离子交换层析柱两者中。随后在Sephacryl S-200柱上进行凝胶过滤，并且最后分别汇集每种表达的蛋白的活性级分。图5示出了使用十二烷基硫酸锂聚丙烯酰胺凝胶电泳的表达产物的纯度。使用针对单独的aHD-PRD构建体的多克隆抗体的蛋白印迹分析证实了它们的身份，与每种构建体上的独特表位结合的单克隆抗体也证实了它们的身份。
实施例4：IM制剂中的单一构建体的免疫原性研究
用于肌内(IM)施用的包含单独的aHD-PRD构建体的制剂用明矾佐剂制备。该明矾制剂是通过将实施例3中描述的单独的aHD-PRD构建体吸附到如描述的氢氧化铝(Al(OH)3)凝胶上而完成的。Lindblad,82Immuno.Cell Biol.497(2004)。
单独测试了三种aHD-PRD构建体(PspA01.1、PspA02和PPspA03)中的每一种，每种构建体在两只兔中测试，以评估直接免疫和交叉反应性免疫。根据其接受的抗原，每只兔被命名为PspA_R1或PspA_R2。例如，PspA01.1_R1和PspA01.1_R2是用PspA01.1免疫接种的两只兔(图5)。在第0天，将每只兔用100μg的指定抗原与完全弗氏佐剂进行IM免疫接种。两周后，将每只兔用100μg的指定抗原与不完全弗氏佐剂进行IM加强。另外两周后，使用间接ELISA在用单独的aHD-PRD构建体涂覆的孔中测试来自个体兔的血清(单独的孔用于每种构建体)。图5示出了特异性结合三种抗原构建体中的每一种的血清IgG的滴度(倒数log2ELISA滴度)。终点滴度被表示为产生比阴性对照大0.1的OD450的最后稀释的倒数log2。预期了每只兔针对免疫接种的构建体产生的高抗体滴度。然而，值得注意的是，兔针对两种非免疫接种的构建体中的每一种产生的滴度表明针对不相似的抗原的交叉反应性的程度。如前所述，PspA01.1包含家族1分支2aHD而PspA02和PspA03分别包含家族2分支3和分支4aHD。因此，家族内分支间的交叉反应性高于家族间的交叉反应性并不令人惊讶。
以下用更大数量的小鼠的研究证实了免疫原性并支持了攻击研究。
使用以下程序，我们示出了在单次初次IM免疫接种和在7.5周的单次加强注射后，IM制剂在小鼠中引发了强烈的PspA特异性血清IgG应答：将三十只7周龄的BALB/c雌性小鼠分为三个十只的组，并且对于三组小鼠中的每个组，将每个组用以明矾为佐剂配制的单一aHD-PRD构建体免疫接种，所述单一aHD-PRD构建体为以下三种构建体PspA01.1、PspA02或PspA03中的一种。每组中五只小鼠接受3μg剂量，并且五只接受10μg剂量。两组中的小鼠均接受了到后腿肌肉上部中的0.02mL的注射体积。在第7.5周，所有小鼠用相同剂量和体积的相同抗原以单次注射到相同肌肉中来加强，但是该加强剂量不用明矾或任何其他佐剂配制。
使用ELISA测定来测量与用来免疫接种每只小鼠的具体构建体结合的IgG抗体的单独的血清滴度。将板(96孔)用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1μg/mL的构建体在4℃包被过夜。用PBS-Tween中的1％BSA封闭后，添加样品的两倍连续稀释液，并在室温(RT)孵育持续2hr。洗涤样品后，我们添加1:1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG，并将样品在RT孵育持续2hr。孵育后，使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)MicrowellPeroxidase Substrate System(XPL)显色。终点滴度被表示为产生比阴性对照大至少0.1的OD450的最后稀释的倒数log2滴度。加强注射后，升高的血清IgG水平持续多于八周，表明持续的记忆应答(图6)。
实施例5：IN制剂中的单一构建体的免疫原性研究
用于IN制剂的递送媒介物包括阳离子型具有胆固醇基基团的普鲁兰多糖(cCHP或纳米凝胶)。普鲁兰多糖是一种麦芽三糖的聚合物。cCHP的产生是已知的，并在别处提供。参见例如Ayame等人，19,Bioconj.Chem.882(2008)；Nochi等人，2010。步骤包括使用酵母表达系统来制造普鲁兰多糖、将原始分子缩短至50kD至100kD的分子量、共价附接胆固醇基基团(每100个葡萄糖单元～1.1-1.6个)和共价添加阳离子氨基基团(每100个葡萄糖单元～20个)。
一种制造方法概述如下：首先允许具有12至50个碳原子的包含羟基基团的烃或甾醇与由OCN-R1NCO(其中R1代表具有1至50个碳原子的烃基团)代表的二异氰酸酯化合物反应，以产生包含异氰酸酯基团的疏水性化合物，该疏水性化合物包含一个分子的包含羟基基团的烃(或甾醇)。允许所得的包含异氰酸酯基团的疏水性化合物与多糖反应，以产生包含疏水性基团的多糖，该多糖包含具有12至50个碳原子的烃或甾基基团。接下来，将产物用酮基溶剂来纯化，以产生高纯度的包含疏水性基团的多糖。
合适的多糖可以是，例如普鲁兰多糖、支链淀粉、直链淀粉、右旋糖酐(dextran)、羟乙基右旋糖酐、甘露聚糖、果聚糖、菊粉、几丁质、壳聚糖、木葡聚糖或水溶性纤维素。在至少一个实施方案中，多糖是普鲁兰多糖。
适用于IN疫苗的纳米凝胶的实例包括包含胆固醇疏水性基团的多糖(CHP)和阳离子CHP衍生物(cCHP)。CHP具有这样的结构，在所述结构中，具有30,000kD至200,000kD的分子量的普鲁兰多糖的每100个葡萄糖单元通过取代添加有1至10个，例如1至2个胆固醇分子。普鲁兰多糖分子量的一个实例范围是70,000kD至100,000kD。
每100个葡萄糖单元的胆固醇取代的程度可以基于抗原的尺寸和疏水性程度来选择。为了进一步改变CHP的疏水性程度，可以添加一个或更多个各自具有10至30个(例如约12至20个)碳原子的烷基基团。至少一个实施方案提供了具有10nm至40nm的颗粒尺寸，诸如20nm至30nm的颗粒尺寸的纳米凝胶。这样的CHP纳米凝胶已经在癌症疫苗的人类临床试验中使用，其中CHP纳米凝胶用作癌症抗原的递送媒介物。
另一个实施方案提供了cCHP纳米凝胶，其掺入了带正电荷的官能团，例如阳离子氨基基团。这使纳米凝胶-抗原复合物能够在带负电的鼻粘膜表面上保留更久。阳离子氨基基团的最佳包含比率取决于抗原。对于大多数抗原包括PspA的最佳范围是cCHP的每100个葡萄糖单元18至22个(诸如20个)阳离子氨基基团。
以下描述了用于将氨基基团与CHP纳米凝胶组合的实例方法：将冻干的CHP(约0.15g)溶解在15mL的二甲基亚砜(DMSO)中，并在氮气流下向其中添加1-1'-羰基二咪唑(约75mg)。允许反应在RT进行持续数小时(例如约1hr)。将阳离子胺，例如乙二胺(例如约300mg)逐渐添加至反应溶液，并将混合物搅拌数hr至超过一天(例如约24hr)。将所得反应溶液针对蒸馏水进行透析持续数天。透析后，将反应溶液冷冻干燥以获得乳白色固体。乙二胺取代的程度可以通过使用例如H-NMR的元素分析来评估。
制备纳米凝胶后，使用报道的程序，产生了三种aHD-PRD构建体PspA01.1、PspA02和PspA03中的每一种的纳米凝胶制剂。参见美国专利第8,961,983号；Nochi等人，2010；Kong等人，2013；Fukuyama等人，2015。这些程序包括，将2％cCHP溶液与包含aHD-PRD构建体的溶液以约1:1的分子比例在40℃或50℃混合持续1hr，然后与磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液混合，然后通过0.22μm膜过滤器。
因为cCHP在尿素中比在PBS中更容易溶解，并且(不同于在PBS中溶解)不需要超声波设备，所以也使用了更适合于更大规模配制的可选择的程序。这包括与6M尿素溶液(而不是与PBS)在约4℃-8℃混合，然后针对PBS透析，并且然后通过0.22μm膜过滤器。所得制剂包含被诱捕在cCHP(纳米凝胶)分子的交联结构中的单一aHD-PRD构建体。这通过使用FITC缀合的aHD-PRD和TRITC缀合的cCHP纳米凝胶的荧光共振能量转移(FRET)证实。此外，动态光散射(DLS)证实了直径约40nm的均匀的颗粒尺寸。
将三十只7周龄的BALB/c雌性小鼠分为三个十只的组，并且对于三组小鼠中的每个组，将每个组用10μg的cCHP-aHD-PRD复合物免疫接种，所述cCHP-aHD-PRD复合物为三种复合物cCHP-PspA01.1、cCHP-PspA02或cCHP-PspA03中的一种。每组中5只小鼠接受用PBS在40℃配制的复合物，而每组中5只小鼠接受用PBS在50℃配制的复合物。在每种情况中，抗原复合物包含在0.006mL(6μL)溶液中，该溶液被滴加到一个鼻孔中。
相同的滴加施用方法可以被用于更大的动物，诸如兔或狗。在人类的情况中，包含适当的量的cCHP-aHD-PRD复合物(或复合物的混合物)的溶液可以通过任何合适的方法来递送，诸如滴加或使用注射器喷雾装置诸如Becton Dickinson’s以分次剂量喷到每个鼻孔中。这种装置已经被用来将流感疫苗有效地递送到灵长类动物的鼻部通道中。
初次(initial)(激发(priming))免疫系列由三个剂量组成，每个剂量相隔一周。随后的实验表明，相隔一周施用的两个剂量，或者甚至单次剂量，也产生强烈的抗原特异性IgG应答。所有小鼠在第7.5周用单次鼻剂量(相同的抗原复合物、剂量、体积和配制温度)加强免疫。
使用实施例4中描述的相同的ELISA测定来测量个体小鼠的血清中的免疫抗原特异性IgG抗体的滴度。这些ELISA测定还示出了在加强剂量后持续多于8周的持续的强记忆应答(图7)。
实施例6：多于一种构建体的免疫原性和攻击研究。
用三种aHD-PRD构建体免疫接种小鼠引发了针对每种单独的组分构建体的强烈的血清IgG应答，并且还引发了针对具有与免疫接种的构建体的aHD不同的aHD的肺炎链球菌菌株的保护性交叉反应性免疫。这在IM施用和IN(纳米凝胶)施用后均被实现。
IM免疫接种程序如下：包含10μg的三种aHD-PRD构建体(PspA01.1、PspA02和PspA03)中的每一种的混合物用明矾Al(OH)3来配制。将六十只7周龄的雌性BALB/c小鼠在第0天用这种制剂通过连续注射到可选择的后腿肌肉上部中来免疫接种。在第7周，将小鼠用相同但不具有明矾的混合物(即10μg的三种aHD-PRD构建体中的每一种)通过连续注射到可选择的后腿肌肉上部中来加强免疫。
IN免疫接种程序如下：制备了三种实例aHD-PRD构建体PspA01.1、PspA02和PspA03中的每一种的单独的cCHP-aHD-PRD复合物。用于配制单独的复合物的方法在实施例5的开始处描述。所有复合物在40℃配制。在第0天，将六十只7周龄的雌性BALB/c小鼠用10μg的cCHP-PspA01.1复合物免疫接种。这是通过将0.006mL(6μL)的包含cCHP-PspA01.1复合物的溶液(包含10μg的PspA01.1)滴加到每只小鼠的一个鼻孔中来实现的。在第1天，用6μL的包含cCHP-PspA02复合物的溶液(包含10μg的PspA02)进行相同操作。在第2天，用cCHP-PspA03复合物(包含10μg的PspA03)进行相同操作。这个过程在五天后(第0天后一周)重复，并且在第0天后两周时再次重复。因此，到第16天，所有六十只小鼠都已经用10μg的三种实例aHD-PRD构建体PspA01.1、PspA02和PspA03中的每一种进行三次经鼻免疫接种。在第7周，通过将6μL的包含cCHP-PspA01.1的溶液(10μg的相应的aHD-PRD构建体)滴加到每只小鼠的一个鼻孔中，用10μg的每种aHD-PRD构建体来加强小鼠。这个过程在接下来的一天对cCHP-PspA02重复并且在接下来的一天对cCHP-PspA03重复。换言之，在三天的时间中，每只小鼠都接受了三种纳米凝胶配制的抗原中的每一种的经鼻加强剂量。
随后的实验表明，两次或甚至仅一次经鼻施用对于激发剂量(priming dose)是足够的。此外，可以配制所有三种cCHP-aHD-PRD构建体的混合物，而不是在连续几天用不同抗原免疫接种小鼠。如果需要在数天中多于一次施用，则施用所有三种抗原复合物的混合物。当将疫苗向人类施用时，它还可以作为与cCHP复合的个体抗原的混合物施用——尽管它可以通过喷雾而不是液滴施用。图8的简述中的程序概述了施用cCHP-PspA复合物的混合物的该方法。
加强剂量后两周，通过ELISA确定针对三种抗原中的每一种的血清IgG的滴度。对于IM和IN免疫接种的小鼠的血清抗原特异性IgG滴度是相似的。比较图6和图7；还参见图8。此外，无论将小鼠仅用每种单独的抗原免疫(图6和图7(加强剂量))还是用三种抗原一起免疫(图8)，针对每种单独的抗原的滴度是相似的。结果表明：(a)几乎不存在或不存在减弱对每种抗原的免疫应答的抗原竞争，或(b)发生的抗原竞争都被交叉反应性抵消，例如针对一种aHD-PRD构建体产生的抗体也与其他构建体结合。
选择了肺炎链球菌的五种菌株作为攻击菌株：BG8838、A66.1、BG12730、3JYP2670和ATCC 6303，它们分别代表多种不同的aHD分支1至分支5；以及被PPSV23和PCV13良好覆盖和未良好覆盖的多糖荚膜血清型。例如，A66.1、3JYP2670和ATCC6303展示了多糖荚膜抗原3，尽管它包含在PPSV23和PCV13中，但它未被任一种疫苗良好覆盖。Andrews等人，2014。BG12730展示了荚膜血清型6A，它未被PPCV23覆盖。因此，这些菌株允许我们评估aHD-PRD疫苗构建体的三个实施方案保护抵抗与当今公共健康相关的肺炎球菌菌株的能力。
为了确定这些菌株中的每一个的适当的攻击剂量，在剂量递增研究中对非免疫接种的小鼠进行攻击，以确定将在五天内导致80％死亡率的菌落形成单位(CFU，即存活的肺炎链球菌细菌的数量)的数量。这是通过将0.05mL的包含105CFU、106CFU、107CFU或108CFU的溶液滴加到每只小鼠的单个鼻孔中来完成的。对于每个菌株和每个CFU水平，将五只小鼠进行鼻内攻击。在这项研究的基础上，对以下五个攻击菌株初步确定了以下80％致死剂量：BG8838：1x108CFU；A66.1：1x105CFU；BG12730：1x108；3JYP2670：1x106；和ATCC 6303：1x107CFU。
攻击研究如下进行：在第一次加强剂量后五周和第一次免疫接种后十二周，将五十只IM免疫接种的小鼠、五十只IN免疫接种的小鼠和五十只初始对照(control)用所述五个菌株以上文指示的CFU强度进行鼻内攻击。在每个菌株的情况中，将包含适当数量的CFU的0.05mL的溶液滴加到十只IM免疫接种的小鼠、十只IN免疫接种的小鼠和十只非免疫接种的对照小鼠的一个鼻孔中。最初的方案要求跟踪小鼠持续七天，并且这是对用A66.1和3JYP2670攻击的小鼠遵循的程序。对其他三个菌株重新进行确定适当攻击剂量的研究(剂量范围研究)，因为对于所有组，初始存活率要么非常高，要么非常低。在新的剂量范围研究后，将方案改变为跟踪小鼠持续十天。因此，BG8838、BG12730和ATCC6303的存活数据在攻击后跟踪小鼠持续十天。
图9中的存活数据表明，IM制剂和纳米凝胶IN制剂两者都保护了小鼠免受原本致命的攻击。菌株A66.1、3JYP2670和ATCC6303具有被PPSV23和PCV13疫苗不良覆盖的荚膜多糖血清型3。针对用A66.1、3JYP2670和ATCC6303攻击的存活曲线示出了实施例疫苗组合物在保护抵抗原本被PPSV23和PCV13疫苗不良覆盖的菌株方面是有利的。攻击菌株BG8838(其具有分支1PspA)和ATCC6303(其具有分支5PspA)的结果示出了疫苗组合物引发了针对两个分支的交叉反应性。这两种菌株都具有组3PRD，因此交叉保护可以通过针对包含在PspA03构建体中的PRD组3产生的免疫来提供。肺炎球菌菌株BG12730具有被PCV13疫苗覆盖，但不被PPSV23疫苗覆盖的荚膜多糖血清型6A。针对用菌株BG12730攻击的存活曲线示出了aHD-PDR构建体保护抵抗不被PPSV23覆盖的菌株(参见图9)。
实施例7：具有短PRD的aHD-PRD构建体的免疫原性。
另外的实验表明，将组2PRD序列用来自PRD组1或组3的短PRD序列取代，或者甚至根本没有PRD序列，可能导致甚至更好的免疫应答。鉴于组3PRD中的十五种PRD的前14个氨基酸残基——PEKPAPAPETPAPE(SEQ ID NO:157)——之间的同源性(参见实施例1中的讨论和表3)，由肺炎球菌菌株D39的aHD组成的aHD-PRD构建体用该PRD片段构建。该构建体被命名为PspA01.3(参见SEQ ID NO:158)。它包括肺炎球菌的天然存在的D39菌株中的PspA蛋白的片段，该片段可能在动物模型中诱导保护性免疫。参见Fukuyama等人，2015。
比较通过PspA01.1、PspA01.2和PspA01.3产生的抗原特异性血清IgG的交叉反应性分析表明，PspA01.3可能比其他两种抗原中的任何一种更具抗原性。当免疫接种十五只小鼠时，五只用PspA01.1免疫接种，五只用PspA01.2免疫接种，以及五只用PspA01.3免疫接种，并分析它们的抗原特异性血清IgG抗体的滴度，每个组针对PspA01.3的反应最好，甚至是用PspA01.1和PspA01.2免疫接种的那些小鼠也是针对PspA01.3的反应最好。例如，在用PspA01.1免疫接种的小鼠的血清中，针对PspA01.3的平均倒数log2滴度为15.6，而针对PspA01.1和PspA01.2的平均倒数log2滴度仅为15.0。在用PspA01.2免疫接种的小鼠的血清中，针对PspA01.3的平均倒数log2滴度为15.8，但针对PspA01.1和PspA01.2的平均倒数log2滴度分别仅为14.4和14.8。
此外，用PspA01.3免疫接种的小鼠的血清针对PspA01.1和PspA01.2的反应比特异性针对这些抗原免疫接种的小鼠的血清的反应好。例如，在用PspA01.3免疫接种的小鼠的血清中，针对PspA01.1的平均倒数log2IgG滴度为16.6，而在用PspA01.1和PspA01.2免疫接种的小鼠的血清中，平均倒数log2IgG滴度分别仅为15.0和14.4。在用PspA01.3免疫接种的小鼠的血清中，针对PspA01.2的平均倒数log2滴度为17.4，但在用PspA01.1和PspA01.2免疫接种的小鼠的血清中，平均倒数log2滴度分别仅为15.0和14.8。
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<400> 1
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Glu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ser Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln
325 330 335
Asp Glu Leu Asp Lys Glu Ala Glu Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala
340 345 350
Asp Glu Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Glu Ile Ser Asn
355 360 365
Leu Glu Ile Leu Leu Gly Gly Ala Asp Ser Glu Asp Asp Thr Ala Ala
370 375 380
Leu Gln Asn Lys Leu Ala Thr Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Gln
385 390 395 400
Lys Glu Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly Pro Asp Gly Asp Glu
405 410 415
Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
420 425 430
Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
435 440 445
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln
450 455 460
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Lys Pro Glu Lys Pro
465 470 475 480
Ala Glu Glu Pro Thr Gln Pro Glu Lys Pro Ala Thr Pro Lys Thr
485 490 495
<210> 4
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> aHD-PRD构建体，一种重组融合蛋白，命名为PspA03
<400> 4
Glu Glu Ala Pro Val Ala Asn Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Asp Tyr Glu Thr Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys
35 40 45
Lys Thr Glu Ala Lys Ala Glu Lys Glu Arg Lys Ala Ser Glu Lys Ile
50 55 60
Ala Glu Ala Thr Lys Glu Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Ala Ser Asn Glu Ser Gln Arg Lys Glu Ala Asp Lys Lys Ile Lys Glu
85 90 95
Ala Thr Gln Arg Lys Asp Glu Ala Glu Ala Ala Phe Ala Thr Ile Arg
100 105 110
Thr Thr Ile Val Val Pro Glu Pro Ser Glu Leu Ala Glu Thr Lys Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Glu Ala Thr Lys Glu Ala Glu Val Ala Lys Lys Lys Ser
130 135 140
Glu Glu Ala Ala Lys Glu Val Glu Val Glu Lys Asn Lys Ile Leu Glu
145 150 155 160
Gln Asp Ala Glu Asn Glu Lys Lys Ile Asp Val Leu Gln Asn Lys Val
165 170 175
Ala Asp Leu Glu Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Gln Asn Glu Val Ala Glu
180 185 190
Leu Asn Lys Glu Ile Ala Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys Asp Ala Glu
195 200 205
Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Glu Gln Ala Ile
210 215 220
Thr Asn Lys Lys Ala Glu Leu Ala Thr Thr Gln Gln Asn Ile Asp Lys
225 230 235 240
Thr Gln Lys Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Glu Leu Glu Lys Val Leu
245 250 255
Ala Thr Leu Asp Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu Asp Lys Glu
260 265 270
Ala Ala Glu Ala Glu Leu Asn Glu Lys Val Glu Ala Leu Gln Asn Gln
275 280 285
Val Ala Glu Leu Glu Glu Glu Leu Ser Lys Leu Glu Asp Asn Leu Lys
290 295 300
Asp Ala Glu Thr Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Glu
305 310 315 320
Glu Ala Ile Ala Thr Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Gln Lys Glu
325 330 335
Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu
340 345 350
Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys
355 360 365
Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr
370 375 380
Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu
385 390 395 400
Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala
405 410 415
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val Pro Ala Pro Lys Thr
420 425 430
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 5
Pro Lys Pro Glu Gln Pro
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 6
Gln Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 7
Pro Lys Pro Ala Pro Ala
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 8
Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 9
Pro Glu Lys Pro Ala Glu
1 5
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 10
Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn
1 5 10 15
Arg Leu Pro Gln Gln Gln
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 11
Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn
1 5 10 15
Arg Leu Thr Gln Gln Gln
20
<210> 12
<211> 96
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 12
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys
65 70 75 80
Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
85 90 95
<210> 13
<211> 68
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 13
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
50 55 60
Thr Pro Lys Thr
65
<210> 14
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 菌株EF3296的修饰的PspA PRD
<400> 14
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys
20 25 30
Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
50 55 60
Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Thr Gln Pro Glu Lys Pro Ala
65 70 75 80
Thr Pro Lys Thr
<210> 15
<211> 75
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 15
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys
20 25 30
Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro
50 55 60
Thr Gln Pro Glu Lys Pro Ala Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 16
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 16
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 17
<211> 94
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 17
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val Pro Ala Pro Lys Thr
85 90
<210> 18
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 18
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 19
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 19
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 20
<211> 87
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 20
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 21
<211> 77
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 21
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys
20 25 30
Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu
35 40 45
Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val Pro Ala Pro
65 70 75
<210> 22
<211> 97
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 22
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
35 40 45
Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser
50 55 60
Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu
65 70 75 80
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val Pro Ala Pro Lys
85 90 95
Thr
<210> 23
<211> 84
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 23
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Val Pro
65 70 75 80
Ala Pro Lys Thr
<210> 24
<211> 86
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 24
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Thr Asp Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp
35 40 45
Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Pro Gln Gln Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro
65 70 75 80
Val Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 25
<211> 97
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 25
Leu Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly
1 5 10 15
Phe Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ala Lys Leu
20 25 30
Ser Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn
50 55 60
Val Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys
65 70 75 80
Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn
85 90 95
Glu
<210> 26
<211> 97
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 26
Leu Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly
1 5 10 15
Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Lys Leu Glu Glu Leu Ser Gly Lys Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Glu Leu Glu Val Gln Leu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn
50 55 60
Val Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys
65 70 75 80
Lys Ala Glu Leu Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp
85 90 95
Glu
<210> 27
<211> 97
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 27
Leu Lys Glu Ile Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly
1 5 10 15
Phe Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Lys Leu Glu Glu Leu Ser Gly Lys Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu
35 40 45
Ile Ala Glu Leu Glu Val Gln Leu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn
50 55 60
Val Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys
65 70 75 80
Lys Ala Glu Leu Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp
85 90 95
Glu
<210> 28
<211> 280
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 28
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Met Glu Lys Tyr Lys Ala Ala Glu Glu Asp Leu Glu Lys Ala
20 25 30
Glu Ala Ala Gln Arg Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Ser Glu Glu
35 40 45
Asn Glu Lys Glu Thr Glu Glu Ala Ser Glu Arg Gln Gln Ala Ala Thr
50 55 60
Leu Lys Tyr Gln Leu Lys Leu Arg Glu Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Glu
65 70 75 80
Lys Asn Lys Glu Lys Ile Ala Lys Ala Glu Lys Glu Met Asn Glu Ala
85 90 95
Lys Gln Glu Glu Asp Lys Glu Lys Ala Asn Leu Asn Lys Val Leu Ala
100 105 110
Lys Val Ile Pro Ser Asp Arg Glu Leu Glu Lys Thr Arg Gln Glu Ala
115 120 125
Glu Lys Ala Lys Lys Asn Ile Pro Glu Leu Lys Lys Lys Val Glu Glu
130 135 140
Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu His
145 150 155 160
Ala Lys Glu Val Ala Pro Gln Ala Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln
165 170 175
Val His Arg Leu Glu Gln Asp Leu Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Ser
180 185 190
Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu
195 200 205
Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Ser Gly Lys
210 215 220
Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Glu Leu Glu Val Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gly Leu
245 250 255
Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Ala Glu Ala
260 265 270
Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu
275 280
<210> 29
<211> 280
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 29
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Met Glu Lys Tyr Lys Ala Ala Glu Glu Asp Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Glu Ala Ala Gln Arg Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu
35 40 45
Lys Ala Lys Glu Thr Glu Glu Ala Ser Lys Arg Gln Gln Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Lys Tyr Gln Leu Lys Leu Arg Glu Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Glu
65 70 75 80
Lys Asn Lys Glu Lys Ile Ala Lys Ala Glu Lys Glu Met Asn Glu Ala
85 90 95
Lys Gln Glu Glu Asp Lys Glu Lys Ala Asn Leu Asn Lys Val Leu Ala
100 105 110
Lys Val Ile Pro Ser Asp Arg Glu Leu Glu Lys Thr Arg Gln Glu Ala
115 120 125
Glu Lys Ala Lys Lys Asn Ile Pro Glu Leu Lys Lys Lys Val Glu Glu
130 135 140
Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu His
145 150 155 160
Ala Lys Glu Val Ala Pro Gln Ala Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln
165 170 175
Val His Arg Leu Glu Gln Asp Leu Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Ser
180 185 190
Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu
195 200 205
Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Ser Gly Lys
210 215 220
Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Glu Leu Glu Val Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gly Leu
245 250 255
Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Ala Glu Ala
260 265 270
Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu
275 280
<210> 30
<211> 280
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 30
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Met Glu Lys Tyr Lys Ala Ala Glu Glu Asp Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Glu Ala Ala Gln Arg Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu
35 40 45
Lys Ala Lys Glu Thr Glu Glu Ala Ser Lys Arg Gln Gln Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Lys Tyr Gln Leu Lys Leu Arg Glu Tyr Leu Lys Tyr Ile Gln Glu
65 70 75 80
Lys Asn Lys Glu Lys Ile Ala Lys Ala Glu Lys Glu Met Asn Glu Ala
85 90 95
Lys Gln Glu Glu Asp Lys Glu Lys Ala Asn Leu Asn Lys Val Leu Ala
100 105 110
Lys Val Ile Pro Ser Asp Arg Glu Leu Glu Lys Thr Arg Gln Glu Ala
115 120 125
Glu Lys Ala Lys Lys Asn Ile Pro Glu Leu Lys Lys Lys Val Glu Glu
130 135 140
Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu His
145 150 155 160
Ala Lys Glu Val Ala Pro Gln Ala Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln
165 170 175
Val His Arg Leu Glu Gln Asp Leu Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Ser
180 185 190
Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Glu Leu
195 200 205
Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Ser Gly Lys
210 215 220
Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Glu Leu Glu Val Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Gly Leu
245 250 255
Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Ala Glu Ala
260 265 270
Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu
275 280
<210> 31
<211> 302
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 31
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys His Tyr Glu Glu Val
20 25 30
Lys Ala Lys Phe Glu Ala Ala Lys Lys Glu Tyr Glu Asp Gly Lys Ala
35 40 45
Ala Gln Lys Lys Tyr Glu Asp Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala
50 55 60
Glu Glu Glu Arg Lys Ala Ser Glu Glu Glu Gln Ala Ala Asn Leu Lys
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Ala Val Leu Lys Tyr Ile Lys Glu Thr Asp Pro Gln Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ala Gln Lys Val Met Asp Glu Ala Gln Lys Glu His Thr
100 105 110
Arg Thr Lys Glu Lys Phe Asp Glu Val Arg Ala Lys Val Ile Pro Ser
115 120 125
Glu Glu Glu Leu Lys Lys Thr Arg Gln Lys Ala Glu Glu Ala Lys Leu
130 135 140
Lys Glu Ala Glu Val Ala Lys Lys Val Glu Glu Thr Lys Lys Gln Glu
145 150 155 160
Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala Thr Glu
165 170 175
Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala Lys Ile
180 185 190
Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu Lys Glu
195 200 205
Ile Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Phe Arg Ala
210 215 220
Pro Leu Gln Ser Glu Leu Asp Thr Lys Lys Ala Lys Leu Leu Lys Leu
225 230 235 240
Glu Glu Leu Ser Gly Lys Ile Glu Glu Leu Asp Ala Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Leu Glu Val Gln Leu Lys Asp Ala Glu Gly Asn Asn Asn Val Glu Ala
260 265 270
Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Thr Ala Glu Lys Lys Ala Glu
275 280 285
Leu Glu Lys Ala Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asp Glu
290 295 300
<210> 32
<211> 97
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 32
Leu Ala Lys Lys Gln Thr Glu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ser Leu Asp
1 5 10 15
Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu Asp Lys Glu Ala Glu Glu Ala
20 25 30
Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp Glu Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu
35 40 45
Glu Lys Glu Ile Ser Asn Leu Glu Ile Leu Leu Gly Gly Ala Asp Ser
50 55 60
Glu Asp Asp Thr Ala Ala Leu Gln Asn Lys Leu Ala Thr Lys Lys Ala
65 70 75 80
Glu Leu Glu Lys Thr Gln Lys Glu Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu
85 90 95
Gly
<210> 33
<211> 319
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 33
Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys His Tyr Glu Glu Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 34
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20 25 30
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
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<211> 319
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 35
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
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<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 40
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 41
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<400> 43
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115 120 125
Lys Ala Glu Glu Ala Lys Ala Glu Glu Lys Val Ala Lys Arg Lys Tyr
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Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Leu Ala Leu Ala Lys Lys Glu Val Glu Ala
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Glu Leu Asp Lys Glu Ala Glu Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp
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Glu Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Glu Ile Ser Asn Leu
355 360 365
Glu Ile Leu Leu Gly Gly Ala Asp Ser Glu Asp Asp Thr Ala Ala Leu
370 375 380
Gln Asn Lys Leu Ala Thr Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Gln Lys
385 390 395 400
Glu Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly
405 410
<210> 54
<211> 410
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 54
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Asp Tyr Glu Glu Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Lys Glu Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Glu Gln Lys
35 40 45
Lys Thr Glu Glu Lys Ala Lys Lys Glu Lys Glu Val Ala Lys Lys Val
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Asp Asp Ala Ser Leu Ala Val Gln Lys Ala His Val Glu Tyr Arg Lys
65 70 75 80
Val Leu Phe Ser Arg Asn Ser Tyr Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr Asp Lys
85 90 95
Lys Leu Ala Glu Ala Gln Ala Lys Ile Asp Glu Ala Asn Lys Lys Leu
100 105 110
Thr Ala Ala Asn Asn Glu Phe Gln Thr Val Arg Ala Val Val Val Pro
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130 135 140
Ala Glu Glu Val Val Ala Lys Lys Lys Ser Asp Glu Ala Ala Gln Glu
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Val Glu Val Ala Lys Lys Glu Val Glu Ala Lys Glu Leu Glu Ile Glu
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Glu Leu Asp Lys Glu Ala Glu Glu Ala Glu Leu Asp Lys Lys Ala Asp
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Glu Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly
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<211> 410
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 55
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 56
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 57
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 58
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1 5 10 15
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<211> 94
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 59
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Glu Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Glu Leu Asn Glu Lys Val Glu
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Lys Thr Gln Lys Glu Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly
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<211> 345
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 60
Glu Glu Ala Pro Val Ala Asn Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Asp Tyr Glu Thr Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys
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Lys Thr Glu Ala Lys Ala Glu Lys Glu Arg Lys Ala Ser Glu Lys Ile
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Leu Asp Ala Ala Leu Asn Glu Leu Gly
340 345
<210> 61
<211> 101
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 61
Leu Glu Lys Ala Glu Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Ser Thr Leu Asp
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Glu Leu Asn Lys Lys Val Glu Ala Leu Gln Asn Gln Val Ala Glu Leu
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Leu Asn Glu Leu Gly
100
<210> 62
<211> 364
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 62
Glu Glu Ala Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Glu Glu Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys
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Glu Val Ala Lys Leu Glu Lys Asp Val Glu Gly Phe Lys Glu Ser Asp
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<210> 63
<211> 101
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 63
Leu Glu Lys Ala Glu Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Ser Thr Leu Asp
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100
<210> 64
<211> 357
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 64
Glu Ala Ala Pro Gln Val Val Glu Lys Ser Ser Leu Glu Lys Lys Tyr
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Glu Glu Ala Lys Ala Lys Ala Asp Thr Ala Lys Lys Asp Tyr Glu Thr
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165 170 175
Glu Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asp Ala
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Glu Lys Thr Val Ala Asp Leu Glu Lys Glu Val Ala Lys Leu Glu Lys
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Leu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Leu Val Ala Lys Lys Ala Glu Leu Ala
225 230 235 240
Glu Ala Lys Ile Lys Ala Ala Thr Lys Lys Ala Glu Leu Glu Pro Glu
245 250 255
Leu Glu Lys Ala Glu Ala Glu Leu Glu Asn Leu Leu Ser Thr Leu Asp
260 265 270
Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala
275 280 285
Glu Leu Asn Lys Lys Val Glu Ala Leu Gln Asn Gln Val Ala Glu Leu
290 295 300
Glu Glu Glu Leu Ser Lys Leu Glu Asp Asn Leu Lys Asp Ala Glu Thr
305 310 315 320
Asn Asn Val Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ile Ala
325 330 335
Thr Lys Lys Ala Glu Leu Glu Lys Thr Gln Lys Glu Leu Asp Ala Ala
340 345 350
Leu Asn Glu Leu Gly
355
<210> 65
<211> 98
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 65
Leu Lys Glu Ile Asp Glu Ser Asp Ser Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly
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Leu Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu
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Asp Glu
<210> 66
<211> 302
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 66
Glu Glu Ala Pro Val Ala Lys Gln Ser Gln Ala Glu Arg Asp Tyr Asp
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35 40 45
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65 70 75 80
Leu Arg Glu Ala Gln Glu Gln Leu Asn Lys Ser Pro Asn Asn Lys Lys
85 90 95
Asn Ala Ala Gln Gln Lys Leu Lys Asp Ala Leu Ala His Ile Asp Glu
100 105 110
Val Thr Leu Lys Gln Lys Glu Ala Glu Ala Asn Phe Asn Lys Glu Gln
115 120 125
Ala Lys Val Val Pro Glu Ala Asp Lys Leu Ala Glu Thr Lys Lys Lys
130 135 140
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35 40 45
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50 55 60
Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Asp
65 70 75 80
Lys Ala Leu Thr Asp Lys Lys Val Glu Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ala
85 90 95
Leu Asp Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Glu Leu Gly
100 105 110
<210> 81
<211> 368
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 81
Glu Glu Ala Pro Val Ala Asn Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Ser Glu Ala Ala Lys Lys Asp Tyr Glu Thr Ala
20 25 30
Lys Lys Lys Ala Glu Asp Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gln Lys
35 40 45
Lys Thr Glu Glu Lys Ala Glu Leu Val Arg Lys Ala Asp Glu Lys Arg
50 55 60
Gln Lys Ala Asn Leu Ala Val Gln Glu Ala Tyr Val Lys Phe Gln Glu
65 70 75 80
Ala Gln Arg Glu Phe Asn Glu Ser Pro Ser Arg Lys Lys Ser Asp Ala
85 90 95
Lys Lys Lys Leu Asp Asp Ala Ser Ala His Ile Glu Glu Val Lys Leu
100 105 110
Lys Gln Lys Glu Ala Asp Ala Asn Phe Asn Lys Glu Gln Ala Lys Val
115 120 125
Ile Pro Glu Ala Ser Asp Leu Ala Val Thr Lys Gln Lys Ala Glu Glu
130 135 140
Ala Lys Lys Glu Ala Glu Val Ala Lys Glu Lys Tyr Asp Lys Ala Val
145 150 155 160
Gln Glu Val Glu Val Glu Lys Asn Lys Ile Leu Glu Gln Asp Ala Glu
165 170 175
Asn Glu Lys Lys Ile Asp Val Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu
180 185 190
Lys Gly Ile Ala Pro Tyr Gln Asn Lys Val Ala Glu Leu Asn Lys Glu
195 200 205
Ile Ala Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val
210 215 220
Glu Asp Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Lys Lys
225 230 235 240
Ala Glu Leu Ala Thr Thr Gln Gln Asn Ile Asp Lys Thr Gln Lys Asp
245 250 255
Leu Glu Asp Ala Glu Leu Glu Leu Glu Lys Val Leu Ala Thr Leu Asp
260 265 270
Pro Glu Gly Lys Thr Gln Asp Glu Leu Asp Lys Glu Ala Ala Glu Asp
275 280 285
Ala Asn Ile Glu Ala Leu Gln Asn Lys Val Ala Asp Leu Glu Asn Lys
290 295 300
Val Ala Glu Leu Asp Lys Glu Val Thr Arg Leu Gln Ser Asp Leu Lys
305 310 315 320
Asp Ala Glu Glu Asn Asn Val Glu Asp Tyr Val Lys Glu Gly Leu Asp
325 330 335
Lys Ala Leu Thr Asp Lys Lys Val Glu Leu Asn Asn Thr Gln Lys Ala
340 345 350
Leu Asp Thr Ala Gln Lys Ala Leu Asp Thr Ala Leu Asn Glu Leu Gly
355 360 365
<210> 82
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码PspA01.1 [SEQ ID NO:1]的DNA。编码甲硫氨酸的ATG已经被添加在起始处
作为起始密码子，并且TGA已经被添加在结尾处作为终止密码子
<400> 82
atggaagaaa gcccggtggc gagccagagc aaagcggaaa aagattatga tgcggcgaaa 60
aaagatgcga aaaacgcgaa aaaagcggtg gaagatgcgc agaaagcgct ggatgatgcg 120
aaagcggcgc agaaaaaata cgatgaagac cagaaaaaaa ccgaagaaaa agcggcgctg 180
gaaaaagcgg cgagcgaaga aatggataaa gcggtggcgg cggtgcagca ggcgtatctg 240
gcgtatcagc aggcgaccga taaagcggcg aaagatgcgg cggataaaat gattgatgaa 300
gcgaaaaaac gcgaagaaga agcgaaaacc aaatttaaca ccgtgcgcgc gatggtggtt 360
ccggaaccgg aacagctggc ggaaaccaaa aagaaaagcg aagaagcgaa acagaaagcg 420
ccggaactga ccaaaaaact ggaagaagcg aaagcgaaac tggaagaagc cgagaaaaaa 480
gcgaccgaag ccaaacaaaa ggttgatgcg gaagaagtgg cgccgcaggc gaaaattgcg 540
gaactggaaa accaggtgca tcgcctggaa caggaactga aagaaattga tgaaagcgaa 600
agcgaagatt atgcgaaaga aggctttcgc gcgccgctgc agagcaaact ggatgcgaaa 660
aaagccaagc tgagcaaact ggaagaactg agcgataaaa ttgatgaact ggatgcggaa 720
attgcgaaac tggaagatca gctgaaagcg gcggaagaaa acaacaacgt ggaagattat 780
tttaaagaag gcctggaaaa aaccattgcg gcgaaaaaag cggaacttga aaaaaccgaa 840
gcggatctga aaaaagcggt taatgaaccg gaaaccccgg caccggcgcc ggcaccggcg 900
ccggccccgg ccccggcccc agcgcccgcg ccggccccga agccagcccc ggctcccaaa 960
ccggcaccgg ccccgaaacc ggcccctgcg cccgcccccg cgcccgcgcc gaaaccggaa 1020
aaaccggcag aaaaaccggc tccggcacct aaaccagaga ccccgaaaac ctga 1074
<210> 83
<211> 1158
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码PspA01.2 [SEQ ID NO:2]的DNA。编码甲硫氨酸的ATG已经被添加在起始处
作为起始密码子，并且TGA已经被添加在结尾处作为终止密码子
<400> 83
atggaagaaa gcccggtggc gagccagagc aaagcggaaa aagattatga tgcggcgaaa 60
aaagatgcga aaaacgcgaa aaaagcggtg gaagatgcgc agaaagcgct ggatgatgcg 120
aaagcggcgc agaaaaaata cgatgaagac cagaaaaaaa ccgaagaaaa agcggcgctg 180
gaaaaagcgg cgagcgaaga aatggataaa gcggtggcgg cggtgcagca ggcgtatctg 240
gcgtatcagc aggcgaccga taaagcggcg aaagatgcgg cggataaaat gattgatgaa 300
gcgaaaaaac gcgaagaaga agcgaaaacc aaatttaaca ccgtgcgcgc gatggtggtt 360
ccggaaccgg aacagctggc ggaaaccaaa aagaaaagcg aagaagcgaa acagaaagcg 420
ccggaactga ccaaaaaact ggaagaagcg aaagcgaaac tggaagaagc cgagaaaaaa 480
gcgaccgaag ccaaacaaaa ggttgatgcg gaagaagtgg cgccgcaggc gaaaattgcg 540
gaactggaaa accaggtgca tcgcctggaa caggaactga aagaaattga tgaaagcgaa 600
agcgaagatt atgcgaaaga aggctttcgc gcgccgctgc agagcaaact ggatgcgaaa 660
aaagccaagc tgagcaaact ggaagaactg agcgataaaa ttgatgaact ggatgcggaa 720
attgcgaaac tggaagatca gctgaaagcg gcggaagaaa acaacaacgt ggaagattat 780
tttaaagaag gcctggaaaa aaccattgcg gcgaaaaaag cggaacttga aaaaaccgaa 840
gcggatctga aaaaagcggt taatgaaccg gaaaccccgg caccggcgcc ggcaccggcg 900
ccggccccgg ccccggcccc agcgcccaaa ccggcaccgg ccccgaaacc ggcccctgca 960
ccaaaaccgg cgccggctcc taaacccgcg ccggccccga agccagcccc ggctcccgcc 1020
cccgcgcccg cgccgaaacc ggcgccggcc cctaagccgg caccggctcc agccccggcg 1080
ccggcccctg cgccgaagcc cgaaaaaccg gcagaaaaac cggctccggc acctaaacca 1140
gagaccccga aaacctga 1158
<210> 84
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码PspA02 [SEQ ID NO:3]的DNA。编码甲硫氨酸的ATG已经被添加在起始处
作为起始密码子，并且TGA已经被添加在结尾处作为终止密码子
<400> 84
atggaagaaa gcccgcaggt ggtggaaaaa agcagcctgg aaaaaaaata tgaagaagcg 60
aaagcgaaag cggataccgc gaaaaaagat tatgaaaccg cgaaaaagaa agcggaagat 120
gcgcagaaaa aatacgaaga cgatcagaaa cgcaccgaag aaaaagcgcg caaagaagcg 180
gaagcgagcc agaaactgaa cgatgtggcg ctggtggtgc agaacgcgta taaagaatat 240
cgcgaagtgc agaaccagcg cagcaaatat aaaagcgatg cggaatatca gaaaaaactg 300
accgaagtgg atagcaaaat tgaaaaagcg cgtaaggagc agcaggatct gcagaacaaa 360
tttaacgaag tgcgtgcggt ggtggttccg gaaccgaatg cgctggcgga aaccaaaaaa 420
aaagccgaag aggccaaagc agaggaaaaa gtggcgaaac gcaaatatga ttatgcgacc 480
ctgaaagtgg cgctggcgaa aaaagaagtg gaagcgaaag aactggaaat tgaaaaactg 540
cagtatgaaa ttagcaccct ggaacaggaa gtggcgaccg cgcagcatca ggtggataac 600
ctgaaaaaac tgctggcggg cgcggatccg gatgatggca ccgaagtgat tgaagcgaaa 660
ctgaaaaaag gcgaagcgga actgaacgcg aaacaggcgg aactggcgaa aaaacagacc 720
gaactggaaa aactgctgga tagcctggat ccggaaggca aaacccagga tgaactggat 780
aaagaagccg aagaagccga gctggacaaa aaagcagatg aactgcagaa caaagtggcg 840
gatctggaaa aagaaattag caatttggag attctgctgg gcggtgcaga cccggaagac 900
gataccgcag cgctgcaaaa taaactggcc gcgaaaaaag cggaactggc gaaaaaacaa 960
accgaactgg agaagctgct tgattcgctg gatccggagg gtaaaacgca agatgaactg 1020
gataaagaag cggaagaagc ggagctggat aaaaaagcgg acgaactgca gaataaggtg 1080
gccgacctgg agaaagaaat cagcaatctc gagatcctgc tgggtggcgc cgacagcgaa 1140
gatgatacgg ccgcgctgca gaataaactc gccaccaaaa aagccgagct cgagaagacc 1200
cagaaagaac tggatgcggc gctgaacgaa ctgggcccgg atggtgatga agaagaaacc 1260
ccggcaccgg caccgcaacc ggaacaaccg gcgccggccc ccaagccgga acagccggca 1320
ccggccccaa agccggagca gccggccccg gcccccaaac cggaacaacc ggcgcctgca 1380
ccgaagccag aacagccggc gccagcgcct aaaccggaac agccagcgaa accggagaag 1440
ccagcggaag aaccgaccca gccggagaaa ccggcaaccc cgaaaacctg a 1491
<210> 85
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码PspA03 [SEQ ID NO:4]的DNA。编码甲硫氨酸的ATG已经被添加在起始处
作为起始密码子，并且TGA已经被添加在结尾处作为终止密码子
<400> 85
atggaagaag cgccggtggc gaaccagagc aaagcggaaa aagattatga tgcggcggtg 60
aaaaaaagcg aagcggcgaa aaaagattac gagaccgcga aaaagaaagc ggaagatgcg 120
cagaaaaaat atgatgaaga tcagaaaaaa accgaagcga aagcggaaaa agaacgcaaa 180
gcgagcgaaa aaattgcgga agcgaccaaa gaagtgcagc aggcgtatct ggcgtatctg 240
caggcgagca acgaaagcca gcgcaaagaa gcggataaaa aaattaaaga agcgacccag 300
cgcaaagatg aagcggaagc ggcgtttgcg accattcgca ccaccattgt ggtgccggaa 360
ccgagcgaac tggcggaaac caaaaaaaaa gccgaagaag caacgaaaga ggccgaagtg 420
gcgaaaaaga aaagcgaaga agcggcgaaa gaagtggaag tggaaaaaaa caaaattctg 480
gaacaggatg cggaaaacga aaagaaaatt gatgtgctgc agaacaaagt ggcggatctg 540
gaaaaaggca ttgcgccgta tcagaatgaa gtcgccgagc tcaacaaaga aattgcgcgt 600
ttgcaaagcg atctgaaaga tgcggaagaa aacaacgtgg aagattacat taaagaaggc 660
ctggaacagg cgattaccaa caaaaaagcg gaactggcga ccacccagca gaacattgat 720
aaaacccaga aagatctgga agacgcggag ctggaactgg aaaaagtgct ggcgaccctg 780
gatccggaag gcaaaaccca ggatgaactg gataaagaag cggcggaagc ggaactgaac 840
gaaaaagtgg aagcgctgca gaaccaggtg gcggaactgg aagaagaact gagcaaactg 900
gaagataacc tgaaagacgc cgagaccaac aatgttgaag attacattaa agagggtctg 960
gaggaagcga ttgcgaccaa aaaagccgag ctcgaaaaaa cgcaaaaaga gttagatgcg 1020
gcgctgaacg aactgggccc ggaaaaaccg gcagaagaaa ccccggcacc ggcgccgaaa 1080
ccggaacagc cggccgagca gccgaaaccg gcaccggcac cgcaaccggc cccggcgcca 1140
aagccagaga agaccgatga tcagcaggcg gaagaagatt atgcgcgccg cagcgaagaa 1200
gaatataacc gcctgccgca gcagcagccg ccgaaagcag aaaaaccggc gccggccccg 1260
aaaccagaac aaccagttcc ggcaccgaaa acctga 1296
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 86
Leu Lys Glu Ile Gly
1 5
<210> 87
<211> 98
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 87
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Thr Pro Glu Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
50 55 60
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro
85 90 95
Lys Thr
<210> 88
<211> 108
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 88
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
100 105
<210> 89
<211> 84
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 89
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
65 70 75 80
Thr Pro Lys Thr
<210> 90
<211> 74
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 90
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
65 70
<210> 91
<211> 82
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 91
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
50 55 60
Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro
65 70 75 80
Lys Thr
<210> 92
<211> 76
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 92
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 93
<211> 75
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 93
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 94
<211> 65
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 94
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
50 55 60
Pro
65
<210> 95
<211> 86
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 95
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala
35 40 45
Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 96
<211> 101
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 96
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro
85 90 95
Glu Thr Pro Lys Thr
100
<210> 97
<211> 83
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 97
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys
50 55 60
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr
65 70 75 80
Pro Lys Thr
<210> 98
<211> 83
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 98
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys
50 55 60
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr
65 70 75 80
Pro Lys Thr
<210> 99
<211> 81
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 99
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
50 55 60
Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys
65 70 75 80
Thr
<210> 100
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 100
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Pro Lys Pro Glu
85
<210> 101
<211> 56
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 101
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys
20 25 30
Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
50 55
<210> 102
<211> 64
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 102
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Lys Thr
50 55 60
<210> 103
<211> 103
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 103
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu
50 55 60
Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro
85 90 95
Thr Pro Glu Thr Pro Lys Thr
100
<210> 104
<211> 76
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 104
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys
1 5 10 15
Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro
20 25 30
Ala Pro Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Glu Lys Pro Ala Glu Glu
35 40 45
Pro Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Ala Pro Thr Pro
50 55 60
Glu Lys Pro Ala Pro Thr Pro Glu Thr Pro Lys Thr
65 70 75
<210> 105
<211> 78
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 105
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Leu Pro Ala Arg Ala Leu Gln Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Thr Pro Ala Pro Lys
20 25 30
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<400> 134
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<400> 135
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<400> 136
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<400> 137
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100
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<400> 138
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 139
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Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 140
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Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 141
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Thr
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<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 143
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<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 144
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala
35 40 45
Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr
50 55 60
Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln
65 70 75 80
Pro Ala Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Thr Gln Pro Glu Lys
85 90 95
<210> 145
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 145
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Lys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 146
<211> 86
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 146
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
1 5 10 15
Gln Pro Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys
20 25 30
Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys
35 40 45
Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu
50 55 60
Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Gln Pro
85
<210> 147
<211> 88
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 147
Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Thr Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
20 25 30
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp
35 40 45
Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
65 70 75 80
Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 148
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 148
Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Lys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Ser
85
<210> 149
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 149
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 150
<211> 84
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 150
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys
<210> 151
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 151
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Pro Pro Glu Ala Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Ser
85
<210> 152
<211> 118
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 152
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Pro Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg
35 40 45
Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys
50 55 60
Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gln
85 90 95
Pro Ala Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Glu Pro Thr Gln Pro Glu Lys
100 105 110
Pro Ala Thr Pro Lys Thr
115
<210> 153
<211> 80
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 153
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu
1 5 10 15
Lys Pro Ala Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Pro Ala Pro Lys Pro Glu
20 25 30
Lys Ser Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Ile
65 70 75 80
<210> 154
<211> 85
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 154
Pro Asp Gly Asp Glu Glu Glu Thr Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Lys Pro Ala Glu
20 25 30
Gln Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro
50 55 60
Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Glu Gln Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Lys Thr
85
<210> 155
<211> 92
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 155
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro
1 5 10 15
Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Asp
35 40 45
Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn
50 55 60
Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Gln Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala Pro Lys Thr
85 90
<210> 156
<211> 89
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 156
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Ala Pro
1 5 10 15
Ala Glu Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro
20 25 30
Lys Pro Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Lys Ala Glu Lys Thr Asp Asp
35 40 45
Gln Gln Ala Glu Glu Asp Tyr Ala Arg Arg Ser Glu Glu Glu Tyr Asn
50 55 60
Arg Leu Thr Gln Gln Gln Pro Pro Lys Ala Glu Lys Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Lys Pro Glu Gln Pro Ala Pro Ala
85
<210> 157
<211> 14
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 157
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu
1 5 10
<210> 158
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 命名为PspA01.3的aHD-PRD构建体
<400> 158
Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala
20 25 30
Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu
35 40 45
Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser
50 55 60
Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met
85 90 95
Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn
100 105 110
Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr
115 120 125
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala
145 150 155 160
Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala
165 170 175
Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu
180 185 190
Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe
195 200 205
Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser
210 215 220
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile
225 230 235 240
Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val
245 250 255
Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys
260 265 270
Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu
275 280 285
Pro Glu Lys Pro Ala Pro Ala Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu
290 295 300
<210> 159
<211> 288
<212> PRT
<213> 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
<400> 159
Glu Glu Ser Pro Val Ala Ser Gln Ser Lys Ala Glu Lys Asp Tyr Asp
1 5 10 15
Ala Ala Lys Lys Asp Ala Lys Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu Asp Ala
20 25 30
Gln Lys Ala Leu Asp Asp Ala Lys Ala Ala Gln Lys Lys Tyr Asp Glu
35 40 45
Asp Gln Lys Lys Thr Glu Glu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Ala Ala Ser
50 55 60
Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val Gln Gln Ala Tyr Leu Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Ala Thr Asp Lys Ala Ala Lys Asp Ala Ala Asp Lys Met
85 90 95
Ile Asp Glu Ala Lys Lys Arg Glu Glu Glu Ala Lys Thr Lys Phe Asn
100 105 110
Thr Val Arg Ala Met Val Val Pro Glu Pro Glu Gln Leu Ala Glu Thr
115 120 125
Lys Lys Lys Ser Glu Glu Ala Lys Gln Lys Ala Pro Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Glu Ala Glu Lys Lys Ala
145 150 155 160
Thr Glu Ala Lys Gln Lys Val Asp Ala Glu Glu Val Ala Pro Gln Ala
165 170 175
Lys Ile Ala Glu Leu Glu Asn Gln Val His Arg Leu Glu Gln Glu Leu
180 185 190
Lys Glu Ile Asp Glu Ser Glu Ser Glu Asp Tyr Ala Lys Glu Gly Phe
195 200 205
Arg Ala Pro Leu Gln Ser Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ala Lys Leu Ser
210 215 220
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu Ile
225 230 235 240
Ala Lys Leu Glu Asp Gln Leu Lys Ala Ala Glu Glu Asn Asn Asn Val
245 250 255
Glu Asp Tyr Phe Lys Glu Gly Leu Glu Lys Thr Ile Ala Ala Lys Lys
260 265 270
Ala Glu Leu Glu Lys Thr Glu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Val Asn Glu
275 280 285
<210> 160
<211> 912
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码PspA01.3 [SEQ ID NO:158]的DNA。编码甲硫氨酸的ATG已经被添加在起始处
作为起始密码子，并且TGA已经被添加在结尾处作为终止密码子
<400> 160
atggaagaaa gcccggtggc gagccagagc aaagcggaaa aagattatga tgcggcgaaa 60
aaagatgcga aaaacgcgaa aaaagcggtg gaagatgcgc agaaagcgct ggatgatgcg 120
aaagcggcgc agaaaaaata tgatgaagat cagaaaaaaa ccgaagaaaa agcggcgctg 180
gaaaaagcgg cgagcgaaga aatggataaa gcggtggcgg cggtgcagca ggcgtatctg 240
gcgtatcagc aggcgaccga taaagcggcg aaagatgcgg cggataaaat gattgatgaa 300
gcgaaaaaac gcgaagaaga agcgaaaacc aaatttaaca ccgtgcgcgc gatggtggtg 360
ccggaaccgg aacagctggc ggaaaccaaa aaaaaaagcg aagaagcgaa acagaaagcg 420
ccggaactga ccaaaaaact ggaagaagcg aaagcgaaac tggaagaagc ggaaaaaaaa 480
gcgaccgaag cgaaacagaa agtggatgcg gaagaagtgg cgccgcaggc gaaaattgcg 540
gaactggaaa accaggtgca tcgcctggaa caggaactga aagaaattga tgaaagcgaa 600
agcgaagatt atgcgaaaga aggctttcgc gcgccgctgc agagcaaact ggatgcgaaa 660
aaagcgaaac tgagcaaact ggaagaactg agcgataaaa ttgatgaact ggatgcggaa 720
attgcgaaac tggaagatca gctgaaagcg gcggaagaaa acaacaacgt ggaagattat 780
tttaaagaag gcctggaaaa aaccattgcg gcgaaaaaag cggaactgga aaaaaccgaa 840
gcggatctga aaaaagcggt gaacgaaccg gaaaaaccgg cgccggcgcc ggaaaccccg 900
gcgccggaat ga 912

Claims (48)

1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)肺炎球菌表面蛋白A(PspA)蛋白的脯氨酸富集结构域(PRD)的至少一部分，其中所述部分由选自SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:157的氨基酸序列组成，或者所述部分由与SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:157中的一个至少90％相同的氨基酸序列组成。
2.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含肺炎链球菌PspA蛋白的α螺旋结构域(aHD)的至少一部分，其中所述部分由选自SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:159的氨基酸序列组成；或者其中所述部分由与选自SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33-SEQ ID NO:58、SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:78、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:159的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
3.一种命名为aHD-PRD构建体的重组蛋白，所述重组蛋白包含连接到肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的脯氨酸富集结构域(PRD)或其一部分的PspA的α螺旋结构域(aHD)或其一部分，其中所述重组蛋白是抗原性或免疫原性的，并且其中所述构建体在自然界中不存在。
4.如权利要求3所述的重组蛋白，其中所述aHD在其N末端处连接到所述PRD的C末端，或者所述PRD在其N末端处连接到所述aHD的C末端。
5.如权利要求3或4所述的重组蛋白，其中所述PRD选自权利要求1中的PRD。
6.如权利要求3或4所述的重组蛋白，其中所述aHD选自权利要求2中的aHD。
7.如权利要求3、权利要求5或权利要求6所述的重组蛋白，所述重组蛋白包含在其C末端处连接到一种PRD的一种aHD，并且其中所述重组蛋白是单一aHD-PRD构建体。
8.如权利要求4、权利要求5或权利要求6所述的重组蛋白，所述重组蛋白包含在其N末端处连接到一种PRD的一种aHD，其中所述重组蛋白是单一aHD-PRD构建体。
9.如权利要求7或权利要求8所述的重组蛋白，其中所述aHD和所述PRD来自相同的肺炎链球菌菌株，并且其中所述aHD-PRD构建体在自然界中不存在。
10.如权利要求7或权利要求8所述的重组蛋白，其中所述aHD和所述PRD来自不同的肺炎链球菌菌株。
11.如权利要求7或权利要求8所述的重组蛋白，其中所述aHD、所述PRD或两者与任何天然存在的aHD蛋白或PRD或多肽不相同，而是包括增强免疫原性的氨基酸取代、缺失或添加。
12.如权利要求3所述的重组蛋白，其中所述重组蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:158中示出的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:158中示出的序列至少90％相同的氨基酸序列组成。
13.一种组合物，所述组合物包含多于一种根据权利要求3-12中任一项所述的重组蛋白。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含三种不同的重组aHD-PRD构建体。
15.如权利要求14所述的组合物，所述组合物包含三种重组蛋白，所述重组蛋白是由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白，或者是由与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成的蛋白。
16.如权利要求14所述的组合物，所述组合物包含三种重组蛋白，所述重组蛋白是由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的蛋白，或者是由与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成的蛋白。
17.如权利要求14所述的组合物，所述组合物包含三种重组蛋白，所述重组蛋白是由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:158的氨基酸序列组成的蛋白，或者是由与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:158的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成的蛋白。
18.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含至少一种如权利要求3-17中任一项所述的重组蛋白或组合物。
19.如权利要求18所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含至少一种非连接的重组aHD蛋白。
20.如权利要求18所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含两种aHD-PRD构建体和一种非连接的aHD蛋白。
21.如权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述两种aHD-PRD构建体选自由氨基酸序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:158组成的构建体；或者由与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:158至少90％相同的氨基酸序列组成的构建体。
22.如权利要求21所述的免疫组合物，其中所述两种aHD-PRD构建体由氨基酸序列SEQID NO:3和SEQ NO:4组成；或者由与SEQ ID NO:3和SEQ NO:4至少90％相同的氨基酸序列组成；并且所述非连接的aHD蛋白选自PspA家族1肺炎球菌肺炎菌株的aHD。
23.如权利要求22所述的免疫组合物，其中所述非连接的aHD蛋白由SEQ ID NO:159的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列组成。
24.如权利要求18所述的免疫组合物，所述免疫组合物包含一种aHD-PRD构建体和两种非连接的aHD蛋白。
25.如权利要求24所述的免疫组合物，其中所述aHD-PRD构建体由来自PspA家族1菌株的aHD组成。
26.如权利要求25所述的免疫组合物，其中所述aHD-PRD构建体由SEQ ID NO:158的氨基酸序列组成，或者是由与SEQ ID NO:158 90％相同的氨基酸序列组成的蛋白。
27.如权利要求25所述的免疫组合物，其中所述两种非连接的aHD蛋白选自分支3PspA、分支4 PspA或分支5 PspA的aHD蛋白；并且进一步地，其中每种所选择的aHD蛋白来自不同的分支。
28.如权利要求24所述的免疫组合物，其中所述非连接的aHD蛋白中的一种是PspA家族1肺炎球菌菌株的aHD，并且所述非连接的aHD蛋白中的一种是PspA家族2肺炎球菌菌株的aHD。
29.如权利要求28所述的免疫组合物，其中所述非连接的aHD蛋白中的一种由SEQ IDNO:159的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO:159至少90％相同的氨基酸序列组成。
30.如权利要求28所述的免疫组合物，其中所述aHD-PRD构建体由SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中示出的氨基酸序列组成，或者是由与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列组成的蛋白。
31.一种疫苗，所述疫苗包含至少一种如权利要求17-30中任一项所述的免疫原性组合物。
32.一种疫苗，所述疫苗包含至少一种如权利要求17-30中任一项所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。
33.如权利要求31或32所述的疫苗，所述疫苗被配制用于肌内施用。
34.如权利要求31或32所述的疫苗，所述疫苗被配制用于粘膜施用，其中所述粘膜施用是鼻内、口服或支气管施用。
35.如权利要求31或32所述的疫苗，所述疫苗包含被诱捕在亲水性多糖中的至少一种aHD-PRD构建体，用于粘膜施用，其中所述亲水性多糖是包含阳离子型具有胆固醇基基团的普鲁兰多糖(cCHP)的纳米凝胶。
36.一种用于选择用于包含在重组免疫原性aHD-PRD蛋白构建体中的肺炎球菌表面蛋白A(PspA)α螺旋结构域(aHD)和PspA脯氨酸富集结构域(PRD)的方法，所述方法包括步骤：
(a)从PspA的第一家族内的第一分支中选择第一aHD，并从第一PRD组中选择第一PRD；并且任选地
(b)从PspA的第一家族内的第二分支中或第二家族内选择第二aHD，并从第二PRD组中选择第二PRD；并且任选地
(c)从与步骤(a)或(b)中选择的分支或家族不同的分支或家族中选择第三aHD，并从第三PRD组中选择第三PRD。
37.如权利要求36所述的方法，其中至少一种aHD选自PspA家族1的分支1或分支2；并且任选地，至少一种aHD选自PspA家族2的分支3、分支4或分支5。
38.如权利要求24所述的方法，其中至少一种aHD选自PspA家族1的分支1或分支2，至少一种aHD选自PspA家族2的第一分支，并且至少一种aHD选自PspA家族2的第二分支。
39.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子编码如权利要求3-30中任一项所述的重组蛋白。
40.如权利要求39所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子由与SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:160至少90％相同的核苷酸序列组成。
41.一种表达盒，所述表达盒包含如权利要求39或权利要求40所述的核酸分子。
42.一种载体，所述载体包含如权利要求39或权利要求40所述的核酸分子或如权利要求41所述的表达盒。
43.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求42所述的载体。
44.如权利要求43所述的宿主细胞，所述宿主细胞还包含如权利要求1-12中任一项所述的重组蛋白。
45.一种用于表达如权利要求1-12中任一项所述的重组蛋白的方法，所述方法包括在遗传修饰的微生物或其他生物表达系统中表达编码多肽的DNA。
46.一种疫苗，所述疫苗包含如权利要求18-30中任一项所述的免疫原性组合物，还包含增强针对肺炎链球菌的保护性免疫应答的至少一种另外的抗原。
47.如权利要求46所述的疫苗，其中所述另外的抗原包含肺炎球菌溶血素或神经氨酸酶中的至少一种。
48.一种疫苗，所述疫苗包含如权利要求18所述的免疫原性组合物，还包含至少一种其他抗原，其中如权利要求18所述的免疫原性组合物增强针对所述其他抗原的免疫原性应答。
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