CN110483624A

CN110483624A - 伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用

Info

Publication number: CN110483624A
Application number: CN201910779530.3A
Authority: CN
Inventors: 郝琴; 苗广青; 张琳; 侯学霞
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN110483624B

Abstract

本发明提供伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用。本发明提供的伽氏疏螺旋体含His标签的OspA肽段(126‑274aa)对家兔具有较好的免疫保护性，且不会对机体产生不良的副反应。本发明为莱姆病螺旋体感染的治疗或预防提供有效手段。

Description

伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用。

背景技术

莱姆病是一种自然疫源性疾病，在自然界伯氏疏螺旋体在蜱和宿主小型哺乳动物间进行感染循环，当感染的蜱叮咬人后，人可患莱姆病。主要引起流感样症状，可能伴有或不伴有慢性游走性红斑、关节炎、神经系统症、心肌炎及其他症状：慢性萎缩性肢皮炎，结膜炎，视神经炎等。因莱姆病患者临床表现复杂多样，且国内目前无统一的莱姆病诊断标准，多种因素导致患者误诊致延误病情。

疫苗研制是控制莱姆病在人群中传播的有效途径，但目前尚未研制出有效的莱姆病疫苗。目前莱姆病疫苗研究的主要类型有两种：1、亚单位疫苗：基于OspA和OspC的研究较多；2、蜱载体疫苗：用化学毒素或转基因方法修饰载体传播病原体的能力或用重要载体抗原疫苗清除载体。

已有研究证实莱姆病螺旋体外膜蛋白OspA，OspB，OspC等是能诱导机体产生免疫保护的蛋白。在亚单位疫苗研制中伯氏疏螺旋体的外表蛋白(OspA)是良好的亚单位疫苗候选者。考虑到莱姆病螺旋体基因结构和抗原性方面的多态性和异质性，即不同基因型间菌株存在明显的差异，难以获得良好的交叉免疫保护，解决此问题的方法是研制针对不同地区主要致病基因型和/或亚型的多价亚单位疫苗。

1998年12月重组的狭义伯氏疏螺旋体(B.b.s.s)基因型OspA疫苗(LYMErix)在美国上市，但最终因为可能存在的副反应(关节炎)从市场撤回。研究发现引起人产生关节炎等副反应的原因可能与OspA蛋白上84-113位残基对应的肽段所引起人体内特异性T细胞的增加有关，另有研究证明莱姆病螺旋体OspA蛋白上的165-173位残基参与人类LFA-1蛋白的自身免疫启动。进一步地，科研人员采用去除或替代交叉反应抗原表位的OspA序列用于研制OspA的亚单位疫苗。

目前已有研究证明我国主要致病基因型伽氏疏螺旋体(B.garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)的OspA全长蛋白对动物具有较好的免疫保护性，但去除可能产生副反应的片段后的OspA肽段是否能和全长蛋白一样对机体产生免疫保护作用尚未见相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用。

本发明构思如下：为研究中国莱姆病主要致病基因型的亚单位疫苗，本发明对我国主要致病基因型伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)代表菌株PD91的OspA羧基端(126-274aa)肽段片段(SEQ ID NO:1)，基因序列全长为447bp(SEQ ID NO:2)，应用基因重组技术，使两端添加了EcoRⅠ和HindⅢ的OspA片段序列与His标签融合进行克隆表达，并通过大量的动物实验对其免疫保护性进行研究，从而为中国莱姆病亚单位疫苗的研究提供科学数据。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)来自伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

第二方面，本发明提供编码所述多肽的核酸分子。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供一种组合物，其包含所述多肽和药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第六方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。

第七方面，本发明提供一种联合疫苗组合物，其包含上述疫苗组合物联合至少一种第二疫苗组合物。

优选地，所述第二疫苗组合物防御蜱传疾病。所述蜱传疾病包括但不限于蜱瘫痪、回归热。

第八方面，本发明提供以所述多肽或上述组合物为免疫原制备的特异性抗体。

优选地，所述抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。

第九方面，本发明提供所述多肽或上述组合物的以下任一应用：

1)用于制备治疗或预防疏螺旋体感染的药物；

2)用于制备疏螺旋体感染检测试剂或试剂盒；

3)用于治疗或预防疏螺旋体感染；

4)用于疏螺旋体感染的检测/诊断。

所述疏螺旋体属包括伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、狭义伯氏疏螺旋体等基因型的伯氏疏螺旋体。

第十方面，本发明提供所述多肽或上述组合物在制备治疗或预防伽氏疏螺旋体感染的药物中的应用。

其中，所述伽氏疏螺旋体感染导致莱姆病。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的莱姆病螺旋体--伽氏疏螺旋体OspA肽段(126-274aa)或含His标签的OspA肽段(重组OspA-pep蛋白)对家兔具有较好的免疫保护性，且不会对机体产生不良的副反应。本发明为伯氏疏螺旋体感染的治疗或预防提供有效手段。本发明提供的重组OspA-pep蛋白免疫实验动物后可以刺激机体产生高滴度的抗体(最高可达1:2048)；体外中和试验表明，重组OspA-pep蛋白免疫后产生的抗体对伽氏疏螺旋体(代表菌株PD91)和阿氏疏螺旋体(代表菌株FP1)都具有很好的中和作用。对10⁶/ml的B.garinii和B.afzelii型代表菌株PD91和FP1的中和率达100％，对10⁷/ml的FP1的中和率为100％，对10⁷/ml的PD91的中和率为60％；抗体持续时间研究表明，重组蛋白免疫后抗体持续上升，45-60天达高峰后持续60-90天，之后逐渐下降。

附图说明

图1为本发明实施例1中PD91菌OspA肽段的克隆表达诱导图(SDS-PAGE检测)；其中，1、蛋白Marker；2、未诱导BL21；3、诱导BL21；4、超声后沉淀；5、超声后上清。

图2为本发明实施例1中莱姆病螺旋体PD91重组OspA-pep纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果；其中，1、蛋白Marker；2、纯化蛋白。

图3为本发明实施例2中40μg重组OspA-pep蛋白免疫家兔抗体滴度变化图。

图4为本发明实施例2中40μg重组OspA-pep蛋白免疫家兔抗体持续时间分析结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中菌株PD91可参见陈建,万康林.中国莱姆病螺旋体PD91重组OspC的鉴定和抗原性检测.中华流行病学杂志,2003；菌株FP1可参见中国莱姆病螺旋体FP1外膜蛋白A的克隆表达及其抗原性的初步研究.郝琴，万康林.中华微生物学和免疫学杂志，2004。

实施例1伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段的表达及鉴定

1、OspA基因片段克隆表达

中国莱姆病螺旋体B.garinii基因型PD91外膜蛋白OspA 126-274aa的基因片段(即从OspA蛋白全长序列中去除了交叉反应序列)，在两端添加EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，并与His标签融合后进行克隆表达，OspA基因片段的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所用引物如下：

上游引物：5’-GAATTCTTTAATGCAAAAGGTGA-3’(下划线标记为EcoRI酶切位点)；

下游引物：5’-AAGCTTTTATTTTAAAGCTGTTTTAAG-3’(下划线标记为HindIII酶切位点)。

将OspA基因片段和质粒PET-30a分别进行双酶切反应，将两个双酶切产物与T4DNA连接酶连接构建成pET-30a-OspApep，转化至BL21感受态细胞，卡那霉素筛选阳性菌落进行培养。挑选阳性克隆菌落活化至菌液OD值为0.6左右时，按最佳表达条件大量表达，纯化。

2、rOspA蛋白表达及鉴定

将含有PD91菌株OspA基因片段的重组质粒转入到BL21中，IPTG浓度设置为1mM，表达温度设置为32℃，培养箱转速设置为160r/min诱导表达，表达产物上清及沉淀用SDS-PAGE电泳检测(图1)。SDS-PAGE电泳分析，上清液中可见明显的特异蛋白表达条带，分子量约为18KD左右(大小约为pET-30a质粒上表达的5KD的多蛋白和OspA基因片段表达的13KD蛋白之和)，沉淀中可见少量特异蛋白表达条带，说明目的蛋白多以可溶形式存在。

3、rOspA-pep蛋白纯化

将PD91菌株OspA的重组质粒pET-30a-OspA转化入BL21中，按最佳表达条件(IPTG浓度1mM，32℃，160r/min)诱导表达4h，采用Merck公司的His标签蛋白纯化试剂盒纯化rOspA蛋白。SDS-PAGE电泳检测结果见图2。

实施例2rOspA-pep蛋白的免疫保护性研究

1、rOspA-pep蛋白最佳免疫剂量筛选

设置7个剂量组(20、30、40、50、60、80、100μg)和1个空白对照组。剂量组用不同剂量的rOspA-pep蛋白免疫新西兰家兔(每组5只)，对照组注射相同体积的PBS进行rOspA-pep最佳免疫剂量筛选。用间接免疫荧光(IFA)法分别检测免疫前和免疫后第15、30、45和60天兔血清的IgG抗体滴度。选取滴度较高的剂量组兔血清进一步进行中和试验。选取10只新西兰家兔(体重2.5kg，雌雄各半)按最佳剂量免疫rOspA-pep蛋白，另5只家兔作为空白对照组(对照组注射PBS溶液)。第1天对其进行首次免疫，第30天进行加强免疫，取首次免疫后第15、30、60、90、120、150和180天血清检测IgG抗体(IFA法)，绘制抗体滴度变化曲线。

实验结果显示，40μg rOspA-pep蛋白免疫后，兔血清抗体滴度在30-60天均达到最高(图3)，选取该剂量进行体外中和试验。结果表明，该剂量rOspA-pep免疫后产生的抗体对10⁶/ml的B.garinii和B.afzelii型代表菌株PD91和FP1的中和率达100％，对10⁷/ml的FP1的中和率为100％，对10⁷/ml的PD91的中和率为60％(表1)。

表1 40μg rOspA-pep蛋白剂量组的体外中和实验结果

注：+：有莱姆病螺旋体生长；—：无莱姆病螺旋体生长。

2、抗体持续时间考察

结果表明10只家兔在免疫2次40μg rOspA-pep蛋白之后，抗体在45-60天均达到高峰，维持60-90天左右开始呈下降趋势(图4)。

可见，本发明提供的rOspA-pep蛋白可对新西兰家兔产生较好的免疫保护性，为伯氏疏螺旋体属感染的治疗或预防提供有效手段。

动物实验结果表明，本发明的rOspA-pep蛋白具有与全长OspA重组蛋白一样的免疫保护性，但去掉了可能引起机体副反应的部分，安全性更好。

莱姆病疫苗研制所面临的主要挑战是伯氏疏螺旋体在基因结构和抗原性方面的多态性和异质性，因此单价疫苗缺乏对不同基因型菌株的交叉保护作用。我国主要存在两种莱姆病致病基因型：伽氏疏螺旋体(B.garinii)和阿氏疏螺旋体(B.afzelii)。本发明中的伽氏疏螺旋体PD91的rOspA-pep蛋白免疫后产生的抗体不仅对伽氏疏螺旋体(B.garinii)PD91有很好的中和作用，而且对阿氏疏螺旋体(B.afzelii)FP1也有很好的中和作用。提示rOspA-pep蛋白可能对阿氏疏螺旋体(B.afzelii)也会产生保护作用。本发明为重组OspA肽段在不同菌株之间的免疫保护性和多价嵌合亚单位疫苗的研究提供数据基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 伽氏疏螺旋体OspA蛋白C端肽段及其应用

<130> KHP191113994.8

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> 伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)

<400> 1

Phe Asn Ala Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Val Val Thr Arg Ala Asn

1 5 10 15

Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys

20 25 30

Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala

35 40 45

Asp Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ile Gln Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys

50 55 60

Lys Glu Ile Glu Lys Ala Gly Thr Val Lys Leu Phe Leu Asp Asp Thr

65 70 75 80

Ser Ser Gly Ser Thr Lys Lys Thr Ala Val Trp Ser Asp Thr Ser Asn

85 90 95

Thr Leu Thr Val Ser Ala Asp Ser Lys Lys Ile Lys Asp Phe Val Phe

100 105 110

Leu Thr Asp Gly Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asp Thr Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Ala Gly Thr Ala Thr Glu Ile Lys Asp Leu Ala Ala Leu Lys

130 135 140

Thr Ala Leu Lys

145

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> 伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)

<400> 2

tttaatgcaa aaggtgaatt aagtgaaaaa gtagtaacaa gagcaaatgg aaacagactt 60

gaatacacag aaatgaaaag cgatggatcc ggaaaagcta aagaagtttt aaaagacttt 120

gctcttgaag gaactctaac tgctgacggc aaaacaacgc taacaataca agagggcact 180

gttactttaa aaaaagaaat tgaaaaagct ggaacagtaa aactcttttt agatgacact 240

tcaagtggta gtactaaaaa aacagctgta tggagcgata cttctaacac cttaacagtt 300

agtgctgaca gcaaaaaaat caaagatttc gtgttcttaa cagacggtac aattacagta 360

caaaattacg acacagcagg cactaagctt gcaggtacag caaccgaaat taaagatctt 420

gcagcactta aaacagcttt aaaataa 447

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽包含如下的氨基酸序列或由其组成：

ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或

2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。

5.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求4所述的组合物。

6.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求5所述的免疫原性组合物。

7.一种联合疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求6所述的疫苗组合物联合至少一种第二疫苗组合物；

优选地，所述第二疫苗组合物防御蜱传疾病。

8.以权利要求1所述多肽或权利要求4-7任一项所述组合物为免疫原制备的特异性抗体；优选地，所述抗体为嵌合抗体和/或人源化抗体。

9.权利要求1所述多肽或权利要求4-7任一项所述组合物的以下任一应用：

1)用于制备治疗或预防疏螺旋体属感染的药物；

2)用于制备疏螺旋体属感染检测试剂或试剂盒。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疏螺旋体属包括伽氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体、狭义伯氏疏螺旋体。