BRPI0716145B1

BRPI0716145B1 - Composição de vacina e método para preparar uma composição de vacina para o vírus chikungunya

Info

Publication number: BRPI0716145B1
Application number: BRPI0716145-0A
Authority: BR
Inventors: Jaya Sheela Pydigummala; Nagendra R. Hedge; Krishna Murthy Ella; Kandaswamy Sumathy
Original assignee: Bharat Biotech International Limited
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-08-31
Publication date: 2021-06-22
Also published as: CN101516395A; US20130022631A1; WO2008026225A2; BRPI0716145A2; US8865184B2; EP2073839A2; WO2008026225A3; EP2073839B1; CN101516395B

Abstract

formulação de vacina, método de adaptação e propagação do vírus chikungunya, método de concentração e purificação de vírus, composição potencialmente imunogênica, seqüência de nucleotídeo, construto de dna recombinante, método para produzir proteína recombinante, composição farmacêutica, método in vitro ou in vivo e método para elicitar resposta imune protetora. a presente invenção se refere a uma formulação de vacina capaz de elicitar a resposta imune protetora contra a infecção pelo vírus chikungunya em humanos e em outros hospedeiros mamíferos. a formulação imunogênica compreende o vírus chikungunya purificado inativado em uma formulação estável. métodos de propagação e purificação do vírus são discutidos. a formulação do virus inativado é não-infecciosa imunogênica e evidencia a resposta imune protetora em hospedeiros mamíferos. a composição imunogênica é formulada para administração in vivo para humanos. a invenção também discute a estratégia de desenvolvimento de uma vacina de subunidade usando proteínas virais recombinantes como antígenos para imunização. os antígenos do vírus recombinante que são potencialmente imunogênicos podem ser usados em diagnóstico para a presença do vírus.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[01] A presente invenção se refere à formulação de vacina capaz de elicitar a resposta imune protetora contra a infecção por vírus Chikungunya (CHIKV) em humanos e em outros hospedeiros mamíferos. A formulação imunogênica compreende o vírus Chikungunya inativado purificado em uma formulação estável. O método de adaptação e propagação do vírus íz vitro em cultura celular continua em linhagens celulares de vacina de qualidade tais como células Vero e MRC-5, que são aprovadas pelo FDA/Autoridade Reguladora Nacional, é fornecido. Purificação e métodos de inativação do vírus são discutidos. O método de preparação e administração de formulações líquidas e liofilizadas do vírus com estabilizadores adicionados é discutido. A preparação do virus inativado é não-infecciosa, imunogênica e evidencia a resposta imune protetora no hospedeiro mamifero. A composiçãoimunogênica é formulada para administração fx vivo aos humanos. Dentro do escopo da presente invenção está a estratégia de desenvolver uma vacina de subunidade usando as proteínas recombinantes do vírus como antigenos capazes de elicitar a resposta imune protetora contra a infecção por vírus Chikungunya em hospedeiros mamíferos. Os antigenos recombinantes poderiam potencialmente encontrar uso no diagnóstico para a presença do vírus.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[02] Doença e epidemiologia: Chikungunya é uma doença fisicamente debilitante dos humanos principalmente na África e Ásia. Os sintomas incluem o inicio abrupto de febre alta,erupções ou hemorragias, artralgia e participação ocasiOnal do sistema nervoso, coração e fígado. A incapacitação é devido à artralgia, que pode persistir por anos (Sarkar et al., 1965; Rao et al., 1965; Nimmannitya et al., 1969;Schuffenecker et al., 2006). A doenÇa é causada pelo vírus Chikungunya (CHIKV), e espalhada por mosquitos Redes spp., ou através de outros hospedeiros vertebrados que habitam na floresta (na África) ou por um ciclo humano-mosquito-humano (na Ásia) (Powers et al., 2000). Houve diversas manifestaçõesprincipais da doença, incluindo as recentes no Oceano Índico, Malária e Índia, com vários milhares de pessoas afligidas. Na Índia, as manifestações principais parecem ter ocorrido uma vez nos anos 60 e então em 2005-2006 (Shah et al., 1964; Raoet al., 1965; Chaturvedi et al., 1970; Ravi, 2006). Na manifestação recente, diversos distritos em Karnataka, Andhra Pradesh, Tamil Nadu, Maharashtra, e possivelmente Orissa foram afetados. A doença pode ser diagnosticada por vários testes sorológicos, mas a identificação definitiva exige a verificação do material genético uma vez que muitos arbovirusestreitamente relacionados causam doença similar. O tratamento é somente paliativo e não há nenhuma vacina comercialmente disponível.

[03] O virus abriga um genoma de RNA de fita única, de sentido positivo, e pertence ao grupo de arbovirus A juntocom os virus da doença da floresta de Semliki e Sindbis no gênero do alfavirus da familia Togaviridae (Fauquet et al., 2005). O virion é 50-60 nm em tamanho e é inativado por etanol 70%, hipoclorito de sódio 1%, glutaraldeido 2%, solventes de lipideo, aquecimento úmido ou seco > 58°C, assimcomo secagem.

[04] Genotipagem sugere a existência de três clados: Da África Ocidental, Leste-Central-Sul-Africano e asiático. As cepas asiáticas e africanas a partir de clados estreitamente relacionados que diferem entre si em seqüência, antigenicidade e propriedades do virus. Os isolados asiáticos parecem ser mais conservados do que cada um dos clados africanos (Powers et al., 2000; Schuffenecker et al., 2006). Os isolados da manifestação recente do Oceano Índico mostrauma mudança de característica de alanina para valina na posição 226 do envelope de glicoproteina E1 do principio auma fase mais tardia da doença, respectivamente (Schuffenecker et al., 2006). Enquanto a importância disSO não for compreendida, uma vantagem evolucionária para o virus pode suposta.

[05] Não muito é conhecido sobre as proteínas virais, sua função ou patogenicidade. O genoma consiste em -12 quilobases, com uma tampa 5' 7mG e região 3' poli(A), e uma composição de base de 30% de A, 25% de C e G, e 20% de U. O genoma tem a seqüência de 5'-nsP1-nsP2-nsP3-nsP4- (região de junçâo)-C-E3-E2-6K-E1-poliA-3'. As proteinas nâo-estrutura is são traduzidas diretamente dos dois terços 5'do genoma, e as proteínas estruturais são produzidas a partir do RNA subgenômico 26S que é colinear com o um terço 3' do genoma. Dgenoma contém seqüências de repetição conservadas assim como um trato poli(A) interno dentro da região 3' não-traduzid a (Khan et al., 2002; Schuffenecker et al., 2006).

[06] Baseado na informação da seqüência, foi deduzido que as proteínas nsP1, nsP2, nsP3, nsP4, C, E3, E2, 6K e El contêm 535, 798, 530, 611, 261, 64, 423 e 61 aminoácidos (Khan et al., 2002; Schuffenecker et al., 2006). As proteínas de envelope podem ser observadas em géis de SDS como 62 kD E2/E3, o qual é clivado em E2 e E3 dentro de 90 minutos, e 45-50 kD El e E2 que migram estreitamente juntos. El e E2 se associam firmemente um com o outro rapidamente. A proteina E3de 11 kD não é associada com o virion, e é liberada no meio (Simizu et al., 1984; Ranadive e Banerjee, 1990). A glicoproteina E1 viral aglutina eritrócitos, e testes de hemaglutinação (HA) e de inibição da hemaglutinação (HI) podem ser realizados rotineiramente em eritrócitos de ganso para finalidades diagnósticas. A atividade HA do virus não é suscetível à tripsina, e é realçada pelo tratamento de tween-éter (Hannoun, 1968). O soro com titulações de HI >40 mostra geralmente a capacidade de neutralização (Bedekar e Pavri,1969b).

[07] O isolamento do vírus pode ser realizado em ratos ou camundongos recém-nascidos, ou em culturas celulares de animais ou insetos. Células Vero, de rim do macaco verde africano, BHK21, BSC-1, fibroblasto do embrião de pinto e C6/36 foram usadas para isolamento e expansão in vitro do vírus. O vírus replica razoavelmente rapidamente na cultura celular. Dependendo da dose e da linhagem celular, o efeito citopático pode ser observado em 1248 horas. Em multiplicidades de 1-5, depois de um periodo de eclipse de 5-6 horas, a titulação do virus intracelular se eleva bruscamente e atinge o pico em 12 horas. O vírus extracelular pode ser observado a 8 horas da pós-infecção e picos em 12-24 horas dependendo do sistema da célula e da dose da inoculação (Chain et al., 1966; Higashi et al., 1967; Hahon e Hankins, 1970; Eckels et al., 1970). A propagação da infecção através da monocamada difere em tipos diferentes de célula, envolvendo ambas as transmissões extracelulares e célula- para-célula nas células BHK2l, mas somente o anterior em L929 e em células do pulmão de cobaia (Hahon e Zimmerman, 1970).As titulações nos sobrenadantes podem alcançar tão alto quanto aquelas observadas com preparações de cérebro de camundongo (Shah et al., 1964; Paul e Singh, 1968; Umrigar e Kadam, 1974).

[08] O vírus pode ser concentrado a partir do sobrenadante da cultura celular por ultracentrifugação, ou precipitação com sulfato de amônio, alume, ou polietileno qlicol (Eckels et al., 1970; Klein et al., 1970; Banerjee e Ranadive, 1988; Killington et al., 1996). O vírus pode ainda ser purificado usando a centrifugação de taxa por zona, gradiente de densidade de equilíbrio ou filtração de gel (Eckels et al., 1970; Simizu et al., 1984; Banerjee e Ranadive, 1988). A titulação do virus pode ser executada por imunofluorescência, ELISA, fixação de complemento, imunodifusão em gel de agar, hemaglutinaçâo e inibição, ensaios de placa, ou neutralização.

[09] É desconhecido como CHIKV ou outros alfavirus causam a artrite. Os mecanismOs sugeridos incluem replicaÇão conduzindo à morte celular e ao dano de tecido, ataque imuno-mediado nas junções, ou inflamação imuno- complexo-mediada. Embora o vírus da floresta de Semliki e o vírus de Ross River tenham sido mostrados como sabendo replicar em tecido conectivo associado ao osso em neonatos assim como pele e músculo em camundongos adultos (Heise et al., 2000), nenhumtal estudo foi feito com CHIKV.

[010] Em contraste com o vírus da Dengue, que requer adaptação para a infecção de animais, CHIKV mostra fatalidade rápida e alta na inoculação primária de amostras clínicas (Myers et al., 1965). Entretanto, os ratos e camundongos recém-nascidos são as únicas espécies que mostram a doença (Chakravarthy e Sarkar, 1969). Em uma maneira dose-dependente, os filhotes de rato/camundongo mostram doença e alta mortalidade seguindo a inoculação intracerebral, intraperitoneal ou subcutãnea no soro dos pacientes em 310 dias, produzindo l0” 5-l07’0 camundongo-LD5 do vírus por mL do soro (Shah et al., 1964). Os animais rapidamente manifestam preguiça, inapetência severa, cianose, hipotermia dérmica, e morte.Patologicamente, eles mostram dilatação cardíaca, hemorragias no trato gastrointestinal, alvéolos, bexiga, junções e pele,músculo esquelético e necrose de almofada de gordura, e disfunção intestinal difusa (Nimmannitya et al., 1969; Weiss et al., 1965). Os sobreviventes (doses mais baixas injetadas)apresentam crescimento reduzido, mas desenvolvem anticorpos de HI e são protegidos do desafio após o desafio intracerebral ou intraperitoneal (Shah et al., 1964; Giovarelli et al., 1977).

[011] Coelhos e cobaias recém-nascidos são moderadamente suscetíveis com alguma recuperação do vírus, e filhotes de gato de um dia são menos suscetiveis. Camundongos, ratos, cobaias, hamsters, lebres e coelhos adultos apresentam viremia, mas não a doença, e desenvolvem anticorpos HI e neutralizantes, enquanto gatos e galinhas adultos não. Titulações mais baixas de anticorpos HI sem viremia ou anticorpos neutralizantes podem ser vistos em vacas, carneiros, cabras e cavalos (McIntosh et al., 1963; Bedekar e Pavri, 1969a; Chakravarthy e Sarkar, 1969). A susceptibilidade dos pássaros é controversa. Em um estudo, os pintinhos legorne brancos foram mostrados sucumbindo à inoculação do vírus, e os pássaros recuperados desenvolvem anticorpos de neutralização (Bedekar e Pavri, 1969a). Este eoutros estudos envolvendo galinhas, pardais, pombos e morcegos apresentaram soroconversâo sem viremia ou nada (Shah et al., 1964; Bedekar e Pavri, 1969a).

[012] Macacos adultos pertencendo a várias espécies apresentam viremia, podem transmitir o vírus aos mosquitos, e desenvolvem anticorpos de neutralização duradouros (Paul e Singh, 1968). Macacos e babuinos selvagens na África circulam titulações elevadas do vírus sem nenhuma doença aparente como resultado da infecção, e podem transmitir o vírus através dos mosquitos (McIntosh et al., 1963). Entretanto, a evidência sorológica da infecção natural dos macacos não existe na Índia (Bedekar e Pavri, 1969b).

[013] A infecção de CHIKV (seja clinica ou silenciosa) é considerada por conferir imunidade de vida longa. Por causa do relacionamento antigênico próximo, a proteção cruzada entre cepas diferentes (Casals, 1957; Porterfield, 1961; Shah et al., 1964) assim como a proteção cruzada recíproca entre outros alfavirus (Parque e Preço, 1958; Hearn e Rainey, 1963)podem ser supostas, e são demonstradas nos modelos animais. Entretanto, existe alguma evidência de que as vacinas de alfavirus vivos atenuados podem interferir com uma vacina subseqüente, relacionada (McClain et al., 1998).

[014] Como um prelúdio às vacinas, as preparações iniciais de CHIKV envolveram ou a inativação por formalina (Harrison et al., 1967) ou a extração tween-éter do virus crescido íx litro (Eckels et al., 1970). Enquanto a formalina mata a atividade HA, o último tratamento retém a atividade HA completamente, embora ambos percam a infectividade drasticamente. Entretanto, ambos evidenciam anticorpos HA e de fixação de complemento e de neutralização similares e também mostram níveis similares de proteção em estudos de desafio letal (Eckels et al., 1970).

[015] O instituto médico de doenças infecciosas do exército dos EUA no forte Detrick, Maryland fez um candidato a vacina para CHIKV. A cepa 15561 de CHIKV da Tailândia lmanifestaçãode 1962) foi usada para desenvolver um lote pequeno de passagem de macaco verde, preparação inativada por formalina que foi administrada a 16 voluntários que não mostraram respostas imunes elevadas e nenhum efeito adverso (Harrison et al., 1971). O virus com passagem em GMK sofreu ainda passagem em série por plaqueamento 18 vezes em células MRC-5 (Levitt et al., 1986), e julgado como sendo seguro e imunogênico no ensaio de fase I com 15 indivíduos alfavirus- ingênuos, viremia ocorrendo no dia 2-4 pós-inoculação (McClain et al., 1988). Em um ensaio de fase II randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, 73 voluntários alfavirus- ingênuos de 18-40 anos foram injetados com a dose de 0,5 mL contendo -105 PFU de virus (59 indivíduos) ou placebo (14 indivíduos) subcutaneamente. A avaliação sorológica envolveu uma titulação de neutralizaçâo de redução de placa (PRNT), e uma redução de 50% de titulação >20 foi considerada positiva. As reações locais e sistêmicas foram limitadas à tomada de vacina visto que 8% dos vacinados para CHIKV (e nenhum do grupo placebo) apresentaram artralgia. 98,3% dos vacinados soroconverteram no dia 28, alcançando titulações PRNT o máximas de 1:10240 nos dias 28-42. Embora os níveis de anticorpo declinassem um tanto no decorrer do tempo, 85% dos vacinados eram ainda soropositivos em um ano, com titulações de 1:1280 nos dias 180-360 (Edelman et al., 2000).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] Fig.1: A - Controle de células Vero não infectada B - Células Vero infectadas com CHIK C - Controle de células MRC-5 D - Células MRC-5 infectadas com CHIKV E - Células BHK21 de controle F - Células BHK21 infectadas com CHIKV

[017] Fig.2: SDS-PAGE da preparação de CHIKV purificada representando as proteinas E1 e E2 que parecem ser mais predominantes do que os antigenos do virus. A amostra do virus foi corrida no gel SDS-PAGE desnaturalizante 12% e visualizada por coloração de prata. As duas proteinas parecem ser aproximadamente 46 - 50 kD em tamanho.

[018] Fig.3: Toxicidade ín vivo do isolado do virus Chikungunya purificado CHK/03/06 após injeção intracerebral em camundongos. Os camundongos de 2 dias de idade foram injetados com o isolado do virus Chikungunya purificado CHK/03/06 intracerebralmente e os animais de controle foram injetados com volume igual de PBS. Painel A - camundongos de controle 7 dias após a injeção de PBS. Painel B - camundongos injetados com virus purificado foram encontrados mortos no 6° dia após a injeção intracerebral da preparação do virus purificado. Painel C - No 9° dia após a injeção intracerebral em camundongos de 2 dias de idade, os animais de controle injetados com PBS mostram crescimento normal (esquerda) e os camundongos injetados com diluição de 1:64 da preparação do virus purificado mostram retardo de crescimento severo.

[019] Fig.4: Micrografia de Transmissão Eletrônica (TEM) do isolado CHK/03/06 em uma ampliação de 200 K.

[020] Fig.5: Fotografia corada com brometo de etidio dos produtos de RT-PCR dos isolados dos virus CHK/01/06 e CHK/03/06 amplificados com primers específicos de gene para o virus CHIK. Faixa 1 - CHK/01/06 amplificado com CHK SP FP1 e CHK SP RP5; - 550bp Faixa 2 - CHK/03/06 amplificado com CHK SP FPl e CHK SP RP5; 550bp M- Marcador de tamanho molecular; “ladder” de l kb; (N3232S; New England Biolabs) Faixa 4 - CHK/01/06 amplificado com CHK SP FP3 e CHK SP RP4; ~686bp Faixa 5 - CHK/03/06 amplificado com CHK SP FP3 e CHK SP RP4; ~686bp Faixa 6 - CHK/01/06 amplificado com CHK SP FP1 e CHK SP RP5; ~637 bp Faixa 7 - CHK/03/06 amplificado com CHK SP FP1 e CHK SP RP5; ~637 bp

[021] Fig.6: Hemaglutinação (HA) do virus CHK/03/06 usando eritrócitos frescos de ganso. As primeiras duas fileiras é a titulação HA da cultura do virus a partir de células Vero em diluição seriada. As últimas duas fileiras é a titulação HA da preparação serialmente diluida do virus CHIK purificado mostrando um aumento na titulação HA.

[022] Fig.7: RT-PCR das proteinas estruturais virais. Painel A - Faixa 1 — Produto de PCR capsideo; Faixa 2 - “ladder” de 100bp; Faixa 3 - Produto de PCR E2 Painel B - Faixa 1 - Produto de PCR El; Faixa 2 - “ladder” de 1 Kb Painel C - Faixa l- “ladder” de 100 bp; Faixa 2 - Produto de PCR E3

[023] Fig.8: SDS-PAGE da indução da proteina E1 clonada em células expressadas de E. coli. Faixa 1 - células não induzidas; Faixa 2 - marcador do tamanho molecular da proteina; Faixa 3 - Células de E. coJí 4 horas após a induçãocom IPTG mostrando a indução da proteina El de - 47kD.

[024] Fig.9: SDS-PAGE da proteina de capsideo induzida de - 30kD em Pfcfía pastores; Faixa 1 - expressão da proteina a 0 horas após a indução com metanol; Faixa 2 - a 72 horas após a indução com metanol; Faixa 3 - marcador do tamanho molecularda proteina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[025] O escopo da presente invenção inclui o procedimento parao isolamento do virus Chikungunya (CHIK) a partir de amostras de soro humano infectado, métodos para adaptação e propagaçãodo virus em uma cultura continua para uma titulação elevada em linhagens celulares aprovadas pelo FDA/Autoridade Reguladora Nacional tais como Vero e MRC-5 e o cultivo do virus a partir de células infectadas na cultura. Os métodos descritos na presente invenção são aplicáveis a quaisquer genótipo/cepas/variações genéticas do virus Chikungunya e é conhecido àqueles habilitados na arte. O escopo da presente invenção inclui métodos usados para a purificação do virus a partir de células infectadas substancialmente livre de componentes celulares e do soro. Um dos métodos usados na presente invenção inclui o uso da tecnologia proprietária de HimaxT’ para a purificação do virus. O virus purificado é ou inativado pelo calor ou quimicamente inativado com um dos agentes inativantes que inclui, mas não é limitado aos seguintes agentes: formalina, beta propiolactona, glutaraldeido, detergentes não-iônicos, ácido ascórbico etc.A formulação da vacina compreende um tampão farmaceuticamenteaceito tal como o tampão fosfato ou fosfato-citrato na faixa de pH 6,4 - 7,5 com agentes estabilizantes adicionados que incluem um ou mais dos seguintes, mas não são limitados a: albumina de soro humano, gelatina, açúcares reduzidos e não- reduzidos, aminoácidos, polióis tais como sorbitol e manitol,sais orgânicos e inorgânicos de glicerol, polivinil pirrolidona etc. A formulação estável em uma forma liquida é apropriada para administração intramuscular/intradérmica/subcutânea/intravenosa em um hospedeiro humano. A formulação estável em uma forma liofilizada seca pode ser reconstituida com um solvente apropriado antes da administraÇão. As formulações são apropriadas para administração oral e intranasal em humanos. A eficácia da formulação da vacina foi estabelecida por vários métodos tais como o teste de neutralização do virus e o ensaio de inibição da hemaglutinação. A estimativa da proteina antigênica é pelo uso de métodos padrão de estimativa de proteina e por ELISA.A potência da vacina foi testada em modelos animais. A potência da formulação da vacina foi testada em doses que variam de 1 pg até 200 ug do antigeno onde o virus inativado é o ingrediente ativo na formulação. Uma taxa elevada desoroconversão e de anticorpos protetores contra o virus foiobservada em coelhos aos quais foi administrada a formulação.

[026] A adaptação e o crescimento do virus em uma cultura de célula continua em uma linhagem celular tal como Vero/MRC-5 que é aprovado pelo FDA e por Autoridades Reguladoras Nacionais oferecem um método de propagação do virus Chikungunya em cultura celular continua acessível, reprodutivel e fácil de ser validado, apropriado para produção em escala industrial de uma formulação estável do virus que pode ser usado como uma vacina. A formulação estável do virus Chikungunya inativado com estabilizantes adicionados é imunogênica evidenciando a resposta imune protetora contra as cepas de virus Chikungunya.

[027] A presente invenção igualmente descreve uma estratégia para desenvolver uma vacina de subunidade usando proteinas de virus recombinantes como antigenos. As proteinas virais podem ser expressas como proteinas recombinantes ou em células de hospedeiro procariótico ou eucariótico. Como conhecido por aqueles habilitados na arte, os métodos de clonagem e expressão descritos aqui são aplicáveis para quaisquer variações genéticas/mutantes das proteinas do virus.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[028] As propriedades das partículas do virus Chikungunya como um imunógeno, adaptação e propagação do virus em linhagens de células hospedeiras para uma titulação elevada, determinação da identidade do virus por RT-PCR, microscopia eletrôniCa; métodos de purificação e inativação do virus, preparação de formulações de vacina líquidas e liofilizadas estáveis em um carreador farmaceuticamente aceitável apropriado para administração em humanos, métodos e testes virais para a potência da vacina em modelo animal foram discutidos.

[029] O ingrediente ativo ou o imunógeno, da vacina descritana presente invenção são partículas de virus inativadas do virus Chikungunya. Os métodos descritos na presente invençãosão aplicáveis para quaisquer genótipo/cepas do virus Chikungunya. As partículas de virus obtidas a partir dos isolados clínicos do soro dos pacientes foram adaptadas e propagadas íx vitro em monocamadas de célula por diversas passagens. Em um protocolo alternativo, as partículas de virus foram passados uma vez através de camundongos bebê de 2dias de idade e o virus foi re-isolado e passado em monocamadas de célula ic vitro.

[030] A vacina do virus Chikungunya (CHIK) de acordo com a presente invenção se refere a um ingrediente ativo (imunógeno) de um virus Chikungunya inativado que é produzido sob condições de cGMP pela infecção de uma monocamada de células Vero ou de células MRC-5 em cultura celular continua onde as células são usadas como células hospedeiras para o cultivo do virus Chikungunya. A linhagem celular é qualificada através de vários testes de controle de qualidadee aprovada pelo FDA/Autoridade Reguladora Nacional como uma linhagem celular de qualidade de vacina. O virus é propagado em grandes quantidades pelo crescimento para uma titulação elevada ( 109) na cultura de célula e purificado a partir de células infectadas. O virus é inativado ou pelo calor ou com um agente inativante.

[031] Uma titulação de anticorpo de neutralização do anti-soro obtido pela imunização com as partículas acima em uma formulação estável, como medida pelo ensaio de neutralização in vitro oferece imunização protetora em animais.

[032] O imunógeno de uma vacina do virus Chikungunya é um exemplo representativo de um imunógeno de uma vacina contra doenças infecciosas causadas pelos virus Chikungunya de qualquer cepa ou variante genotipica do virus Chikungunya. A vacina da presente invenção é fornecida em um frasco ou ampola selada em uma forma liquida ou liofilizada. No caso daformulação liquida, pode ser injetada subcutaneamente/ intramuscularmente/intradermicamente/intravenosa ou administrada oralmente/intranasalmente a um individuo a ser vacinado em uma quantidade de aproximadamente 0,05 mL a 5 mL por pessoa. No caso de uma formulação liofilizada seca, ela é injetada após ser re-solubilizada com uma solução de solubilizaçâo apropriada.

[033] De acordo com a presente invenção, o método que é aplicável ãs cepas do virus Chikungunya que está sendo usado na presente invenção é aplicável a qualquer cepa do virus Chikungunya com um amplo espectro antigênico. O amplo espectro de resposta antigênica poderia oferecer uma proteção imune satisfatória contra cepas plurais do virus CHIK além da cepa de virus ser usada na produção da vacina. Como conhecido por aqueles habilitados na arte, uma vacina divalente ou polivalente pode ser preparada misturando as vacinas produzidas a partir de duas ou mais cepas do virus CHIK que tenham sido geneticamente confirmadas como virus CHIK e é misturado em uma relação apropriada baseada no conteúdo de proteina antigênica. Tal mistura poderia fornecer uma preparação de vacina tendo um espectro antigênico mais amplo para a proteção contra a infecção.

[034] De acordo com a presente invenção, inoculando uma linhagem celular hospedeira apropriada tal como células Vero/células MRC-5 com o virus, e mantendo as células infectadas em cultura continua A, o método de cultivo envolve infectar a monocamada de célula hospedeira com o virus e cultivar o virus em quantidades suficientes a partir das células hospedeiras infectadas. O virus crescido em camadas de célula poderia incluir uma população de virus extracelularque é obtido no sobrenadante da cultura de célula infectada que pode ser cultivada por centrifugação, e cultivar o virus que é associado às células por sonicação e centrifugação.

[035] Uma linhagem celular que pode ser propagada íx vitro em cultura pode ser usada como um hospedeiro para a cultura do virus. Por exemplo, as linhagens celulares diplõides taiscomo MRC-5 e WI-38 e linhagens celulares passadas em série tais como as células Vero, BHK-21, CHO etc. podem ser usadas. Para propagar cepas do virus Chikungunya, são selecionadas células preferivelmente permissivas as quais permitem que o virus cresça bem. Por exemplo, Vero (ATCC no. CCL-81), BHK-21(ATCC no. CCL-10), C6/C3 (ATCC no. CRL-1660) etc. são usadaspreferivelmente. Uma de tal linhagem celular usada na presente invenção são as células Vero que foram validadas para uso como célula hospedeira para produção de vacina. As linhagens celulares de Vero validadas conformam-se às Exigências para Substâncias Biológicas No.50 a respeito das exigências para o uso das células para a produção de produtos biológicos recomendados pela Organização Mundial de Saúde(OMS) confirmando desse modo estas linhagens celulares como qualificadas para produzir uma vacina (Série de relatório Técnico da OMS, no. 878, pp 19-52, 1998). Além disso, CV-1, BSC-1, MA104, MDCK, CaCO-2 cauterizado e DBS-FLC-1, DBS-FLC- 2, DBS-FRhl-2, ESK-4, HEL, IMR-90, WRL68, etc. Usados convencionalmente para produzir uma vacina de virus podem igualmente ser usados (“ATCC Microbes and Cell at Work”, 2a Edição., ppl44, American Type Culture Collection (ATCC) 1991, EUA).

[036] Para a manutenção na cultura de célula das linhagens celulares mencionadas acima, cultura estacionária em monocamadas, cultura de sistema de perfusão, frascos de agitação, cultura de tubo de cilindro/garrafa, cultura de suspensão, cultura de microcarreador, fábricas de célula e amontoados de célula e semelhantes podem ser adotadas. Por exemplo, Cytodex comercialmente disponível (Pharmacia Biotech, Suécia) de vários tipos é usado como um microcarreador, e outros dispositivos de cultura celular animal comercialmente disponiveis podem ser usados.

[037] Um agente inativante tal como formalina, beta- propiolactona, e glutaraldeido é adicionado a uma suspensão do virus para inativar o virus. Por exemplo, ao usar formalina e beta-propiolactona, a quantidade a ser adicionada é aproximadamente de 0,001% a 0,4% (v/v), a temperatura de inativação é de aproximadamente 2-8°C a aproximadamente 40°C e a duração da inativação depende principalmente da temperatura de inativação. Por exemplo, ela poderia variar entre 2 horas a 72 horas a §7°C e de aproximadamente 12 horas a 250 horas a 2-8°C. A inativação é igualmente eficaz em temperaturas intermediárias em torno de 22°C por um periodo de 2120 horas. A inativação do virus também pode ser realizada por detergentes não-iônicos e pelo ácido ascórbico. A inativação pelo calor é eficaz para o vírus Chikungunya em temperaturas em torno de 56-58°C por uma hora.

[038] A purificação do virus é conduzida por meios físicos ou por meios químicos e preferivelmente por uma combinação de ambos. Os métodos físicos utilizam as propriedades físicas do virus tais como densidade, tamanho, massa, coeficiente de sedimentação etc. e incluem qualquer uma das seguintes técnicas, mas não são limitados a: ultra-centrifugation de zona, centrifugação de gradiente de densidade, ultrafiltraçãocom membranas com tamanho de corte que variam de 50-1000 kDa para remover os componentes celulares e do soro.

[039] A purificação através de meios químicos emprega métodos tais como a adsorção/dessorção através de reações químicas ou fisioquimicas e incluem, por exemplo, purificação por ultracentrifugação, centrifugação de gradiente de densidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de gelfiltração, salgar com sais inorgânicos um de tal exemplo sendo sulfato do amônio, e pelo uso da tecnologia HimaxT’ proprietária, sais orgânicos, solventes orgânicos, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio e compostos orgânicos tais como polietileno glicol. A purificação do virus é alcançada ou por um ou por uma combinação de dois ou mais dos métodos mencionados acima.

[040] A concentração do virus é alcançada pela centrifugação 30 de velocidade baixa com membrana de ultrafiltraçâo, precipitação com sais ou purificação com a Tecnologia HimaxT’. A inativação das particulas do virus pode ser alcançada ou antes ou após a purificação do virus.

[041] O vírus pode ser visualizado por um método de coloração negativa usando acetato de uranila 2% (p/v) pode serobservado sob um microscópio eletrônico em uma ampliação de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 200.000.

[042] A identidade genética do virus CHIK foi confirmada pelo seqüenciamento do cDNA complementar ao RNA genômico das cepas. Mais especificamente, o RNA genômico foi extraído das células infectadas por virus ou a partir do CHIKV purificado após a granulação pela ultracentrifugação ou isolamento em um gradiente de densidade. Depois disso, uma região codificando uma proteina de envelope ou uma proteina não-estrutural foi ainda amplificada pela reação em cadeia da polimerase da transcriptase reversa (RT-PCR) usando um par de primers e a seqüéncia de base do cDNA resultante é determinada pelo método da terminação da cadeia dideoxi.

[043] A seqüência de aminoácido codificada pela seqüência de base foi decodificada usando códigos universais e a identidade genética do virus foi confirmada como o virus Chikungunya.

[044] Uma partícula de virus inativado da presente invenção é diluida com qualquer diluente apropriado que seja farmaceuticamente aceitável de forma a obter a titulação desejada. O tampão usado na formulação pode ser o tampão fosfato ou fosfato-citrato. Uma vacina pode opcionalmente conter conservantes, estabilizantes etc. Açúcares reduzidos e não-reduzidos, álcoois de açúcar tal sorbitol e manitol, glicerol, aminoácidos, albumina de soro humano são adicionados na faixa de 0,01% a 10% para a formulação liquidae até 60% dos sólidos totais para uma formulação liofilizada. Tal formulação estável do imunógeno ou em um liquido ou em uma forma liofilizada e após a reconstituição em um tampão farmaceuticamente aceitável ou em água é apropriado para administração intradermicamente/subcutaneamente/intramuscularmente/intravenosamente no hospedeiro humano e é igualmente apropriado para administração oral e intranasal.

[045] A vacina para o virus Chikungunya alternativamentepoderia ser uma vacina de subunidade preparada com as proteinas estruturais tais como, Capsideo, glicoproteinas Ele E2 e E3 das cepas de virus Chikungunya ou clonadas e expressas individualmente e purificadas para constituir uma formulação de vacina, ou expressando a poliproteina estrutural inteira que consiste no Capsideo, no polipeptideo E3, E2, 6K e nas proteinas E1 que é clonada como um único polipeptideo com um potencial de se agrupar em uma Partícula Semelhante a Virus (VLP) em células hospedeiras eucarióticas tais como levedura, em células de inseto através da expressão sediada por baculovirus, e em células mamiferas após ter sido processada por peptidases de sinal hospedeiras. As VLPs são altamente imunogênicas uma vez que elas imitam a partícula nativa do virus em estrutura quando processadas corretamente para agrupamento pelas peptidases de sinal hospedeiras. Elas contêm cópias múltiplas das proteinas antigênicas em sua estrutura agrupada. As proteinas virais ou expressas em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas são purificadas livres de proteinas da célula hospedeira. As proteinas estruturais purificadas podem ser administradas em uma formulação e pelos métodos descritos acima. A adição de resíduos de Histidina a uma ou outra extremidade das proteinas recombinantes enquanto a clonagem facilita a purificação das proteinas recombinantes.

[046] Em um outro aspecto da invenção, as partículas de virus obtidas de acordo com a presente invenção, assim como as proteinas virais recombinantes podem ser usadas como um reagente (como um antigeno) nos testes de diagnóstico, por exemplo, como um antigeno em um método de imunoprecipitação,um teste de inibição da hemaglutinação (HI), reação de fixação de complemento (CF), ELISA, radioimunoensaio, imunofluorescência, Western Blot e semelhantes. Mais especificamente usando inteira ou uma parte de uma partículado virus inativado da presente invenção, um ensaio diagnóstico com alta sensibilidade e especificidade para detectar a infecção por cepas diferentes do virus Chikungunya pode ser fornecido. Conforme usado aqui o termo “uma parte”de uma partícula do virus inativado se refere a uma fração do virus que retém a antigenicidade desejada e é derivada das partículas do virus incluindo, por exemplo, a proteina estrutural solubilizada durante a etapa de purificação descrita nos exemplos dados ou expressa em um sistema de expressão recombinante. Anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais especificos para o virus podem ser usados em um ensaio diagnóstico para a infecção por virus Chikungunya.

[047] Para o teste da potência da vacina, as formulações de vacina foram testadas em camundongos Balb/c e coelhos. Os animais em cada grupo foram injetados intraperitonealmente com aproximadamente de 0,2 a 0,5 mL/camundongo da preparaÇão da vacina diluida em série que varia na dose de 1 pg a aproximadamente 500 ug para os grupos de teste diferentes. Uma dose impulsionadora foi dada 7-14 dias após a primeira administração do antigeno. Uma formulação da preparação do virus inativado formulada em hidróxido de aluminio em combinação com oligonucleotideos deu uma resposta imune mais elevada. O soro resultante foi analisado por testes de neutralização ín vítio e a titulação do anticorpo foi determinada por ELISA. A Soroconversão foi observada nos animais imunizados com a formulação da vacina.

[048] Os seguintes exemplos são incluídos somente para ajudar em uma compreensão mais completa da invenção descrita e reivindicada aqui. Os exemplos não limitam o escopo da invenção reivindicada de maneira nenhuma eles não devem interpretar o escopo de proteção das reivindicações. Entretanto, uma pessoa ordinariamente habilitada na arte aprecia as modificações e as mudanças que podem ser feitas sem se afastar do escopo da presente invenção como apresentado nas reivindicações abaixo. Os beneficios, vantagens, soluçÕes aos problemas, e quaisquer elementos que possam causar qualquer beneficio, vantagem, ou uma solução a ocorrer ou se tornar mais pronunciada não deve ser interpretada como características críticas, requeridas, ou essenciais ou elementos de qualquer ou de todas as reivindicaçÕes. A invenção é definida unicamente pelas reivindicações anexadas incluindo quaisquer emendas feitas durante a dependência deste pedido e todos os equivalentesdaquelas reivindicações como emitidas.

[049] EXEMPLO 1:

[050] Proliferação em uma linhagem celular para a cultura do virus: linhagem de célula Vero (ATCC no. CCL-81), células BHK-21 e células MRC-5 foram usadas como linhagens celulares candidatas para cultura do virus Chikungunya (CHIKV) e a boa propagação viral em cada linhagem celular foi observada. As células Vero e as células BHK-21 foram cada uma preparadas em um meio de crescimento consistindo de DMEM (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; Catálogo Sigma-Aldrich # D5523 e usado de acordo com as instruções do fabricante) contendo soro bovino fetal (FBS) 5%. Eles foram incubados estaticamente a 37°C até atingir 80 - 100% de confluência da monocamada. Por conseguinte, o número de células foi contado. As células MRC-5 foram preparadas em meio de crescimento consistindo de MEM (Meio de Eagle Minimo) tamponado para pH neutro com tampão Hepes e consistindo de FBS 5%, foram incubadas estaticamente a 37°C por 6 dias e depois disso aS cólulas foram contadas. Em um procedimento alternativo, as células Vero e as células MRC- 5 foram cultivadas em meio livre de soro. Para escalar a produÇão de células para a infecção por virus, um frasco cryo contendo 5 x 106 células Vero viáveis a partir do banco de célula de trabalho foi usado para semear um frasco de grau de cultura de célula Tl75. DMEM contendo FBS 5% e 50 pg/mL de sulfato de neomicinafoi usado para a restauração e o reabastecimento das células.Após 90% de confluência da monocamada de célula nos frascos T175, as células foram tripsinizadas e propagadas ainda nas fábricas de célula/amontoado de célula (CF10). O mesmo meio DMEM é usado para a propagação (- 2,0 L/CFl0).

[051] EXEMPLO 2:

[052] Isolamento do virus: O virus Chikungunya (CHIKV) foi isolado a partir do soro de pacientes infectados que tiveram os sintomas clínicosclássicos da infecção por virus Chikungunya. Os isolados indianos do virus foram usados no desenvolvimento da formulação da vacina. Dos muitos isolados obtidos, dois isolados a saber, CHK/03/06 e CHK/01/06 foram caracterizados.A amostra de sangue selecionada a partir do paciente foi transportada a 4°C e o soro foi separado. O soro foi diluído 1:1 com salina tamponada com fosfato (PBS) e 0,5 mL do soro diluído foi usado para a infecção das células Vero (ATCC no. CCL-81) em frasco de 252cm e incubado de 34°C a 37°C em meio livre de soro. O frasco de controle de células Vero foi tratado com volume igual de lx PBS. Pós-infecção, o meio paraa propagação de células Vero foi DMEM contendo soro bovino fetal 1% (FBS). Em um método alternativo, a cultura do viruse célula foi realizada em meio livre de soro. O virus foi cultivado 30-48 horas após a infecção. O efeito citopático (cpe) do isolado do virus Chikungunya CHK/03/06 em células Vero infectadas foi como observado na Fig. lB, e lA é o controle não infectado. O virus também foi cultivado sob condições similares nas células MRC-5 e o efeito citopáticode CHK/03/06 observado nas células MRC-5 é representado na Fig. lD. lC são as células MRC-5 não infectadas de controle.O cpe do virus nas células BHK21 é observado na Fig.1F e aquele das células BHK-21 não infectadas de controle é representado na Fig. lE. Em um dos métodos alternativos testados, as células Vero e MRC-5 foram tratadas com agentes químicos tais como tripsina em baixas concentrações variando de 0,D1% a 1% e com ou sem íons divalentes tais como cálcio emagnésio antes da infecção.

[053] EXEMPLO 3:

[054] Propagação dos isolados do virus CHK/01/06 e CHK/03/06:

[055] Os isolados do virus CHK/01/06 e CHK/03/06 foram propagadosem cultura celular continua em células Vero (ATCC no. CCL-81)e em células BHK- 21 e em células MRC-5. O meio para a infecção foi DMEM contendo FBS 0% - 1%. No fim de 48 horas deinfecção, o efeito citopático estava perto do total nas células Vero e BHK21 e o virus estava amplamente presente no meio extracelular. Um TCIDS do virus de até 10'/mL foi obtido. Os isolados do virus foram passados em série 23 vezesem células Vero e encontrados como sendo estáveis em cultura celular continua. A titulação do virus significativamente realçada após a passagem através do cérebro do camundongo. A infecção e a propagação do virus foram também alternadamente testadas em um meio livre de soro.

[056] EXEMPLO 4:

[057] Purificação do virus: Os dois isolados do virus forampurificados a partir das monocamadas de célula Vero infectadas pelos métodos que incluem, mas não são limitados a: centrifugaÇão de velocidade baixa para remover muito dos restos celulares e dos componentes de soro, ultracentrifugação, centrifugação de gradiente de densidade de sacarose, e ultrafiltração através de membrana de 100 - 1000 kDa. O virus foi ainda purificado por cromatografia de coluna de troca iônica e por gel filtração em Sepharose CL 4Bou uma matriz de propriedade similar. As frações contendo o virus foram juntadas e precipitadas com sais que incluiram umdos seguintes: PEG na presença de Nah 0,020M - 0,20 M, precipitação usando a tecnologia Himax T sulfato de amônio, do alume etc. A infectividade dos virions foi verificada pela re-infecção das celulas Vero, BHK 21 e MRC-5 e encontrada como sendo infecciosa. O virus concentrado foi resuspenso em tampão de fosfato, pH 7,2 para verificação em SDS-PAGE 7,5% - 12% e as proteinas do virus foram visualizadas pela coloração de prata. Alta purificação do virus foi alcançada também pelacromatografia de troca iônica e cromatografia de coluna de interação hidrofóbica e pelo uso de colunas MonolithT’ com eluiçâo de sal. A pureza da preparação do virus foi verificada pela coloração de prata do gel de SDS-PAGE e por Western blot usando os anti-soros anti-CHIKV aumentados em coelho. A purificação nas colunas de troca de ânion Monolith deu uma recuperação mais elevada da infectividade. A infectividade do virus também foi monitorada durante etapas diferentes de uma purificação em escala piloto que elimina o soro e contaminação da célula hospedeira do virus e TCID de 10' a 107/mL poderia ser rotineiramente obtido e está sendoainda aperfeiçoado.

[058] EXEMPLO 5:

[059] A pureza da preparação do virus foi verificada por SDS-PAGE foi considerada como sendo de boa pureza. As glicoproteinas de envelope E1 e E2 podiam ser facilmente detectadas. Ver Fig. 2. O virus purificado tinha tido infectividade como determinada pela determinação da contagem infecciosa do virus e pela injeção intracerebral da fração do virus purificado em camundongos de 2 dias de idade, em vârias diluições. O virus purificado puro e diversas diluições em série conduziram à morte quando injetados intracerebralmente.Os camundongos mostraram crescimento retardado severo quando comparados ao PBS injetado em camundongos de controle como observados na Fig.3.

[060] EXEMPLO 6:

[061] Microscopia eletrônica do virus: A microscopia de transmissão eletrônica (Hitachi H-7500) do virus CHIK depois que a ultracentrifugação foi realizada pelo método de coloração negativa usando acetato de uranila 2% é representada na Fig.4.

[062] EXEMPLO 7:

[063] A identidade genética os isolados do virus Chikungunya CHK/01/06 e CHK/03/06 crescidos em células Vero foi confirmada pela reação em cadeia da Polimerase de TranscriçãoReversa (RT-PCR) do RNA genômico viral dos isolados do virus CHIK. O RNA genômico do virus foi extraído da cultura de virus em células Vero usando protocolos padrão. O RNA total foi transcrito reverso em reações diferentes usando oliqodT(18 mer) e por primers especificos para seqüências do virus Chikungunya. Alternativamente, o PCR foi realizado no produtotranscrito reverso usando primers para frente e reversos especificos de gene como dados abaixo. O PCR foi realizado usando a Vent DNA polimerase (New Englang Biolabs). Alguns exemplos do RT-PCR do cDNA de isolados do virus CHIK são apresentados na Fig. 5. A seqüência de alguns dos primers para frente e dos primers reversos usados em algumas dasreaÇões de PCR sâo como seguem:

[064] CHK SP FP1: 5' CTAAATAGGTACGCACTACAGC 3';

[065] CHK SP FP2: 5' TGGACTCCGCGCCCTACTATC 3';

[066] CHK SP FP3: 5' TACTCAGGAGGCCGGTTCAC 3'. CHK SP RP4: 5' GTGTCCCATTGTTCCAG 3'

[067] CHK SP RP5: 5' GTGAACCGGCCTCCTGAGTA 3'

[068] Os fragmentos de cDNA amplificados por RT-PCR foram seqüenciados pelo método de terminação da cadeia dideoxi. As seqüências de proteina deduzidas foram determinadas usando códigos genéticos universais. As regiões adicionais das seqüências do genoma do virus Chikungunya foram amplificadas com outros primers específicos de gene, e as seqüências do DNA amplificado foram determinadas pelo método de terminação da cadeia dideoxi. A seqüência dos produtos de RT-PCR confirmou a identidade dos isolados do virus Chikungunya.

[069] EXEMPLO 8:

[070] Inativação do virus por calor:

[071] Os virions purificados dos isolados CHK/03/06 foram

[072] inativados por calor em temperaturas variando de 50°C - 60°C por 30 - 60 min. A infectividade dos virions foi verificada pela re-infecção das células Vero. Nenhuma re-infecção foi observada.

[073] EXEMPLO 9:

[074] Inativação quimica do virus:

[075] Os virions purificador do isolado CHK/03/06 foram inativados por métodos químicos incluem, mas não são limitados a um dos seguintes métodos: inativação em concentrações que variam de 0,01% a 0,5% de formalina(formaldeido) por 2 horas a 37°C seguida pela incubação a 4’C por um periodo de 48-96 horas. Os virions inativados nas várias concentrações de formalina foram considerados como sendo não-infecciosos quando re- infectados em células Vero após pelo menos três passagens em série. Em um método alternativo da inativação, os virions purificados foram inativados com beta-propiolactona (BPL) em várias concentrações variando de 1:500 a 1:3000 de BPL:virus e por duas horas a 37°C, seguido pela incubaÇão em intervalos de tempo variantes de 48 - 200 horas a 4°C. Nenhuma re-infecção por virus foi observada após três passagens em série do virus em uma relação de BPL:virus na diluição de 1:500 â diluição de 1:1000. A inativação do virus podia igualmente ser realizada com sucesso 22°C para número variante de horas variando de 48 - 96 horas. Nenhuma infectividade foi observada nos virions inativados com formalina e beta-propiolactona na variação das concentrações e para os vários períodos de tempo testados.

[076] EXEMPLO 10:

[077] Medida da titulação do virus infeccioso: A titulação da infecção por virus do isolado CHK/03/06 foi contado em PFUs (unidades formadoras de placa/mL) por um método de contagemde placa usando células Vero e pela determinação do TCIDo (dose infecciosa da cultura de tecido) por protocolos padrão. As placas poderiam estar prontas em 36-48 horas e as titulações poderiam ser determinadas em 30-48 horas. Nas células Vero, as várias passagens do virus adaptado a Vero produziram titulações variando até 108” TCID>o/mL. Um aumentona titulação foi observado após a passagem do virus atravésdo cérebro do camundongo de 2 dias de idade. O virus foi purificado em placa a partir da amostra da passagem 2 em células Vero.

[078] EXEMPLO 11 :

[079] Determinação da imunogenicidade do virus:

[080] Uma quantidade do antigeno do virus Chikungunya do isolado CHK/03/06 foi medida por estimativa de proteina pelo método de BCA e por ELISA usando anti-soros antivirus Chikungunya de coelho. Os anticorpos policlonais foram aumentados no coelho injetando 100 ug do isolado CHK/03/06 do virus de Chikungunya purificado intradermicamente/ subcutaneamente/intramuscularmente e injetando uma quantidade similar de antigeno como uma dose impulsionadora 7 - 14 dias após a primeira administração do antigeno. A injeção de uma única dose do virus purificado a partir das células BHK21 deu uma titulação de ELISA de - 6400, e um titulação de >80 pelo ensaio de neutralização do virus comparado ao soro normal de coelho de - 4. Quatro amostras de anti-soros humanos convalescentes deram um titulação variante de 80 - 240 como contraste com o soro humano de controle que deu um titulação de - 4. Anti-soros também foram aumentados contra ambos os isolados do virus CHK/01/06 e CHK/03/06. Boa soroconversào foi observada como determinado por ELISA e pelo ensaio de neutralização íx vitro. A titulação do ensaio de neutralização observada após a única injeção impulsionadora foi mais elevada.

[081] EXEMPLO 12:

[082] Hemaglutinação e Inibição da Hemaglutinação:

[083] A titulação da hemaglutinação foi estimada pelo procedimento padrão usando suspensão de célula sangüínea vermelha de ganso. A inibição da hemaglutinaçâo dos soros imunes de coelho e soro humano convalescente foi determinada por protocolos padrão. Ambos os anti-soros do coelho e soro humano convalescente mostraram a inibição da hemaglutinaçâo.A titulação HA do virus purificado foi mais elevada do que a amostra do virus cultivado puro. A titulação HA da amostra infectada de virus e da amostra de virus purificado após diluições em série são representadas na Fig. 6.

[084] EXEMPLO 13: Teste animal:

[085] Quinze camundongos Balb/c de um mês de idade foram usados em cada grupo. Os animais em cada grupo foraminjetados intraperitonealmente com aproximadamente 0,2 mL a 0,5 mL/camundongo da preparação da vacina diluida em série do isolado CHK/03/06 variando em dose de 1 pg a aproximadamente 200 ug para os diferentes grupos de teste. Os animais foram impulsionados 14 dias após a primeira imunização. O sangue foi coletado em qualquer um de 7 e 14 dias após a injeção impulsionadora. Uma quantidade igual de soro foi juntada paracada grupo e o complemento foi inativado a 56°C por aproximadamente 30 min. O soro resultante foi usado para o teste de neutralização como um soro imune e para a estimativada titulação de anticorpo por ELISA. Em uma experiência alternativa, uma quantidade similar da preparação do virus inativado foi administrada intramuscularmente. A resposta do anticorpo foi mais elevada com injeção intramuscular. Todas as formulações contiveram o antigeno viral junto com o hidróxido de aluminio em tampão de fosfato 40 mM, pH 6,8-7,2contendo NaCl 150 mM, oligonucleotideos 50 pg/dose e quantidades variantes de excipientes como mencionado no exemplo abaixo.

[086] EXEMPLO 14:

[087] Formulação:

[088] A formulação do antigeno do virus Chikungunya CHK/03/06 foi preparada em tampão de fosfato 40 mM, pH 6,9-7,2 com ou sem NaCl 154 mM. As preparações virais foram formuladas em uma formulação liquida com hidróxido de aluminio/fosfato de aluminio contendo ou um ou uma combinação de açúcares tais como sacarose, maltose, trealose, lactose, glicose, manitol ou sorbitol. A presença de açúcares na faixa de 0,5%-10% e preferivelmente na faixa de 0,5% a 5% conferiu boa estabilidade na formulação como determinado pela estabilidade acelerada a 37°C por três semanas. Uma titulação significativamente elevada da resposta de anticorpo fOi obtida quando os oligonucleotideos em uma dose de 50 ug/dose foram incluídos na formulação liquida. Formulação similar foitambém testada com tampão fosfato-citrato de pH 6,8-7,2, e nenhuma diferença foi observada. Uma concentração mais elevada dos açúcares, tampão e sal acima de até 60% dos sólidos totais conferiu boa estabilidade na formulação liofilizada da vacina. A estabilidade da formulação fOi testada por testes de potência em camundongos.

[089] EXEMPLO 15:

[090] Clonaqem e expressão recombinante de antigenos virais em sistemas de expressão proCdrióticos e eucarióticos:

[091] O isolado do virus CHK/03/06 foi usado como fonte para clonagem e expressão de todos os antigenos virais com as seqüências dadas em SEQ ID uO. 1 à SEQ ID NO. 10. A fase de leitura aberta completa da poliproteina estrutural do virus Chikungunya codificada pela SEQ ID NO. 1 foi amplificada por RT-PCR do RNA genômico viral usando os primers CHKCPFP como o primer adiante e o CHKElRP como o primer reverso para obterum fragmento de PCR de - 3776 bp. O fragmento de PCR foi digerido com Nde1 e BamH1 e clonado nos sítios Nde1 e BamH1 do vetor de expressão procariótico, pETllB e o plasmideo recombinante contendo a inserção foi transformado em f. coli DH5a. Em um método alternativo, a fase de leitura aberta que codifica a poliproteina estrutural do virus Chikungunya, a SEQ ID NO. 2 foi clonada e expressa de uma maneira similar usando CHKCKOZAKFP como o primer adiante e CHKElRP2 como o primer reverso para obter um fragmento de tamanho similar. A SEQ ID NO. 2 foi amplificada com uma seqüência de primer que introduzisse uma seqüência de consenso de Kozak na extremidade 5' para expressão realçada no sistema de expressão eucariótico. A seqüência de primer CHKCKOZAKFP tem o sítio EcoR1 e CHKE1RP2 tem os sítios HindIII e Not1 para facilitar a clonagem no vetor pFastBac do baculovirus (Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA) e no vetor de PícLía pPIC3.5K (Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA), respectivamente.

[092] A SEQ ID NO. 2 foi ainda amplificada com um primer C- terminal que introduziu os resíduos 6-Histidina na extremidade C-terminal para obter a SEQ ID NO. 3.

[093] A SEQ ID NO.1 e a SEQ ID NO.2 codificam a proteina daSEQ ID NO.4. A SEQ ID NO. 3 codifica a proteina da SEQ ID NO.5 que tem os resíduos 6 His na extremidade C-terminal. Os resíduos 6-Histidina na extremidade C-terminal da SEQ ID NO. 5, facilitam a purificação da proteina expressa na coluna de afinidade de Ni+. Ambas as SEQ ID NO.4 e SEQ ID NO.5 foram expressas para a montagem da partícula semelhante a virus na levedura e na expressão mediada por baculovirus em células Sf9. Os fragmentos de gene de PCR correspondentes ãs SEQ ID NO.2, e SEQ ID NO.3 foram digeridos com EcoR1 e Not1 e o gelfoi purificado por protocolos padrão e clonados nos sitios EcoR1 e Not1 do vetor de expressão pPIC3.5K de levedura (Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA). Os clones positivos foram selecionados após a confirmação pelo PCR usando os mesmos primers. O plasmideo recombinante codificando a proteina estrutural completa da SEQ ID NO.4 e da SEQ ID NO.5foi transformado em Pichía Pastores GSl15 conforme a instrução dos fabricantes (Invitrogen) e de acordo com seus protocolos. O fragmento amplificado por PCR foi clonado no local AOX1 e expresso sob o promotor AOX1 pela indução de metanol. A clonagem, seleção, isolamento das cepas recombinantes de Píchía e a indução do gene clonado com metanol foram realizados de acordo com o manual do usuário “A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in PfcAíd pdstorís” Versão M janeiro de 2002, Kit de Expressãode Píchía, Catálogo # Kl710-01, Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA.

[094] A fase de leitura aberta completa (ORF) da poliproteina estrutural do vírus Chikungunya codificada pela SEQ ID NO.2 eSEQ ID NO.3 amplificada por RT-PCR foram digeridas com EcoR1e HindIII, purificado por gel e clonado nos sitios EcoRl e HindIII do vetor pFastBac sob o controle do promotor polihedron (Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA). Os métodos para clonagem e seleção do vetor recombinante de baculovirus são exatamente como esboçados no manual do usuário de Bac para o sistema de expressão de Bac Baculovirus(“An efficient site-specific transposition system to generate baculovirus for high-level expression of recombinant proteins”, Versão D, 6 de abril de 2004, Invitrogen Corporation, Carlsbad, EUA). Resumidamente, o método utiliza uma transposição especifica de sítio do cassete de expressão tal como o vetor recombinante pFastBac com as inserções clonadas como descritas acima em um vetor de ida e volta do baculovirus (bacmid) propagado em E. coli. O vetor pFastBac recombinante contendo uma das inserções SEQ ID NO.4 ou SEQ ID NO.5 clonada sob o controle do promotor polihedron é transformado em células competentes de L. coli de eficiênciamáxima DH10Bac” , que contêm um vetor de ida e volta do baculovirus (bMON14272) e um plasmideo ajudante (pMON7124) que facilita a transposição para permitir a regeneração eficiente do bacmid recombinante que segue a transposiÇão dos construtos recombinantes de pFastBac contendo a SEQ ID NO. 4ou a SEQ ID NO. 5. O bacmid recombinante foi selecionado em placas contendo ampicilina, gentamicina e canamicina pela seleção azul/branca usando bluo-gal e IPTG. O bacmid recombinante foi isolado por protocolos padrão similares ãquele do isolamento do DNA do plasmideo e 1 ug do DNA do bacmid foi usado para transfecção com o uso do reagente CellfectinT’ nas células de inseto Sf9 que foram crescidas em meio de célula de inseto de Grace (Invitrogen Corporation, EUA). Os métodos usados para a transfecção, isolamento e titulação do estoque de P1 viral são exatamente como descritos no manual do usuário do sistema de expressão Bac- para-Bac Baculovirus como dado acima.

[095] A fase de leitura aberta de cada um dos antigenos estruturais tais como Capsideo, polipeptideo E3, E2, 6K e as proteinas El estruturais correspondentes às seguintes seqüências IDs: SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9 e SEQ ID NO. 10 respectivamente codificadas na seqüência de poliproteina estrutural foram amplificadas por PCR usando primers especificos de gene como esboçados abaixo na primeira etapa da amplificação. Na segunda etapa os primers reversos que codificam os resíduos de 6 histidina foram usados para PCR (seqüências de primer não fornecidas) de cada um dos genes individuais e clonados em pETll B para expressão procariótica em E. coli e no vetor pFastBac para expressão mediada por baculovirus em células de inseto.

[096] Algumas dos primers de PCR projetados originalmente paraa clonagem de E. coli e baculovirus não tiveram sitios de restrição apropriados para clonar em pPIC3.5 K para expressãoem Pichia pastoris. Aqueles fragmentos de PCR que tiveram o sítio EcoR1 na extremidade 5' e o sítio BamHl no C- terminalem virtude da presença destes sitios de restrição nos primers adiante e reverso respectivamente, foram inicialmente clonados nos sitios EcoRl e BamH1 do vetor pBluescript SK+. O clone recombinante selecionado foi digerido com EcoR1 e Notle o fragmento digerido foi entâo subclonado em pPIC3.5K para a transformação da levedura como descrito acima. As seqüências do primer usadas para várias amplificações estão indicadas abaixo. A expressão dos antigenos El em E.coli e da proteina de Capsideo na levedura é mostrada na Fig. 8 e na Fig. 9. Seqüências de Primer: 1) CHKCKOZAKFP: 5' ATTGAATTCACCATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC 3' 2) CHKE1RP2: 5' AACAAGCTTGCGGCCGCTTAGTGCCTGCTGAACGACACG 3' 3) CHKSPE3FP: 5' ACCGAATTCATATGAGTCTTGCCATCCCAGTTATG 3' 4) CHKSPE3RP: 5' TGCAAGCTTGGATCCTTAGCGTCGCTGGCGGTGGGGAG 3' 5) CHKSP6KFP: 5' ACGGAATTCATATGGCCACATACCAAGAGGCTGCG 3' 6) CHKSP6KRP: 5' ATTAAGCTTGGATCCTTAGGTGCCCACACTGTGAGCGC 3' 7) CHKCPFP: 5' ACAGAATTCATATGGAGTTCATCCCAACCCAAAC 3' 8) CHKCPRP: 5' ATTAAGCTTGGATCCTTACCACTCTTCGGCCCCCTCGGGG 3' 9) CHKEIFP: 5' TAGAATTCATATGTACGAACACGTAACAGTGATCC 3' 10) CHKElRP: 5' TATAAGCTTGGATCCTTAGTGCCTGCTGAACGACACGC 3' 11) CHKE2FP: 5' TCGGAATTCATATGAGCACCAAGGACAACTTCAATGTC 3' 12) CHKE2RP: 5' TCCAAGCTTGGATCCTTACGCTTTAGCTGTTCTGATGCAGC 3'

[097] EXEMPLO 16:

[098] Os antigenos recombinantes expressos no sistema de expressão procariótico ou eucariótico podem ser usados para propósitos diagnósticos tal como em ELISA. ELISA foi estabelecido usando o virus inteiro inativado e usando anti- soro de coelho. Técnica similar pode ser estabelecida usando antigenos recombinantes purificados em vez do virus inteiro como antigeno. Os anti-soros policlonais ou anticorpo monoclonal contra os antigenos do virus particularmente os antigenos estruturais podem ser usados como agentes imunoterapêuticos.

Claims

1. Composição de vacina para vírus Chikungunya caracterizada pelo fato de compreender vírus Chikungunya purificado e inativado por beta-propiolactona (BPL), em que BPL é empregada em uma concentração de 0,001% a 0,4% (v/v).

2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração de BPL é de 0,01% a 0,1% (v/v).

3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da inativação por BPL ser realizada em uma das seguintes temperaturas e períodos de tempo: i) 2 horas a 4 horas a 37°C seguido pela incubação a +2 a +8 °C por 48 a 120 horas, ii) a 22 °C por 40 a 72 horas.

4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender: i) Antígeno do vírus Chikungunya purificado e inativado como antígeno, ii) Tampão de fosfato, de 10 mM a 500 mM ou tampão fosfato-citrato de pH de 6,4 a 7,5, iii) Concentração de açúcar na faixa de 0,1% a 5% onde os açúcares são selecionados da lista compreendendo: lactose, maltose, sacarose, glicose, trealose e ou uma combinação dos mesmos, iv) NaCl 25 mM - 200 mM, v) Aditivos de proteína tais como albumina de soro humana, hidrolisado de lactalbumina, hidrolisado de levedura ou gelatina, presentes na concentração de 0,1% a 5%.

5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir de: hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de cálcio, óleo mineral, adjuvante de Freund, oligonucleotídeos imunoestimulatórios, peptídeos policatiônicos, ou quaisquer outros compostos orgânicos ou inorgânicos apropriados que podem ser usados como adjuvantes.

6. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que os antígenos do vírus são usados na faixa de 1 a 1000 μg por dose de vacina.

7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que os antígenos do vírus são usados na faixa de 1 a 100 μg por dose de vacina.

8. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por elicitar uma resposta imune protetora contra o vírus Chikungunya, em que a composição é empregada por pelo menos uma das seguintes rotas: rota de administração intramuscular, intradérmica, subcutânea, intravenosa, oral e intranasal.

9. Método para preparar uma composição de vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para imunoterapia para a infecção por vírus Chikungunya em mamíferos, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer um vírus Chikungunya, o qual é inativado por beta-propiolactona (BPL), em que BPL é empregada em uma concentração de 0,001% a 0,4% (v/v).