KR20130125771A - 다가 키메라 ospc 백시노겐 및 진단 항원 - Google Patents

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리차드 티. 마르코니
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Abstract

라임병에 대한 백신 및 진단제로서 사용하기 위한 키메라 다가 재조합 단백질이 제공된다. 키메라 단백질은 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 및/또는 알파 나선 5 영역의 에피토프를 포함한다. OspC 타입은 포유동물 보렐리아 감염과 연관될 수 있다.

Description

다가 키메라 OSPC 백시노겐 및 진단 항원{POLYVALENT CHIMERIC OSPC VACCINOGEN AND DIAGNOSTIC ANTIGEN}
본 발명은 일반적으로 라임 (Lyme) 병에 대한 백신 및 진단제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물 감염과 연관된 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5의 면역우성 에피토프 및/또는 알파 나선 5 영역/도메인을 포함하는 키메라 (chimera) 다가 재조합 단백질을 제공한다.
라임병은 북미와 유럽에서 가장 흔한 절지동물-매개 질환이다. 이것은 스피로헤테스 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 비. 가리니이 (B. garinii) 및 비. 아프젤리이 (B. afzelii)에 의해 야기된다. 포유동물에 대한 전염은 감염된 익소데스 (Ixodes) 진드기에게 물림으로써 발생한다 ([Burgdorfer et al., 1982], [Benach et al., 1983]). 상당한 이환률이 라임병과 관련되고, 매년 집단의 3%까지 감염되는 지역이 미국과 유럽에 존재한다 [Fahrer et al., 1991]. 감염은 이동성 홍반, 낮은 (low-grade) 열, 관절통, 근육통, 및 두통을 포함할 수 있는 초기 증상을 동반하는 전신 다발적 염증성 질환을 야기한다 [Steere et al., 1977a]. 후기 임상 징후는 심할 수 있고, 부분적으로는 관절염 ([Steere et al., 1977a]; [Eiffert et al., 1998]; [Steere et al., 2004]), 심장염 ([Asch et al., 1994]; [Nagi et al., 1996]; [Barthold et al., 1991]) 및 신경계 합병증 ([Nachman and Pontrelli, 2003]; [Coyle and Schutzer 2002])을 포함할 수 있다. 또한, 라임병에는 진드기 노출에 대한 우려에 의한 야외 레크리에이션 및 사회적 활동의 감소에 의해 표시되는, 유의한 사회경제적 비용이 든다.
약리경제학적 연구는 특히 매년 질환 위험이 1%를 초과하는 집단에서 라임병 백신에 대한 분명한 필요성이 존재함을 보여준다 ([Meltzer et al., 1999]; [Shadick et al., 2001]). 그러나, 현재 백신은 상업적으로 이용가능하지 않은 상태이다. 최초의 인간 라임병 백신은 OspA-기반 LYMErix (글락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline))이었지만; 그의 유지 기간은 짧았고, 판매 감소를 이유로 GSK는 이를 2002년도에 시장에서 자발적으로 철수시켰다. 판매 감소는 HLA-DR4-양성 수여자에서 이론적으로 발생할 수 있는 만성 염증성 관절염을 포함하는 가능한 유해 효과에 대한, 실제 또는 인지되는 우려에 의한 것일 수 있다 [Kalish et al., 1993]. 상기 잠재적인 합병증을 완화하기 위해 새로운 OspA-기반 백시노겐이 개발되었지만 ([Koide et al., 2005]; [Willett et al., 2004]), OspA-기반 백신의 생존력에 대한 문제가 계속 존재한다. 하나의 관심사는 장기간 보호를 유지하기 위해 필요한 추가접종 (boost)의 빈도이다. OspA는 진드기 중간창자에서 발현되고, 진드기가 물었을 때 신속하게 하향조절되고, 포유동물에서 발현되지 않는다 ([Gilmore et al., 2001]; [Schwan et al., 1995]). OspA-기반 백신의 작용 메카니즘은 진드기 내의 스피로헤테스를 표적화하고 그의 전염을 방지하는 것이다 [de Silva et al., 1999]. 전염은 진드기가 물었을 때 48시간 내에 발생하기 때문에, 효과적인 보호는 항-OspA 항체의 높은 순환 역가에 의존적이고, 이것은 잦은 추가접종을 필요로 한다. OspA-기반 백신과 연관된 고유한 문제는 초기 감염 동안 높은 수준에서 발현되고 살균 항체를 유도하는 항원의 사용에 의해 방지될 수 있다.
OspC는 라임병 백신 개발에서 상당한 주목을 받았다. 이것은 비. 부르그도르페리 센수 라토 (B. burgdorferi sensu lato) 복합체의 단리물 사이에서 보편적인 26 kb 환상 플라스미드 상에서 코딩되는 ([Marconi et al., 1993]; [Sadziene et. al., 1993]) 22 kDa의 표면 노출 지질단백질 [Fuchs et al., 1992]이다. 그의 발현은 진드기가 물었을 때 유도되고, 초기 포유동물 감염 동안 유지되고 [Schwan, 2004], 감염 동안 유전적으로 안정하다 ([Hodzic et al., 2000]; [Stevenson et al., 1994] 참조). 항-OspC 항체는 감염에 대해서뿐만 아니라, 백시노겐에 대해 서열이 밀접하게 관련된 OspC를 발현하는 균주에 대해서도 보호를 제공하는 것으로 입증되었다 ([Gilmore et al., 1996]; [Bockenstedt et al., 1997]; [Gilmore and Mbow, 1999]; [Mathiesen et al., 1998]; [Scheiblhofer et al., 2003]; [Jobe et al., 2003]; [Rousselle et al., 1998]; [Wallich et al., 2001]; [Mbow et al., 1999]; [Probert et al., 1997]; [Brown et al., 2005]; [Probert and LeFebvre 1994] 참조). OspC 서열의 분석은 문자 지정 (A 내지 U)에 의해 구별되는 ~21 OspC 계통발생 (phyletic) 클러스터 또는 타입을 설명하였다 ([Seinost et al., 1999]; [Wang et al., 1999] 참조). 클러스터 내의 서열 변이는 일반적으로 OspC 타입 사이에서 2% 미만이지만, 22%만큼 높을 수 있다 ([Wang et al., 1999]; [Theisen et al., 1995]; [Brisson and Dykhuizen, 2004] 참조). 상기 에피토프의 타입간 변이는 단일 OspC 타입을 사용한 백신 접종에 의해 제공되는 제한된 보호 범위를 가장 가능성있게 설명한다.
미국 특허 6,248,562 (2001년 6월 19일, 던 (Dunn) 및 루프트 (Luft))에는 동일한 및/또는 상이한 종의 보렐리아의 대응하는 및/또는 비-대응하는 단백질로부터의 적어도 2개의 폴리펩티드로 이루어진 키메라 보렐리아 단백질이 기재되어 있다. 키메라 단백질에 통합된 키메라 폴리펩티드는 보렐리아의 임의의 균주로부터의 임의의 보렐리아 단백질로부터 유래하고, OspA, OspB, OspC, OspD, pl2, p39, p41, p66, 및 p93를 포함한다. 키메라 단백질은 보렐리아 감염에 대한 면역진단 시약으로서 및 백신 면역원으로서 사용될 수 있다. 그러나, OspC 단백질에 존재하는 루프 5 및 알파 5 에피토프에 대한 언급은 존재하지 않는다.
미국 특허 6,872,550 및 6,486,130 (각각 2005년 3월 29일, 및 2002년 11월 26일, 둘 모두 리베이 (Livey))에는 OspC 항원을 함유하는, 라임병에 대한 백신으로서 사용하기 위한 구축물이 기재되어 있다. 그러나, 이들 특허에는 루프 5 및 알파 5 에피토프의 특성 결정에 대한 언급은 존재하지 않는다.
미국 특허 7,008,625 (2006년 3월 7일, 타트윌러 (Dattwyler) 등)에는 단일 단백질 내에 다양한 보렐리아 균주 및/또는 단백질들의 항원 폴리펩티드가 개시되어 있다. 키메라 보렐리아 단백질은 외부 표면 단백질 OspA 및 외부 표면 단백질 OspC의 폴리펩티드 단편으로 이루어진다. 이들 단백질은 라임 보렐리아증 (Lyme borreliosis)에 효과적이고 면역진단 시약으로 유용할 수 있다. 그러나, 루프 5 및 알파 5 에피토프의 특성 결정에 대한 언급은 존재하지 않는다.
문헌 ["Recombinant Chimeric Borrelia Proteins for Diagnosis of Lyme Disease" (Maria J. C. Gomes-Solecki et al., 2000. J. Clin. Microbiol., 38: 2530-2535)은 상기 확인된 2개의 특허와 관련된다. 저자들은 보렐리아 부르그도르페리의 핵심 항원 단백질의 일부, OspA, OspB, OspC, 플라겔린 (Fla 또는 p41), 및 단백질 p93을 각각 함유하는 재조합 키메라를 조작하였다. 이 논문은 진단에 관한 것이지만, 마지막 단락에서 백시노겐의 용도를 설명하고 있다. 저자들은 중요한 에피토프의 유전자 변이성에 대한 추가의 연구를 통해 보다 우수한 키메라를 생성할 수 있다고 언급하였지만, OspC의 루프 5 및 알파 5 에피토프는 언급하지 않았다.
선행 기술은 지금까지 라임병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 다수의 OspC 타입에 대한 넓은 보호를 제공하는 백신을 제공하지 못하였다.
발명의 개요
본 발명은 라임병에 대한 백신 및 진단제로서 사용하기 위한 키메라 다가 재조합 단백질을 제공한다. 본 발명은, 각각 포유동물 (예를 들어 인간) 라임병 감염과 연관된 몇몇의 상이한 OspC 계통발생 군 (타입)으로부터의 신규한 보호 에피토프의 발견 및 특성 결정을 기초로 한다. 상기 에피토프의 확인을 통해, 상이한 OspC 감염성 타입으로부터의 많은 에피토프를 포함하는 키메라 단백질 또는 단백질들의 구축이 가능하였다. 따라서, 백신으로서 사용될 때, 키메라 재조합 단백질은 OspC 타입을 발현하고 포유동물 라임병과 연관되는 많은 보렐리아 균주에 대한 넓은 보호를 유도한다. 또한, 키메라 단백질은 에피토프에 대한 항체를 갖는 개체를 확인하고 따라서 개체가 라임병의 원인 물질에 노출되었는지 또는 이 물질에 의해 감염되었는지를 결정하기 위한 진단 도구로서 유용하다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 에피토프는 B-세포 에피토프 및/또는 면역우성 에피토프이다.
본 발명의 목적은 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질을 제공하는 것이다. 한 실시양태에서, OspC 타입은 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, OspC 타입은 침습성 보렐리아 감염과 연관된다.
본 발명은 그를 필요로 하는 개체에서 보렐리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 개체에게 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, OspC 타입은 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, OspC 타입은 침습성 보렐리아 감염과 연관된다.
본 발명은 개체가 보렐리아에 노출되었는지 또는 보렐리아로 감염되었는지를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 이 방법은 1) 개체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 2) 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 재조합 키메라 단백질에 생물학적 샘플을 노출시키는 단계; 3) 상기 생물학적 샘플 내의 항체가 적어도 하나의 키메라 단백질에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 항체 결합의 검출은 보렐리아에 대한 이전의 노출 또는 보렐리아에 의한 감염을 나타낸다. 본 발명의 한 실시양태에서, OspC 타입은 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, OspC 타입은 침습성 보렐리아 감염과 연관된다.
본 발명 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질에 대한 항체를 추가로 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, OspC 타입은 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, OspC 타입은 침습성 보렐리아 감염과 연관된다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 보렐리아 스피로헤테스 (Borrelia spirochetes)에 대해 살균성이다.
본 발명은 키메라 재조합 단백질의 면역원성 칵테일 (cocktail)을 추가로 제공한다. 칵테일 내의 각각의 키메라 재조합 단백질은 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함한다.
도 1. 미국 메릴랜드주의 인간 환자로부터 유도된 OspC 서열의 진화 관계: OspC 타입 확인. OspC 유전자를 PCR 증폭하고, 서열결정하고, 계통도를 제작하였다. 22 ospC 타입을 나타내는 데이타베이스 서열을 분석에 포함시켰다 (기탁 번호를 표시함). 각각의 계통발생 군에 할당된 타입 지정 (대문자)은 각각의 가지 상의 대문자로 표시된다. 부트스트랩 (bootstrap) 값 (1000회 시험)은 군 구별에 중요한 각각의 마디에 제시된다.
도 2. 감염 동안 OspC에 대한 항체 반응이 우세하게 OspC 타입 특이적임의 증명. 몇몇의 OspC 타입의 재조합 OspC 단백질 (도면에 표시된)을 생성하고, SDS-PAGE에 의해 분리하고, 면역블로팅하고, HRP 접합된 S-단백질 또는 나타낸 바와 같은 공지의 OspC 타입의 클론 단리물로 감염된 마우스로부터 수집된 혈청으로 스크리닝하였다.
도 3a-c. 타입 A OspC의 면역우성 에피토프의 위치 결정. 타입 A OspC의 말단절단 (truncation)을 S-태그 융합 단백질로서 생성하고, 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현시켰다. 패널 a는 OspC 말단절단의 개략도를 제시한다. 넘버링 (numbering)은 비. 부르그도르페리 B31MI OspC의 잔기 넘버링을 반영한다. 패널 a에서, 각각의 말단절단된 단백질이 감염 항체에 결합하는 능력은 우측에 (+) 또는 (-)로 표시된다. 좌측의 숫자는 각각의 말단절단을 포함하는 아미노산 잔기를 나타낸다. 패널 b 및 c에서, 재조합 단백질의 면역블롯을 발현 및 로딩을 확인하기 위해 HRP-접합된 S-단백질로 또는 타입 A OspC 생산 균주인 비. 부르그도르페리 B31MI로 감염된 마우스로부터의 혈청 (α-B31MI 감염 혈청)으로 스크리닝하였다. 참조를 위해, 패널 b 및 c 내의 화살표는 나타낸 α-B31MI 감염 혈청과 면역반응성이 아닌 재조합체의 이동 위치를 나타낸다. 분자 질량 마커는 각각의 면역블롯의 우측에 표시된다.
도 4a 및 b. 표 형태로 제시된, 타입간 (intertype) 및 타입내 (intratype) 수준의 루프 5 및 알파 5 에피토프의 세그먼트의 비교 분석.
도 5. 상이한 타입 A OspC 생산 균주로 감염된 다수의 동물에서 루프 5 항체 반응의 증명. 1) 전장 타입A OspC 또는 2) 아미노산 130-150을 함유하는 (루프 5를 포함하는) 단편의 면역블롯을 감염 혈청으로 스크리닝하였다. 감염 혈청 생성에 사용된 균주 및 혈청이 그로부터 수집된 구체적인 마우스 (m)가 각각의 패널 위에 표시된다. 혈청이 수집되는 감염 동안의 시점도 표시된다. 등량의 단백질을 각각에 대해 면역블로팅하고, 모두 동일한 시간 동안 필름에 노출시켰다.
도 6. ELISA: 타입 A OspC 표적화 항체를 보유하는 혈청 샘플의 확인. r-타입 A 전장 OspC, r-타입 A 루프 5, 및 소 혈청 알부민을 사용하여 ELISA 플레이트의 웰을 코팅하였다. 웰을 인간 라임병 환자로부터의 혈청으로 스크리닝하였다. 모든 검정은 삼중으로 수행하고, 평균을 표준 편차와 함께 제시한다. 모든 방법은 본원에서 설명되는 바와 같았다. 환자 15로부터의 혈청은 음성 대조군으로서 기능하는 비. 부르그도르페리 B31MI에 대한 항체에 대해 IgG 음성으로 결정되었다.
도 7a 및 b. PepSpot 분석을 통한, 타입 A OspC 루프 5 에피토프를 포함하는 특이적 잔기의 확인. 루프 5 도메인에 걸치는 중복 (overlap) 펩티드를 생성하고, 니트로셀룰로스 상에 점재시켰다. 이어서, 고정된 펩티드를 타입 A OspC-생산 균주 (B31 MI)의 클론 집단으로 감염된 마우스로부터의 혈청으로 또는 인간 라임병 환자 (지시된 바와 같이)로부터의 혈청으로 스크리닝하였다. (A) 루프 5 도메인에 대한 면역블로팅 결과; (B) 펩티드 서열.
도 8. 루프 5가 표면 노출되고 루프 5에 대한 항체가 살균성임의 증명. IFA 및 살균 검정은 타입 A 루프 5에 대해 생성된 항혈청을 사용하여 수행하였다. (A) 결과는 항-루프 5 항혈청의 특이성을 보여준다. 비. 부르그도르페리 B31 MI, 비. 파르케리 (B. parkeri), 및 r-타입 A 루프 5 단편의 전체-세포 용해물을 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 면역블로팅하고, 항-타입 A 루프 5 항혈청 (1:1,000)으로 스크리닝하였다. 단백질 마커의 분자 질량을 도면의 우측에 표시한다.
도 9a 및 b. 4가 키메라 OspC 시험 구축물의 생성. a, 4가 ABKD 키메라 백시노겐 구축물의 생성에 대한 흐름도가 패널 a에 제시된다. ABKD 키메라 백시노겐에 사용된 타입-특이적 OspC 에피토프는 상이한 막대 음영으로 표시된다. OspC 타입 A의 루프 5 에피토프 및 타입 B, K 및 D의 알파 나선 5 에피토프를 PCR 라운드 1에서 증폭하고, 겔 정제하였다. 이어서, 상기 초기의 앰플리콘은 후속 라운드의 PCR에서 연결되어 전체 키메라 구축물을 생성하였다. 앰플리콘의 말단 (링커 서열)은 상보성이기 때문에, 변성 후에 말단들은 중복 연장을 허용하기 위해 어닐링 (annealing)된 후, PCR에 의해 증폭될 수 있다. 최종 앰플리콘은 pET46 Ek/LIC 벡터 내로 어닐링되었다. b, 패널 b에서, ABKD 키메라 백시노겐 구축물의 최종 단백질 서열은 표시된 구성 에피토프-함유 영역 및 링커 서열과 함께 제시된다.
도 10. 항-ABKD 항혈청의 ABKD 키메라 백시노겐 및 전장 OspC와의 면역반응성을 보여주는 웨스턴 블롯 (Western blot). 면역원성은 ABKD 키메라 백시노겐, 타입 A, B, K 및 D (지시된 바와 같이)의 전장 r-OspC 단백질, 및 rBBN39 (음성 대조군)를 면역블로팅함으로써 평가하였다. 블롯을 대략 동일한 로딩을 보여주기 위한 항-His 태그 mAb로, 또는 대표적인 항-ABKD 항혈청 (아래에 나타낸 바와 같은)으로 스크리닝하였다. 분자 질량은 우측에 제시된다. A, B 및 K에 대한 강한 IgG 반응이 관찰되었다 (D에서는 관찰되지 않았다).
도 11a 및 b. ABKD 키메라 백시노겐으로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청의 반응성의 ELISA 적정. a, ABKD 키메라 백시노겐으로 백신접종된 마우스로부터의 혈청 (n=12) 또는 PBS/아주반트 (adjuvant)로 면역화된 샴 (sham) (n=3)을 ABKD 키메라 백시노겐 또는 타입 A, B, K, 및 D의 rOspC 단백질과의 반응성에 대해 적정하였다. 패널 a는 모든 혈청의 ABKD 키메라 백시노겐 구축물에 대한 면역반응성의 적정 (각각의 마우스에 대한 상이한 기호의 실선)을 보여준다. Ab 반응은 샴 백신접종된 마우스에서 관찰되지 않았다 (파선). b, 각각의 OspC 타입에 대한 특이적인 반응의 적정도 수행하였고 (곡선 미제시), ½ 최대 OD405에서 결정된 역가를 패널 b에 제시한다 (마우스당 하나의 점, 평균 역가 - 수평선). 대조군 마우스는 역가를 갖지 않았고, 도시하지 않았다.
도 12. 항-ABKD 항혈청의 면역글로불린 이소형 프로파일. ELISA 웰을 ABKD 키메라 백시노겐 구축물 (100 ng/웰)로 코팅하고, 항-ABKD 항혈청으로 이중으로 프로빙하였다 (1:10000; n=12). 결합된 Ig는 비오티닐화 이소형-특이적 2차 Ab (마우스 이소형 결정 키트; 자이메드 래보러토리즈) 및 HRP-접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다. 반응성은 ABTS 기질의 HRP-매개 전환에 의해 생성된 발색 생성물의 측정에 의해 정량하였다.
도 13a-e. ABKD 백신 변이체 구축에 대한 개략도. ABKDppa (패널 a)는 C-말단 아미노산을 부가하기 위해 5' 오버행 (overhang)을 갖는 역방향 프라이머를 사용한 본래의 구축물의 증폭에 의해 구축하였다. ABKDgg (미제시)는 동일한 방식을 사용하되, OCDH5ggLIC 프라이머를 사용하였다. ABKDD (패널 b), ADBK (패널 c), 및 ADBKD (패널 d)는 모두 링커 서열을 코딩하는 테일을 부가하는 프라이머를 사용한 구성 서열의 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 생성되는 PCR 생성물을 겔 정제하고, 중복부 어닐링 및 연장에 의해 연결하였다. 최종 생성물을 pET-46 Ek/LIC 벡터 내에 클로닝하였다. OspC 타입-특이적 에피토프 함유 영역은 문자로, 링커 서열은 숫자로 나타낸다 (코딩되는 아미노산 서열 내의 삽화 참조). 화살표는 프라이머를 나타내고, 5' 오버행 LIC 테일 또는 링커 서열은 각각의 프라이머 화살표의 테일 상에 표시된다.
도 14. 키메라 백시노겐 시험 구축물의 쿠마시 (Coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔. 백시노겐 r-단백질을 이. 콜라이에서 발현시키고, 니켈 크로마토그래피에 의해 친화도 정제하고, BCA 방법에 의해 정량하였다. 2 ㎍의 정제된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 (크라이테리온 (Criterion); 바이오라드 (Biorad)) 상에서 전기영동하고, 쿠마시 G-250으로 염색하였다. 오염 단백질은 관찰되지 않았고, 재조합 단백질은 최소로 분해되거나 분해되지 않았다.
도 15a 및 b. 전장 r-OspC의 마우스 백신 혈청 인식의 평가. 패널 a에서, 타입 A, B, K, 및 D의 r-OspC를 전기영동하고, PVDF에 블로팅하고 (타입은 상부에 나타냄; 500 ng/레인), 각각의 변이체 구축물 (좌측에 표시함)로 백신접종된 마우스로부터의 대표적인 혈청의 1:2500 희석액으로 프로빙하였다. 2차 검출은 퍼옥시다제-접합된 염소-항-마우스 IgG (1:40000) 및 화학발광에 의해 수행하였다. 분자 질량은 우측에 나타내었다. 패널 b에는 전장 r-OspC와의 마우스 백신 혈청 반응성의 정량적 ELISA 적정의 결과가 제시된다. 각각의 백신 구축물 (하부에 나타냄)에 대해 생성된 혈청을 타입 A, B, K, 및 D의 고정된 전장 r-OspC에 대해 적정하였다. 또한, PBS에 대해 투석된 ABKD 구축물 (ABKD*)로부터의 역가가 포함된다 [17]. 막대는 OspC 타입 A (흑색), B (회색), K (비어있음), 및 D (가는 평행선)에 대한 평균 역가를 나타낸다. 개개의 마우스로부터의 역가는 빈 삼각형으로 표시된다. 아래에 평균 역가 수치, 및 PBS에 대해 (ABKD*) 또는 Arg/Glu 완충제 (ABKD)에 대해 투석된 ABKD 구축물의 대응하는 역가로 지수화된 역가가 나열된다.
도 16a-c. 3개의 백신 구축물에 대한 에피토프-특이적 이소형 반응. OspC 타입 A, B, K, 및 D를 ELISA 플레이트에 고정하고, 이중으로 ABKD, ABKDD, 또는 ADBKD 구축물로 백신접종된 마우스로부터의 면역 혈청으로 프로빙하였다. 결합된 Ig 이소형을 비오티닐화 이소형-특이적 2차 항체 및 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다.
도 17. 면역화 항원을 사용한 시험관 내 재자극에 대한 면역화된 마우스로부터의 비장세포의 IFN-γ 반응. 각각의 6개의 백신 구축물로 면역화된 3마리의 마우스로부터의 적혈구-미함유 비장세포를 수거하고, 모으고, 본래의 면역화 항원 (24 웰 플레이트 내 107 세포/mL, 10 또는 5 ㎍/mL의 항원)으로 삼중으로 재자극하였다. 삼중 대조군 웰에 10 mg/mL BSA를 투여하거나 또는 단백질을 투여하지 않았다. 96시간 동안 인큐베이션 (37℃, 5% CO2) 후에, 세포 미함유 상청액을 수집하고, IFN-γ 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 모든 경우에, BSA 및 단백질 미함유 웰 내의 IFN-γ의 농도는 검정 검출 한계 미만이었다.
도 18a 및 b. 프로인트 (Freund) 아주반트 또는 명반 내에서 투여된 ABKD 백시노겐에 대한 항체 반응의 평가. 패널 a에 프로인트 아주반트 (실선 막대)에 유화시킨 또는 명반 (가는 평행선이 그려진 막대)에 흡착시킨 ABKD 백신에 대해 생성된 마우스 혈청 내의 IgG의 정량적 ELISA 적정의 결과가 제시된다. 혈청을 고정된 ABKD 백시노겐 또는 타입 A, B, K, 및 D의 전장 r-OspC에 대해 적정하였다. 패널 b에는 고정된 ABKD 백시노겐에 결합된 혈청의 이소형 프로파일이 제시된다. 결합된 Ig 이소형은 비오티닐화 이소형-특이적 2차 항체 및 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘으로 검출하였다.
도 19. OspC 단백질 서열 동일성의 쌍별 비교의 분포. 280 보렐리아 단리물로부터의 OspC 단백질 서열을 PAM40 평가 매트릭스를 사용하여 Clustal 정렬하고, 쌍별 동일성 비율을 계산하였다. 막대그래프 간격은 1%이고, <50%의 동일성 비율은 존재하지 않았다.
도 20a-c. 지정된 OspC 타입에 대한 종, 지리학적 및 생물학적 단리 데이타.
도 21a-c. 대표적인 OspC 단백질 서열의 일치 (consensus) 계통수. 아미노산 20-200 (A), 20-130 (B), 및 131-200 (C)을 포함하는 OspC 서열을 부트스트래핑하고 (n=1000), 거리를 계산하고, 이웃 연결 트리 (neighbor joining tree)를 생성하고, 일치 트리로 조정하였다. 비. 헤름시이 (B. hermsii)의 Vmp33 서열을 외집단 (outgroup)으로 사용하였다. 라벨은 비. 부르그도르페리 (Bb), 비. 가리니이 (Bg), 또는 비. 아프젤리이 (Ba)로서의 종, 단리물 균주 지정, 지정된 OspC 타입 (볼드체), 및 상기 단일 서열 (괄호 내의)에 의해 표시되는 다른 균주로부터의 동일한 OspC 서열의 수를 나타낸다. 부트스트랩 지지값은 OspC 타입 사이에서 구분되는 모든 마디에서 제시된다.
도 22. OspC 타입 Pki (비. 가리니이; 흑색 실선), F (비. 부르그도르페리; 회색 실선), 및 M (비. 부르그도르페리; 흑색 파선)과 비교한, OspC 타입 PLj7 (비. 아프젤리이) ospC 서열의 부트스캔 (Bootscan) 분석. 부트스캔 윈도우는 40개 염기이고, 10개 염기 스텝이 존재하였다. 비교는 100개 부트스트랩 복제물의 엄격한 일치에 의해 수행하였다. 그래프는 % 순열 트리 (permuted tree)가 50%를 초과하는 피크만을 보여줌으로써 단순화하였고, 가능한 재조합을 나타내는 것으로 간주되는 70% 수준이 표시된다.
도 23. 상기 연구에서 규정된 모든 OspC 타입으로부터의 OspC 단백질 서열의 에피토프-함유 영역의 정렬. 1 초과의 아미노산이 상이한 OspC 타입 내의 모든 서열이 대표적인 서열로 표시된다. 음영의 동일성 역치는 80%이다. 2차 구조적 알파 나선 및 루프 (B31 구조에 대응)가 정렬 아래에 제시된다 (Kumaran et al., 2001).
도 24. ABKD 키메라 백시노겐의 구축에 사용된 모 OspC 서열의 Clustal X 정렬 및 백시노겐에 포함된 에피토프-함유 영역의 물리적 위치. OspC 타입 A (루프 5 영역, 연회색 박스) 및 타입 B, K, 및 D (알파 나선 5 영역, 암회색 박스)의 에피토프-함유 영역의 위치는 모 서열의 Clustal X 정렬 내에 강조된다.
도 25a-j. 본 발명의 예시적인 키메라 백시노겐. 구축물 표제는 구축물에 포함된 OspC 타입-특이적 루프 5 및 나선 5 에피토프 및 그의 순서를 나타낸다. 볼드체 X는 임의의 링커 서열의 위치를 나타낸다.
도 26. 몇몇의 보렐리아 균주로부터의 OspC의 단백질 및 DNA 기탁 번호.
도 27. ELISA 방식에서 키메라 A8.1 단백질을 사용한 진드기-시험접종된 개에서 라임병 혈청 전환의 평가. ELISA 플레이트를 카르보네이트 완충제 내의 100 ng/웰의 A8.1 단백질로 코팅하였다. 시험접종 후 제3, 4, 및 5주에 수집된 비시험접종된 (대조군) 및 진드기-시험접종된 개로부터의 혈청을 희석하고 (1:250), ELISA 플레이트에 이중으로 적용하였다. 인큐베이션 후에, 결합된 개 Ig는 IgG-특이적인 퍼옥시다제-접합된 2차 항체로 검출하였다 (1:20000). 반응성은 TMB-기반 색소원을 사용하여 정량하였다. 각각의 막대는 동물에 대한 평균 데이타를 나타낸다.
도 28a-d. a, 비. 부르그도르페리로부터의 OspC의 대표적인 서열 내의 일반적인 에피토프 위치; b, A9.1 구축물 내의 에피토프 패턴; c, B9.1 구축물 내의 에피토프 패턴; d, C9.1 구축물 내의 에피토프 패턴.
도 29a-c. a, A9.2 구축물 내의 에피토프 패턴; b, B9.2 구축물 내의 에피토프 패턴; c, C9.2 구축물 내의 에피토프 패턴.
도 30a-c. a, A9.3 구축물 내의 에피토프 패턴; b, B9.3 구축물 내의 에피토프 패턴; c, C9.3 구축물 내의 에피토프 패턴. "루프"는 나선 3을 포함하는 루프 5 영역을 나타낸다.
본 발명은 인간 라임병 감염과 연관된 OspC 타입의 신규한 보호성, 타입-특이적 에피토프의 확인 및 특성 결정을 기초로 한다. 신규한 에피토프는 OspC의 카르복실-말단 절반 내의 2개의 도메인 (영역) 내에 위치한다. 어느 도메인도 이전에 고 면역원성으로 확인되지 않았다. 제1 도메인 (본원에서 "알파 나선 5 영역/도메인" 또는 "알파 5 영역/도메인" 또는 "나선 5 영역/도메인"으로 언급됨)은 잔기 160 내지 200에 위치하고, 루프 6의 일부, 알파 나선 5, 및 비구조적 (unstructured) C-말단 도메인을 포함하는 2차 구조적 요소를 함유한다 (Kumaran et al., 2001). 제2 도메인 (본원에서 "루프 5 영역/도메인")은 잔기 131 내지 159에 위치하고, 알파 나선 3의 일부, 루프 5 및 알파 나선 4를 포함하는 2차 구조적 요소를 함유한다 (Kumaran et al., 2001). 각각의 상기 영역은 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유한다. 상기 2개의 도메인으로부터의 에피토프, 또는 상기 2개의 영역 내로부터의 항원 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 실시에서 단독으로 또는 바람직하게는 키메라 면역원 내의 다른 에피토프와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 에피토프는 면역우성 에피토프이다. 일반적으로, 에피토프는 B-세포 에피토프이지만, T-세포 에피토프가 배제되지 않는다.
신규한 에피토프의 발견, 및 상이한 OspC 타입에 대한 에피토프의 매핑 (mapping)에 의해, 다수의 OspC 타입으로부터의 많은 선형, 타입-특이적 면역우성 에피토프를 함유하는 다가 키메라 단백질의 구축이 가능해졌다. 백신으로서 사용될 때, 다중가 (다가) 재조합 키메라 단백질은 키메라 단백질 내의 것에 대응하는 OspC 타입을 발현하는 보렐리아 스피로헤테스, 즉, 고 감염성인 보렐리아의 감염에 대한 넓은 보호를 유도한다. 또한, 키메라 단백질은 키메라 단백질에 함유된 에피토프에 대한 항체를 갖는 개체를 확인하고 따라서 개체가 라임병의 원인 물질에 노출 및/또는 감염되었는지를 결정하기 위한 진단 도구로서 유용하다.
본 발명의 이해를 촉진하기 위해, 다음 정의를 제공한다:
항원: 항체가 결합되는 실체 (identity)를 지정하고 또한 항체의 생산을 유도하는 실체를 지정하기 위해 역사적으로 사용된 용어. 보다 현재의 용법은 항원의 의미를 항체가 결합되는 실체로 제한하고 있고, 용어 "면역원"은 항체 생산을 유도하는 실체에 대해 사용된다. 본원에서 논의되는 실체가 면역원성이면서 항원인 경우에, 면역원 또는 항원으로서의 언급은 일반적으로 그의 의도되는 유용성에 따라 이루어질 것이다. 용어 "항원", "면역원" 및 "에피토프"는 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다.
B-세포 에피토프: B-세포 수용체에 의해 인식되고 분비된 항체에 의해 결합될 수 있는 항원 상의 특이적인 화학적 도메인. 이 용어 "항원 결정자"와 교환가능하다.
면역우성 에피토프: 우성, 또는 가장 강한 면역 반응을 유도하는 분자 상의 에피토프.
선형 에피토프: 펩티드 결합에 의해 함께 연결되어 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 아미노산의 단일, 비-중단된, 연속적인 사슬을 포함하는 에피토프. 상기 에피토프는 그의 1차 구조, 즉, 사슬 내의 아미노산의 선형 서열에 의해 설명될 수 있다.
입체형태적 에피토프: 아미노산의 비중단된 선형 서열은 아니지만 단백질의 2차, 3차 및/또는 4차 상호작용에 의해 에피토프 내의 다른 잔기와 근접하게 위치하는 적어도 몇몇의 아미노산을 포함하는 에피토프. 상기 잔기는 1차 서열에 대해 에피토프 내의 다른 잔기로부터 멀리 위치할 수 있지만, 단백질 폴딩에 의해 공간적으로 입체형태적 에피토프 내의 다른 잔기 근처에 위치할 수 있다.
루프 5 영역/도메인: 도 23에서 알 수 있는 바와 같이 타입 A OspC 서열의 잔기 131 내지 159과 정렬되는 잔기를 포함하는 OspC의 영역. 이 영역에 포함되는 균주 B31 OspC 2차 구조적 요소는 문헌 [Kumaran et al., (2001)]에 의해 규정된 바와 같이 알파 나선 3의 일부, 루프 5, 및 알파 나선 4이다.
알파 나선 5 영역/도메인: 도 23에 제시된 균주 B31 (OspC 타입 A) 서열의 아미노산 160 내지 200과 정렬되는 잔기, 및 도 23에 제시되지 않은 단백질의 C-말단 부분 (B31 서열의 아미노산 201-210)을 포함하는 영역. 상기 영역에 포함되는 균주 B31 OspC 2차 구조적 요소는 문헌 [Kumaran et al., (2001)]에 의해 규정된 바와 같이 루프 6의 일부, 알파 나선 5 및 비구조적 C-말단 도메인의 일부이다.
단백질: 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 약 100개 이상의 아미노산의 선형 서열.
폴리펩티드: 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 약 20 내지 약 100개의 아미노산의 선형 서열.
펩티드: 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 약 20개 이하의 아미노산의 선형 서열.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 교환가능하게 사용된다.
키메라 단백질: 그의 1차 서열이 자연에서 단일 분자로 함께 발생하지 않는 다수의 펩티드, 폴리펩티드, 및/또는 단백질 서열을 포함하는 것인 재조합 단백질.
키메라 단백질의 결합가 (예를 들어 "다중가" 또는 "다가")는 키메라 백시노겐에 포함된 OspC 타입-특이적 에피토프-보유 폴리펩티드의 수를 의미한다. 예를 들어, 2가 키메라는 타입 A의 알파 나선 5 및 타입 B의 알파 나선 5, 또는, 타입 A의 알파 나선 5 및 타입 A의 루프 5로 이루어질 수 있다. 각각의 폴리펩티드 에피토프-보유 영역에 다수의 별개의 에피토프가 존재할 수 있다.
본래의 또는 천연 또는 야생형 서열: 자연에서 발견되는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산의 서열.
재조합 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산: 분자 생물학 기술, 예컨대 클로닝, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 등을 사용하여 생산 및/또는 조작된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산.
타입-특이적: 주로 단일 계통발생 군과 연관된.
침습성 감염: OspC 단백질은, 진드기가 문 초기 접종 주위의 피부 이외의 다른 위치 (예를 들어 혈장, 뇌척수액 등)로부터 인간 감염 동안 OspC 타입 보유 보렐리아가 단리될 경우, "침습성 감염과 연관된" 것으로 언급된다.
따라서, 본 발명은 적어도 2개가 침습성 감염과 연관된 상이한 OspC 타입으로부터 유래된 루프 5 및/또는 알파 나선 5 영역으로부터의 다수의 선형 에피토프를 포함하는 재조합 키메라 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 약 2 내지 약 20, 바람직하게는 약 5 내지 약 13개의 상이한 OspC 타입을 나타내는 항원 에피토프가 단일 키메라 단백질에 포함된다. 일부 실시양태에서, 키메라 재조합 단백질은 5개의 OspC 타입, 또는 6개의 OspC 타입, 또는 7개의 OspC 타입, 또는 8개의 OspC 타입, 또는 9개의 OspC 타입, 또는 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함한다. 일반적으로 적어도 2개의 에피토프는 1차 서열에서 서로 상이하고 상이한 OspC 타입으로부터 기원하지만, 키메라에 단일 타입의 에피토프의 다수의 카피를 포함하거나, 또는 동일한 OspC 타입의 본래의 서열을 기초로 하거나 이로부터 유래된 몇몇의 서열을 포함하는 것도 가능하다. 키메라 내의 선형 에피토프의 총수는 다소 상이할 수 있지만, 일반적으로 약 10 내지 30일 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 면역우성 에피토프는 OspC 타입 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T 중의 2 이상으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 키메라 단백질은 4가이고, 타입 A, B, K 및 D로부터의 에피토프를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 단백질은 8가이고, OspC 타입 E, N, I, C, A, B, K 및 D로부터의 에피토프를 함유한다. 그러나, 당업자는 생성되는 키메라가 적합한 면역 반응을 생성하고/하거나 라임병 예방시에 백신으로서 효과적이라면, OspC 타입의 다른 조합으로부터의 에피토프도 사용될 수 있음을 알 것이다. 본원에서 개시되는 많은 예에 의해 입증되는 다른 적합한 조합의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 1) A, B, K, D, E, N, C; 2) I, C, A, B, K, D; 및 3) C, A, B, K, D.
일부 실시양태에서, 키메라 단백질은 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266, 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖거나; 또는 서열 250-267에 제시된 아미노산 서열 중의 임의의 하나에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
추가의 실시양태에서, 키메라 재조합 단백질 내의 적어도 하나의 OspC 타입은 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관된다.
본 발명은 상기 키메라 재조합 단백질을 사용하여 그를 필요로 하는 개체에서 보렐리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 추가로 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 개체가 보렐리아에 노출되었는지 또는 보렐리아로 감염되었는지를 확인하기 위한 진단 방법을 제공한다. 이 방법은 1) 상기 개체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 2) 생물학적 샘플을 본원에서 설명되는 적어도 하나의 재조합 키메라 단백질에 노출시키고; 3) 생물학적 샘플 내의 항체가 적어도 하나의 키메라 단백질에 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 항체 결합의 검출은 보렐리아에 대한 이전의 노출 또는 보렐리아에 의한 감염을 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 설명되는 키메라 재조합 단백질에 대한 항체; 및 본원에서 설명되는 키메라 재조합 단백질을 포함하는 면역원성 칵테일을 제공한다.
일부 실시양태에서, 루프 5 및 알파 나선 5 영역 둘 모두가 포함될 것이다. 예를 들어, "E, N, I, C, A, B, K, D" 구축물은 각각의 OspC 타입 E, N, I, C, A, B, K, 및 D의 루프 5 및 나선 5 영역 둘 모두를 포함할 수 있다. 그러나, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 타입 A의 루프 5 영역 및 E, N, I, C, B, K, 및 D의 알파 나선 5 영역이 포함될 수 있거나; 또는 단지 각각의 OspC 타입에 대한 루프 5 영역만이 포함될 수 있거나; 또는 단지 알파 나선 5 영역; 또는 다른 조합이 포함될 수 있다 (예를 들어, 타입 E, N, I, 및 C의 루프 5 영역 및 타입 A, B, K, 및 D의 알파 나선 5 영역). 많은 상기 조합을 당업자는 생각할 수 있고, 모든 상기 변이는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 키메라 내의 에피토프의 선형 순서는 상이할 수 있다. 일반적으로, 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로의 순서는 "루프 5 영역, 알파 나선 5 영역, 루프 5 영역, 알파 나선 5 영역..." 등일 것이다. 예를 들어, E, N, I, C, A, B, K, D 구축물의 경우에, 바람직한 순서는 키메라의 길이를 따라 "E-타입 A 루프 5 영역, E-타입 알파 나선 5 영역; N-타입 A 루프 5 영역, N-타입 알파 나선 5 영역; I-타입 A 루프 5 영역, I-타입 알파 나선 5 영역..."이고, 상이한 OspC 타입 및/또는 상이한 도메인은 임의로 중성 링커 서열에 의해 분리된다. 그러나, 상기 순서는 예를 들어 키메라 내에 포함되기 위해 선택된 요소에 따라 상이할 수 있다. 생성되는 키메라가 적합한 면역 반응을 생성하고/하거나 라임병 예방시에 백신으로서 효과적이거나, 또는 진단제에서 효과적으로 사용될 수 있다면, OspC 타입 및 도메인의 임의의 순서가 사용될 수 있다. 예시적인 키메라 서열의 예가 도 25a-j에 제시된다. 보렐리아의 몇몇의 균주로부터의 OspC에 대한 단백질 및 DNA 기탁 번호가 도 26에 표 형태로 제시된다.
키메라 단백질에 포함되는 아미노산 서열은 알파 나선 5 및/또는 루프 5 영역, 또는 그의 항원 단편을 포함할 수 있다. "항원 단편"은 감염 동안 인식되는 적어도 하나의 선형 에피토프을 함유하는 1차 OspC 서열의 세그먼트를 의미한다. 상기 에피토프는 OspC의 재조합 단백질 하위단위에서 발현될 때, 세포 표면에 발현되는 야생형 단백질의 결합과 유사한 방식으로 감염-유도된 항체에 결합하는 능력을 보유한다. 개개의 항원 단편은 하나 초과의 별개의 에피토프를 함유할 수 있다. 당업자는 에피토프에 대한 항체의 친화도 또는 결합력의 척도가 다소 부정확하고 친화도/결합력이 예를 들어 친화도 성숙/체세포 과다돌연변이에 의해 면역 반응 동안 유의하게 변할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 일반적으로, 키메라 단백질에 대한 항체 결합의 친화도/결합력은 천연, 무손상 알파 5 또는 루프 5에서 보이는 친화도의 적어도 약 50%, 바람직하게는 약 60%, 보다 바람직하게는 약 70%, 훨씬 더 바람직하게는 약 80%, 가장 바람직하게는 약 90-100%이거나 또는 심지어 더 크다. 일반적으로, 키메라 단백질에 포함되는 항원 서열은 약 20 내지 약 100개의 아미노산, 바람직하게는 약 30 내지 약 70개의 아미노산을 함유할 것이고, 키메라 단백질 자체는 총 약 160 내지 약 800개의 아미노산, 바람직하게는 약 240 내지 약 560개의 아미노산을 함유할 것이다. 또한, 항원 서열은 본원에서 설명되는 항체 결합 특성을 보유한다면 전체 "천연" 에피토프를 포함하거나 포함하지 않거나 상관없이 본원에서 "에피토프"로서 언급될 수 있다.
별법으로, 적절한 항원 단편 또는 항원 서열 또는 에피토프는 키메라 단백질에 포함될 때, 키메라 단백질이 투여되는 숙주에서 에피토프에 대한 적합한 항체 생산을 유도하는 그의 능력에 의해 확인될 수 있다. 당업자는 항체 역가의 정의가 상이할 수 있음을 알 것이다. 본원에서, "역가"는 100 ng의 시험 단백질로 코팅된 ELISA 웰 상의 이용가능한 결합 부위의 1/2에 결합하는 항혈청의 희석배수의 역수로 간주된다. 일반적으로, 적합한 항체 생산은 약 100 내지 약 100,000, 바람직하게는 약 10,000 내지 약 10,000,000의 항체 역가를 특징으로 한다. 별법으로, 및 특히 진단 검정에서, "역가"는 결합 배경 수준의 약 3배이어야 한다. 예를 들어, "양성"으로 간주되기 위해서, 시험에서 반응성은 비감염된 개체로부터의 혈청에서 검출된 반응성의 적어도 3배이어야 한다. 바람직하게는, 항체 반응은 보호, 즉, 비백신접종된 숙주에 비해 보렐리아에 추후 노출된 백신접종된 숙주에서 질환의 증상 발생을 억제하거나 완화한다.
본 발명에 따른 한 예시적인 키메라 단백질의 아미노산 서열이 도 9b에 제시된다. 본 예시적인 실시양태에서, 키메라는 타입 A OspC로부터의 루프 5 영역 아미노산 서열, 및 OspC 타입 B, K 및 D로부터의 알파 나선 5 영역 서열을 함유한다. 이 경우에, 타입 A OspC 서열은 균주 LDP56으로부터 유래한 것이고, 뉴클레오티드 기탁 번호는 EF053513이고 단백질 기탁 번호는 ABK41054이고; 타입 B OspC는 균주 LDP73으로부터 유래한 것이고, 뉴클레오티드 기탁 번호는 EF053525이고 단백질 기탁 번호는 ABK41066이고; 타입 K OspC는 균주 LDP89로부터 유래한 것이고, 뉴클레오티드 기탁 번호는 EF053523이고 단백질 기탁 번호는 ABK41064이고; 타입 D OspC는 균주 LDP116으로부터 유래한 것이고, 뉴클레오티드 기탁 번호는 EF053527이고 단백질 기탁 번호는 ABK41068이다. 당업자는 보렐리아의 많은 균주로부터의 OspC가 알려져 있거나 발견될 수 있고, 본 발명의 실시에 사용될 수 있음을 알 것이다. 예시적인 키메라 구축물의 서열은 본원에 개시된 서열 번호에 제시되거나 서열 번호로 표시된다.
당업자는 본 발명의 일부 실시양태에서 본 발명의 키메라 단백질에 포함하기 위해 선택된 아미노산 서열이 OspC 단백질의 본래의 또는 천연 서열의 1차 아미노산 서열에 직접 대응하지만 반드시 그럴 필요는 없음을 알 것이다. 본 발명의 키메라 단백질에 포함되는 에피토프의 아미노산 서열은 다소 변경될 수 있고, 본 발명에 사용하기에 계속 적합할 수 있다. 예를 들어, 특정 보존적 아미노산 치환은 면역 반응을 유도하는 에피토프의 능력에 대한 유해한 효과를 갖지 않으면서 이루어질 수 있다. 당업자는 상기 보존적 치환의 특성, 예를 들어, 양 하전 아미노산의 또 다른 양 하전 아미노산으로의 치환; 음 하전 아미노산의 또 다른 음 하전 아미노산으로의 치환; 소수성 아미노산의 또 다른 소수성 아미노산으로의 치환 등을 알 것이다. 본 발명의 키메라 단백질에 포함되는 에피토프의 서열의 모든 상기 치환 또는 변경은 생성되는 에피토프가 적합한 면역 반응을 유도하는 기능을 계속 보인다면 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 본 발명의 키메라 단백질에 포함되는 아미노산 서열은 전장 천연 에피토프 또는 에피토프-함유 도메인을 포함할 필요가 없다. 당업자는 에피토프에 대해 제시되는 기준이 서열에 의해 충족된다면, 에피토프이거나 에피토프를 함유하는 것으로 알려진 아미노산 서열의 말단절단된 버전이 다양한 이유로 본 발명에서 사용하기 바람직할 수 있음을 알 것이다. 이와 같이 치환되거나 달리 변경된 아미노산 서열은 본원에서 본래의 야생형 또는 천연 서열을 "기초로 하거나" 또는 "이로부터 유래된" 것으로 언급될 수 있다. 일반적으로, 선형 에피토프가 그로부터 "유래되거나" 또는 선형 에피토프가 그를 "기초로 하는" OspC 단백질은 자연에서 발생하는 OspC 단백질이다. 상기 천연 OspC 단백질은 별법으로 천연 또는 야생형 단백질로서 언급될 수 있다.
1차 서열에 대한 상기 변화는 임의의 다양한 이유로, 예를 들어 프로테아제 절단 부위의 제거 또는 도입, 용해도의 증가 또는 감소, 키메라의 길이를 따라 개개의 에피토프의 제시 및 접근성을 방해할 수 있는 분자내 또는 분자간 상호작용, 예컨대 폴딩, 이온 상호작용, 염 다리 등의 촉진 또는 차단을 위해 도입될 수 있다. 모든 상기 변화는 생성되는 아미노산 서열이 에피토프가 그로부터 기원하는 OspC 타입에 대한 보호 항체 반응을 유도하는 기능을 수행한다면, 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 일반적으로, 상기 치환된 서열은 천연 단백질 내의 대응하는 서열에 적어도 약 50% 동일하고, 바람직하게는 야생형 서열에 약 60 내지 70, 또는 심지어 70 내지 80, 또는 80 내지 90%, 바람직하게는 약 95 내지 약 100% 동일할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 키메라 백시노겐 내의 개개의 선형 에피토프들은 특성이 다소 중성인 개재하는 서열에 의해 서로 분리되고, 즉, 이들은 보렐리아에 대한 면역 반응을 그 자체로 및 저절로 유도하지 않는다. 상기 서열은 키메라의 에피토프 사이에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 존재할 경우, 이들은 예를 들어 에피토프를 분리하는 기능을 하고 에피토프를 서로 입체적으로 분리하는데 기여할 수 있다. 별법으로, 상기 서열은 단순히 재조합 처리 절차, 예를 들어 클로닝 절차의 인공물일 수 있다. 상기 서열은 일반적으로 링커 또는 공간 펩티드로 알려져 있고, 그의 많은 예는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 비구조적 링커를 설명하는 참고 문헌 [Crasto, C. J. and J. A. Feng. 2000. LINKER: a program to generate linker sequences for fusion proteins. Protein Engineering 13(5): 309-312]을 참조한다. 구조적 (예를 들어 나선) 서열 링커는 또한 예를 들어 2차 구조를 갖는 것으로 알려진 존재하는 서열을 사용하거나, 또는 링커를 설계하기 위해 공지된 기본적인 생화학적 원칙을 사용하여 설계될 수 있다. 또한, 다른 요소, 예를 들어 리더 서열 또는 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위해 단백질을 "태그 (tag)"하는 서열이 키메라 단백질에 존재할 수 있고, 그 예는 히스티딘 태그, 검출 태그 (예를 들어 S-태그, 또는 Flag-태그), 다른 항원 아미노산 서열, 예컨대 공지의 T-세포 에피토프 함유 서열 및 단백질 안정화 모티프 (motif) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 키메라 단백질은 예를 들어 아미드화, 술포닐화, 지질화, 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 키메라 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 제공한다. 상기 핵산은 DNA, RNA, 및 이들의 혼성체 등을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 코딩 서열을 함유하거나 수용하는 벡터를 포함한다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 기반 벡터, 발현 벡터 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 발현 벡터일 것이다.
본 발명의 키메라 단백질은 당업자에게 많이 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 화학적으로 합성되거나, 또는 예를 들어 세균 세포에서, 세포 배양액 (포유동물, 효모 또는 곤충 세포)에서, 식물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 기술을 사용하여, 또는 무세포 원핵 또는 진핵-기반 발현 시스템에 의해, 다른 시험관내 시스템 등에 의해 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 특히 라임병 (라임 보렐리아증)으로 나타날 때 보렐리아 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신으로서 이용될 수 있는 면역 반응의 유도에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 면역 반응의 유도는 본원에서 항원의 투여가 특이적 항체의 합성 (상기 설명한 역가에서) 및/또는 예를 들어 3H 티미딘 혼입에 의해 측정되는 세포 증식을 유발함을 의미한다. "백신"은 본원에서 비-백신접종된 (예를 들어 보조물 단독) 대조 유기체에 비해 보렐리아 감염에 관련된 증상 (즉, 라임병의 증상)의 발생을 전체적으로 또는 부분적으로 억제하거나 정지시키는 보렐리아 시험접종에 대한 보호를 생성하는 면역 반응을 유도하는 키메라 단백질을 의미한다. 조성물은 본원에서 설명되는 하나 이상의 실질적으로 정제된 재조합 키메라 단백질, 및 약리학적으로 적합한 담체를 포함한다. 조성물 내의 다수의 키메라 단백질은 동일하거나 상이할 수 있고, 즉, 조성물은 상이한 키메라의 "칵테일", 또는 단일 타입의 키메라만을 함유하는 조성물일 수 있다. 백신으로서 사용하기 위한 그러한 조성물의 제조는 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조되지만, 고체 형태, 예컨대 정제, 알약, 분말 등도 고려된다. 투여 전에 액체에 용해되거나 현탁되기 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 성분은 제약상 허용되고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 이들의 조합물이다. 또한, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 본 발명의 백신 제제는 아주반트를 추가로 포함할 수 있고, 그의 적합한 예는 세픽 (Seppic), 퀼 (Quil) A, 알히드로겔 (Alhydrogel) 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 조성물의 경구 형태를 투여하기 위해 요구될 경우, 다양한 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 결합제 등을 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여에 적합한 조성물을 제공하기 위해서 임의의 상기 추가의 성분을 함유할 수 있다. 제형 내의 키메라 단백질의 최종량은 상이할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 제형 내의 양은 약 0.01-99% (중량/부피)일 것이다.
방법은 키메라 재조합 단백질을 약리학적으로 허용되는 담체 내에 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 백신 제제는 주사, 흡입, 경구, 비내, 키메라 단백질 함유 식품의 섭취 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 임의의 많은 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 투여 방식은 피하 또는 근육내 투여이다. 또한, 조성물은 다른 치료 방식, 예컨대 면역계를 추가접종하는 물질, 화학치료제 등과 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 포유동물에서 보렐리아에 대한 면역 반응을 유도하고 보렐리아 감염에 대해 백신을 접종하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 그러나, 당업자는 상기 백신 접종이 또한 바람직한 다른 포유동물을 알 것이고, 예를 들어, 제제는 수의용으로도 사용될 수 있다. 그 예는 반려 "애완동물", 예컨대 개, 고양이 등; 식품원, 작업 및 오락용 동물, 예컨대 소, 말, 황소, 양, 돼지, 염소 등; 또는 심지어 보렐리아 병원소로서 기능하는 야생 동물 (예를 들어 마우스, 사슴)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 본 발명의 키메라 단백질 내에 함유된 에피토프에 대한 항체를 갖는 개체를 확인하기 위한 진단제 및 진단제의 사용 방법을 제공한다. 보렐리아에 노출된 것으로 의심되거나 보렐리아에 노출될 위험이 있는 개체 (예를 들어 인간, 사슴, 또는 보렐리아 스피로헤테스에 의한 감염에 취약한 다른 포유동물)로부터의 생물학적 샘플은 본 발명의 키메라 단백질과 접촉한다. 공지의 방법을 사용하여, 생물학적 샘플 내의 키메라 단백질과 항체 사이의 결합 반응의 존재 또는 부재가 검출된다. 양성 결과 (결합 발생, 따라서 항체 존재)는 개체거 보렐리아에 노출되었고/되었거나 보렐리아로 감염되었음을 나타낸다. 이와 관련하여, 분석 목적에 따라, OspC 타입의 관심있는 임의의 하위세트에 특이적인 키메라가 구축될 수 있고, 즉, 모든 가능한 OspC 타입이 진단 키메라에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 측면은 임상용 또는 가정용으로 한정되지 않고, 예를 들어 진드기로부터 단리된 보렐리아 스피로헤테스의 확인, OspC 타입의 지리학적 분포의 조사 등을 위한 연구 도구로서 실험실에서 사용하기 위해 가치가 있을 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 에피토프 및/또는 키메라 단백질에 대한 항체를 포함한다. 상기 항체는 폴리클로날, 모노클로날 또는 키메라일 수 있고, 당업자에게 공지된 임의의 방식으로 생성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체는 살균성 (보렐리아 살균성)이고, 즉, 보렐리아 스피로헤테스의 항체에 대한 노출은 스피로헤테스의 사멸을 유발한다. 상기 항체는 다양한 방식으로, 예를 들어 보렐리아에 대한 선행 노출을 진단하기 위한 검출 시약으로서, 보렐리아의 조사를 위한 키트 내의 시약으로서, 보렐리아 감염의 치료 등을 위해 사용될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하기 위해 제공되지만, 어떠한 방식으로도 제한으로 간주되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 침습성 인간 라임병 단리물 내의 OspC 타입 다양성의 입증, 및 OspC 항체 반응의 특이성을 규정하는 이전에 특성화되지 않은 에피토프의 확인.
도입
라임병은 보렐리아 부르그도르페리, 비. 가리니이 또는 비. 아프젤리이로 감염된 익소데스 진드기에게 물림으로써 인간에게 전염된다. 외부 표면 단백질 C (OspC)는 전염 과정에 및 가능하게는 포유동물에서 초기 감염의 확립에 관여하는 중요한 발병 인자인 것으로 생각된다 ([Grimm et al., 2004]; [Parl et al., 2004]; [Schwan et al., 1995]). OspC는 가변적인 ~22 kDa의 표면 노출된 플라스미드-코딩 지질단백질이다 ([Fuchs et al., 1992]; [Marconi et al., 1993]; [Sadziene et al., 1993]). 결정 구조는 3개의 OspC 단백질에 대해 결정되었다 ([Eicken et al., 2001]; [Kumaran et al., 2001]). 단백질은 주로 나선이고, 가변 루프에 의해 연결된 5 알파 나선을 갖는다. 루프는 리간드 결합 도메인을 형성하는 것으로 가정되었다 ([Eicken et al., 2001]; [Kumaran et al., 2001]). 증거는 OspC가 침샘에서 미확인 수용체에 결합하는 어드헤신으로서 기능함으로써 진드기 중간창자로부터의 스피로헤테스의 이동을 용이하게 할 수 있음을 제시한다 (Pal et al., 2004). OspC의 오솔로그 (ortholog)가 재발성 열 군의 몇몇 종에서 확인되었고, 이것은 OspC 관련 단백질이 다른 보렐리아 종에서 유사한 역할을 수행할 가능성을 제시한다 ([Marconi et al., 1993]; [Margolis et al., 1994]). OspC 발현은 환경에 의해 조절되고, 진드기가 물었을 때 유도되고, OspC는 포유동물에서 초기 감염 동안 우성 항원이다 ([Alverson et al., 2003]; [Schwan et al., 1998]; [Stevenson et al., 1995]). 전사는 적어도 부분적으로는 RpoN/S 조절 네트워크에 의해 조절된다 (Hubner et al., 2001). 전염 동안 및 초기 감염 동안 OspC 발현의 시간적 (temporal) 특성의 정확한 상세한 내용에 대한 모순되는 보고가 존재함을 유의하여야 한다 ([Ohnishi et al., 2001]; [Schwan et al., 1995).
OspC는 유의한 유전적 및 항원 다양성을 보인다 ([Theisen et al., 1995]; [Theisen et al., 1993]). 21개의 OspC 계통발생 군 (이후 OspC 타입으로 언급됨)이 설명되었다 ([Seinost et al., 1999]; [Wang et al., 1999]). OspC 타입은 문자 지정 (A 내지 U)에 의해 구분된다. 데이타베이스에 존재하는 수백 개의 OspC 아미노산 서열의 분석은 OspC 타입 사이의 차이가 30%만큼 높을 수 있지만, 한 타입 내에서는 일반적으로 6% 미만임을 나타낸다. 문헌 [Seinost et al.]은 OspC 타입 A, B, I 및 K와 인간의 침습성 감염 사이의 상관관계를 가정하였다 (Seinost et al., 1999). 또한, 문헌은 단일-가닥 입체형태 다형성 분석에 의해 규정되는 바와 같이 특이적인 ospC 변이체가 침습성 인간 감염과 상관된다고 보고하였다 (Lagal et al., 2003). 그러나, 최근의 연구는 상기 상관관계의 강도에 대해 의문을 제기하였다 (Alghaferi et al., 2005). 기능 및 숙주-병원체 상호작용에 대한 OspC 타입 또는 서열의 영향은 중요하고 활발한 조사 영역을 나타낸다. OspC는 라임병 백신 개발에 사용하기 위해 조사되었다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Gilmore et al., 2003]; [Gilmore et al., 1999a]; [Probert et al., 1994]; [Theisen et al., 1993]; [Wilske et al., 1996]). 그러나, OspC 변이 및 OspC의 항원 구조에 대한 제한된 지식 때문에 상기 노력이 복잡해졌다. OspC는 보호 능력을 갖지만, 단지 동일한 균주에 대해서만 갖는다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Gilmore et al., 1999]; [Gilmore et al., 1999b]; [Probert and LeFebvre, 1994]; [Wilske et al., 1996]). 이것은 보호 에피토프가, 서열 내의 고 가변성인 단백질 내의 영역 내에 존재함을 제시한다.
상기 연구의 목적은 다양하였다. 먼저, OspC 타입과 침습성 감염 사이의 추정 상관관계에 대한 추가의 평가를 미국 메릴랜드주의 규정된 환자 집단으로부터 회수된 침습성 및 비-침습성 단리물의 OspC 타입을 결정함으로써 수행하였다. 두 번째로, OspC에 대한 항체 반응을 보다 잘 이해하기 위한 시도에서, 반응의 타입 특이적 여부의 결정을 수행하였다. 마지막으로, OspC의 항원 구조는 마우스에서 감염 동안 항체 반응을 유도하는 에피토프를 확인함으로써 규정되었다. 여기서 제시되는 데이타는 침습성 감염과 연관된 OspC 타입의 수가 이전에 가정된 것보다 더 큼을 나타낸다 (Seinost et al., 1999). 또한, 본 발명자들은 이전에 특성화되지 않은 2개의 에피토프를 확인하고, OspC에 대한 항체 반응이 타입 특이적으로 보인다는 것을 제시하였다. 상기 분석은 라임병 발병에서 OspC의 역할에 대한 본 발명자들의 이해를 증진하고 OspC 기반 백신의 구축을 용이하게 할 중요한 정보를 제공한다.
실험 절차
세균 단리물 , 배양 및 감염 혈청의 생성. 미국 메릴랜드주의 인간 환자로부터 회수된 라임병 단리물을 이들 분석에 사용하였다 (표 1). 환자는 존 홉킨스 의대 임상 시험 심사위원회 (John Hopkins Medicine Institutional Review Board)에 의해 승인된 연구전 고지 동의서를 제출하였다. 스피로헤테스를 33℃에서 BSK-H 완전 배지 (시그마 (Sigma))에서 배양하고, 암시야 현미경에 의해 모니터링하고, 원심분리에 의해 수거하였다. 문헌 (Sung et al., 2000)에 설명된 바와 같이 표면하 (sub-surface) 플레이팅에 의해 몇몇의 단리물에 대한 클론 집단을 생성하였다. 개개의 콜로니의 ospC 타입을 결정하기 위해서, ospC 유전자를 PCR로 증폭하고, 서열을 결정하고, 비교 서열 분석을 수행하였다 (아래에서 설명되는 바와 같이). 공지 타입의 OspC 단백질을 발현하는 일련의 클론 집단에 대한 항혈청을 생성하기 위해, 103 스피로헤테스를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내에서 세척하고, 바늘로 C3H-HeJ 마우스 내로 접종하였다 (피하, 어깨뼈 사이; 잭슨 랩스 (Jackson Labs)). 마우스의 감염은 문헌 [Zhang et al., 2005]에 기재된 바와 같이 flaB 유전자를 표적화하는 프라이머를 사용하여 접종 2 또는 4주 후에 귀 천공 생검의 실시간 PCR에 의해 확인하였다. 혈액을 꼬리 절단에 의해 제0, 2, 4 및 8주에 각각의 마우스로부터 수거하고, 감염 혈청을 회수하였다. 상기 분석에 사용된 추가의 항혈청 및 감염 혈청은 문헌 [McDowell et al., 2002]에 기재되어 있다.
Figure pct00001
DNA 단리, OspC 타입 결정 및 컴퓨터 지원 구조 분석. OspC 타입을 결정하기 위해서, 총 DNA를 문헌 [Marconi et al., 2003]에 기재된 바와 같이 각각의 균주로부터 단리하고, OspC20(+)LIC 및 OspC210(-)LIC 프라이머 (표 2)를 사용한 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. PCR은 다음 순환 조건 하에 Expand High Fidelity 중합효소 (로슈 (Roche))를 사용하여 수행하였다: 94℃에서 2분의 초기 변성; 94℃ 15 s, 50℃ 30 s, 68℃ 60 s의 10 사이클; 94℃ 15 s, 50℃ 30 s, 68℃ 60 s 및 각각의 최종 20 사이클에 추가된 추가의 5 s; 68℃에서 7분의 최종 신장. 앰플리콘을 퀴아퀵 (QiaQuick) PCR 정제 키트 (퀴아겐 (Qiagen))를 사용하여 회수하고, T4 DNA 중합효소로 처리하여 단일 가닥 오버행을 생성하고, pET-32 Ek/LIC 벡터 (노바겐 (Novagen))에 어닐링하고, 이. 콜라이 노바블루 (NovaBlue) (DE3) 세포 (노바겐) 내로 형질전환시켰다. 상기 절차를 위한 방법은 제조자가 제시하였다. 콜로니를 암피실린 내성 (50 ㎍/ml)에 대해 선택하고, PCR에 의해 ospC 삽입체에 대해 스크리닝하였다. 선택된 콜로니를 LB 브로쓰 (피셔 (Fisher)) 내로 옮기고, 진탕 (300 rpm)하면서 37℃에서 배양하고, 플라스미드를 키아필터 미디 (QiaFilter Midi) 플라스미드 단리 키트 (퀴아겐)를 사용하여 단리하였다. ospC 삽입체의 서열 결정은 외부 회사 (MWG 바이오테크 (MWG Biotech))에 의뢰하였다. 결정된 서열을 번역하고, 디폴트 파라미터를 사용하는 ClustalX (35)에 의해 정렬하였다. OspC 타입을 결정하기 위해서, 이웃 연결 트리를 생성하고, 부트스트랩 값을 계산하였다 (1000회 시험). 생성되는 계통도를 N-J 플로터 (Plotter)에 의해 가시화하였다. 데이타베이스에서 이용가능한 추가의 OspC 서열이 분석에 포함되었다. OspC에 대한 구조 모델을 웹사이트 ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml에서 이용가능한 NCBI 분자 모델링 데이타베이스 파일 1GGQ, 1F1M, 및 1G5Z (4, 15) 및 CN3D 소프트웨어를 사용하여 생성하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
재조합 단백질의 생성. OspC의 전장 및 말단절단체를 생성하기 위해, 프라이머를 비. 부르그도르페리 B31MI의 타입 A ospC 서열을 기초로 하여 설계하였다 (Fraser et al., 1997). 프라이머는 리가제 비의존성 클로닝 (LIC) 및 발현 벡터인 pET-32 Ek/LIC 벡터 (노바겐) 내로의 어닐링을 허용하는 테일 서열을 갖는다. 모든 LIC 절차는 이전에 문헌 [Hovis et al., 2004]에 기재되었다. 모든 구축물의 서열을 확인하기 위해서, 재조합 플라스미드를 키아필터 미디 플라스미드 정제 키트 (퀴아겐)를 사용하여 이. 콜라이 노바블루 (DE3) 세포로부터 정제하고, 삽입체의 서열을 결정하였다 (MWG 바이오테크).
SDS - PAGE 및 면역블롯 분석. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 12.5% 크라이테리온 프리캐스트 겔 (Precast Gel) (바이오라드)에서 분리하고, 문헌 [Roberts et al., 2002]에 기재된 바와 같이 PVDF 막 (밀리포어 (Millipore)) 상에 면역블로팅하였다. 재조합 단백질의 발현은 상기 연구에서 사용된 모든 재조합 단백질에 보유된 N-말단 S-태그 융합체를 검출하는 S-단백질 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합체 (노바겐)를 사용하여 확인하였다. HRP 접합된 S-단백질은 1:10,000의 희석액으로 사용하였다. 면역블롯 분석을 위해, 감염된 마우스로부터 수집한 혈청은 1:1000의 희석액으로 사용하였다. HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG는 2차 항체 (피어스 (Pierce))로서 기능하였고, 1:10,000의 희석액으로 사용하였다. 일반적인 면역블롯 방법은 문헌 [Metts et al., 2003]에 기재되어 있다.
결과
미국 메릴랜드주의 인간 라임병 환자로부터 회수된 단리물에 대한 ospC 타입 결정 분석. 미국 메릴랜드주의 인간 라임병 환자로부터 회수된 각각의 분석된 단리물로부터 ospC가 성공적으로 증폭되었다. 각각의 앰플리콘의 서열을 결정하고, OspC 타입을 결정하기 위해 비교 서열 분석을 수행하였다 (도 1). A (n=6), B (n=l), C (n=l), D (n=l), H (n=2), K (n=4) 및 N (n=3)를 포함하는 대표적인 몇몇의 상이한 OspC 타입이 확인되었다. 단지 OspC 타입 A, B, I 및 K만이 인간의 침습성 감염에 연관된다고 이전에 보고되었다 (Seinost et al., 1999). 그 연구에서, 침습성 단리물은 혈액, 장기 또는 뇌척수액으로부터 회수된 것으로 규정되었고, 비-침습성 단리물은 피부에서 회수되지만 다른 신체 부위에서는 발견되지 않은 것이었다 (Seinost et al., 1999). 그러나, 본원에서 OspC 타입 C, D, 및 N을 발현하는 몇몇의 단리물이 혈액 (LDP84, LDP63, LDP 116, 및 LDP120) 또는 뇌척수액 (LDC83)으로부터 회수되었고 따라서 침습성임이 음이 입증되었다. 상기 관찰은 특이적인 OspC 타입의 침습성 감염과의 상관관계가 엄격하지 않을 수 있고 상관관계의 강도가 재-평가를 필요로 함을 제시한다.
마우스에서 감염 동안 OspC 에 대한 항체 반응의 타입 특이성 분석. 감염 동안 OspC에 대해 유도되는 항체 반응이 타입 특이적인지를 결정하기 위해, 타입 A, B, C, D, H, K 및 N 재조합 OspC 단백질을 시험 항원으로서 사용하기 위해 생성하였다. 재조합 단백질을 면역블로팅하고, A, B, 또는 D OspC 타입 (상기 결정된 바와 같은)의 비. 부르그도르페리 단리물로 감염된 마우스로부터 수집한 혈청으로 스크리닝하였다 (도 2). 이. 콜라이에서 재조합 단백질의 발현 및 단백질의 동일한 로딩은 N-말단 융합체에서 S-태그를 인식하는 HRP 접합된 S-단백질로 하나의 면역블롯을 스크리닝함으로써 확인하였다. 감염 제2주에 수거된 항-비. 부르그도르페리 B31MI 항혈청 (타입 A OspC)으로 스크리닝할 때, 강한 반응성은 타입 A 단백질에서만 검출되었다. OspC에 대한 강한 초기 IgG 반응은 이전의 보고와 일치한다 ([Theisen et al., 1995]; [Wilske et al., 1993]). 감염 제8주에 수거된 혈청도 타입 A OspC와 우세하게 반응하지만, 다른 OspC 타입과의 약한 교차 면역반응성이 관찰되었다. LDP116 및 LDP73 (각각 OspC 타입 D 및 B 단리물)로 감염된 마우스에서 OspC에 대한 Ab 반응도 타입 특이적이었다. OspC에 대한 항체 반응에 유의한 정도의 타입 특이성이 존재하고 이 특이성은 생체 내 면역우성 에피토프가 단백질의 타입 특이적 도메인 내에 위치함을 시사한다고 결론지을 수 있다.
마우스에서 감염 동안 항체 반응을 유도하는 OspC 선형 에피토프의 위치 결정. 감염 동안 항체 반응을 유도하는 타입 A OspC의 선형 에피토프를 확인하기 위해, 몇몇 재조합 OspC 단편을 생성하고, α-비. 부르그도르페리 B31MI 감염 혈청 (제8주)으로 스크리닝하였다 (도 3). B31MI는 OspC 타입 A 생산 균주이다. 재조합 단백질의 발현은 HRP 접합된 S-단백질로 면역블로팅함으로써 확인하였다. OspC의 선형 에피토프의 위치를 알아내기 위해, OspC 단편의 면역블롯을 감염 혈청으로 스크리닝하였다. 하나 이상의 에피토프를 함유하는 2개의 도메인의 위치를 결정하였는데, 하나는 알파 나선 5의 잔기 168과 203 사이의 단백질의 C-말단 1/2에, 다른 하나는 나선 3 및 루프 5의 잔기 136과 150 사이에 존재하였다 (이후 각각 알파 5 및 루프 5 에피토프로서 칭함). 이들 에피토프는 문헌에서 이전에 특성화되지 않았다.
ospC 서열 분석 및 OspC 구조의 컴퓨터 모델링 . 루프 5 및 알파 5 에피토프가 공간적으로 OspC 단백질 상의 어디에 존재하는지를 결정하기 위해, X-선 결정학 분석에 의해 결정된 좌표 ([Eicken et al., 2001]; [Kumaran et al., 2001])를 평가하고, 리본 및 공간 충전 (ribbon and space fill) 모델을 단량체 및/또는 이량체 형태의 타입 A OspC에 대해 생성하였다 (데이타를 제시하지 않음). 단량체 형태의 타입 I 및 E OspC 단백질을 또한 모델링하였다. 이들 분석은 루프 5 에피토프가 타입 A, E 및 I OspC 단백질의 단량체 및 이량체 형태 둘 모두 상에 표면 노출됨을 보여주었다. 본래의 X-선 결정학 분석에서, N- 및 C-말단 부분 둘 모두는 재조합 단백질의 일부가 아니거나 또는 모델링될 수 없었다. 어떠한 경우든, 결정된 구조는 N- 및 C-말단이 서로 매우 근접하여 위치하고, 세포막에 근접함을 나타낸다.
타입내 수준에서 루프 5 및 알파 5 에피토프의 서열 변이를 평가하기 위해, 227개의 OspC 서열을 정렬하였다. 이들 분석은 루프 5 및 알파 5 에피토프 둘 모두가 타입간 수준에서 고도로 가변적이지만, 타입 내에서 현저하게 고도로 보존됨을 보여주었다. 도 4는 각각의 OspC 타입에 대한 루프 5 및 알파 5 도메인 서열을 (표 형태로) 제공하고, 각각의 특이적 서열이 분석되는 OspC 서열에서 검출되는 빈도를 나타낸다. 타입내 수준에서 루프 5가 보존된다는 증거로서, 57개의 타입 A 루프 5 에피토프 서열의 비교는 53개가 단지 하나 또는 두 개의 잔기에서만 상이한 가외 (outlying) 서열과 동일함을 보여주었다. 유사한 관찰이 알파 5 에피토프에 대해 이루어졌다. 43개의 타입 A OspC 서열 중에서, 42개가 잔기 168 내지 203에서 동일하였다. 알파 5 에피토프 서열은 많은 경우에 데이타베이스에서 이용가능한 서열이 부분적이고 상이한 양의 C-말단이 결여되었기 때문에 보다 적은 수가 분석되었음을 유의한다.
루프 5 에피토프에 대한 항체 반응이 개개의 마우스에 특유하지 않음의 입증. 루프 5의 타입내 보존 및 그의 비교적 짧은 길이에 비추어, 루프 5 에피토프는 키메라 OspC 루프 5 기반 백시노겐의 개발에 사용하기 위한 뛰어난 후보일 수 있다. 루프 5 에피토프에 대한 항체 반응이 통상적으로 감염 동안 발생하고 개개의 마우스에 특유하지 않음을 확인하기 위해, 130-150 단편을 함유하는 루프 5의 면역블롯을 타입 A OspC 생산 균주인 B31MI, LDP56 및 5A4로 감염된 몇몇의 추가의 마우스로부터의 혈청으로 스크리닝하였다. 모든 경우에, 상기 에피토프를 인식한 항체가 검출되었다 (도 5). 루프 5에 대한 반응은 LDP56 감염된 마우스 2로부터의 감염 혈청에서 더 약하였지만, 보다 긴 노출은 루프 5가 상기 동물에서 항원임을 분명히 보여주었다. 이것은 이들 에피토프에 개시된 면역 반응이 개개의 동물에 특유하지 않음을 증명하고 백신 개발에서 그의 가능한 용도를 추가로 지지한다.
논의.
OspC는 라임병 발병의 중요한 원인체로서 분명하게 확립되었다 ([Grimm et al., 2004]; [Pal et al., 2004]; [Schwan et al., 1995]). 이것이 라임병 스피로헤테스의 중간창자로부터 침샘으로의 이동 동안 중요한 역할을 수행한다는 강한 증거가 존재한다 (Pal et al., 2004). 또한, 이것은 초기 감염 동안 선택적으로 발현되고, 면역우성 항원이고 ([Fingerle et al., 1995]; [Schwan et al., 1998]; [Wilske et al., 1993]), 라임병 단리물의 전파능의 중요한 결정자로 가정되었다 (Seinost et al., 1999). 상기 연구의 목적은 OspC 타입과 침습성 감염 사이의 잠재적인 상관관계를 시험하고, OspC에 대한 항체 반응이 타입 특이적인지를 결정하고 감염 동안 제시되는 선형 에피토프의 위치를 결정함으로써 OspC의 항원 구조를 추가로 규정하는 것이었다.
OspC의 서열 분석은 21개의 별개의 OspC 타입을 설명하고 (Seinost et al., 1999), 이들 중 단지 4개 (타입 A, B, I 및 K)만이 인간에서 침습성 감염과 연관된다고 가정되었다 (Seinost et al., 1999). 그러나, 최근의 연구는 상기 추정 상관관계에 대해 의문을 제기하였다 (Alghaferi et al., 2005). 이를 추가로 처리하기 위해, 미국 메릴랜드주의 인간 환자로부터 회수된 침습성 및 비-침습성 라임병 단리물의 OspC 타입을 결정하였다. 이를 수행하기 위해서 전장 ospC 유전자를 PCR 증폭하고, 서열을 결정하고, 비교 서열 분석을 수행하였다. 이들 분석은 상기 환자 집단에서 침습성 인간 감염과 연관된 OspC 타입이 타입 C, D, 및 N을 또한 포함함을 보여주었다. 타입 I OspC 생산 균주가 침습성 인간 감염과 연관된 우세한 타입으로 제안되었지만 (Seinost et al., 1999), 미국 메릴랜드주 환자 집단에서 확인된 모든 침습성 단리물은 타입 I ospC를 보유하지 않았다. 이와 유사하게, 문헌 [Alghaferi et al., 2005]에서도 타입 I OspC 생산 균주를 검출하지 못하였다. 전체적으로, 상기 2개의 연구는 다음과 같이 더 큰 볼티모어 지역에서 18개의 침습성 단리물을 확인하였다: A, n=5; B, n=2; C, n=l; D, n=l; H, n=l; K, n=3 및 N, n=7. 따라서, 상기 지리적 지역에서 OspC 타입 A 및 N을 생산하는 침습성 단리물이 우세한 것으로 보인다. 이들 데이타는 단지 4개의 OspC 타입만이 인간의 침습성 감염과 연관된다는 가설을 반박한다. OspC 타입 - 침습성 감염 상관관계의 타당성을 추가로 평가하고 규정된 지리적인 지역에 우세하게 존재하는 특이적 OspC 타입의 차이를 결정하기 위해, 상이한 지리적인 지역으로부터의 보다 큰 환자 집단으로부터 회수된 단리물에 대한 추가의 분석이 필요할 것이다.
별개의 OspC 타입의 설명과 함께 OspC를 사용한 백신 접종에 의해 제공되는 가변적인 보호 (Seinost et al., 1999)는 항체 반응이 타입 특이적일 수 있을 가능성을 제기한다. 상기 가설은 OspC를 사용한 백신 접종이 동일한 균주에 대해서만 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다는 사실에 의해 지지된다 ([Bockenstadt et al., 1997]; [Gilmore et al., 1999a]; [Probert and LeFebvre, 1994]). 이 보고서 이전에는, 감염 동안 OspC에 대한 항체 반응의 타입 특이성은 직접적으로 평가되지 않았다. 이를 처리하기 위해, 타입 A, B, C, D, H, K 및 N의 일련의 전장 재조합 OspC 단백질을 공지의 OspC 타입을 발현하는 클론 집단을 갖는 마우스에서 생성된 감염 혈청으로 스크리닝하였다. 감염 혈청의 사용은 중요하고, 그 이유는 이것이 생체 내에서 세균에 의해 특이적으로 제시되는 에피토프에 대한 항체 반응에 대한 집중적인 평가를 허용하기 때문이다. 이들 분석은 OspC의 N- 및 C-말단 도메인 내의 강한 서열 보존에도 불구하고, 분석한 OspC 타입에 대한 항체 반응이 타입 특이적임을 보여주었다. 예를 들어, 타입 A 또는 D 균주로 감염된 마우스로부터의 혈청은 타입 특이적 방식으로 면역반응성이었고, 다른 OspC 타입과 교차-면역반응성을 거의 또는 전혀 보이지 않았다. 모든 21개의 OspC 타입에 대한 항체 반응을 분석하지 않았지만, 상기 제시된 데이타는 보존된 도메인이 면역우성이 아니고 감염 동안 세균에 의해 제시된 OspC의 선형 에피토프가 단백질의 가변 도메인 (즉, 타입 특이적 도메인) 내에 포함됨을 제시한다.
OspC의 에피토프의 위치를 결정하거나 에피토프를 확인하기 위한 몇몇 연구만이 현재까지 발표되었다. 선형 및 입체형태적 에피토프 둘 모두가 확인되었다. 길모어 (Gilmore) 등은 6개 잔기만큼 짧은 리더 펩티드를 넘어서는 비의존성 N 말단 결실 및 13개 잔기의 C-말단의 말단절단이 모노클로날 항체 B5의 결합을 제거함을 입증하였다 ([Gilmore et al., 1999a]; [Gilmore, 1998]). 이로부터, B5 모노클로날 항체가 입체형태적으로 규정된 에피토프를 인식한다고 결론지어졌다 (Gilmore et al., 1999b). 상기 입체형태적으로 규정된 에피토프 내의 항체 인식 부위를 포함하는 정확한 잔기는 확인되지 않았다. 모노클로날 항체 B5에서 관찰된 것과 대조적으로, 상기 세포 회합 천연 OspC에 대한 폴리클로날 항체 반응의 분석은 OspC의 마지막 10개의 C-말단 잔기의 또는 N-말단의 연장된 영역의 결실이 감염 동안 유도된 IgG에 의한 OspC의 인식을 제거하지 않음을 보여주었다. 상기 결과의 차이는 폴리클로날 항체 대 모노클로날 항체에 집중한 결과의 반영으로 추정된다. 입체형태적 에피토프의 존재를 분명히 배제하지 않는 상기 데이타는 선형 에피토프가 OspC에 또한 존재함을 명백하게 입증한다. 선행 연구에서, 마티슨 (Mathieson) 등은 또한 OspC 내의 선형 에피토프에 대해 보고하였다 (Mathieson et al., 1998). 이들은 OspC의 C-말단의 7개 잔기가 유럽 신경보렐리아증 환자로부터 수거된 혈청에서 IgM에 의해 인식되는 선형 에피토프를 구성함을 밝혀내었다. IgM 결합은 상기 보고서에서 평가되지 않았지만, OspC의 C-말단 10개 잔기의 결실은 IgG 결합을 제거하지 않았다. 감염 유도 IgG에 의해 인식되는 에피토프는 단백질 내의 몇몇 부위에 위치하는 것으로 보인다. 그러나, 이것은 C-말단 에피토프가 존재하지 않거나 감염 동안 유도된 항체에 의해 인식되지 않음을 제시하지 않는 것이 아니라, 오히려 OspC 내의 다른 부위에 추가의 에피토프가 존재함을 제시한다.
보다 짧은 OspC 단편의 면역블롯 분석을 통해 OspC 에피토프의 보다 정밀한 위치 결정이 가능하였다. OspC의 항원 영역은 두 영역에 위치하였다. 하나는 잔기 136-150에 걸쳐 이어지고, 다른 하나는 잔기 168 내지 210에 걸쳐 이어진다. X-선 회절 분석으로부터 좌표를 사용하여 생성된 구조적 모델에 따르면 잔기 136-150은 주로 루프 5로 불리는 표면 노출된 루프 내에 위치하였다 (Kumaran et al., 2001). 루프 5는 OspC의 단량체 및 이량체 모델 둘 모두에서 표면 노출되고, 돌출 만곡부 내에 위치한다. 재조합 OspC가 사실상 이량체를 형성하는 것으로 입증되었지만, 천연 OspC가 생체 내에서 이량체 또는 더 큰 올리고머를 형성하는지는 아직 결정되지 않았다. OspC에 대한 이량체 모델은 >30%의 단백질을 포함하는 유의한 묻힌 계면 (buried interface)을 나타낸다. 상기 정도의 묻힌 계면은 단량체 사이의 긴밀한 상호작용을 시사하고, 이량체 형태의 단백질이 생물학적 활성 형태임을 표시하는 것으로 간주된다 ([Kumaran et al., 2001]; [Eicken et al., 2001]; [Zuckert et al., 2001]). OspC 이량체에서, 루프 5 내의 잔기는 생물학적 유의성을 가질 수 있는 입체형태적으로 규정된 추정 리간드 결합 포켓의 일부인 것으로 예측된다. 상기 충전된 포켓은 카르보닐기, 예컨대 글루타메이트 및 아스파르테이트 잔기를 함유하는 아미노산에 의해 채워진다. 결정 구조는 타입 A, I (Kumaran et al., 2001) 및 E (Eicken et al., 2001)의 3개의 OspC 단백질에 대해 결정되었다. 모든 이들 단백질에서 상기 추정 결합 포켓의 용매 구조는 현저하게 잘 보존된다. 감염 혈청 내의 항체에 대한 루프 5의 접근성은 상기 도메인이 표면 노출되고 잠재적으로 리간드 결합에 이용가능할 수 있다는 가정을 지지한다. 루프 5 및 추정 리간드 결합 포켓의 타입간 구조적 보존에도 불구하고, 상기 도메인의 서열은 타입간 수준에서 고도로 가변적이다. 잔기 168 내지 210에 걸쳐 이어지는 알파 5 도메인의 서열도 고도로 보존된 마지막 20개의 잔기를 제외하고 타입간 수준에서 가변적이다. 일련의 타입 특이적 에피토프로 이루어지는 키메라 OspC 백신의 구축을 허용하도록 충분한 보존이 타입내 수준에서 존재하는지를 결정하기 위해서, OspC 서열을 정렬하고 계통수를 구축하였다. 이들 분석을 통해, OspC 타입이 227개 서열에 대해 결정되었다 (데이타를 제시하지 않음). 루프 5 및 알파 5 에피토프 둘 모두가 타입내 수준에서 잘 보존된 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 타입 A OspC 단백질의 루프 5 에피토프는 57개 중 54개의 서열에서 동일하였고, 알파 5 에피토프는 43개 중 42개의 타입 A 서열에서 보존되었다. 다른 OspC 타입에서 이들 도메인의 유의한 보존도 관찰되었고, 타입 C 내지 I, M, N 및 O는 루프 5 및 알파 5 에피토프 내에 절대적인 타입내 보존을 보였다.
상기 연구는 이전에 알려진 침습성 단리물 중에 보다 큰 OspC 다양성이 존재함을 보여준다. 상기 연구는 또한 마우스에서 OspC에 대한 항체 반응이 주로 타입 특이적이고 이전에 특성화되지 않은 루프 5 및 알파 5 에피토프에 의해 규정됨을 입증한다. 보다 초기의 연구 및 본원에서 제시된 데이타는 단일 OspC 단백질이 다양한 균주에 대한 보호를 전달하지 않을 것임을 명백하게 보여준다 (Bockenstedt et al., 1997). 하나의 가능한 백신 접종 방법은 재조합 키메라 OspC 백시노겐의 개발에서 상기 보고서에서 확인된 에피토프를 이용하는 것이다. 인간에서 일관되게 항원성인 것으로 입증된다면 루프 5 에피토프 또는 루프 5와 알파 5 에피토프의 조합이 가장 유망할 수 있다. 이들 에피토프는 비교적 길이가 짧고, 선형이며, 타입내 수준에서 고도로 보존된다. 이들 특징에 비추어, 고도로 다양한 라임병 단리물에 대한 보호를 전달할 수 있는 루프 5-알파 5 키메라 백시노겐의 구축이 기술적으로 실행가능함이 입증되어야 한다.
실시예 2. 인간에서 타입 A OspC 루프 5 도메인에 대한 항체 반응의 분석 및 라임병 백신 개발에서 루프 5 에피토프의 잠재적인 유용성에 대한 평가
라임병 스피로헤테스의 외부 표면 단백질 C (OspC)는 진드기가 물었을 때 발현 및 감염 초기 동안 발현되는 (Schwan et al., 1995) 22 kDa 면역우성 (Fuchs et al., 1992) 항원이다. OspC에 대한 강한 항체 반응이 천연 감염 동안 개시되지만, OspC 생산이 감염 확립 직후에 차단되기 때문에 반응은 세균 소실을 유도하지 않는다 (Schwan et al., 1995). OspC는 발병 인자 및 라임병 백신 개발을 위한 잠재적인 후보로 등장하였다. 그러나, OspC-기반 백신 개발 노력은 균주 사이의 그의 불균일성에 의해 저하되었다 ([Theisen et al., 1993]; [Wilske et al., 1996]; [Wilske et al., 1993]). OspC를 사용한 백신 접종은 고도로 보호 반응을 유도하였지만, 대부분의 연구는 단지 균주-특이적 보호만을 보고하였다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Gilmore et al., 1996]; [Mbow et al., 1999]; [Probert et al., 1997]; [Rousselle et al., 1998]; [Scheiblhofer et al., 2003]). 최근의 분석은 OspC의 항원 구조 및 균주-특이적 보호의 기초에 대한 본 발명의 이해에 유의한 통찰력을 제시하였다. A 내지 U로 지정된 21개의 OspC 타입이 규정되었다 ([Lagal et al., 2003]; [Seinost et al., 1999]; [Wang et al., 1999]). 특이적 OspC 타입을 생산하는 보렐리아 부르그도르페리의 클론 집단으로 마우스를 감염시킴으로써, 초기 감염 동안 항체 반응이 주로 OspC 타입 특이적임이 입증되었다 (실시예 1 참조). 이것은 초기 감염 동안 제시되는 우세한 에피토프가 OspC의 타입-특이적 도메인 내에 존재할 가능성이 있음을 제시한다. 초기의 연구는 21개 중 4개의 OspC 타입만이 침습성 감염과 연관된 것으로 제시하였지만 (Seinost et al., 1999), 최근의 연구는 추가의 OspC 타입을 생성하는 단리물도 또한 침습성 감염을 확립할 수 있음을 입증하였다 ([Alghaferi et al., 2005]; 실시예 1). 그러나, 타입 A OspC는 인간에서 침습성 감염을 야기하는 균주에서 우세하게 존재하는 것으로 보인다. 타입 A OspC의 에피토프-매핑 분석은 마우스에서 반응을 유도하는 우세한 선형 에피토프 중의 하나가 루프 5 도메인 내에 위치함을 밝혀내었다 (실시예 1 참조). 루프 5 도메인은 타입간 수준에서 고도로 가변적이지만, 제시된 타입의 서열 내에서 보존된다 (실시예 1 참조). 본 연구에서, 본 발명자들은 에피토프의 위치를 보다 정확하게 파악하고, 무손상 세균 상의 그의 표면 노출을 입증하고, 에피토프가 살균 항체를 유도함을 입증한다.
OspC의 면역우성 에피토프를 규정하기 위한 대부분의 연구는 마우스를 사용하여 수행하였다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Gilmore et al., 1996]; [Mbow et al., 1999]; [Probert et al., 1994]). 그러나, 몇몇의 에피토프에 대한 항체 반응은 인간 대 마우스 및 다른 포유동물에서 상이함이 입증되었다 (Lovrich et al., 2005). 본 연구의 제1 목적은 OspC의 루프 5 도메인이 인간에서 감염 동안 유도된 항체에 의해 인식되는지 결정하는 것이었다. 이상적으로는, 이들 분석은 타입 A-생산 균주의 클론 집단으로 감염된 개체로부터 수거된 혈청을 사용하여 수행할 것이다. 개체가 불균일하거나 균일한 집단으로 감염되었는지를 절대적으로 확신하면서 결정할 수 없기 때문에, 본 발명자들은 타입 A-특이적 서열에 대한 반응을 보이는 환자 혈청을 확인하고자 하였다. 이를 수행하기 위해서, 이동성 홍반 (초기 라임병)이 있는 환자로부터 수거된 일군의 혈청 샘플을 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 스크리닝하였다. 루프 5 잔기 130 내지 150을 함유하는 재조합 타입 (r-타입) A OspC 및 r-타입 A OspC 하위단편을 사용하여 96-웰 플레이트를 코팅하였다 (250 ng의 r-단백질/웰; 0.1 M Na2HP04; 4℃ 밤새). 플레이트를 차단하고 (포스페이트-완충 염수, 0.5% 트윈 (Tween) 20 내의 10% 탈지 분유; 37℃, 2 h), 세척하고, 인간 라임병 환자 혈청 (1:400 희석)을 각각의 웰 (37℃; 1 h)에 첨가하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 면역글로불린 G (IgG; 시그마) (50 ㎕의 1:40,000 희석)를 첨가한 후 (1 h; 37℃), TMB 기질 (3,3,5,5-테트라메틸벤지딘)을 공급사 (시그마)의 지시에 따라 첨가하였다. 450 nm에서의 광학 밀도 값을 플레이트 판독기를 사용함으로써 결정하였다. 추가의 웰을 음성 대조군으로서 기능하는 소 혈청 알부민으로 코팅하였다. 모든 검정은 삼중으로 수행하였다. 평균 A450 값을 표준 편차와 함께 제시한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 몇몇의 혈청 샘플은 전장 타입 A OspC 및 루프 5 단편 둘 모두에 대해 강한 IgG 반응을 보이는 것으로 밝혀졌다. 혈청 샘플 8 및 44는 루프 5 단편과 가장 강한 면역반응성을 보였고, 따라서 추가의 분석을 위해 선택하였다.
감염-유도된 항체에 의해 인식되는 루프 5 도메인 내의 잔기를 보다 정확하게 규정하기 위해, PepSpot 어레이를 환자 8 및 44로부터의 혈청으로 및 타입 A OspC-생산 균주 B31MI의 클론 집단으로 감염된 마우스로부터의 혈청으로 스크리닝하였다 (실시예 1 참조). PepSpot 어레이는 와트만 (Whatman) 50 셀룰로스막 (150 nmol/cm2; JPT 펩티드 테크놀로지스 게엠베하 (Peptide Technologies GmbH, 독일 베를린))에 점재시킨 타입 A OspC의 루프 5 도메인에 걸치는 12- 내지 13-잔기 중복 펩티드 (2-아미노산 단계)로 이루어졌다. PepSpot 막을 차단하고 (Tris-완충 염수-0.5% 트윈 20 내의 5% 탈지 분유), 세척하고, 마우스 및 인간 혈청 샘플 (각각 차단 용액에 1:1,000 및 1:400 희석됨)로 스크리닝하고, 항체 결합을 종-특이적 항-IgG 항혈청을 사용하여 검출하였다. 면역반응성 도메인을 이루는 특이적 잔기는 마우스 및 인간에서 약간 상이하였지만, 주요 에피토프는 잔기 130 내지 146에 위치하였다 (도 7). 타입 A OspC 서열에서, 상기 영역은 알파 나선 3의 C-말단 영역 및 루프 5의 N-말단 부분을 포함한다.
OspC의 결정 구조는 루프 5를 공간적으로 단백질의 돌출 만곡부 상에 위치시킨다 ([Eicken et al., 2005]; [Kumaran et al., 2001]; 도 24). 상기 루프는 잠재적인 리간드-결합 포켓의 일부인 것으로 가정되었다 (Kumaran et al., 2001). 루프 5가 세포 표면 상에 제시되고 시험관 내에서 성장한 스피로헤테스에서 항체에 접근가능한지 결정하기 위해서, 면역형광 검정 (EFA)을 항-루프 5 항혈청을 사용하여 수행하였다. 비. 부르그도르페리 B31 MI (타입 A OspC), 비. 파르케리, 및 S-태깅된 r-타입 A 루프 5의 전체-세포 용해물을 사용한 면역블롯 분석은 루프 5 항혈청이 특이적임을 입증하였고, 이것은 상기 항혈청의 EFA 적합성을 확립하였다. EFA에 의해 분석한 균주는 비. 부르그도르페리 B31MI (타입 A OspC) 및 LDP74 (타입 K OspC)로 이루어졌다. 스피로헤테스를 33℃에서 성장시키고, OspC 발현을 자극하기 위해 3일 동안 37℃로 옮겼다. IFA는 투과성 세포 (아세톤 고정된), 비투과성 세포 (공기 건조된), 및 이전에 설명된 표준 방법 (Roberts et al., 2002)을 사용하여 수행하였다. 슬라이드를 마우스-루프 5 항혈청, 마우스 면역전 혈청, 또는 토끼-플라겔린 항혈청의 1:1,000 희석액으로 스크리닝하였다. 검출은 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 568-접합된 염소 α-마우스 IgG 또는 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 α-토끼 IgG (차단 완충제 내의 10 ㎍/ml)를 사용하여 달성하였다. 슬라이드를 적절한 로다민 또는 플루오레세인 필터 세트를 사용한 올림푸스 (Olympus) BX51 형광현미경으로, 또는 암시야 현미경에 의해 가시화하고, 올림푸스 마그나파이어 (MagnaFire) 카메라를 사용하여 사진을 찍었다. IFA에 의해 관찰된 표지는 고도로 특이적이고, 면역블롯 분석과 일치하였다; 타입 A-생산 단리물은 표면 표지된 반면, 비. 부르그도르페리 LDP74 타입 K OspC는 표지되지 않았다 (데이타를 제시하지 않음). 또한, 승온에서 OspC의 상향조절과 일치하게, IFA는 33℃에서 성장한 세포보다 37℃에서 성장한 스피로헤테스의 현저하게 더 큰 표면 표지를 보여주었다. 내막 고정된 주변세포질 단백질을 인식하는 α-FlaB 항혈청은 비투과성 세포를 표지하지 않았지만, 아세톤으로 투과성화된 세포를 쉽게 표지하였다 (데이타를 제시하지 않음). 상기 제어는 루프 5 에피토프가 실제로 표면 노출되고, IFA에서 사용된 실험 조건이 세포 일체성을 파괴하지 않고 따라서 세균의 표면 상에 천연적으로 제시되는 에피토프를 인공적으로 노출시킴을 입증한다.
세포 표면에서 OspC에 효율적으로 결합하는 루프 5 항혈청의 능력은 전장 OspC에 대해 항체에서 입증된 바와 같이 상호작용이 살균성일 수 있을 가능성을 제시하였다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Ikushima et al., 2000]; [Jobe et al., 2003]; [Lovrich et al., 2005]; [Rousselle et al., 1998]). 루프 5를 표적화하는 항체가 또한 살균 활성을 보이는지 결정하기 위해서, 치사 검정을 33℃에서 배양하거나 또는 온도를 37℃로 전환한 비. 부르그도르페리 단리물 B31MI 및 LDP74를 사용하여 수행하였다. 스피로헤테스를 원심분리에 의해 수거하고, 세척하고, 5xl05 세포/500 리터 (BSK-H 배지 내)로 조정하고, 12.5 ㎕를 멸균 0.65-ml 미세원심분리관 내로 옮겼다. 이어서, 10 ㎕의 열-불활성화된 (56℃; 30 min) 루프 5 혈청을 단독으로 또는 기니 피그 보체 (7.5 ㎕; 시그마 케미컬 (Sigma Chemical, 미국 미주리주 세인트루이스))와 함께 첨가하고, 성분들을 혼합하고 33 또는 37℃에서 8 h 동안 인큐베이팅하였다. 총 70 ㎕의 H2O를 첨가하고, 스피로헤테스를 제조자의 지시에 따라 생존/사멸 (Live/Dead) 백라이트 (BacLight) 염료 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))로 염색하였다. 간단히 설명하면, 2개의 염료, 즉 SYTO 9 및 요오드화프로피듐을 세포에 첨가하였다. 이들 염료는 살아있는 세균 (즉, 무손상 막 보유)을 손상된 막을 보유한 세균과 구분할 수 있다. 살아있는 세균은 SYTO 9 염색에 의해 녹색 형광을 내는 반면에, 죽은 또는 손상된 세균은 요오드화프로피듐 염색에 의해 적색 형광을 낸다. 면역전 열 불활성화된 혈청 (보체 존재 또는 부재)으로 처리시에 관찰된 파괴된 막을 갖는 세포의 기준선 수준은 25%이었다. 이와 반대로, α-루프 5 항혈청에 노출된 ~70%의 세포는 막 파괴를 보였다. 살균 활성은 보체 의존적인 것으로 결정되었다. 항-루프 5 항체 처리시에 여기서 관찰된 기포형성 (blebbing) 효과는 다른 항-OspC 항체에서 보고된 것과 일치한다 ([Bockenstedt et al., 1997]; [Escudero et al., 1997]). 또한, 승온에서 OspC의 상향조절과 일치하게, 죽은 세포의 비율은 33℃에서 성장한 세포에서보다 37℃에서 성장한 스피로헤테스에서 일관되게 더 높음에 유의하는 것이 중요하다 (데이타를 제시하지 않음). 항-루프 5 항체가 살균성임은 제시된 데이타로부터 명백하다.
몇몇 보고서에서는 라임병 백신의 개발에 대한 타당한 이유의 개요를 설명하였다 (문헌 [Hanson and Edelman, 2004]에서 검토됨). 그러나, 현재 어떠한 백신도 상업적으로 이용가능하지 않다. 광범위 보호성 라임병 백신의 개발을 위해, 백스터 (Baxter)는 14개의 상이한 전장 r-OspC 단백질의 백신 칵테일 생성 전략을 추구하였다 (Hanson and Edelman, 2004). 그러나, 칵테일은 허용될 수 없을 정도로 반응원성으로 여겨진다. 반응원성은 칵테일 내의 각각의 OspC 타입 단백질의 독특한 보호 에피토프에 대한 충분한 반응을 유도하기 위해 필요한 다량의 단백질에 의한 것일 수 있다. 다수의 전장 단백질을 사용하는 칵테일 백신의 잠재적인 문제는 보존된, 무관한 비보호 에피토프에 대한 항체 반응을 잘못 지시할 가능성이다. 각각의 우세한 OspC 타입의 천연적으로 제시된 면역우성 선형 에피토프로 이루어진 키메라 r-백시노겐의 개발을 통해 상기 문제를 극복할 수 있다. 상기 일반적인 개념의 기원은 상이한 감염기에서 발현된 단백질로부터의 에피토프를 사용하여 말라리아 백신을 개발하기 위한 노력에 있다 (Hanson and Edelman, 2004). 동일한 개념이, 큰 성공을 거둔 A군 스트렙토코커스 (streptococcus)에 대한 6가 M 단백질 백신의 개발 (Dale, 1999) 및 몇몇 다른 병원체에 대한 백신의 개발 ([Apta et al., 2006]; [Caro-Aguilar et al., 2005]; [Fan et al., 2005]; [Horvath et al., 2005]; [Kotloff et al., 2005]; [McNeil et al., 2005]; [Wang et al., 2005])에 적용되었다. OspC의 물리적 및 항원성 구조에 대한 새로운 통찰력을 가짐으로써, 효과적인 r-다가, 키메라 OspC 백신을 개발하는 것이 이제 가능하다. 새로 확인된 루프 5 도메인은 상기 백신에 포함하기에 이상적으로 적합하다.
실시예 3. OspC-기반 4가, 재조합, 키메라 백시노겐의 개발
라임병은 북미 및 유럽에서 가장 흔한 절지동물-매개 질환이다. 현재, 인간에서 사용하기 위한 상업적으로 이용가능한 백신은 없다. 외부 표면 단백질 C (OspC)은 그를 매력적인 백신 후보로 만드는 항원성 및 발현 특성을 갖지만; 서열 불균일성 때문에 백시노겐으로서 그의 사용이 지연되고 있다. 서열 분석을 통해 21개의 잘 규정된 OspC 계통발생 군 또는 "타입" (A 내지 U로 지정됨)이 확인되었다. 상기 연구는 인간 및 뮤린 감염 동안 OspC 타입 B, K 및 D에 의해 제시되는 선형 에피토프의 매핑 및 재조합, 4가, 키메라 백시노겐의 개발에서 이들 에피토프의 이용 (이전에 확인된 타입 A OspC 선형 에피토프와 함께)을 보고한다. 구축물은 마우스에서 고도로 면역원성이고, 유도된 항체가 시험관 내에서 배양한 스피로헤테스를 표면 표지함이 밝혀졌다. 중요하게는, 백신 접종은 구축물 내로 통합된 각각의 OspC 타입을 발현하는 균주에 대해 보체-의존성 살균 항체를 유도하였다. 이들 결과는 효과적인 광범위 보호성 다가 OspC-기반 라임병 백신이 재조합 키메라 단백질로서 생산될 수 있음을 제시한다.
물질 및 방법
보렐리아 부르그도르페리 단리물 및 배양.
보렐리아 부르그도르페리 단리물 B31MI (타입 A OspC), LDP73 (타입 B), LDP116 (타입 D) 및 LDP74 (타입 K)의 클론 집단 [실시예 1 참조]을 이전에 설명된 바와 같이 하위표면 플레이팅함으로써 얻었다 [Sung et al., 2000]. ospC의 PCR 증폭 (Taq 중합효소, 프로메가 (Promega)) 및 DNA 서열결정에 의해 개별 클론의 OspC 타입을 결정하였고, 계통발생학 분석에 의해 타입을 지정하였다 [실시예 1 참조]. 스피로헤테스를 지시된 바와 같이 33 또는 37℃에서 완전 BSK-H 배지 (시그마)에서 배양하였다.
재조합 (r-) OspC 단백질의 리가제 비의존성 클로닝 및 생산.
전장 타입 B, K 및 D OspC 및 일련의 말단절단체 및 단편을 각각의 단리물로부터 대응하는 유전자의 PCR 증폭에 의해 생성하였다. pET-32 Ek/LIC 벡터에서 리가제-비의존성 클로닝 (LIC)을 허용하기 위해 5' 오버행을 갖는 프라이머를 설계하였다 (표 3) [실시예 1]. 모든 LIC 방법은 본질적으로 제조자 (노바겐)가 제시한 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 단일 가닥 테일의 증폭 및 재생 후에, 앰플리콘을 pET-32 Ek/LIC 벡터와 어닐링하고, 노바블루 (DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시키고 증식시켰다. 플라스미드를 회수하고, 삽입 서열을 DNA 서열결정에 의해 확인하였다. 단백질 정제를 위해, 정제된 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이 BL21 (DE3) 세포를 형질전환시키고, 지수 성장기 동안 배양액에 IPTG (1 mM)의 첨가에 의해 단백질 발현을 유도한 후, 3시간 인큐베이션하였다. pET-32 Ek/LIC 벡터로부터의 발현에 의해 부가된 N-말단 융합체는 Trx-태그, S-태그, 및 헥사히스티딘 (His-태그) 모티프를 함유한다. His-태그는 니켈 친화도 크로마토그래피에 의한 r-단백질의 정제를 허용하기 위해 이용하였다. 간단히 설명하면, 세포를 용해시키고, 핵산 및 세포벽 펩티도글리칸을 각각 벤조나제 뉴클레아제 및 r-리소자임에 의해 분해하였다. 가용성 단백질을 원심분리 (16000 x g에서 15 min 동안)에 의해 투명하게 만들고, 고정된 니켈 컬럼을 통과시키고, 세척한 후, 제조자의 프로토콜 (노바겐)에 따라 용리하였다. 용리된 단백질을 10 kDa 분자량 컷오프 (cut-off) 막 (Slid-a-lyzer, 피어스)을 가로질러 포스페이트 완충 염수 (PBS; pH 7.4)에 대해 강하게 투석하고, 최종 단백질 농도를 BCA 검정 (피어스)에 의해 정량하고, 제제의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
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면역블롯 분석: OspC 타입 B, D, 및 K의 에피토프 매핑
감염 동안 관련되는 에피토프의 매핑을 허용하기 위해, C3H/HeJ 마우스를 OspC 타입 B, K, 또는 D를 발현하는 클론 집단의 104개의 스피로헤테스로 감염시키고, 혈액을 제2, 4, 6, 8 및 12주에 테일 방혈에 의해 수집하였다. 이들 혈청을 실시예 1에 설명된 바와 같이 정제된 OspC 단백질 및 말단절단체를 스크리닝하기 위해 사용하였다. r-단백질을 SDS-PAGE로 처리하고, PVDF로 옮기고, 타입-특이적 뮤린 감염 혈청 (제6주에 수집함)의 1:1000 희석액으로 스크리닝하였다. 이와 유사하게, r-단백질을 OspC 타입 B, K, 또는 D를 발현하는 비. 부르그도르페리 균주로 감염된 것으로 알려진 환자로부터의 혈청 (1:400) (알렌 스티어 박사 (Dr. Allen Steere)로부터 제공받음)으로 스크리닝하였다. 적절한 IgG-특이적, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 2차 항체를 이용하였고, 그 결과를 화학발광에 의해 가시화하였다.
4가 키메라 백시노겐의 구축 및 발현.
타입 A의 루프 5 영역 (aa 131 내지 149) 및 타입 B의 알파 나선 5 영역 (aa 160-201), K (aa 161-201), 및 D (aa 161-201)를 4가 시험 백시노겐에 포함시키기 위해 선택하였다. 각각의 에피토프-함유 영역을 상기 설명된 r-플라스미드 및 표 4에 나열된 프라이머로부터 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 초기의 2 min 94℃ 변성 단계, 이어서 94℃ 15 sec의 변성, 50℃ 30 sec의 프라이머 어닐링, 및 72℃ 60 sec의 연장의 35 사이클, 및 72℃ 7 min의 최종 연장의 표준 조건이었다. 5' 오버행으로서 벡터-특이적 LIC 테일 또는 비구조적 프로테아제-저항성 링커 서열을 갖는 프라이머를 설계하였다 (도 9a) [Crasto and Feng, 2000]. 모든 앰플리콘을 TAE 완충제를 사용하여 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분석하고, 겔 정제하였다 (퀴아퀵 겔 추출, 퀴아겐). 이어서, 정제된 생성물을 후속 라운드의 PCR에서 주형으로 사용하였다. 제2 라운드에서, 타입 A 루프 5 및 타입 B 알파 나선 5의 앰플리콘을 주형으로서 조합하였다. 변성 후에, 앰플리콘은 전방향 타입 A 루프 5 및 역방향 타입 B 알파 나선 5 프라이머를 사용한 중복 연장 및 후속 증폭을 허용하는 상보성 링커 서열을 통해 어닐링하였다. 타입 K 및 D 알파 나선 5 서열을 유사한 방식으로 구축물에 부가하되, 어닐링 특이성을 증가시키기 위해서 어닐링 온도를 처음 10 사이클 후에 60℃로 올렸다. 최종 생성물을 N-말단 헥사히스티딘 태그 융합체를 코딩하는 pET-46 Ek/LIC 발현 벡터 (노바겐)에 어닐링하고, 노바블루 (DE3) 이. 콜라이 세포를 형질전환시켰다. 백시노겐 서열은 정제된 플라스미드의 DNA 서열 결정에 의해 확인하였다. 단백질 발현 및 정제를 상기 설명된 바와 같이 완료하였다.
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Figure pct00011
4가 ABKD 키메라 백시노겐을 사용한 마우스의 면역화
완전 프로인트 아주반트 (CFA)와 1:1 비로 유화시킨 50 ㎍의 키메라 백시노겐으로 12마리의 6주령 수컷 C3H/HeJ 동물주 마우스를 면역화시켰다. 백시노겐을 분할된 복강내 및 피하 데포제 (depot)에서 200 ㎕의 총 부피로 투여하였다. 3마리의 대조 마우스에게 CFA 내의 PBS의 샴 백신을 접종하였다. 제2 및 4주에, 마우스를 프로인트 불완전 아주반트 내의 50 ㎍ 단백질로 추가접종하였다. 샴 면역화시킨 마우스에게 아주반트 내의 PBS를 투여하였다. 모든 마우스를 제1 주사 전에, 및 제6주에 꼬리를 칼로 베어 출혈시켰다.
ABKD 키메라 백시노겐의 면역원성의 평가.
백시노겐의 면역원성을 면역블롯 분석 및 ELISA에 의해 평가하였다. 상기 설명된 바와 같이 면역블롯을 생성하고 스크리닝하였다. 1 ㎍의 각각의 정제된 r-단백질 (OspC 타입 A, B, K, D, 및 키메라 백시노겐)을 면역블롯에 의해 분석하였다. 비. 부르그도르페리로부터 유래된 비관련 His-태깅된 단백질인 r-BBN39 (이원성 (paralogous) 단백질 패밀리 163)는 음성 대조군으로 기능하였다. 동등한 단백질 로딩을 확인하기 위해, 한 블롯을 항-His 태그 모노클로날 Ab (mAb) (1:2000; 노바겐)로 스크리닝하였다. 백신 접종에 대한 반응을 평가하기 위해, 동일한 블롯을 마우스 항-ABKD 항혈청의 1:500 희석액으로 스크리닝하였다. HRP-접합된 염소-항-마우스 IgG (1:40000 희석)는 2차 항체로서 기능하고, 결합은 화학발광에 의해 가시화되었다. ELISA 분석을 카르보네이트 완충제 (pH 9.6; 16 hr, 4℃) 내의 웰당 100 ng의 백신 구축물 또는 r-OspC (타입 A, B, K, 또는 D)로 코팅된 96 웰 플레이트 (코스타 (Costar) 3590; 코닝 (Corning))를 사용하여 수행하였다. 플레이트를 차단하고 (0.2% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBS-T) 내의 1% BSA; 2 hr), PBS-T로 3회 세척하고, 연속 희석된 항-ABKD 항혈청 (100 ㎕; 1:50 내지 1:109350)을 이중 플레이트의 웰에 첨가하였다 (1 hr). HRP-접합된 염소-항-마우스 IgG (1:20000)는 2차 항체로서, ABTS는 발색 기질로서 기능하였다. 흡광도를 405 nm에서 ELISA 플레이트 판독기 (ELx 808; 바이오테크 (Biotek))에서 판독하였고, 이때 반응 속도는 선형이었다. 역가는 4개 파라미터 로지스틱 (logistic) 식 (시그마플롯 (SigmaPlot))에 의해 에스자형 곡선을 흡수 곡선에 피팅하고 최대 흡수 고원 (plateau)의 50%에 대응하는 희석배수의 역수를 계산함으로써 계산하였다.
항- ABKD 항체 반응의 면역글로불린 이소형 프로파일링.
항-ABKD 항체 반응의 이소형 프로파일은 이중 ELISA 플레이트를 웰당 100 ng의 키메라 구축물로 코팅함으로써 평가하였다. 플레이트를 상기 설명된 바와 같이 세척하고, 차단하였다. 12마리의 백신접종된 마우스로부터 수집한 항-ABKD 항혈청을 이중으로 분석하였다 (100 ㎕; 1:10000; 1 hr). 결합된 백시노겐-특이적 Ig가 이소형 특이적 비오티닐화 2차 항체 (1 hr; 마우스 이소형 결정 키트; 자이메드 (Zymed))와 함께 인큐베이션함으로써 검출되었다. 결합된 비오티닐화 항체는 HRP-접합된 스트렙타비딘 (30 min) 및 발색 기질, 즉 ABTS에 의해 검출되었다. 모든 인큐베이션은 실온에서 완료하였다.
간접적 면역형광 검정 ( IFA ).
ABKD 키메라 백시노겐 내에 포함된 에피토프가 시험관 내에서 배양한 비. 부르그도르페리의 표면 상에 제시되는지 결정하기 위해, IFA 분석을 수행하였다. OspC 생산을 최대화하기 위해, 타입 A, B, K, 또는 D OspC를 생산하는 클론 집단의 배양액의 온도를 33℃에서 37℃로 전환하였다. 5 mL의 조밀 배양액 (~107 - 108 세포/mL)으로부터의 스피로헤테스를 원심분리 (7000 x g에서 15 min 동안)에 의해 수집하고, PBS로 3회 세척하고, 5 mL의 PBS 내에 재현탁하고, 100 ㎕를 하전된 슬라이드 (Superfrost Plus, 피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific)) 상의 2 cm2 영역 상에 엷게 발랐다. 1 세트의 슬라이드를 공기 건조하고, 제2 세트의 슬라이드를 아세톤 고정하였다. 슬라이드를 차단하고 (1 hr; PBS-T 내의 3% BSA), 이어서 항-ABKD 항혈청, 면역전 혈청의 1:100 희석액, 또는 토끼-항-플라겔린 항혈청의 1:1000 희석액으로 스크리닝하였다 (1 hr). 결합된 항체는 알렉사플루오르 568-접합된 염소-항-마우스 IgG 또는 알렉사플루오르 488-접합된 염소-항-토끼 IgG (차단 완충제 내의 10 ㎍/ml)를 사용하여 검출하였다. 슬라이드를 각각의 단계 사이에 PBS-T 내에 3회 세척하고, 모든 인큐베이션은 1시간 동안 실온에서 어두운 가습 챔버에서 수행하였다. 슬라이드를 플루오로마운트 (Fluoromount)-G (일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 (Electron Microscopy Sciences))에 올리고, 적절한 로다민 또는 플루오레세인 필터 세트를 사용한 올림푸스 BX51 형광현미경으로, 또는 암시야 현미경에 의해 가시화하고, 올림푸스 마그나파이어 디지털 카메라를 사용하여 사진을 찍었다.
살균 활성의 평가.
비. 부르그도르페리를 사멸시키는 항-ABKD 항혈청의 능력을 시험관 내에서 평가하였다. 상기 설명된 바와 같이 온도를 33℃에서 37℃로 전환한 스피로헤테스를 BSK-H 배지로 3회 세척하고, 세포 밀도를 ~106 세포/mL로 조정하였다. 8 ㎕의 세포를 8 ㎕의 기니 피그 보체 (시그마) 및 4 ㎕의 각각의 시험 혈청 (56℃에서 열 불활성됨; 30 min)과 합하였다. 대조군은 보체를 함유하지 않는 열 불활성화된 항-ABKD 항혈청, 보체 단독, 및 보체를 포함하고 한데 모으고 열-불활성화된 면역전 혈청을 포함하였다. 필요한 만큼 BSK-H 배지를 첨가하여 총 반응 부피를 20 ㎕로 만들고, 샘플을 37℃에서 18 hr 동안 인큐베이팅하였다. 백라이트 생존/사멸 검정 (몰레큘라 프로브스) 및 플루오레세인 및 로다민 필터 세트를 사용하는 올림푸스 BX51 형광 현미경을 사용한 5개의 고배율 시야에서의 생존 및 사멸/손상된 세포의 수동 계수를 사용하여 사멸을 평가하였다.
결과
마우스 및 인간에서 감염 동안 제시되는 OspC 타입 B, D, 및 K의 에피토프의 확인.
지금까지, OspC 타입 A, B, C, D, H, I, K 및 N이 침습성 감염이 존재하는 것으로 결정된 환자로부터 회수되었다 ([Seinost et al., 1999]; 실시예 1; [Alghaferi et al., 2005]). 다가 키메라 OspC 백신의 유용성의 기준에 대한 증거를 확립하기 위해 4개의 이들 OspC 타입 (A, B, K, 및 D)을 선택하였다. 감염 동안 제시되는 에피토프는 타입 A OspC에 대해서만 확인되었기 때문에, 상기 연구의 제1 단계는 OspC 타입 B, K 및 D의 감염-관련 에피토프를 확인하는 것이었다. 이를 수행하기 위해, 각각의 타입의 말단절단체 및 단편의 면역블롯을, 비. 부르그도르페리의 클론 집단 (OspC 타입 B, K 또는 D)으로 감염된 마우스로부터의 혈청으로 또는 적어도 부분적으로 타입 B, K, 또는 D의 OspC를 생산하는 비. 부르그도르페리 균주로 감염된 것으로 결정된 인간 라임병 환자로부터의 혈청 (개인적인 전달, 알렌 스티어 박사 및 캐스린 존스 (Kathryn Jones) 박사)으로 스크리닝하였다. 제6주에 마우스에서 항체 반응은 타입-특이적이었지만; 몇몇의 인간 혈청은 타입 사이의 교차-면역반응성을 보였고 (데이타를 제시하지 않음), 이것은 이들 환자가 혼합된 스피로헤테스 집단에 감염되었을 가능성이 있음을 시사한다. OspC 타입 B에서, 에피토프는 마우스 감염 혈청에 대해 알파 나선 5에 위치하였다 (aa 175 내지 200). 인간 감염 혈청은 유사하게 위치하는 단편 (aa 164-185)과 반응하였고, 이것은 타입 B의 알파 나선 5 영역이 항원성임을 나타낸다. 타입 K OspC에서, 에피토프는 마우스의 aa 148 내지 160에서, 인간의 알파 나선 5 영역 (aa 160 내지 175)에 매핑되었다. OspC 타입 D 에피토프는 마우스 및 인간의 알파 나선 5 영역 (aa 167 내지 180)에 매핑되었지만, 인간 혈청에 의해 인식되는 다수의 추가의 에피토프가 존재하였다. 이들 데이타는 OspC 타입 B, K, 및 D의 알파 나선 5 영역이 4가 ABKD 백시노겐 구축물에 포함하기 위한 적절한 선택임을 나타낸다.
4가 키메라 OspC 백시노겐의 구축, 발현 및 정제.
타입 B, K 및 D에 대해 상기 규정된 알파 나선 5 에피토프 및 앞선 연구 [실시예 1]에서 규정된 타입 A 루프 5 에피토프를 사용하여, 4개의 에피토프-함유 영역으로 이루어진 다가의 키메라 r-백시노겐을 생산하였다. 에피토프를 짧은 비구조적 프로테아제-저항성 링커 서열에 의해 연결하였다 (도 9b). 재조합 백시노겐은 길이가 169 aa이고, 분자 질량은 18.0 kDa이고, 등전점은 6.49이다. 그의 구조는 우세하게 나선이고 ([Gasteiger et al., 2005]; [Kneller et al., 1990]) 높은 안정성 지수를 갖는 [Guruprasad et al., 1990] 것으로 예측된다. PBS를 사용한 분석 후에, 재조합 백시노겐의 몇몇 침전이 존재하였지만; 대략 500 ㎍/mL은 가용성 상태로 유지되었고, 상기 가용성 단백질을 모든 실험에 사용하였다. SDS-PAGE에 의한 정제된 백시노겐 단백질의 분석은 18 kDa 분자 질량의 단일 밴드를 보여주었고, 오염 단백질은 보이지 않았다.
마우스에서 ABKD 키메라 백시노겐의 면역원성
ABKD 키메라 백시노겐 및 그의 개별 성분 에피토프에 대한 항체 반응을 평가하기 위해, C3H/HeJ 마우스에게 프로인트 아주반트 내의 백시노겐을 투여하였다. 혈청을 백신접종된 (n=12) 및 샴 (PBS + 아주반트) 면역화시킨 마우스 (n=3)로부터 수집하고, ABKD 키메라 백시노겐 및 타입 A, B, K, 및 D의 전장 r-OspC 단백질과의 반응성에 대해 평가하였다. 웨스턴 블롯 분석은 항-ABKD 항혈청이 백시노겐 단백질과 및 타입 A, B, 및 K의 r-OspC와 강하게 반응하였음을 입증하였다. 이와 반대로, 키메라 구축물의 C-말단 OspC 타입 D 에피토프와의 반응성은 상당히 더 약하였다 (도 10). 임의의 혈청의 음성 대조군 단백질 (r-BBN39)과의 반응성은 존재하지 않았고, 샴-백신접종된 마우스로부터의 혈청은 임의의 단백질과 반응하지 않았다. 혈청 반응성의 정량적 ELISA-기반 적정은 ABKD 키메라 백시노겐 단백질에 대해 고-역가 IgG 반응을 보여주었고, 평균 역가는 27,800이었다 (도 11a). 타입-특이적 에피토프에 대한 반응성의 적정은 고정된 전장 r-OspC 단백질과의 결합을 평가함으로써 달성하였다. 개별 에피토프에 대한 항체 역가의 유의한 차이가 관찰되었다 (도 11b). 에피토프-특이적 역가는 백시노겐의 C-말단에 근접함에 따라 감소한다는 사실이 주목된다.
항- ABKD 항혈청의 면역글로불린 이소형 프로파일.
면역글로불린 이소형 프로파일은 백신-특이적 항체의 잠재적인 이펙터 기능의 평가에 중요하다. ABKD 키메라 백시노겐에 의해 유도된 면역글로불린 중쇄 클래스 전환을 평가하기 위해, 이소형 프로파일을 ELISA에 의해 결정하였다. 지배적인 이소형은 IgG1이고, IgG2a 및 IgG2b의 수준은 미미하게 더 낮았다. 6주 혈청은 단지 제한된 수준의 IgM, IgG3, 또는 IgA만을 보였다 (도 12).
간접 면역형광 검정 .
ABKD 키메라 백시노겐의 각각의 에피토프에 대해 유도된 항체가 보렐리아 세포 표면 상의 OspC에 결합하는 능력을 간접 면역형광 현미경에 의해 평가하였다. 특이적 표면 표지가 타입 A, B, K, 및 D의 OspC를 생산하는 세포에서 관찰되었다 (데이타를 제시하지 않음). 형광 신호의 강도는 타입-특이적 역가와 일치하였고, 가장 강한 형광은 OspC 타입 A 또는 B 보유 세포에서 관찰되었다. 타입 K 또는 D 보유 세포의 형광은 강도가 더 작았고, 염색은 드문드문 존재하여 세포가 작은 점으로 보였다. 반응성은 일치하는 면역전 혈청으로 프로빙된 세포에서 관찰되지 않았다. 공기 고정된 세포에 대한 항-플라겔린 항체에 의한 표면 표지의 결여를 통해, 세포의 외부 막이 무손상이고 검출된 에피토프가 세포 표면에 자연적으로 존재함을 확인할 수 있었다. 예상된 바와 같이, 아세톤으로 투과성화된 세포는 항-플라겔린 항체로 표지되었다 (데이타를 제시하지 않음).
ABKD 키메라 백시노겐의 백신 접종이 살균성 항체를 유도함의 입증.
항-ABKD 항혈청의 살균 활성을 생존/사멸 백라이트 검정을 이용하여 평가하였다 ([Tily et al., 2001]; [Ledin et al., 2005]; [Elias et al., 2000]; [Montgomaery et al., 2006]; [Elias et al., 2002]; [Shin et al., 2004]). 살균 활성은 키메라 백신 구축물에 포함된 모든 타입의 OspC를 보유하는 균주에 대해 검출되었다. 항-ABKD 항혈청과 함께 인큐베이팅하면 유의한 세포 응집이 유도되었다. 생존 및 사멸 세포 둘 모두가 응집물 내에 존재한다. 응집물 내의 세포 계수의 고유한 어려움 때문에, 생존 및 사멸 세포의 백분율은 비-응집된 유리 세포만을 계수함으로써 결정하였다. 4가지의 모든 OspC 타입에 대해, 살균 검정에 사용된 배양액 내의 사멸 세포의 배경 수준은 대략 20-30%이었다. 이 사멸 세포의 배경 수준은 OspC 발현을 상향조절하기 위해 배양액을 33℃로부터 37℃로 이송한 후 본 발명자들의 실험에서 일관되게 관찰되었다. 살균 검정에서, 사멸은 보체 의존 방식으로 발생하였고, 죽은 세포의 백분율은 배경보다 56 내지 90% 더 높게 유의하게 증가하였다. 사멸 세포의 수는 모든 경우에 임의의 대조군에서 관찰된 사멸 세포의 수의 적어도 2배이었다. 보체 단독은 사멸을 유도하지 않았다. 한데 모은 면역전 혈청에 의해 유도된 살균 활성은 존재하지 않았고, 이것은 백시노겐에 대한 특이적 면역 반응이 살균 활성에 필요함을 나타낸다.
논의
몇몇 연구에서는 잠재적인 백시노겐으로서 라임병 스피로헤테스의 OspC의 잠재적인 유용성을 조사하였다. OspC를 사용한 백신 접종은 보호성 항체 반응을 유도하지만, 보호는 주로 균주 특이적인 것으로 보고되었다 ([Gilmore et al., 1996]; [Scheiblhofer et al., 2003]; [Wallich et al., 2001]; [Brown et al., 2005]; [Probert and LeFebvre, 1994]; [Gilmore 3t al, 2003]). 다수의 OspC 단백질의 칵테일을 사용하여 보다 넓은 보호를 유도한 시도는 성공한 것으로 입증되지 않았다. 백스터에서는 14개의 상이한 전장 OspC 변이체로 이루어진 OspC 칵테일을 시험하였지만; 이들은 각각의 변이체의 독특한 도메인에 대해 생성된 충분한 항체 역가를 유도할 수 없었다 - 광범위 보호가 전달될 필요가 존재한다. 또한, 허용되지 않는 반응원성이 보고되었다 [Hanson et al., 2004]. 칵테일 백신에서의 일반적인 우려는 감염 동안 자연적으로 제시되지 않는 및 보호 항체를 유도하지 않는 에피토프에 대한 항체 반응의 잠재적인 잘못된 지시 (misdirection)이다. 키메라 백신의 생성은 r-단백질의 단순한 칵테일을 사용하여 겪게 되는 문제를 회피할 수 있는 대안적인 방법을 제공한다. 일련의 면역우성 에피토프로 이루어진 키메라 백신은 말라리아 ([Hanson et al., 2004]; [Caro-Aguilar et al., 2005]);, A군 스트렙토코커스 ([McNeil et al., 2005]; [Dale et al., 2005]; [Hu et al., 2002]; [Dale, 1999]; [Kotloff et al., 2005]; [Horvath et al., 2005]), 및 몇몇 바이러스 ([Apt et al., 2006]; [Fan and Mei, 2005]; [Wang et al., 2005]; [Bouche et al., 2005])에 대한 백신의 개발에 활용되었다. 다가 OspC 백신이 광범위 보호성이면, 다양한 균주에 대한 보호 반응을 유도하기 위해 백시노겐 내로 충분한 어레이의 에피토프를 포함시키는 것이 필요할 것이다. 그러한 백시노겐의 구축을 향해 나아가는 능력은 A 내지 U로 지정된 21개의 별개의 OspC 타입을 설명한 계통발생학 분석에 의해 크게 촉진되고 [Seinost et al., 1999], 그 중 단지 하나의 하위세트가 인간에서 침습성 감염과 상호관련되었다 ([Seinost et al., 1999]; 실시예 1; [Alghaferi et al., 2005]).
키메라 백시노겐의 개발을 위해 OspC의 에피토프 구조의 상세한 이해가 요구된다. OspC 에피토프 위치의 몇몇 이전의 설명이 존재한다 ([Gilmore et al., 1996]; [Jobe et al., 2003]; [Lovrich et al., 2005]). 2가지 연구에서는 살균성 항체를 유도하는 에피토프가 OspC의 C-말단 도메인 내에 존재한다고 보고하였지만 ([Jobe et al., 2003]; [Lovrich et al., 2005]); 상기 도메인은 비교적 보존적이므로, C-말단에 대한 항체가 광범위 보호성이 아닌 이유는 명백하지 않다. 마티센 등은 또한 10개 아미노산 C-말단 말단절단된 형태보다 전장 OspC와 유럽 신경보렐리아증 환자로부터의 혈청의 보다 큰 반응성을 인지하여, C-말단이 항체 반응의 지배적인 표적임을 제안하였다 [Mathiesen et al., 1998]. 이로부터, 그들은 C-말단 에피토프가 반드시 존재할 것으로 결론지었지만; 시험 항원은 미지의 타입의 단일 OspC 변이체로 이루어졌으므로, C-말단의 보다 널리 알려진 인식은 상기 도메인의 보다 큰 보존 때문일 수 있고, 반드시 C-말단이 면역우성임을 나타내지는 않는다. 길모어 (Gilmore) 등은 비-변성된 r-OspC를 사용한 마우스의 면역화는 상동성 단리물을 사용한 시험접종에 대한 보호를 부여하였지만 변성된 r-OspC에서는 그렇지 않았음을 입증하였고 ([Gilmore et al., 1996]; [Gilmore and Mbow, 1999]), 이것은 보호 에피토프가 입체형태적으로 규정될 수 있음을 나타낸다. 별개의 분석에서, 길모어 등은 수동 면역을 부여하는 항-OspC 모노클로날 항체와 단일 OspC 타입 (타입 A)로부터 유래된 제한된 수의 OspC 말단절단의 면역반응성을 분석하였다 [Gilmore and Mbow, 1999]. N- 또는 C-말단의 결실은 mAb에 의한 r-단백질의 검출을 제거하였고, 이것은 입체형태적 또는 불연속 에피토프의 존재를 추가로 제안한다. mAb에 의해 인식되는 에피토프가 천연 감염 동안 면역우성, 관련성이거나 상이한 OspC 타입 사이에서 보존되는지 명백하지 않다. 타입 A OspC의 선형 면역우성 에피토프는 최근에 매핑되었고, 루프 5 및 알파 나선 5 영역 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다 [실시예 1]. 타입 A 루프 5 에피토프를 함유하는 r-단백질은 마우스에서 살균성 항체를 유도하였고, 이것은 개별 타입-특이적 에피토프가 백신 개발에 활용될 수 있는 가능성을 증가시킨다 [실시예 2 참조]. 상기 보고서에서, 초기 감염 동안 제시되는 OspC 타입 B, K, 및 D의 에피토프를 매핑하고, 이들 에피토프를 기초로 한 4가 키메라 백시노겐을 구축하였다. 상기 ABKD 키메라 백시노겐은 마우스에서 고도로 면역원성이고, 세포 표면에서 OspC에 결합하고 타입 A, B, K, 및 D OspC를 생산하는 균주를 보체-의존 방식으로 효과적으로 사멸시키는 항체를 유도하였다.
4가 키메라 시험 백시노겐을 개발하기 위한 본 발명자들의 노력에서 제1 단계는 마우스 및 인간에서 감염 동안 제시된 OspC 타입 B, K 및 D의 선형 에피토프를 확인하는 것이었다. 이들 분석은 본질적으로 타입 A OspC의 루프 5 및 알파 나선 5 에피토프를 확인한 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 광범한 패널의 타입 B, K 및 D OspC 말단절단 및 단편을 클론 단리물로 감염된 마우스로부터 및 적어도 부분적으로, 대응하는 OspC 타입을 발현하는 균주로 감염된 인간으로부터의 혈청을 사용하여 스크리닝하였다. 정확한 에피토프 매핑은 실험적으로 감염된 마우스로부터의 혈청을 사용하여 가능하지만; 자연 감염된 인간에서, 항체 반응은 보다 넓은 에피토프 어레이에 대한 것이었다. 이것은 놀랍지 않고, 아마도 초기 감염 동안 세균 세포 표면에서 정상적으로 제시되지 않는 OspC 에피토프에 대한 항체 반응의 팽창을 반영한다. 새로운 에피토프 (이 중 몇몇은 OspC의 보존된 도메인으로부터의 것일 수 있다 (예를 들어 알파 나선 1))는 세균 세포 사멸 및 막으로부터 OspC의 방출 시에 접근가능해질 수 있다. 이것은 에피토프 매핑에서 인간 혈청 샘플의 사용에 동반하는 경고를 예시하고; 즉, 감염의 정확한 지속기간은 일반적으로 알려져 있지 않고, 감염성 집단의 클론형성능은 불확실하다 ([Wang et al., 1999]; [Ruzic-Sabljic et al., 2006]; [Hofmeister et al., 1999]; [Guttman et al., 1996]; [Rijpkema et al., 1997]). 임의의 경우에, 인간 혈청 샘플의 분석으로부터, 알파 나선 5 영역 내의 에피토프가 OspC 타입 A, B, K 또는 D를 생산하는 균주에 의해 감염 동안 인식되는 것이 명백하다. 또한, 몇몇 상이한 OspC 타입 생산 균주 사이에서 알파 나선 5에 대한 반응의 일관성은 상기 OspC 도메인의 기능적 관련성을 나타낼 수 있다.
알파 나선 5 및 루프 5 영역 서열은 OspC 타입들 사이에서 가변적이지만, 이들 영역은 각각의 타입 내에서 고도로 보존된다 [실시예 1 참조]. 이것은 키메라 백신의 문맥에서, 광범위 보호를 실행하기 위해 단지 제한된 수의 OspC 에피토프가 요구될 것임을 제안한다. 광범위 보호성 백시노겐의 개발의 제1 단계로서, 타입 A 루프 5 에피토프 및 OspC 타입 B, K 및 D로부터의 알파 나선 5 에피토프를 시험 백시노겐의 개발에 사용하였다. 이들 에피토프를 함유하는 영역을 링커 서열을 코딩하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 이것은 키메라 구축물의 생성에서 PCR 중복부 연장의 사용을 허용하고, 짧은 비구조적 프로테아제-저항성 아미노산 서열을 갖는 에피토프들을 구분하기 위한 수단을 제공하였다 [Crasto and Feng, 2000]. 상기 연구에서 개발된 실험적 OspC-기반 4가 ABKD 키메라 백시노겐은 시험한 모든 마우스 (n=12)에서 일관된 높은 역가의 IgG 항체 반응을 유도하였다. 추가로, 백시노겐은 각각의 포함된 에피토프에 대한 항체를 유도하였다. 흥미롭게도, 에피토프-특이적 역가는 구축물 내의 에피토프 위치에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. N-말단 에피토프 (타입 A의 루프 5)로부터 C-말단 에피토프 (타입 D의 알파 나선 5)까지 역가가 점진적으로 감소하였다. C-말단 에피토프로의 역가 감소 현상은 스트렙토코커스 M-단백질 기반 키메라 백신의 초기 연구에서 또한 보고되었다 ([Dale et al., 1993]; [Dale et al., 1996]). 역가에 대한 위치-특이적 효과를 위한 기초는 명백하지 않지만, 생체내 분해 또는 C-말단의 구조의 변경 때문일 수 있다 [Dale et al., 1999].
보렐리아 감염에 대한 보호를 위해 필요한 Th 시토카인 반응 및 관련 면역글로불린 이소형 패턴은 완전히 해명되지 않았지만 ([Kraiczy et al., 2000]; [Widhe et al., 2004]; [Keane-Myers et al., 1995]; [Keane-Myers et al., 1996]; [Keane-Myers and Nickell, 1995]), 상기 패턴의 결정은 백시노겐 개발에서 중요한 단계이고, 백시노겐의 상이한 구축의 잠재적인 보호 능력에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 반응의 이소형 프로파일을 ELISA에 의해 결정하였고, 혼합형 Th1 및 Th2 시토카인 반응과 연관된 중쇄 Ig 이소형이 관찰되었다. 상기 연구에서 인지된 클래스 전환은 백시노겐 내로 포함되는 규정된 T-세포 에피토프의 부재 하에서도 적당한 T-세포 헬퍼 (help)를 시사한다. 뮤린 (H2Ak/H2Ek) 및 인간 (HLA-DRB1) 타입 II MHC의 하위세트에 대한 예측적 펩티드 결합 알고리즘을 사용하는 백시노겐 서열의 분석은 모든 이용가능한 대립유전자에 결합하는 것으로 예측된 백시노겐 내의 잠재적인 T-세포 에피토프를 밝혔다 ([Rammensee et al., 1999]; [Zhang et al., 2005]). 예측된 결합 펩티드 중 하나인 LANSVKELT는 구축물 내에서 3회 반복되고, 상기 반복은 Th 반응을 유도하는데 중요할 수 있다 ([Jiang et al., 1999]; [Ahlborg et al., 1998]; [Kjerrulf et al., 1997]; [Theisen et al., 2000]). 잠재적인 T-세포 에피토프의 분석은 철저하지 않았지만, 예측은 키메라 백시노겐이 마우스에서 T-림프구 헬퍼 세포를 유도할 수 있음을 나타내는 본 발명자들의 데이타를 지지한다. 또한, 이것은 상기 구축물이 아마도, 잡다한 T-세포 에피토프 서열을 포함할 필요 없이 인간에서 그렇게 할 것임을 시사한다. 상기 이소형 프로파일의 생성에서 프로인트 아주반트의 중요성은 알려져 있지 않지만, 반응 및 이소형 프로파일은 인간에서 사용하기 위해 적절한 명반 또는 다른 아주반트의 문맥에서 평가될 필요가 있을 것이다 ([ten Hagen et al., 1993]; [Lindblad, 2004]; [Petrovsky and Aguilar, 2004]; [Brewer et al., 1999]; [McNeela and Mills, 2001]). 추가로, 키메라 백시노겐의 에피토프 순서 또는 구조의 변경은 생체내 보호를 최대화하기 위해 면역 반응이 맞추어질 수 있는 메카니즘을 제공할 수 있다 ([Tongren et al., 2005]; [Cai et al., 2004]).
백신 개발의 면에서 생산적인 백시노겐에 대한 반응을 위해, 유도된 항체는 무손상 비. 부르그도르페리 세포의 표면에 결합하고 세균 사멸을 일으킬 수 있어야 한다. IFA 분석으로 OspC 타입 A, B, K 및 D를 생산하는 균주의 세포 표면의 강한 표지를 밝혔다. 타입 D 에피토프에 대한 항체 역가가 보다 많은 N-말단 에피토프에 대해 유도된 것보다 유의하게 더 낮은 역가이기는 하지만, 타입 D 생산 균주의 표면 표지는 쉽게 명백하였다. 각각의 OspC 타입 배양액 내의 세포의 하위세트는 항-ABKD 항혈청으로 표지되지 않는 것으로 관찰되었고, 이것은 이들 세포가 OspC를 발현하지 않음을 시사한다. 그러나, 생체 내에서, 모두는 아니지만 대부분의 세포가 진드기로부터 포유동물로의 전염 동안 및 조기 포유동물 감염 동안 OspC를 발현하는 것으로 입증되었다 ([Gilmore et al., 2001]; [Zhong et al., 1997]). 세포 사멸을 일으키는 항-ABKD 항체의 능력을 또한 평가하였다. 백신접종된 마우스로부터의 혈청은 타입 A, B, K 및 D OspC 단백질을 발현하는 스피로헤테스를 보체 의존 방식으로 효과적으로 사멸시켰다. 모든 OspC 타입에 대해 사멸은 100% 미만이었지만, 이것은 아마도 생체 내에서 잘 문서화되어 있는 현상인 집단의 세포들 사이에서 시험관내 OspC 발현의 불균일성의 함수이다 ([Schwan et al., 1995]; [Schwan and Piesman, 2000]; [Hu et al., 1996]).
본 실시예는 신규한 r-키메라 다가 OspC-기반 라임병 백시노겐의 구축 및 원리 증명 (proof of principle)을 설명한다. 에피토프-기반 r-키메라 단백질의 사용은 동일한 구축물 내에 다수의 OspC 타입의 포함을 허용하고, 비관련 단백질 도메인에 대해 잘못 지시된 면역 반응의 잠재적인 문제를 회피한다. 활성 감염 동안 인식된 선형 에피토프의 매핑은 키메라 백신 개발의 중대 성분이고, 이것은 인간에서 침습성 감염과 연관된 4가지 OspC 타입에 대해 성공적으로 완료되었다. 백시노겐 내에 포함된 에피토프는 보렐리아 세포 표면에서 OspC에 결합할 수 있고 보체-매개 세균 사멸을 일으킬 수 있는 타입-특이적 IgG 항체를 유도하였다.
실시예 4. 면역원성을 개선하도록 의도된 키메라 다가 라임병 백신의 변이체에 대한 면역 반응
본 연구에서, 본 발명자들은 구축물의 용해도를 개선하고, 면역 반응에 대한 에피토프 배치, 에피토프 반복, 및 추정 C-말단 안정화화 태그의 포함의 잠재적인 영향을 평가하고자 하였다. 이들 분석은 광범위 보호성 OspC 백신을 위한, 및 일반적인 키메라 백신의 구축을 위한 설계 전략에 대한 새로운 통찰력을 제공한다.
재료 및 방법
재조합 OspC 의 발현 및 정제
타입 A, B, K 및 D의 재조합 전장 OspC 단백질을 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다 [실시예 1 및 2 참조]. 간단히 설명하면, 비. 부르그도르페리 단리물 B31MI (타입 A OspC), LDP73 (타입 B), LDP74 (타입 K), 및 LDP116 (타입 D)의 클론 집단으로부터의 ospC 유전자를 pET-32 Ek/LIC 벡터 (노바겐)에서 리가제-비의존성 클로닝 (LIC)을 허용하기 위해 5' 오버행을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다 [실시예 1]. 단일 가닥 테일의 증폭 및 재생 후에, 앰플리콘을 pET-32 Ek/LIC 벡터와 어닐링하고, 이를 노바블루 (DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시키고 증식시켰다. DNA 서열결정에 의해 삽입체 서열을 확인한 후에 (MWG-바이오테크), IPTG (1 mM)을 사용하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질은 pET-32 Ek/LIC 발현 태그-코딩 헥사히스티딘 모티프 (노바겐)을 사용하는 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이미다졸-용리된 단백질을 10 kDa 분자량 컷오프 막 (Slid-a-lyzer, 피어스)을 가로질러 포스페이트 완충 염수 (PBS; pH 7.4)에 대해 강하게 투석하고, 단백질 농도를 BCA 검정 (피어스)에 의해 정량하고, 제제의 순도를 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
ABKD 백신 변이체의 구축, 발현, 및 정제
백신 구축물을 가로질러 특이적 에피토프에 대한 감소하는 IgG 역가의 잠재적인 메카니즘 및 그에 대한 해결책을 조사하기 위해, 본래의 백신의 다수의 변이체를 구축하였다. 모든 백신 변이체는 이전에 설명된 ABKD 백시노겐의 서열에 기초하였고 [실시예 3], 동일한 에피토프-함유 서열을 함유한다. 이들은 타입 A의 루프 5 영역 (아미노산 (aa) 131 내지 149) 및 타입 B (aa 160-201), K (aa 161-201), 및 D (aa 161-201)의 알파 나선 5 영역을 함유하였다 (도 13 삽화). ABKDppa 및 ABKDgg는 본래의 ABKD 구축물의 C-말단에 각각 Pro-Pro-Ala 또는 Gly-Gly 모티프를 첨가하였다. 이들 구축물은 둘 모두 적절한 아미노산을 코딩하는 5' 오버행을 통해 모티프를 첨가한 역방향 프라이머 (표 5)를 사용하여 본래의 ABKD 구축물을 증폭함으로써 제조하였다 (도 13a). 다른 백신 변이체는 본래의 ABKD 백시노겐의 구축에서 사용된 것과 유사한 중복 어닐링 및 연장 기술에 의해 제조하였다 [실시예 3]. ABKDD 구축물은 비구조적, 프로테아제-저항성 링커를 코딩하는 3' 테일 서열을 보유하는 역방향 프라이머를 사용하여 ABKD 구축물을 재증폭함으로써 제조하였다. 이것은 PCR 생성물이 5' 단부에서 상보성 링커-코딩 서열을 사용하여 증폭된 타입 D OspC 에피토프-함유 서열에 어닐링되도록 허용하였고, 여기서 후속적인 어닐링된 구축물의 중복 연장 및 증폭을 수행하였다 (도 13b). ADBK 구축물은 따로 증폭된 타입 A 및 D 에피토프-함유 영역을 서로, 및 후속적으로 본래의 ABKD 구축물로부터 증폭된 타입 B 및 K 나선 5 에피토프 영역과 어닐링함으로써 제조하였다 (도 13c). ADBKD 구축물은 ABKD 및 ADBK 서열로부터의 앰플리콘을 어닐링함으로써 제조하였다 (도 13d). 모든 경우에, PCR 증폭은 초기의 2 min 94℃ 변성 단계, 이어서 94℃에서 15 sec의 변성, 50℃에서 30 sec의 프라이머 어닐링, 및 72℃에서 60 sec의 연장의 35회 사이클을 이용하고, 7 min 동안 최종 72℃ 연장하는 GoTaq Green (프로메가)를 사용하여 완료하였다. 이들 백시노겐의 구축에 사용된 모든 프라이머를 표 5에 나열한다. 후속적인 PCR 반응에서 주형으로서 사용하기 전에 모든 PCR 생성물을 겔 정제하였다 (퀴아겐). 최종 앰플리콘을 리가제 비의존성 클로닝에 의해 pET-46 Ek/LIC 벡터에 어닐링시키고, 노바블루 (DE3) 이. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 콜로니를 T7 프라이머를 사용하여 삽입체에 대해 스크리닝하고, DNA 서열결정에 의한 삽입체의 확인을 위해 플라스미드를 회수하였다 (키아필터 미디, 퀴아겐). 재조합 단백질을 상기 설명된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 정제 후에, 백신 단백질을 PBS (pH 7.4), 또는 100 mM 포스페이트, 100 mM NaCl, 50 mM 아르기닌, 50 mM 글루탐산을 함유하는 pH 8 완충제 (Arg/Glu 완충제)의 3개의 변화에 대한 10 kDa 분자량 컷오프 (cutoff) 막 (Slide-a-Lyzer, 피어스)을 가로질러 투석시켰다 [Golovanov et al., 2004]. 구축물의 순도는 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
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백신 변이체를 사용한 마우스의 면역화
6주령 수컷 C3H/HeJ 마우스를 각각의 6개의 백시노겐 변이체로 면역화시켰다 (구축물당 3마리 마우스). 변이체의 면역원성을 서로 비교해야 하므로, 백시노겐 질량 단위당 에피토프의 수에서 차이를 보상하기 위해 단백질을 몰 기초로 투여하는 것이 바람직하다. 각각의 마우스에게 면역화당 대략 2.8 나노몰의 단백질을 투여하였고, 이것은 50 ㎍의 구축물 ABKD, ABKDppa, ABKDgg, 및 ADBK, 또는 62.5 ㎍의 구축물 ABKDD 및 ADBKD이다. 마우스를 완전 프로인트 아주반트 내의 백신으로 면역화시킨 후, 제2 및 4주에 프로인트 불완전 아주반트로 추가접종하였다. 제1 면역화 전에 및 제6주에 꼬리를 칼로 베어 모든 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 총 및 에피토프-특이적 항체 역가에 대한, 및 이소형 프로파일에 대한 아주반트의 효과를 결정하기 위해, 마우스 (6마리/아주반트)를 상기 설명된 바와 같이 프로인트 아주반트 내에 유화시킨 또는 명반 (임젝트 알룸 (Imject Alum), 피어스)에 흡착시킨 ABKD 백시노겐으로 면역화시키고, 제6주에 꼬리를 칼로 베어 혈청을 수집하였다.
백신 변이체에 의해 유도된 에피토프 -특이적 IgG 역가의 평가
각각의 백시노겐의 면역원성을 면역블롯 및 ELISA 둘 모두에 의해 평가하였다. 웨스턴 블롯에 대해, 타입 A, B, K, D의 r-OspC를 환원성 샘플 완충제 내에서 레인당 500 ng으로 부가하고, 12.5% SDS-PAGE 겔 (크라이테리온, 바이오라드)에서 전기영동시키고, PVDF (임모빌론 (Immobilon)-P, 밀리포어)로 전기블로팅하였다. 블롯을 0.2% 트윈-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS-T) 중 1% BSA로 차단하였다. 블롯을 PBS-T 내의 각각의 항혈청의 1:2500 희석액으로 1시간 동안 프로빙한 후 3회 세척하였다. 동일한 단백질 로딩을 확인하기 위해, 1개의 블롯을 항-His 태그 모노클로날 Ab (1:2000; 노바겐)를 사용하여 스크리닝하였다. 2차 검출은 퍼옥시다제-접합된 염소-α-마우스 IgG의 1:40000 희석 및 화학발광 (수퍼 시그날 피코 (Super Signal Pico), 피어스)에 의해 이루어졌다. 정량 분석을 위해, OspC 타입-특이적 IgG 역가를 ELISA 분석에 의해 결정하였다. 타입 A, B, K, 또는 D의 r-OspC를 96 웰 플레이트 (코스타 3590; 코닝) 상에 100 ng/웰로 16 hr 동안 4℃에서 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내에서 코팅하였다. 플레이트를 차단하고 (0.2% 트윈-20을 함유하는 PBS (PBS-T) 내의 1% BSA; 2 hr), PBS-T로 3회 세척하고, 연속 희석된 항-백시노겐 항혈청 (100 ㎕)을 이중 플레이트의 웰에 첨가하였다 (1 hr). HRP-접합된 염소-α-마우스 IgG (1:20000)는 2차 항체로서, ABTS는 발색 기질로서 기능하였다. 반응 속도가 선형인 동안 ELISA 플레이트 판독기 (ELx 808; 바이오테크)에서 405 nm에서 흡광도를 판독하고, 역가는 4개 파라미터 로지스틱 식 (시그마플롯)에 의해 에스자형 곡선을 흡수 곡선에 피팅함으로써 계산하였다. 역가는 최대 흡수 고원의 50%에 대응하는 희석배수의 역수로서 보고한다.
에피토프 -특이적 면역글로불린 이소형 프로파일의 결정
ABKD, ABKDD, 및 ADBKD 백신 변이체 구축물에 대한 항체 반응의 이소형 프로파일을 ELISA에 의해 평가하였다. 96 웰 플레이트를 타입 A, B, K, 및 D의 r-OspC 100 ng/웰로 코팅하였다. 플레이트를 상기 설명된 바와 같이 차단하고 세척하였다. 항-백시노겐 항혈청을 플레이트에 첨가하고 이중으로 분석하였다 (100 ㎕; 1:10000; 1 hr). 결합된 에피토프-특이적 Ig는 이소형 특이적 비오티닐화 2차 항체 (1 hr; 마우스 이소형 결정 키트; 자이메드)와 함께 인큐베이팅함으로써 검출하였다. 2차 항체는 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘 (30 min) 및 발색 기질, 즉, ABTS에 의해 검출하였다. 모든 인큐베이션은 실온에서 완료하였다.
백신-특이적 T-림프구에 의한 IFN -γ 및 IL -4 생산의 결정
면역화시킨 마우스로부터의 비장세포의 시토카인 반응은 문헌 [Abuodeh et al., 1999]의 방법을 변형시켜 백시노겐을 사용한 시험관내 재자극에 의해 평가하였다. 백신접종된 마우스를 CO2 혼수에 의해 안락사시키고, 비장을 무균 제거하고 RPMI 배지 (시그마)에 넣었다. 각각의 백신 구축물로 면역화시킨 3마리의 마우스로부터의 비장을 모으고, 22 게이지 바늘을 이용하여 비장낭 내로 RPMI의 반복 주사에 의해 세포를 수거하였다. 세포 현탁액을 50 mL 원심분리관에 옮기고, 세포를 200 x g에서 5분 동안 수거하였다. 3 mL의 8.3 mg/mL 염화암모늄 (R-7757, 시그마)에 1분 동안 노출시켜 적혈구를 용해시켰다. 이어서, 염화암모늄을 20 mL의 RPMI (시그마)로 희석하고, 세포를 원심분리하고 3회 세척하였다. 세포를 10% FCS, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린, 2.5 ㎍/mL 암포테리신 B를 함유하는 10 mL RPMI 내에 재현탁하였다. 세포를 생존력을 평가하기 위해 트립판 블루로 염색하고, 혈구계로 계수하고, 모든 세포 현탁액을 107 세포/mL로 조정하였다. 세포를 24 웰 플레이트 (코스타 3526)로 웰 당 107 세포로 분취하였다 (백시노겐 타입당 12개의 웰). 삼중의 웰을 면역화 백시노겐으로 5 또는 10 ㎍/mL에서 자극하였다. 대조군은 비관련 단백질, 소 혈청 알부민 10 ㎍/mL로 자극한 삼중 웰, 및 자극하지 않은 웰 (단백질 없음)을 포함하였다. 모든 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 96시간 동안 인큐베이팅한 후, 상청액을 수거하고 시토카인의 ELISA 정량까지 -80℃에서 동결시켰다.
Th1/Th2 시토카인 IFN-γ 및 IL-4의 수준을 정량하기 위해, ELISA-기반 검정 (ELISA-Max; 바이오레전드 (Biolegend))을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 간단히 설명하면, 포획 항체를 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 플레이트를 차단하고, 100 uL의 각각의 배양 상청액을 이중으로 플레이트 내에서 2 hr 동안 인큐베이팅하였다. IL-4 검출을 위해 희석시키지 않은 배양 상청액을 사용한 반면, IFN-γ에 대해 희석시키지 않은 및 PBS 내에 1:20 희석한 상청액을 시험하였다. 공지의 농도의 각각의 시토카인을 함유하는 샘플을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 결합된 시토카인의 검출은 비오티닐화 2차 항체에 이어 HRP-접합된 스트렙타비딘에 의해, 및 TMB 기질을 사용한 비색 검출에 의해 이루어졌다.
결과
변이체 백신 구축물의 구축, 발현 및 정제
5' 오버행을 갖는 프라이머 및 중복 어닐링 및 연장 PCR 기술을 이용하여, 본래의 ABKD 백신의 5가지 변이체를 생산하였다 (도 13). 모든 구축물의 DNA 서열이 확인되었다. 백시노겐의 물리화학적 특성 선택을 표 6에 제시한다 [Gasteiger et al., 2005]. 니켈 크로마토그래피에 의한 재조합 백시노겐의 정제 후에, 유의한 비율의 r-단백질이 PBS에 대한 투석 동안 침전한 것으로 인지되었다. 이것은 ABKD 백시노겐의 초기 보고서에서 또한 인지되었다 [실시예 3]. 보다 고분자량 구축물인 ABKDD 및 ADBKD는 PBS 내의 보다 높은 용해도를 갖지만, r-단백질 침전은 여전히 유의하였다. 이러한 이유 때문에, 문헌 [Golovanov et al., 2004]의 작업에 기초하여 변형된 투석 완충제 (Arg/Glu 완충제)를 개발하였다. 완충제 pH 및 r-단백질의 pI (pI 6.49 또는 6.85) 사이의 차이를 증가시키기 위해, 완충제의 pH를 PBS의 pH (pH 7.4)에서 pH 8.0으로 증가시켰다. 또한, 염 농도를 150 mM에서 100 mM로 감소시키고, 50 mM 아르기닌 및 50 mM 글루탐산을 첨가하였다. 상기 완충제를 사용하여, 임의의 r-단백질의 침전이 인지되지 않았고, 가용성 단백질의 농도가 뚜렷이 증가하였다. SDS-PAGE에 의해 가시화할 때, r-단백질은 순수하고 분해 생성물이 없었다 (도 14).
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백신 변이체의 면역원성
ABKD 백신 변이체의 상대적 면역원성을 평가하기 위해, 마우스를 프로인트 아주반트 내의 각각의 변이체로 면역화시켰다. 혈청의 에피토프-특이적 반응성은 웨스턴 블롯에 의해 평가하였고, 여기서 혈청을 사용하여 각각의 4가지 타입의 PVDF-고정된 r-OspC를 프로빙하였다. 단백질은 태그-특이적 마우스-a-His 태그 모노클로날 항체와의 반응성에 의해 평가할 때 블롯 상에 동등하게 부가된 것으로 확인되었다. 면역화시킨 마우스로부터의 혈청은 각각의 r-OspC 단백질과의 반응성의 수준에서 백시노겐-의존성 차이를 나타냈다 (도 15a). 특히, ABKDppa 및 ABKDgg 변이체로 백신접종된 마우스에서 타입 D 나선 5 에피토프와의 반응성이 감소하였고, ADBK 변이체에서 가장 현저하게 감소하였다. 이들 변이를 정량적 방식으로 평가하기 위해, 구축물 내에 포함된 각각의 OspC 타입-특이적 에피토프와의 IgG 반응성의 적정을 ELISA에 의해, 다시 고정된 항원으로서 각각의 4가지 타입의 전장 r-OspC를 사용함으로써 달성하였다. 역가는 주로 정성적 웨스턴 블롯 결과를 모방하고, 이것은 개별 에피토프에 대한 면역 혈청의 반응성에서 백신-특이적 차이를 입증한다 (도 15b). 타입 D 에피토프와의 반응성에서 가장 뚜렷한 차이가 보였고, 여기서 ABKDppa, ABKDgg 및 ADBK 변이체에 대해 특히 낮은 역가가 보였다.
백신 변이체 -특이적 면역글로불린의 이소형 프로파일
변이체 백시노겐에 의해 유도된 면역 반응을 보다 더 상세히 이해하기 위해, 에피토프-특이적 면역글로불린 이소형 프로파일을 에피토프-특이적 역가에 의해 결정할 때 최상의 백신 가능성을 갖는 3가지 변이체 (ABKD, ABKDD, ADBKD)에 대해 완료하였다. 일반적으로, 항원-특이적 면역글로불린 내에 IgG1의 우세, 보다 소량의 IgG2a 및 IgG2b, 및 매우 적은 IgG3 또는 IgM이 존재하였고, 상기 패턴은 이전에 인지되었다 [실시예 3] (도 16). 모든 에피토프 및 모든 백신 변이체에 대해, Ig 이소형의 패턴은 하나를 제외하고는 유사하였다. ABKD 또는 ADBKD 변이체로 면역화시킨 마우스보다 ABKDD로 면역화시킨 마우스에서 더 큰 반응성의 타입 K 및 D 에피토프-특이적 IgG2a 및 IgG2b가 존재하였다.
백신-특이적 T-림프구에 의한 Th1 / Th2 시토카인 생산
시토카인 환경 및 ABKD 백시노겐 내의 변이에 의해 유도된 Th1/Th2 균형의 잠재적인 영향을 평가하기 위해, 마우스 비장세포를 시험관 내에서 마우스를 면역화시킨 백시노겐으로 재자극하였다. 상이하게 면역화시킨 마우스들 사이에서 IFN-γ의 유도된 수준에서 뚜렷한 차이가 인지되었다. 모든 백신 변이체는 배양 상청액 내의 증가된 수준의 IFN-γ와 연관되었지만, ADBK 및 ADBKD는 다른 백시노겐에 의해 유도된 것보다 2 내지 3배 더 높은 수준을 가졌다 (도 17). 모든 경우에, 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL 농도의 항원이 0.5 내지 8.6 ng/mL의 수준으로 IFN-γ를 유도하였다. 자극하지 않은 비장세포로부터 또는 소 혈청 알부민으로 자극한 비장세포로부터 세포 배양 상청액은 모두 검정의 검출 한계 15.6 pg/mL 미만인 IFN-γ 수준을 가졌다. 백신-자극된 또는 대조군 배양 상청액에서 IL-4는 검출되지 않았고, 이것은 농도가 검정의 검출 한계 2.0 pg/mL 미만임을 나타낸다.
항체 역가 및 이소형 프로파일에 대한 아주반트 종류의 효과
백시노겐에 대한 반응에 대한 아주반트 종류의 효과를 결정하기 위해, 마우스를 프로인트 아주반트 내에 유화시킨 또는 명반에 흡착시킨 ABKD 단백질로 면역화시켰다. 전체 백시노겐에 대한 및 각각의 성분 에피토프에 대한 IgG 역가는 명반 아주반트로 면역화시킨 마우스에서 약간 더 낮지만, 일반적인 반응 패턴은 2개의 아주반트 사이에 유사하였다 (도 18a). 유사한 수준의 IgG1에도 불구하고, 명반으로 면역화시킨 마우스는 감소된 백시노겐-특이적 IgG3, IgG2a, 및 IgG2b를 가졌다 (도 18b). 에피토프-특이적 이소형 프로파일은 전체 백시노겐을 사용하여 보이는 프로파일과 매우 유사하였다 (데이타를 제시하지 않음).
논의
다수의 B-세포 에피토프를 함유하는 키메라 단백질의 사용은 백신 개발에서 전체-단백질 다가 백시노겐 및 펩티드 접합체에 비해 잠재적인 잇점을 가진다. 보호성 에피토프 서열만을 포함하는 것은 모 분자 내에서 또는 펩티드 담체 상에서 비관련 에피토프에 대한 반응의 잘못된 지시에 대한 가능성을 감소시킨다. 이것은 OspC에서와 같이, 재조합 백시노겐 내에서 면역우성이지만 감염 동안 세균에 의해 제시되지 않는 큰 보존된 도메인이 존재하면 중요하다 (실시예 1; [Kumaran et al., 2001]; [Eicken et al., 2001]). 그러한 에피토프는 보호 면역 반응의 생성에 비관련된다. 그러나, 신규한 단백질의 생성에서는 에피토프를 막거나 단백질 안정성 및 용해도에 영향을 미칠 수 있는 분자간 및 분자내 상호작용을 고려해야 한다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 OspC에 기초한 재조합체 다가 키메라 라임병 백시노겐의 조사를 연장하였다. 본래의 ABKD 백신은 마우스에서 고도로 면역원성이고, 유도된 IgG는 세균 세포 표면에서 천연 OspC에 결합하고 보체-의존성 사멸을 유도하였다 [실시예 3]. 상기 성공에도 불구하고, ABKD 구축물은 개선을 요구하는 2가지 인자를 가졌다 (즉, r-단백질의 생산을 저해하고 저장 안정성에 영향을 미칠 수 있는 PBS 내의 그의 불량한 용해도, 및 단백질 내의 개별 에피토프에 대한 IgG 역가의 차이). 구체적으로, 역가는 백신 C-말단에 대한 에피토프의 근접성에 관련하여 감소하였다. 본 연구의 목표는 백시노겐 용해도를 개선하기 위한 것, 및 총 및 에피토프-특이적 면역 반응을 개선하기 위해 에피토프 배치, 에피토프 반복 및 안정화 모티프의 포함이 상이한 변형된 백시노겐을 사용하기 위한 것이었다.
앞선 연구에서, PBS에 대한 투석 후에 재조합 백시노겐의 유의한 침전이 있음이 인지되었다 [실시예 3]. 상기 불량한 용해도는 단지 백시노겐 생산을 제한할 뿐만 아니라, 또한 백신 면역원성에 영향을 줄 수 있다. PBS에 대한 투석 후 달성된 ABKD 구축물의 최대 농도는 0.5 mg/mL이고, 종종 훨씬 더 적었다. OspC 결정 구조는 나선 5 에피토프 영역이 천연 OspC 단백질 내에서 인트라단량체성 4-나선 다발에 참여함을 제안한다 ([Kumaran et al., 2001]; [Eicken et al., 2001]). 이것은 백시노겐 단백질 내에서 및 사이에서 노출된 소수성 나선 면들 사이의 상호작용을 일으키고, 이는 다시 침전을 일으킨다. 투석 완충제에 Arg 및 Glu를 첨가하면 모든 재조합 백시노겐 단백질의 용해도를 4 내지 100배 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (표 7). 상기 증가된 용해도에 대한 기초는 Arg 및 Glu와 반대 전하의 노출된 잔기와의, 및 Arg 및 Glu 측쇄의 지방족 부분과 상호작용에 의한 소수성 잔기와의 상호작용일 수 있다 [Golovanov et al., 2004]. Arg/Glu 완충제 내에 투석시킨 ABKD 구축물로 면역화시킨 마우스는 PBS에 대해 투석시킨 ABKD 백시노겐으로 면역화시킨 것보다 현저하게 더 높은 역가를 가졌다 [실시예 3]. Arg/Glu 완충제는 보다 유익한 폴딩 패턴 또는 보다 적은 분자간 또는 분자내 상호작용을 유발할 수 있어서, B-세포 수용체에 대한 에피토프의 보다 우수한 접근을 제공한다. r-단백질에 Arg 또는 Glu을 흡착시키면 에피토프 인식을 명백하게 저해하지 않았다. Arg/Glu 완충제는 시험관 내에서 프로테아제의 활성에 대해 보호하는 것으로 보고되었다 [Golovanov et al., 2004]. PBS- 또는 Arg/Glu-투석된 샘플 내에서 명백한 단백분해적 분해가 존재하지 않지만, 단백분해적 절단에 대한 생체내 보호는 배제될 수 없다. Arg 및 Glu를 함유하는 완충제에 대한 투석은 유의한 분자간 상호작용을 갖는 다른 신규한 키메라 단백질에 적용될 수 있는 유용한 도구일 수 있다.
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불량한 면역 반응과 C-말단 에피토프 위치와의 연관성은 잠재적으로 C-말단과 연관된 구조적 문재 또는 카르복시펩티다제에 의한 단백분해적 분해 때문에, 키메라 스트렙토코커스 M-단백질 백시노겐에서 이전에 보고되었다 ([Dale et al., 1993]; [Dale et al., 1996]; [Dale et al., 1999]). C-말단의 아미드화 또는 PEG화, 아미노 (N)-말단의 아세틸화, 및 보호 아미노산 모티프의 부가를 포함하여, 프로테아제 활성으로부터 펩티드 및 재조합 단백질의 보호를 위한 수많은 방법이 제안되었다 ([Brickerhoff et al., 1999]; [Powell et al., 1992]; [Lee et al., 2005]; [Alvarez et al., 2004]; [Kawarasaki et al., 2003]; [Walker et al., 2003]). 아미노산 모티프는 카르복시펩티다제의 작용을 억제함으로써 단백질의 C-말단을 안정화하는 것으로 또한 보고되었지만; 보호하는 그들의 능력은 단지 소수의 단백질에서만 평가되었다. 2개의 안정화 모티프를 ABKD 백시노겐에 대한 항체 반응을 향상시키는 그들의 능력에 대해 평가하였다. 2개의 중성, 친수성 Gly 잔기의 부가는 각각 소수성 및 염기성 C-말단 아미노산에 대한 특이성을 갖는 카르복시펩티다제 C 및 D의 활성을 감소시킬 수 있다 ([Alvarez et al., 2004]; [Kawarasaki et al., 2003]; [Remington and bredam, 1994]). Pro-Pro-Ala 모티프의 부가는 병치된 부피가 큰 프롤린 잔기를 통해 카르복시펩티다제 진행을 입체적으로 방해할 수 있다 [Walker et al., 2003].
ABKD 키메라 백시노겐에 대한 항체 반응에 대한 이들 모티프의 부가의 영향을 평가하기 위해, 마우스를 ABKDgg 또는 ABKDppa 구축물로 면역화시켰다. 두 경우에 모두, 혈청은 비변형된 ABKD 구축물로 면역화시킨 것에 비해 보다 많은 에피토프 중 하나에 대해 더 낮은 평균 IgG 역가를 가졌다. ABKDppa 구축물에서는 타입 D 특이적 IgG의 역가가 감소하였지만, 이것은 주로 단일 가외치 (outlier) 때문이기는 하다. ABKDgg 구축물은 타입 K 및 D 에피토프에 대해 감소된 역가를 가졌다. IgG 역가에 기초하여, 이들 모티프 중 어느 하나의 사용에 대한 잇점은 없었다. C-말단 에피토프에 대한 역가의 감소는 이들 모티프가 내성을 부여할 카르복시펩티다제의 작용에 의해 매개되는 것으로 보이지 않지만, 프로테아제 보호로 인한 임의의 잇점이 Arg/Glu 완충제에 의해 제공된 유사한 보호에 의해 차폐될 수 있는 것이 가능하기는 하다 [Golovanov et al., 2004].
C-말단 에피토프에 대한 불량한 면역 반응에 관여된 가능한 구조적 인자를 조사하기 위해, 몇몇 추가의 구축물을 생성하였다. 키메라 스트렙토코커스 백신에서, C-말단에서 N-말단 에피토프를 반복시키면 미지의 메카니즘에 의해 전자의 C-말단 에피토프를 '보호하였다' ([Dale et al., 1999]; [Dale et al., 2005]; [Hu et al., 2002]; [McNeil et al., 2005]). 상기 성공에 기초하여, ABKD 백시노겐의 유사한 변이체를 개발하였다. 타입 D 에피토프에 대한 반응이 제2 C-말단 타입 D 에피토프에 의해 보호될 수 있는지 평가하기 위해, ABKDD 구축물을 생성하였다. 감소된 역가가 주로 C-말단 에피토프 위치 때문인지 평가하기 위해, 타입 D 에피토프를 제2-최 N-말단 위치로 이동시켰다 (ADBK). 마지막으로, ADBKD 구축물을 사용하여 반복된 C-말단 에피토프에 의한 보호, 및 ABKDD와 함께, 특이적 면역 반응에 대한 반복된 에피토프의 효과를 평가하였다. ABKDD 백시노겐 내의 에피토프 반복은 타입 D-특이적 IgG 역가를 2배로 하였지만, 동시에 인접한 타입 K 에피토프에 대한 역가의 감소를 유발하였다. 타입 D 에피토프가 ADBK 구축물 내에서 보다 N-말단 위치에 놓일 때, 타입-D 특이적 IgG 역가는 유의하게 감소하였다. 또한, ADBK 구축물 내에서 C-말단 타입 K 에피토프에 대한 반응성은 ABKD에 비해 개선되었다. C-말단 타입 D 에피토프를 부가하면 (ADBKD), 타입 K-특이적 역가를 개선하지 않았지만; 타입 D 에피토프에 대한 2배는 아니지만 유의하게 개선된 역가를 생성시켰다. 이들 결과는 타입 D 에피토프의 C-말단 위치는 내부 위치가 바람직하고, 추가의 '보호성' C-말단 에피토프에 의한 C-말단 에피토프의 명백한 보호가 존재하지 않음을 나타낸다. 상기 백시노겐 내에서 에피토프-특이적 역가의 1차 결정자는 C-말단에 대한 그의 근접성이 아니라, 대신에 아마도 키메라 단백질의 3차 구조이다.
백시노겐-유도된 Ig 이소형은 생체내 보호 효능에 대한 중대함을 가질 수 있다. 에피토프 또는 그들의 순서를 변경함으로써, 이소형 프로파일 [Tongren et al., 2005], 및 따라서 항체 이펙터 기능을 변경하는 것이 가능할 수 있다. 에피토프-특이적 이소형 프로파일을 측정하기 위해, 가장 유망한 백시노겐 (ABKD, ABKDD, ADBKD)에 대한 항혈청을 타입 A, B, K 또는 D의 고정된 rOspC에 결합시키고, 결합된 항체를 이소형-특이적 항혈청을 사용하여 검출하였다. ABKD 백시노겐에 대해 앞서 보고된 바와 같이 [실시예 3], 지배적인 이소형은 IgG1이고, 여기서 구축물에 의존적으로 다소 보다 낮은 수준의 IgG2a 및 IgG2b, 및 낮은 수준의 IgM 및 IgG3을 가진다. 에피토프 특이적 Ig 이소형 프로파일은 ABKD 및 ADBKD 항혈청 사이에 유사하였고, 여기서 총 IgG 역가를 모방하는, N-으로부터 C-말단 에피토프까지 IgG2a 및 IgG2b 수준이 감소한다. ABKDD는 보다 낮은 타입 K-특이적 총 IgG 역가에도 불구하고 모든 에피토프를 가로질러 일관된 수준의 IgG2a 및 IgG2b를 가졌다.
ABKD 백시노겐은 보체-의존성 살균 항체를 유도한다 [실시예 3]. 마우스에서, IgG1은 보체를 활성화하지 않고 ([Dangl et al., 1988]; [Miletic and Frank, 1995]), 이것은 주요 유도된 이소형이 보호성이 아닐 수 있음을 나타낸다. OspA-특이적 IgG1은 보체-비의존성 메카니즘에 의해 보렐리아 살균성일 수 있음이 보고되었지만 [Munson et al., 2000], ABKD 백시노겐-유도된 항체에 의한 세균 사멸은 보체 의존적이다 [실시예 3]. 유도된 이소형 프로파일은 C3H/HeJ 마우스 (라임병 연구를 위한 표준 동물 모델)의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다. C3H/HeJ 및 BALB/c 동물주 마우스 사이의 체액성 면역 차이가 비. 부르그도르페리 감염 동안 특히 총 IgG의 수준에서 및 특히 IgG2a의 수준에서 (둘 모두 C3H/HeJ 마우스에서 더 높다) 인지되었다 ([Yang et al., 1992]; [Keane-Myers and Nickell, 1995]). 추가로, 보렐리아는 지질다당체를 만들지 않으므로 백신 접종에 의해 또는 감염 동안 라임병에 대한 보호를 위해 중대한 것으로 예상되지는 않지만, C3H/HeJ 마우스 동물주는 TLR-4가 결핍된다 ([Takayama et al., 1987]; [Barthold et al., 1990]).
체액성 보렐리아살균 활성은 보체-의존적인 것으로 일반적으로 인정되므로, Th1 시토카인 반응의 유도는 유익할 수 있고, 이것은 많은 세균 질환에 존재하기 때문이다 ([Spellberg and Edwards, 2001]에서 검토됨). 활성 감염 동안, Th 시토카인은 라임병 및 그의 후유증의 발병 및 해소에 시사되었다. 몇몇 연구에서는 IL-4가 보렐리아살균 항체 반응의 발생을 위해 중대한 시토카인이 아님을 발견하였고 ([Munson et al., 2000]; [Potter et al., 2000]; [Christie et al., 2000]; [Satoskar et al., 2000-64]), 이것은 Th1-타입 반응이 보호와 연관될 수 있음을 시사한다. 추가로, IFN-γ 분비 Th1 세포는 라임병과 연관된 심장염의 해소를 촉진한다 ([Bockenstedt et al., 2001]; [Kelleher et al., 1998]). 반대로, 관절염 중증도 및 피부 스피로헤테스 부하량 (load)은 r-IL-4의 투여에 의해 감소하고, 감염 동안 α-IL-4 항체의 투여에 의해 증가하였다 ([Keane-Myers and Nickell, 1995]; [Keane-Myers et al., 1996]). IFN-γ의 생산은 자연 감염 동안 만성 라임병의 발병 [Widhe et al., 2004], 및 라임 관절염에서 관절 종창의 정도 [Gross et al., 1998]와 연관되었다. IFN-γ는 또한 시험관내 림프절 배양물로부터 유도된 보렐리아살균 항-OspA 항체의 억제된 생산과 연관되었다 [Munson et al., 2002]. 백신 접종에 의해 유도된 Th 시토카인 환경을 조사하기 위해, 마우스 비장세포를 시험관 내에서 백시노겐으로 재자극하고, Th1 (IFN-γ) 및 Th2 (IL-4) 시토카인을 ELISA에 의해 정량하였다. IFN-γ은 구축물에 따라 상이한 농도이지만 백시노겐으로 재자극한 세포의 상청액 내에서 검출되었다. 이와 반대로, IL-4는 임의의 비장세포 상청액 내에서 검출되지 않았다. ABKD, ABKDppa, 및 ABKDD 구축물은 모두 유사한 농도의 IFN-γ를 가졌다. ADBKD는 대략 2배의 IFN-γ의 농도를 가졌고, ADBK는 훨씬 더 높은 수준을 가졌다. 재자극한 세포의 상청액 내의 IFN-γ의 수준 및 총 에피토프-특이적 혈청 IgG 역가 또는 이소형 프로파일 사이에 명백한 상관관계는 없었다.
시토카인 및 연관된 Ig 이소형 프로파일은 면역학적 아주반트의 선택에 의해 변경될 수 있다. 프로인트 완전 아주반트는 Th1 시토카인 반응과 연관되었고 [Cribbs et al., 2003; Shibaki and Katz, 2002], 이것은 IgG2a의 수준을 증가시킬 수 있다. 인간 사용을 위해 현재 승인받은 유일한 아주반트는 명반이고, 이것은 Th2 시토카인의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다 ([Cribbs et al., 2003]; [Brewer et al., 1999]; [Lindblad, 2004]; [Petrovsky and Aguilar, 2004]). 명반으로 면역화시킨 마우스에서, 프로인트 아주반트에 비해 백시노겐 및 그의 성분 에피토프에 대한 IgG 역가의 예상된 중등도 감소가 인지되었다. 추가로, IgG1에 비해 IgG3, IgG2a, 및 IgG2b 이소형이 비례적으로 보다 크게 감소하였다. 이것은 상기 아주반트를 사용한 보다 낮은 Th1 시토카인 반응의 예상과 일치한다. 그러나, 백시노겐은 보체 고정을 할 수 있는 항체를 계속하여 유도하고, 이것은 구축물에 대한 유의한 변화 또는 아주반트의 변형이 효과적인 반응을 위해 필요하지 않을 수 있음을 나타낸다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 유도된 체액성 면역 반응을 최적화하도록 의도된 잠재적인 키메라 다가 라임병 백시노겐에 대한 변경을 조사하였다. 구축물의 면역원성에 대한 유의한 개선은 Arg/Glu 완충제에 대한 투석에 의해 그의 용해도를 증가시킴으로써 실행될 수 있었다. 이것은 감소된 단백질 상호작용을 가질 수 있어서, 생체 내에서 보다 큰 에피토프 노출을 허용한다 [Theisen et al., 2000]. 프로테아제-보호성 C-말단 모티프의 부가 및 '보호성' C-말단 에피토프의 부가는 백시노겐에 대한 면역 반응을 개선하지 않았다. 에피토프의 재정돈은 이동한 에피토프에 대한 면역 반응의 실질적인 감소를 일으켰다. 상기 백신 구축물 내의 성분 에피토프를 향한 면역 반응의 차이는 프로테아제 소화에 대한 단백질의 저항성보다는 주로 단백질의 구조에 의존적인 것으로 보인다. 또한, 백시노겐에 의해 유도된 Th 시토카인 및 IgG 이소형이 키메라 구축물의 구조에 의해 및 아주반트 제형에 의해 변경될 수 있다는 증거가 존재한다. 본 연구는 키메라 백시노겐에 대한 최적미만 면역 반응을 위한 기초에 관한 중요한 정보, 및 그에 의해 이들 반응을 개선할 수 있는 방법을 제공한다.
실시예 5. 이용가능한 OspC 서열의 분석은 광범위 보호성 다가 키메라 라임병 백신의 실행가능성을 입증한다.
광범위 보호성 키메라 구축물의 추가의 개발을 용이하게 하기 위해, 본 발명자들은 데이타베이스에서 이용가능한 OspC 서열의 계통발생학 분석을 수행하였다. 분석된 OspC의 세그먼트는 잔기 20 내지 200에 걸쳐 이어졌다 (B31MI 서열에 대한 넘버링을 이용함. 데이타베이스 내의 보다 짧은 서열은 이들 분석으로부터 배제하였고, 280 보렐리아 균주로부터 서열이 분석을 위해 이용가능하게 남았다. 각각의 서열의 OspC 타입 지정은 정렬 (PAM40 평가 매트릭스) 및 쌍별 동일성 매트릭스 분석을 통해 결정하였다. 앞선 연구와 일치하게, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 보이는 서열은 동일한 OspC 타입에 속하는 것으로 간주하였다 ([Attie et al., 2006]; [Wang et al., 1999]) (도 19). 상이한 OspC 타입 서열들 사이에서 65%의 평균 서열 동일성 및 타입 내에서 >97% 동일성을 갖는 서열 비교의 명백한 2정점 (bimodal) 분포가 관찰되었다. 문헌 [Wang et al (1999)]에 설명된 21개 타입에 추가로, 17개의 추가의 클러스터가 규정되었다. 본 발명자들은 OspC 타입 지정을 3개 미만의 서열을 포함한 클러스터에 배정하지 않았다. 새로운 OspC 타입을 명명하는데 있어서, 본 발명자들은 기존의 OspC 타입 지정 A 내지 U를 유지하는 것을 선택하였고 (Wang et al., 1999), 여기서 각각의 클러스터 내에 함유된 원형 균주에 기반하여 추가의 타입을 명명하였다. 280개의 분석한 서열 중에서, 202개를 OspC 타입에 지정하였고, 이들은 모두 라임병-유발 종으로부터의 것이었다. OspC 타입에 배정되지 않은 78개의 서열은 라임병-유발 스피로헤테스 (51개 단리물) 및 다른 보렐리아 종 (27개 단리물)을 포함하였다. 각각의 OspC 서열을 얻은 단리물의 지리적 및 생물학적 기원을 도 20에 표 형태로 나타낸다. 대다수의 비. 부르그도르페리 단리물은 북미 (80%)로부터의 것이고, 더 적은 수는 유럽 (16%) 및 아시아 (4%)로부터의 것이었다. 53%의 비. 부르그도르페리, 48%의 비. 아프젤리이 및 79%의 비. 가리니이 OspC 서열이 인간으로부터 수집한 단리물로부터 기원하였다. 인간 단리물로부터의 비. 가리니이 OspC 서열은 우세하게 뇌척수액 (CSF) 기원 (68%)인 반면, 비. 아프젤리이 단리물은 우세하게 피부 (83%)로부터의 것임은 주목할 만하다. 이와 반대로, 비. 부르그도르페리 유래된 OspC 서열은 인간 피부 (51%), 혈장 (30%), 및 CSF (19%)로부터 회수한 단리물로부터의 것이었다. 이들 발견은 이들 유기체에 의해 유발된 질환의 공지된 패턴과 일치하고, 본 보고서에서 평가한 OspC 서열의 샘플이 라임병 스피로헤테스의 진정한 집단을 대표함을 나타낸다.
추가의 계통발생학 분석을 용이하게 하기 위해, 동일한 서열을 제거함으로써 분석한 서열의 세트를 74개로 감소시켰다. 이어서, 이들 서열을 부트스트래핑 (n=1000)을 하는 Phylip (v. 3.66) 계통발생학 패키지를 이용하여 배정하고 분석하였다. 데이호프 (Dayhoff) PAM 매트릭스를 이용하여 20 내지 200, 20 내지 130 및 131 내지 200에 걸치는 영역에 대해 거리를 계산하고, 이웃 연결에 의해 트리를 생성하였다. 비. 헤름시이 OspC 오솔로그 (Vmp33) 서열은 외집단으로서 역할을 하였다 (Margolis et al., 1994). 다수결 원칙 (군 포함에 대한 50% 컷오프)에 의해 일치 트리를 생성하였다. 데이호프 PAM 모델 하에서 최대 가능도 방법에 의해 일치 트리에 대해 거리를 재계산하였다 (도 21).
OspC의 20-200 aa 세그먼트를 사용하여 생성된 일치 트리는 말단 마디 (terminal node)에서 잘 지지되었고, 여기서 모든 결정된 OspC 타입은 예상된 바와 같은 클러스터링된다. 보다 깊은 가지 중 몇몇은 부트스트랩 분석에 의해 덜 지지되었지만 (도 21a), 이것은 서열들 사이의 동일성의 연장된 영역은 그들의 계통발생적 차이를 미묘하게 만들기 때문에 예상 밖의 것이 아니다. OspC의 20-200 및 20-130 아미노산 세그먼트를 사용하여 생성된 일치 트리는 주로 종 동일성에 기초한 유사한 계통발생학 클러스터링을 보였다 (도 21a, 21b). 그러나, 아미노산 131-200을 사용하여 생성된 일치 트리 (도 21c)는 부트스트랩 분석에 의해 강하게 지지되지 않은 유의하게 상이한 클러스터링 패턴을 생성시켰다. 상기 관찰은 ospC 유전자의 짧은 세그먼트들 사이의 재조합이 상이한 OspC 타입의 균주들 사이에서 발생한다는 가설과 일치한다. OspC 타입들 사이의 OspC의 짧은 세그먼트의 재조합에 대한 증거는 특이적 서열에서 보일 수 있다. 예를 들어, 비. 아프젤리이 OspC 타입의 서열, PLj7은 Pki 클러스터를 형성하는 비. 가리니이 OspC 서열에서 보인 것과 동일한 아미노산 20-130 도메인 내의 영역을 가진다. PLj7의 131-200 영역에서, 초가변 루프 5 및 루프 6 영역은 각각 비. 부르그도르페리 OspC 타입 F 및 M에서 보이는 것과 동일한 모티프를 갖는다. 재조합에 대한 추가의 증거는 SimPlot (v. 3.5.1)을 이용하는 부트스캐닝으로부터 생겼다 (Lole et al., 1999). 부트스캐닝에서, 잠재적인 재조합은 슬라이딩 (sliding) 윈도우 (40개 염기 윈도우, 10개 염기 스텝 간격) 내에서 서열 세그먼트의 계통 트리의 생성에 의해 평가한다 (기무라 (Kimura) 모델, Ts/Tv 비 = 2.0, 이웃 연결). 트리를 부트스트래핑하고 (n=100), 그 윈도우 내의 서열 군 배정을 지지하는 순열 트리의 수를 보고한다. >70%의 순열 트리가 윈도우 내에서 서열들을 함께 클러스터링할 때 재조합의 증거가 일반적으로 지지되는 것으로 여겨진다. 상기 설명된 타입 (도 22)에서 및 수많은 다른 OspC 타입 (데이타를 제시하지 않음)에서 가능한 재조합의 증거가 발견되었다.
OspC 변이성이 초돌연변이에 의해서보다는 기존의 OspC 타입 사이의 교환에 의해 발생한다는 증거는 광범위 보호성 백시노겐 내에 포함하기 위해 요구되는 OspC 타입-특이적 에피토프의 절대 수에 제한이 있다는 증거를 제공한다. 현재 매핑된 선형 에피토프는 모두 OspC의 C-말단 영역 내에 함유되므로 (aa 131-200), 키메라 백시노겐을 위해 요구되는 에피토프의 이론적 수를 규정하는 것이 가능하다. 상기 설명된 74개의 대표적인 서열 내에서 상기 영역을 조사함으로써, 동일한 또는 단일 아미노산 변화만을 갖는 서열의 제거에 의해 독특한 에피토프-함유 영역의 수를 34로 감소시킬 수 있다 (도 22). 몇몇 에피토프는 2개 이상의 OspC 타입에 대한 보호를 전달할 수 있으므로, 상기 수는 에피토프 매핑에 의해 추가로 제한될 수 있을 것 같다. 인간 질환 또는 보다 구체적으로 침습성 인간 질환과 연관된 OspC 타입만의 고려하여 에피토프의 요구되는 수의 추가의 감소를 또한 이룰 수도 있다 (실시예 1 참조). OspC 에피토프의 하위세트에 대한 백신 접종에 관련한 하나의 이론적 관심은 백시노겐 내에 포함되지 않은 타입을 향한 선택을 추진시키고, 따라서 희귀 대립유전자를 보유하는 집단의 분율을 증가시킬 가능성이다. 그러나, 인간은 유일한 우발 숙주이므로, 백신 접종이 진드기 벡터 또는 포유동물 병원소 내에서 특이적 OspC 타입을 발현하는 균주의 집단 분포를 유의하게 변경시킬 것 같지 않다.
요약하면, OspC 데이타베이스의 광범한 성질은 새로운 OspC 타입을 규정하고 그들의 단리 빈도 및 인간 질환과의 연관성에 관한 정보를 제공하는 철저한 분석이 수행되도록 허용하였다. 데이타는 광범위 보호성 키메라 백시노겐 내에 포함시키기 위해 요구되는 OspC 에피토프-함유 서열의 수가 제한되고 키메라 백시노겐의 개발이 실행가능함을 제안한다.
실시예 6. 8가 키메라의 구축
ENICABKD 8가 구축물 (또한 본원, 예를 들어 실시예 7에서 구축물 A8.1로서도 칭함)을 아래에 제시하고, PROTPARAM 프로그램에 의해 계산한 구축물의 몇몇 특성을 제공한다. 본 표현에서, "TAG"는 단백질의 아미노 말단 상의 히스티딘 태그를 나타낸다. "RS"는 제한 부위를 보유하는 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가리키고; 상기 서열은 기본적으로 단백질 내에서 링커로서 기능을 한다. "L" (예를 들어 L1, L2, L3, L6, L7, L8 등)은 타입 특이적 서열들을 함께 연결하기 위해 사용된 링커 서열, 예를 들어 비구조적 링커 서열을 가리킨다.
Figure pct00017
아미노산의 수: 384
분자량: 41263.7
이론적 등전점: 6.52
아미노산 조성:
Ala (A) 51 13.3%
Arg (R) 2 0.5%
Asn (N) 20 5.2%
Asp (D) 25 6.5%
Cys (C) 0 0.0%
Gln (Q) 5 1.3%
Glu (E) 42 10.9%
Gly (G) 21 5.5%
His (H) 12 3.1%
Ile (I) 7 1.8%
Leu (L) 46 12.0%
Lys (K) 62 16.1%
Met (M) 7 1.8%
Phe (F) 7 1.8%
Pro (P) 5 1.3%
Ser (S) 27 7.0%
Thr (T) 26 6.8%
Trp (W) 0 0.0%
Tyr (Y) 0 0.0%
Val (V) 19 4.9%
음 하전 잔기의 총수 (Asp + Glu): 67
양 하전 잔기의 총수 (Arg + Lys): 64
원자 조성:
탄소 C 1787
수소 H 2983
질소 N 501
산소 O 597
황 S 7
화학식: C1787H2983N501O597S7
원자의 총수: 5875
추정 반감기:
고려된 서열의 N-말단은 A (Ala)이다.
추정 반감기: 4.4시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내).
>20시간 (효모, 생체내).
>10시간 (에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli), 생체내).
불안정성 지수:
불안정성 지수 (II)는 12.58인 것으로 계산된다.
이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다.
지방족 지수: 81.46
수치료의 그랜드 평균 (GRAVY): -0.668.
시험 포유동물에게 투여될 때, 상기 키메라 단백질 구축물은 강건한 면역 반응을 유도하고, 라임병의 발병으로부터 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7. 조기 진단제 및 백신 항원으로서 사용하기 위한 구축물
몇몇 키메라 단백질이 라임병에 대한 조기 진단 검정뿐만 아니라 백신 후보의 개발을 위해 유망한 것으로 보였다. 질환 증상은 보다 더 치료가능할 수 있고, 비가역적인 만성 손상이 아직 발생하지 않을 수 있고 예방될 수 있기 때문에 조기 검출 (예를 들어, 약 3주 이내)이 중요하다. 그러나, 진단제는 필요한 경우에 나중에, 예를 들어 6주 이내에 또는 훨씬 더 오래 뒤에 사용될 수 있다. 백신에 대하여 이들은 예방상 또는 치료상 투여될 수 있다. 일반적으로, 단백질은 몇몇 상이한 보렐리아 계통발생학 타입으로부터의 외부 표면 단백질 C (OspC) 또는 외부 표면 단백질 A (OspA)의 전장 및/또는 항원성 하위단편을 연결함으로써 형성된 키메라 구축물이다.
A8.1 구축물을 사용하여 생성된 예시적인 데이타를 도 27에 제시한다. 상기 도면에 제시된 데이타는 실험상 감염된 개 모델에서, 혈청 전환이 감염 후 조기 시점에 특이적으로 검출될 수 있음을 입증한다. 개를 응집물 내에서 다수의 설명된 OspC 타입을 발현하는 스피로헤테스를 함유하는 것으로 확인된 야생-포획 진드기로 감염시켰다. 상기 검정은 키메라 단백질이 OspC-기반 라임 진단제의 감수성을 위해 중요한, 넓은 어레이의 OspC 혈청형-특이적 IgG 항체를 검출할 수 있음을 입증한다. 감염 이후 조기 시점에 OspC 혈청 전환의 검출을 또한 입증한다. OspC는 초기 감염 동안 보렐리아 세포 표면에서 발현된 우세한 단백질이므로, 다른 잠재적인 진단 항원에 비해 혈청 전환의 조기 검출에서 명확한 잇점을 가진다. 이들 동일한 이유 때문에, 이는 또한 백신 항원으로서 유의한 가능성을 가진다.
A9 시리즈의 단백질은 또한 진단 검정을 위한 기초로서 또는 별법으로 백신으로서 사용될 수 있다. A9 단백질은 보렐리아 부르그도르페리의 북미 균주에서 우세하게 발견된 OspC 계통발생학 타입으로부터의 항원 단편을 함유한다. A9.1, A9.2, 및 A9.3 백신 단백질은 각각 동일한 OspC 타입으로부터의 서열을 함유하지만, 정확한 하위단편 및/또는 하위단편이 단백질로 조립되는 순서에서 상이하다. A9.1은 루프 5로부터 나선 5까지의 서열 + 각각의 지시된 타입에 대한 천연 개재하는 서열을 포함한다. 도 28a에서는 OspC 단백질의 에피토프의 일반적인 위치, 및 구축물 A9.1 내의 에피토프의 정렬 또는 패턴을 도시한다. 도 28b는 A9.1 내의 정확한 패턴을 보여준다. A9.1에서, N- 및 C-말단은 여분의 서열을 제거하기 위해 말단절단되고; 다양한 타입의 에피토프들은 링커 서열 없이 연결되고; 보존된 C-말단 모티프는 단부에 존재한다. 본 실시예에 설명된 A10, A11 및 A12 시리즈를 비롯한 모든 "A" 구축물에 대해, 에피토프는 비. 부르그도르페리 타입 A, B, C, D, E, F, H, I, K, M, N, T, 및 U의 것을 포함한다.
구축물 A9.1
Figure pct00018
구축물 A9.1에 대해, 아미노산의 수는 569이고, 분자량은 60657.2이고, 이론적 pI는 6.35이다.
A9.2 구축물의 서열을 아래에 제공하고 (여기서 "Lp"는 "루프"를 나타내고, "Hx"는 "나선"을 나타낸다), 도 29a에 개략적으로 도시한다. 상기 구축물에서, N- 및 C- 말단은 여분의 서열을 제거하기 위해 말단절단되고; 다양한 타입의 에피토프들은 링커 서열 없이 연결되고; 개재하는 서열 (나선 4 및 루프 6)은 존재하지 않고, 보존된 C-말단 모티프는 존재한다. 상기 구축물에 대해, 에피토프 순서는 A9.1 (상기)과 동일하다.
구축물 A9.2
Figure pct00019
구축물 A9.2에 대해, 아미노산의 수는 431이고, 분자량은 46088.0이고, 이론적 pI는 5.85이다.
A9.3 구축물의 서열을 아래에 제공하고 (여기서, "Lp"는 "루프"를 나타내고, "Hx"는 "나선"을 나타낸다), 도 30a에 개략적으로 도시한다. 상기 구축물에서, N- 및 C- 말단은 여분의 서열을 제거하기 위해 말단절단되고; 다양한 타입의 에피토프들은 링커 서열 없이 연결되고; 개재하는 서열 (나선 4 및 루프 6)은 존재하지 않고, 보존된 C-말단 모티프는 존재한다. 상기 구축물에 대해, 에피토프 순서는 A9.1 및 A9.2와 상이하고, 대신에, 에피토프는 "나선-나선-루프-루프"로서 정돈된다. 단백질은 나선의 소수성 면들을 서로를 향하여 및 연결된 나선들 사이에 배향시키도록 설계된다. 이론에 매이기를 바라지 않으면서, 상기 정렬은 천연 OspC에서 발견된 것과 유사한 방식으로 나선 5 에피토프의 배향을 촉진할 수 있는 것으로 생각된다.
구축물 A9.3
Figure pct00020
구축물 A9.3에 대해, 아미노산의 수는 432이고, 분자량은 46201.2이고, 이론적 pI는 5.85이다.
A9 시리즈에 추가로, 북미에서는 흔히 발견되지 않지만 유럽 및 아시아에서 더 유행하는 보렐리아 OspC 타입을 포함하는 유사하게 구축된 단백질이 개발되었다. 이들 OspC 타입 중 많은 것은 보렐리아 가리니이 또는 보렐리아 아프젤리이에서 발견된다. 이들 단백질은 B9 및 C9 시리즈로서 지정된다. B9 시리즈에 대해, 비. 가리니이 타입 Pwa, Pli, Pbes, Pki, PfiM, H13, Smar 및 HT22로부터의 에피토프가 포함된다 (아래 설명된 몇몇을 제외하고). C9 시리즈에 대해, 비. 아프젤리이 타입 Pko, PLj7, pHez, Pmit, Szid, VS461, HT25 및 DK15로부터의 에피토프가 존재한다 (아래 설명된 몇몇을 제외하고).
B9.1 및 C9.1은 루프 5 및 나선 5 + 지시된 타입으로부터의 개재하는 서열을 함유한다 (A9.1에 대해 상기 설명된 바와 같이, 및 도 28c 및 d에 도시된 바와 같이).
구축물 B9.2 및 C9.2는 에피토프들을 함유하고 (상기 A9.2에 대해 설명된 바와 같이, 및 도 29b 및 c에 도시된 바와 같이), 단, H13 나선 5는 Pki 나선 5와 동일하고, 따라서 배제되고 (즉, 서열은 단지 1회 존재한다), Dk15 나선 5는 VS461 나선 5와 동일하고, 따라서 서열은 또한 단지 1회 존재한다. 또한, C-말단 모티프는 존재하지 않는다.
구축물 B9.3 및 C9.3은 에피토프들을 함유하고 (상기 A9.3에 대해 설명된 바와 같이, 및 도 30b 및 c에 도시된 바와 같이), 단, H13 나선은 Pki와 동일하고, 따라서 배제되고 (즉, 서열은 단지 1회 존재한다), Dk15 나선은 VS461 나선과 동일하고, 따라서 서열은 또한 단지 1회 존재한다. 또한, C-말단 모티프는 존재하지 않는다.
구축물 B9.1
Figure pct00021
구축물 B9.1에 대해, 아미노산의 수는 503이고, 분자량은 53102.4이고, 이론적 pI는 7.16이다.
구축물 B9.2
Figure pct00022
구축물 B9.2에 대해, 아미노산의 수는 381이고, 분자량은 39928.6이고, 이론적 pI는 5.79이다.
구축물 B9.3
Figure pct00023
구축물 B9.3에 대해, 아미노산의 수는 382이고, 분자량은 40056.8이고, 이론적 pI는 5.93이다.
구축물 C9 .1
Figure pct00024
구축물 C9.1에 대해, 아미노산의 수는 512이고; 분자량은 54372.0이고; 이론적 pI는 8.14이다.
구축물 C9 .2
Figure pct00025
구축물 C9.2에 대해, 아미노산의 수는 383이고, 분자량은 40492.5이고, 이론적 pI는 6.45이다.
구축물 C9 .3
Figure pct00026
구축물 C9.3에 대해, 아미노산의 수는 383이고, 분자량은 40622.6이고; 이론적 pI는 6.10이다.
A10, A11, 및 A12 시리즈 단백질이 또한 다음과 같이 백신을 위한 단백질로서 및/또는 진단 항원으로서 개발되었다:
A10CF
Figure pct00027
구축물 A10CF에 대해, 아미노산의 수는 823이고, 분자량은 87013.4이고, 이론적 pI는 6.28이다. 추정 반감기 (고려된 서열의 N-말단은 S (Ser)이다): 1.9시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내); >20시간 (효모, 생체내); >10시간 (에셔리키아 콜라이, 생체내). 불안정성 지수 (II)는 17.53인 것으로 계산된다. 이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다. 지방족 지수는 86.18이다. 수치료의 그랜드 평균 (GRAVY)은 -0.487이다.
A11
Figure pct00028
구축물 A11에 대해, 아미노산의 수는 335이고; 분자량은 35688.4이고; 이론적 pI는 5.87이다. 추정 반감기 (고려된 서열의 N-말단은 S (Ser)이다): 1.9시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내); >20시간 (효모, 생체내); >10시간 (에셔리키아 콜라이, 생체내). 불안정성 지수 (II)는 17.08인 것으로 계산된다. 이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다. 지방족 지수: 84.57. 수치료의 그랜드 평균 (GRAVY)은 -0.478이다.
A12
Figure pct00029
구축물 A12에 대해, 아미노산의 수는 298이고; 분자량은 31637.7이고; 이론적 pI는 7.19이다. 추정 반감기 (고려된 서열의 N-말단은 A (Ala)이다): 4.4시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내); >20시간 (효모, 생체내); >10시간 (에셔리키아 콜라이, 생체내). 불안정성 지수 (II)는 17.79인 것으로 계산되고; 이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다. 지방족 지수는 82.99이고, 수치료의 그랜드 평균 (GRAVY)은 -0.573이다.
A12A
Figure pct00030
구축물 A12A에 대해, 아미노산의 수는 451이고; 분자량은 48061.1이고; 이론적 pI는 7.19이다. 추정 반감기 (고려된 서열의 N-말단은 A (Ala)이다): 4.4시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내); >20시간 (효모, 생체내); >10시간 (에셔리키아 콜라이, 생체내). 불안정성 지수 (II)는 16.121인 것으로 계산되고; 이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다. 지방족 지수는 81.84이다. 수치료의 그랜드 평균 (GRAVY)은 -0.579이다.
A12CF
Figure pct00031
구축물 A12CF에 대해, 아미노산의 수는 488이고; 분자량은 51342.9이고; 이론적 pI는 7.18이다. 추정 반감기 (고려된 서열의 N-말단은 A (Ala)이다): 4.4시간 (포유동물 망상적혈구, 시험관내); >20시간 (효모, 생체내); >10시간 (에셔리키아 콜라이, 생체내). 불안정성 지수 (II)는 17.56인 것으로 계산되고; 이것은 단백질을 안정한 것으로 분류한다. 지방족 지수는 87.30이다. 수치료의 그랜드 평균 (GRAVY)은 -0.492이다.
LDX1, LDX2, LDX3, 및 LDX4로서 지정된, 진단 항원으로서 사용될 수 있는 추가의 예시적인 키메라 단백질을 아래에 제시한다. 이들 서열은 또한 백신 조성물에서 사용될 수 있다. 이들 서열에서, "ECR"은 "에피토프 함유 영역"을 나타낸다. ECR은 루프 5 (이를 포함함) 내지 나선 5 (이를 포함함)까지의 영역, 및 지시된 타입으로부터의 C-말단 모티프를 함유한다.
LDX1
Figure pct00032
LDX2
Figure pct00033
LDX3
Figure pct00034
LDX4
Figure pct00035
실시예 8. 개에서 키메라 A12CF 단백질에 대한 면역 반응의 평가.
건강이 우수하고 이전에 라임병에 대해 백신접종받지 않은 대략 2월령의 10마리의 개를 연구에 사용하였다. 하나의 군 (5마리의 개)에게 제0일 및 제21일 모두에 1 ml 용량의 0.063% PBS를 경부 영역/등 어깨의 목덜미에서 피하 (SC) 투여하였다. 제2군 (5마리의 개)에게 또한 제0일 및 제21일 모두에 리히드라겔 (Rehydragel) LV를 아주반트로 첨가한 1 ml 용량의 키메라 A12CF 단백질을 유사하게 투여하였다. 혈청을 제0, 21, 42 및 63일에 수집하고, A12CF 키메라 단백질에 대한 항체에 대해 ELISA 및/또는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
염수 투여를 한 개는 41.0 (제0일), 54.1 (제21일), 58.7 (제42일), 및 71.4 (제63일)의 역가를 가져, 연구 내내 OspC에 대한 항체에 대해 혈청학적 음성으로 유지되었다. 그러나, 리히드라겔 LV를 아주반트로 첨가한 A12CF 단백질을 투여한 개는 77.6 (제0일), 540.6 (제21일), 16333.0 (제42일), 및 8650.2 (제63일)의 역가를 가져, 단백질에 대해 강건한 혈청학적 반응을 일으켰다.
본 발명은 그의 바람직한 실시양태의 면에서 설명되지만, 당업자는 본 발명이 첨부된 청구항의 취지 및 범위 내에서 변형을 가지면서 실시될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 설명된 실시양태에 제한되어서는 안 되고, 대신에 본원에 제공된 설명의 취지 및 범위 내에서 모든 변형 및 그의 동등물을 추가로 포함할 것이다.
참조문헌
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
SEQUENCE LISTING <110> Virginia Commonwealth University <120> Polyvalent Chimeric OspC Vaccinogen and Diagnostic Antigen <130> 02940426tb <150> US 61/394,877 <151> 2010-10-20 <160> 267 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 1 Asn Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp Leu Gly Lys Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 2 Asn Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp Leu Gly Lys Arg Gly Val 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 3 Asn Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp Ser Phe Gly Lys Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 4 Thr Lys Leu Lys Asp His His Ala Gln Leu Gly Ile Gln Gly Val 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 5 Thr Lys Leu Lys Asp Asn Gln Ala Gln Arg Gly Ile Gln Gly Val 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Borrelia burgdorferi <400> 6 Lys Lys Leu Lys Glu Lys His Thr Asp Leu Gly Lys Lys Asp Ala 1 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(144)..(144) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (215)..(215) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (286)..(286) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (428)..(428) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 124 Ser Glu Asp Phe Thr Asn Lys Leu Lys Asn Gly Asn Ala Gln Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Thr Asp Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr 20 25 30 Asn Gly Thr Asn Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp Leu Ser Asp 35 40 45 Ser Val Glu Ser Leu Val Lys Ala Ala Gln Val Met Leu Thr Asn Ser 50 55 60 Val Lys Glu Leu Thr Ser Xaa Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu Lys 65 70 75 80 Ser Ser His Ala Glu Leu Gly Ile Ala Asn Gly Ala Ala Thr Asp Ala 85 90 95 Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly 100 105 110 Ala Gln Glu Leu Glu Lys 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Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (217)..(217) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (288)..(288) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (359)..(359) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 139 Ser Glu Ala Phe Thr Lys Lys Leu Lys Asp Asn Asn Ala Gln Leu Gly 1 5 10 15 Ile Gln Asn Val Gln Asp Val Glu Ala Lys Lys Ala Ile Leu Lys Thr 20 25 30 Asn Gly Asp Ile Ser Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Glu Leu Phe Glu 35 40 45 Ser Val Glu Ser Leu Ala Lys Ala Ala Gln Ala Ala Leu Ala Asn Ser 50 55 60 Val Gln Glu Leu Thr Asn Xaa Ser Glu Ala Phe Thr Asn Lys Leu Lys 65 70 75 80 Glu Lys Thr Gln Glu Leu Ala Val Ala Ala Gly Ala Ala Thr Asp Ile 85 90 95 Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu Lys Thr Asn Arg Asp Lys Asp Leu Gly 100 105 110 Ala Asp Glu Arg Gly Lys Leu Phe Lys Ser Val Glu Ser Leu Ser Lys 115 120 125 Ala Ala Gln Glu Ala Ser Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser 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Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (142)..(142) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (284)..(284) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (355)..(355) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (426)..(426) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (499)..(499) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 148 Ser Ala Ala Phe Thr Lys Lys Leu Gln Asp Gly His Val Asp Leu Gly 1 5 10 15 Lys Thr Asp Val Thr Asp Asp Asn Ala Lys Glu Ala Ile Leu Lys Thr 20 25 30 Asn Pro Thr Lys Thr Lys Gly Ala Thr Glu Leu Glu Glu Leu Phe Lys 35 40 45 Ser Val Glu Gly Leu Val Lys Ala Ala Lys Glu Ala Ser Ala Asn Ser 50 55 60 Val Lys Glu Leu Thr Ser Xaa Ser Glu Glu Phe Thr Asn Lys Leu Lys 65 70 75 80 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(71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (215)..(215) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (286)..(286) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (430)..(430) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (501)..(501) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 157 Ser Gln Asp Phe Ile Asn Lys Leu Lys Gly Gly His Ala Glu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Thr Asp Ala Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr 20 25 30 Asn Gly Asp Lys Thr Lys Gly Ala Asp Glu Phe Glu Lys Leu Phe Lys 35 40 45 Ser Val Glu Gly Leu Leu Lys Ala Ala Gln Glu Ala Leu Thr Asn Ser 50 55 60 Val Lys Glu Leu Thr Ser Xaa Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys 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primer for PCR <400> 167 gacgacgaca agattggagc ttatgcaata tcaaccc 37 <210> 168 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 168 gacgacgaca agatttgttc tgaaacattt actaataaat taaaag 46 <210> 169 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 169 gacgacgaca agattaataa attaaaagaa aaacacacag atcttg 46 <210> 170 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 170 gacgacgaca agattcacac agatcttggt aaagaagg 38 <210> 171 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 171 gacgacgaca agattactga tgctgatgca aaagaag 37 <210> 172 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 172 gacgacgaca agattgaaga acttggaaaa ttatttgaat c 41 <210> 173 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 173 gacgacgaca agattcttgc 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taacataccc atgctaccac ttgtaagctc tttaactgaa ttag 44 <210> 243 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 243 agttcaagcc aaggcttaaa aacacataat gctaaagaca ag 42 <210> 244 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 244 taagccttgg cttgaacttg taagctcttt aactgaatta gc 42 <210> 245 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 245 ggtgctatgt cagctttaaa aacacataat gctaaagaca ag 42 <210> 246 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 246 gaggagaagc ccggt 15 <210> 247 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 247 cgaaattaat acgactcact atagggg 27 <210> 248 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic oligonucleotide primer for PCR <400> 248 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 249 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric 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Sequence <220> <223> Chimeric protein <400> 266 Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser Ala Asp Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Thr Glu 20 25 30 Ser Asn Ala Val Val Leu Ala Val Lys Glu Ile Glu Thr Leu Leu Ser 35 40 45 Ser Ile Asp Glu Leu Ala Thr Lys Ala Ile Gly Gln Lys Ile Asp Ala 50 55 60 Asn Gly Leu Gly Val Gln Ala Asn Gln Asn Gly Ser Leu Leu Ala Gly 65 70 75 80 Ala Tyr Ala Ile Ser Thr Leu Ile Thr Gln Lys Leu Ser Ala Leu Asn 85 90 95 Ser Glu Asp Leu Lys Glu Lys Val Ala Lys Val Lys Lys Cys Ser Glu 100 105 110 Asp Phe Thr Asn Lys Leu Lys Asn Gly Asn Ala Gln Leu Gly Leu Ala 115 120 125 Ala Ala Thr Asp Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly 130 135 140 Thr Asn Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp Leu Ser Asp Ser Val 145 150 155 160 Glu Ser Leu Val Lys Ala Ala Gln Val Met Leu Thr Asn Ser Val Lys 165 170 175 Glu Leu Thr Ser Pro Val Val Ala Glu Ser Pro Lys Lys Pro Ser Glu 180 185 190 Lys Phe Ala Gly Lys Leu Lys Asn Glu His Ala Ser Leu Gly Lys Lys 195 200 205 Asp Ala Thr Asp Asp Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu Lys Thr His Gly 210 215 220 Asn Thr Asp Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp Leu Ser Asp Ser Val 225 230 235 240 Glu Ser Leu Val Ser Thr Gly Phe Thr Asn Lys Leu Lys Ser Gly His 245 250 255 Ala Glu Leu Gly Pro Val Gly Gly Asn Ala Thr Asp Glu Asn Ala Lys 260 265 270 Gln Ala Ile Leu Lys Thr His Gly Asn Val Thr Lys Gly Ala Lys Glu 275 280 285 Leu Lys Asp Leu Ser Glu Ser Val Glu Ala Leu Ala Lys Ala Ala Gln 290 295 300 Ala Met Ser Glu Lys Phe Thr Lys Lys Leu Ser Glu Ser His Ala Asp 305 310 315 320 Ile Gly Ile Gln Ala Ala Thr Asp Ala Asn Ala Lys Asp Ala Ile Leu 325 330 335 Lys Thr Asn Pro Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Asp Lys Leu 340 345 350 Phe Lys Ala Val Glu Asn Leu Ser Lys Ala Ala Lys Lys Leu Lys Glu 355 360 365 Lys His Thr Asp Leu Gly Lys Lys Asp Ala Thr Asp Val His Ala Lys 370 375 380 Glu Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala Ala Glu 385 390 395 400 Leu Glu Lys Leu Phe Glu Ser Val Glu Asn Leu Ala Lys Ala Ala Lys 405 410 415 Glu Met Leu Ser Asn Ser Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu Lys Ser 420 425 430 Ser His Ala Glu Leu Gly Ile Ala Asn Gly Ala Ala Thr Asp Ala Asn 435 440 445 Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala 450 455 460 Gln Glu Leu Glu Lys Leu Phe Glu Ser Val Lys Asn Leu Ser Lys Ala 465 470 475 480 Ala Gln Glu Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr Glu Phe Thr Asn Lys Leu 485 490 495 Lys Ser Glu His Ala Val Leu Gly Leu Asp Asn Leu Thr Asp Asp Asn 500 505 510 Ala Gln Arg Ala Ile Leu Lys Lys His Ala Asn Lys Asp Lys Gly Ala 515 520 525 Ala Glu Leu Glu Lys Leu Phe Lys Ala Val Glu Asn Leu Ser Lys Ala 530 535 540 Ala Gln Asp Thr Leu Lys Asn Ala Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile 545 550 555 560 Val Ala Glu Ser Pro Lys Lys Pro 565 <210> 267 <211> 437 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric protein <400> 267 Asn Lys Leu Lys Asn Gly Asn Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Asp Asp Asn Ala Lys Ala Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Asn Asp 20 25 30 Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp Leu Ser Asp Ser Val Glu Ser Leu 35 40 45 Val Lys Ala Ala Gln Val Met Leu Thr Asn Ser Ser Glu Lys Phe Ala 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Glu His Ala Ser Leu Gly Lys Lys Asp Ala Thr 65 70 75 80 Asp Asp Asp Ala Lys Lys Ala Ile Leu Lys Thr His Gly Asn Thr Asp 85 90 95 Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp Leu Ser Asp Ser Val Glu Ser Leu 100 105 110 Val Ser Thr Gly Phe Thr Asn Lys Leu Lys Ser Gly His Ala Glu Leu 115 120 125 Gly Pro Val Gly Gly Asn Ala Thr Asp Glu Asn Ala Lys Gln Ala Ile 130 135 140 Leu Lys Thr His Gly Asn Val Thr Lys Gly Ala Lys Glu Leu Lys Asp 145 150 155 160 Leu Ser Glu Ser Val Glu Ala Leu Ala Lys Ala Ala Gln Ala Met Ser 165 170 175 Glu Lys Phe Thr Lys Lys Leu Ser Glu Ser His Ala Asp Ile Gly Ile 180 185 190 Gln Ala Ala Thr Asp Ala Asn Ala Lys Asp Ala Ile Leu Lys Thr Asn 195 200 205 Pro Thr Lys Thr Lys Gly Ala Glu Glu Leu Asp Lys Leu Phe Lys Ala 210 215 220 Val Glu Asn Leu Ser Lys Ala Ala Lys Lys Leu Lys Glu Lys His Thr 225 230 235 240 Asp Leu Gly Lys Lys Asp Ala Thr Asp Val His Ala Lys Glu Ala Ile 245 250 255 Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala Ala Glu Leu Glu Lys 260 265 270 Leu Phe Glu Ser Val Glu Asn Leu Ala Lys Ala Ala Lys Glu Met Leu 275 280 285 Ser Asn Ser Asn Lys Ala Phe Thr Asp Lys Leu Lys Ser Ser His Ala 290 295 300 Glu Leu Gly Ile Ala Asn Gly Ala Ala Thr Asp Ala Asn Ala Lys Ala 305 310 315 320 Ala Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Asp Lys Gly Ala Gln Glu Leu 325 330 335 Glu Lys Leu Phe Glu Ser Val Lys Asn Leu Ser Lys Ala Ala Gln Glu 340 345 350 Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr Glu Phe Thr Asn Lys Leu Lys Ser Glu 355 360 365 His Ala Val Leu Gly Leu Asp Asn Leu Thr Asp Asp Asn Ala Gln Arg 370 375 380 Ala Ile Leu Lys Lys His Ala Asn Lys Asp Lys Gly Ala Ala Glu Leu 385 390 395 400 Glu Lys Leu Phe Lys Ala Val Glu Asn Leu Ser Lys Ala Ala Gln Asp 405 410 415 Thr Leu Lys Asn Ala Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile Val Ala Glu 420 425 430 Ser Pro Lys Lys Pro 435

Claims (33)

  1. 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 5 내지 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 5개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 6개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 7개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 8개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 9개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 OspC 타입이 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 키메라 재조합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성, 또는 완전 (100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 키메라 재조합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 OspC 타입 중의 적어도 하나가 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 키메라 재조합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 각각의 상기 OspC 타입이 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 키메라 재조합 단백질.
  13. 보렐리아에 대한 면역 반응의 유도를 필요로 하는 개체에게 서로 상이한 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질을 제공하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 보렐리아에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 키메라 재조합 단백질이 5 내지 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 OspC 타입이 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성, 또는 완전 (100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 OspC 타입 중의 적어도 하나가 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 각각의 상기 OspC 타입이 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 방법.
  19. 개체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    서로 상이한 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 재조합 키메라 단백질에 상기 생물학적 샘플을 노출시키는 단계;
    상기 생물학적 샘플 내의 항체가 상기 적어도 하나의 키메라 단백질에 결합하는지를 결정하는 단계
    를 포함하며, 여기서 항체 결합의 검출은 보렐리아에 대한 이전의 노출 또는 보렐리아에 의한 감염을 나타내는 것인, 상기 개체가 보렐리아에 노출되었는지 또는 보렐리아로 감염되었는지 또는 둘 모두를 확인하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 키메라 재조합 단백질이 5 내지 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 OspC 타입이 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성, 또는 완전 (100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 OspC 타입 중의 적어도 하나가 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 방법.
  24. 제19항에 있어서, 각각의 상기 OspC 타입이 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 방법.
  25. 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 키메라 재조합 단백질에 대한 항체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 키메라 재조합 단백질이 5 내지 13개의 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 것인 항체.
  27. 제25항에 있어서, 상기 OspC 타입이 Smar, PLi, H13, PFiM, SL10, PMit, PKi, Pbes, HT22, Pko, PLj7, VS461, DK15, HT25, A, 72a, F, E, M, D, U, I, L, H, Szid, PHez, PWa, B, K, N, C 및 T로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 항체.
  28. 제25항에 있어서, 상기 키메라 단백질이 서열 250, 서열 251, 서열 252, 서열 253, 서열 254, 서열 255, 서열 256, 서열 257, 서열 258, 서열 259, 서열 260, 서열 261, 서열 262, 서열 263, 서열 264, 서열 265, 서열 266 및 서열 267로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 동일성, 또는 완전 (100%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  29. 제25항에 있어서, 상기 OspC 타입 중의 적어도 하나가 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 항체.
  30. 제25항에 있어서, 각각의 상기 OspC 타입이 인간에서 침습성 보렐리아 감염과 연관되는 것인 항체.
  31. 제25항에 있어서, 보렐리아 스피로헤테스에 대해 살균성인 항체.
  32. 키메라 재조합 단백질의 면역원성 칵테일로서, 상기 칵테일 내의 각각의 키메라 재조합 단백질이 2개 이상의 외부 표면 단백질 C (OspC) 타입의 루프 5 영역 또는 알파 나선 5 영역 또는 둘 모두로부터의 에피토프를 포함하는 것인, 키메라 재조합 단백질의 면역원성 칵테일.
  33. 제32항에 있어서, 각각의 키메라 재조합 단백질이 6 내지 13개의 상기 OspC 타입으로부터의 에피토프를 포함하는 것인 면역원성 칵테일.
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