DE69532369T2

DE69532369T2 - Rekombinantes infektiöses nicht-in-Segmente-geteiltes, negativ-Strange-RNS-Virus

Info

Publication number: DE69532369T2
Application number: DE69532369T
Authority: DE
Inventors: Karl Klaus Conzelmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-07-18
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2015-07-15
Also published as: EP0702085A1; ATE257175T1; EP0702085B1; JP4704232B2; CA2154023A1; JPH08168381A; DE69532369T3; CN1121959A; PT702085E; US6033886A; JP2006136340A; JP3816126B2; CA2154023C; DE69532369D1; CN100447247C; ES2210273T3; EP1394259A3; EP0702085B9; DK0702085T3; DK0702085T4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine genetisch manipulierte infektiöse replizierende nicht-segmentierte Negativ-Strang-RNA-Virus-Mutante und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Mutante.
Tollwutvirus (RV) ist ein Beispiel eines nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus' der Rhabdoviridae-Familie. Andere Arten, die zu dieser Familie gehören, sind das Virus der vesikulären Stromatitis (VSV), das Virus der infektiösen hämatopoetischen Nekrose (IHNV), das Virus der viralen hämorrhagischen Septikämie (VHS, Egtved-Virus), das Virus des Ephemeral-Fiebers des Rindes (BEFV) und das Sonchus-Yellow-Net-Virus (SYNV).
Neben der Familie der Rhabdoviridae besitzen auch Viren, die zu den Paramyxoviridae (z. B. Sendai-Virus (SV), Parainfluenza-Virus (PIV Typ 2 und 3, Virus der atypischen Geflügelpest (NDV), Mumps-Virus (MUV), Masern-Virus (MEV) und Staupe-Virus des Hundes (CDV) und Filoviridae gehören und etliche Viren, die nicht einer Familie zugeordnet sind (z. B. das Virus der Borna'schen Krankheit; BDV), ein nicht segmentiertes Negativ-Strang-RNA-Genom.
Die Gesamtheit der genomischen Organisation in den nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren der verschiedenen Familien ist vergleichbar. Insbesondere gibt es zwischen den Paramyxoviridae und den Rhabdoviridae lediglich geringe Unterschiede in der Gesamtheit der genomischen Organisation (Tordo et al., Seminars in Virology 3: 341–357, 1992).
RV kann alle warmblütigen Tiere infizieren und in nahezu allen Fällen nach dem Auftreten von Symptomen führt die Infektion zum Tode. Tollwut beim Hund ist immer noch in vielen Teilen der Welt wichtig: infizierte Hunde verursachen die meisten der schätzungsweise 75.000 menschlichen Tollwutfälle, die jedes Jahr weltweit auftreten. In vielen europäischen Ländern und in den Vereinigten Staaten und Canada hat die Tollwut bei wild lebenden Tieren an Bedeutung zugenommen.
Die klinischen Merkmale von Tollwut sind in den meisten Arten ähnlich, jedoch gibt es große Variation zwischen Individuen. Nach dem Biss von einem Tier mit Tollwut beträgt die Inkubationszeit üblicherweise zwischen 14 und 90 Tagen, sie kann jedoch beträchtlich länger sein. Inkubationszeiten von mehr als einem Jahr sind dokumentiert worden. Zwei klinische Formen der Erkrankung werden als rasend und stumm oder paralytisch erkannt. In der rasenden Form wird das Tier ruhelos, nervös, aggressiv und oftmals gefährlich, da es jegliche Angst vor Menschen verliert und nach allem beißt, das seine Aufmerksamkeit erregt. Das Tier kann oftmals nicht schlucken, was zu dem Synonym für die Erkrankung "Hydrophobie" führt. Oftmals treten übermäßiger Speichelfluss, übertriebene Reaktionen auf Licht und Geräusche und Hyperästhesie. Mit fortschreitender Enzephalitis nimmt die Wut zugunsten der Paralyse ab und das Tier offenbart die gleichen klinischen Merkmale wie durchweg in der stummen Form der Erkrankung beobachtet wird. Im letzten Abschnitt treten häufig krampfhafte Anfälle, Koma und Atemstillstand auf, wobei der Tod 2–7 Tage nach Beginn der klinischen Anzeichen eintritt.
Das Tollwutvirus dringt über den Biss oder gelegentlich die Kratzwunde eines Tollwuttieres in den Körper ein oder wenn Virus-beladener Speichel aus einem Tollwuttier in eine offene Wunde eindringt. Die virale Replikation in der Bissstelle, im Muskel, wird gefolgt von der Invasion von peripheren Nervenendungen und die zentrale Bewegung von viralem Genom im Zytoplasma von Axonen zum zentralen Nervensystem. Der virale Eintritt in das Rückenmark und anschließend das Gehirn (insbesondere das limbische System) wird von klinischen Anzeichen neuronaler Fehlfunktion begleitet. Üblicherweise, etwa zur gleichen Zeit bei der die Infektion des zentralen Nervensystems die Wut hervorruft, werden Virionen auch aus dem apikalen Ende von Schleim absondernden Zellen in den Speicheldrüsen ausgeschüttet und in hohen Konzentrationen in den Speichel abgegeben.
Während des gesamten Ablaufs der Tollwut werden die Entzündungs- und spezifischen Immunantworten des Wirtes nur geringfügig stimuliert; der wahrscheinlichste Grund dafür ist der, dass die Infektion im Muskel und in Nervenzellen nicht zytopathisch ist und dass die Infektion hauptsächlich in der immunologisch abgeschiedenen Umgebung des Nervensystems konzentriert ist.
RV-Virionen, wie alle Rhabdoviren, sind aus zwei Hauptstrukturkomponenten zusammengesetzt: ein Nukleokapsid- oder Ribonukleoprotein (RNP)-Kern und eine Hülle in Form einer doppellagigen Membran, die den RNP-Kern umschließt. Die infektiöse Komponente aller Rhabdoviren ist der RNP-Kern. Die genomische RNA ist negativ-sinnig und kann somit nicht als ein Messenger dienen, sondern benötigt ihre eigene endogene RNA-Polymerase für die Transkription von mRNA. Das RNA-Genom wird von dem Nukleokapsid (N)-Protein in Kombination mit zwei Nebenproteinen eingekapselt, d. h., RNAabhängige RNA-Polymerase (L) und Phosphoprotein (P), um den RNP-Kern zu bilden. Die Membran-Komponente enthält zwei Proteine: ein Trans-Membran-Glykoprotein (G) und ein Matrix (M)-Protein, das an der inneren Seite der Membran lokalisiert ist. Das G-Protein ist für die Zellanheftung und Membran-Fusion bei RV verantwortlich und ist zusätzlich das Hauptziel für das Immunsystem des Wirtes.
Während der Transkription steuert das Genom die sequentielle Synthese einer kurzen Führungs-RNA und fünf monocistronischen, gekappten und polyadenylierten mRNAs. Während der Replikation werden die konditionalen transkriptionellen Stopp- und Startsignale zwischen den Cistronen von der viralen Polymerase ignoriert. Sowohl für die Transkriptase- und die Replikase-Reaktion wird die Anwesenheit des N-Proteins, das mit dem RNA-Genom komplexiert ist, sowie die L- und P-Proteine benötigt. Die Gen-Anordnung auf dem RV-Genom ist bestimmt worden und ist 3'-Leader-N-P-M-G-L-5' wie in 1 gezeigt. Jedes der mRNAs von RV wird unmittelbar nach der Transkription translatiert. Zwei Ereignisse finden sequentiell während der Replikation statt: zunächst die Herstellung einer eingekapselten vollständigen Positiv-Strang-RNA, die zu dem Genom komplementär ist, gefolgt von der Herstellung vollständiger Negativ-Strang-RNA, die ebenfalls von den N-, L- und P-Proteinen eingekapselt ist. Schließlich assoziieren die neu zusammengesetzten RNP-Kerne mit M-Protein und G-Protein während des Zusammenbaus und des Knospungsprozesses, was zur Freisetzung von vollständig ausgebildeten und infektiösen RV-Virionen führt.
Die 11,9 kb genomische RV-RNA enthält fünf offene Leseraster (ORFs), die für die N-, P-, M-, G- und L-Proteine kodieren, zusätzlich zur Anwesenheit einer Pseudogen-Region (ψ) zwischen den G- und L-Genen (1).
Gegenwärtige Vakzine für nicht-segmentierte Negativ-Strang-RNA-Viren umfassen chemisch inaktivierte Virus-Vakzine oder modifizierte Lebendvirus-Vakzine umfassend einen abgeschwächten Virus-Stamm, dessen Pathogenität durch mehrfaches Passagieren in Zellkultur herabgesetzt ist. Chemisch inaktivierte Tollwut-Vakzine sind z. B.: Rabivac, Beh ringwerke (menschlich), HDC, Rhone-Poulenc (menschlich), Bayovac-LT, Bayer (tierisch), Madivac, Hoechst (tierisch), Epivax-LT, Pitman-Moore, Rabisin, Rhone-Merieux. RV-Beispiele von solchen abgeschwächten Viren sind die Vakzin-Stämme SAD B19 und ERA. Inaktivierte Vakzine induzieren im Allgemeinen nur ein geringes Maß an Immunität, was wiederholte Immunisierungen erfordert. Weiterhin können die neutralisationsinduzierenden antigenischen Determinanten der Pathogene durch die Inaktivierungsbehandlung verändert werden, was das Schutzpotential des Vakzins herabsetzt.
Im Allgemeinen werden abgeschwächte Lebendvirus-Vakzine bevorzugt, da sie eine Immunantwort hervorrufen, die oftmals sowohl auf humorale sowie zelluläre Reaktionen basiert. Während der Zellkultur-Passage können jedoch unkontrollierte Mutationen in das virale Genom eingeführt werden, was zu einer Population von Virus-Partikeln führt, die hinsichtlich der Virulenz und immunisierenden Eigenschaften heterogen sind. Eine übermäßige Abschwächung während der Passage in Zellkultur kann ebenfalls ein Problem bei diesen Vakzinen sein. Es muss eine empfindliche Balance hergestellt werden, wobei gewährleistet sein muss, dass das Vakzin nicht virulent ist, während sichergestellt sein muss, dass es noch schützend ist. Außerdem ist es wohl bekannt, dass solche traditionellen, abgeschwächten Lebendvirus-Vakzine zur Virulenz zurückkehren können, was zu einer massenhaften Ausbreitung der Erkrankung in geimpften Tieren und zur möglichen Ausbreitung des Pathogens auf andere Tiere führt.
Darüber hinaus ist ein Problem mit kombinierten viralen Lebend-Vakzinen die gegenseitige Beeinflussung der antigenischen Komponenten, was zu einer Verringerung der Stärke von einem oder mehreren der bildenden Komponenten führt.
Weiterhin ist es mit gegenwärtig verabreichten abgeschwächten oder inaktivierten RV-Lebend-Vakzinen nicht möglich zu bestimmen, ob ein bestimmtes Tier ein Träger von RV-Feld-Virus ist oder ob das Tier geimpft wurde. Somit kann es wichtig sein, zwischen Tieren, die mit einem RV-Vakzin geimpft wurden und denen, die mit einem Feld-Virus infiziert wurden, unterscheiden zu können, um in der Lage zu sein, geeignete Maßnahmen zu ergreifen, um die Ausbreitung eines virulenten Feld-Virus' herabzusetzen. Das Einführen beispielsweise eines serologisch identifizierbaren Markers kann erreicht werden durch Einführen einer Mutation in ein Gen, das für ein (Glyko-) Protein von RV kodiert, das normalerweise die Herstellung von Antikörpern in einem infizierten Wirtstier verursacht.
Es ist erwünscht, eine Mutation in das RV-RNA-Genom in einer kontrollierten Weise einzuführen, so dass beispielsweise das resultierende mutante RV abgeschwächt ist oder eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz umfasst, die für Epitope von fremden Proteinen kodiert, beispielsweise immunologische Marker-Proteine oder Antigene von Pathogenen. Rekombinante DNA-Techniken sind bereits weithin zu diesem Zweck mit DNA-Viren und Positiv-Strang-RNA-Viren im Gebrauch. Beispiele für rekombinante DNA-Viren: Aujeszky-Virus (PRV); Adenoviren; Vaccinia-Viren. Beispiele für rekombinante Positiv-Strang-RNA-Viren: Alphaviren (Sindbis-V., Semliki Forest-Virus: H. V. Huang, C. M. Rise, C. Xiong, S. Schlesinger (1989) RNA viruses as gene expression vectors. Virus Genes 3, 85–91). Picornaviren (Polio-Virus, Hepatitis-A-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus: J. W. Almond und K. L. Burke (1990) Poliovirus as a vector for the presentation of foreign antigens. Semin. Virol. 1, 11–20). Die gerichtete genetische Manipulation von RNA-Virus-Genomen hängt ab von der Fähigkeit, rekombinante RNAs herzustellen, die als ein Template von den speziellen RNA-abhängigen RNA-Polymerasen angenommen werden. Transkripte, die von vielen Standard-DNA-abhängigen RNA-Polymerasen erzeugt werden (z. B. T7 RNA-Polymerase oder zelluläre RNA-Polymerase II) und die virale Genome imitieren, werden von den Polymerasen von vielen Positiv-Strang-RNA-Viren erkannt. Dies ermöglichte die Gewinnung von infektiösen Viren oder Replikons von cDNA-Transkripten und die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie, um diese Genome in einer stellenspezifischen Weise zu manipulieren. Da RNAs, die den Genomen von Positiv-Strang-RNA-Viren entsprechen, als mRNA für die Translation von viralen Polymerasen fungieren können, kann ein infektiöser Zyklus durch Einführen der Genom-Analoga in eine Zelle initiiert werden. Das Template der Polymerasen von Negativ-Strang-RNA-Viren ist jedoch ausschließlich der RNP-Komplex. Darüber hinaus und im Gegensatz zu Positiv-Strang-RNA-Viren mag ihre genomische oder antigenomische RNA nicht als mRNA funktionieren und somit müssen alle viralen Proteine, die an der Replikation und Transkription von künstlichen RNAs beteiligt sind, in trans bereitgestellt werden.
Ein geeignetes System für das Einkapseln von genomischen RNA-Analoga von Negativ-Strang-RNA-Viren mit einem segmentierten Genom, um die geeignete Matrize bereitzustellen, ist kürzlich von Palese, P. et al., (WO 91/03552) offenbart worden. RNA-Transkripte von Influenza-Virus-Genom-Segmenten wurden von gereinigten Proteinen in vitro eingekapselt, die verwendet werden können, um gemeinsam mit einem Helfer-Virus Zellen zu transfizieren. Es zeigte sich jedoch, dass dieser Ansatz nicht erfolgreich mit RV war, ein Virus, das ein nicht-segmentiertes Genom aufweist. Kurze Model-Genome von VSV und RV, denen der Großteil des RNA-Genoms fehlt, das die Gene, die für die viralen Proteine kodieren, umfasst, könnten von durch Plasmid-kodierten Proteinen eingekapselt und exprimiert werden (Pattnaik, A. K. et al., Cell 69, 1011–1020, 1992, Conzelmann, K-K. und M. Schnell, J. Virology 68, 713–719, 1994). Dieser Ansatz umfasste die Ko-Expression sowohl von den Genom-Analoga, die gegebenenfalls Reportergen-Inserts umfassen, als auch insbesondere virale Proteine von transfizierten Plasmiden, um fehlerhafte Viruspartikel herzustellen. Ballart et al. beschrieben ein Verfahren, um ein infektiöses Masern-Virus, ebenfalls ein nicht-segmentiertes Negativ-Strang-RNA-Virus, aus klonierter cDNA zu erhalten (The EMBO-Journal, 9: 379–384 (1990)). Eine europäische Patentanmeldung, die dieses Verfahren betrifft, wurde mit dem Verfasser als einer der Erfinder eingereicht.
Sowohl die Publikation als auch die Anmeldung wurden jedoch zurückgezogen, da weitere Forschung enthüllte, dass alle vermuteten rekombinanten Viren gar keine Rekombinanten waren, sondern nur Virusabkömmlinge des ursprünglich verwendeten Vakzin-Strangs.
Somit muss gefolgert werden, dass Versuche, infektiöse rekombinante Negativ-Strang-RNA-Viren mit einem großen nicht-segmentierten Genom zu erhalten, das die Manipulation von ganzen Genomen erfordert, bis heute gescheitert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt eine genetisch manipulierte infektiöse replizierende nicht-segmentierte Negativ-Strang-RNA-Virus-Mutante bereit, die durch rekombinante DNA-Techniken erhältlich sind, umfassend eine Insertion und/oder Deletion in einem ORF, einer Pseudogen-Region oder einer nicht-kodierenden Region des RV-Genoms.
Insbesondere stellt die Erfindung nicht-segmentierte Negativ-Strang-RNA-Viren der Paramyxo- und Rhabdovirus-Familie bereit.
Wie oben beschrieben ist eine große Homologie in der genomischen Organisation zwischen den nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus-Familien vorhanden. Wo die Funktion von kodierten Proteinen im Prozess der Replikation, des Zusammenbaus, der Zellanheftung oder der Zellfusion vergleichbar ist, werden diese Proteine im Weiteren als "Analoga" bezeichnet. Es kann sein, dass die Funktion von z. B. zwei Proteinen einer Familie in einem Protein einer anderen Familie vereinigt ist. Dies ist z. B. der Fall mit den F- und HN-Proteinen der Paramyxoviridae, die gemeinsam die gleiche Funktion aufweisen wie Glykoprotein G der Rhabdoviridae. In diesem Fall werden die beiden Proteine der einen Familie als Analog mit dem einen Protein der anderen Familie betrachtet.
Die Insertion und Deletion von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten können in das RV-Genom eingeführt werden durch Einführen der geeigneten Mutationen in das korrespondierende virale ORF, die Pseudogen-Region oder die nicht-kodierende Region. Diese Veränderung wird als Änderung der genetischen Information in dem RV ORF oder Pseudogen eines Stamm-RV verstanden, wobei die erfindungsgemäße Insertions- oder Deletions-RV-Mutante erhalten wird.
Bei einer Mutation, in der ein oder mehrere Nukleotide durch andere Nukleotide ersetzt sind, wird ein so genannter Substitutionsaustausch als das Ergebnis einer kombinierten Deletions- und Insertions-Aktivität betrachtet. Diese An von Mutation wird somit auch betrachtet in dem Wortlaut: Deletion und(/oder) Insertion eingeschlossen zu sein.
Es ist ersichtlich, dass eine beliebige Mutation, wie hierin definiert, eine Veränderung der geeigneten RV-Sequenzen umfasst, so dass die resultierende RV-Mutante immer noch infektiös und replizierend ist, d. h. das mutante RV ist fähig, empfängliche Zellen zu infizieren und sein mutantes RNA-Genom ist fähig zur autonomen Replikation und Transkription, d. h. keine Ko-Expression von RV N-, P- und L-Proteinen ist erforderlich.
Es ist selbstverständlich, dass in der vorliegenden Erfindung mutante RVs ebenfalls umfasst werden, die nur zu einer einzigen Infektionsrunde fähig sind, gefolgt von Replikation (s. unten).
Die genomische Organisation verschiedener RV-Stämme ist identisch. Die Analyse der Nukleotidsequenz und der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des Vakzinstammes SAD B19 und des virulenten Stammes PV sind bestimmt worden (Conzelmann et al., Virology 175, 485–499, 1990 und Tordo et al., Nucleic Acids Res. 14, 2671–2683, 1986; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3914–3918, 1986; Virology 165, 565–567, 1988). In Conzelmann et al., 1990 (oben) wird bestimmt, dass das virale Genom des SAD B19-Stammes 11928 Nukleotide umfasst und dass die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der fünf viralen Proteine N, P, M, G und L in hohem Maße zu denjenigen des pathogenen PV-Stammes ähnlich sind. Die Lage der jeweiligen ORFs, der Pseudoregion und der intergenetischen nicht kodierenden Regionen in RV sind hierin bestimmt worden: die kodierende Region der RV N-, P-, M-, G- und L-Gene korrespondieren jeweils mit Positionen 71–1423, 1514–2407, 2496–3104, 3317–4891 bzw. 5414–11797. Die Pseudogen-Region (ψ) ist an Position 4961–5359 kartiert, während die intergenischen Regionen, die die fünf Cistrone trennen und die von nicht-kodierenden Sequenzen flankiert sind, die transkriptionelle Start- und Stop/Poly-Adenylierungssignale enthalten, an Positionen 1483–1484; 2476–2480; 3285–3289; 5360–5383 kartiert sind. Obwohl die Nummerierung und die Nukleotid-Sequenz von den ORFs, der Pseudogen-Region oder den nicht-kodierenden Regionen des Stamm-RV-Stamms, der hierin verwendet wird, um eine Mutation einzuführen, nicht notwendigerweise die gleichen sind wie diejenigen des SAD B19- oder PV-Stammes, definieren die oben genannten Charakterisierungen dieser Regionen genau ihre Lokalisation in dem Genom eines jeden beliebigen RV-Stammes.
Ein Verfahren, um ein abgeschwächtes RV aus einem virulenten Stamm-RV-Stamm zu erhalten, ist das Einführen der Insertion und/oder Deletion in einem ORF, das für ein virales Protein kodiert, beispielsweise derart, dass die Aktivität des viralen Proteins für eine Wirtszell-Anheftung und -Membranfusion modifiziert, d. h. vermindert ist. Für RV ist bekannt, dass Veränderungen in der Aminosäure-Sequenz des Trans-Membran-Glykoproteins G signifikante Auswirkungen auf die Pathogenität des RV haben. Zusätzlich, hinsichtlich der Abschwächung, können auch Änderungen in dem Matrix (M)-Protein die Konformation des G-Proteins beeinflussen, was in einer Abschwächung des Virus' resultiert. Somit werden mutante RV, umfassend eine Deletion oder Insertion in dem ORF, der für das G- oder M-Protein kodiert, hierin besonders bevorzugt.
Ebenfalls werden in der vorliegenden Erfindung infektiöse replizierende Tollwutvirus-Mutanten umfasst, die nur zu einer einzigen Infektionsrunde fähig sind, gefolgt von Replikation. Der Vorteil davon wird unten erläutert:
Obwohl allgemein gesprochen rekombinante Lebend-Vakzine sich als sicher und wirksam erwiesen haben, besteht ein Risiko, dass die Vakzin-Viren sich auf andere Tiere ausbreiten, die für das Virus empfänglicher sind.
Somit gibt es einen starken Widerwillen sowohl auf politischer, ethischer als auch zum Teil wissenschaftlicher Ebene, die Verwendung von rekombinanten Viren auf dem Gebiet zu genehmigen.
Insbesondere für Studien zur Risikoabschätzung durch Regulierungsbehörden hinsichtlich genetisch modifizierter Vakzin-Viren, insbesondere Lebendviren, die Fremdgene exprimieren, ist der Aspekt, dass Viren möglicherweise in die Umwelt freigesetzt werden, ein sehr wichtiger.
Somit ist ersichtlich, dass Tollwutvirus-Vakzine, die alle Vorteile von Lebendvirus-Vakzine aufweisen, jedoch auf die geimpften Tiere beschränkt sind und nicht freigesetzt werden, in höchstem Maße erwünscht sind.
Solche Viren können hergestellt werden z. B. durch Mutation des M-Gens, das für das M(atrix-)-Protein kodiert. Das M-Protein spielt eine Hauptrolle beim Zusammenbau des Virus, wobei es zusätzlich den Einbau und die Konformation des Glykoproteins G beeinflusst.
Wenn M^(–)-Mutanten, denen ein funktionelles M-Protein fehlt, in manipulierten Zellen wachsen, die das M-Protein in trans herstellen, werden intakte Viruspartikel hergestellt, die sich wie Wildtyp-Virus verhalten insoweit es ihren infektiösen Charakter gegen ihren natürlichen Wirt betrifft. Sobald sie jedoch eine Wirtszelle infiziert haben, gibt es keine Möglichkeit, neue infektiöse Viren zu bilden, da ihnen die genetische Informationen zur Synthese des M-Proteins fehlen.
Somit verbleiben sie im Wirt. Die Vorteile solcher Viren werden unten diskutiert.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform eine Insertion und/oder Deletion in dem offenen Leseraster, das für das Matrix-Protein M kodiert, so dass es ein nicht-funktionelles Matrix-Protein M oder sogar die Abwesenheit von Matrix-Protein M zur Folge hat. Die M^(–)-mutanten Viren mit dem nicht-funktionellen oder fehlenden Matrix-Protein M müssen in Zellen wachsen, die ein Matrix-Protein M-Analog in trans bereitstellen, um das Virus phenotypisch zu komplementieren.
Alternativ können solche Viren z. B. durch Mutation des G-Gens hergestellt werden. Das G-Protein spielt frühzeitig in der Infektion eine Hauptrolle im Prozess der Zellanheftung und -Membranfusion, wie vorher erwähnt.
Es ist möglich, das G-Gen durch Insertion und/oder Deletion (oder sogar durch Deletion des gesamten G-Gens) in einem solchen Ausmaß zu mutieren, dass das resultierende G^–-mutante Virus aufgrund des schwer beschädigten (oder sogar fehlenden) Glykoproteins G nicht länger fähig ist, andere Zellen erfolgreich zu infizieren. Solche Mutanten werden im Weiteren als G-minus (G^–-)Mutanten bezeichnet.
Diese An der Mutationen des G-Gens ist somit schwerwiegender als die vorher beschriebenen Mutationen, die lediglich zu einer verminderten Virulenz führen: wirkliche G^–-Mutanten sind nicht infektiös, da ihnen ein funktionelles Glykoprotein G fehlt.
Wenn solche G^–-mutante Viren in rekombinanten Wirtszellen wachsen, die für das G-Protein komplementieren, werden Viren-Abkömmlinge ausgeschieden, die phenotypisch G-positiv, jedoch genotypisch G-negativ sind.
Diese Viren besitzen einen wichtigen Vorteil gegenüber G-positiven Viren: auf der einen Seite sind sie fähig zur Infektion von nicht-komplementierenden Wirtszellen, da sie das G-Protein in ihrer Membran besitzen. In den infizierten Fällen replizieren die G^–-Mutanten wie Wildtyp-Viren. Dies hat den Vorteil, dass das gesamte virale Genom einschließlich der heterologen Gene, die in das rekombinante Virus kloniert sind, multipliziert wird und die kodierten Genom-Produkte wie beim Wildtyp-Virus exprimiert und prozessiert werden.
Auf der anderen Seite jedoch kann kein Virus-Abkömmling in dem Wirt hergestellt werden, da normale Wirtszellen das G-Protein nicht synthetisieren und das mutante Virus selbst genotypisch G-negativ ist.
Somit setzen mit G^–-mutantem Virus infizierte Tiere kein infektiöses Virus in die Umwelt frei. Dies macht G^–-Mutanten (wie auch die oben beschriebenen M^(–)-Mutanten) sehr sicher als Basis für Vakzine.
Alternativ können die erfindungsgemäßen G^–-Mutanten phenotypisch durch andere, nicht Tollwut-, Glykoproteine, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Zellanheftung spielen, komplementiert werden.
Da von Glykoprotein(en), die aus der viralen Membran in die Umgebung herausragen, bekannt ist, dass sie die Zellspezifität bestimmen, ist es somit möglich, durch Wahl des richtigen komplementierenden Glykoproteins die infektiöse Tollwutvirus-Mutante auf andere spezifische Zellen als die natürlichen Wirtszellen bei Tollwut zu richten.
Diese Glykoproteine werden im Weiteren "Glykoprotein-G-Analoga" genannt, um darauf hinzudeuten, dass sie wie Glykoprotein G an der zellspezifischen Anheftung beteiligt sind.
Es sollte jedoch bemerkt werden, dass in einigen Viren die "Glykoprotein-G-Analoga", die die Zellspezifität bestimmen, nicht Glykoproteine sondern nicht glykosylierte Proteine sind. Es ist ersichtlich, dass diese Proteine ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung sind.
Somit ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Insertion und/oder Deletion in dem offenen Leseraster, das für das Glykoprotein G kodiert, solcher Art, dass es ein nicht funktionelles Glykoprotein G oder sogar die Abwesenheit von Glykoprotein G zur Folge hat. Die G^(–)-mutanten Viren mit dem nicht-funktionellen oder fehlenden Glykoprotein G müssen in Zellen wachsen, die ein Glykoprotein G-Analog in trans bereitstellen, um das Virus phänotypisch zu komplementieren.
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Glykoprotein-Analog, das für die Komplementierung verwendet wird, das Tollwutvirus Glykoprotein G selbst.
Rekombinante infektiöse Tollwutviren mit einem Glykoprotein-G-Analog besitzen etliche wichtige Vorteile:

a) Sie können spezifisch auf bestimmte Zellen, Organe oder Wirte gerichtet werden, in Abhängigkeit von dem Ziel des Glykoprotein-G-Analogs, das gewählt wurde. Dies impliziert, dass beispielsweise speziell der Respirationstrakt oder der Verdauungstrakt anvisiert werden kann. Somit können z. B. Schleimhautreaktionen an einer vorbestimmten Stelle erhalten werden. Alternativ können spezifische Zellen des Immunsystems anvisiert werden.
b) Sie können zusätzlich Träger von fremder genetischer Information sein, die für Epitope aus Nicht-Tollwut-Pathogenen, wie oben beschrieben, kodieren. Alternativ können sie Träger von fremder genetischer Information sein, die für toxische Substanzen kodieren.

Eine sehr wichtige Anwendung von erfindungsgemäßen Viren wird erreicht mit Viren, die sowohl ein Glykoprotein-G-Analog gemäß a), als auch fremde genetische Information gemäß b) aufweisen.
Rekombinante infektiöse Tollwutviren können gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen werden, die auf einen spezifischen Zelltyp gerichtet sind, der normalerweise von einem Nicht-Tollwutvirus angegriffen wird, während sie gleichzeitig eine immunprotektive Determinante dieses Nicht-Tollwutvirus' tragen.
Solch ein Virus induziert eine Immunität in dem Wirt gegen das Nicht-Tollwutvirus während es zur gleichen Zeit aufgrund des Fehlens von genetischer Information für das Glykoprotein-G-Analog völlig sicher ist.
Eine weitere wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind erfindungsgemäße Viren, die beispielsweise auf CD4-Zellen, die Zielzellen von HIV darstellen, durch genotypische Komplementierung mit HIV gp120 gerichtet sind, und die fakultativ für ein zytotoxisches Protein kodieren.
Solche Viren werden in selektiver Weise CD4-Zellen angreifen und sofern sie einmal innerhalb dieser Zellen sind, werden sie sie töten.
Alternativ können erfindungsgemäße rekombinante infektiöse Tollwutviren sehr sichere Vakzine gegen virulente/pathogene Viren bereitstellen, gegen die es im Moment keine sichere Lebend-Vakzine gibt: ein rekombinantes infektiöses Tollwutvirus, das z. B. gegen die natürlichen Zielzellen des Bovinen respiratorischen Synzytial-Virus (BRSV) durch Komplementierung mit BRSV-Glykoprotein-G-Analog gerichtet ist und immunprotektive Epitope von BRSV exprimiert, stellt ein sehr sicheres Vakzin gegen diese Erkrankung dar.
Parainfluenza-Virus-Vakzine standen bislang den gleichen Problemen gegenüber wie BRSV-Vakzine. Somit stellt das rekombinante infektiöse Tollwutvirus mit dem Parainfluenza-Glykoprotein-G-Analog und zusätzlichen immunogenen Epitopen von Parainfluenza ein gutes und sicheres Vakzin gegen diese Erkrankung bereit.
Weitere wichtige Veterinär-Vakzine, die auf dem rekombinanten infektiösen Tollwutvirus basieren, werden hergestellt durch Einführung von immunogenen Determinanten in dem rekombinanten Tollwutvirus von:

i) den Toroviren; Pferde-, Bovines- und Schweine-Torovirus,
ii) den Koronarviren: Bovine-, Hunde-, Schweine- und Katzen-Koronarvirus, insbesondere die Spike-Proteine davon.

Somit betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung rekombinante infektiöse Tollwutvirus-Glykoprotein-G^(–)-Mutanten, die mit einem Glykoprotein-G-Analog komplementiert sind, und eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz tragen, die für ein Epitop oder Polypeptid eines pathogenen Virus' oder ein Mikroorganismus' kodieren.
Alternativ kann die Abschwächung von RV erhalten werden durch Veränderung der Enzymaktivität der RV-Replikase oder -Transkriptase, so dass das Enzym weniger aktiv ist, was zur Produktion von weniger infektiösen Virionen nach Infektion eines Wirtstieres führt. Da die N-, P- und L-Proteine an der RV-Polymeras-Aktivität beteiligt sind, sind RV-Mutanten, die eine Insertion oder Deletion in dem ORF, das für die N-, P- oder L-Proteine kodiert, aufweisen, ebenfalls Teil der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen RV-Deletions- und/oder Insertionsmutanten können ebenfalls verwendet werden, um einen Wirt zu impfen, um in der Lage zu sein, zwischen einem Wirt, dem ein Vakzin, umfassend die genannte RV-Mutante, verabreicht wird und einem Wirt, der mit einem Stamm-RV infiziert ist, (serologisch) zu unterscheiden. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann das Insert in der RV-Insertionsmutante für ein heterologes Epitop, das zum Auslösen einer spezifischen Nicht-RV-Immunantwort in einem geimpften Wirt fähig ist, oder für ein Protein mit enzymatischer Aktivität, wie beispielsweise CAT oder lacZ, kodieren (Conzelmann und Schnell, 1994, oben). Eine bevorzugte Region für den Einbau solcher Inserts ist die RV-Pseudogen-Region. Wie in den Beispielen gezeigt, können Insertionen und Deletionen in dieser Region durchgeführt werden, ohne es sentielle Funktionen von RV, wie diejenigen, die für die Infektion oder Replikation notwendig sind, zum Erliegen zu bringen. Der RV-Deletionsmutante kann ein Epitop eines RV-Proteins fehlen, gegen das eine Immunantwort normalerweise durch die Vakzine hervorgerufen wird, insbesondere ist eine RV-Mutante, die eine Deletion in dem ORF, das für das G-Protein kodiert, umfasst, für diesen Zweck geeignet. Im Fall einer RV-Insertionsmutante umfasst die Insertion eine Nukleinsäure-Sequenz, die für ein serologisches Marker-Antigen oder ein Epitop davon, kodiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine RV-Mutante bereitgestellt, die fähig ist zur Expression von ein oder mehreren verschiedenen heterologen Epitopen oder Polypeptiden eines spezifischen Pathogens. So eine Mutante kann verwendet werden zur Vakzinierung von Tieren, sowohl Haustiere als auch nicht-Haustiere gegen Wildtier-Tollwut und das genannte Pathogen.
Die Vakzinierung mit solch einem Lebend-Vektor-Vakzin wird vorzugsweise gefolgt von der Replikation der RV-Mutante innerhalb des geimpften Wirtes, der in vivo das heterologe Epitop oder Polypeptid gemeinsam mit den RV-Polypeptiden exprimiert. Die Polypeptide, die in dem geimpften Wirt exprimiert sind, werden dann eine Immunantwort sowohl gegen RV als auch das spezifische Pathogen hervorrufen. Wenn das heterologe Polypeptid, das von dem spezifischen Pathogen abgeleitet ist, eine protektive Immunantwort stimulieren kann, wird das Tier, das mit der erfindungsgemäßen RV-Mutante geimpft wurde, dann gegenüber nachfolgender Infektion durch das Pathogen sowie gegenüber Infektion durch RV immun sein. Somit kann eine heterologe Nukleinsäure-Sequenz, die in eine geeignete Region des RV-Genoms eingeführt wird, fortwährend in vivo exprimiert sein, was eine stabile sichere und dauerhafte Immunität gegenüber des Pathogens bereitstellt.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen RV-Vektor bereit, der eine Insertion von einer Nukleinsäure-Sequenz umfasst, die für ein Epitop oder Polypeptid eines spezifischen Pathogens kodiert, wobei die Insertion in der Pseudogen-Region gemacht wurde.
Falls gewünscht, kann die Pseudogen-Region teilweise oder gänzlich in dem oben beschriebenen RV-Vektor deletiert sein.
Vorzugsweise werden Nukleinsäure-Sequenzen, die für ein Epitop oder Polypeptid von Parvovirus des Hundes, Koronavirus des Hundes und klassischem Schweinepest-Virus (CSFV) kontemplatiert für den Einbau in eine geeignete Region des RV-Genoms.
Die Möglichkeit, das nicht-segmentierte Negativ-Strang-RNA-Genom von RV auf der DNA-Ebene durch rekombinante DNA-Verfahren zu manipulieren, war bislang nicht möglich, da kein infektiöses replizierendes Virus erzeugt werden konnte. Jedoch wird hier ein Verfahren bereitgestellt, das die Konstruktion einer Mutation in einem kodierenden Bereich oder nicht-kodierenden Bereich des viralen Genoms auf der DNA-Ebene mittels rekombinanter DNA-Techniken erlaubt, gefolgt von dem Erzeugen eines infektiösen replizierenden RV, das die Mutation in seinem Genom trägt.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist wie in Anspruch 13.
Normalerweise ist die cDNA des Tollwutvirus-Genoms durch den Einbau einer Mutation in das Genom modifiziert.
Das Verfahren kann jedoch ebenfalls verwendet werden, um beispielsweise kontaminierte RV-Pools zu reinigen. In solch einem Fall wird die ursprüngliche nicht-mutierte cDNA verwendet werden.
Hinsichtlich der Tatsache, dass die Ausbeute-Effizienz eines modellhaften Mini-Genoms von RV, umfassend heterologe Inserts mit Plasmid-kodierten Proteinen, extrem gering ist und darüber hinaus mit der Insert-Länge korreliert (Conzelmann und Schnell, 1994, oben), konnte nicht erwartet werden, dass die Initiierung einer produktiven Infektion von transfizierter genomischer RNA voller Länge durch eine Ko-Transfektion mit Plasmiden, die für die RV N-, P- und L-Proteine kodieren, erreicht werden könnte. Dies um so mehr als große Mengen von Positiv-Sinn-N-, P- und L-spezifischen RNAs von den transfizierten Protein-kodierenden Plasmiden produziert werden, von denen angenommen wurde, dass sie mit gleichzeitig exprimierten Negativ-Strang genomischen RNA-Transkripten hybridisieren. Jedoch wurde angenommen, dass eine mögliche Hybridisierung, die mehr als die Hälfte des Genoms beeinflussen könnte, auf den entscheidenden Einkapselungsschritt störend eingreift. Außerdem könnte die Translation von N-, P- und L-mRNA beeinflusst werden. In der Tat wurde gefunden, dass mit dem Standard-Transfektionsprotokoll keine infektiösen Viren erhalten werden konnten. Jedoch, wie in den Beispielen gezeigt, führte die An wendung eines alternativen Transfektionsprotokolls in Kombination mit der Verwendung eines RV-cDNA-Genoms, das Positiv-Strang antigenomische RNA-Transkripte erzeugt, zu einem replizierenden genetisch manipulierten RV.
Das oben genannte Verfahren ermöglicht das in vitro-Einführen einer Mutation in das Genom eines Stamm-RV mittels rekombinanter DNA-Techniken, gefolgt von der Erzeugung einer infektiösen replizierenden RV-Mutante, die die genannte Mutation trägt. Die Mutation schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf eine Insertion, Deletion oder Substitution von Nukleinsäure-Resten in ein ORF, das für ein RV-Protein, einen nicht-kodierenden Bereich, z. B. die Pseudogen-Region, oder eine transkriptionelle Signalsequenz des Stamm-Genoms von RV kodiert.
Die Konstruktion einer Mutation in einem nicht-kodierenden intergenischen Bereich kann die Transkription eines spezifischen viralen Gens in so einer Weise beeinflussen, dass die Transkription der mRNA und die nachfolgende Translation des Proteins, entweder einem Hüll-Protein, wie das M- und G-Protein, oder ein Protein, das an der Polymerase-Aktivität beteiligt ist, wie das N-, P- oder L-Protein, herabgesetzt ist, was zu einer Virus-Mutante führt, die abgeschwächte Eigenschaften aufweist, da die Fähigkeit der Mutante (infektiöse) Virus-Nachkommen herzustellen, vermindert ist. Insbesondere kann die Substitution von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten in diesem intergenischen Bereich und/oder diesen transkriptionellen Signal-Sequenzen die Wirksamkeit der Transkription beeinflussen.
Weiterhin ist die Substitution von einem oder mehreren Nukleinsäure-Resten in einem Bereich des Genoms eines virulenten RV, das an der Virulenz beteiligt ist, wie z. B. das ORF, das für das G-Protein kodiert, durch die Anwendung des hier beschriebenen Verfahrens Teil der Erfindung ist.
Solch eine Mutation mag einen Austausch einer einzigen Aminosäure in dem G-Protein eines virulenten RV-Stammes zur Folge haben, was zu einem (teilweisen) Verlust von Pathogenität, z. B. Austausch von Arg (333) mit Ile, Glu oder Gln, oder Leu (132) durch Phe oder Trp.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst das DNA-Molekül, das die genetische Information von RV enthält, vorzugsweise ein Plasmid, das mit geeigneten Initiierungs- und Terminations-Sequenzen der Transkription ausgestattet ist, die von einer Polymerase erkannt werden können, die von den transfizierten Wirtszellen ko-exprimiert wird.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren umfasst die Verwendung von Wirtszellen, die mit RV-DNA transfiziert sind, die beispielsweise zytoplasmatisch von einer Vaccinia-Virus-Rekombinanten exprimiert wird, wobei die Zellen zur Expression von DNA-abhängiger RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 fähig sind. In diesem Fall werden die Plasmide, die die RV-DNA enthalten, mit dem T7-Promoter und Terminationssequenzen bereitgestellt (Conzelmann und Schnell 1994, oben) Für die Herstellung eines Lebend-Vakzins kann die erfindungsgemäße rekombinante RV-Mutante auf einer Zellkultur, abgeleitet aus beispielsweise BHK- oder menschlichen Diploide Zellen, wachsen gelassen werden.
Die so gewachsenen Viren können durch Sammeln der Gewebszellkultur-Flüssigkeiten und/oder -Zellen geerntet werden. Das Lebend-Vakzin kann in Form einer Suspension hergestellt werden oder kann lyophilisiert sein.
Zusätzlich zu einer immunogenetisch wirksamen Menge des rekombinanten RV kann das Vakzin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten.
Beispiele von pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Stabilisatoren, wie z. B. SPGA, Kohlenhydrate (z. B. Sorbitol, Mannitol, Stärke, Saccharose, Glukose, Dextran), Proteine, wie z. B. Rinderserum oder entrahmte Milch und Puffer (z. B. Phosphatpuffer) ein.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Verbindungen, die Adjuvanz-Aktivität aufweisen, zu dem Vakzin hinzugefügt werden. Geeignete Adjuvanzien sind beispielsweise Aluminium-Hydroxid, -Phosphat- oder -Oxid, Öl-Emulsionen (z. B. von Bayol F^(R) oder Marcol 52^(R), Saponine oder Vitamin-E-Lösungen.
Die verwendbare Dosierung, die verabreicht werden soll, wird in Abhängigkeit der Säugetierart, die geimpft werden soll, des Alters, des Gewichts und Art der Verabreichung variieren.
Die Dosierung kann in weiten Bereichen variieren: 10² bis 10⁷ pfu/Tier würden beispielsweise geeignete Dosierungen sein.
Eine spezifische Dosierung kann beispielsweise etwa 10⁶ pfu/Tier sein.
Eine erfindungsgemäße RV-Mutante kann auch verwendet werden, um ein inaktiviertes Vakzin herzustellen.
Zur Verabreichung an Tieren kann die erfindungsgemäße RV-Mutante u. a. oral, intranasal, intradermal, subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
Das erfindungsgemäße RV-Vakzin kann Hunden, jedoch auch den Hauptvektoren, d. h. Waschbären, Stinktieren und Füchsen verabreicht werden. Weiterhin wird auch die Impfung von Wildschweinen mit einem Lebend-RV-Vektor, der zur Expression eines heterologen Gens eines Schweine-Pathogens fähig ist, wie z. B. das klassische Schweinepest-Virus, in Betracht gezogen.
Beispiel 1
Herstellung von infektiösen replizierenden RV-Virionen
Konstruktion einer RV-cDNA voller Länge (2)
Die Klonierung von cDNA, die das gesamte Genom des RV-Stammes SAD B19 umfasst, wurde vorher beschrieben (Conzelmann et al., 1990, oben; GenBank Zugangsnummer M31046). Die Nummerierung von RV-Nukleotiden und -Aminosäuren, die hier verwendet wird, entspricht der von Conzelmann et al., 1990 (oben). Als Basis für den Zusammenbau eines DNA-Klons voller Länge von SAD B19 wurde die RV-Mini-Genom-Sequenz, die in dem Transkriptionsplasmid pSDI-1 enthalten ist (Conzelmann und Schnell, 1994, oben), verwendet (2). PSDI-1 enthält die genomischen 3'- und 5'-Enden von SAD B19 (SAD B19-Nukleotide 1–68 bzw. 11760–11928), die zwischen einem T7-RNA-Polymerase-Promotor und der antigenomischen Ribozym-Sequenz des Hepatitis-Deltavirus (HDV) eingefügt worden ist. Um ein Plasmid zur Herstellung von Positiv-Strang-SDI-1-Transkripten (pSDI-1 plus) zu erzeugen, wurden die RV-Sequenzen, die in pSDI-1 enthalten sind, zunächst mittels PCR unter Verwendung eines 11-Basen-Primers (5'- ACGCTTAACAA-3') amplifiziert, der aufgrund von komplementären genomischen Enden von RV den 5'-Termini von sowohl positiv- als auch negativ-sinnigen viralen RNAs entspricht. Nach anschließender partieller Ligation eines synthetischen EcoRI/Blunt-Adaptors (T7/3), der eine T7-Promotor-Sequenz enthält, gefolgt von drei G-Resten (unterstrichen) (5'-AATTCCTGCAGTAATACGACTCACTATAGGG-3') an die amplifizierte RV-Sequenz, wurden die in die EcoRI/SmaI-Stellen von pX8dt kloniert. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pBluescriptII (Stratagene), aus dem ein BssHII/ClaI-Fragment der multiplen Klonierungsstelle, die den ursprünglichen T7-Promotor enthält, deletiert wurde. Es enthält die 84-Basen-HDV-antigenomische Ribozym-Sequenz in der SmaI-Stelle, gefolgt unmittelbar von einer T7-Transkriptions-Terminationssequenz, die in die BamHI-Stelle kloniert worden ist. Konstrukte, die einen T7-Promotor stromaufwärts der Plus-Sinn-RV-Sequenz enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse und -Sequenzierung identifiziert. Das MunI-BglII-Fragment von pSDI-1 (SAD B19-Nukleotide 40–68) wurde dann durch ein 1 kb MunI/BglII-cDNA-Konstrukt ersetzt, das in pBluescriptII aus drei Fragmenten verschiedener SAD B19-cDNA-Klone (MunI-SphI (SAD B19-Nukleotide 40–482 aus pZAD1-9); SphI-AatII (4041–4273 aus pSAD13) und AatII-BglII (11472–11759 aus pSAD85)) zusammengesetzt worden war, was zu pSDI-1170 führte. Durch Einführen eines SphI-Fragments, das aus den Klonen pSAD25 und pSAD13 über NcoI (SAD B19-Nukleotide 482–4041) zusammengesetzt war und eines AatII-Fragments, das aus den Klonen pSAD49 und pSAD85 über XhoI (SAD B19-Nukleotide 4273–11472) zusammengesetzt war, in die einzigen SphI- und AatII-Stellen von pSDI-1170, wurde der endgültige grundlegende Volle-Länge-Klon pSAD L16 fertig gestellt. Unter Verwendung des zirkulären Plasmids wurden in vitro-Transkriptionen durchgeführt und die Produkte auf denaturierenden Agarose-Gelen analysiert. Das Vorhandensein von RNA-Transkripten, die mit der 12 kb genomischen RNA von RV ko-migrierten, deuteten darauf hin, dass antigenomische RNA voller Länge von T7-Polymerase transkribiert wird.
Gewinnung von infektiösem rekombinantem RV
Die Ko-Transfektion von Plasmid pSAD L16 und Plasmiden, die für die RV-Proteine N, P und L kodieren, wurde wie in Conzelmann und Schnell, 1994 (oben) beschrieben durchgeführt.
Transfektionsexperimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.
BHK-21, Klon BSR-Zellen wurden über Nacht in Schalen von 3,2 cm Durchmesser in Eagle's Medium, das mit 10% Kälberserum supplementiert war, bis zu einer Konfluenz von 80% wachsen gelassen und bei einer m. o. i. von 5 mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3 infiziert (Fours et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 8122–8126, 1986). Eine Stunde lang inkubierte („pontificating") Zellen wurden zweimal mit Kulturmedium ohne Kälberserum gewaschen und mit einem Plasmidgemisch, das 5 μg pT7T-N, 2,5 μg pT7T-P und 2,5 μg pT7T-L enthält, und mit 2 μg pSAD L16-Plasmid unter Verwendung des Säugetier-Transfektionskits (Stratagene; CaPO₄-Protokoll) unter Beachtung der Vorschriften des Herstellers transfiziert. Das Präzipitat wurde 4 Stunden nach Transfektion entfernt und Zellen wurden in Eagle's Medium, was 10% Kälberserum enthielt, gewaschen und inkubiert. Eine mögliche Einkapselung von pSAD L16-abgeleiteten T7-RNA-Polymerase-Transkripte und die resultierende Expression von RV-Proteinen aus den Nukleokapsiden wurde durch indirekte Fluoreszenz geprüft. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen das RV-G-Protein gerichtet war, das nur von dem rekombinanten RV-Genom exprimiert werden konnte, wurde verwendet, um die Kulturen zu durchmustern. Einen Tag nach der Transfektion waren gefärbte Zellen vorhanden, was die Expression von Genen von dem RV-Genom zeigte. Jedoch wurden nur einzelne positive Zellen in einer Serie von 20 Transfektionsexperimenten beobachtet. Keine fluoreszierende Zellfoci, die das Vorhandensein von infektiösem Virus anzeigen, wurden in diesen Experimenten erhalten. Zusätzlich konnte zwei Tage später kein infektiöses Virus auf Zellkulturen erhalten werden, die mit dem gesamten Überstand von den transfizierten Zellen geimpft worden waren. Um eine mutmaßlich sehr kleine Anzahl von infektiösen Viren zu isolieren, die in transfizierten Zellen erzeugt worden waren, wurde daher das experimentelle Verfahren modifiziert. Zur Isolierung von transfizierenden Viren wurden Zellen und Überstände 2 Tage nach Transfektion geerntet. Zellen wurden in dem Überstand durch Kratzen mit einem Gummirührstab suspendiert. Die Suspension wurde drei Zyklen des Gefrierens und Auftauens (–70°C/37°C, jeweils 5 Minuten) unterzogen. Zelltrümmer und der Überschuss an Vaccinia-Virus, der unter diesen Bedingungen Aggregate bildet, wurde durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 10000 g in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Der gesamte Überstand wurde verwendet, um eine Kulturplatte mit einem konfluenten Monolayer von Zellen zu beimpfen. Nach Inkubation für 2 Stunden wurde der Überstand durch 2 ml frisches Kulturmedium ersetzt. Ein zytopathogener Effekt (cpe), der durch Vaccinia-Virus hervorgerufen wurde, wurde ein bis zwei Tage nach der Infektion beobachtet. Im Durchschnitt wurden lediglich zehn Plaques nach Zentrifugation bei 10000 g beobachtet. Eine RV-Infektion von Zellen, die nicht zu einem nachweisbaren cpe führt, wurde zwei Tage nach der Infektion durch eine direkte Immun-Fluoreszenz-Färbung des gesamten Monolayers mit einem Anti-N-Konjugat (Centocore) gezeigt. In zwei von 20 Experimenten wurden fluoreszierende Foci beobachtet und die jeweiligen Überstände enthielten infektiöses RV (SAD L16), das vermutlich transfektantes Virus darstellte, das aus cDNA-Transkripten erzeugt worden war.
Die Hälfte der Überstände aus den Kulturen, in denen Foci beobachtet wurden, wurde für die zweite Passage nach Zentrifugation bei 10000 g verwendet. Für weiteres Passagieren (jeweils 2 Tage) wurden abnehmende Aliquote von Überständen gemäß des RV-Infektionsgrades verwendet. Um das Vaccinia-Virus vollständig zu beseitigen, wurden Überstände von Kulturen, in denen nahezu alle Zellen infiziert waren (dritte Passage), zweimal für 10 Minuten bei 14000 g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der endgültige Überstand wurde dann unter Verwendung einer sterilen MILLEX-VV-Filtereinheit mit 0,1 μm (Millipore Products, Bedford, MA 01730) filtriert und dann verwendet, um Stammlösungen von rekombinanten RVs mit hohem Titer herzustellen.
Das letztere Transfektions- und Isolierungsprotokoll wurde in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
Beispiel 2
Einfügen eines Oligonukleotides in die RV-Pseudogen-Region
Manipulationen an der ψ wurden in dem Sub-Klon pPsiX8 durchgeführt, der ein 2,8 kb XhoI-ScaI-Fragment von pSAD L16 enthält, das die SAD B19-Nukleotide 3823 bis 6668 entspricht. Die StuI-Fragmente der modifizierten pPsiX8-Plasmide wurden daraufhin isoliert und verwendet, um das entsprechende Fragment (SAD B19-Position 4014 bis 6364) des Klons pSAD L16 voller Länge (1) zu ersetzen. Das Einfügen von 4 Nukleotiden in die ψ und das Erzeugen einer neuen NheI-Stelle wurde erreicht durch einen Verdau von pPsiX8 mit HindIII, auffüllen der Überhänge mit Klenow-Enzym und Religation. Der endgültige Klon pSAD U2 voller Länge unterscheidet sich von SAD L16 durch die Verdoppelung von Nukleotiden 5338 bis 5341.
Die Erzeugung von infektiösen Viren wurde nach Übertragung von Extrakten von transfizierten Zellen zusammen mit dem Überstand auf frische Zellen gezeigt. In jeder der Reihen wurde Fokusbildung in einem Experiment beobachtet. Die transfizierenden Viren (Klone SAD U2-13 und SAD U2-32) wurden durch Übertragung der Überstände auf frische Zellen für zwei weitere Male passagiert, was zu einer nahezu 100%igen Infektion der Zellen führt. Um die Insertion in das SAD U2-Virus-Genom zu zeigen, wurde Gesamt-RNA aus Zellen, die mit SAD U2-13 infiziert worden waren, isoliert und eine reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) der ψ wurde durchgeführt. Mit den Primern G3P und L4M (1), die spezifisch für die G- bzw. L-Gene sind, wurden DNA-Fragmente von ungefähr 730 bp aus den Genomen der transfizierenden Viren SAD U2 und SAD L16 und aus dem Standard-RV SAD B19 erhalten. Jedoch wurde ein nachfolgender Verdau mit HindIII nur für die PCR-DNA beobachtet, die aus SAD B19 und SAD L16 erhalten wurde, nicht aber für diejenige aus SAD U2. Umgekehrt wurde nur SAD U2- abgeleitete DNA mit NheI verdaut, was zwei Fragmente von etwa 530 bzw. 200 bp zur Folge hatte (3). Die direkte RT-Sequenzierung der genomischen RNA aus dem transfizierenden Virus SAD U2 bestätigte weiterhin das Vorhandensein der erwarteten Insertion von 4 Resten an der vorhergesagten Stelle, während der Rest der bestimmten Sequenz derjenigen des ursprünglichen SAD B19-Genoms entsprach. Somit war es eindeutig, dass das SAD U2-Virus ein transfizierendes Virus darstellte, dessen Genom aus manipulierter cDNA stammte.
Das Einführen von vier zusätzlichen Nukleotiden in der Nähe des Endes der RV-ψ beeinflusste weder die Lebensfähigkeit des transfizierenden Virus' SAD U2 noch störte es die korrekte Transkriptionstermination der G-mRNA.
Beispiel 3
Änderung der RV-Transkription durch eine Insertion oder Deletion zwischen der G- und L-kodierenden Region
Durch einen Doppelverdau mit StyI und HindIII, Auffüllen mit Klenow und Religation, wurden 396-Basen (SAD B19-Nukleotide 4942 bis 5337) entfernt, das endgültige Konstrukt war pSAD W9. Für die Konstruktion von pSAD V*, wurde ein BgIII-AsuII-Fragment mit 180 bp, das die Grenzregion des SAD B19-n/P-Cistrons enthielt, aus pSAD13 isoliert (Conzelmann et al., 1990, oben). Das Fragment enthielt 97 Nukleotide der N-kodierenden Region, die gesamte 3'-nicht-kodierende Region und die Grenze des N/P-Citrons, die aus dem N-transkriptionellen Stop/Polyadenylierungssignal bestand, die intergenische Region und die ersten 16 Nukleotide des P-Cistrons, einschließlich des transkriptionellen Startsignals. Das cDNA-Fragment wurde zunächst in die EcoRI-Stelle von pBluescript subkloniert nach dem Auffüllen der 3'-eingerückten Enden mit Klenow-Enzym (pNigP-180). Nach dem Herausschneiden mit HindIII/XbaI aus pNigP und die Erzeugung von stumpfen Enden, wurde das erhaltene 230 bp-Fragment, das das RV-Insert enthielt, das von 16 bzw. 34 bp von Vektor abgeleiteten Sequenzen flankiert wurde, in die aufgefüllte StyI von pPsiX8 kloniert. Das endgültige Konstrukt (pSAD V*) voller Länge wies somit eine 234 bp-Insertion im Vergleich zu pSAD L16 auf.
Wie vorher wurden pSAD V* und pSAD W9 verwendet, um jeweils 20 Kulturplatten zu transfizieren. In drei Kulturen, die mit SAD V* transfiziert wurden, und in einer, die mit SAD W9 transfiziert wurde, wurde eine Ausbeute durch die nachfolgende Isolierung von lebensfähigem Virus angezeigt. Nach fünf aufeinanderfolgenden Passagen wurde RNA aus infizierten Zellen und Überstand isoliert und mittels RT-PCR analysiert unter Verwendung der gleichen Primer wie in den vorherigen Experimenten. Im Vergleich zum Standard SAD B19-Virus resultierte ein vergrößertes DNA-Fragment von ungefähr 0,9 kb aus RNA von Zellen, die mit SAD V* infiziert worden waren, was somit zeigte, dass die zusätzlichen Sequenzen in der ψ-Region dieses transfizierenden Virus' vorhanden waren (4). Im Gegensatz dazu wurde ein DNA-Fragment von nur 0,3 kb aus RNA von Zellen, die mit SAD W9 infiziert worden waren, erhalten; diese Größe wurde erwartet gemäß der Deletion, die in der cDNA-Kopie des Genoms durchgeführt worden war. Die Sequenzierung von PCR-Produkten bestätigte weiterhin, dass die ursprünglich manipulierten cDNA-Sequenzen in die Genome der transfizierenden Viren SAD V* und SAD W9 gerettet wurden. Dementsprechend beeinträchtigte weder das Vorhandensein zusätzlicher Sequenzen, einschließlich 50 Vektor-abgeleiteten Nukleotiden zwischen dem offenen Leseraster von G und der ψ, noch die Deletion der gesamten ψ die Infektiösität und Ausbreitung der transfizierenden Tollwutviren. Die Änderungen, die in den Genomen von SAD V* und SAD W9 konstruiert worden waren, wurden derart entworfen, um zu phenotypischen Veränderungen in dem Transkriptionsmuster zu führen, und es wurde untersucht, ob dies die Wachstumseigenschaften der jeweiligen transfizierenden Viren beeinflusste. Jedoch war die Ausbreitung in der Zellkultur sowie die endgültigen Titer von infektiösen SAD V*- und SAD W9-Viren ähnlich denen des Standard SAD B19-RV. Drei Tage nach Infektion von Zellen mit einem m. o. i. von 0,01, wurden Titer von 10⁸ Fokus-bildenden Einheiten (ffu) in den Überständen für SAD B19, SAD V* und SAD W9 erreicht, was zeigte, dass die RV-ψ nicht essentiell für die Ausbreitung in der Zellkultur ist.
Unter Verwendung einer ψ-spezifischen Sonde wurde keine Hybridisierung mit RNA aus Zellen, die mit dem ψ-deletierten SAD W9-Virus infiziert worden waren, nachgewiesen. Während die genomischen RNAs der anderen Viren und G-mRNAs von SAD B19 und SAD L16 durch diese Sonde erkannt wurden, reagierte die SAD V* G-mRNA nicht. Im Gegensatz dazu trat eine schwache RNA-Bande auf, die in der Größe der neuen zusätzlichen ψ-mRNA entsprach, die durch das Vorhandensein des transkriptionellen Startsignals des zusätzlichen P-Gens, das den SAD V*-ψ-Sequenzen vorausgeht, vorausgesagt war. im Gegensatz zu natürlich vorkommendem RV repräsentiert das transfzierende Virus SAD V* ein RV, dessen Genom aus sechs funktionellen Cistronen zusammengesetzt ist.
Beispiel 4
Expression eines fremden, für ein Protein kodierendes Gen aus rekombinantem RV
Das 230 bp cDNA-Fragment, das die in Beispiel 3 beschriebene N/P-Citron-Grenze enthält, die von mehreren Restriktionsstellen flankiert wird, wurde in die BstXI-Stelle der Pseudogen-Region der cDNA pSAD L16 voller Länge (SAD B19-Position 4995) nach Erzeugung von stumpfen Enden mit Klenow-Enzym eingeführt. Die resultierende cDNA pSAD V wurde als eine Basis für die Einführung des bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gens verwendet. Um pSAD XCAT zu erhalten, wurde ein 0,8 kb DNA-Fragment von pCM7 (Pharmacia), das die gesamte CAT-kodierende Region enthält, in die AsuII-Stelle von pSAD V kloniert, die in der N/P-Cistron-Grenze stromaufwärts der Pseudogen-Sequenz enthalten war. Für die Konstruktion von pSAD VCAT wurde die cDNA zwischen der AsuII-Stelle und der HindIII-Stelle, die nahe dem Ende der Pseudogen-Sequenz (SAD B19-Position 5337) lokalisiert war, deletiert und durch die für CAT-kodierende HindIII-DNA aus pCM7 nach der Erzeugung von stumpfen Enden mit Klenow-Enzym ersetzt. Dementsprechend sollte die Transkription des rekombinanten RV SAD XCAT zu einer CAT-mRNA führen, die die Pseudo-Sequenzen als eine nicht translatierte 3'-Region enthält, wobei SAD VCAT eine CAT-mRNA transkribieren sollte, der die Pseudogen-Sequenz fehlt.
Rekombinante Tollwutviren wurden nach Transfektion von Plasmiden, die für die N-, P- und L-Proteine von RV kodieren, und pSAD-XCAT bzw. pSAD-VCAT, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Nach dem Entfernen von Vaccinia-Virus wurde das Transkriptionsmuster der rekombinanten RVs mittels Northern-Hybridisierung analysiert. Beide Vi ren transkribierten CAT-mRNAs der erwarteten Größe und Zusammensetzung (5). Die Expression der CAT-Enzym-Aktivität wurde in Zellen durch Standard CAT-Assays (Conzelmann und Schnell, 1994, oben) bestimmt, die jeweils mit den zwei Viren infiziert worden waren. Für beide wurde gefunden, dass sie CAT wirksam exprimieren. Nachfolgende Passagen in Zellkulturzellen zeigten, dass die eingeführten fremden Sequenzen genetisch stabil sind. Selbst nach 40 Passagen exprimierten beide Viren CAT wirksam (6). Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um die Expression und das Verhalten der rekombinanten Viren in infizierten Tieren zu untersuchen. Sechs Wochen alte Mäuse (jeweils fünf) wurden intrazerebral mit 10⁴ ffu von SAD VCAT, SAD CXCAT bzw. RV-Standard-Sequenz SAD L16 geimpft. Sieben Tage nach Infektion zeigten alle Tiere typische Tollwut-Symptome und starben an Tollwut innerhalb der folgenden Woche. CAT-Aktivität wurde in Gehirnen von Mäusen gezeigt, die mit SAD VCAT bzw. SAD CXCAT infiziert worden waren. Beide Viren konnten aus Mäusegehirnen wieder isoliert werden und in CAT-Zellkultur exprimiert werden. Somit kann ein fremdes Gen in das Genom von infektiösem RV eingeführt und stabil exprimiert werden und kann außerdem als ein Marker dienen, um rekombinante Viren zu unterscheiden.
Beispiel 5
Expression eines heterologen viralen Antigens aus rekombinantem RV und Induktion einer Immunantwort gegen RV und dem heterologen Virus
Das Genom des klassischen Schweinepestvirus (CSFV) kodiert für drei strukturelle Glykoproteine (E0, E1 und E2). In CSFV-infizierten Tieren sind neutralisierende Antikörper gegen E2 gerichtet, wobei E0 eine zelluläre Immunantwort induziert. cDNA, die die kodierende Region des E2-Proteins bzw. des E0-Proteins von CSFV-Stamm Alfort umfassen, wurden verwendet, um die Pseudogen-Region zwischen den AsuII- und HindIII-Stellen von pSAD V, wie in Beispiel 4 beschrieben, zu ersetzen. Rekombinante Viren (SAD-VE0 bzw. SAD-VE2) wurden, wie in Beispiel 1 ausgeführt, aus Transfektionsexperimenten gewonnen. In infizierten Zellen exprimierten die Viren das CSFV E0-Protein bzw. CSFV E2-Protein (7).
Die rekombinanten Viren SAD VE0 und SAD VE2 wurden verwendet, um Schweine über den oralen Weg zu immunisieren. Standardköder für Füchse, die üblicherweise verwendet werden für die orale Immunisierung von Füchsen mit dem abgeschwächten SAD B19 RV- Stamm, wurden mit 107 pfu von SAD VE0, SAD VE2 bzw. SAD B19 beladen. Jeweils zwei Schweine wurden mit zwei Ködern einer jeden Zubereitung gefüttert (Schwein #1 und #2: SAD VE0, #3 und #4, SAD B19, #5 und #6, SAD VE2). Vier Wochen nach der Immunisierung wurde das Vorkommen von neutralisierenden Antikörpern gegen RV und CSFV analysiert. Mit Ausnahme von #5 wiesen alle Schweine RV-neutralisierende Antikörper auf (Titer > 250), was die Aufnahme der Vakzin-Köder bestätigt. Schwein 5 wurde deshalb nicht weiter betrachtet. Schwein #6 entwickelte CSFV-neutralisierende Antikörper bei einem Titer von > 16. Wie erwartet, entwickelten Schwein #1 bis 4 keine CSFV-neutralisierenden Antikörper. Eine intranasale Verabreichung mit 10⁷ pfu von CSFV-Stamm Alfort wurde 5 Wochen nach Immunisierung durchgeführt. Leukozyten-Zahlen von Schweinen und Körpertemperatur wurden nach der Gabe überwacht und sind in 8 bzw. 9 gezeigt. Alle Schweine entwickelten Fieber, jedoch erholten sich Schweine #1 und #2 sowie #6 schneller. Das Kontrolltier #5 starb 15 Tage nach der Gabe mit typischen CSFV-Symptomen, die Kontrolle #3 wurde am Tag 21 getötet. Das Vorhandensein von CSFV-neutralisierenden Antikörpern in dem Schwein, das mit SAD VE2 gefüttert wurde und der partielle Schutz der Schweine, die entweder SAD VE0 oder SAD VE2 erhielten, zeigt, dass sowohl orale als auch zelluläre Immunantworten gegen zwei heterologe Viren durch rekombinante RV-lebend-Vakzine nach Verabreichung über den oralen Weg induziert werden können.
Beispiel 6
Erzeugung eines abgeschwächten RV durch Einführen einer Mutation in G-Gen-Sequenzen
Um ein Virus zu erzeugen, das sich weniger effizient als das Standardvirus SAD B19 ausbreitet, wurde eine Rekombinante hergestellt, die ein mutiertes G-Protein enthält.
Für diesen Zweck wurde die Sequenz, die für die letzten 46 Aminosäuren des G-Proteins kodieren, deletiert. Zuerst wurde das Plasmid, das für das G-Protein kodiert, pT7T-G (Conzelmann und Schnell, 1994, oben) verdaut mit AflIII (Position 4752 der SAD B19-Sequenz) und EcoRV (die letztere Stelle ist in der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids vorhanden) und stumpfe Enden wurden mittels Klenow-Enzym erzeugt. Die Ligation der resultierenden AflIII- und EcoRV-Enden führte zur Erzeugung eines Translationsterminationskodons an der vorherigen AflIII-Sequenz. Ein 0,3 kb PpuMI-SmaI-DNA- Fragment, das die modifizierte Region enthält, wurde verwendet, um das authentische PpuMI-BstXI-Fragment 4469–4995 von pSAD L16 zu ersetzen. Diese Manipulation führte zur Deletion der SAD B19-Nukleotide 4753–4995, die für die carboxyterminalen 46-Aminosäuren des zytoplasmatischen Schwanzes des G-Proteins und einen Teil der Pseudogen-Sequenz kodiert. Ein weiteres Ergebnis ist die Einführung von 18 Vektorabgeleiteten Nukleotiden unmittelbar stromabwärts des neuen G-Translationsterminationskodons.
Rekombinantes RV (SAD DCD) wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, wiedergewonnen. Wie erwartet, wurde ein verkürztes G-Protein in Zellen, die mit SAD DCD infiziert worden waren, exprimiert (10). Im Vergleich zum Standard-Sequenz-Virus SAD L16, wurden 100fach geringere Titer mit SAD DCD-Virus nach Infektion von Zellen bei einer m. o. i. von 1 erhalten. Darüber hinaus wurde eine verminderte Ausbreitungsrate in Zellkulturen beobachtet (11), was darauf hindeutete, dass die Verkürzung des G-Proteins zu einer Abnahme beim Zusammenbau von Virionen oder zu einer Abnahme der Zellinfektiosität von Virionen führte. Um das Verhalten von SAD DCD in infizierten Tieren zu analysieren, wurden fünf Mäuse intrazerebral mit 10⁵ ffu von SAD DCD und 5 Mäuse mit der selben Dosis von SD L16 geimpft.
Beispiel 7
Erzeugung einer Tollwutvirus-G-minus (G^–)-Mutante durch Komplementierung in trans
Um die vollständige kodierende Region des G-Proteins aus dem RV-Genom zu deletieren, wurde der Klon pSAD UE voller Länge (Beispiel 2) verwendet. Dieser Klon unterscheidet sich von pSAD L16 durch die Anwesenheit einer einzigen NheI-Stelle innerhalb der nicht-translatierten 3'-Region des G-Gens (SAD B19-Position 5339). Durch partiellen Verdau von pSAD U2 mit PflMI (SAD-Position 3176) und vollständigen Verdau mit NheI, nachfolgendes Auffüllen durch Klenow-Enzym und Religation, wurde ein cDNA-Fragment, umfassend SAD B19-Nukleotide 3177–5339, entfernt. Der resultierende Klon pSAD dG wurde in Transfektionsexperimenten verwendet, um rekombinantes Virus wiederzugewinnen. Zusätzlich zu Plasmiden, die für N-, P- und L-Proteine kodieren, wurde jedoch ein Plasmid, das für das G-Protein kodiert, mit pSAD dG ko-transfiziert, um die G-Defizienz des viralen Genoms zu komplementieren. Das resultierende Virus SAD dG wurde auf Zel len übertragen, die nochmals mit dem G-kodierenden Plasmid transfiziert und mit den vTF-7-3 des Vaccinia-Virus infiziert worden waren, um das G-Protein bereitzustellen.
RNA-Transkripte von SAD dG wurden durch Northern-Blotting-Experimente analysiert. Nach Hybridisierung mit einer N-spezifischen Sonde wurde ermittelt, dass das SAD dG-Genom wesentlich kleiner als das Tollwutvirus wt-Genom ist, was die cDNA-Deletion von 2,1 kb widerspiegelt. Eine Sonde, die die gesamte G-kodierende Region umspannt, konnte jedoch nicht mit SAD dG RNAs hybridisieren, was das Fehlen von G-kodierenden Sequenzen zeigt (12). Die Identität der Deletion wurde weiterhin durch RT-PCR und Sequenzieren bestätigt.
Phenotypisch komplementierte SAD dG war in der Lage, nicht komplementierende BSR-Zellen zu infizieren, sein Genom zu replizieren und die Gene zu exprimieren, die von dem Genom kodiert sind. Jedoch war sie nicht in der Lage, infektiöse Virionen herzustellen und somit konnte sich die Infektion nicht auf andere Zellen ausbreiten (13) oder durch Passage von Kulturüberständen auf andere Zellkulturen übertragen werden.
Beispiel 8
Komplementierung von G-Mutanten durch heterologe Glykoproteine
Richten des Virus auf spezifische Zellen
Um zu zeigen, dass heterologe Oberflächen-Proteine funktionell in die Hülle eines rekombinanten Virus eingebaut werden können, wurde die G-Mutante SAD dG durch rekombinante virale Glykoproteine, wie in Beispiel 7 für das Tollwutvirus G beschrieben, komplementiert. Infektiöse pseudotypische Partikel wurden erzeugt, die die Spike-Proteine aus Mokola-Virus, ein weiteres Mitglied der Lyssavirus-Gattung, dem Rhabdovirus Stomatitisvesikulären Virus (VSV; Serotyp New Jersey, Gattung Vesiculovirus) und dem Retrovirus humanes Immundefizienz-Virus (HIV-1, Stamm NL-43) enthielten.
Die Expression des authentischen Mokola- und VSV-G-Proteins von transfizierten Plasmiden und die Infektion von Zellen mit SAD dG führte zur Bildung von infektiösen Pseudotyp-Viren. Im Vergleich zum Tollwutvirus G und dem nahe verwandten Mokola-Virus G wurde jedoch ein verminderter Titer mit VSV-G beobachtet (10⁴/ml im Gegensatz zu 10⁶/ml). Jedoch wurde nach dem Ersetzen der Sequenzen der zytoplasmatischen und transmembranen Domäne von SVSG durch die entsprechenden Domänen des Tollwutvirus-G-Proteins 10⁶ infektiöse Partikel erzeugt, was darauf hindeutet, dass die zytoplasmatische Domäne der G von RV das Protein in die virale Hülle lenkt.
Die Herstellung von pseudotypischen Partikeln, die authentische HIV gp160 (gp120/40)-Spikes enthalten, wurde nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu führte die Expression eines chimären Proteins, das aus der Ecto- und Transmembran-Domäne des HIV gp, das an die zytoplasmatische Domäne von RV G fusioniert war, zur Bildung von RV (HIV)-Pseudotypen. Dies bestätigte, dass die zytoplasmatische Domäne des G-Proteins verantwortlich ist für den wirksamen Einbau von Spike-Proteinen in die Hülle von Rhabdoviren. Die Pseudotyp-Partikel von RV(HIV) infizierten erfolgreich Vero-Zellen, die das humane CD4 Oberflächenprotein exprimieren (T4⁺-Zellen), aber nicht die Kontrollzellen, die CD8 exprimieren (T8⁺-Zellen) (Zellen wurden von dem AIDS Research and Reference Reagent Programme erhalten). Die Pseudotyp-Viren weisen somit den Wirtsbereich und die Zellspezifität von HIV auf.
BESCHRIFTUNG DER ZEICHNUNGEN
1:
Organisation der RV-Pseudogen-Region (ψ) und Konstruktion von rekombinanten RV-Genomen (maßstabsgerecht gezeichnet). Die Zahlen bezeichnen die Nukleotid-Positionen in der Anti-Genom-Sequenz von SAD B19. Oben ist das gesamte RV-Genom mit seinen fünf offenen Leserastern gezeigt. Mutationen wurden in pPsiX8 durchgeführt, das einen Teil des Genoms enthielt (3823–6668), und in den Klon pSAD L16 voller Länge durch Austausch des StuI-Fragments (4041–6364) wieder eingeführt. In der detaillierten Zeichnung sind kodierenden Bereiche durch graue Kästen, nicht-kodierende Sequenzen als Linien dargestellt. Funktionelle transkriptionelle Signalsequenzen sind durch gefüllte Balken (Stop/Polyadenylierung) und Pfeilspitzen (mRNA-Transkriptionsstart) angezeigt. Die nicht-funktionelle signalähnliche Sequenz, die den Start der ψ-Region definiert, ist durch den offenen Balken gezeigt. Pfeile zeigen die Position von Oligonukleotid-Primern G3P und L4M an, die für die RT-PCR-Analyse der ψ-Region verwendet wurden. In SAD U2 führte das Auffüllen von HindIII-Extensionen zur Insertion von 4 Nukleotiden und der Erzeugung einer einzigen NheI-Stelle. In SAD V* wurde ein cDNA-Fragment, das die N/P-Cistron-Grenze von RV enthielt (SAD B19-Nukleotide 1323–1502), in die Styl-Stelle eingeführt; SAD W9 weist eine Deletion des StyI/HindIII-Fragments auf.
2:
Vereinfachtes Schema für die Konstruktion von Transkriptionsplasmiden, die cDNA voller Länge von RV enthalten. Die Zahlen beziehen sich auf Nukleotid-Positionen der antigenomischen Sequenz des SAD B19 RV (Conzelmann et al., 1990). Das Plasmid pSDI-1plus, das als Basis für die Rekonstruktion von RV-genomischer DNA voller Länge diente, ist das Gegenstück von pSDI-1 (Conzelmann und Schnell, 1994), das das Mini-Genom von SDI-1 RV enthält, welches die terminalen Nukleotide 1–68 und 11760–11928 in umgekehrter Richtung bezüglich des T7 RNA-Polymerasen-Promoters (T7) und der antigenomischen Ribozym-Sequenz des Hepatitis-Delta-Virus' (HDV) umfasst. Das MunI-BglII-Fragment von pSDI-1plus wurde mit einem 1 kb-cDNA-Konstrukt ersetzt, das aus drei SAD B19-cDNA-Klonen wie angedeutet zusammengesetzt worden war. Die Insertion eines 3,6 kb SphI- und eines 7,2 kb AatII-Fragments, die aus zwei cDNA-Klonen zusammengesetzt waren, führten zum endgültigen Plasmid pSAD L16, das die SAD B19-cDNA in voller Länge enthält. Die Transkription dieses Plasmids durch T7 RNA-Polymerase sollte Positiv-Strang-(antigenomische)-RNA ergeben, die drei zusätzliche nicht-virale G-Reste am 5'-Ende und ein genaues 3'-Ende nach Autolyse des Ribozyms aufweist. (T7) T7-Promoter; (T7T) T7-Transkriptionsterminator; (HDV) HDV-antigenomische Ribozym-Sequenz von HDV.
3:
Darstellung des genetischen Tags in dem Genom des transfizierenden Virus' SAD U2.
Gesamt-RNA aus Zellen, die mit Standard-RV SAD B19 (B19) und den transfizierenden Viren SAD L16 (L16) und SAD U2 (U2) infiziert worden waren, wurde 2 Tage nach Infektion isoliert und für die RT-PCR-Amplifikation der entsprechenden ψ-Regionen mit Primern G3P und L4M verwendet. Die amplifizierte DNA wurde in einem 1%igen Agarosegel direkt und nach Verdau mit HindIII bzw. NheI getrennt. Eine NheI-Restriktionsstelle ist nur in der DNA vorhanden, die aus SAD U2 abgeleitet ist. M, DNA-Größen-Marker.
4:
PCR-Analyse von SAD B19 (B19)-, SAD V* (V*)- und SAD W9 (W9)-Genomen. RT-PCR wurde wie in 3 beschrieben mit den Primern G3P und L4M durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden in einem 1%igen Agarosegel getrennt.
5:
Darstellung von CAT-mRNAs, die von rekombinantem RVS transkribiert werden.
Ein Northern-Blot von Gesamt-RNA aus Zellen, die mit SAD L16 (L16), SAD XCAT (X6) und SAD VCAT (VC18) infiziert worden waren, wurde mit Sonden hybridisiert, die jeweils spezifisch für das G-Gen (G), Pseudogen (Y) bzw. CAT-Gen waren. Auf der linken Seite sind die viralen Genome (v) und bestimmte mRNAs gezeigt. Während SAD XCAT eine mRNA transkribiert, die sowohl CAT- als auch Pseudogen-Sequenzen ("CATY") enthält, fehlen SAD VCAT Pseudogen-Sequenzen und es transkribiert eine mRNA ("CAT"), die nur CAT-Sequenzen besitzt. Die Größe der RNA-Marker sind in kb angegeben.
6:
CAT-Aktivität von SAD XCAT und SAD VCAT nach mehreren Passagen in Zellkultur. Zellen wurden mit Viren aus den einzelnen Passagen infiziert (Nummer der Passage wie angegeben) und gleiche Mengen an Zellextrakten wurden für CAT-Aktivität zwei Tage nach der Infektion analysiert. In Spur "–" wurden Extrakte von Zellen, die mit SAD L16 infiziert worden waren, analysiert.
7:
Expression von E0- und E2-Protein durch rekombinante RVs.
Zellen wurden mit SAD VE0 (Isolate 1, 2, 3) bzw. SAD VE2 (Isolate a, b, c) infiziert. Zwei Tage nach der Infektion wurden Zellextrakte in PAA-Gelen unter reduzierenden Bedingungen getrennt und auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Nach Inkubation mit monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen CSFV E0- bzw. E2-Protein und anschließend mit an alkalischer Phosphatase gekoppelten sekundären Antikörper, wurden die Proteine durch Hinzugabe von Substrat und Belichtung eines Röntgenfilms sichtbar gemacht. Als Kontrolle wurde Baculovirus-exprimiertes und gereinigtes E0- und E2-Protein verwendet (B). Zusätzlich dienten Extrakte aus Zellen, die mit CSFV (V) infiziert waren, als Vergleich.
8:
Leukozyten von Schweinen, immunisiert mit SAD VE0 (#1 und 2), SAD VE2 (#6) und Standard-Tollwutvirus SAD B19 (#3 und #4), und nach CSVF-Gabe. Die Leukozyten-Anzahl ist in Prozent der absoluten Zahlen angegeben, die vor dem Tag der Gabe vorhanden waren (Tag 0). *(#1, Tag 10 nach der Gabe): nicht durchgeführt, geschätzter Wert.
9:
Körpertemperatur von Schweinen nach CSFV-Gabe (Tag 0).

a) Tiere, die mit SAD VE0 (#1 und #2) immunisiert worden waren, entwickelten schwaches Fieber bis Tag 11 (#1) oder kein Fieber (#2). Beide Kontrolltiere, die mit SAD B19 (#3 und #4) immunisiert worden waren, zeigten hohes Fieber über einen langen Zeitraum. #4 starb am Tag 15 nach der Gabe an klassischer Schweinepest aufgrund der schweren Symptome, #4 wurde 21 Tage nach der Gabe getötet.
b) Das Tier, das mit SAD VE2 immunisiert worden war, entwickelte schwaches Fieber nur an den Tagen 6 bis 8. Kontrollen sind die gleichen wie a).

10:
Expression eines verkürzten G-Proteins in mit SAD DCD-infizierten Zellen.
BSR-Zellen wurden bei einer m. o. i. von 1 mit SAD DCD oder SAD L16 infiziert und 16 Stunden nach der Infektion mit 50 μCi von [³⁵S]-Methionin für 3 Stunden markiert. Zellextrakte wurden mit einem Antitollwut-G Mab inkubiert und Aliquote von immunpräzipitierten Proben wurden entweder mit PNGase F(+PF) verdaut, um die Protein-Grundgerüste zu zeigen oder scheinbehandelt (–), um die glykosylierten Proteine zu zeigen. +TM: infizierte Zellen wurden in Gegenwart von 2 μg/ml Tunicamycin für 90 Minuten vor Markierung und während der 3-stündigen Markierungsperiode inkubiert. Proteine wurden auf 10% SDS-PAGE getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Zellextrakte wurden wie oben analysiert. L16, SAD L16-Virus; ΔCD, SAD DCD-mutantes Virus. M: Protein-Größen-Marker.
11:
Ausbreitung von SAD L16 und SAD DCD in Zellkultur.
Kulturzellen wurden bei einer m. o. i. von 0,05 mit SAD L16 (L16) bzw. SAD DCD (DCD) infiziert und bei den angegebenen Zeiten nach Infektion mittels direkter Immunfluoreszenz mit einem Konjugat (Centocor^®), das gegen Tollwutvirus-N-Protein gerichtet war, analysiert. Eine langsamere Ausbreitung der Infektion von benachbarten Zellen ist in Zellen, die mit SAD DCD infiziert wurden, beobachtet worden.
12:
Analyse von SAD dG-(Beispiel 7) und SAD dCD-(Beispiel 6)-spezifischen RNAs.
Gesamt-RNA von BSR-Zellen, die mit SAD L16 (Beispiel 1), SAD dCD (ΔCD) und phenotypisch komplementiertes SAD dG-Virus (ΔG) bei m. o. i. s. von 1 infiziert worden waren, wurde zwei Tage nach Infektion isoliert und mittels Northern-Hybridisierung analysiert. Wie mittels Hybridisierung mit einer N-Gen-spezifischen Probe (A) gezeigt, ist das Genom von SAD dG beträchtlich kleiner als das Standard-Tollwutvirus-Genom (v), was die 2.1 kb-Deletion des G-Gens widerspiegelt. Eine Sonde, die die gesamte G-Protein-kodierende Sequenz umspannt, kann nicht mit SAD dG-RNAs hybridisieren. Die kleine Deletion der zytoplasmatischen Domain-kodierenden Region in dem SAD dCD-Genom wird durch das Auftreten einer G-mRNA (G), die kürzer als die Standard-Tollwutvirus-G-mRNA ist, veranschaulicht.
v: genomische RNA; N, G: monocistronische mRNAs; N + P, M + G, G + L: bicistronische mRNAs.
13:
Fehlen der Ausbreitung des G^–-mutanten SAD dG.
BSR-Zellen wurden mit phenotypisch komplementiertem SAD dG infiziert und 36 Stunden nach Transfektion mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert. In (A) ist die N-Protein-Expression durch die Inkubation von Zellen mit einem FITC-gekoppelten Antikörper, gerichtet gegen das N-Protein (Centocore), gezeigt. Nur einzelne Zellen werden infiziert, keine Ausbreitung von Virus auf benachbarte Zellen wird beobachtet. (B): Kontrolle mit einem G-spezifischen Antikörper.
14:
Zusammensetzung des funktionellen chimären HIV/RV-Glykoproteins, das für die Erzeugung von RV(HIV)-Pseudotyp-Virionen verwendet wurde. Die gesamte zytoplasmatische Domäne von HIV-NL43 gp160, mit Ausnahme von drei Aminosäuren unmittelbar stromabwärts der Transmembran-Domäne, wurde durch die vollständige RV-G-zytoplasmatische Domäne ersetzt. "p" stellt einen Prolinrest dar, der in den Stamm-Proteinen nicht vorhanden ist. Zytoplasmatische und Transmembran-Domän-Sequenzen sind durch einen Schrägstrich (/) getrennt.

Claims

Genetisch manipulierte, infektiöse, replizierende, nicht-segmentierte Negativstrang-RNA-Virusmutante, umfassend eine Insertion und/oder Deletion in einem offenen Leseraster, einer Pseudogen-Region oder einer intergenischen Region des Virusgenoms.
Virusmutante gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante eine Insertion und/oder Deletion in einer Pseudogen-Region umfasst.
Virusmutante gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante eine Insertion und/oder Deletion in einem offenen Leseraster umfasst.
Virusmutante gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante eine Insertion und/oder Deletion indem offenen Leseraster umfasst, das für das Matrixprotein oder ein Protein mit derselben Funktion kodiert, was das Fehlen eines funktionellen Matrixproteins bewirkt, wobei die Mutante mit dem Matrixprotein phänotypisch komplementiert ist.
Virusmutante gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante eine Insertion und/oder Deletion in dem offenen Leseraster umfasst, das für das Glykoprotein G kodiert.
Virusmutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine heterologe Nukleinsäuresequenz trägt, die für ein Epitop oder Polypeptid eines pathogenen Virus oder Mikroorganismus kodiert.
Virusmutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante zu der Familie der Paramyxoviridae gehört.
Virusmutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante zu der Familie der Rhabdoviridae gehört.
Virusmutante gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion und/oder Deletion das Fehlen eines funktionellen Glykoproteins G bewirkt, wobei die Mutante mit einem Glykoprotein, das bei der Zellanheftung und Membranfusion beteiligt ist, phänotypisch komplementiert ist.
Virusmutante gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoprotein, das bei der Zellanheftung und der Membranfusion beteiligt ist, das Tollwut-Glykoprotein G ist.
Virusmutante gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusmutante das Tollwutvirus ist.
Vaccin zur Vorbeugung einer Infektion, die durch ein nicht-segmentiertes Negativstrang-RNA-Virus in einem Säugetier verursacht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Vaccin eine Virusmutante gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines infektiösen, replizierenden, nicht-segmentierten Negativstrang-RNA-Virus gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: a) Einführen in eine Wirtszelle 1) eines oder mehrerer DNA-Moleküle, kodierend für die N-, P- und L-Virusproteine oder Analoge davon; und 2) eines DNA-Moleküls, umfassend die cDNA eines nicht-segmentierten Negativstrang-DNA-Virusgenoms, umfassend eine Insertion, und/oder Deletion in einem offenen Leseraster, einer Pseudogen-Region oder einer intergenischen Region, des Virusgenoms, wobei das DNA-Molekül geeignete Transkriptions-Initiator- und Terminatorsequenzen umfasst, die von einer Polymerase, die durch die Wirtszelle co-exprimiert wird, erkennbar sind und wobei die Transkripte des cDNA-Genoms des nicht-segmentierten Negativstrang-RNA-Virus antigenomische Positivstrang-RNAs sind, und wobei die Transkripte präzise 3'-Enden haben; und b) Isolieren der von den Zellen hergestellten Viren.
Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die cDNA des nicht-segmentierten Negativstrang-RNA-Virusgenoms durch die Einführung einer Mutation modifiziert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Polymerase die T7-RNA-Polymerase ist, die vorzugsweise von einem rekombinanten Vacciniavirus exprimiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-segmentierte Negativstrang-RNA Virusgenom von der Familie der Paramyxoviridae erhalten wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-segmentierte Negativstrang-RNA-Virusgenom von der Familie der Rhabdoviridae erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-segmentierte Negativstrang-RNA-Virusgenom von dem Tollwutvirus erhalten wird.