CN110144002A

CN110144002A - 甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用

Info

Publication number: CN110144002A
Application number: CN201810152073.0A
Authority: CN
Inventors: 徐可; 平宪强; 胡伟斌
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-08-20

Abstract

本发明提供了一种甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用。具体地，本发明提供了一种甲型流感病毒H1N1型病毒的HA共有序列CH1(包括氨基酸序列和核苷酸序列)，以及相应的载体、表达细胞柱，以及基于该共有序列构建的重组病毒株。本发明还提供了包含所述共有序列和重组病毒株的疫苗组合物、制法和应用。

Description

甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地涉及一种甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用。

背景技术

流行性感冒(flu)是一种由流感病毒引起的呼吸道传染病。流感病毒每年都能在全球范围内造成严重感染和死亡病例。流感病毒分3个型——甲型、乙型和丙型，其中丙型流感病毒的病例数远远少于甲型和乙型，这也是只有甲型和乙型流感病毒被纳入每年的疫苗计划的原因。乙型流感病毒一般只感染人，在人群中小范围流行，致病力较弱,不会导致大流行。甲型流感病毒不仅能感染人，而且还能感染水禽、鸡、貂和猪等多种动物。另外，甲型流感病毒也是历史上导致大流行的病原体。甲型流感病毒根据其表面膜蛋白HA和NA的抗原特性又可以分为不同的亚型，其中HA有18个亚型，NA有11个亚型。在诸多亚型的流感病毒中，目前流行于人群的是H1N1和H3N2亚型的流感病毒。

预防流感最行之有效的方法是接种疫苗。现有的疫苗抵抗流感病毒的主要原理是其诱导产生的中和性抗体识别病毒HA蛋白头部结构域的受体结合区附近的区域。目前使用的疫苗有两种类型——灭活苗和减毒活疫苗。我国批准上市的是流感灭活苗。然而由于流感病毒突变较快，因此流感疫苗需要逐年根据当年的流行株更新，每年接种。这大大降低了流感疫苗的普及度，也造成了疫苗的生产滞后于疫情以及没有预见性等问题。为此，研发具有广谱保护效果的通用疫苗是流感疫苗的未来市场和方向。目前的通用疫苗以亚单位疫苗为主，如HA的茎秆区和M2e蛋白疫苗，以及DNA疫苗和载体疫苗等，这些亚单位疫苗由于只包含有限的病毒抗原，不能覆盖所有的全病毒抗原表位，其激活的免疫反应往往有一定的局限性，通常需要较强的佐剂辅助，在大动物水平上的免疫保护效果也难以保证。同时，这些新型疫苗都需要对流感疫苗现有的生产工艺和流水线进行更改，而且对于基因突变非常频繁的流感病毒来说亚单位疫苗的广谱保护效果还有待更多的验证。有一类通用疫苗是基于共有序列consensus sequence来设计疫苗抗原，但多是针对分离株有限而且基因序列变异不大的某个特定亚型的流感病毒比如H5N1，H7N9等设计抗原，在亚型内部达到通用效果。这些亚型的病毒由于在历史上感染人的病例不多，在亚型内HA，NA等基因序列的差异度也不是很大，因此较容易设计出能够与亚型内所有病毒株产生交叉保护的抗原。但目前主要流行于人群中的甲型流感病毒株是H1N1和H3N2亚型，也是现有流感疫苗的主要组分。由于H1N1和H3N2亚型的流感病毒在人群中流行时间长，地理范围广，亚型内的差异度非常大，目前尚没有报道一种广谱疫苗能对H1或者H3亚型内所有病毒株都产生交叉保护。

因此，本领域迫切需要开发针对这种长期流行于人群中、分离株众多的H1N1病毒的通用疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用。

具体地，本发明的目的在于提供甲型流感病毒H1N1型通用型疫苗株的通用序列和获得方法。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的流感病毒CH1多肽，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有CH1免疫原性的由(a)衍生的衍生多肽。

在另一优选例中，所述的衍生多肽还具有血凝素功能。

在另一优选例中，所述的一个或多个指1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-5，最佳地1、2、或3个。

在另一优选例中，所述多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述多肽与SEQ ID No.:2的同一性≥95％,较佳地≥97％，更佳地≥98％，最佳地≥99％或99.5％。

在另一优选例中，所述的衍生多肽中一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的各个突变位置各自独立地位于表位区，或非表位区。

在另一优选例中，所述的衍生多肽中一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加的突变位置均位于非表位区。

在另一优选例中，所述的衍生多肽具有一个或多个氨基酸残基的取代。

在另一优选例中，所述的一个或多个指1-20个，更佳地1-5，最佳地1、2、或3个。

在另一优选例中，所述的衍生多肽(或突变型蛋白)具有在第1-173，第175-207位、第209-389位、和/或第391-566位具有一个或多个氨基酸残基的取代。

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了SEQ ID No.:2所示的序列中的90％-100％的表位，或至少10个(如10、11、12或13个)表位(表位在图6中用下划线表示)。

在另一优选例中，所述的衍生多肽具有SEQ ID No.:2中第167位-176位所示的表位。

在另一优选例中，所述的衍生多肽具有SEQ ID No.:2中第167位-176位所示的表位，并且具有L174S突变。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如本发明第一方面所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的序列具有SEQ ID NO:1中序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸；

(c)如SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体包括pCAGGS载体、和pHW2000载体。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞(或基因工程细胞)，它含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第一方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物的体细胞。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在本发明的第五方面，提供了一种多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出流感病毒CH1蛋白多肽。

在本发明的第六方面，提供了一种重组的流感病毒，所述的流感病毒的基因组中含有外源导入的编码本发明第一方面所述的流感病毒CH1多肽的核苷酸序列和/或所述的流感病毒的包膜表面含有本发明第一方面所述的流感病毒CH1多肽。

在另一优选例中，所述的流感病毒为减毒病毒。

在另一优选例中，所述的流感病毒为灭活的。

在另一优选例中，所述的流感病毒由本发明第四方面所述的细胞表达和生产。

在另一优选例中，所述的流感病毒可以用做流感病毒疫苗。

在另一优选例中，所述的疫苗包括减毒疫苗和灭活疫苗。

在另一优选例中，所述的流感病毒可以进一步进行减毒修饰和温度敏感性修饰。

在另一优选例中，所述的流感病毒是基于PR8的重组流感病毒。

在另一优选例中，所述的流感病毒为H1N1型。

在本发明的第七方面，提供了一种重组的病毒样颗粒(VLP)，所述的VLP含有本发明第一方面所述的流感病毒CH1多肽。

在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，它含有(i)安全有效量的第一活性成分：所述第一活性成分选自下组：本发明第一方面所述的多肽、或本发明第二方面所述的多核苷酸、或本发明第六方面所述的重组的流感病毒、和/或本发明第七方面所述的重组的病毒样颗粒(VLP)以及(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为甲型流感病毒H1N1型病毒的HA共有的核苷酸序列(如SEQ ID No.:1)。

在另一优选例中，所述药物组合物包括疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有(iii)安全有效量的一种或多种第二活性成分，所述的第二活性成分选自下组：针对其他流感病毒株的DNA、蛋白、VLP、减毒病毒、和/或灭活病毒。

在另一优选例中，所述的第二活性成分包括甲型流感毒株SC09的HA蛋白。

在另一优选例中，所述的第二活性成分包括针对甲型流感毒株SC09的减毒病毒、和/或灭活病毒。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物为DNA疫苗或重组活病毒疫苗。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物为单价或多价(如2、3、4、5、6、7、8)疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物含有针对CH1的活性成分以及针对甲型流感毒株SC09的活性成分。

在本发明的第九方面，提供了一种能与本发明第一方面所述的流感病毒CH1蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的第十方面，提供了一种检测样品中是否存在流感病毒CH1蛋白的方法，包括：

将样品与本发明第九方面所述的抗体接触，

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在流感病毒CH1蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了H1N1HA通用序列的表达、病毒空斑和生长曲线。

其中，图1A显示了CH1在293T细胞中的表达，图1B显示了PR8-CH1病毒在MDCK细胞上形成空斑的形态。图1C显示了PR8-CH1病毒在MDCK细胞上的生长曲线。

图2显示了CH1载体的DNA疫苗免疫效果。

图3显示了CH1和09年甲流二价DNA疫苗的保护效果。

图4显示了PR8-CH1重组病毒的保护效果。

图5显示了8质粒反向遗传学拯救的示意图。

图6显示了本发明CH1的氨基酸序列，其中下划线标出了保守性表位。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次开发了针对H1N1的HA共有序列(CH1),该HA共有序列包含所有已知的T细胞和B细胞表位整合到该序列中，使其具有最普遍的序列代表性。与其他经筛选的共有序列无法被拯救相比，该HA共有序列CH1的核苷酸序列可以成功地用于病毒拯救(如采用标准的8质粒拯救法)，并且经拯救后所获得的病毒株出乎意料地不仅具有广谱性，而且具有优异的减毒性能。因此，基于本发明的共有序列CH1及其DNA和重组活病毒疫苗是具有前景的针对H1N1病毒的广谱性疫苗候选抗原。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人以该CH1序列作为DNA疫苗免疫小鼠，可以激活针对40年代、90年代和09年以后爆发的H1N1病毒的细胞免疫反应。如果在DNA疫苗中加入09年的H1N1流行株的HA序列则可以产生对不同H1N1病毒的广谱性细胞和体液免疫保护反应。进一步用反向遗传学构建了PR8-CH1病毒株，该病毒株在细胞水平繁殖力和疫苗株PR8病毒相当，但在小鼠中致病力极低，以其作为活病毒疫苗，可以保护多种H1N1病毒的攻击。

在本发明中，用DNA疫苗的方式检测了H1N1型甲型流感病毒共有序列CH1的广谱特性。将CH1克隆至真核表达载体中，然后直接免疫小鼠，分别检测了免疫血清对几株代表性H1N1亚型流感毒株的广谱中和活性，以及免疫T细胞对这几种病毒抗原的交叉反应性。结果显示，免疫血清对SC09这株病毒没有中和活性，而对NC99和FM47有很强的中和活性。另外，免疫T细胞在体外用病毒抗原进行刺激发现，所有病毒抗原都能刺激T细胞产生IFNγ。接下来，又在小鼠免疫中加入了SC09流感病毒的HA抗原，然后检测免疫血清和免疫T细胞的广谱反应性。结果发现，在免疫血清获得对SC09病毒中和能力的同时，免疫T细胞对所有病毒抗原的交叉反应性均得到提高。这说明，本发明的HA蛋白通用抗原具有一定的广谱特性，另外，将CH1和SC09的HA联合免疫动物能得到更好的效果。最后发现，PR8-CH1病毒本身是一株弱毒株，有望作为通用型H1N1流感疫苗的备选株。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

本发明多肽

在本发明中，术语“CH1蛋白”、“CH1多肽”、“血凝素HA”或“HA蛋白CH1”可互换使用，都指本发明第一方面所述的CH1多肽，尤其是具有HA蛋白CH1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的HA蛋白CH1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CH1蛋白或多肽”是指CH1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CH1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。CH1多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括流感病毒CH1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然流感病毒CH1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“流感病毒CH1多肽”指具有流感病毒CH1蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与流感病毒CH1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括流感病毒CH1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与流感病毒CH1DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗流感病毒CH1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含流感病毒CH1多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO:3所示的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了流感病毒CH1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有流感病毒CH1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供流感病毒CH1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然流感病毒CH1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“流感病毒CH1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明的核酸和多肽

如本文所用，“本发明的多核苷酸”是指本发明发现的H1N1的HA的共有序列，序列如SEQ ID NO.:1所述。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CH1蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的流感病毒CH1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体(尤其是表达载体)，以及用本发明的载体或CH1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CH1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码流感病毒CH1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，流感病毒CH1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263：3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含流感病毒CH1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold SpringHarbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的流感病毒CH1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为免疫原用于制备疫苗组合物，和用于筛选促进或对抗CH1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组流感病毒CH1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激流感病毒CH1蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对流感病毒CH1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于流感病毒CH1基因产物或片段。较佳地，指那些能与流感病毒CH1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制流感病毒CH1蛋白的分子，也包括那些并不影响流感病毒CH1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的流感病毒CH1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的流感病毒CH1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达流感病毒CH1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断流感病毒CH1蛋白功能的抗体以及不影响流感病毒CH1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用流感病毒CH1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与流感病毒CH1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

流感病毒

流感病毒分3个型——甲型、乙型和丙型，其中，甲型流感病毒不仅能感染人，而且还能感染水禽、鸡、貂和猪等多种动物。甲型流感病毒也是历史上导致大流行的病原体。甲型流感病毒根据其表面膜蛋白HA和NA的抗原特性又可以分为不同的亚型，其中HA有18个亚型，NA有11个亚型。在诸多亚型的流感病毒中，目前流行于人群的是H1N1和H3N2亚型的流感病毒。

具体地，流感病毒的血凝素(HA)是同源三聚体跨膜蛋白，具有由球状头区和茎区组成的胞外结构域。现有疫苗抵抗流感病毒的主要原理是其诱导产生的中和性抗体识别病毒HA蛋白头部结构域的受体结合区附近的区域。

对于甲型流感病毒亚型，可以用血凝素(H)病毒表面蛋白表征甲型流感病毒亚型，并因此用H的数量来标记，诸如例如H1、H3和H5。此外，亚型可进一步用神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白表征，用N的数量表示，诸如例如N1和N2。同样，亚型可以通过H和N的数量两者来表征，诸如例如H1N1、H5N1和H5N2。本术语具体包括每种亚型内的所有菌株(包括灭绝的菌株)，这些菌株通常由突变产生，并表现出不同的病原谱。这类菌株还被称为病毒亚型的各种“隔离体”，包括所有过去的、当今的和未来的隔离体。因此，在该语境下，术语“菌株”和“隔离体”可交替使用。亚型含有基于甲型流感病毒的抗原。所述抗原可以基于血凝素病毒表面蛋白，并可被称为“HA抗原”。在某些情况下，这类抗原基于特定亚型的蛋白，诸如例如H1亚型和H5亚型，其可以分别被称为H1抗原和H5抗原。

基于本发明，可用常规方法制备重组的流感病毒，以用于制备疫苗等应用场合。

一种代表性的方法是采用拯救技术，例如，基于PR8病毒株的拯救技术。PR8病毒是全球通用的疫苗株，一般由8质粒(可获自MTA)反向遗传学拯救获得。将所述的8个质粒导入特定的包装细胞，可用拯救得到PR8病毒。8质粒反向遗传学拯救的示意图如图5所示。

在本发明方法，可用基于本发明CHI的核苷酸序列的质粒，替换原含HA的质粒，从而制得含有本发明多肽的流感病毒(尤其是减毒病毒)。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：本发明第一方面所述的多肽，本发明第二方面所述的多核苷酸、或本发明第六方面所述的重组病毒。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一种重组病毒或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多种重组病毒或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明重组病毒或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的活性组分。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的共有序列CH1及其DNA和重组活病毒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylacticacid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明的共有序列CH1及其DNA和重组活病毒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的共有序列CH1及其DNA和重组活病毒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予共有序列CH1及其DNA和重组活病毒疫苗的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：流感。

在各疫苗剂份中所选用的共有序列CH1及其DNA和重组活病毒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明提供了H1N1型甲型流感病毒的共有序列，表达HA全长基因，保留HA蛋白上所有的抗原表位。

(b)本发明以全长HA1共有序列联合09年的流行株的HA的二价DNA疫苗，可保护多种H1N1病毒的攻击。

(c)本发明以全长HA1共有序列通过反向遗传学构建在PR8骨架中可以得到活病毒疫苗，保护多种H1N1病毒的攻击，可以直接应用于现有的流感疫苗制备生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料和方法

实施例中涉及的通用材料和实验方法如下所示：

1.小鼠、细胞、病毒和质粒

6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，并饲养于SPF级别的动物房；马达二氏犬肾细胞系(MDCK)，人胚胎肾细胞系(293T)均购自ATCC。流感病毒A/Sichuan/1/2009(H1N1)(SC09)，A/New Caledonia/20/1999(H1N1)(NC99)，A/FortMonmouth/1/1947(H1N1)(FM47)获自国家流感中心。PR8病毒骨架获自美国St.JudeChildren Research Hospital，PR8-CH1病毒利用流感病毒反向遗传学技术拯救；pCAGGS载体获自Addgene；HA共有序列CH1由Generay公司化学合成。

2.主要试剂

opti-MEM、RPMI 1640和DMEM细胞培养液购自Gibco；BsmBI限制酶购自NEB公司；pyrobest DNA聚合酶和DNA连接酶Solution I购自TAKARA公司；DNA Gel Extraction Kit和PCR Cleanup Kit购自AXYGEN；质粒抽提试剂盒购自FAVORGEN公司；TIANamp virus RNAKit购自TIANGEN；反转录酶MLV和转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；辣根过氧化酶直标的抗NP抗体由上海生命科学研究院抗体中心(AC)提供；True Blue底物购自KPL；免疫印迹所用的一抗：鼠源抗flag标签的单克隆抗体购自Abmart公司；二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体购自Southern Biotech公司，显影液Luminol/EnhancerSolution购自Thermal公司；Mouse IFNγELISA kit(Ready-Set-Go)购自eBioscience公司。

3.DNA表达质粒的构建

CH1的合成：采用全人工合成方法，合成SEQ ID No.:1所示的CH1的核苷酸序列。

对于pCAGGS-CH1(pCH1-1)的构建，用加了3’-flag标签和BsmB I酶切位点的引物扩增化学合成的CH1模板。引物序列为：正向引物：TATTGCGGCCGCATGAAAGCAAAACTGCTGGTCC(SEQ ID NO.:3)；反向引物：ATATCGTCTCGTATTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGATGCATATTCTGCACTGCAAAG(SEQ ID NO.:4)。

对于pCAGGS-SC09-HA(pSC-HA)的构建，以pHW2000-pH1N1-HA(获自美国St.JudeChildren Research Hospital)为模板，用加了3’-flag标签和BsmB I酶切位点的引物进行扩增。引物序列为：正向引物：TATTCGTCTCAGGGAGCCACCATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCT(SEQID NO.:5)；反向引物：ATATCGTCTCGTATTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAATACATATTCTACACTGTAGAGACCC(SEQ ID NO.:6)。

将上述两种PCR产物和pCAGGS-M载体(将获自Addgene的pCAGGS载体的多克隆位点替换为BsmB I单酶切位点，获得pCAGGS-M)分别进行BsmB I单酶切，然后用solution I连接酶分别将CH1和SC09-HA连接到pCAGGS－M载体上。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，即可分别得到重组质粒pCH1-1和pSC-HA。

4.PCR反应体系和循环参数

对于本实验中所涉及的PCR反应均用以下体系：

循环参数：

第1步：94℃，3min

第2步：94℃，30s

第3步：55℃，30s

第4步：72℃，2min(1kb/min)

第5步：72℃，5min

第6步：4℃

其中，第2—4步运行33个循环

酶切体系

总体积10μl，37℃水浴30min

连接体系

溶液1 5μl

目的基因 4μl

载体 1μl

总体积10μl，16℃静置1小时

蛋白表达鉴定

①前一天晚上铺293T细胞于24孔板使之12小时后长满90％备用。

②取两个EP管，每管加入50μl opti-MEM。在第一个管加入2μl lipofectamine并混合均匀，在第二个管中加入1μg待转质粒并混合均匀，静置5min。

③将第二管中的溶液加到第一管里，混合均匀，静置20min。

④将24孔板中的原有培液换成新鲜培液(DMEM含有10％FBS和1％P/S)，再将质粒和lipofectamine的混合物加入细胞上清的培液，微微晃动板子使之混匀。8—12小时之后换成新鲜培养液。

⑤转染后24—48小时用免疫印迹法检测蛋白表达。

5.免疫印迹

在样品中加入100μl 1×SDS上样缓冲液(60mM的Tris盐酸pH6.8，2％SDS，10％甘油，1％β-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)充分混匀裂解，然后100℃煮10分钟，13000g离心2分钟，取上清，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，设定为恒压200V，30到50分钟。电泳结束后将分离开来的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，转膜恒流350mA，90分钟。之后用含有5％脱脂奶粉的TTBS溶液(20mM Tris base，150mM NaCl，0.1％Tween-20)封闭1小时。然后用鼠源抗flag标签的单克隆抗体(用TTBS加5％脱脂奶粉稀释)室温孵育1.5个小时或4℃孵育过夜。再用TTBS洗膜3次，每次5分钟。最后以辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体(也用TTBS加5％脱脂奶粉稀释)室温孵育1.5个小时，用TTBS洗膜3次，每次5分钟。用显影液Luminol/Enhancer溶液显影。

6.DNA免疫

6到8周龄的小鼠用大腿内侧肌内注射的方式分别免疫空载及表达质粒。两只大腿注射相等的量，每只大腿注射50μl。将一对相距5mm的电极针头插入肌肉，使电极插入位点位于注射位点的两侧，然后进行电击，电转仪参数设置为：电压100V，5个电脉冲，每个脉冲20ms，脉冲之间间隔200ms。

7.全病毒灭活抗原的制备

接种病毒于2个长满MDCK细胞的细胞培养瓶中，培养液为含有0.2％BSA和1μg/mlTPCK-Trypsin的DMEM培养基。待培养瓶中细胞产生明显CPE时(细胞有约80％从瓶底脱落)收集病毒上清，3500rpm离心5min。将上清转移至一个新的50ml离心管中，加入1‰的多聚甲醛溶液并混合均匀，4℃静置48h，然后进行安检盲传。将灭活了的病毒液进行超速离心，先将超速离心管中加入大于一半体积的20％蔗糖(蔗糖溶液需过滤除菌)，然后在蔗糖垫上缓缓加入已经灭活了的病毒液，使最终液面高度离超离管口接近1毫米的距离(如果病毒液体积不够则用PBS补加)，用天平进行两两平衡后开始超速离心。离心参数设置为：4℃，200000g转速离心2小时。离心结束后，取出离心管，弃上清，将离心管倒扣于无菌的纸上面一段时间，使管底不再有液体残留。用适量PBS溶解管底的灭活病毒即可。

8.血清采集

用无菌眼科镊快速摘除眼球，放血于无菌2mL离心管中(不加抗凝剂)，每只可收集最多1mL全血，垂直立于管架上。4℃过夜，10000rcf，15min。吸取上面血清并分装，每只小鼠的血清分装成若干份，每份100μl。

9.脾细胞收集

①在工作台中将12孔板每个孔装预冷RPMI1640培液。

②将小鼠摘眼球取血处死后，置75％酒精浸泡1～2min，取出后无菌解剖取出脾脏，尽量不带有脂肪。

③将每个脾脏置于12孔板每一行的第一孔，然后从第一孔向后依次洗涤脾脏，直到最后一孔。

④用扁头镊子捏碎脾脏，使脾细胞充分悬浮。

⑤将BD Falcon(40μm)置于50ml离心管上，将捏碎的脾脏悬液全部透过BD Falcon过滤至离心管中。

⑥1500rpm离心5min，弃上清。

⑦加入3～5ml红细胞裂解液，吹打均匀，冰上裂解5min。

⑧1500rpm离心5min，弃上清。

⑨重复⑦～⑧(裂解不充分则重复一次)。

⑩用RPMI1640洗细胞一次。1500rpm离心5min，弃上清。

加入5ml RPMI1640(含10％FBS和1％P/S)重悬细胞。

细胞计数后，稀释至107cells/ml，备用。

10.T细胞的体外抗原刺激

将分离得到的脾脏细胞加入96孔板中，每孔106个细胞。然后在每个孔中加入相应的灭活病毒抗原，使每孔抗原浓度为40μg/ml。37℃，5％CO2，孵育48小时。取细胞上清，5000rpm/min离心5min去除细胞沉淀。用ELISA kit检测上清中IFNγ浓度。

11.ELISA

①ELISA板每孔加100μl Capture Antibody(按照试剂盒说明以1∶1000稀释在Coating Buffer里)，4℃过夜。

②吸出每孔中的液体，用Wash Buffer洗涤三次，每孔加入至少250μl，每次洗涤使板子浸泡至少1min。最后一次洗涤之后将板子倒扣于吸水纸上并拍干。

③每孔用200μl 1×Assay Diluent封闭(5×Assay Diluent用去离子水稀释)，室温孵育1小时。

④将Assay Diluent吸出之后加标准品和待测样品，每孔100μl，用膜将ELISA板子密封，室温放置2小时。标准品用Assay Diluent稀释成最高浓度2000pg/μl，然后再进行一系列倍比稀释，一共做8个稀释度。

⑤按照步骤②进行洗涤，洗涤3—5次。

⑥每孔加入100μl Detection Antibody(按照试剂盒说明以1∶1000用1×AssayDiluent进行稀释)，用膜将ELISA板子密封，室温放置1小时。

⑦按照步骤②进行洗涤，洗涤3—5次。

⑧每孔加入100μl Avidin-HRP，用膜将ELISA板子密封，室温放置30min。

⑨按照步骤②进行洗涤，每次加入Wash Buffer后静置1—2min，洗涤5—7次。

⑩每孔加入100μl底物，室温孵育。

每孔加50μl终止液终止显色。

在450nm波长下读板。

12.病毒TCID50测定

①铺MDCK于96孔板(第A-H行，第1-11列)，12小时后生长至超过90％备用。

②在96孔板用DMEM(0.2％BSA和1μg/ml TPCK)稀释病毒原液(1-10列10-1～10-10，A-H行8个重复)。

③MDCK细胞吸掉培液，用PBS洗细胞一遍，1-10列每孔加入相应稀释度病毒100μl。第11列空白对照，加入DMEM(含0.2％BSA和1μg/ml TPCK)。A-H行8个重复。37℃，5％CO2，20小时。

④吸去孵育上清，PBS洗细胞两遍。预冷的80％丙酮的PBS溶液每孔100μll固定20min。做antiNP ELISA测吸光值。

大于(空白对照+3×空白对照标准差)的孔记为阳性。Reed-Muench法计算TCID50。

13.Anti-NP ELISA：

漂洗液：0.05％Tween20的PBS溶液；稀释液：PBS溶液含1％BSA和0.1％Tween20；OPD：2g OPD(邻苯二胺)加入到4L 0.05M含0.03％过硼酸钠的柠檬酸缓冲液，现配现用。

①弃固定液后用漂洗液洗3遍，3min/次，用力拍干。

②用稀释液1:10000稀释anti-NP HRP，50μl/well，室温1h。

③用漂洗液洗板子6次，3min/次，用力拍干。

④每孔加入OPD 50μl，室温3～5min。0.5M H₂SO4 50μl/well终止反应。

分光光度计在490nm波长下读板

14.微中和试验：

①铺MDCK细胞于96孔板，使之12小时后生长至超过90％备用。

②把血清放置56℃水浴灭活30min，加9倍体积的PBS稀释至10-1稀释度。在96孔板中用加0.2％BSA的DMEM培液以2倍梯度稀释(1～10列，20～2-9稀释)，最终每孔50μl。

③每孔加入50μl含有100个TCID50的病毒液(预先将病毒原液稀释到100个TCID50/50μl)。

阳性对照(PC):(第11列A-D)50μl DMEM(含0.2％BSA)+50μl virus；阴性对照(NC):(第11列E-H)100μl DMEM(含0.2％BSA)。置于37℃，5％CO2，1小时。每个血清做两个重复。

④吸去MDCK细胞上层培液，加入100μl DMEM(含0.2％BSA和2μg/ml TPCK)。

⑤将100μl病毒-血清混合物对应全部加入MDCK细胞板中。37℃，5％CO2培养20小时。

⑥吸掉上清，用PBS洗细胞一遍，预冷的80％丙酮的PBS溶液100μl/well固定10min。用anti-NP ELISA测吸光值。

⑦

OD值低于X的孔判定为中和试验反应阳性，阳性血清最高稀释度的倒数即为血清滴度。

15.小鼠攻毒实验：

①准备病毒置于冰上。

②麻醉小鼠。用棉球蘸上无水乙醚，置于封闭的LOCK盒中，将小鼠放进盒中，约1-3min即可起效。小鼠应昏迷并呈腹式呼吸状。此时可进行下一步操作。

③鼻腔接种50μl稀释好的病毒液。拇指、食指抓住麻醉好小鼠的颈后部，小指抓住尾部，使其头部朝上稍向后仰。吸取50μl稀释好的病毒液，滴入鼻孔。控制速度均匀、缓慢，防止小鼠喷咳出病毒液。放回小鼠。

④感染后逐天称量小鼠体重至第14天，若有体重下降超过25％则计为死亡，并将小鼠处以安乐死。

16.石蜡包埋、切片和HE染色：

小鼠肺脏取出之后放在4％多聚甲醛中固定至少两个小时，然后4℃保存于70％乙醇中。然后依次经历石蜡包埋、切片、脱蜡复水、HE染色4个步骤。

①石蜡包埋：保存于4℃70％乙醇中的组织样品依次经过以下溶液浸泡：80％乙醇45min，95％乙醇45min，100％乙醇45min，100％乙醇45min，1/2乙醇1/2二甲苯10min，二甲苯透明5min看一下，若没有出现淡黄色半透明状态，再浸泡5min，石蜡(1)1h，石蜡(2)1h，石蜡包埋，4℃保存。

②用切片机切片，切片的厚度为5μm。

③脱蜡、复水步骤：密封保存于4℃的组织切片依次经过：60℃焙烤10min，二甲苯(1)10min，二甲苯(2)10min，100％乙醇3min，80％乙醇3min，70％乙醇3min，ddH₂O浸泡3min。

④石蜡切片经脱蜡、复水后依次经过以下溶液浸泡：苏木精室温4min，水洗3次、2min/次，0.1％盐酸乙醇1-2sec，水洗2次、2min/次，氨水1min，水洗1min，95％乙醇1min，伊红液30s—1min(2min)，95％乙醇1min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，60℃焙烤2min，二甲苯2min，最后用中性树胶封片，室温干燥保存。

实施例1

H1N1型流感病毒HA基因共有序列CH1的表达和PR8-CH1重组病毒的拯救

从NCBI上下载了2656条H1N1病毒的HA序列，用MEGA 5.0软件Neighbor-Joining方法构件进化树，以2009年爆发的甲型流感大流行株为结点选取树状进化树上的与其交叉的其他病毒基因，将这些病毒基因用clustalX软件获得共有序列，并将所有已知的T细胞B细胞表位进行替换，得到共有序列CH1。

以全人工合成CH1(SEQ ID NO.:1)序列为模板，用引物(SEQ ID No.:3和4)经PCR扩增获得扩增产物，并将经酶切的扩增产物插入到pCAGGS真核表达载体(氨基酸序列的C-端加上flag标签)构建成重组质粒pCH1，转染293T人胚胎肾细胞以检测蛋白表达情况。

结果如图1A所示，pCH1在293T细胞中有很高的表达量，确定其在真核细胞中能够高效表达。

又将CH1克隆至pHW2000载体，将pHW2000-CH1质粒与含有PR8其它七条基因的七个pHW2000质粒一起，用反向遗传学技术构建重组病毒，命名为PR8-CH1。

经检测，PR8-CH1可以在MDCK细胞上正常形成病毒空斑(图1B)。在MDCK细胞上和PR8病毒的生长速度也相当(图1C)。

实施例2

H1N1型流感病毒HA基因共有序列CH1的共有序列CH1的广谱效果

为了检测CH1是否能够诱导交叉反应性免疫应答从而作为广谱疫苗的候选抗原，直接以pCH1作为DNA疫苗免疫小鼠，然后检测免疫血清和免疫T细胞的广谱反应性。用pCH1通过肌肉注射和电穿孔的方法免疫6—8周龄的雌性Balb/c小鼠，一共免疫3次，间隔2周。在最后一次免疫后两周取小鼠血清和脾脏T细胞，用几株有代表性的病毒作为抗原来检测免疫小鼠所产生的交叉反应性体液免疫应答和细胞免疫应答。

检测所用病毒株的选择如图2A所示。SC09来自于2009年爆发的所谓“甲流”所在的进化簇，它形成一个庞大的分支，目前流行的季节性H1N1流行株大多是甲流的后代病毒；CH1和FM47都来自于位于中间的这个进化簇，此进化簇中的序列均来自20世纪80年代及其以前的病毒株，在进化时间上比较古老；第三簇位于最底端，它的序列包括20世纪90年代以后的病毒HA序列，相当于比较近代的进化簇，NC99来自于此进化簇。

小鼠免疫后第14天取了免疫血清并同时分离了脾脏细胞。用SC09、NC99、FM47和PR8-CH1四株病毒检测了免疫血清的微中和活性。

如图2B所示，pCH1免疫过的血清对PR8-CH1病毒自身和NC99以及FM47三株病毒有很强的中和活性，微中和效价均超过2000，但是免疫血清对SC09的中和活性很低，效价不足40。

SC09的HA和CH1蛋白质序列相似性分析表明，两者序列的同源性只有80.2％。虽然细胞免疫应答不能阻止流感病毒入侵机体，但是T细胞在清除体内流感病毒的过程中起到重要作用。因此，又检测了pCH1-1是否能诱导小鼠产生交叉反应性细胞免疫应答。用SC09、NC99、FM47和PR8-CH1四株病毒的灭活抗原在体外刺激免疫过的小鼠脾脏T细胞，然后检测细胞上清中分泌的IFNγ的浓度。

结果如图2C所示，免疫T细胞在体外能被PR8-CH1抗原自身强烈活化，而SC09、NC99和FM47的灭活抗原也能诱导T细胞分泌IFNγ，这说明CH1共有序列中存在与3株病毒共有的T细胞表位(即广谱表位)，能够诱导交叉反应性T细胞免疫应答。

由于，本发明设计的共有序列CH1不能产生对甲流毒株SC09的交叉反应性细胞免疫应答，因此，又将SC09的HA蛋白纳入了免疫方案中。在下面的动物免疫中，将pSC-HA与pCH1-1联合起来共同免疫小鼠，免疫血清对SC09病毒的中和活性得到了极大的提高，对其他病毒也有很高的中和活性(图2D)。用灭活病毒抗原体外刺激免疫T细胞，灭活的SC09刺激的细胞上清中分泌的IFNγ的含量明显增高，其他三种灭活病毒抗原刺激的细胞上清中IFNγ的含量也明显得到提高(图2E)。这说明加入SC09-HA进行免疫小鼠使得广谱表位的数量增加了。

实施例3

H1N1型流感病毒共有序列CH1作为二价DNA疫苗的保护效果

本实施例用于检验免疫pCH1-1+pSC-HA的质粒组合能否保护小鼠免受病毒的致死攻击。

每只小鼠免疫pSC-HA与pCH1-1各50μg，对照组每只小鼠免疫76μg Vector。第三次免疫后第14天，每组小鼠鼻腔分别接种SC09(10个LD50)、NC99(10个LD50)和FM47(60个LD50)活病毒，接种后每天对其称重，将体重下降超过初始体重25％的小鼠处死，并记为死亡，攻毒后第14天小鼠称重后全部处死。

如图3所示，SC09(A和D)和FM47(C和F)对免疫过的小鼠几乎没有致病作用，小鼠体重在攻毒后的14天内没有任何下降的趋势，小鼠死亡率也为0；免疫Vector的小鼠则完全不被保护，所有小鼠在第4天体重均明显下降，在第6天所有小鼠体重低于75％因而被处死，死亡率为100％。另外，用NC99攻毒免疫过的小鼠发现(B和E)，在攻毒后的2到4天里小鼠体重稍有下降，但是很快又恢复正常，最终所有小鼠均得到了很好的保护，小鼠死亡率为0；而免疫Vector的小鼠则完全不被保护，NC99攻毒后，小鼠体重持续下降，在第4天死亡50％，在第6天死亡100％。因此，pCH1+pSC-HA质粒组合诱导的交叉免疫应答能够对小鼠产生交叉保护作用，这种保护作用能够抵抗SC09、NC99和FM47三株病毒的致死攻击。

为了检测质粒组合免疫是否能够保护肺脏免受病理损伤，将小鼠免疫过pCH1+pSC-HA质粒组合后用病毒攻毒，然后观察小鼠肺脏的病理变化情况。

如图3G所示，免疫过pCH1-1+pSC-HA质粒组合的小鼠在用SC09、NC99和FM47攻毒后只表现出了轻微的病变，肺泡、细支气管形态都相对正常，与未经病毒感染的肺脏状况相似。而免疫了Vector的小鼠，在攻毒后其肺脏发生了严重的病变，支气管周围淋巴细胞浸润、血管破裂、炎性因子充满了支气管和肺泡，肺泡的形态已经完全被炎性因子掩盖。

实施例4

重组病毒PR8-CH1的保护效果

实施例1构建的重组病毒PR8-CH1是一株天然减毒的弱毒株。在本实施例中，直接用PR8-CH1重组活病毒作为疫苗免疫小鼠，检测其对小鼠的交叉保护作用。

每只小鼠鼻腔接种50μl含10⁶个PFU的PR8-CH1的病毒粒子或50μl PBS作对照。接种后第28天，每组小鼠鼻腔分别接种10个LD50的SC09和NC99活病毒，接种后每天对其称重，将体重下降超过初始体重25％的小鼠处死，并记为死亡，攻毒后第14天小鼠称重后全部处死。

如图4所示，用SC09和NC99对小鼠攻毒后，免疫过的小鼠在第1到第3天体重发生轻微减小，随后很快恢复正常；而接种PBS的小鼠体重持续下降，在SC09攻毒后第5天，所有小鼠体重均低于原始体重的75％因而全部记为死亡；在NC99攻毒后第5天，75％的小鼠体重下降至75％以下，最终只有25％的小鼠存活下来。上述结果提示，以PR8-CH1作为减毒活疫苗可以诱导交叉保护性免疫应答，这种免疫应答能抵抗2009年发生的流感大流行毒株的侵染。

如图4E所示，在实验终点时PBS接种免疫的小鼠肺脏内SC09病毒平均病毒残留量超过10⁴数量级，NC99攻读的小鼠肺脏内病毒滴度接近10⁴数量级(其中一只小鼠最后存活下来，肺脏内没有病毒残留，其余小鼠肺脏内病毒残留约10⁴数量级)。而PR8-CH1免疫的小鼠肺脏内没有任何可检测到的病毒残留。因此，这表明以PR8-CH1活病毒作为减毒活疫苗对小鼠具有极好的交叉保护作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用

<130> P2018-0206

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaagcaa aactgctggt cctgttatgt gcactttcag ctacagatgc agacacaata 60

tgtataggct accatgcgaa caactcaacc gacactgttg acacagtact cgaaaagaac 120

gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagtc acaacggaaa actatgcaga 180

ctaaaaggaa tagccccact acaattgggg aaatgcagca ttgccggatg gatcttagga 240

aacccagaat gcgaatcact gttttctaag aaatcatggt cctacattgc agaaacacca 300

aactccgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg actatgagga actgagggag 360

caattgagtt cagtatcatc attcgagaga ttcgaaatat tccccaagga aagttcatgg 420

cccaaacaca acgtaaccag aggagtaacg gcatcatgct cccataaggg gaaaagcagt 480

ttttacagaa atttgctatg gctgacggag aaaaatggct tgtacccaaa tctgagcaag 540

tcctatgtga acaacaaaga gaaagaagtc cttgtactat ggggtgttca tcacccgtct 600

aacatagagg accaaaagac cctgtatcgt aaagaaaatg cttatgtctc tgtagtgtct 660

tcacattata acaggagatt caccccagaa atagcaaaaa gacccaaagt aagagatcaa 720

gaagggagaa ttaactacta ctggactctg ctggaacccg gggacacaat aatatttgag 780

gcaaatggaa atctaatagc gccatggtat gctttcgcac tgagtagagg ctttgggtca 840

ggaatcatca cctcaaacgc atcgatggat gaatgtgacg cgaagtgtca aacaccccag 900

ggagctataa acagtagtct tcctttccag aatgtacacc cagtcacaat aggagagtgc 960

ccaaagtacg tcaggagtac aaaattaagg atggttacag gactaaggaa catcccatcc 1020

attcaatcca gaggtttgtt tggagccatt gccggtttca ttgaaggggg atggactgga 1080

atgatagatg gatggtatgg ttatcatcat cagaatgaac agggatctgg ctatgctgcg 1140

gatcaaaaaa gcacacaaaa tgccattgac gggattacaa acaaggtgaa ctctgtaatc 1200

gagaaaatga acactcaatt cacagctgtg ggtaaagaat tcaacaaatt agaaaaaagg 1260

atggaaaact taaataaaaa agttgatgat ggatttctgg acatttggac atataatgca 1320

gaattgttgg ttctactgga aaatgaaagg actttggatt ttcatgactc aaatgtgaag 1380

aacctgtatg agaaagtaaa aagccaatta aagaataatg ccaaagaaat aggaaacggg 1440

tgttttgaat tctaccacaa gtgtaacaat gaatgcatgg aaagtgtaaa aaatggaact 1500

tatgactatc caaaatattc agaggaatca aagttaaaca gggaaaaaat tgatggagtg 1560

aaattggaat caatgggagt ctatcagatt ctggcgatct actcaactgt cgccagttca 1620

ctggtgcttt tggtctccct gggggcaatc agcttctgga tgtgttctaa tgggtctttg 1680

cagtgcagaa tatgcatcga ctacaaagac gatgacgaca agtaa 1725

<210> 2

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ser Ala Thr Asp

1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile

50 55 60

Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile

85 90 95

Ala Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe

100 105 110

Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe

115 120 125

Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Asn

130 135 140

Val Thr Arg Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Lys Gly Lys Ser Ser

145 150 155 160

Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro

165 170 175

Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val

180 185 190

Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Lys Thr Leu

195 200 205

Tyr Arg Lys Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Asn

210 215 220

Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln

225 230 235 240

Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr

245 250 255

Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe

260 265 270

Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser

275 280 285

Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn

290 295 300

Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys

305 310 315 320

Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg

325 330 335

Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

340 345 350

Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr

355 360 365

His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser

370 375 380

Thr Gln Asn Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile

385 390 395 400

Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys

405 410 415

Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe

420 425 430

Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn

435 440 445

Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu

450 455 460

Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly

465 470 475 480

Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val

485 490 495

Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu

500 505 510

Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr

515 520 525

Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu

530 535 540

Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu

545 550 555 560

Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tattgcggcc gcatgaaagc aaaactgctg gtcc 34

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatcgtctc gtattacttg tcgtcatcgt ctttgtagtc gatgcatatt ctgcactgca 60

aag 63

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tattcgtctc agggagccac catgaaggca atactagtag ttctgct 47

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atatcgtctc gtattacttg tcgtcatcgt ctttgtagtc aatacatatt ctacactgta 60

gagaccc 67

Claims

1.一种分离的流感病毒CH1多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

2.如权利要求1所述的CH1多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列具有SEQ ID NO:1中序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞(或基因工程细胞)，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求1所述的多核苷酸。

7.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出流感病毒CH1蛋白多肽。

8.一种重组的流感病毒，其特征在于，所述的流感病毒的基因组中含有外源导入的编码权利要求1所述的流感病毒CH1多肽的核苷酸序列和/或所述的流感病毒的包膜表面含有权利要求1所述的流感病毒CH1多肽。

9.一种重组的病毒样颗粒(VLP)，其特征在于，所述的VLP含有权利要求1所述的流感病毒CH1多肽。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有(i)安全有效量的第一活性成分：所述第一活性成分选自下组：权利要求1所述的多肽、或权利要求3所述的多核苷酸、或权利要求8所述的重组的流感病毒、和/或权利要求9所述的重组的病毒样颗粒(VLP)以及(ii)药学上可接受的载体。