WO2016204265A1 - 肺炎球菌補体依存性殺菌能測定方法 - Google Patents

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capsular
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pneumococcal
pspa
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幸宏 明田
浩 宮武
貞玉 朴
ゆか 古泉
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一般財団法人阪大微生物病研究会
国立大学法人大阪大学
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    • G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • G01N2333/3156—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring pneumococcal complement-dependent bactericidal ability.
  • Streptococcus pneumoniae is a major respiratory pathogenic bacterium and is a frequently isolated bacterium that causes pneumonia. Streptococcus pneumoniae affects invasive infections (invasive pneumococcal disease: IPD), community-acquired Pneumonia (CAP), and medical care-related pneumonia (Nursing and). healthcare associated pneumonia (NHCAP). Streptococcus pneumoniae has a capsule made of polysaccharides that are pathogenic and important on the outside of the cell body. The serotype of capsular serotypes is more than 93 belonging to 21 groups and 25 singles. It is classified into 118 types or more in total. This capsule serves as a barrier, and the bacterium is highly resistant to phagocytosis by human multinucleated leukocytes.
  • PCV13 13-valent pneumococcal conjugate vaccine
  • PV23 23-valent capsular polysaccharide vaccine
  • Pneumococcal surface protein A which is one of the pneumococcal surface protein antigens, has been attracting attention as a novel pneumococcal vaccine antigen for the purpose of compensating for the drawbacks of the current pneumococcal vaccine as described above.
  • PspA Pneumococcal surface protein A
  • PspA is roughly classified into three families according to the amino acid sequence of the clade definition region at the N-terminus, and further classified into six subgroups called clades.
  • PspA The PspA family of Streptococcus pneumoniae isolated from the clinic accounts for 98% or more in families 1 and 2.
  • PspA acts as a virulence factor has been reported to inhibit the binding of complement C 3 to pneumococcal cell surface. It has been reported that anti-PspA-specific antibodies act antagonistically with respect to the complement inhibitory activity of PspA and exhibit infection-protecting activity against this bacterium. This protective activity is also caused by antibodies that cross-recognize different PspA families. Since there is diversity in the cross-reactivity of different PspAs, it is considered important for the development of vaccines based on PspA to select clade combinations belonging to family 1 and family 2 that exhibit broader cross-reactivity. .
  • CbpA Choolin binding protein A
  • PsaA Pierisococcal surface adhesion A
  • CbpA Choline binding protein A
  • PsaA Pneumococcal surface adhesion A
  • CbpA is a choline binding protein and is detected in about 75% of all pneumococcal strains.
  • CbpA binds to an immunoglobulin receptor on the surface of epithelial cells or mucosal cells
  • Streptococcus pneumoniae is taken into the cells, and then transcytosised into the living body
  • PsaA is a protein present in all serotypes of Streptococcus pneumoniae, and is an important factor for adhesion to host cells as well as other bacterial adhesion molecules (Non-patent Document 2).
  • Serotype-specific IgG concentration by ELISA method and serotype-specificity by multiplex opsonization assay (MOPA) for the purpose of evaluating immune induction ability (immunogenicity) of pneumococcal vaccine and humoral immunity of patients suffering from pneumococcal infection Measurement of opsonic activity is possible.
  • the serotype-specific IgG concentration measurement by the ELISA method is based on the CPS of individual serotypes immobilized on ELISA plates after absorption of antibodies against the common antigens of pneumococci in the serum [cell wall polysaccharide and 22F capsular polysaccharide (CPS)].
  • Non-patent Document 3 the serotype-specific IgG concentration ⁇ 0.20 ⁇ g / ml (3rd generation ELISA) as the protective threshold for mass infection of pediatric 7-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) against invasive pneumococcal infection (IPD) in children Is shown (Non-Patent Document 4).
  • PCV7 pneumococcal conjugate vaccine
  • IPD invasive pneumococcal infection
  • the present invention relates to a method for measuring complement-dependent bactericidal ability against pneumococci, and an object of the present invention is to provide a method for measuring activity that can be measured against any capsular serotype of pneumococci.
  • complement-dependent pneumococci using capsular-deficient pneumococci, i.e., non-capsular or non-capsular pneumococci, or transparent pneumococci
  • OPA sterilizing ability
  • the present invention comprises the following. 1. Complement-dependent bactericidal ability measurement method of Streptococcus pneumoniae-specific antibody against Streptococcus pneumoniae, comprising the following steps 1) to 3): 1) A step of mixing a capsular-deficient pneumococci (a) and a sample (b) containing a pneumococcal specific antibody; 2) Step of further adding complement component (c) and phagocytic cell (d) after step 1); 3) A step of determining the concentration of the sample (b) at which a certain amount of bacteria in the capsular-deficient pneumococcus (a) is killed after the step 2). 2. 2.
  • the capsular-deficient pneumococci (a) is a capsular-deficient pneumococcus derived from any of the pneumococci selected from the WU2, D39, KK1162, ATCC6303, BG9739, TIGR4, and EF5668 strains. 5.
  • the measurement method according to any one of items 1 to 5, wherein the phagocytic cell (d) in the step 1) is an HL-60-derived cell. 7).
  • the complement-dependent bactericidal effect can be easily and effectively confirmed regardless of the serotype of the capsule of infected pneumococci.
  • the opsonin activity measured by the method of the present invention can be used as a surrogate marker for a vaccine using a pneumococcal surface protein. Thereby, it becomes possible to provide a certain evaluation about the effectiveness of the vaccine using the surface protein of pneumococcus irrespective of the serotype of the pneumococcal capsule.
  • Example 1 It is a figure which shows the one aspect
  • Example 1 It is a figure which shows the opsonin activity with respect to the Streptococcus pneumoniae R6 strain
  • Example 1 It is a figure which shows the opsonin activity with respect to the Streptococcus pneumoniae R6 strain
  • Example 1 It is a figure which shows the opsonin activity with respect to the Streptococcus pneumoniae R6 strain
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having measured the amount of anti- PspA-IgG contained in the IgG fraction purified from human plasma and the anti-PspA-IgG fraction.
  • Test example It is a figure which shows the result of having measured the amount of anti-capsular (serotype 3) IgG, the amount of anti-CbpA IgG, and the amount of anti-PsaA IgG contained in the IgG fraction purified from human plasma and the anti-PspA IgG IgG fraction. (Test example)
  • the present invention relates to a method for measuring complement-dependent bactericidal ability of Streptococcus pneumoniae-specific antibodies against Streptococcus pneumoniae, comprising the following steps 1) to 3). 1) A step of mixing a capsular-deficient pneumococci (a) and a sample (b) containing a pneumococcal specific antibody; 2) Step of further adding complement component (c) and phagocytic cell (d) after step 1); 3) A step of determining the concentration of the sample (b) at which a certain amount of bacteria in the capsular-deficient pneumococcus (a) is killed after the step 2).
  • the above measurement method relates to a modification of the so-called opsonophagocytic killing assay (OPA).
  • the “capsular-deficient pneumococci (a)” refers to pneumococci that are thin or non-capsular in comparison with normal capsular pneumococci, such as non-capsular pneumococci And transparent pneumococci.
  • the capsule may be completely deficient, or even if there is a capsule, the surface protein should be sufficiently exposed.
  • the capsular-deficient pneumococci may be artificially prepared or capsular-deficient pneumococci obtained from the natural world. Artificially, non-capsular pneumococci can be produced by artificial deletion of genes related to capsular synthesis and addition of antibiotics, and drugs such as xylitol and capsular are degraded in the culture system.
  • Transparent pneumococci can be produced by a method of adding an enzyme, shaking culture, or the like.
  • non-capsular pneumococci include Streptococcus pneumoniae R6.
  • capsular serotype D39 strain, type 3 WU2, KK1162 strain, ATCC6303 strain, type 4 BG9739 strain, TIGR4 strain EF5668 strain or the like can be used as a derived strain.
  • the “constant amount” means 0 to 100% of the amount of capsular deficient pneumococci added to the complement-dependent bactericidal ability measurement system. There is no particular limitation as long as it is a certain amount specified between them. Specifically, for example, the amount of bacteria specified as 60%, 50%, 40%, 30% or 20% of the capsular-deficient pneumococci (a) of the present invention is mentioned, and particularly preferably 50% 60% applies.
  • complement-dependent bactericidal activity measuring method of the present invention 60%, 50%, 40%, 30% or 20%, particularly preferably 50% or 60% of the capsular-deficient pneumococci (a) Complement-dependent bactericidal ability can be measured by measuring the concentration of the dying sample.
  • sample (b) refers to a sample that is applied to the complement-dependent bactericidal ability measurement method of the present invention, and specifically refers to a sample that is used to measure opsonization activity.
  • any sample may be used as long as it may contain a pneumococcal specific antibody, and is not particularly limited.
  • a sample that may contain such pneumococcal specific antibody a blood sample collected from a subject administered with a pneumococcal vaccine, or a blood sample collected from a subject that may be infected with pneumococci Can be mentioned.
  • the blood sample may be a sample derived from blood, and may be serum or plasma.
  • the sample may be a sample that can be used for a normal clinical test that is used after processing blood collected during a clinical test.
  • the subject may be a vertebrate such as a human or a mouse, and is particularly preferably a human.
  • the complement-dependent bactericidal ability can be measured for the pneumococcal specific antibody in the sample by reacting the pneumococcal specific antibody and the complement in the sample.
  • the “complement component (c)” that can be used may be any complement that can be used for measuring the complement-dependent bactericidal ability of pneumococcal specific antibodies against pneumococci. If it is such a complement, a commercially available complement reagent can be used. For example, according to the protocol of Protocol for a multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA, reference 2) for antibodies against Streptococcus pneumoniae Version E.02, December 2014 (www.vaccine.uab.edu) Can be used.
  • UAB-MOPA multiplexed opsonophagocytic killing assay
  • the concentration of complement used is the above-mentioned step 1) compared to the case where the concentration of complement component (c ′) used when measuring using capsular (Opaque) pneumococci (a ′) is 1.
  • the amount of the complement component (c) used may be 1/400 to 1/100, preferably 3/400. Specifically, it can be set to 1/400 to 1/100, preferably 3/400, of the use concentration shown in Pelfreez 3-4 week baby rabbit complement, sterile (manufactured by Pelfreez).
  • the phagocytic cell (d) is not particularly limited as long as it is a phagocytic cell applicable to the measurement of complement-dependent bactericidal ability.
  • Examples of commonly used phagocytic cells include, but are not limited to, human leukemia-derived HL-60-derived cells that have induced phagocytic ability.
  • the immunogenicity of pneumococcal vaccine can be examined by the method for measuring the complement-dependent bactericidal ability of pneumococcal specific antibodies of the present invention against pneumococci.
  • immunogenicity of pneumococcal vaccine refers to immunity-inducing ability such as antibody production and cellular immunity induced by pneumococcal vaccine, and may be opsonization activity (opsonization op index; OI) .
  • Opsonin activity measured by the method of the present invention can be used as a surrogate marker for vaccines.
  • the “pneumococcal vaccine” applicable to the complement-dependent bactericidal activity measuring method of the present invention may be a known “pneumococcal vaccine” or any “pneumococcal vaccine” to be developed in the future. Also good.
  • a pneumococcal vaccine specified in International Publication No. 2014/045621 can be used, and a pneumococcal vaccine targeting a newly developed surface protein can be evaluated.
  • OPA complement-dependent bactericidal activity measurement
  • the incubation conditions in step 1) can be room temperature, for example, 10 to 35 ° C., 15 to 60 minutes, preferably 30 minutes.
  • the culture conditions in step 2-1) can be 30 to 180 minutes, preferably 40 to 80 minutes, more preferably 45 to 75 minutes at 37 ⁇ 1 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the culture conditions in step 2-2) can be 6 to 48 hours, preferably 6 to 24 hours, more preferably 16 hours at 37 ⁇ 1 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • optimum conditions in the measurement system can be appropriately selected.
  • the buffer solution and medium used in the measurement of complement-dependent bactericidal ability of the present invention may be a buffer solution or medium known per se, or an applicable buffer solution or medium developed in the future, and is particularly limited. It is not a thing. Specifically, Protocol for a multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-) except for applying the matter specified in the present invention to the amount of capsular-deficient pneumococci (a) or complement component (c) used in the present invention.
  • UAB- multiplexed opsonophagocytic killing assay
  • MOPA reference 2 for antibodies against Streptococcus pneumoniae Version E.02, December 2014 (www.vaccine.uab.edu)
  • Opsonin activity of mouse immune serum Opsonin activity (OPA) of anti-PspA clade2 mouse immune serum or anti-PspA clade3 mouse immune serum was measured by the following method (see FIG. 1).
  • Anti-PspA clade2 mouse immune serum or anti-PspA clade3 mouse immune serum was used as a sample.
  • Capsule-deficient pneumococci non-capsular pneumococcus R6 strain
  • the anti-PspA clade3 serum is also a serum obtained from a mouse immunized with PspA clade3 shown in paragraph 0065 of WO2014 / 045621 as an antigen.
  • mice C57 / BL6j mice (6-8 weeks old, female) were mixed with 0.1 ⁇ g of PspA clade2 or PspA clade3 as an antigen, 2.5 ⁇ g of adjuvant CpGK3 and 5 ⁇ g of Alum, and the mice were inoculated subcutaneously. Inoculation was carried out three times every week, and whole blood was collected one week after the final immunization to obtain immune serum.
  • Phagocytic cells Human leukemia-derived HL-60 cells were cultured in CM1 medium (RPMI1640 500 ml, non-immobilized FBS 50 ml, GlutaMax-1 5 ml, penicillin / streptomycin 5 ml) at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2. Thereafter, the medium is changed to a differentiation medium (RPMI 1640 500 ml, non-immobilized FBS 50 ml, GlutaMax-1 5 ml, DMF (dimethyl formamide) 4.55 ml) to induce differentiation.
  • CM1 medium RPMI1640 500 ml, non-immobilized FBS 50 ml, GlutaMax-1 5 ml, penicillin / streptomycin 5 ml
  • DMF dimethyl formamide
  • HL-60 cells 4-5 days after the start of culture are washed with HBSS (without Ca ++ , Mg ++ ), and then washed with HBSS (with Ca ++ , Mg ++ ).
  • the resulting cell, OBB liquid distilled water 32ml, 10xHBSS (with Ca ++, Mg ++) 4ml, 1% gelatin 4ml, inactivated FBS 2.12ml
  • OBB liquid distilled water 32ml, 10xHBSS (with Ca ++, Mg ++) 4ml, 1% gelatin 4ml, inactivated FBS 2.12ml
  • step 1) 20 ⁇ l of sample (b) was added to each well of a 96-well microplate seeded with 500 CFU of pneumococcal R6 strain (a) and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • step 2) 10 ⁇ l of complement component (c) (final concentration: 0.75%) is added, and 4 ⁇ 10 5 cells of phagocytic cells (d) are added, and in the presence of 5% CO 2 , 37 Incubating at 75 ° C. for 75 minutes; 2-2)
  • the reaction solution of the above step 2-1) was added to 10 ⁇ l of an agar medium and cultured at 37 ° C. for 16 hours in the presence of 5% CO 2 .
  • FIG. 2 The results are shown in FIG. 2 and FIG.
  • the opsonin activity was examined using the anti-PspA clade2 mouse immune serum obtained in (b) above.
  • an opsonin activity of 70 times or more was observed for the test bacteria compared to the non-immune serum.
  • FIG. 3 the opsonin activity of anti-PspA mouse immune serum (PspA clade2 or clade3) against the test bacteria (pneumococcal R6 strain, PspA clade2) was examined.
  • anti-PspA clade2 mouse immune sera showed antigen-specific opsonin activity against the test strain, but anti-PspA clade3 mouse immune sera did not show any opsonin activity, and this test was antigen-specific. It became clear that opsonin activity could be measured.
  • Example 2 Opsonin activity using human anti-PspA IgG
  • opsonin activity was measured for a sample containing human anti-PspA IgG.
  • the fraction obtained by purifying anti-PspA IgG from human plasma by affinity chromatography using PspA clade2 protein was used as sample (b), and opsonin activity (OPA) was measured by the following method.
  • Capsule-deficient pneumococci non-capsular pneumococci R6 strain (same as Example 1)
  • Sample A human plasma sample containing human anti-PspA clade2 antibody. Used to measure opsonin activity. The method for preparing the sample used in this example is as follows. Human plasma stored at ⁇ 80 ° C. was thawed at room temperature, and all IgG contained in the plasma was purified using HiTrap rProtein G FF Column (manufactured by GE Healthcare) according to the procedure for using this column. In addition, after fixing PspA clade2 protein shown in paragraph 0065 of International Publication No.
  • Example 2 (Test Example) Analysis of Sample (b)
  • the sample (b) prepared in Example 2 that is, PsaA, CbpA, capsule (serotype 3) or PspA contained in the purified human anti-PspA clade2 IgG fraction
  • the amount of antigen-specific IgG was measured by ELISA.
  • PsaA and CbpA antigens were prepared by a genetic recombination technique using E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (manufactured by TOYOBO) based on the following method.
  • the cloning procedure for PsaA or CbpA was performed using E. coli DH5 ⁇ Competent Cells (TOYOBO).
  • E. coli DH5 ⁇ was cultured using LB (Luria-Bertani) or LB agar medium containing 30 ⁇ g / ml kanamycin.
  • -PsaA was amplified by PCR using the primer set shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 with the genomic DNA of S. pneumoniae strain D39 as a template.
  • PsaA-F NdeI: GGAATTCCATATGGCTAGCGGAAAAAAAG (SEQ ID NO: 1)
  • PsaA-R HingIII: CCCAAGCTTTTATTTTGCCAATCCTTCAG (SEQ ID NO: 2)
  • -CbpA was amplified by the PCR method using the primer set shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 and genomic DNA of S. pneumoniae strain D39 as a template.
  • ⁇ -Helix (SEQ ID NO: 3) on the N-terminal side of CbpA and a gene portion (SEQ ID NO: 4) encoding a prolin-rich region were used.
  • CbpA-F (NdeI): GGAATTCCATATGACAGAGAACGAGGGAAGTACCCA (SEQ ID NO: 3)
  • CbpA-R (HingIII): CCCAAGCTTTTACCACATACCGTTTTCTTGTTTC (SEQ ID NO: 4)
  • coli BL21 (DE3) expressing each protein was shaken at 37 ° C in LB medium containing 30 ⁇ g / ml kanamycin, and 0.5 mM when the absorbance OD600nm was about 0.8.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • PsaA and CbpA proteins were purified by Ni 2+ affinity chromatography and gel filtration as proteins with His-tag added to the N-terminus. The purified protein was confirmed using SDS-PAGE and Westen blotting.
  • the plate coated with antigen is washed with PBST (Phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20)
  • PBST Phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20
  • the total IgG fraction purified from serially diluted human plasma and the purified PspA clade2-specific IgG fraction are 50 ⁇ l / well. And incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the microplate was washed with PBST, and 100 ⁇ l of alkaline phosphatase conjugated affini pure goat anti-human IgG diluted 5000 times was added to each well and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the plate was washed with PBST, and 100 ⁇ l of a substrate [4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate diluted with substrate buffer (1M diethanolamine, 0.5 mM MgCl 2 )] was added to each well, followed by incubation at room temperature for 45 minutes under light shielding. Thereafter, the absorbance at OD405 nm was measured.
  • a substrate 4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate diluted with substrate buffer (1M diethanolamine, 0.5 mM MgCl 2 )
  • Serotype 3 capsule-specific IgG antibody measurement Serotype 3 capsular antigen (ATCC, 169-X) was prepared to 5 ⁇ g / ml, then 100 ⁇ l was added to each well of a 96-well microplate, and incubated at 37 ° C. for 5 hours. Wash the antigen-coated plate with PBST, add the whole IgG fraction purified from human plasma diluted serially and the purified anti-PspA IgG fraction at 100 ⁇ l / well to each well, and continue at 37 ° C for 1 hour. Incubated.
  • alkaline phosphatase conjugated affini pure goat anti-human IgG diluted 5000 times was added at 100 ⁇ l / well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the plate was washed with PBST, and 100 ⁇ l each of a substrate [4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate diluted with substrate buffer (1M diethanolamine, 0.5 mM MgCl 2 )] was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes under light shielding. After incubation, the absorbance at OD405nm was measured.
  • the complement-dependent bactericidal effect measuring method of the present invention can be easily and effectively confirmed regardless of the capsular serotype of pneumococci.
  • the opsonin activity measured by the method of the present invention can be used as a surrogate marker for a vaccine using a pneumococcal surface protein. Thereby, it becomes possible to provide a certain evaluation about the effectiveness of the vaccine using the surface protein of pneumococcus irrespective of the serotype of the pneumococcal capsule.

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Abstract

肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法に関し、いずれの莢膜血清型の肺炎球菌に対しても測定可能な活性測定方法を提供する。莢膜欠損型肺炎球菌、即ち無莢膜型若しくは無莢膜に近い型、又はトランスペアレント（Transparent）型の肺炎球菌を用いて肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能を測定することによる。いずれの莢膜血清型の肺炎球菌に対して補体依存性殺菌能を測定することができる。

Description

肺炎球菌補体依存性殺菌能測定方法
　本発明は、肺炎球菌補体依存性殺菌能測定方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１５－１２２５２０号優先権を請求する。
　肺炎球菌は主要な呼吸器病原性細菌であり、肺炎の原因菌として分離頻度の高い細菌である。肺炎球菌は、小児や成人に感染すると髄膜炎・敗血症を含む侵襲性感染症（Invasive pneumococcal disease：IPD）、や市中肺炎（Community-Acquired Pneumonia：CAP）、及び医療介護関連肺炎（Nursing and healthcare associated pneumonia；NHCAP）を惹起する。肺炎球菌は菌体の外側に病原性の上で重要な多糖体でできた莢膜を保持しており、莢膜血清型（serotype）は21のグループに属する93種以上と、25の単一型の計118型以上に分類されている。この莢膜がバリアーとなり、菌はヒト多核白血球による貪食作用に強い抵抗性を示す。
　現行の肺炎球菌ワクチンには肺炎球菌の血清型を決定する莢膜多糖体を精製したものが抗原として含まれている。小児に重症感染症を惹起しやすく、また耐性菌の多い莢膜型7種の肺炎球菌から精製した抗原と無毒化ジフテリアトキシン（CRM197）を結合した7価結合型ワクチン（PCV7）が市販された。PCV7導入後にワクチン含有の7血清型の肺炎球菌による侵襲性感染症は明らかに減少したものの、小児及び成人におけるワクチン非含有血清型である血清型19AなどによるIPD症例の増加の問題が浮上してきた。このため、PCV7にさらに6血清型の莢膜多糖体を抗原として追加した13価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（PCV13）が導入され、既に承認、市販されている。 また、成人に対する23種の精製された莢膜を抗原として含む23価莢膜多糖体ワクチン（PPV23）も市販されている。
　Croneyらは、PCV13接種前の2002～2010年の間に発症した米国アラバマ州の小児侵襲性感染症由来肺炎球菌株を集めて大規模調査を行った。その結果、PCV13に含有される血清型は60％しか含んでおらず、残りの40％の菌株にはPCV13に含まれない17血清型が含まれることを報告した。我が国でも2011年から小児に対するPCV7接種の公費助成が開始されたが、2012年には米国と同様にワクチン非含有血清型によるIPD症例の増加が報告されている。現行ワクチンにワクチン非含有血清型莢膜多糖体を抗原として追加し続けることは非現実的であり、このことは莢膜多糖体をベースとする現行の肺炎球菌ワクチンの限界を示唆するものであると言える。 
　以上のような現行肺炎球菌ワクチンの欠点を補う目的で、肺炎球菌表層タンパク質抗原の一つである肺炎球菌表面タンパク質Ａ（Pneumococcal surface protein A：PspA）が、新規肺炎球菌ワクチン抗原として注目されている。PspAのα－へリックス及びプロリンリッチ領域には肺炎球菌に対して感染防御作用を示す抗体が認識する抗原エピトープが存在することが知られている。PspAは、そのN末端に存在するclade definition領域のアミノ酸配列により、大きく３つのファミリーに分類され、さらに６つのクレードと呼ばれる亜群に分類される。臨床より分離される肺炎球菌のPspAファミリーは、ファミリー１及び２で98％以上を占める。PspAは病原因子としても働き、肺炎球菌菌体表面への補体C3の結合を阻害することが報告されている。抗PspA特異抗体は、PspAの持つ補体阻害活性に対して拮抗的に作用し、本菌に対する感染防御活性を示すことが報告されている。この感染防御活性は、異なるPspAファミリーを交差認識する抗体によっても起こる。異なるPspAの交差反応性には多様性があるため、より広域な交差反応を示すファミリー１とファミリー２に属するクレードの組み合わせを選別することは、PspAをベースとするワクチンの開発に重要と考えられる。 
　CbpA（Cholin binding protein A）及びPsaA（Pneumococcal surface adhesion A）は肺炎球菌細胞表面に発現するタンパク質であるとともに、病原因子としても知られ、ワクチン抗原候補として考えられている。CbpAはPspAと同じくコリン結合性タンパク質であり、全ての肺炎球菌株の約 75％で検出される。CbpAが上皮細胞あるいは粘膜細胞表面の免疫グロブリン受容体へ結合することにより、肺炎球菌は細胞内に取りこまれ、その後、transcytosisされて生体内へと侵入する（非特許文献１）。PsaAはすべての血清型の肺炎球菌に存在するタンパク質であり、ほかの細菌の接着分子（adhesin）と同様に宿主細胞への付着に重要な因子である（非特許文献２）。
　肺炎球菌ワクチンの免疫誘導能（免疫原性）や肺炎球菌感染症に罹患した患者の液性免疫の評価を目的として、ELISA法による血清型特異IgG濃度とmultiplex opsonization assay（MOPA）による血清型特異的なオプソニン活性の測定が可能である。ELISA 法による血清型特異IgG濃度測定は、血清中の肺炎球菌の共通抗原［cell wall polysaccharideと22F莢膜ポリサッカライド（CPS）］に対する抗体を吸収後に、ELISAプレートに固定した個々の血清型のCPS抗原と結合するIgG抗体量から定量することが可能である（非特許文献３）。現在、小児における侵襲性肺炎球菌感染症（IPD）に対する小児用７価肺炎球菌結合型ワクチン（PCV7）の集団感染防御閾値として、血清型特異的IgG濃度≧0.20μg/ml（第３世代ELISA）が示されている（非特許文献４）。一方、Burtonらは、肺炎球菌ワクチン接種後の血清型特異抗体の機能評価のために、複数の血清型に対するオプソニン活性（opsonization index; OI）の測定を可能にするMOPA法を開発した（非特許文献５）。しかしながら、何れの評価方法も莢膜血清型に特化した測定方法であった。
Mol Microbiol 25: 819-829, 1997 Microb Pathog 21: 17-22, 1996 Clin Diagn Lab Immunol 8: 266-272, 2001 Clin Vaccine Immunol 18: 2161-2167, 2011 Clin Vaccine Immunol 13: 1004-1009, 2006
　本発明は、肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法に関し、いずれの莢膜血清型の肺炎球菌に対しても測定可能な活性測定方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、莢膜欠損型肺炎球菌、即ち無莢膜型若しくは無莢膜に近い型、又はトランスペアレント（Transparent）型の肺炎球菌を用いて肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能（OPA）を測定することで、本発明の課題を解決することを見出した。上記方法により、いずれの莢膜血清型の肺炎球菌に対しても補体依存性殺菌能を測定することができる。
　本発明は、すなわち以下よりなる。
１．以下の１）～３）の工程を含む、肺炎球菌特異抗体の、肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法：
１）莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）と肺炎球菌特異抗体を含む試料（ｂ）とを混合する工程；
２）前記工程１）の後、補体成分（ｃ）及び貪食細胞（ｄ）をさらに加える工程；
３）前記工程２）の後、莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）における一定量の菌が死滅する試料（ｂ）の濃度を決定する工程。
２．前記工程３）における一定量が、50％である、前項１に記載の補体依存性殺菌能測定方法。
３．前記工程１）の補体成分（ｃ）の使用量が、莢膜型肺炎球菌（ａ’）を用いて測定する場合に使用する補体成分（ｃ’）に比べて、前記工程１）の補体成分（ｃ）の使用量が、1/400～1/100である、前項１又は２に記載の補体依存性殺菌能測定方法。
４．前記工程１）及び２）に示す莢膜欠損型肺炎球菌が、無莢膜型肺炎球菌又はトランスペアレント型肺炎球菌である、前項１～３のいずれかに記載の補体依存性殺菌能測定方法。
５．莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）が、WU2株、D39株、KK1162株、ATCC6303株、BG9739株、TIGR4株、及びEF5668株から選択されるいずれかの肺炎球菌由来の莢膜欠損型肺炎球菌である、前項１～４のいずれかに記載の測定方法。
６．前記工程１）の貪食細胞（ｄ）が、HL-60由来細胞である、前項１～５のいずれかに記載の測定方法。
７．試料（ｂ）が、被験体より採取した血液試料である、前項１～６のいずれかに記載の測定方法。
８．試料（ｂ）が、肺炎球菌ワクチンの接種を受けた被験体より採取した血液試料である、前項７に記載の測定方法。
９．前項１～８のいずれかに記載の測定方法により測定した結果に基づいて検査することを特徴とする、肺炎球菌ワクチンの免疫原性の検査方法。
　本発明の補体依存性殺菌能測定方法によれば、感染した肺炎球菌の莢膜の血清型にかかわらず、容易かつ効果的に補体依存性殺菌効果を確認することができる。また、本発明の方法で測定されたオプソニン活性を肺炎球菌の表層タンパク質を用いたワクチンのサロゲートマーカーとして利用することができる。これにより、肺炎球菌の表層タンパク質を用いたワクチンの有効性について、肺炎球菌の莢膜の血清型に関わらず、一定の評価を提供することが可能となる。
本発明の測定系の一態様を示す図である。（実施例１） 抗PspA clade2マウス免疫血清又は非免疫血清の肺炎球菌R6株に対するオプソニン活性を示す図である。（実施例１） 抗PspA clade2マウス免疫血清又は抗PspA clade3マウス免疫血清の肺炎球菌R6株に対するオプソニン活性を示す図である。（実施例１） ヒト血漿より精製したIgG画分及び抗PspA IgG画分の肺炎球菌R6株に対するオプソニン活性を示す図である。（実施例２） ヒト血漿より精製したIgG画分及び抗PspA IgG画分中に含まれる抗PspA IgG量を測定した結果を示す図である。（試験例） ヒト血漿より精製したIgG画分及び抗PspA IgG画分中に含まれる、抗莢膜（血清型３）IgG量、抗CbpA IgG量、抗PsaA IgG量を測定した結果を示す図である。（試験例）
　本発明は、以下の１）～３）の工程を含む、肺炎球菌特異抗体の肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法に関する。
１）莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）と肺炎球菌特異抗体を含む試料（ｂ）とを混合する工程；
２）前記工程１）の後、補体成分（ｃ）及び貪食細胞（ｄ）をさらに加える工程；
３）前記工程２）の後、莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）における一定量の菌が死滅する試料（ｂ）の濃度を決定する工程。
　上記の測定方法は、いわゆるオプソニン作用活性方法（Opsonophagocytic killing assay：OPA）の変法に関する。
　本明細書において、「莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）」とは、無莢膜又は莢膜が通常の莢膜型肺炎球菌と比較して薄い肺炎球菌をいい、例えば無莢膜型肺炎球菌やトランスペアレント型肺炎球菌が挙げられる。この場合において、莢膜は完全に欠損していても良いし、莢膜があったとしても、表層タンパク質が十分に露出していれば良い。莢膜欠損型肺炎球菌は、人為的に作製したものであっても良いし、自然界から得られる莢膜欠損型肺炎球菌であっても良い。人為的には、莢膜合成に関わる遺伝子群の人工的な欠損及び抗生物質の添加により無莢膜型肺炎球菌を作製することができるし、培養系にキシリトールなどの薬品及び莢膜を分解する酵素を添加する方法、さらに振とう培養等によりトランスペアレント型肺炎球菌を作製することができる。無莢膜型肺炎球菌として肺炎球菌R6株をあげることができる。また、人為的に莢膜欠損型肺炎球菌を作製するために、例えば莢膜血清型が２型のD39株、３型のWU2株、KK1162株、ATCC6303株や、４型のBG9739株、TIGR4株、EF5668株等を由来株として使用することができる。
　本明細書において、莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）における一定量に関し、「一定量」とは、補体依存性殺菌能測定系に添加した莢膜欠損型肺炎球菌量の0～100％の間で特定される一定量であればよく、特に限定されない。具体的には、例えば本発明の莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）の60％、50％、40％、30％又は20％のように特定した菌量をいい、特に好適には50％ 又は60％が適用される。本発明の補体依存性殺菌能測定方法において、莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）の60％、50％、40％、30％又は20％、特に好適には50％又は60％の菌が死滅する試料の濃度を測定することで、補体依存性殺菌能を測定することができる。
　本明細書において、「試料（ｂ）」とは、本発明の補体依存性殺菌能測定方法に適用される試料をいい、具体的にはオプソニン作用活性の測定に用いられる試料をいう。本発明の測定のために、肺炎球菌特異抗体を含有可能性のある試料であればよく、特に限定されない。このような肺炎球菌特異抗体を含有可能性のある試料として、肺炎球菌ワクチンを投与した被験体から採取された血液試料、又は肺炎球菌に感染した可能性のある被験体から採取された血液試料を挙げることができる。ここにおいて、血液試料とは、血液に由来する試料であればよく、血清や血漿であってもよい。例えば臨床検査の際に採取した血液を処理した後に使用する通常の臨床検査に使用しうる試料であってもよい。ここにおいて、被験体とは、ヒト又はマウス等の脊椎動物であればよく、特に好適にはヒトである。本発明によれば、試料中の肺炎球菌特異抗体と補体を反応させることで、試料中の肺炎球菌特異抗体について補体依存性殺菌能を測定することができる、
　本明細書において、使用可能な「補体成分（ｃ）」とは、肺炎球菌特異抗体の肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定に使用可能な補体であればよい。その様な補体であれば、市販の補体試薬を使用することができる。例えばProtocol for a multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA, reference 2) for antibodies against Streptococcus pneumoniae Version E.02, December 2014 (www.vaccine.uab.edu)のプロトコールに従い、第16頁に示される補体成分を使用することができる。補体の使用濃度は、莢膜（Opaque）型肺炎球菌（ａ’）を用いて測定する場合に使用する補体成分（ｃ’）の濃度を１とした場合と比べて、前記工程１）の補体成分（ｃ）の使用量を1/400～1/100、好ましくは3/400とすることができる。具体的には、Pelfreez 3-4 week baby rabbit complement, sterile（Pelfreez製）に示される使用濃度の1/400～1/100、好ましくは3/400とすることができる。
　本明細書において、貪食細胞（ｄ）とは、補体依存性殺菌能の測定に適用しうる貪食細胞であればよく、特に限定されない。汎用される貪食細胞としては貪食能を誘導させたヒト白血病由来HL-60由来の細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本発明の肺炎球菌特異抗体の肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法により、肺炎球菌ワクチンの免疫原性を検査することができる。ここにおいて「肺炎球菌ワクチンの免疫原性」とは、肺炎球菌ワクチンによる抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質等の免疫誘導能をいい、オプソニン活性（opsonization index; OI）であっても良い。本発明の方法で測定されたオプソニン活性をワクチンのサロゲートマーカーとして利用することができる。
　本発明の補体依存性殺菌能測定方法に適用可能な「肺炎球菌ワクチン」は、自体公知の「肺炎球菌ワクチン」であっても良いし、今後開発されるあらゆる「肺炎球菌ワクチン」であっても良い。例えば国際公開公報第2014/045621号に明示されている肺炎球菌ワクチンを用いることができ、今後開発される新たに表層タンパク質をターゲットとした肺炎球菌ワクチンの評価を行うことができる。
　本発明の肺炎球菌特異抗体の肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定（オプソニン作用活性方法：OPA）の一態様は、図１に示すとおりである。例えば、以下の方法により測定することができる。
１）莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）を播種したマイクロプレートの各ウェルに、肺炎球菌特異抗体を含む試料（ｂ）加え、インキュベートする工程；
２－１）前記工程１）の後、補体成分（ｃ）及び貪食細胞（ｄ）をさらに加え、培養する工程；
２－２）前記工程２－１）の反応溶液を寒天培地に添加し、さらに培養する工程；
３）寒天培地に出現した莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）のコロニー数を計測し、添加莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）における一定量の菌が死滅する試料（ｂ）の濃度を決定する工程。
　上記において、工程１）におけるインキュベート条件は、室温、例えば10～35℃で、15～60分、好ましくは30分とすることができる。工程２－１）における培養条件は、5％ CO2存在下で、37±1℃で30～180分間、好ましくは40～80分間、さらに好ましくは45～75分間とすることができる。さらに、工程２－２）における培養条件は、5％ CO2存在下で、37±1℃で6～48時間、好ましくは6～24時間、さらに好ましくは16時間、とすることができる。上記条件は、測定系において最適な条件を適宜選択することができる。
　本発明の補体依存性殺菌能測定において使用される緩衝液、培地は自体公知の緩衝液や培地、又は今後開発される適用可能な緩衝液、培地を使用することができ、特に限定されるものではない。具体的には、使用する莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）や、補体成分（ｃ）の添加量を本発明で特定する事項を適用する以外は、Protocol for a multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA, reference 2) for antibodies against Streptococcus pneumoniae Version E.02, December 2014 (www.vaccine.uab.edu)のプロトコールに従い行なうことができる。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
（実施例１）マウス免疫血清のオプソニン活性
　抗PspA clade2マウス免疫血清又は抗PspA clade3マウス免疫血清のオプソニン活性（OPA）を、以下の方法で測定した（図１参照）。抗PspA clade2マウス免疫血清又は抗PspA clade3マウス免疫血清を試料とした。
（ａ）莢膜欠損型肺炎球菌：無莢膜型肺炎球菌R6株
（ｂ）試料：抗PspA clade2血清は、国際公開公報第2014/045621号の段落0065に示すPspA clade2のタンパク質を抗原として免疫したマウスより得られた血清であり、抗PspA clade3血清も国際公開第2014/045621号の段落0065に示すPspA clade3を抗原として免疫したマウスより得られた血清である。C57/BL6jマウス（6-8週齢、メス）に抗原としてPspA clade2又はPspA clade3を0.1μg、アジュバントCpGK3を2.5μg及びAlum 5μgと混合しマウスに皮下接種した。接種は1週間毎で計3回行い、最終免疫後1週間後に全採血を行い、免疫血清を得た。
（ｃ）補体成分：Pelfreez 3-4 week baby rabbit complement, sterile（Pelfreez製）
（ｄ）貪食細胞：ヒト白血病由来HL-60細胞をCM1培地（RPMI1640 500ml、非動化FBS 50ml、GlutaMax-1 5ml、penicillin/streptomycin 5ml）で、5％ CO2存在下で、37℃で培養後、分化用培地（RPMI 1640 500ml、非動化FBS 50ml、GlutaMax-1 5ml、DMF（dimethyl formamide）4.55ml）に培地を交換し、分化誘導を行う。培養開始4-5日後のHL-60細胞をHBSS（without Ca++, Mg++）で洗浄し、その後、HBSS（with Ca++, Mg++）で洗浄する。得られた細胞を、OBB液（distilled water 32ml、10xHBSS (with Ca++, Mg++) 4ml, 1％ gelatin 4ml, inactivated FBS 2.12ml）に1×107個/mlとなるよう懸濁したものを使用した。
１）肺炎球菌R6株（ａ）を500CFU播種した96穴のマイクロプレートの各ウェルに、試料（ｂ）20μl加え、室温で30分間インキュベートした。
２－１）前記工程１）の後、補体成分（ｃ）を10μl（終濃度0.75％） 加え、及び貪食細胞（ｄ）を4×105細胞加え、5％ CO2存在下で、37℃で75分間インキュベートする工程；
２－２）前記工程２－１）の反応溶液を寒天培地10μlに添加し、5％ CO2存在下で、37℃で16時間培養した。
３）寒天培地に出現した肺炎球菌R6株のコロニー数を計測し、50％の肺炎球菌R6株（ａ）が死滅する試料（ｂ）の濃度を算出し、OPA活性を測定した。
　その結果を、図２及び図３に示した。図２では上記（ｂ）で得られた抗PspA clade2マウス免疫血清を用いてオプソニン活性を検討した。その結果、免疫血清では非免疫血清と比較して、試験菌に対して70倍以上のオプソニン活性が認められた。図３では、試験菌（肺炎球菌R6株、PspA clade2）に対する抗PspAマウス免疫血清（PspA clade2又はclade3）のオプソニン活性を検討した。その結果、抗PspA clade2マウス免疫血清は試験菌株に対して抗原特異的なオプソニン活性を示したが、抗PspA clade3マウス免疫血清は全くオプソニン活性を示すことができず、本試験が抗原特異的なオプソニン活性を測定できることが明らかとなった。
（実施例２）ヒトの抗PspA IgGを用いたオプソニン活性
　本実施例では、ヒトの抗PspA IgGを含む試料について、オプソニン活性の測定をおこなった。PspA clade2タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりヒト血漿から抗PspA IgGを精製した画分を試料（ｂ）とし、オプソニン活性（OPA）を、以下の方法で測定した。
（ａ）莢膜欠損型肺炎球菌：無莢膜型肺炎球菌R6株（実施例１と同じ）
（ｂ）試料：ヒト抗PspA clade2抗体を含むヒト血漿試料である。オプソニン活性の測定に用いられる。本実施例で使用される試料の作製方法は以下のとおりである。
　-80℃で保存されたヒト血漿を常温で融解し、HiTrap rProtein G FF Column（GEヘルスケア製）を用いて本カラムの使用手順に従って血漿中に含まれる全てのIgGを精製した。また国際公開公報第2014/045621号の段落0065に示すPspA clade2タンパク質をNHS-activated HP Column（GEヘルスケア製）に固定した後、本カラムの使用手順に従って、ヒト血漿中抗PspA IgGを精製した。
（ｃ）補体成分：Pelfreez 3-4 week baby rabbit complement, sterile（Pelfreez 製）
（ｄ）貪食細胞：実施例１に示すヒト白血病由来HL-60細胞を貪食細胞として使用した。
（ｅ）OPA試験方法：実施例１と同手法により試験を行った。
　精製ヒト抗PspA clade2 IgG画分及び精製全IgG画分を用いてR6株に対するオプソニン活性を測定した結果、全IgG画分では肺炎球菌R6株に対するオプソニン活性が17496であった。精製抗PspA IgG画分によるオプソニン活性は603であった（図４）。この結果から、ヒト抗PspA IgGは肺炎球菌R6株に対して高いオプソニン活性を示すことが明らかとなった。これは、ヒトPspA特異IgGが肺炎球菌R6株に存在するPspAに結合することによってオプソニン化が誘導されたためと考えられる。このことからヒト抗PspA特異IgGは、莢膜欠損肺炎球菌株及びトランスペアレント型肺炎球菌株に対してもオプソニン活性を示す可能性が示唆された。
（試験例）試料（ｂ）の解析
　本試験例では実施例２で作製した試料（ｂ）、即ち精製ヒト抗PspA clade2 IgG画分に含まれるPsaA、CbpA、莢膜（血清型３）又はPspAに対する抗原特異的IgG量をELISA法で測定した。
１）ELISA法に使用する各抗原の作製
　PsaA及びCbpA抗原は、以下の方法に基づき、E.coli DH5α Competent Cells（TOYOBO製）を用いて遺伝子組み換えの手法により作製した。PsaA又はCbpAのクローニング手順はE.coli DH5α Competent Cells（TOYOBO製）を用いて行った。E.coli DH5αは30μg/mlのカナマイシンを含むLB（Luria-Bertani）又はLB agar培地を用いて培養した。
・PsaAは、配列番号１及び２に示すプライマーセットを用いて、肺炎球菌D39株のゲノムDNAをテンプレートとしてPCR法にて増幅した。
　PsaA-F(NdeI): GGAATTCCATATGGCTAGCGGAAAAAAAG（配列番号１）
　PsaA-R(HingIII): CCCAAGCTTTTATTTTGCCAATCCTTCAG（配列番号２）
・CbpAは、配列番号３及び４に示すプライマーセットを用いて、肺炎球菌D39株のゲノムDNAをテンプレートとしてPCR法にて増幅した。プライマーは、CbpAのN末端側のα-Helix （配列番号３）及びprolin-rich 領域をコードする遺伝子部分（配列番号４）を用いた。
　CbpA-F(NdeI): GGAATTCCATATGACAGAGAACGAGGGAAGTACCCA（配列番号３）
　CbpA-R(HingIII): CCCAAGCTTTTACCACATACCGTTTTCTTGTTTC（配列番号４）
２）各抗原の発現及び作製：
　N末端側に制限酵素NdeI認識配列、C末端側にHindIII認識配列が付加されているPsaA 及びCbpAのPCR産物をpET28a(+) ベクターの制限酵素NdeI及びHindIII認識サイトに挿入し、PsaA 又はCbpAタンパク質を発現するプラスミドを作製した。この2つのPsaA、CbpA遺伝子断片はシーケンシングすることでその配列を確認した。CbpAあるいはPsaA発現プラスミドはE.coli BL21（DE3）に形質転換され、それぞれのタンパク質を大量発現させた。タンパク質を精製するために、それぞれのタンパク質を発現するE.coli BL21（DE3）はカナマイシン30μg/mlを含むLB培地において37℃で震盪培養され、吸光度OD600nmが約0.8になった時点で、0.5mM IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加し、さらに3時間震盪培養を行ない、その後、菌体を収集した。PsaA、CbpAタンパク質はN末端にHis-tagが付加されたタンパク質としてNi2+ affinity chromatography及びgel filtration法によって精製された。精製タンパク質はSDS-PAGE及びWesten blotting法を用いて確認した。
３）PsaA、CbpA、PspA特異的IgG抗体測定
　PsaA、CbpA、莢膜、PspA抗原に対する 抗原特異的 IgG量をELISA法で測定した。
　1μg/mlのPsaA、CbpA、PspA抗原を96-wellマイクロプレートに100μl/wellとなるように添加し、4℃で一晩インキュベートをおこなった。抗原がコーティングされたプレートはPBST（Phosphate buffered saline containing 0.05％ Tween 20）で洗浄した後、段階希釈したヒト血漿より精製された全IgG画分及び精製PspA clade2特異IgG画分を50μl/wellとなるように添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後マイクロプレートをPBSTで洗浄し、そこに5000倍希釈した alkaline phosphatase conjugated affini pure goat anti-human IgGを100μlずつ各ウェルに添加し、37℃30分間インキュベートした。その後PBSTで洗浄し、基質[4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate diluted with substrate buffer (1M diethanolamine, 0.5mM MgCl2)] を100μlずつ各ウェルに添加した後、室温、遮光下で45分間インキュベートした。その後、OD405nmの吸光度を測定した。
４）血清型３莢膜特異的IgG抗体測定 
　血清型３の莢膜抗原（ATCC、169-X）は5μg/mlに調製したのち、96-wellマイクロプレートの各ウェルに100μlずつ添加し、37℃で5時間インキュベートした。抗原がコーティングされたプレートをPBSTで洗浄し、これに段階希釈したヒト血漿より精製された全IgG画分及び精製抗PspA IgG画分を100μl/wellで各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後PBSTで洗浄したのち、5000倍希釈した alkaline phosphatase conjugated affini pure goat anti-human IgGを100μl/wellで添加し、37℃で1時間インキュベートした。その後PBSTで洗浄し、基質[4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate diluted with substrate buffer (1M diethanolamine, 0.5mM MgCl2)]を100μlずつ添加し、37℃、遮光下で45分間培養した。培養後、OD405nmの吸光度を測定した
５）結果
　ヒト血漿より精製した抗PspA IgG画分中には高濃度の抗PspA IgG抗体が存在していた（図５）。ヒト血漿より精製した抗PspA IgG画分中には、肺炎球菌由来抗原である抗莢膜（血清型３）IgG、抗CbpA IgG、抗PsaA IgG抗体は残存していないことを確認した（図６）。
　以上詳述したように、本発明の補体依存性殺菌能測定方法によれば、肺炎球菌の莢膜血清型にかかわらず、容易かつ効果的に補体依存性殺菌効果を確認することができる。また、本発明の方法で測定されたオプソニン活性を肺炎球菌の表層タンパク質を用いたワクチンのサロゲートマーカーとして利用することができる。これにより、肺炎球菌の表層タンパク質を用いたワクチンの有効性について、肺炎球菌の莢膜の血清型に関わらず、一定の評価を提供することが可能となる。

Claims (9)

  1. 以下の１）～３）の工程を含む、肺炎球菌特異抗体の、肺炎球菌に対する補体依存性殺菌能測定方法：
    １）莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）と肺炎球菌特異抗体を含む試料（ｂ）とを混合する工程；
    ２）前記工程１）の後、補体成分（ｃ）及び貪食細胞（ｄ）をさらに加える工程；
    ３）前記工程２）の後、莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）における一定量の菌が死滅する試料（ｂ）の濃度を決定する工程。
  2. 前記工程３）における一定量が、50％である、請求項１に記載の補体依存性殺菌能測定方法。
  3. 前記工程１）の補体成分（ｃ）の使用量が、莢膜型肺炎球菌（ａ’）を用いて測定する場合に使用する補体成分（ｃ’）に比べて、前記工程１）の補体成分（ｃ）の使用量が、1/400～1/100である、請求項１又は２に記載の補体依存性殺菌能測定方法。
  4. 前記工程１）及び２）に示す莢膜欠損型肺炎球菌が、無莢膜型肺炎球菌又はトランスペアレント型肺炎球菌である、請求項１～３のいずれかに記載の補体依存性殺菌能測定方法。
  5. 莢膜欠損型肺炎球菌（ａ）が、WU2株、D39株、KK1162株、ATCC6303株、BG9739株、TIGR4株、及びEF5668株から選択されるいずれかの肺炎球菌由来の莢膜欠損型肺炎球菌である、請求項１～４のいずれかに記載の測定方法。
  6. 前記工程１）の貪食細胞（ｄ）が、HL-60由来細胞である、請求項１～５のいずれかに記載の測定方法。
  7. 試料（ｂ）が、被験体より採取した血液試料である、請求項１～６のいずれかに記載の測定方法。
  8. 試料（ｂ）が、肺炎球菌ワクチンの接種を受けた被験体より採取した血液試料である、請求項７に記載の測定方法。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の測定方法により測定した結果に基づいて検査することを特徴とする、肺炎球菌ワクチンの免疫原性の検査方法。
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