PT1131414E - Mutantes do vírus da raiva atenuados, estáveis, e suas vacinas vivas - Google Patents

Description

ΕΡ 1 131 414 /PT

DESCRIÇÃO "Mutantes do vírus da raiva atenuados, estáveis, e suas vacinas vivas" A presente invenção refere-se a mutantes do vírus da raiva atenuados e a vacinas anti-rábicas vivas atenuadas compreendendo os referidos mutantes. A raiva é uma doença que pode ocorrer em todas as espécies de sangue quente e é causada por vírus da raiva (VR). A infecção com VR seguida pelo surgimento das manifestações clínicas resulta em quase todos os casos na morte das espécies infectadas. Na Europa, nos EUA e Canadá, ainda existe raiva na vida selvagem e constitui um importante factor na causa da maior parte dos casos de raiva que ocorrem em seres humanos. Por outro lado, a raiva urbana constitui a principal causa de raiva humana nos países em desenvolvimento. 0 vírus da raiva (VR) é um vírus de ARN de cadeia negativa não segmentada da família Rhabdoviridae. Os viriões do VR são compostos por dois componentes estruturais principais: uma nucleocápside ou ribonucleoproteína (RNP), e um envelope na forma de uma membrana em bicamada que circunda o núcleo de RNP. A componente infecciosa de todos os Rabdovírus é o núcleo de RNP que consiste no genoma de ARN encapsidado pela proteína da nucleocápside (N) em combinação com duas proteínas menores, i.e. ARN-polimerase dependente de ARN (L) e fosfoproteína (P) . A membrana que circunda o núcleo de RNP consiste em duas proteínas: uma glicoproteína transmembranar (G) e uma proteína de matriz (M) localizada do lado interno da membrana. A proteína G, também referida como proteína espigão, é responsável pela fixação à célula e fusão à membrana no VR e adicionalmente é o alvo principal para o sistema imunitário do hospedeiro. A região de aminoácidos na posição 330 a 340 (referida como local antigénico III) da proteína G, foi identificada como sendo responsável pela virulência do vírus, em particular o resíduo Arg na posição 333. Todas as estirpes de VR possuem em comum este local antigénico III determinante de virulência. 2

ΕΡ 1 131 414 /PT

Uma maneira eficaz de controlar a raiva é a vacinação com VR inactivado ou com estirpes de vacina atenuadas de VR. Em geral, as vacinas anti-rábicas vivas atenuadas são preferidas porque frequentemente evocam uma resposta imunitária duradoura, usualmente com base tanto em reacções humorais como celulares. As vacinas anti-rábicas vivas atenuadas correntemente disponíveis são baseadas em estirpes de vacina de VR atenuadas incluindo a estirpe SAD Bern ou a estirpe SAD B19, contudo, estas vacinas possuem ainda uma patogenicidade residual indesejada.

Foram feitas várias tentativas para obter estirpes de VR não patogénicas para utilização numa vacina viva. A Patente Europeia 350398 descreve um mutante SAG1 de VR avirulento derivado da estirpe Bern SAD de VR em que a glicoproteína possui Ser em vez de Arg na posição 333. O mutante SAG1 avirulento foi obtido sob pressão de selecção de anticorpos monoclonais específicos com a estirpe SAD Bern. Em ratinhos adultos verificou-se que a SAG1 não é patogénica. Contudo, os revertentes patogénicos do vírus atenuado ocorriam com uma frequência de 1 em 10 000 (Lafay et al. Vaccine 12. pp. 317-320, 1994) . A instabilidade genética deste mutante torna-o inadequado para uma vacinação segura. O pedido de patente europeia 583998 descreve outro mutante de VR atenuado, SAG2, em que Arg na posição 333 foi substituída por Glu na glicoproteína. O SAG2 não é patogénico para ratinhos adultos quando administrado por várias vias. O SAG2 é presentemente utilizado para vacinação oral de raposas particularmente em França. Como este mutante também tem o potencial de reverter para a estirpe patogénica progenitora, a vacina é produzida na presença de anticorpos monoclonais específicos para evitar a reversão (Blancou e Meslin. 1996; em Laboratory techniques in rabies, pp. 324-337). Como estes anticorpos monoclonais específicos não estão presentes em animais inoculados, a vacinação com este mutante ainda tem o risco de o mutante reverter para virulência no animal inoculado resultando em surtos de doença nos animais inoculados e possível disseminação do patogénio para outros animais. 3

ΕΡ 1 131 414 /PT

Portanto, existe uma presente necessidade de vacinas anti-rábicas vivas atenuadas que não possuam patogenicidade residual nem o potencial de reverter para a variante patogénica. A presente invenção proporciona estas vacinas.

De acordo com a presente invenção verificou-se que se podiam obter mutantes de VR estáveis, atenuados, através de uma mutação no gene da proteína G do genoma virai, compreendendo a referida mutação uma substituição do codão de Arg333 por um tripleto GAC ou um tripleto CAC. Para os fins da presente invenção, a expressão "codão de Arg333" é definida como o codão no gene da proteína G do genoma virai que codifica Arg333 na proteína G. 0 termo "Arg333" é definido como o resíduo Arg na posição 333 da proteína G do VR. Na estirpe SAD do VR e nas estirpes dela derivadas o codão de Arg333 é AGA e a mutação deste codão num codão que difere em todos os três nucleótidos do referido codão de Arg333 resultou em mutantes de VR estáveis e atenuados. Preferivelmente, o codão de Arg333 foi mutado para GAC, ou CAC. Podem ser realizadas mutações similares com outras estirpes de VR para obter mutantes estáveis atenuados. Verificou-se que as mutações de acordo com a invenção são estáveis e os mutantes de VR resultantes eram atenuados e não revertiam para patogenicidade. Estes mutantes de VR estáveis, atenuados, são muito adequados para utilização numa vacina. Uma grande vantagem da invenção é adicionalmente o facto das vacinas compreendendo os mutantes de VR de acordo com a invenção poderem ser produzidos sem a necessidade de anticorpos monoclonais específicos. Portanto, a produção de vacinas torna-se mais simples e mais fácil de realizar.

Assim, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona mutantes de VR recombinantes compreendendo uma mutação no genoma virai, pelo que a referida mutação compreende pelo menos uma substituição do codão de Arg333 por um tripleto GAC ou um tripleto CAC. Preferivelmente os mutantes são mutantes de uma estirpe de VR em que o codão de Arg333 é um tripleto AGA. Mais preferivelmente os mutantes de acordo com a invenção são mutantes da estirpe SAD do VR e seus derivados, especialmente da estirpe SAD B19 do VR. São particularmente preferidas as estirpes mutantes do VR recombinantes SAD D29 e SAD H31, em que o codão de Arg333 no 4

ΕΡ 1 131 414 /PT genoma da estirpe SAD 819 do VR foi substituído por um tripleto GAC e um tripleto CAC, respectivamente.

Assim, a presente invenção proporciona mutantes de VR estáveis, atenuados, recombinantes, em que a proteína G do referido mutante compreende um aminoácido na posição 333 que é codificado por um codão que difere em todos os três nucleótidos do codão de Arg333 do vírus progenitor.

Verificou-se que os mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção não são patogénicos em animais imunocompetentes e verificou-se que são altamente estáveis. Surpreendentemente, mesmo após experiências de 25 passagens em cultura celular não se observaram alterações. Todas as passagens em cultura celular foram realizadas na ausência de anticorpos monoclonais. Adicionalmente, os mutantes permaneceram não patogénicos para ratinhos adultos mesmo após uma passagem em ratinhos ainda não desmamados. As substituições na posição 333 da proteína G não afectaram de nenhum modo a taxa de crescimento do vírus em células BSR e o título final foi semelhante ao da estirpe progenitora. Isto torna os mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção muito adequados para utilização numa vacina anti-rábica viva.

Em adição à substituição do codão de Arg na posição de aminoácido 333 na proteína G, os mutantes de VR recombinantes de acordo com a presente invenção podem compreender outras substituições que afectam os aminoácidos do local antigénico III da glicoproteína. Preferivelmente, estas substituições são feitas nos codões que codificam os aminoácidos do local antigénico III da glicoproteína, mais preferivelmente nos codões que correspondem à posição de aminoácido 330 e/ou 336 na proteína G. Os mutantes de VR recombinantes de acordo com a presente invenção podem ainda compreender outras mutações ou modificações incluindo genes heterólogos e.g. um gene que codifica uma proteína G de uma estirpe de VR diferente.

Os mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção podem ser obtidos utilizando tecnologia de ADN recombinante e mutagénese específica do local para introduzir a mutação desejada, em contraste com a alteração da arte anterior ao acaso utilizando anticorpos monoclonais. A manipulação 5

ΕΡ 1 131 414 /PT

genética directa de VR pode ser realizada utilizando o sistema genético inverso descrito em Schnell et al, 1994; EMBO J., Vol. 13, N.° 18, pp. 4195-4203 e no pedido de patente europeia 0 702 085, ambos aqui incorporados por referência. A mutagénese especifica do local pode ser realizada de acordo com o método descrito por Kunkel, T.A., Roberts, J.D. e Zakour, R.A. (1987): Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymology Vol. 154, pp. 376-382. Utilizou-se um clone de ADNc de comprimento completo da estirpe de vacina SAD B19 descrito em Schnell et al, supra, como base para introduzir codões que diferiam do tripleto de Arg da estirpe de VR progenitora em todos os três nucleótidos, para a produção de mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção. Os mutantes de VR de acordo com a invenção podem ser obtidos por a) introdução da mutação desejada no clone de ADNc de comprimento completo do VR, b) expressão simultânea de um ARN de VR anti-genómico de comprimento completo a partir do ADNc modificado e proteínas N, P, e L do VR a partir de plasmídeos transfectados em células que expressam ARN-polimerase de T7, e 3) isolamento dos virus mutantes de VR produzidos pelas referidas células.

Os mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção podem ser crescidos numa cultura celular derivada, por exemplo, de células BHK ou células diplóides humanas. Os virus assim crescidos podem ser colhidos recolhendo os fluidos e/ou as células da cultura de células de tecidos.

Num outro aspecto a presente invenção proporciona vacinas anti-rábicas vivas atenuadas compreendendo um ou mais mutantes de VR recombinantes de acordo com a invenção. Preferivelmente uma vacina anti-rábica viva atenuada de acordo com a invenção compreende um mutante de VR recombinante derivado da estirpe SAD B19 de RV. As vacinas anti-rábicas vivas atenuadas de acordo com a invenção que são especialmente preferidas compreendem estirpes mutantes de VR recombinantes em que o codão de Arg333 no genoma virai foi substituído por um tripleto GAC e um tripleto CAC, respectivamente. Mais especificamente, a vacina de acordo com a invenção compreende uma estirpe mutante de VR recombinante em que o codão de Arg333 no genoma virai foi substituído pelo tripleto GAC, resultando na substituição de Arg por Asp na posição 333 da proteína G. São 6

ΕΡ 1 131 414 /PT particularmente preferidas as vacinas compreendendo a estirpe SAD D29 mutante de VR recombinante. A vacina de acordo com a invenção tem a grande vantagem de que pode ser produzida na ausência de anticorpos monoclonais específicos. A vacina de acordo com a invenção pode ser preparada utilizando técnicas Standard disponíveis na arte. Em geral a vacina é preparada misturando o mutante de VR recombinante atenuado de acordo com a invenção com um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.

Os transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados para formular uma vacina de acordo com a invenção são estéreis e fisiologicamente compatíveis tais como, por exemplo, água estéril, solução salina, tampões aquosos tais como fosfatos de metais alcalinos (e.g. PBS), álcoois, polióis, e semelhantes. Em adição, a vacina de acordo com a invenção pode compreender outros aditivos tais como adjuvantes, estabilizantes, antioxidantes, conservantes e semelhantes.

Os adjuvantes adequados incluem, mas não se lhes limitam, sais de alumínio ou géis, carbómeros, copolímeros de blocos não iónicos, tocoferóis, monofosforil-lípido A, dipéptido de muramilo, emulsões oleosas (a/o ou o/a), citoquinas e saponinas tais como Quil A. A quantidade de adjuvante adicionado depende da natureza do próprio adjuvante.

Os estabilizantes adequados para utilização numa vacina de acordo com a invenção são, por exemplo, hidratos de carbono incluindo sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrina e glucose, proteínas tais como albumina ou caseína e tampões como fosfatos alcalinos.

Os conservantes adequados incluem, entre outros, timerosal, mertiolato e gentamicina. A vacina anti-rábica viva atenuada de acordo com a invenção pode ser administrada a mamíferos de sangue quente, incluindo seres humanos, cães, raposas, guaxinins e doninhas, por injecção (intramuscular, intradérmica, ou subcutânea), pulverização ou aerossol (intranasal), ou per oral. 7

ΕΡ 1 131 414 /PT

Preferivelmente, a vacina é administrada aos indivíduos oralmente, especialmente no caso de animais selvagens ou cães vadios. Para administração oral a vacina é misturada com um transportador adequado tal como, por exemplo, proteínas ou óleos de origem vegetal ou animal. Para entrega oral, a formulação da vacina pode ainda ser encapsulada em iscos preparados a partir de substâncias metabolizáveis de origem animal ou vegetal. A dosagem útil a administrar variará, dependendo do tipo de mamíferos de sangue quente a vacinar, da idade, peso e modo de administração. Em geral uma dosagem adequada variará entre 102 a 108 TCID5o/mamíf ero .

Os exemplos que se seguem ilustrarão a invenção sem limitar a invenção.

MÉTODO E MATERIAL

Construção de clones de ADNc A mutagénese dirigida ao local pelo método de Kunkel et al., 1987; Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods Enzymology, Vol 154, pp. 376-382 foi realizada com oligonucleótidos 21-mero para alterar três nucleótidos de pT7T-G (Conzelmann e Schnell, 1994; J. Virology, Vol. 68, N.° 2, pp. 713-719). Os plasmídeos resultantes codificavam a glicoproteína de VR modificada (proteína G) em que Arg na posição 333 (SAD B19 posição 4370-4372) da proteína G madura de VR foi substituída por diferentes aminoácidos (veja-se a Tabela I). De modo a incorporar as mutações introduzidas num clone de ADNc do VR de comprimento completo (pSAD L16), alterou-se um fragmento StuI/PpuMI do ADNc compreendendo os nucleótidos 4015-4470 de SAD B19. 8

ΕΡ 1 131 414 /PT

Tabela I: Clones de ADNc de VR e os codões que codificam para os resíduos de aminoácido no local antigénico III da glicoproteína dos vírus mutantes de VR recombinantes resultantes.

Plasmídeo Posição do codão no gene 6 Alteração de aminoácidos Alteração de codões pSAD L16 330 333 336 K R N AAG AGA AAT pSAD Q1 --- 333 --- - Q - ---CAG--- pSAD Sll --- 333 --- - S - ---TCC — pSAD E 18 --- 333 --- - E - ---GAG--- pSAD D29 --- 333 --- - D - ---GAC--- pSAD TQ6 330 333 --- T Q - -C- CAG --- pSAD H31 --- 333 --- - H - ---CAC--- pSAD G4 *) — 333 --- . - G - ---G-T--- pSAD 121 *) — 333 — - I - ----TC — pSAD NM7 *) 330 333 — N M - —C -TG --- pSADTMD23* 330 333 336 T M D -C--TG G-C *) exemplos comparativos: clones de ADNc de VR em que o codão difere em apenas dois nucleótidos do codão de Arg

Recuperação e propagação de mutantes do local antigénico III

As experiências de transfecção foram realizadas como descrito previamente (Conzelmann e Schnell, 1994; j. Virology, Vol. 68, N.0 2, pp. 713-719). Aproximadamente 106 células de BSR foram infectadas com o virus vaccinia recombinante vTF7-3 (Fuerst et ai., 1986) e depois foram transfectadas com uma mistura de plasmideos contendo 5 pg de pT7T-N, 2,5 pg de pT7T-P, 2,5 pg de pT7T-L e com 4 pg de um plasmídeo que codifica o ARN antigenómico de comprimento completo utilizando o kit de transfecção em mamíferos Stratagene (protocolo do CaP04) . 0 isolamento do vírus transfectante e a remoção do vírus vaccinia foram realizadas como descrito em Schnell et al., 1994 supra. A infecção de células foi monitorada por imunofluorescência directa com um conjugado de nucleoproteína anti-VR (Centocor) e os VR recombinantes foram adicionalmente submetidos a passagens até se atingir a infecção da totalidade da monocamada. As reservas de vírus resultantes foram tituladas por diluição de ponto final. Realizaram-se vinte 9 ΕΡ 1 131 414 /PT cinco passagens em série em culturas de células BSR a uma multiplicidade de infecção (moi) de 0,01. RT-PCR e Análise da sequência

Para determinar a estabilidade dos vírus recombinantes, realizaram-se 25 passagens sucessivas em células BSR. Realizou-se a RT-PCR com 1 pg de ARN total isolado de células infectadas utilizando o "Titan One Tube RT-PCR System" de acordo com as instruções do fornecedor (Boehringer Mannheim). Os produtos da PCR foram analisados em géis de agarose a 1% e utilizados directamente para sequenciação.

Inoculação de ratinhos e neutralização de vírus

Grupos de ratinhos NMRI de 3 semanas de idade foram inoculados intracerebralmente (ic) com 0,03 ml de uma suspensão de vírus (3 000 a 9 000 000 ffu/ratinho) e observados quanto a sintomas de raiva. Para determinar se surgiam revertentes patogénicos após passagem em ratinhos ainda não desmamados, inocularam-se os vírus recombinantes ic em ratinhos de dois dias de idade. Foi preparada uma suspensão a 20% de cérebro a partir de ratinhos mortos e inoculou-se em ratinhos de 3 semanas de idade. Recolheram-se amostras de soro dos ratinhos sobreviventes 21 dias após a infecção. Para determinar a actividade de neutralização dos soros de ratinho, incubaram-se diluições em série de 5 vezes dos soros com 40 ffu da estirpe CVS. Após 1 hora, adicionaram-se células BHK à mistura de vírus e soro, incubaram-se durante 24 horas e examinaram-se por fluorescência directa. Quanto aos resultados, veja-se a tabela II. 10

ΕΡ 1 131 414 /PT

Tabela II: Mutantes de local antigénico III; os mutantes correspondem aos clones de ADNc da Tabela I (rec = recombinante; VR = vírus da raiva; pfu = unidades formadoras de placas fágicas; ic = intracerebral; ffu = unidades formadoras de focos; N = ratinhos desmamados de 3 semanas de idade; S = ratinhos não desmamados de 2 dias de idade; Ab = anticorpo; ND = não determinado)

mutante rec de VR Título em BSR pfu/ml patogen em rati de mort após W icidade nhos (% alidade ic.) S Dose ffu/ratinho patogenicidade após passagem em ratinhos não desmamados Título de Ab após ic. em UI SAD L16 1 X 108 100 100 3 000 ND ND SAD Q1 TI 0 100 3 000 000 0 62,5 SAD Sll TI 0 100 3 000 000 ND ND SAD E18 TI 0 100 3 000 000 ND 312,5 SAD D29 2 x 108 0 100 6 000 000 0 312,5 SAD TQ6 7 x 107 0 100 2 000 000 0 ND SAD H31 3 x 108 0 100 9 000 000 0 ND SAD G4 1 x 108 0 100 3 000 000 ND 37,5 SAD 121 7 x 107 0 100 3 000 000 ND 12,5 SAD NM7 2 x 107 0 100 600 000 0 ND SADTMD23 4 x 106 0 100 120 000 0 ND

Lisboa,

Claims (6)

1. ΕΡ 1 131 414 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Mutante do vírus da raiva recombinante compreendendo uma mutação no gene da proteína G do genoma virai, em que a referida mutação compreende pelo menos uma substituição do codão no gene da proteína G do genoma virai que codifica Arg333 na proteína G por um tripleto GAC ou um tripleto CAC.
2. 2. Mutante de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido mutante ser um mutante da estirpe SAD.
3. 3. Mutante de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o mutante ser a estirpe SAD D29 mutante do vírus da raiva recombinante.
4. 4. Mutante do vírus da raiva recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização como agente terapêutico ou profilático.
5. 5. Mutante do vírus da raiva recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização numa vacina.
6. 6. Vacina anti-rábica viva atenuada caracterizada por a referida vacina compreender um mutante do vírus da raiva recombinante de acordo com as reivindicações 1-3 e um transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa,