CN104812405A - 含有肺炎球菌表面蛋白a的肺炎球菌疫苗 - Google Patents
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Abstract
含有至少包含家族1的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段和家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段的融合蛋白、特别是以下的(1)~(3)中的任意一种融合蛋白的肺炎球菌疫苗显示广范围的交叉反应,作为包含能够对广范围的临床分离肺炎球菌株诱导免疫应答的单一的蛋白质抗原的肺炎球菌疫苗有用:(1)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;(2)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;(3)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及含有肺炎球菌表面蛋白A的肺炎球菌疫苗。
背景技术
肺炎球菌是主要的呼吸道病原性细菌,在儿童、成人中引起包含髓膜炎、败血症在内的侵袭性感染症(Invasive pneumococcal disease:IPD)、社区获得性肺炎。现有的肺炎球菌疫苗抗原为决定该细菌的血清型的荚膜多糖,已知到目前为止存在至少93种血清型。
在2000年,在美国引入了在多糖抗原中结合有无毒化白喉毒素(CRM197)的7价肺炎球菌结合疫苗(PCV7)作为儿童用疫苗。引入PCV7后,由疫苗含有的7血清型的肺炎球菌引起的侵袭性感染症明显减少,但由儿童和成人中的非疫苗含有血清型即血清型19A等引起的IPD症例增加的问题浮现。因此,在2010年,引入了在PCV7中进一步追加6血清型的荚膜多糖体作为抗原的13价肺炎球菌结合疫苗(PCV13),并已经在美国在儿童、成人中得到认可。
另一方面,Croney等人收集接种PCV13前的2002~2010年间发病的来源于美国亚拉巴马州的儿童侵袭性感染症的肺炎球菌株并进行了大规模调查,结果,仅含有60%的PCV13中含有的血清型,其余的40%的菌株含有PCV13中不含的17血清型(非专利文献1)。在日本,从2011年开始了对儿童接种PCV7的公费资助,在2012年报道了,与美国同样由非疫苗含有血清型引起的IPD增加(非专利文献2)。在现有疫苗中继续追加非疫苗血清型荚膜多糖体作为抗原是不现实的,可以说这暗示了基于荚膜多糖体的现有的肺炎球菌疫苗的极限。
为了弥补如上所述的现有肺炎球菌疫苗的缺点,作为肺炎球菌表层蛋白抗原之一的肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA,以下记作“PspA”)作为新型肺炎球菌疫苗抗原受到关注。已知PspA具有图1所示的包含各结构域的结构,在PspA的α-螺旋和脯氨酸富集区存在对肺炎球菌显示感染防御作用的抗体所识别的抗原表位(非专利文献3、4)。PspA根据其抗原表位区域的基因序列而大致分为三个家族,并进一步分为六个被称为支系的亚组。由临床分离的肺炎球菌的PspA家族在家族1和2中占98%以上(非专利文献5)。已知PspA还作为病原因子发挥作用,抑制补体C3与肺炎球菌菌体表面的结合(非专利文献6),另一方面,已知抗PspA特异抗体对PspA所具有的补体抑制活性发挥拮抗性作用,显示出对该细菌的感染防御活性(非专利文献7、8)。据报道,该感染防御活性也由交叉识别不同的PspA家族的抗体而产生(非专利文献9)。另一方面,不同的PspA的交叉反应性具有多样性(非专利文献10、11),因此认为筛选显示更广泛的交叉反应的属于家族1和家族2的支系的组合对基于PspA的疫苗的开发是重要的。
例如专利文献1、2中记载了PspA蛋白质作为针对肺炎球菌感染的疫苗的免疫学活性成分有用。
非专利文献12中,对家族1支系1的PspA与家族2支系4的PspA的融合蛋白和家族1支系1的PspA与家族2支系3的PspA的融合蛋白的疫苗效果进行了研究。另外,非专利文献13中,对家族1支系2的PspA与家族2支系4的PspA的融合蛋白的疫苗效果进行了研究。但是,对于这两篇文献中记载的PspA融合蛋白,没有评价对表达支系5和6的PspA的肺炎球菌的疫苗效果、对广范围的临床分离肺炎球菌株的疫苗效果,尚未有实用化的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特公平6-504446号公报
专利文献2:日本特表2000-503676
非专利文献
非专利文献1:Croney CM,Coats MT,Nahm MH et al.2012.PspAfamily distribution,unlike capsular serotype,remains unaltered followingintroduction of the heptavalent pneumococcal conjugate vaccine.ClinVaccine Immunol.19:891-896.
非专利文献2:厚生劳动科学研究费补助金药品/医疗器械等监管科学综合事业。“新しく開発されたHib,肺炎球菌、ロタウイルス、HPV等の各ワクチンの有効性、安全性並びにその投与方法に関する基礎的·臨床的研究”来源于儿童侵袭性感染症的肺炎球菌的免疫学分析。柴山恵吾。p46-53。平成24年3月
非专利文献3:McDaniel LS,Ralph BA,McDaniel DO et al.1994.Localization of protection-eliciting epitopes on PspA of Streptococcuspneumonia between amino acid residues 192 and 260.Microb Pathog.17:323-37.
非专利文献4:Daniels CC,Coan P,King J et al.2010.Theproline-rich region of pneumococcal surface proteins A and C containssurface-accessible epitopes common to all pneumococci and elicitsantibody-mediated protection against sepsis.Infect Immun.78:2163-2172.
非专利文献5:Hollingshead SK,Becker R,Briles DE.2000.Diversity of PspA:mosaic genes and evidence for past recombination inStreptococcus pneumoniae.Infect Immun.68:5889-5900.
非专利文献6:Tu AH,Fulgham RL,McCrory MA et al.1999.Pneumococcal surface protein A inhibits complement activation byStreptococcus pneumoniae.Infect Immun.67:4720-4724.
非专利文献7:Ezoe H,Akeda Y,Piao Z,Aoshi T,Koyama S,Tanimoto T,Ken J.Ishii KJ,Oishi K.2011.Intranasal vaccination withpneumococcal surface protein A plus poly(I:C)protects against secondarypneumococcal pneumonia in mice.Vaccine 29:1754-1761.
非专利文献8:Piao Z,Oma K,Ezoe H,Akeda Y,Tomono K,OishiK.2011.Comparative effects of toll-like receptor agonists on a low dosePspA intranasal vaccine against fatal pneumococcal pneumonia in mice.JVaccines Vaccin 2:1,htt://dx.doi.org/10.4172/2157-7560.1000113
非专利文献9:Ren B,Szalai AJ,Hollingshead SK et al.2004.Effects of PspA and antibodies to PspA on activation and deposition ofcomplement on the pneumococcal surface.Infect Immun.72:114-122.
非专利文献10:Darrieux M,Moreno AT,Ferreira DM et al.2008.Recognition of pneumococcal isolates by antisera raised against PspAfragments different clades.J Med Microbiol.57:273-278.
非专利文献11:Moreno AT,Oliveira ML,Ferreira DM et al.2010.Immunization of mice with single PspA Fragments induces Antibodiescapable of mediating complement deposition on different pneumococcalstrains and cross-protection.Clin Vaccine Immunol.17:439-446.
非专利文献12:M.Darrieux,E.N.Miyaji,D.M.Ferreira,L.M.Lopes,A.P.Y.Lopes,B.Ren,D.E.Briles,S.K.Hollingshead,and L.C.C.Leite.2007.Fusion Proteins Containing Family 1 and Family 2 PspAFragments Elicit Protection against Streptococcus pneumoniae ThatCorrelates with Antibody-Mediated Enhancement of ComplementDeposition.Infect Immun.75:5930-5938.
非专利文献13:Wei Xin,Yuhua Li,Hua Mo,Kenneth L.Roland,and Roy Curtiss III.2009.PspA Family Fusion Proteins Delivered byAttenuated Salmonella enterica Serovar Typhimurium Extend and EnhanceProtection against Streptococcus pneumonia.Infect Immun.77:4518-4528.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于从作为肺炎球菌表层蛋白抗原的PspA的组合中找出显示广范围的交叉反应并能够对广范围的临床分离肺炎球菌株诱导免疫应答的支系的组合或菌株的组合,从而提供基于PspA的新型肺炎球菌疫苗。特别是,其课题在于,在组合多种PspA而得到的融合蛋白中找出显示广范围的交叉反应并能够对广范围的临床分离肺炎球菌株诱导免疫应答的单一的蛋白质抗原,从而提供新型肺炎球菌疫苗。
用于解决问题的手段
为了解决上述课题,本发明包括以下的各发明。
[1]一种肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有融合蛋白,所述融合蛋白至少包含家族1的肺炎球菌表面蛋白A(其中,不包括来源于肺炎球菌Rx1株的肺炎球菌表面蛋白A和来源于肺炎球菌St435/96株的肺炎球菌表面蛋白A)的全长或其片段和家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段。
[2]如上述[1]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,家族1的肺炎球菌表面蛋白A为支系2。
[3]如上述[2]所述的肺炎球菌疫苗,其中,融合蛋白为以下的(1)~(3)中的任意一种:
(1)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(2)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(3)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白。
[4]如上述[3]所述的肺炎球菌疫苗,其中,融合蛋白为以下的(4)~(6)中的任意一种:
(4)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白;
(5)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白;
(6)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白。
[5]如上述[1]~[4]中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段至少包含脯氨酸富集区的全部或一部分。
[6]如上述[5]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段由脯氨酸富集区的全部或一部分和与其相邻的α-螺旋区的全部或一部分构成。
[7]如上述[2]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A来源于选自由D39、WU2、E134、EF10197、EF6796、BG9163和DBL5组成的组中的肺炎球菌株。
[8]如上述[3]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,表达家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的肺炎球菌来源于TIGR4、BG8090或AC122,家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A来源于EF5668、BG7561、BG7817或BG11703,家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A来源于ATCC6303或KK910。
[9]如上述[1]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,融合蛋白包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
[10]一种肺炎球菌疫苗,其特征在于,至少含有家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段以及选自由支系3、支系4和支系5组成的组中的家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段。
[11]如上述[10]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,所含有的肺炎球菌表面蛋白A为以下的(i)~(iii)中的任意一种:
(i)仅家族1支系2和家族2支系3;
(ii)仅家族1支系2和家族2支系4;
(iii)仅家族1支系2和家族2支系5。
[12]如上述[1]~[11]中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有佐剂。
[13]如上述[1]~[12]中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有抗肺炎球菌以外的病原体的疫苗成分。
发明效果
根据本发明,能够提供显示广范围的交叉反应并能够对广范围的临床分离肺炎球菌株诱导免疫应答的肺炎球菌疫苗。通过接种本发明的肺炎球菌疫苗,能够对儿童和成人诱导肺炎球菌感染症的感染防御免疫。
附图说明
图1是表示PspA蛋白质的结构的图。
图2是表示实施例1中制作的三种融合PspA蛋白质的结构的图,(A)是表示PspA2+4的结构的图,(B)是表示PspA2+5的结构的图,(C)是表示PspA3+2的结构的图。
图3(A)是表示各融合PspA蛋白质的SDS-PAGE的结果的图,(B)是表示各融合PspA蛋白质的免疫蛋白印迹的结果的图。
图4是表示对由免疫了各融合PspA蛋白质的小鼠得到的免疫血清中IgG的PspA支系与不同的肺炎球菌表面的结合能力进行测定而得到的结果的图。
图5是表示使免疫了各融合PspA蛋白质的小鼠感染PspA支系不同的肺炎球菌并对感染后2周的存活率进行观察而得到的结果的图,(A)是使其感染2×107CFU的BG9739后的结果,(B)是使其感染2×107CFU的WU2后的结果,(C)是使其感染5×106CFU的TIGR4后的结果,(D)是使其感染1×108CFU的KK1162后的结果,(E)是使其感染5×105CFU的ATCC6303后的结果。
图6是表示对由免疫了各融合PspA蛋白质的小鼠得到的免疫血清中IgG与临床分离肺炎球菌株的结合能力进行测定而得到的结果的图,(A)是由PspA2+4得到的免疫血清的结果,(B)是由PspA2+5得到的免疫血清的结果,(C)是由PspA3+2得到的免疫血清的结果。
图7是表示对由分别免疫了单一的PspA2、单一的PspA3、PspA2和PspA3、PspA3+2融合蛋白的小鼠得到的免疫血清中的抗PspA抗体效价进行测定而得到的结果的图。
图8是表示对由并用CpG和Alum或者单独使用CpG作为佐剂并免疫了三种融合PspA蛋白质(PspA2+4、PspA2+5、PspA3+2)的小鼠得到的免疫血清中的抗PspA抗体效价进行测定而得到的结果的图。
图9是表示对由单独使用各浓度的Alum作为佐剂免疫了PspA3+2融合蛋白的小鼠得到的免疫血清中的抗PspA抗体效价进行测定而得到的结果的图。
具体实施方式
[肺炎球菌疫苗]
本发明提供含有至少包含家族1的PspA的全长或其片段和家族2的PspA的全长或其片段的融合蛋白的肺炎球菌疫苗。但是,上述非专利文献13中记载的包含家族1支系2的PspA与家族2支系4的PspA的融合蛋白中使用的来源于肺炎球菌Rx1株的PspA(家族1支系2)的融合蛋白从本发明中排除。另外,上述非专利文献12中记载的融合蛋白中,包含作为家族1支系1的PspA使用的来源于肺炎球菌St435/96株(参见非专利文献12和Miyaji EN et al.,Infect Immun.70:5086-5090,2002.TABLE 1)的PspA(家族1支系1)的融合蛋白也从本发明中排除。编码肺炎球菌St435/96株的PspA的基因的一部分及其氨基酸序列以登记号AY082387登记在GenBank等数据库中。本说明书的以下的记载中,“家族1的PspA”中不包含来源于Rx1株和St435/96株的PspA。
本发明的肺炎球菌疫苗(以下记作“本发明的疫苗”)所含有的融合蛋白(以下,有时记作“本发明的融合蛋白”)只要至少含有家族1的PspA和家族2的PspA即可。本发明的融合蛋白可以含有3种以上的PspA,也可以含有PspA以外的蛋白质、荚膜多糖(例如,载体蛋白、荚膜疫苗抗原等)。优选为由两种PspA构成的融合蛋白、即由家族1的PspA和家族2的PspA构成的融合蛋白。另外,融合蛋白可以含有标签序列、来源于载体的序列、来源于限制性酶的序列等PspA以外的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白中,融合的各蛋白质的顺序没有限定,例如,在家族1和家族2这两种PspA的融合蛋白的情况下,可以为N末端侧为家族1、C末端侧为家族2的顺序,也可以相反地为N末端侧为家族2、C末端侧为家族1的顺序。3种以上的PspA的融合蛋白的情况、包含PspA以外的蛋白质的情况也同样,顺序没有限定。
本发明的融合蛋白中,可以优选使用来源于已鉴定了家族和支系的肺炎球菌的PspA。另外,在使用来源于家族和支系未经鉴定的肺炎球菌的PspA的情况下,优选在鉴定家族和支系后使用。PspA的家族和支系可以通过如下方法确认:将PspA基因的预测包含α-螺旋区和脯氨酸富集区的部分利用PCR进行扩增,确定碱基序列,并将所得到的碱基序列中脯氨酸富集区的上游约400bp的碱基序列与支系已进行了鉴定的PspA基因的碱基序列进行比较。具体而言,如果该部分的碱基序列与表1或2中示出的任意的PspA基因的碱基序列的同源性为97~100%,则判断为同一支系。鉴定为支系1或2的PspA判断为家族1,鉴定为支系3或4或5的PspA判断为家族2,鉴定为支系6的PspA判断为家族3(参考文献:非专利文献5,Swiatlo E,Brooks-Walter A,BrilesDE,McDaniel LS.Oligonucleotides identity conserved and variableregions of pspA and pspA-like sequences of Streptococcus pneumonia.Gene 1997,188:279-284.)。另外,使用对家族1和家族2呈特异性的引物对PspA基因进行扩增,如果PCR产物的大小为约1000bp,则可以判断为家族1,如果PCR产物的大小为约1200bp,则可以判断为家族2(参考文献:Vela Coral MC,Fonseca N,E,Di Fabio JL,Hollingshead SK,Briles DE.Pneumococcal surface protein A of invasiveStreptococcus pneumonia isolates from Colombian children.Emerg InfectDis 2001,7:832-6.)。
作为鉴定了家族和支系的肺炎球菌,可以列举例如表1和表2中记载的肺炎球菌,来源于这些肺炎球菌(不包括Rx1)的PspA均可以优选用于本发明的融合蛋白。
[表1]
家族1
[表2]
家族2
本发明的融合蛋白中,家族1的肺炎球菌表面蛋白A优选为支系2。更优选为以下的(1)~(3)的融合蛋白:
(1)至少含有家族1支系2的PspA和家族2支系3的PspA的融合蛋白;
(2)至少含有家族1支系2的PspA和家族2支系4的PspA的融合蛋白;
(3)至少含有家族1支系2的PspA和家族2支系5的PspA的融合蛋白。
进一步优选为以下的(4)~(6)的融合蛋白:
(4)由家族1支系2的PspA和家族2支系3的PspA构成的融合蛋白;
(5)由家族1支系2的PspA和家族2支系4的PspA构成的融合蛋白;
(6)由家族1支系2的PspA和家族2支系5的PspA构成的融合蛋白。
另外,家族2的PspA优选为支系3。因此,作为本发明的疫苗,优选含有上述(1)或(4)的融合蛋白。
融合蛋白中使用的PspA可以为全长也可以为其的片段。构成融合蛋白的2种以上的PspA可以全部为全长,也可以为全长与片段的混合,还可以全部为片段。如图1所示,PspA作为包含信号序列(signalsequence)、α-螺旋(α-Helix)、脯氨酸富集(Proline-rich)、胆碱结合(Cholinebinding)和C末端尾部(C-terminal tail)的各区域的蛋白质(前体)进行表达,从其中切断信号序列而成为成熟PspA。因此,全长PspA是指从图1所示的PspA中除掉信号序列的区域以外的部分。本发明的融合蛋白中使用的PspA的片段只要包含全长PspA的一部分且能够对生物体诱导肺炎球菌感染症的感染防御免疫则没有特别限定,优选包含脯氨酸富集区的全部或一部分。另外,PspA的片段可以包含与脯氨酸富集区相邻的α-螺旋区的全部或一部分。此外,PspA的片段优选不包含C末端尾部区,更优选不包含胆碱结合区和C末端尾部区。即,本发明的融合蛋白中使用的PspA的片段优选为仅由脯氨酸富集区的一部分构成的片段、仅由脯氨酸富集区的全部构成的片段、由脯氨酸富集区的一部分和相邻的α-螺旋区的一部分构成的片段、由脯氨酸富集区的一部分和相邻的α-螺旋区的全部构成的片段、由脯氨酸富集区的全部和相邻的α-螺旋区的一部分构成的片段以及由脯氨酸富集区的全部和α-螺旋区的全部构成的片段中的任意一种。更优选为由脯氨酸富集区的全部和α-螺旋区的全部构成的片段。
PspA的各区域可以根据Yother等人(Yother J,Briles DE.1992.Structural properties and evolutionary relationships of PspA,a surfaceprotein of Streptococcus pneumoniae,as revealed by sequence analysis.J.Bacteriol.174:601-609)的报道进行确定。具体而言,α-螺旋区是来源于Rx1株的PspA中从使用二次结构预测程序预测具有α-螺旋结构的区域(第1位~第288位)中除掉信号序列(第1位~第31位)以外的区域,可以定义为与该氨基酸序列显示出高同源性的区域。脯氨酸富集区可以定义为位于α-螺旋区与胆碱结合区之间且频繁出现脯氨酸残基的区域。胆碱结合区是来源于Rx1株的PspA中包含比较高度保守的20个氨基酸(以TGWLQVNGSWYYLNANGAMA(序列号24)为基础)的重复序列存在10次的区域,可以定义为与该氨基酸序列显示出高同源性的区域。C末端尾部区可以定义为从胆碱结合区中存在的最终重复序列起至C末端的终止密码子为止的区域。
PspA的片段的长度只要是能够对生物体诱导免疫应答的长度则没有特别限定。优选为至少27个残基以上,更优选为108个残基以上,进一步优选为300个残基以上(参考文献:Daniels CC,Coan P,King J,Hale J,Benton KA,Briles DE,Hollingshead SK.The Proline-Rich Regionof Pneumococcal Surface Proteins A and C Contains Surface-AccessibleEpitopes Common to All Pneumococci and Elicits Antibody-MediatedProtection against Sepsis.Infect.Immun.2010.78:2163-2172.)。
作为家族1支系2的PspA,优选例如来源于肺炎球菌株D39、WU2、E134、EF10197、EF6796、BG9163、DBL5等的PspA。更优选为来源于D39或WU2的PspA。作为家族2支系3的PspA,优选来源于肺炎球菌株TIGR4、BG8090、AC122等的PspA。更优选为来源于TIGR4的PspA。作为家族2支系4的PspA,优选来源于肺炎球菌株EF5668、BG7561、BG7817、BG11703等的PspA。更优选为来源于EF5668的PspA。作为家族2支系5的PspA,优选来源于肺炎球菌株ATCC6303、KK910等的PspA。更优选为来源于ATCC6303的PspA。
本发明的融合蛋白优选来源于D39的PspA与来源于EF5668的PspA的组合、来源于D39的PspA与来源于ATCC6303的PspA的组合、或来源于WU2的PspA与来源于TIGR4的PspA的组合。其中,更优选来源于WU2的PspA与来源于TIGR4的PspA的组合,进一步优选N末端侧为来源于TIGR4的PspA、C末端侧为来源于WU2的PspA的组合。
此外,本发明的融合蛋白优选包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。其中,更优选包含与由序列号5表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的融合蛋白。
由序列号1表示的氨基酸序列为作为来源于D39的PspA与来源于EF5668的PspA的融合蛋白且自N末端侧起来源于包含聚组氨酸标签的载体的序列、D39的PspA的氨基酸序列(登记号ABJ54172,619aa)的第32位~第401位、来源于EcoRI识别碱基序列的序列、EF5668的PspA的氨基酸序列(登记号AAC62252,653aa)的第32位~第454位依次连接而得到的氨基酸序列。
由序列号3表示的氨基酸序列为作为来源于D39的PspA与来源于ATCC6303的PspA的融合蛋白且自N末端侧起来源于包含聚组氨酸标签的载体的序列、D39的PspA的氨基酸序列(登记号ABJ54172,619aa)的第32位~第401位、来源于EcoRI识别碱基序列的序列、ATCC6303的PspA的部分氨基酸序列(登记号AF071820,461aa)的第32位~第461位依次连接而得到的氨基酸序列。
由序列号5表示的氨基酸序列为作为来源于TIGR4的PspA与来源于WU2的PspA的融合蛋白且自N末端侧起来源于包含聚组氨酸标签的载体的序列、TIGR4的PspA的氨基酸序列(登记号AAK74303,744aa)的第32位~第524位、来源于EcoRI识别碱基序列的序列、WU2的PspA的部分氨基酸序列(登记号AAF27710,415aa)的第32位~第409位依次连接而得到的氨基酸序列。
作为与由序列号1表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列,可以列举例如在由序列号1表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个~多个氨基酸而得到的氨基酸序列。“缺失、取代或添加1个~多个氨基酸”是指缺失、取代或添加能够通过定点突变法等公知的突变肽制作方法缺失、取代或添加的程度的数量(优选10个以下、更优选7个以下、进一步优选5个以下)的氨基酸。这样的突变蛋白质不限于具有通过公知的突变多肽制作方法人为导入的突变的蛋白质,可以为对天然存在的蛋白质进行分离纯化而得到的蛋白质。另外,实质上相同的氨基酸序列可以列举与由序列号1表示的氨基酸序列至少80%相同、更优选至少85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。与由序列号3或5表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列也同样。
作为包含与由序列号1表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的融合蛋白,优选与包含由序列号1表示的氨基酸序列的融合蛋白实质上具有同质的活性的融合蛋白。作为实质上同质的活性,可以列举对广范围的肺炎球菌株诱导免疫应答的活性,优选该活性与包含由序列号1表示的氨基酸序列的融合蛋白同等(例如,约0.5~约20倍、优选约0.5~约2倍)。包含与由序列号3或5表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的融合蛋白也同样。
本发明的融合蛋白可以通过如下方法制造:通过公知的基因工程方法构筑以能够表达编码本发明的融合蛋白的基因的方式插入的重组表达载体,将其导入到适当的宿主细胞中,作为重组蛋白使其进行表达,并进行纯化。另外,本发明的融合蛋白可以使用编码本发明的融合蛋白的基因和公知的体外转录、翻译系统(例如,兔网状红细胞、来源于小麦胚芽或大肠杆菌的无细胞蛋白质合成系统等)来制造。
本发明的疫苗即使不含佐剂也能够对肺炎球菌诱导免疫应答,在这一方面有用性高。但是,本发明的疫苗可以含有1种以上的佐剂。在本发明的疫苗含有佐剂的情况下,可以从公知的佐剂中适当选择使用。具体而言,可以列举例如:铝佐剂(例如,氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等铝盐或其组合)、弗氏佐剂(完全或不完全)、TLR配体(例如,CpG、Poly(I:C)、Pam3CSK4等)、BAY、DC-chol、pcpp、单磷酸脂质A、QS-21、霍乱毒素、甲酰甲硫氨酰肽等。优选为铝佐剂、TLR配体或它们的组合。
在本发明的疫苗含有佐剂的情况下,佐剂的配合量只要是非特异性地提高对本发明的融合蛋白的免疫应答的量则没有特别限定,根据佐剂的种类等适当选择即可。例如,在并用铝佐剂(氢氧化铝)和CpG的情况下,优选相对于本发明的融合蛋白以质量比计配合约1倍量~约100倍量的铝佐剂、约1倍量~约50倍量的CpG。
本发明的疫苗可以还含有抗肺炎球菌以外的病原体的疫苗成分。即、本发明提供含有作为抗肺炎球菌的疫苗成分的上述本发明的融合蛋白和抗肺炎球菌以外的病原体的疫苗成分的混合疫苗。抗肺炎球菌以外的病原体的疫苗成分没有特别限定,可以列举例如已作为混合疫苗具有使用效果的疫苗成分。具体而言,可以列举例如:白喉类毒素、百日咳类毒素、百日咳菌抗原、破伤风类毒素、灭活脊髓灰质炎病毒、弱毒麻疹病毒、弱毒风疹病毒、弱毒腮腺炎病毒、流感菌b型多糖抗原、B型肝炎病毒HBs抗原、灭活A型肝炎病毒抗原等。
作为目前使用的混合疫苗,可以列举白喉-百日咳-破伤风混合疫苗(DPT疫苗)、白喉-百日咳-破伤风-灭活脊髓灰质炎混合疫苗(DPT-IPV疫苗)、麻疹-风疹混合疫苗(MR疫苗)、麻疹-风疹-流行性腮腺炎疫苗(MMR)、流感菌b型-B型肝炎病毒疫苗、A型肝炎病毒-B型肝炎病毒疫苗、白喉-百日咳-破伤风-B型肝炎病毒-灭活脊髓灰质炎疫苗等,优选在这些混合疫苗的成分中追加作为本发明的肺炎球菌疫苗的成分的融合蛋白。
本发明的疫苗可以通过经口给药或非经口给药来给药。作为非经口给药,可以列举例如腹腔内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、静脉内给药、鼻腔内给药、经皮给药、经粘膜给药等。优选非经口给药,更优选皮内给药、皮下给药或肌肉内给药。
本发明的疫苗可以通过适当配合本发明的融合蛋白和药学上容许的载体以及添加剂而制成制剂。具体而言,可以制成片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浊剂、乳剂等经口给药用制剂;注射剂、输液剂、栓剂、软膏、巴布剂等非经口给药用制剂。关于载体或添加剂的配合比例,根据药品领域中通常采用的范围进行适当设定即可。能够配合的载体或添加剂没有特别限制,可以列举例如:水、生理盐水、以及水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体;赋形剂、粘合剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。
作为经口给药用的固体制剂中使用的添加剂,可以列举例如:乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、微晶纤维素、玉米淀粉等赋形剂;羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、偏硅酸铝酸镁等粘合剂;玉米淀粉等分散剂;纤维素乙醇酸钙等崩解剂;硬脂酸镁等润滑剂;谷氨酸、天冬氨酸等助溶剂;稳定剂;羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素等纤维素类、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等合成聚合物类等水溶性聚合物;白糖、糖粉、蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、还原麦芽糖糖浆、粉末还原麦芽糖糖浆、葡萄糖果糖糖浆、果糖葡萄糖糖浆、蜂蜜、山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、阿斯巴甜、糖精、糖精钠等甜味剂、白糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯等包衣剂等。
经口给药用的液体制剂可以通过溶解、悬浊或乳化在通常使用的稀释剂中而制成制剂。作为稀释剂,可以列举例如纯化水、乙醇、它们的混合液等。此外,该液剂可以含有润湿剂、助悬剂、乳化剂、甜味剂、风味剂、芳香剂、保存剂、缓冲剂等。
作为经口给药用的注射剂中使用的添加剂,可以列举例如:氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、葡萄糖、丙二醇等等渗剂;磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、tris缓冲液、谷氨酸缓冲液、ε-氨基己酸缓冲液等缓冲剂;对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等保存剂;羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇等增稠剂;亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等稳定剂;盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等pH调节剂等。另外,注射剂中,可以进一步配合适当的助溶剂,例如:乙醇等醇;丙二醇、聚乙二醇等多元醇;聚山梨醇酯80、聚氧化乙烯硬化蓖麻油50、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇等非离子表面活性剂等。注射剂等液体制剂也可以通过冷冻保存或冷冻干燥等除去水分后保存。冷冻干燥制剂在使用时加入注射用蒸馏水等再溶解后使用。
本发明的疫苗可以以具有免疫系统的所有动物(人、非人)作为给药对象。可以列举例如:人、猴、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠等哺乳动物;鸡、鸭、鹅等鸟类。本发明的疫苗优选以人的儿童和成人作为对象。
本发明的疫苗的给药次数和给药间隔没有特别限定。例如,可以单次给药,也可以以约2天~约8周的间隔多次给药。
疫苗给药量根据给药对象、给药方法等而异,优选将一次给药量设定为约0.01μg~约10mg,更优选设定为约0.1μg~约1mg,进一步优选设定为约1μg~约0.1mg。
本发明包括肺炎球菌感染症的预防或治疗方法,其包括对动物给用有效量的本发明的疫苗。
本发明的疫苗与以往的以荚膜多糖体作为抗原的结合肺炎球菌疫苗相比,在以下方面具有优势。
1)仅利用单一的融合蛋白抗原对广泛类型的肺炎球菌株显示出效果。
2)由于是蛋白质抗原,因此不需要与载体蛋白的融合步骤,生产成本低廉。
3)由于是蛋白质抗原,因此,在不存在载体蛋白的状态下,对儿童和成人均能够诱导感染防御免疫。
4)使用单一的融合蛋白,不需要混合多种抗原。
5)仅进行一种融合蛋白(疫苗抗原)的纯化即可,制造工艺容易,能够抑制制造成本。
本发明包含肺炎球菌疫苗,其特征在于,至少含有家族1支系2的PspA的全长或其片段以及选自由支系3、支系4和支系5组成的组中的家族2的PspA的全长或其片段。即,是至少含有支系2的PspA和支系3的PspA的肺炎球菌疫苗、至少含有支系2的PspA和支系4的PspA的肺炎球菌疫苗、至少含有支系2的PspA和支系5的PspA的肺炎球菌疫苗。本方式的肺炎球菌疫苗可以含有上述三种组合的PspA作为不同的蛋白质。本方式的肺炎球菌疫苗除了可以含有上述三种组合的PspA作为不同的蛋白质以外,可以与含有上述本发明的融合蛋白的肺炎球菌疫苗同样地实施。
在上述三种组合的PspA为不同的蛋白质的情况下,肺炎球菌疫苗所含有的PspA优选为以下的(i)~(iii)中的任意一种:
(i)仅家族1支系2和家族2支系3;
(ii)仅家族1支系2和家族2支系4;
(iii)仅家族1支系2和家族2支系5。
上述三种组合的PspA为不同的蛋白质的情况下,片段中含有的优选区域与上述融合蛋白中使用的片段相同。优选的表达PspA的肺炎球菌株的种类与融合蛋白的说明中记载的菌株相同。具体而言,作为支系2的PspA,优选包含与由序列号25表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质、包含与由序列号26表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。作为支系3的PspA,优选包含与由序列号27表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。作为支系4的PspA,优选包含与由序列号28表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。作为支系5的PspA,优选包含与由序列号29表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的蛋白质。
由序列号25表示的氨基酸序列为包含来源于D39的PspA(将氨基酸序列示于序列号30,将编码基因的碱基序列示于序列号31)的α-螺旋区的全长和脯氨酸富集区的全长的蛋白质,对应于D39的PspA的氨基酸序列(序列号30)的第32位~第401位。
由序列号26表示的氨基酸序列为包含来源于WU2的PspA(将部分氨基酸序列示于序列号32,将编码基因的碱基序列示于序列号33)的α-螺旋区的全长和脯氨酸富集区的全长的蛋白质,对应于WU2的PspA的部分氨基酸序列(序列号32)的第32位~第409位。
由序列号27表示的氨基酸序列为包含来源于TIGR4的PspA(将氨基酸序列示于序列号34,将编码基因的碱基序列示于序列号35)的α-螺旋区的全长和脯氨酸富集区的全长的蛋白质,相当于TIGR4的PspA的氨基酸序列(序列号34)的第32位~第524位。
由序列号28表示的氨基酸序列为包含来源于EF5668的PspA(将氨基酸序列示于序列号36,将编码基因的碱基序列示于序列号37)的α-螺旋区的全长和脯氨酸富集区的全长的蛋白质,对应于EF5668的PspA的氨基酸序列(序列号36)的第32位~第454位。
由序列号29表示的氨基酸序列为包含来源于ATCC6303的PspA(将部分氨基酸序列示于序列号38,将编码基因的碱基序列示于序列号39)的α-螺旋区的全长和脯氨酸富集区的全长的蛋白质,对应于ATCC6303的PspA的氨基酸序列(序列号38)的第32位~第461位。
包含与由序列号25~29中的任意一个表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质跟与由前述的序列号1表示的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列相同。
[多核苷酸]
本发明提供编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。多核苷酸可以以RNA(例如,mRNA)的形态或DNA的形态(例如,cDNA或基因组DNA)存在。多核苷酸可以为双链也可以为单链。在双链的情况下,可以为双链DNA、双链RNA或DNA与RNA的杂交中的任意一种。在单链的情况下,可以为编码链(有义链)或非编码链(反义链)中的任意一种。另外,本发明的多核苷酸可以融合于在其5’侧或3’侧编码标签识别物(标签序列或标志物序列)的多核苷酸中。此外,可以包含非翻译区域(UTR)的序列、载体序列(包含表达载体序列)等序列。
本发明的多核苷酸可以通过分别获得编码构成融合蛋白的两种以上的PspA的多核苷酸并将其结合来制作。编码构成融合蛋白的各PspA的多核苷酸可以分别通过公知的DNA合成法、PCR法等各自获得。具体而言,例如,可以基于构成本发明的融合蛋白的各PspA的氨基酸序列,适当选择各氨基酸的密码子来设计碱基序列,并使用市售的DNA合成机来进行化学合成。另外,从公知的数据库(GenBank等)获取编码目标PspA的基因的碱基序列信息(参考表1和表2的登记号),设计用于对编码期望的PspA的区域进行扩增的引物,以表达该PspA的肺炎球菌的基因组DNA作为模板进行PCR等,由此能够大量获得期望的DNA片段。在得到编码构成融合蛋白的各PspA的多核苷酸后,将其利用基因工程结合,由此可以制作本发明的多核苷酸。
作为编码包含由序列号1表示的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸,可以列举例如包含由序列号2表示的碱基序列的多核苷酸,但不限于此。作为编码包含由序列号3表示的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸,可以列举例如包含由序列号4表示的碱基序列的多核苷酸,但不限于此。作为编码包含由序列号5表示的氨基酸序列的融合蛋白的多核苷酸,可以列举例如包含由序列号6表示的碱基序列的多核苷酸,但不限于此。
[表达载体]
本发明提供用于制造上述本发明的融合蛋白的表达载体。本发明的表达载体只要包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸则没有特别限定,优选具有RNA聚合酶的识别序列的质粒载体(pSP64、pBluescript等)。作为表达载体的制作方法,可以列举使用质粒、噬菌体或柯斯质粒等的方法,没有特别限定。载体的具体种类没有限定,可以适当选择能够在宿主细胞中表达的载体。即,可以根据宿主细胞的种类,为了可靠地使本发明的多核苷酸进行表达,适当选择启动子序列,将其和本发明的多核苷酸各重组到各种质粒等中,将所得到的载体作为表达载体使用。可以将使用本发明的表达载体进行转化而得到的宿主进行培养、栽培或饲育后,通过惯用的方法(例如,过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等)从培养物等中回收本发明的融合蛋白并进行纯化。
表达载体优选含有至少一种选择性标志物。作为这样的标志物,对于真核生物细胞培养,可以列举二氢叶酸还原酶、新霉素抗性基因等,对于大肠杆菌(Escherichia coli)和其它细菌的培养,可以列举四环霉素抗性基因、安比西林抗性基因、卡那霉素抗性基因等。如果使用上述选择性标志物,则可以确认本发明的多核苷酸是否导入宿主细胞中,并进一步可以确认是否在宿主细胞中可靠地进行表达。
宿主细胞没有特别限定,可以优选使用以往公知的各种细胞。具体而言,可以列举例如:大肠杆菌等细菌、酵母(出芽酵母Saccharomycescerevisiae、裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe)、线虫(Caenorhabditiselegans)、光滑爪蟾(Xenopus laevis)的卵母细胞、动物细胞(例如,CHO细胞、COS细胞和Bowes黑色瘤细胞)等。将上述表达载体导入宿主细胞的方法、即转化法也没有特别限定,可以优选使用电穿孔法、磷酸钙法、溶菌酶法、DEAE葡聚糖法等以往公知的方法。
[转化体]
本发明提供导入有上述本发明的表达载体的转化体。本发明的转化体不仅包含细胞、组织或器官,也包含生物个体。另外,作为转化对象的生物也没有特别限定,可以列举作为上述宿主细胞例示的各种微生物、植物或动物。本发明的转化体可以适合用于本发明的融合蛋白的制造。这些转化体优选为稳定地表达本发明的融合蛋白的转化体,但也可以为瞬时性表达的转化体。
本发明还包含以下的各发明。
[1]一种融合蛋白,其特征在于,至少含有家族1的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段和家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段。
[2]如上述[1]所述的融合蛋白,其为以下的(1)~(3)中的任意一种:
(1)包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(2)包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(3)包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白。
[3]如上述[1]或[2]所述的融合蛋白,其特征在于,家族2的肺炎球菌表面蛋白A为支系3。
[4]如上述[1]所述的融合蛋白,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段至少含有脯氨酸富集区的全部或一部分。
[5]如上述[4]所述的融合蛋白,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段含有脯氨酸富集区的全部或一部分和与其相邻的α-螺旋区的全部或一部分。
[6]如上述[1]所述的融合蛋白,其特征在于,包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
[7]一种多核苷酸,其编码上述[1]~[6]中任一项所述的融合蛋白。
[8]一种表达载体,其包含上述[7]所述的多核苷酸。
[9]一种转化体,其导入有上述[8]所述的表达载体。
[10]上述[1]~[6]中任一项所述的融合蛋白在制造肺炎球菌疫苗中的应用。
[11]一种肺炎球菌疫苗,其特征在于,包含上述[1]~[6]中任一项所述的融合蛋白。
[12]如上述[11]所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,还包含佐剂。
[13]一种肺炎球菌感染症的预防或治疗方法,其包括:对动物给用有效量的上述[1]~[6]中任一项所述的融合蛋白。
[14]用于肺炎球菌感染症的预防或治疗的上述[1]~[6]中任一项所述的融合蛋白。
[实施例]
以下,通过实施例对本发明详细进行说明,但本发明不限于此。
[实施例1:融合PspA蛋白质的制作]
使用来源于表3所示的肺炎球菌中的D39、TIGR4、EF5668、ATCC6303和WU2的PspA,制作图2(A)、(B)和(C)所示的三种融合PspA蛋白质。全部的基因克隆操作使用E.coli DH5α进行。E.coli DH5α在LB培养基(1%细菌蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl)中进行培养,需要时,向LB培养基中添加卡那霉素以使终浓度为30μg/ml。
[表3
UAB:University of Alabama at Birmingham,USA.
使用表4所示的引物,以各菌株的基因组DNA作为模板,通过PCR对各菌株的PspA的编码N末端侧的α-螺旋区和脯氨酸富集区的DNA片段进行扩增,将所得到的PCR产物插入pET28a(+)载体中,从而制作融合PspA蛋白质表达载体。具体而言如下所述。
[表4]
将在5’末端侧添加有限制性酶NdeI识别序列、在3’末端侧添加有EcoRI识别序列的来源于肺炎球菌D39(引物P1和P2)或TIGR4(引物P7和P8)的PspA PCR产物插入到pET28a(+)载体的限制性酶切断部位NdeI和EcoRI识别位点。然后,在插入有来源于D39的PspA的pET28a(+)载体的限制性酶EcoRI和XhoI识别位点分别插入在5’末端侧添加有限制性酶EcoRI识别序列、在3’末端侧添加有XhoI识别序列的来源于肺炎球菌EF5668(引物P3和P4)或ATCC6303(引物P5和P6)的PspA PCR产物,从而制作表达来源于D39和EF5668的PspA融合蛋白PspA2+4、D39和ATCC6303 PspA融合蛋白PspA2+5的两种表达载体。另外,在插入有来源于TIGR4的PspA PCR产物的pET28a(+)载体的限制性酶EcoRI和XhoI识别位点插入在5’末端侧添加有限制性酶EcoRI识别序列、在3’末端侧添加有XhoI识别序列的来源于WU2(引物P9和P10)的PspA PCR产物,从而制作表达来源于TIGR4和WU2的PspA融合蛋白PspA3+2的载体。对于这三种融合基因(PspA2+4基因、PspA2+5基因和PspA3+2基因),利用DNA测序仪分别确认碱基序列,确认到分别为由序列号2、4和5表示的碱基序列。
将制作的各融合PspA蛋白质表达载体分别转化到E.coliBL21(DE3)中,并将其在含有卡那霉素30μg/ml的LB培养基中在37℃下进行振荡培养。在吸光度OD600nm达到约0.8的培养液中添加IPTG(终浓度0.5mM),再继续进行3小时的振荡培养,使融合PspA蛋白质大量表达。从回收的菌体中提取融合PspA蛋白质,使用N末端存在的聚组氨酸标签,通过Ni2+亲和色谱法和凝胶过滤法进行纯化。通过SDS-PAGE(参照图3A)和使用抗PspA抗体的免疫蛋白印迹(参照图3B),确认了纯化后的融合蛋白为目标融合蛋白。
[实施例2:融合PspA蛋白质免疫血清中IgG与各PspA支系肺炎球菌表面的结合能力]
(1)利用融合PspA蛋白质的小鼠的免疫
将融合PspA蛋白质(PspA2+4、PspA2+5或PspA3+2)0.1μg和佐剂(CpGK32.5μg和Alum 5.0μg)利用不含LPS的PBS进行制备,皮下接种到6周龄的雌性C57/BL6j小鼠中。每个相同免疫组,使用5只小鼠。接种每隔1周进行1次共计进行3次。从末次免疫(第3次接种)起1周后采血,得到血清。
(2)免疫血清中IgG与肺炎球菌表面的结合能力的测定
肺炎球菌使用PspA支系1~6这六种。具体而言,使用BG9739作为支系1的菌株,使用WU2作为支系2的菌株,使用TIGR4作为支系3的菌株,使用KK1162作为支系4的菌株,使用ATCC6303作为支系5的菌株,使用BG6380作为支系6(参照表3)。肺炎球菌在THY培养基(用0.5%酵母提取物补充的Todd-Hewitt肉汤)中进行培养,在对数增殖期的培养液中添加甘油以使终浓度达到25%,将其在-80℃下冷冻保存,使用该保存物。
将在血液琼脂培养基中培养过夜的肺炎球菌株在血液琼脂培养基中进行4~5小时的传代培养后,利用PBS收集肺炎球菌。使约107CFU的肺炎球菌溶液90μl与10μl的免疫血清(相同免疫组的混合血清)在37℃下反应30分钟。然后,使其与FITC标记的抗小鼠IgG山羊抗体反应,然后清洗并离心,通过流式细胞法测定与菌体结合的荧光强度。
(3)结果
将结果示于图4。关于结合率,将每10000个菌数中的免疫血清中IgG结合菌数用%表示。PspA3+2的免疫血清对支系1~5中的任意一种支系的肺炎球菌株均显示出高结合性。PspA2+4和PspA2+5的免疫血清对支系3的TIGR4显示出稍低的结合性,但对除此以外的支系的肺炎球菌株显示出高结合性。PspA2+5对于支系6的BG6380显示出高结合性。
[实施例3:利用融合PspA蛋白质免疫的小鼠致死的肺炎模型中的感染防御效果]
(1)实验方法
通过与实施例2同样的方法对小鼠进行融合PspA蛋白质的免疫。以单独给用佐剂的小鼠作为阴性对照。在末次免疫(第3次接种)的2周后,对小鼠经鼻接种表达PspA的支系1~5的以下的肺炎球菌株(参照表3),从而制作小鼠致死的肺炎模型。对于一只小鼠,使其感染2×107CFU的致死的菌量的BG9739(支系1)、2×107CFU的致死的菌量的WU2(支系2)、5×106CFU的致死的菌量的TIGR4(支系3)、1×108CFU的致死的菌量的KK1162(支系4)、5×105CFU的致死的菌量的ATCC6303(支系5)。1组的只数为10只或8只(BG9739感染组的PspA2+5组、KK1162感染组的阴性对照组和PspA3+2组、ATCC6303感染组的阴性对照组)。
对免疫小鼠感染肺炎球菌后,对其存活率进行观察2周。对于存活率的差异,使用Kaplan-Meier log-rank test进行分析。P值小于0.05时,具有显著差异。
(2)结果
将结果示于图5。图5中的*表示将疫苗给药组中的小鼠的存活率与佐剂给药组进行比较而显示出显著差异、P值小于0.05的情况,**表示在同样的比较中显示出显著差异、P值小于0.01的情况。(A)是BG9739(支系1)的结果,(B)是WU2(支系2)的结果,(C)是TIGR4(支系3)的结果,(D)是KK1162(支系4)的结果,(E)是ATCC6303(支系5)的结果。利用PspA3+2的免疫小鼠中,在使其感染PspA支系1~5的肺炎球菌株中的任意一种的情况下,均观察到显著的存活率的改善。利用PspA2+4的免疫小鼠和利用PspA2+5的免疫小鼠中,在使其感染PspA支系2、4或5的肺炎球菌株的情况下,观察到显著的存活率的改善。
[实施例4:免疫血清中IgG与临床分离肺炎球菌株的结合能力的测定]
(1)实验方法
使用实施例2中得到的各融合PspA蛋白质的免疫血清,测定免疫血清中IgG与临床分离肺炎球菌株的结合能力。除了将对象菌株变更为临床分离肺炎球菌株以外,与实施例2同样地进行。
另外,临床分离肺炎球菌株的PspA家族和支系的鉴定方法以下述方式进行。即,使用下述的引物LSM12和SKH2,以各临床分离肺炎球菌株的基因组DNA作为模板进行PCR,并进行PCR产物的序列分析。将脯氨酸富集区的上游约400bp的碱基序列与已鉴定了家族和支系的PspA的碱基序列进行比较来进行鉴定(参考文献:Pimenta FC,Ribeiro-Dias F,Brandileone MC et al.2006.Genetic diversity of PspAtypes among nasopharyngeal isolates collected during an ongoingsurveillance study of children in Brazil.J Clin Microbiol.44:2838-43.)。
LSM12:CCGGATCCAGCGTCGCTATCTTAGGGGCTGGTT(序列号17)
SKH2:CCACATACCGTTTTCTTGTTTCCAGCC(序列号18)
(2)评价标准和结果
如上所述,免疫血清中IgG对肺炎球菌菌体表层存在的PspA蛋白质的结合对于感染防御效果而言是必须的,因此,以与肺炎球菌的IgG结合能力作为基准,评价各融合PspA蛋白质对各种临床分离肺炎球菌株的覆盖率。
将结果示于图6。图6中,括弧内表示使用的临床分离肺炎球菌株的血清型和PspA支系。对于(A)的利用PspA2+4的免疫血清、(B)的利用PspA2+5的免疫血清、(C)的利用PspA3+2的免疫血清中的任意一种而言,均显示出对几乎全部临床分离肺炎球菌株(97.0%)的IgG结合能力(结合率10%以上)。
[实施例5:PspA蛋白质免疫血清中的抗PspA抗体效价的测定]
(1)各支系的PspA抗原蛋白质的制作
将包含支系1~5的各PspA的α-螺旋区和脯氨酸富集区的蛋白质制作成重组蛋白质,作为抗原蛋白质。使用来源于BG9739的PspA作为支系1,使用来源于D39的PspA作为支系2,使用来源于TIGR4的PspA作为支系3,使用来源于EF5668的PspA作为支系4,使用来源于ATCC6303的PspA作为支系5。各支系的PspA抗原蛋白质的表达载体以下述方式制作。
即,将在5’末端侧添加有限制性酶NdeI识别序列、3’末端侧添加有XhoI识别序列的编码α-螺旋区和脯氨酸富集区的DNA片段通过PCR进行扩增。作为PCR引物,BG9739使用引物P11和P12,D39使用引物P1和P13,TIGR4使用引物P7和P14,EF5668使用引物P15和P4,ATCC6303使用引物P7和P6。将所得到的PCR产物插入到pET28a(+)载体的限制性酶切断部位NdeI和XhoI识别位点。将这些载体分别转化到E.coli BL21(DE3)中,将其在含有卡那霉素30μg/ml的LB培养基中在37℃下进行振荡培养。在吸光度OD600nm达到约0.8的培养液中添加IPTG(终浓度0.5mM),再继续进行3小时的振荡培养,使PspA抗原蛋白质大量表达。从回收的菌体中提取PspA抗原蛋白质,使用N末端存在的聚组氨酸标签,通过Ni2+亲和色谱法和凝胶过滤法进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫蛋白印迹,确认了纯化后的PspA抗原蛋白质为目标蛋白质。
(2)利用抗原进行的小鼠的免疫
抗原使用通过上述得到的支系2的PspA抗原蛋白质(PspA2)、支系3的PspA抗原蛋白质(PspA3)和实施例1中制作的融合PspA蛋白质(PspA3+2)。将6周龄的雌性的C57/BL6j小鼠分为以下5组,每组5只。
·PspA3+PspA2给药组(给用PspA30.05μg、PspA20.05μg和佐剂)
·PspA3+2给药组(给用PspA3+20.1μg和佐剂)
·PspA2给药组(给用PspA20.1μg和佐剂)
·PspA3给药组(给用PspA30.1μg和佐剂)
·PspA3+2给药组(给用PspA3+24.0μg)
佐剂使用CpGK32.5μg和Alum 5.0μg。利用不含LPS的PBS制备抗原溶液,皮下接种到小鼠中。接种每隔1周进行1次共计进行3次。从末次免疫(第3次接种)起1周后采血,得到血清。
(3)ELISA
将各支系的纯化PspA抗原蛋白质制备为5μg/ml,在96孔板中以100μl/孔进行添加。将其在4℃下静置过夜,并将抗原涂布到板上。将板用PBST(含有0.05%Tween20的PBS)进行清洗,将梯度稀释后的免疫血清样品以50μl/孔进行添加,并在37℃下静置30分钟。接着,将各孔用PBST进行清洗,将稀释至2000倍的碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体以100μl/孔进行添加,并在室温、遮光下静置45分钟。然后,测定OD405nm的吸光度。将减去阴性对照的吸光度而得到的吸光度达到0.1的稀释倍率用Log2表示,将其作为血清中含有的抗PspA抗体效价。
(4)结果
将结果示于图7。PspA2单独时,对支系3的抗体效价低,PspA3单独时,对支系1、2、4和5的抗体效价低。并用PspA2与PspA3时,对支系1~5中的任意一种支系均显示出高的抗体效价。PspA2与PspA3的融合蛋白(PspA3+2)与PspA2与PspA3的并用相比,对于任意一种支系均显示出同等或更高的抗体效价。此外,PspA2与PspA3的融合蛋白(PspA3+2)即使不并用佐剂也能够以高浓度进行免疫,由此可知,对于任意一种支系均显示出高的抗体效价。由该结果表明,融合PspA蛋白质与以单独的蛋白质的方式给药相比得到同等或更高的抗体效价,并且,即使不并用佐剂也能得到高的抗体效价,因此,作为肺炎球菌疫苗的抗原是非常有用的。
[实施例6:佐剂的研究(之一)]
对并用CpG和Alum或单独使用CpG作为佐剂时的效果进行研究。
(1)小鼠的免疫
抗原使用实施例1中制作的三种融合PspA蛋白质(PspA2+4、PspA2+5、PspA3+2),佐剂并用CpG和Alum或单独使用CpG。设置以下的6组。
·PspA2+40.1μg+CpGK32.5μg
·PspA2+40.1μg+CpGK32.5μg+Alum 5.0μg
·PspA2+50.1μg+CpGK32.5μg
·PspA2+50.1μg+CpGK32.5μg+Alum 5.0μg
·PspA3+20.1μg+CpGK32.5μg
·PspA3+20.1μg+CpGK32.5μg+Alum 5.0μg
利用不含LPS的PBS制备抗原溶液,皮下接种到小鼠中。接种每隔1周进行1次共计进行3次。从末次免疫(第3次接种)起1周后采血,得到血清。
(2)ELISA
通过与实施例5同样的方法进行ELISA,求出血清中含有的抗PspA抗体效价。
(3)结果
将结果示于图8。图8中的*表示含有Alum组对相同支系的PspA抗原的抗体效价与不含Alum组相比显著高、P值小于0.05的情况,**表示在同样的比较中显著高、P值小于0.01的情况。对于PspA2+4而言,在不含Alum的条件下,对支系2、4、5的抗体效价高,对支系1、3的抗体效价低,但通过添加Alum,观察到对支系1、3的抗体效价的提高。对于PspA2+5而言,在不含Alum的条件下,对支系1、3的抗体效价特别低,即使添加Alum,对支系3的抗体效价也仍然为低值。对于PspA3+2而言,在不含有Alum的条件下,对支系1的抗体效价为低值,但通过添加Alum,观察到对全部支系的高的抗体效价。由该结果可知,在本条件下下,通过添加Alum,确认到对PspA的特异抗体效价的提高,另外,融合型PspA诱导对全部支系的PspA的高的特异抗体效价。
[实施例7:佐剂的研究(之二)]
对单独使用Alum而非并用CpG与Alum作为佐剂时的效果进行研究。
(1)小鼠的免疫
抗原使用实施例1中制作的融合PspA蛋白质(PspA3+2),佐剂使用Alum。设置以下的3组。
·PspA3+20.1μg+Alum 5.0μg
·PspA3+20.1μg+Alum 25.0μg
·PspA3+20.1μg+Alum 50.0μg
利用不含LPS的PBS制备抗原溶液,皮下接种到小鼠中。接种每隔1周进行1次共计进行3次。从末次免疫(第3次接种)起1周后采血,得到血清。
(2)ELISA
通过与实施例5同样的方法进行ELISA,求出血清中含有的抗PspA抗体效价。
(3)结果
将结果示于图9。即使单独使用Alum,对支系1~5中的任意一种支系也均显示出高的抗体效价。另外,即使将给药量设为与并用的情况相同的5.0μg,也显示出与并用的情况大致同等的抗体效价。
[参考例1:日本的临床分离肺炎球菌中存在的PspA家族的分布]
对在日本分离出的来源于成人侵袭性肺炎球菌感染症的肺炎球菌73株的PspA家族和支系的分布进行了考察。PspA家族和支系的鉴定与实施例4所述的方法同样,通过将脯氨酸富集区的上游约400bp的碱基序列与家族和支系已进行了鉴定的PspA的碱基序列进行比较来进行。
将结果示于表5。145株中,145株具有PspA家族1或2。另外,具有由成人用23价肺炎球菌疫苗PPV23(23-valent pneumococcalpolysaccharide vaccine)覆盖的血清型的分离株为126株(86.9%),具有由PCV7和PCV13覆盖的血清型的分离株分别为57株(39.3%)、108株(74.5%)。
需要说明是的,本发明不限于上述的各实施方式和实施例,在权利要求书所示的范围内可以进行各种变更,将在不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包括在本发明的技术范围内。另外,本说明书中记载的学术文献和专利文献全部作为参考援引于本说明书中。
Claims (13)
1.一种肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有融合蛋白,所述融合蛋白至少包含家族1的肺炎球菌表面蛋白A(其中,不包括来源于肺炎球菌Rx1株的肺炎球菌表面蛋白A和来源于肺炎球菌St435/96株的肺炎球菌表面蛋白A)的全长或其片段和家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段。
2.如权利要求1所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,家族1的肺炎球菌表面蛋白A为支系2。
3.如权利要求2所述的肺炎球菌疫苗,其中,融合蛋白为以下的(1)~(3)中的任意一种:
(1)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(2)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白;
(3)至少包含家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A的融合蛋白。
4.如权利要求3所述的肺炎球菌疫苗,其中,融合蛋白为以下的(4)~(6)中的任意一种:
(4)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白;
(5)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白;
(6)由家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A和家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A构成的融合蛋白。
5.如权利要求1~4中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段至少包含脯氨酸富集区的全部或一部分。
6.如权利要求5所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,肺炎球菌表面蛋白A的片段由脯氨酸富集区的全部或一部分和与其相邻的α-螺旋区的全部或一部分构成。
7.如权利要求2所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A来源于选自由D39、WU2、E134、EF10197、EF6796、BG9163和DBL5组成的组中的肺炎球菌株。
8.如权利要求3所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,表达家族2支系3的肺炎球菌表面蛋白A的肺炎球菌来源于TIGR4、BG8090或AC122,家族2支系4的肺炎球菌表面蛋白A来源于EF5668、BG7561、BG7817或BG11703,家族2支系5的肺炎球菌表面蛋白A来源于ATCC6303或KK910。
9.如权利要求1所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,融合蛋白包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
10.一种肺炎球菌疫苗,其特征在于,至少含有家族1支系2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段以及选自由支系3、支系4和支系5组成的组中的家族2的肺炎球菌表面蛋白A的全长或其片段。
11.如权利要求10所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,所含有的肺炎球菌表面蛋白A为以下的(i)~(iii)中的任意一种:
(i)仅家族1支系2和家族2支系3;
(ii)仅家族1支系2和家族2支系4;
(iii)仅家族1支系2和家族2支系5。
12.如权利要求1~11中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有佐剂。
13.如权利要求1~12中任一项所述的肺炎球菌疫苗,其特征在于,含有抗肺炎球菌以外的病原体的疫苗成分。
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