DE69935445T2 - Attenuierte stabile tollwutvirusmutante und lebende impfstoffe - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft attenuierte Tollwutvirus-Mutanten und lebende attenuierte Anti-Tollwut-Impfstoffe, umfassend diese Mutanten.
- Tollwut ist eine Krankheit, die bei allen warmblütigen Arten auftreten kann, und wird durch den Tollwutvirus (RV) hervorgerufen. Die Infektion mit Tollwut, gefolgt von dem Ausbruch der klinischen Symptome, führt in nahezu allen Fällen zum Tod der infizierten Arten. In Europa, in den USA und in Kanada existiert die Wild-Tollwut immer noch, und ist ein wesentlicher Faktor für die meisten menschlichen Tollwut-Fälle, die auftreten. Auf der anderen Seite bildet Tollwut im Siedlungsraum, so genannte urbane Tollwut, einen Hauptgrund für den Menschen betreffende Tollwut in Entwicklungslängern.
- Das Tollwutvirus (RV) ist ein nicht segmentiertes, negativsträngiges RNS-Virus der Rhabdoviridae-Familie. RV-Virionen bestehen aus zwei hauptsächlichen strukturellen Komponenten: ein Nukleokapsid oder Ribonukleoprotein (RNP), und eine Hülle in Form einer zweischichtigen Membrane, die den RNP-Kern umgibt. Die infektiöse Komponente von allen Rhabdoviren ist der RNP-Kern, der aus dem RNS-Genom besteht, welches durch das Nukleokapsid (N) Protein in Kombination mit zwei weiteren Proteinen enkapsidiert ist, d.h. RNS-abhängige RNS-Polymerase (L) und Phosphoprotein (P). Die Membrane, die den RNP-Kern umgibt, besteht aus zwei Proteinen: einem trans-membranen Glykoprotein (G) und einem Matrix (M) Protein, welches am inneren Ort der Membrane angeordnet ist.
- Das G-Protein, auch als Spike-Protein bezeichnet, ist verantwortlich für die Anhaftung an der Zelle und der Membran-Fusion in RV und ist zusätzlich das Hauptziel für das Immunsystem des Wirts. Der Aminosäuren-Bereich an der Position 330–340 (Als antiger Ort III bezeichnet) des G-Proteins ist als verantwortlich für die Virulenz des Virus identifiziert worden, insbesondere das Arg Residuum an der Position 333. Alle RV-Stämme haben diesen virulenz-bestimmenden antigenen Ort III gemeinsam.
- Ein effizienter Weg, um Tollwut zu kontrollieren, ist die Impfung mit inaktiviertem RV oder mit attenuierten Impfstämmen von RV. Im Allgemeinen werden attenuierte lebende Anti-Tollwut Impfungen bevorzugt, weil sie häufiger eine lang anhaltende Immunantwort erzeugen, die üblicherweise auf sowohl humoralen als auch zellulären Reaktionen beruht. Derzeitig verfügbare attenuierte Lebend-Antitollwut-Impfstoffe basieren auf attenuierten RV-Impfstoff-Stämmen, die den SAD Bern Stamm oder den SAD B19 Stamm umfassen, auch wenn diese immer noch eine unerwünschte residuelle Pathogenizität aufweisen.
- Verschiedene Versuche sind gemacht worden, nicht pathogene RV-Stämme für die Verwendung in einem Lebendimpfstoff zu erhalten. Das europäische Patent
EP 0 350 398 beschreibt eine avirulente RV-Mutante SAG1, die aus dem Bern SAD Stamm des RV abgeleitet worden ist, bei dem das Glykoprotein Ser statt Arg an der Position 333 aufweist. Die avirulente Mutante SAG1 ist unter Selektions-Druck aus spezifischen monoklonalen Antikörpern des SAD Bern Stammes erhalten worden. Bei erwachsenen Mäusen ist SAG1 als nicht pathogen befunden worden. Pathogene Rückbildungen der attenuierten Viren treten mit einer Frequenz 1:10.000 auf (Lafay et al., Vaccine 12, Seiten 317-320, 1994). Die genetische Instabilität dieser Mutante macht sie ungeeignet für eine sichere Impfung. - Die europäische Patentanmeldung
EP 0 583 998 beschreibt eine andere attenuierte RV-Mutante, SAG2, bei der Arg an der Position 333 durch Glu in dem Glykoprotein ersetzt worden ist. SAG2 ist nicht pathogen bei erwachsenen Mäusen, wenn es über verschiedene Wege verabreicht wird. SAG2 wird derzeit für die orale Impfung von Füchsen, insbesondere in Frankreich, eingesetzt. Weil diese Mutante auch das Potential hat, in den pathogenen Elternstamm zurückzukehren, wird dieser Impfstoff in Gegenwart von spezifischen monoklonalen Antikörpern hergestellt, um die Reversion zu verhindern. (Blancou und Meslin, 1996; in Laboratory techniques in rabies, Seiten 324–337). Da diese spezifischen monoklonalen Antikörper nicht in inokulierten Tieren auftreten, hat die Impfung mit solch einer Mutante immer noch das Risiko, dass die Mutante die Virulenz in dem inokulierten Tier wiedergewinnt, was in Krankheitsausbrüchen in den inokulierten Tieren und einer möglichen Verbreitung des Pathogens zu anderen Tieren resultieren kann. - Es besteht daher ein weitergehender Bedarf für attenuierte Lebend-Antitollwut-Impfstoffe, welche nicht die residuelle Pathogenizität oder das Potential haben, zur pathogenen Variante zurückzukehren. Die vorliegende Erfindung liefert solche Impfstoffe.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung ist befunden worden, dass stabile, attenuierte RV-Mutanten erhalten werden konnten durch Mutation des G-Protein Gens des viralen Genoms, wobei die besagte Mutation die Substitution des Arg333 Kodons mit einem GAC Triplett oder einem CAC Triplett umfasst. Zu diesem Zweck der Erfindung ist der Begriff „Arg333" Kodon definiert als das Kodon, in dem G-Protein Gen des viralen Genoms, das Arg333 in dem G-Protein kodiert. Der Begriff „Arg333" wird definiert als das Arg- Residuum an der Position 333 RV G Proteins. In dem RV-Stamm SAD und den Stämmen, die davon abgeleitet worden sind, ist das Arg333 Kodon AGA und die Mutation dieses Kodons in ein Kodon, bei dem sich alle drei Nukleotide von dem Arg333 Kodon unterscheiden, resultierte in stabilen und attenuierten RV-Mutanten. Vorzugsweise ist das Arg333 Kodon in GAC oder CAC mutiert. Ähnliche Mutationen können mit anderen RV-Stämmen ausgeführt werden, um stabile attenuierte Mutanten zu erhalten. Mutationen gemäss der Erfindung sind als stabil befunden worden, und die sich ergebenden RV-Mutanten sind attenuiert worden und kehrten nicht zur Pathogenizität zurück. Diese stabilen attenuierten RV-Mutanten sind für einen Einsatz in einem Impfstoff sehr geeignet. Ein grosser Vorteil der Erfindung liegt ferner darin, dass Impfstoffe, die die RV-Mutanten gemäss der Erfindung umfassen, ohne spezifische monoklonale Antikörper hergestellt werden können. Daher wird die Impfstoff-Produktion vereinfacht und ist einfacher auszuführen.
- Daher liefert die vorliegende Erfindung gemäss einem ersten Aspekt rekombinante RV-Mutanten, die eine Mutation in dem viralen Genom umfassen, wobei die besagte Mutation mindestens eine Substitution des Arg333 Kodons mit einem GAC Triplet oder einem CAC Triplet umfasst. Vorzugsweise sind diese Mutanten Mutanten eines RV-Stammes, bei dem das Arg333 Kodon ein AGA Triplet ist. Bevorzugter sind die Mutanten gemäss der Erfindung Mutanten des RV-Stammes SAD und seiner Derivate, insbesondere des RV-Stammes SAD B19.
- Besonders bevorzugt sind rekombinante RV-Mutanten Stämme SAD D29 und SAD H31, bei denen das Arg333 Kodon in dem Genom des RV-Stammes SAD B19 mit einem GAC Triplet oder einem CAC Triplet ersetzt worden sind.
- Somit liefert die vorliegende Erfindung stabile attenuierte re kombinante RV-Mutanten, bei denen das G-Protein der besagten Mutanten eine Aminosäure an der Position 333 umfasst, die durch ein Kodon kodiert wird, welches sich in allen 3 Nukleotiden von dem Arg333 Kodon des parentalen Virus unterscheidet. Es ist befunden worden, dass die rekombinanten RV-Mutanten gemäss der Erfindung in immun-kompetenten Tieren nicht pathogen sind und als hochstabil befunden worden sind. Überraschenderweise sind selbst nach 25 Passage-Experimenten in Zellkulturen keine Veränderungen beobachtet worden. Alle Zellkultur-Passagen sind ausgeführt worden in Abwesenheit von monoklonalen Antikörpern. Darüber hinaus verblieb die Mutante nicht pathogen für erwachsene Mäuse, selbst nach einer Passage bei säugenden Mäusen. Die Substitutionen an der Position 333 des G-Proteins beeinflusste in keiner Weise die Wachstumsrate des Virus in BSR-Zellen, und der finale Titer war ähnlich zu dem parentalen Stamm. Dies macht die rekombinanten Mutanten gemäss der Erfindung sehr geeignet für die Verwendung in einem lebenden Antitollwut-Impfstoff.
- Zusätzlich zur Substitution des Arg-Kodons an der Aminosäure-Position 333 in dem G-Protein können die rekombinanten RV-Mutanten gemäss der vorliegenden Erfindung andere Substitutionen umfassen, welche die Aminosäuren des antigenen Ortes III des Glyko-Proteins beeinträchtigen. Insbesondere können diese Substitutionen in den Kodonen gemacht werden, die die Aminosäuren des antigenen Ortes III des Glykoproteins codieren, bevorzugterweise in den Kodonen, welche der Aminosäure-Position 330 und/oder 336 in dem G-Protein entsprechen. Die rekombinanten RV-Mutanten gemäss der vorliegenden Erfindung können weiterhin andere Mutationen oder Modifikationen umfassen, die heterologe Gene umfassen, beispielsweise ein Gen, welches ein G-Protein eines anderen RV-Stammes kodiert.
- Die rekombinanten RV-Mutanten gemäss der Erfindung können unter Einsatz von rekombinanter DNS-Technologie und ortspezifischer Mutagenese erhalten werden, um die gewünschten Mutationen zu erhalten, im Gegensatz zu den beim Stand der Technik eingebrachten Veränderungen durch Zufall unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern. Direkte genetische Manipulation des RV kann durch reverse genetische Systeme ausgeführt werden, wie sie in Schnell et al., 1994; EMBO J. Band 13, Nr. 18, Seiten 4195–4203 und in der europäischen Patentanmeldung
EP 0 702 085 beschrieben worden sind, welche beide hier durch Referenznahme einbezogen sind. Die ortsgerichtete Mutagenese kann gemäss dem Verfahren ausgeführt werden, welches durch Kunkel, T.A., Roberts, J.D. und Zakour, R.A., (1987): Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection in Methods Enzymology, Band 154, Seiten 376–382, beschrieben worden ist. Ein Volllängen cDNS Klon des Impfstammes SAD B19, welcher in Schnell et al., siehe oben, beschrieben worden ist, ist als Basis eingesetzt worden, um Kodone, die sich von dem Arg-Triplet des parentalen Stammes in allen drei Nukleotiden unterscheiden, zur Erzeugung von rekombinanten RV-Mutanten gemäss der Erfindung einzuführen. RV-Mutanten gemäss der Erfindung können erhalten werden durch a) Einführung der gewünschten Mutation in den RV Volllängen cDNS Klon, oder b) simultane Exprimierung eines Volllängen antigenomen RV RNS aus der modifizierten cDNS und RV N, P, und L Proteinen aus Plasmiden, die in T7-RNS Polymerase exprimierenden Zellen transfektiert worden sind, und 3) Isolieren der RV mutanten Viren, die aus diesen Zellen produziert worden sind. - Die rekombinanten RV-Mutanten gemäss der Erfindung können auf einer Zellkultur gewachsen werden, die beispielsweise aus BHK Zellen oder menschlichen Diploid-Zellen stammt. Die so gewachsenen Viren können durch Sammeln der Gewebe-Zellkultur Flüssigkeit und/oder Zellen geerntet werden.
- Gemäss einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung attenuierte lebende Antitollwut-Impfstoffe, die eine oder mehrere rekombinante RV-Mutanten gemäss der Erfindung umfassen. Vorzugsweise umfasst ein attenuierter lebender Antitollwut-Impfstoff gemäss der Erfindung eine rekombinante RV-Mutante, die aus dem RV-Stamm SAD B19 abgeleitet worden ist. Attenuierte lebende Antitollwut-Impfstoffe gemäss der Erfindung, die insbesondere bevorzugt sind, umfassen rekombinante RV mutante Stämme, in denen das Arg333 Kodon in dem viralen Genom durch ein GAC Triplett beziehungsweise durch ein CAC Triplett ersetzt worden ist. Insbesondere umfasst der Impfstoff gemäss der Erfindung einen rekombinanten RV mutanten Stamm, bei dem das Arg333 Kodon in dem viralen Genom ersetzt worden ist durch das Triplet GAC, was in dem Ersatz von Arg mit Asp an der Position 333 des G-Proteins übereinstimmt. Insbesondere bevorzugt sind Impfstoffe, die den rekombinanten RV mutanten Stamm SAD D29 umfassen. Der Impfstoff gemäss der Erfindung hat den grossen Vorteil, dass er in Abwesenheit von spezifischen monoklonalen Antikörpern hergestellt werden kann.
- Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann hergestellt werden unter Einsatz von Standard-Techniken, die aus dem Stand der Technik verfügbar sind. Im Allgemeinen wird der Impfstoff durch Mischen der attenuierten rekombinanten RV-Mutanten gemäss der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mit einem Verdünnungsmittel gemischt.
- Pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel, die eingesetzt werden können, um einen Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung zu formulieren, sind steril und physiologisch kompatibel mit beispielsweise sterilem Wasser, Salzlösung, wasserbasierten Puffern wie Alkali-Metall-Phosphate (beispielsweise PBS), Alkohole, Polyole und ähnliche. Zusätzlich kann der Impf stoff gemäss der Erfindung andere Additive wie Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, Antioxidanzmittel, Konservierungsmittel und andere Stoffe enthalten.
- Geeignete Adjuvantien umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Aluminiumsalze oder Gele, Carbomere, nicht ionische Block-Copolymere, Tocopherole, Monophospheryl Lipid A, Muramyl Dipeptid, Öl-Emulsionen (Wasser/Öl oder Öl/Wasser), Zytokine und Saponine wie Quil A. Die Menge des hinzugefügten Adjuvans hängt von der Natur des Adjuvans ab.
- Geeignete Stabilisierungsmittel zum Einsatz in einem Impfstoff gemäss der Erfindung sind beispielsweise Kohlenhydrate wie Sorbitol, Mannitol, Stärke, Saccharose, Dextrin und Glukose, Proteine wie Albumin oder Casein und Puffer wie Alkali-Phosphate.
- Geeignete Konservierungsstoffe umfassen unter anderem Thimerosal, Merthiolat und Gentamycin.
- Die attenuierten lebenden Antitollwut-Impfstoffe gemäss der Erfindung können warmblütigen Säugetieren verabreicht werden, umfassend Menschen, Hunde, Füchse, Waschbären und Stinktiere, über Injektion (intramuskulär, intradermal, oder subkutan), Sprays oder Aerosol (intranasal), oder auf dem oralen Weg. Vorzugsweise wird der Impfstoff den Subjekten oral verabreicht, insbesondere bei Wildtieren oder entlaufenen Hunden. Für die orale Verabreichung wird der Impfstoff mit einem geeigneten Träger gemischt, beispielsweise Proteinen oder Ölen von pflanzlicher oder tierischer Herkunft. Für die orale Verabreichung kann die Impfstoff-Formulierung weiter mit Ködern verkapselt werden, die aus verdaubaren Substanzen von tierischer oder pflanzlicher Herkunft hergestellt worden sind.
- Die nützliche Dosismenge, die zu verabreichen ist, hängt von dem Typ des warmblütigen zu impfenden Säugetieres ab, dessen Gewicht, dessen Alter und dessen Verabreichungsweg. Im Allgemeinen ist dies eine geeignete Dosismenge zwischen 102 und 108 TCID50 Säugetier.
- Die folgenden Beispiele werden die Erfindung erläutern, ohne deren Umfang zu begrenzen.
- Verfahren und Material
- Herstellung der cDNS Klonez
- Ortsgerichtete Mutagenese durch das Verfahren von Kunkel et al, 1987; Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods Enzymology, Band 154, Seiten 376–382, ist mit 21-mer Oligonukleotiden durchgeführt worden, um drei Nukleotide des T7T-G auszutauschen (Conzelmann und Schnell, 1994; J. Virology, Band 68, Nr. 2, Seiten 713–719). Die sich ergebenden Plasmide kodierten modifiziertes RV Glykoprotein (G-Protein), bei dem Arg an der Position 333 (SAD B19), Position 4370–4372) des reifen RV G-Proteins ersetzt worden war mit unterschiedlichen Aminosäuren (siehe Tabelle 1). Um die eingeführten Mutationen in einem Volllängen RV cDNS Klon (pSAD L 16) einzubinden, ist ein StullPpuMI cDNS Fragment, welches die SAD B19 Nukleotide 4015–4470 umfasst, ausgetauscht werden. Tabelle I: RV cDNS Klone und die Kodone, die für die Aminosäuren-Residuen an dem antigenen Ort III des Glykoproteins des sich ergebenden rekombinanten RV mutanten Virus codieren.
- *) Vergleichsbeispiele: RV cDNS Klone, bei denen das Kodon sich nur in zwei Nukleotiden von dem Arg Kodon unterscheidet.
- Wiedergewinnung und Ausbreitung der antigenen Ort III Mutanten
- Transfektions-Experimente sind wie oben beschrieben ausgeführt worden (Conzelmann und Schnell, 1994; J. Virology, Band 68, Seiten 713–719). Ungefähr 106 BSR-Zellen sind mit dem rekombinanten Vaccinia Virus vTF7-3 (Fuerst et al., 1986) infiziert worden und dann mit einer Plasmid-Mischung, welche 5 μg des pT7T-N, 2.5 μg des pT7T-P, 2.5 μg des pT7T-L enthalten hat, und mit 4 μg eines Plasmids, welches das Volllängen antigenome RNS kodiert, unter Einsatz des Stratgene Säugetier-Transfektions-Kits (CaPO4 Protokoll) transfektiert worden. Die Isolation des transfektanten Virus und die Entfernung des Vaccinia Virus ist ausgeführt worden wie in Schnell et al., 1994, Zitat wie oben, beschrieben. Die Infektion von Zellen ist durch direkte Immuno-Fluoreszenz mit einem Anti-RV Nukleoprotein Konjugat (Centocor) überwacht worden und die rekombinanten RV's sind weiter passagiert worden, bis die Infektion der gesamten Monoschicht erreicht worden war. Die sich ergebenden Virusmengen sind bis zur Endpunkt-Verdünnung titriert worden. Fünfundzwanzig serielle Passagen in BSR-Zellkulturen sind mit einer Multiplizität der Infektion (moi) von 0.01 ausgeführt worden.
- RT-PCR und Sequenz-Aaalyse
- Um die Stabilität der rekombinanten Viren zu bestimmen, sind 25 aufeinander folgende Passagen in BSR-Zellen durchgeführt worden. RT-PCR ist ausgeführt worden auf 1 μg von Gesamt-RNS, isoliert aus infizierten Zellen, unter Einsatz des „Titan One Tube RT-PCR Systems", gemäss den Instruktionen des Lieferanten (Boehringer, Mannheim). Die PCR-Produkte sind analysiert worden auf 1%-igen Agarose-Gels und direkt für die Sequenzierung verwendet worden.
- Mäuse-Inokulation und Virus-Neutralisierung
- Gruppen von 3 Wochen alten NMRI Mäusen sind intracerebral (ic) mit 0.03 ml einer viralen Suspension (3'000 bis 9'000'000 ffu/Maus) inokuliert worden und auf Tollwut-Symptome hin überwacht worden. Um festzustellen, ob pathogene Rückbildungen nach dem Passagieren in säugenden Mäusen erscheinen, sind rekombinante Viren intercerebral in zwei Tage alte Mäuse inokuliert worden. Eine 20%-ige Gehirn-Suspension ist von den toten Mäusen hergestellt worden und in 3 Wochen alte Mäuse inokuliert worden. Serumproben sind von den überlebenden Mäusen 21 Tage nach der Infektion gesammelt worden. Um die neutralisierende Aktivität der Maus-Seren zu bestimmen, sind 5-fach seriell diluierte Seren mit 40 ffu des CVS-Stammes inkubiert worden. Nach 1 Stunde sind BHK-Zellen in die Virus-Serum Mischung hinzugefügt worden, für 24 Stunden inkubiert und durch direkte Fluoreszenz beobachtet worden. Für die Daten siehe Tabelle II. Tabelle II: Antigene Ort III Mutanten; Mutanten entsprechen den cDNS Klonen der Tabelle 1 (rec = rekombinant; RV = Tollwut-Virus; PBE = Plaque bildende Einheiten; ic = intercerebral; ffu = Fokus ausbildende Einheiten; W = entwurmte Mäuse, 3 Wochen alt; S = säugende Mäuse, 2 Tage alt; Ab = Antikörper; ND = nicht ausgeführt)
Claims (6)
- Rekombinante Tollwutvirusmutante, umfassend eine Mutation in dem G-Protein Gen des viralen Genoms, wobei diese Mutation mindestens eine Substitution des Codons in dem G-Protein Gen des viralen Genoms umfasst, welches Arg333 in dem G-Protein mit einem GAC-Triplett oder einem CAC-Triplett kodiert.
- Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Mutante eine Mutante des SAD-Stammes ist.
- Mutante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante der rekombinante Tollwutvirusmutantenstamm SAD D29 ist.
- Rekombinante Tollwutvirusmutante nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als ein therapeutisches oder prophylaktisches Agens.
- Rekombinante Tollwutvirusmutante nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in einem Impfstoff.
- Lebender attenuierter Anti-Tollwut-Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Impfstoff eine rekombinante Tollwutvirusmutante gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
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