DE60010358T2

DE60010358T2 - Infectiösenbursalkrankheitsvirus (IBDV) die an Zellkultur angepasst sind

Info

Publication number: DE60010358T2
Application number: DE60010358T
Authority: DE
Inventors: Adriaan Antonius Wilhelmus Maria Van Loon; Egbert Mundt
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2020-02-29
Also published as: HUP0000992A3; EP1035203A1; DK1035203T3; JP2011036255A; HU226254B1; ES2220333T3; BR0001011B1; ATE266097T1; PT1035203E; CA2298956A1; ZA200001069B; DE60010358D1; CA2298956C; HU0000992D0; KR20010069175A; EP1035203B1; JP4675447B2; US6492148B1; PL338773A1; PL198981B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer infektiösen IBDV-Mutanten, die in der Lage ist, sich in CEF-Zellkulturen zu replizieren, eine gentechnologisch hergestellte IBDV-Mutante sowie einen Impfstoff, der eine solche IBDV-Mutante umfasst.
Das Virus der infektiösen bursalen Erkrankung (IBDV) ist ein Mitglied der Familie der Birnaviridae. Viren dieser Familie besitzen eine sehr ähnliche Genomorganisation und einen ähnlichen Replikationszyklus. Die Genome dieser Viren bestehen aus zwei Segmenten (A und B) doppelsträngiger (ds) RNA. Das grössere Segment A codiert ein Polyprotein, das durch Autoproteolyse gespalten wird, um die reifen viralen Proteine VP2, VP3 und VP4 zu bilden. VP2 und VP3 sind die vorherrschenden Strukturproteine des Virions. VP2 ist das wichtigste, den Wirt schützende Immunogen der Birnaviren und enthält antigene Regionen, die für die Bildung von neutralisierenden Antikörpern verantwortlich sind. Das VP4-Protein scheint eine Virus-codierte Protease zu sein, die an der Verarbeitung der Vorläuferproteine der VP2-, VP3- und VP4-Proteine beteiligt ist. Das grössere Segment A besitzt auch einen zweiten offenen Leserahmen (ORF), der dem Polyprotein-Gen vorangeht und teilweise mit diesem überlappt. Dieser zweite offene Leserahmen codiert ein Protein VP5 mit unbekannter Funktion, das in mit IBDV infizierten Zellen vorkommt. Das kleinere Segment B codiert VP1, ein 90 kDa grosses multifunktionales Protein mit Polymerase- und Capping-Enzym-Funktionen.
Es gibt zwei Serotypen von IBDV, Serotyp 1 und 2. Die beiden Serotypen können mittels Virusneutralisationstests (VN) voneinander unterschieden werden. Darüber hinaus wurden Subtypen des Serotyps 1 isoliert. Diese so genannten Virus-„Varianten" des Serotyps 1 können mittels Kreuzneutralisationstests, einem Panel von monoklonalen Antikörpern oder RT-PCR identifiziert werden. Diese Subtypen des IBDV-Serotyps 1 wurden auch in der Literatur beschrieben wie zum Beispiel: der klassische, der Variante E-, GLS-, RS593- und der DS326-Stamm (van Loon et al., Proceedings of the International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Infectious Anaemia, Rauischholzhausen, Deutschand, 179–187, 1994).
Die infektiöse bursale Erkrankung (IBD), auch als Gumboro-Krankheit bezeichnet, ist eine akute, hoch kontagiöse Erkrankung von Hühnern, die als primäres Ziel das Lymphgewebe befällt und einen selektiven Tropismus für Zellen der Bursa fabricii aufweist. Die Morbiditätsrate in suszeptiblen Herden ist hoch, einhergehend mit schnellem Gewichtsverlust und moderaten Mortalitätsraten. Hühner, die sich von der Erkrankung erholen, können unter Umständen auf Grund der Zerstörung der Bursa fabricii, die für Abwehrmechanismen von Hühnern wesentlich ist, Immunschwächen aufweisen. Das IBDV-Virus verursacht eine ausgeprägte Immunsuppression in Hühnern, die jünger als 3 Wochen sind und induziert Läsionen der Bursa in Hühnern, die bis zu 3 Monaten alt sind.
Während vieler Jahre konnte der Krankheit in Zuchtherden durch Induktion hoher Antikörper-Niveaus vorgebeugt werden, in dem mit attenuiertem, lebendem Impfstoff geprimten Hühnern ein inaktivierter Impfstoff verabreicht wurde. Dies hat die durch IBDV verursachten wirtschaftlichen Verluste auf ein Minimum gebracht. Mütterliche Antikörper von Hühnern aus durchgeimpften Zuchten, verhindern eine frühe Infektion mit IBDV und verringern die Probleme, die mit einer Immunsuppression einhergehen. Ausserdem wurden lebende attenuierte Impfstoffe erfolgreich in kommerziellen Herden angewendet, nachdem die mütterlichen Antikörper zurückgegangen waren.
Kürzlich haben stark virulente Stämme in Europa Krankheitsausbrüche mit hoher Mortalität verursacht. Die gegenwärtigen Impfstoffprogramme haben keinen ausreichenden Schutz für die Hühner geboten. Impfausfälle wurden hauptsächlich auf das Versagen der Lebendimpfstoffe zurückgeführt, die Vögel vor einem Challenge mit dem virulenten Feld-Virus zu infizieren.
Es besteht daher ein bleibendes Bedürfnis bestehende Impfstoffe zu verbessern und neue Impfstofftypen zu entwickeln. Für die Entwicklung von lebenden IBDV-Impfstoffen sind Viren in attenuierter Form erforderlich. Dies wird herkömmlicherweise durch Serienpassagen von IBDV-Feldisolaten auf einem geeigneten Substrat erreicht. Für die Entwicklung inaktivierter IBDV-Impfstoffe ist ein geeignetes Substrat notwendig, um grosse Mengen an IBDV-Antigenmassen zu bilden, die aus der Vermehrung der IBDV-Viren auf dem Substrat resultieren.
Es ist bekannt, dass IBDV-Feldstämme in vivo in der Bursa infizierter Vögel oder in embryonierten Eiern schnell vermehrt werden können. Obwohl von einer erfolgreichen Adaptierung und Vermehrung einiger IBDV-Stämme in in vitro-Zellkulturen, die von Hühnerembryonen stammten, berichtet wurde, ist jedoch allgemein bekannt, dass die meisten aus infizierten Bursae isolierten IBDV-Feldstsämme, insbesondere die sogenannten virulenten oder sehr virulenten IBDV-Stämme nicht an Zellen adaptiert werden können, die Hühnerembryonen stammen, wie zum Beispiel Hühnerembryofibroblasten (CEF) oder Zellen von anderen Organen wie Niere und Leber (Brown et al., J. Gen. Virology 75, 675–680, 1994; Van Loon et al., 1994, supra).
Die Nachteile der in vivo- Kultursubstrate sind offensichtlich. Solche Kulturmethoden sind nicht tierfreundlich, benötigen viele Tiere und können nicht unter standardisierten und stringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Ausserdem besitzt die begrenzte Zahl von IBDV-Stämmen, die sich einer Adaptierung an in vitro-Zellkultursubstraten nicht entzieht, den Nachteil, dass als Ergebnis des seriellen Passagenverfahren, das zu einer Adaptierung der IBDV-Stämme führt, auf unkontrollierte Weise Zufallsmutationen in das Virusgenom eingeführt werden. Solche Mutationen können andere Eigenschaften als diejenigen, die mit einer Adaptierung des Virus an die Zellkultur zusammenhängen, beeinflussen, z. B. Eigenschaften, die mit der Immunogenität der Viren zu tun haben. Solche zusätzlichen zufälligen Mutationen sind nicht erwünscht.
Die Adaption der IBDV durch Passagieren des Virus in vitro in Zellkulturen wurde mit einer Attenuierung der Virulenz in Zusammenhang gebracht, wie durch die Reduzierung der Fähigkeit des Virus Läsionen in der Bursa der infizierten Vögel zu verursachen, gezeigt werden konnte. Yamaguchi et al., (Virology 223, 219–223, 1996) untersuchten die molekularen Grundlagen der Virulenz der IBD-Viren und die Attenuierung dieser Viren als ein Ergebnis der Adaption von IBDV aus der Bursa an die CEF-Zellkultur. Es wurde daraus geschlossen, dass aus den von Yamaguchi durchgeführten Untersuchungen die exakten Mutationen, die an der Attenuierung des Wildtyp-IBDV beteiligt waren, nicht identifiert werden konnten. Es wurde vorgeschlagen, das die Aminosäurereste in den Positionen 279 (Asp/Asn) und 284 (Ala/Thr) des von dem langen Segment A des offenen Leserahmens codierten Polyproteins für die Virulenz oder die Vermehrung der IBDV in CEF-Zellen verantwortlich sind.
Das letztere wurde durch Lim, B-L (Proceedings of the 4th Asia Pacific Poultry Health Conference, 22.–26. November 1998, Melbourne, Australien, Abst. 79) bestätigt. Darin wurde offenbart, dass der Ersatz der Aminosäurereste 279 (Asp → Asn) und 284 (Ala → Thr) in dem VP2-Protein eines IBDV in einer IBDV-Mutanten resultiert, die in CEF-Zellkulturen vermehrt werden kann. Cao, Y. C. et al. (Avian Diseases 42: 340–351, 1998) vergleicht die Aminosäuresequenzen von VP2 verschiedener IBDV-Isolate, einschliesslich des klassischen IBDV, der Variante E und des GLS.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung ein allgemein anwendbares Verfahren für die Adaption von IBDV-Isolaten zur Verfügung zu stellen, die ausschlieslich in vivo in der Bursa infizierter Vögel wachsen, dann auch in Zellkulturen zu wachsen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die Herstellung attenuierter IBDV-Mutanten durch Einführen von Mutationen in das IBDV-Genom auf kontrollierte Weise zur Verfügung zu stellen.
Darüber hinaus ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine gentechnologisch veränderte IBDV-Mutante zur Verfügung zu stellen, die die geeigneten Aminosäurereste umfasst, die es der Mutante erlauben in einer Zellkultur zu wachsen.
Es wurde festgestellt, dass dieser Gegenstand der Erfindung mittels eines Verfahrens für die Herstellung einer infektiösen IBDV-Mutante, die fähig ist in CEF-Zellkulturen zu replizieren, ermöglicht wurde, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) getrenntes Herstellen eines DNA-Konstrukts, dass cDNA der Genomsegmente A und B eines IBDV umfasst, der nicht in CEF-Kulturen replizieren kann,
(ii) Einführen einer Mutation in:
a ein oder mehrere Codons der Aminosäurereste 253 und 284 des VP2-Gens der Variante E oder des klassischen IBDV-Stamms, oder in
b ein Codon für den Aminosäurerest 284 des VP2-Gens eines GLS-IBDV-Stamms auf der cDNR, die das Segment A umfasst auf solche Weise, dass die Codons für die Aminosäurereste 253 und 284 des mutierten VP2-Gens einen Histidin- beziehungsweise einen Threoninrest im Fall einer Variante E oder des klassischen IBDV-Stamms codieren, oder auf solche Weise, dass das Codon für den Aminosäurerest 284 des mutierten VP2-Gens einen Threoninrest im Fall eines GLS-IBDV-Stamms codiert,
(iii) Initiieren der Replikation der IBDV-Mutante in Wirtszellen in einem Kulturmedium durch Herstellen von RNA-Transkripten von der cDNA, die das Segment A umfasst, und
(iv) Isolieren der IBDV-Mutante aus der Kultur.

Die vorliegende Erfindung identifiziert erstmalig die Aminosäuren, die erforderlich und ausreichend sind, einem IBDV zu ermöglichen in CEF-Zellkulturen zu replizieren. Während die meisten IBDV-Isolate aus der Bursa die Amiosäurereste 253 (Gln), 284 (Ala) und 330 (Ser) auf dem VP2-Protein umfassen, sind die Mutanten der Variante E oder der klassischen IBDV, deren Codons an Position 253 und 284 dahingehend ausgetauscht wurden, dass sie nun die Aminosäurereste 253 (His) und 284 (Thr) codieren, in der Lage in CEF-Zellkulturen zu wachsen.
Für GLS-IBDV-Mutanten wurde festgestellt, dass es ausreichend ist das Codon in Position 284 so zu verändern, dass es nun den Aminosäurerest 284 (Thr) codiert.
Ausserdem wurde festgestellt, dass die Aminosäureposition 330 für die Replikation des klassischen oder der Variante E-IBDV nicht kritisch ist. In der vorliegenden Erfindung werden jedoch in dieser Position Serin-, Arginin- oder Lysinreste in dieser Position am meisten bevorzugt.
Ausserdem wurde festgestellt, dass für GLS-IBDV die Aminosäureposition 253 für die Replikation nicht kritisch ist und das es gewöhnlich ein Glutaminrest ist.
Daher wird in einem bevorzugten Verfahren eine IBDV-Mutante hergestellt, die alle drei dieser Aminosäurereste umfasst, insbesondere 330 (Arg) in dieser Position in dem VP2-Protein. In den GLS-IBDV-Mutanten ist der bevorzugte Aminosäurerest in Position 253 ein Glutamin.
Tabelle 1
Es wurde festgestellt, dass im Genom eines (chimären) Variante E-IBDV, das sich nur in der Bursa infizierter Hühner vermehren (D78/Variante E) kann, zwei Änderungen notwendig sind, um IBDV-Isolate an CEF-Kulturen zu adaptieren. Diese Positionen schliessen die Aminosäurereste 253 und 284 ein. Die Aminosäurereste Histidin beziehungsweise Threonin in diesen Positionen erlauben es der IBDV-Mutante in CEF-Zellkulturen zu replizieren. (Tabelle 1 und Beispiel 1). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die IBDV-Mutanten, die gemäss dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren an CEF-Kulturen adaptiert wurden, auch attenuiert waren (Beispiel 2).
Um weiterhin zu beweisen, dass die Adaption der klassischen IBDV-Stämme von der Bursa an CEF-Zellen ebenfalls durch die beiden Aminosäuren bestimmt wird, wurden die Codons des IBDV- Stamms D78, der fähig ist in CEF-Kulturen zu replizieren, in den Positionen 253, 284 und 330 geändert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2A dargestellt.
Tabelle 2A
Das klassische „sehr virulente" (W) europäische Isolat UK661 (Brown et al., J. Gen. Virology 75, 675–680, 1994; Brown und Skinner, Virus Res. 40, 1–15, 1996) kann in vitro nicht vermehrt werden, und muss deshalb in Hühnern in vivo vermehrt werden. Die Hühner müssen mit dem VV-Stamm infiziert werden und wenige Tage nach der Infektion werden die überlebenden Vögel getötet und die Bursa entfernt. Das Virus kann dann aus dem Bursa-Homogenat für die weitere Verwendung extrahiert werden. Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegenden Experimente zeigen, dass die oben definierten Aminosäureaustausche in den Positionen 253 und 284 dem VV-Stamm UK661 erlauben in Zellkulturen zu wachsen, Die Ergebnisse der Mutations- und Transfektionsexperimente mit diesem klassischen IBDV-Stamm sind in Tabelle 2B zusammengefasst.
Tabelle 2B
Diese Daten beweisen weiterhin, dass die Aminosäureaustausche in den Positionen 253 und 284 ausreichen, damit die klassischen bursalen IBDV-Stämmen in Zellkulturen wachsen. Alle anderen Mutationen resultieren in Mutanten, die sich entweder in Zellkulturen nicht oder nur sehr schlecht replizieren (siehe auch Lim et al., J. Virol. 73, 2854–62, 1999).
Ausserdem wurde nachgewiesen, dass in GLS IBDV der Austausch eines einzelnen Aminosäurerests in Positionb 284 ausreichend war, um einem Bursa-adaptierten IBDV zu ermöglichen in CEF-Zellen zu replizieren (Tabelle 3).
Tabelle 3
Daher erlaubt das erfindungsgemässe Verfahren einem IBDV-Bursa-Isolats durch Adaption mittels rekombinanter DNA- Techniken in Zellkulturen zu wachsen. Der Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist, dass als ein Ergebnis des Adaptionsprozesses Mutationen in das IBDV-Genom nur in ein oder mehrere der Codons in Position 253 und 284 eingeführt werden. Die Zahlen zeigen die Aminosäure- und Codonposition des Polyproteins beziehungsweise des grossen offenen Leserahmens auf dem Segment A des IBDV-Genoms (Mundt und Müller, J. Gen. Virol. 77, 437–443, 1995; NCBI Hinterlegungsnummer X 84034).
Viele, jedoch nicht alle IBDV-Stämme, die nicht auf CEF-Kulturen wachsen, enthalten die Codons 253 (Gln), 284 (Ala) und 330 (Ser) in dem VP2-Gen. Einige Variante E- oder klassische IBDV-Stämme, die nicht auf CEF-Kulturen wachsen, können bereits eines der erforderlichen Codons 253 (His) und 284 (Thr) besitzen. Daher umfasst das erfindungsgemässe Verfahren die Einführung einer Mutation in eines oder beide der oben erwähnten Codons, so dass die daraus resultierende IBDV-Mutante die Codons in dem VP2-Gen umfasst, die die Aminosäuren 253 (His) und 284 (Thr) codieren.
Bevorzugter wird das erfindungsgemässe Verfahren an einem IBDV durchgeführt, das nicht in der Lage ist in CEF-Zellen zu replizieren und das die Codons für die Aminosäurereste 253 (Gln) und 284 (Ala) und sogar noch bevorzugter 330 (Ser) umfasst. Im Fall der klassischen und Variante E-Stämme, werden Mutationen in zwei oder drei der Codons des VP2-Gens eingeführt, was in den Codons 253 (His) und 284 (Thr) und gegebenenfalls 330 (Arg) resultiert. Die neuen Codons für die Aminosäuren in diesen Positionen können sein: für His (CAT oder CAC), für Thr (ACT, ACC, ACA, ACG) und für Arg (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG).
Noch bevorzugter wird das erfindungsgemässe Verfahren an einem IBDV durchgeführt, das nicht fähig ist sich in CEF-Zellen zu replizieren und das die Codons Gln 253 (CAA), Ala 284 (GCC) und gegebenenfalls Ser 330 (AGT) oder in allen möglichen Kombinationen davon umfasst.
Insbesondere wird das erfindungsgemässe Verfahren an einem IBDV durchgeführt, das nicht fähig ist in CEF-Zellen zu replizieren und das die Codons 253 (CAA), 284 (GCC) und 330 (AGT) umfasst.
Das Verfahren für die Herstellung einer IBDV-Mutante gemäss der vorliegenden Erfindung umfass das kürzlich entwickelte „reverse genetics"-System für Birnaviren (Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131–11136, 1996 und WO 98/09646). Dieses reverse genetische System bietet die Möglichkeit Mutation in das RNA-Genom eines IBD-Virus einzuführen. Das Prinzip des reversen genetischen Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung beruht auf der Isolierung der genomischen RNA-Segmente A und B aus dem Virus, gefolgt von einer reversen Transkription der RNAs in cDNA, wonach die cDNAs in RNA transkribiert werden. Die Einführung der erforderlichen Mutation(en) in das Segment A (oder B) des Virus findet auf DNA-Ebene statt. Ein wichtiger Schritt in diesem genetischen System ist es, separate DNA-Konstrukte zur Verfügung zu stellen, die ein DNA-Vektormolekül (z. B. ein Plasmid) und volle Länge cDNA-Klone der Segmente A oder B des IBDV umfassen. Die DNA-Konstrukte, die die cDNA des Segments A oder B einschliesslich der Nukleotide der 5'- und 3'-Enden beider Segmente umfassen, können gemäss dem von Mundt und Vakharia (1996, supra) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Der anschliessende Schritt in dem reversen genetischen Verfahren ist die Transfektion von geeigneten Wirtszellen mit dem geeigneten genetischen Material von Segment A und B auf solche Weise, dass in den transfizierten Wirtszellen RNA-Transkripte der cDNA von Segment A und B die Replikation des Virus initiieren können, was in einem infektiösen IBDV resultiert, das aus dem Medium isoliert werden kann, in dem die Wirtzellen gezüchtet werden.
Für den letzten Schritt des reversen genetischen Systems können verschiedene Verfahren angewendet werden. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemässe Verfahren die in vitro Herstellung eines synthetischen RNA-Transkripts sowohl von der cDNA des Segments A als auch von B. In diesem Fall umfassen die DNA-Konstrukte einen RNA-Polymerasepromoter, der operabel an eines der Segmente gebunden ist. Der Promoter kann derjenige für die T7-, SP6- oder T3-Polymerase sein, wobei der T7-Promoter bevorzugt wird. Die synthetischen Transkripte des A- und des B-Segments werden isoliert und für die Transfektion geeigneter Wirtszellen verwendet.
Alternativ dazu gibt es ein Verfahren, in dem Wirtszellen zur Verfügung gestellt werden, die fähig sind eine RNA-Polymerase zu exprimieren und die mit einem DNA-Konstrukt transformiert sind, das die cDNA der das Segment B sowie einen RNA-Polymerasepromoter umfasst, so dass die RNA-Transkripte des Segments B konstitutiv exprimiert werden. Nach der Transfektion einer solchen Zelle mit einem synthtischen RNA-Transkript der cDNA, die das mutierte Segment A umfasst, wird die Replikation der IBDV-Mutante initiiert. Insbesondere können Wirtszellen verwendet werden, die fähig sind Bacteriophagen T7 DNA-abhängige RNA-Polymerase zu exprimieren, die zum Beispiel cytoplasmatisch von rekombinantem Vaccinia-Virus exprimiert wird.
Die gewünschte Mutation kann in das VP2-Gen mittels für diesen Zweck allgemein bekannter Verfahren eingeführt werden. Insbesondere werden Mutationen mittels gerichteter Mutagenese eingeführt. Verfahren zur Einführung einer Mutation in das IBDV-Genom werden hierin beschrieben, werden aber auch allgemein im Stand der Technik angewendet (Mundt und Vaharia, 1996, supra; Yao et al., J. Virology 72, 2647–2654, 1998; Mundt et al. Europäische Patentanmeldung Nr. 0887,412 und Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. M. Ausubel et al., Wiley N. Y., Ausgabe 1995, Seiten 8.5.1.–8.5.9.).
Das erfindungsgemässe Verfahren kann für alle IBDV-Stämme angewendet werden, die nicht fähig sind in CEF-Zellkulturen zur replizieren und die von dem klassischen, der Variante E oder den antigenen GLS-Subtypen des IBDV stammen.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemässe Verfahren für alle IBDV-Stämme angewendet werden, die nicht fähig sind in CEF-Zellkulturen zur replizieren, unabhängig von der Virulenz der Viren und schliesst sehr virulente Stämme (wie CS89 und UK661), virulente Stämme (wie F52/70 und STC) und Impfstämme (wie 228E und 2512) ein. Diejenigen IBDV-Mutanten, die an eine Replikation in Zellkulturen adaptiert sind und von sehr virulenten und virulenten Stämmen stammen, werden weniger virulent sein und können als lebende Impfstämme verwendet werden. Alternativ können solche IBDV-Mutanten leicht in Zellkulturen vermehrt und als inaktivierte Impfstoffe formuliert werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch vorteilhaft bei attenuierten IBDV-Stämmen angewendet werden, die nicht fähig sind in CEF-Zellkulturen zu replizieren. Diese Mutanten, die von solchen attenuierten Viren stammen, können in einem Zellkultursystem für Impfstoffherstellung anstatt in einem in vivo-Produktionssystem verwendet werden.
Gemäss einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer „chimären" IBDV-Mutante zur Verfügung, die fähig ist sich in CEF-Zellkulturen zu replizieren. Das Verfahren umfasst den zusätzlichen Schritt des Einführens einer Mutation in ein Gen des Segments A, vorzugsweise in das VP2-Gen eines ersten IBDV, worauf als ein Ergebnis davon das von diesem Gen exprimierte Protein eine Epitop-Determinante eines zweiten IBDV umfasst.
Ein chimäres IBDV ist ein Virus, das als genetisches Rückgrad das Segment A oder das VP2-Gen eines ersten antigenen Subtyps unfasst und ausserdem die genetische Information für eine Epitopdeterminante eines zweiten antigenen IBDV-Subtyps codiert. Insbesondere exprimieren solche chimären IBDVs eine oder mehrere zusätzliche Epitop-Determinanten des VP2-Proteins des ersten antigenen IBDV-Subtyps. Der Vorteil eines solchen chimären IBDV ist, dass er als einzelnes Immunogen verwendet werden kann, das mindestens gegen zwei antigene IBDV-Subtypen Immunität induziert.
Insbesondere werden IBDV-Mutanten hergestellt, die ein Rückgrad aus dem Segment A oder dem VP2-Gen des klassischen, GLS- oder des Variante E-IBDVs umfassen. cDNA-Klone, die die gesamte codierende Region des Segments A der verschiedenen IBDV-Stämme codieren, können unter Anwendung standardisierter im Stand der Technik beschriebene Klonierungsverfahren hergestellt werden (Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736– 742, 1992; J. Gen. Virology 74, 1201–1206, 1993). Die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen des Segments A verschiedener IBDV-Stämme sind im Stand der Technik offenbart (z. B. WO 95/26196 und Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736– 742, 1992).
Darüber hinaus offenbart die WO 95/26196 die Aminosäuresequenz verschiedener Epitopdeterminanten der antigenen IBDV-Subtypen, die für jeden Subtyp charakteristisch sind. Ausserdem offenbart die WO 95/26196 die Antigencharakterisierung verschiedener IBDV-Stämme durch ihre Reaktionsfähigkeit mit einem Panel neutralisierender monoklonaler Antikörper. Wichtige Epitopdeterminanten, die mit solchen neutralisierenden Moabs reagieren, sind die Epitop-Determinanten B69 (klassischer Subtyp), R63 und 67 (Variante E) und 57 (GLS). Die Region des VP2-Proteins, die die Aminosäuresequenzen für diese Epitopdeterminanten umfasst, werden in Vakharia et al. (Virus Res. 31, 265–273, 1994) beschrieben.
Vorzugsweise wird in der vorliegenden Erfindung eine chimäre, zur Replikation in CEF-Zellkulturen fähige IBDV-Mutante hergestellt, die ein Rückgrad des klassischen Segments A und die Nukleotidsequenz, die die Epitopdeterminate der Variante E oder die Epitopdeterminante GLS 57 codiert. Alternativ dazu umfasst die chimäre IBDV-Mutante ein GLS-Rückgrad und Nukleotidsequenzen, die die Epitopdeterminante B69, R63 oder 67 codieren.
Insbesondere umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Herstellung eines chimären IBDV-Stamms (D78/Variante E), der von dem Stamm D78 abstammt (im Handel erhältlich von Intervet International B. V., Niederlande), in welchem (i) das VP2-Gen durch das VP2-Gen eines Stamms der Variante E ersetzt ist und (ii) die Codons in den Positionen 253, 284 und 330 wie oben beschrieben (Beispiel 1) verändert wurden.
Im Grunde sind die Schritte für die Einführung von Nukleotidsequenzen, die die Epitop-Determinaten in dem Rückgrad des Segments A eines ersten IBDV codieren, im wesentlichen die gleichen, wie diejenigen, die für die Einführung der oben definierten Mutationen beschrieben wurden. Dies wird am einfachsten durch zur Verfügung stellen der cDNA der Genom-Segmente A und B und (i) durch Ersetzen der codierenden Sequenz der Epitop-Determinante des ersten IBDV durch diejenige des zweiten IBDV oder (ii) durch Verändern eines spezifischen Codons in dem ersten IBDV durch gerichtete Mutagenese durchgeführt. Solche Verfahren werden auch in der WO 95/26196 beschrieben. Schliesslich initiieren die RNA-Transkripte dieser cDNA-Moleküle die Replikation in einer transfizierten Wirtszelle, um infektiöse, chimäre IBDV zu erhalten.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung einer wie oben beschriebenen IBDV-Mutante zur Verfügung gestellt, worin die daraus resultierende IBDV-Mutante auch andere Mutationen umfasst, die das Virus abschwächen. Ein Beispiel einer solchen Mutation ist eine Mutation in dem VP5-Gen des Segments A des IBDV-Genoms, die in einer IBDV-Mutante resultiert, die nicht in der Lage ist ihr natives VP5-Protein zu exprimieren. Die Herstellung einer VP5^–-Mutante wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 887 412 beschrieben.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung eine gentechnisch veränderte, infektiöse IBDV-Mutante zur Verfügung, die fähig ist in CEF-Zellkulturen zu replizieren, welche die Codons 253 (His) und 284 (Thr) und gegebenenfalls 330 (Arg) in dem VP2-Gen des klassischen oder des Variante E-Stamms oder Codon 284 (Thr) eines GLS-Stamms umfassen.
Solche IBDV-Mutanten umfassen immer noch die genetische Information bursaler IBDVs, die nicht fähig sind in CEF-Zellkulturen zu replizieren, mit Ausnahme der oben genannten neuen Codons, die auf kontrollierte Weise mittels gentechnischer Verfahren eingeführt wurden.
Insbesondere wird eine wie oben definierte IBDV-Mutante der Varianten E zur Verfügung gestellt, die kein Glycin und/oder Valin in den Positionen 318 beziehungsweise 325 hat. Gentechnisch hergestellte Mutanten der Variante E, die Asparaginsäure und/oder Methionin in diesen Positionen haben, werden am meisten bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gentechnisch hergestellte erfindungsgemässe IBDV-Mutante eine chimäre IBDV-Mutante, insbesondere eine von dem Stamm D78 abgeleitete chimäre IBDV-Mutante, die die für das VP2-Gen des Variante E-Stamms codierende Nukleotidsequenz umfasst und die die oben spezifizierten drei neuen Codons besitzt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die einfache Herstellung von IBDV-Impfstoffen aus IBDV-Stämmen, die zuvor nicht fähig waren in in vitro-Zellkulturen zu replizieren.
Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die IBDVs (weiterhin) durch das oben beschriebene Verfahren auf eine kontrollierte Weise abgeschwächt werden können. Solche attenuierten IBDV-Mutanten können als aktive Komponente in IBDV-Lebendvakzinen verwendet werden.
Daher betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung einen Impfstoff zur Verwendung zum Schutz von Geflügel gegen die aus einer IBDV-Infektion resultierende Erkrankung. Der Impfstoff umfasst eine wie oben beschrieben gentechnisch hergestellte IBDV-Mutante zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder einem Verdünnungsmittel.
Die IBDV-Mutante kann als lebendes attenuiertes oder inaktiviertes Virus in den Impfstoff eingeführt werden.
Ein erfindungsgemässer Impfstoff kann mittels herkömmlicher Verfahren, wie zum Beispiel für die im Handel erhältlichen lebenden und inaktivierten IBDV-Impfstoffe angewendeten, hergestellt werden. Kurz zusammengefasst wird ein suszeptibles Substrat mit einer erfindungsgemässen IBDV-Mutante inokuliert und vermehrt, bis das Virus sich zu einem erwünschten infektiösen Titer repliziert hat, wonach das IBDV enthaltende Material geerntet wird.
Jedes Substrat, das fähig ist die Replikation der IBDV-Mutanten zu unterstützen, kann für die Herstellung des erfindungsgemässen Impfstoffs verwendet werden, einschliesslich primärer (aviärer) Zellkulturen wie zum Beispiel Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) oder Hühnerembryo-Leberzellen (CEL), Säugetierzellen wie die VERO-Zelllinie oder die BGM-70-Zelllinie oder aviäre Zelllinien wie QT-35, QM-7 oder LMH. Gewöhnlich wird das Virus nach Inokulation der Zellen 3–10 Tage vermehrt, wonach der Überstand der Zellkultur geerntet und falls erwünscht filtriert oder zentrifugiert wird, um Zelldebris zu entfernen.
Alternativ dazu wird die IBV-Mutante in embryonierten Hühnereiern vermehrt. Das Substrat auf dem diese IBDVs vermehrt werden, sind vor allem embryonierte SPF-Eier. Embryonierte Eier können zum Beispiel mit einer 0,2 ml IBDV-Mutante enthaltenden Suspension oder einem Homogenat inokuliert werden, das mindestens 10² TCID₅₀ pro Ei umfasst und anschliessend bei 37°C inkubiert werden. Nach ungefähr 2–5 Tagen kann das IBD-Virusprodukt durch Sammeln der Embryos und/oder der Membranen und/oder der Allantoisflüssigkeit geerntet werden, gefolgt von einer geeigneten Homogenisierung dieses Materials. Das Homogenat kann danach 10 Minuten bei 2500 × g zentrifugiert werden und der Überstand wird anschliessend durch einen Filter (100 μm) filtriert.
Der das Lebendvirus enthaltende erfindungsgemässe Impfstoff kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter Form hergestellt und verkauft werden und enthält ausserdem einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder ein Verdünnungsmittel, das gewöhnlich für solche Zusammensetzungen verwendet wird. Trägerstoffe schliessen Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer ein. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGR, Kohlehydrate (wie Sorbit, Mannit Stärke, Saccharose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (wie Trockenmilchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Alkalimetallphophate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamicin. Verdünnungsmittel schliessen Wasser, wässrige Puffer (wie gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole (wie Glycerol) ein.
Falls erwünscht kann der erfindungsgemässe Lebendimpfstoff ein Adjuvanz enthalten. Beispiele geeigneter Verbindungen oder Zusammensetzungen mit Adjuvanzaktivität sind die gleichen wie unten aufgeführt.
Obwohl eine Verabreichung des erfindungsgemässen Lebendimpfstoffs durch Injektion, z. B. intramuskulär, subcutan möglich ist, wird der Impfstoff vorzugsweise mittels weniger teuren Massenverabreichungsverfahren verabreicht, die allgemein für eine IBDV-Impfung angewendet werden. Diese Verfahren schliessen im Fall einer IBDV-Impfung Drinkwasser- oder Sprayimpfungen ein.
Alternative Verfahren für die Verabreichung des Lebendimpfstoffs schliessen eine Verabreichung mittels Ei, Augentropfen und Schnabeleintauchen ein.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der die IBDV-Mutante in einer inaktivierten Form umfasst. Der hauptsächliche Vorteil eines inaktivierten Impfstoffs sind die hohen Niveaus schützender Antikörper von lang anhaltender Dauer, die erzielt werden können.
Das Ziel der Inaktivierung der nach dem Vermehrungsschritt geernteten Viren ist die Eliminierung der Virusreproduktion. Im allgemeinen kann dies durch chemische oder physikalische Mittel erreicht werden. Chemische Inaktivierung kann zum Beispiel durch Behandlung der Viren mit Enzymen, Formaldehyd, β-Propiolacton, Ethylenimin oder ein Derivat davon bewirkt werden. Falls notwendig wird die inaktivierende Verbindung anschliessend neutralisiert. Mit Formaldehyd inaktiviertes Material kann zum Beispiel mit Thiosulfat neutralisiert werden. Physikalische Inaktivierung kann durchgeführt werden, in dem das Virus vorzugsweise energiereicher Bestrahlung wie UV-Licht oder γ-Strahlen ausgesetzt wird. Falls erwünscht, kann der pH nach der Behandlung auf ungefähr 7 eingestellt werden.
Ein die inaktivierte Mutante enthaltender Impfstoff kann zum Beispiel einen oder mehrere der oben genannten pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffe oder ein für diesen Zweck geeignete Lösungsmittel enthalten.
Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemässer Impfstoff eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvanzaktivität. Für diesen Zweck geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen schliessen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen, die zum Beispiel auf einem Mineralöl, wie Bayrol E^® oder Marcol 52^® oder einem Pflanzenöl wie Vitamin E-Acetat und Tensiden basieren, ein.
Der erfindungsgemässe Impfstoff umfasst eine wirksame Dosis der IBDV-Mutante als aktive Komponente, d. h. eine Menge an immunisierendem IBDV-Material, die in den geimpften Vögeln Immunität gegenüber einem Challenge mit einem virulenten Virus induzieren. Immunität wird hier als die Induktion eines signifikant höheren Schutz-Niveaus in einer Vogel-Population nach der Impfung im Vergleich zu einer ungeimpften Gruppe definiert.
Typischerweise kann der erfindungsgemässe Lebendimpfstoff in einer Dosierung von 10²–10⁹ TCID₅₀ infektiöse Dosis₅₀ (TCID₅₀) pro Tier verabreicht werden, vorzugsweise in einer Dosierung im Bereich von 10^5,0–10^7,0 TCID₅₀ und ein inaktivierter Impfstoff kann das antigene Äquivalent von 10⁵–10⁹ TCID₅₀ pro Tier enthalten.
Inaktivierte Impfstoffe werden gewöhnlich parenteral, z. B. intramuskulär oder subcutan verabreicht.
Obwohl der erfindungsgemässe IBDV-Impfstoff wirkungsvoll in Hühnern verwendet werden kann, können auch andere Geflügelarten wie Truthähne, Perlhühner und Wachteln erfolgreich mit diesem Impfstoff geimpft werden. Hühner schliessen Masthühner, Reproduktionsherden und Legeherden ein. Das Alter der Tiere, die einen erfindungsgemässen lebenden oder inaktivierten Impfstoff erhalten, ist das gleiche wie dasderjenigen Tiere, die herkömmliche Lebend- oder inaktivierte IBDV-Impfstoffe erhalten. Zum Beispiel können Masthühner (frei an mütterlichen Antikörper-MDA) im Alter von einem Tag geimpft werden, wohingegen Masthühner mit hohen Nivaus an MDAs vorzugsweise im Alter von 2–3 Wochen geimpft werden. Legeherden oder Reproduktionsherden mit niedrigen MDA-Nivaus werden im Alter von 1–10 Tagen, gefolgt von einer Auffrischungsimpfung mit inaktiviertem Impfstoff im Alter von 6–8 und 16–20 Wochen geimpft.
Die Erfindung schliesst auch Kombinationsimpfstoffe ein, die ausser der oben beschriebenen IBDV-Mutante ein oder mehrere Immunogene umfassen, die von anderen Krankheitserregern stammen, die für Geflügel beziehungsweise Fische infektiös sind.
Vorzugsweise umfasst der Kombinationsimpfstoff zusätzlich einen oder mehrere Impfstämme des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV), Newcastle Disease Virus (NDV), Eischwundsyndromvirus (EDS), Truthahn-Rhinotracheitis Virus (TRTV) oder Reovirus.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Konstruktion von IBDV-Mutanten und ihrer Replikationseigenschaften in CEF-Zellkulturen
Material und Methoden
Konstruktion von (intergenen) IBDV-Plasmiden, die die variable Region des VP2 der klassischen, Variante E oder GLS-Stämme von IBDV umfassen
(i) VP2 des klassischen IBDV-Stamms.
D78
Voraussetzung für die folgende gerichtete Mutagenese war die Modifikation des Plasmids pUC 18. Zu diesem Zweck wurde pUC18 mit Nde I und BamH I geschnitten, elektroeluiert, mit Klenow-Enzym stumpfe Enden eingeführt und wieder ligiert um pUC18ΔNde I-BamH I (pUC18/ΔNB) zu erhalten. Plasmid pAD78/EK (Mundt et al., J. Virology 71, 5647–51, 1997) wurde mit EcoR I und Kpn geschnitten, um die volle Länge Sequenz des Segments A des Serotyp I-Stamms D78 einschliesslich der T7-RNA-Polymerase-Promoterstelle zu erhalten. Dieses Fragment wurde in das mit EcoR I und Kpn I gespaltene pUC18/ΔNB ligiert, um pD78A//ΔNB zu erhalten. Das Plasmid pD78A/ΔNB wurde als Rückgrad für die Klonierungs- und gerichteten Mutagenese-Verfahren verwendet.
UK661
Das Plasmid pD78-E/DEL (siehe unten) wurde für die Konstruktion chimärer Plasmide verwendet, die die Sequenzen des Segments A vom Stamm UK661 enthielten. Nach der Präzipitation der viralen RNA wurde eine reverse Transkription und PCR gemäss Standardverfahren unter Verwendung der Oligonukleotide UK661AFor1 und UK661ARev1 (Brown und Skinner, Virus Res. 40, 1–15, 1996, Nukleotid Nr. 621-644-Sinn beziehungsweise 1201-1223-Gegensinn) durchgeführt. Die daraus resultierenden PCR-Fragmente wurden mit stumpfen Enden in den Sma I-geschnittenen Vektor pUC 18 (Pharmacia, Schweden) kloniert, um p661Apart zu erhalten. Nach dem Sequenzieren wurde p661Apart mit den Restriktionsenzymen Nde I und Spe I bei den Nukleotiden 647 beziehungsweise 1182 geschnitten (die Numerierung folgt der volle Länge Sequenz des Stamms P2: NCBI Hinterlegungsnummer X 84034), um ein 535 Basenpaare grosses Fragment zu erhalten, das die codierende Sequenz der variablen Region von VP2 des Stamms UK661 einschliesst. Nach der Ligierung in das Nde I-Spe I geschnittene pD78-E/DEL, wurde ein chimäres volle Länge Plasmid D78A-E-661 hergestellt, das die Sequenzen des Segments A des Stamms D/78, E/DEL und UK661 enthielt (4).
(ii) VP2 der IBDV-Variante E.
Als Ersatz für die IBDV-spezifischen Sequenzen wurde ein Plasmid verwendet, das die vollständige codierende Region des Variante E-Stamms E/DEL enthielt (pEDEL22BacII, Vakharia, Biotechnology Annual Review 3, 151–168, 1997). pEDEL22BacII (1A) wurde mit den Restriktionsenzymen Nde I und Sal I, Nukleotide 647 beziehungsweise 1725 gemäss der volle Länge Sequenz des Stamms P2 (NCBI Hinterlegungsnummer X 84034) geschnitten, um ein 1078 Bp grosses Segment zu erhalten, das die codierenden Sequenzen der variablen Region von VP2 und Sequenzen von VP4 des Stamms E/DEL enthielt. Nach der Ligierung in das mit Nde I-Sal I geschnittene pD78A/ΔNB wurde ein chimäres volle Länge Plasmid pD78A/ΔNB-E/Del ( 1A) erhalten, das sowohl die Sequenzen des Segments A des Stamms D78 als auch von E/Del enthielt. Die Plasmide pD78A/ΔNB und pD78A/ΔNb-E/DEL wurden für die gerichtete Mutagenese verwendet.
(iii) VP2 von IBDV-GLS.
Weiterhin wurde ein Paar Plasmide konstruiert, die die variable Region von GLD-B beziehungsweise GLS-TC enthielten. Zum Klonieren der hypervariablen Region wurde GLS-TC in CEF vermehrt und durch Ultrazentrifugation gereinigt. Das bursale Homogenat von GLS-B wurde mittels Niedergeschwindigkeits-Zentrifugation gereinigt und der Überstand wurde für die folgenden Verfahren verwendet. Nach einem Proteinase K-Verdau (0,5 mg/ml) Natriumdodecylsulfat (SDS, 0,5%) wurde die virale RNA gereinigt, mittels reverser Transkription in cDNA überführt und mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäss Standardverfahren unter Verwendung der Oligonukleotide A14 und A44 (Tabelle 4) vermehrt. Das Amplifikationsprodukt wurde mit stumpfen Enden kloniert und die Plasmide, die die geeigneten PCR-Fragmente enthielten, wurden sequenziert. In den folgenden Experimenten wurden Plasmide verwendet, die jeweils eine Insertion entweder von GLS-TC (pGLS-TC) oder GLS-B (pGLS-B) enthielten. Für die Konstruktion des intergenen Segments A wurde der volle Länge Klon pD78A/ΔNB-E/Del verwendet. pGLS-TC beziehungsweise pGLS-B wurden mit Sac I und Spe I verdaut. Die elektroeluierten Fragmente wurden anschliessend in das zuvor mit Sac I-Spe I verdaute pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC beziehungsweise pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B zu erhalten. Die Plasmidkarten beider Plasmide sind in 1B dargestellt.
Gerichtete Mutagenese
Die gerichtete Mutagenese wurde mittels PCR durchgeführt. Oligonukleotide enthielten Mutationen, die zu Aminosäureaustauschen und zusätzlichen Schnittstellen für Restriktionsenzyme führten (Tabelle 4). Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Plasmide pD78A/ΔNB, pD78A/ΔNB-E/Del beziehungsweise pD78A-E-661 wurden die Fragmente mit stumpfen Enden kloniert und sequenziert (pfrag). Klone, die die mutierten Codons -enthielten wie folgt in die zuvor geschnittenen Plasmide ligiert:
(i) Variante E-IBDV.
Für die Herstellung des volle Länge Klons des Segments A des Plasmids pD78A/ΔNB-E/Del, der die mutierten Codons enthielt, wurden die folgenden PCR-Fragmente erhalten: Primer E/Del-MutQH und A14 (pfragQH), E/Del-MutAT und A14 (pfragAT), E/Del-MutSR und P21F (pfragSR) wurden verwendet, um Fragmente mit den geeigneten Einzelaminosäureaustauschen Q253H, A284T beziehungsweise S330R der E-Del-Sequenz zu erhalten. PfragQH und pFragSR wurden in mit Sac I und Spe I geschnittenen pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/DelQH (1C) beziehungsweise pD78A/ΔNB-E/DelSR (1C) zu erhalten. pfragAT wurde mit Nar I und Spe I geschnitten und anschliessend in das zuvor geschnittene pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/DelAT (1C) zu erhalten. Um Plasmide zu erhalten, die die zwei mutierten Codons enthalten, wurde die folgende PCR durchgeführt: Primer E/Del-MutQH und E/Del-MutSR sowie E/Del-MutAT und E/Del-MutSR wurden für die Amplifikation von fragQH-SR beziehungsweise fragAT-SR in pD78A/ΔNB-E/Del verwendet. Nach dem Klonieren und Sequenzieren wurde pfragQH-SR mit Sac I-Spe I verdaut und anschliessend in das zuvor geschnittene pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/DelQH-SR zu erhalten (1D). Für die Herstellung des pD78A/ΔNB-E/DelAT-SR-Plasmids (1D) wurde das Plasmid pfragAT-SR mit Nar I und Spe I geschnitten und in das identisch geschnittene pD78A/ΔNB-E/Del ligiert. Für die Konstruktion eines Plasmids, das die mutierten Codons für zwei Aminosäureaustausche (Q253H; A284T) enthält, wurde eine PCR unter Verwendung des Plasmids pD78A/ΔNB-E/DelAT und der Primer E/Del-MutQH; A14 durchgeführt. Das erhaltene Plasmid pfragQH-AT wurde mit Sac I-Spe I geschnitten und in pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/DelQH-AT zu erhalten (1D). Für die Klonierung eines Plasmids, das die mutierten Codons für alle drei Aminosäureaustausche (Q253H, A284T und S330R) enthält, wurden die Primer E/Del-Mut-QH und E/Del-MutSR für die Amplifikation von fragQH-AT-SR in pD78A/ΔNB-E/Del-AT verwendet. Nach dem Schneiden von pfragQH-AT-SR mit Sac I und Spe I wurde das eluierte Fragment in das mit Sac I und Spe I geschnittene pD78A/ΔNB-E/Del ligiert, um pD78A/ΔNB-E/DelQH-AT-SR zu erhalten (1E).
(ii) Klassisches IBDV
D78
Für die Herstellung eines volle Länge Klons des Segments A des Plasmids pD78A/ΔNB, das die mutierten Codons enthielt, wurde ein Nde I-Hind III geschnittenes Fragment von pD78A/ΔNB in ein zuvor mit Nde I-Hind III geschnittenes pUC19 subkloniert, um einzelne Schnittstellen für Restriktionsenzyme für die folgenden Verfahren (pUC19/NH-D78A) zu erhalten. Die Oligonukleotide D78-MutHQ und A14 (pfragHQ), D78MutTA und A14 (pfragTA), D78-MutRS und P21F (pfragRS) wurden für die PCR- Amplifikation verwendet; um Fragmente mit den geeigneten Einzelaminosäureaustauschen H253Q, T284A beziehungsweise R330S der D78-Sequenz zu erhalten. Fragment pFragHQ wurde mit Sac I und Sty I geschnitten, pfragTA wurde mit Nar I und Sty I geschnitten und in das auf geeignete Weise geschnittene pUC19/NH-D78A religiert. Plasmid pUC19/NH-D78A, das das mutierte Codon enthielt, wurde mit Nde I und Sac II geschnitten, die geeigneten Fragmente wurden elektroeluiert und in pD78A/ΔNB ligiert, das zuvor mit Nde I und Sac II geschnitten wurde, um pD78A/ΔNB-HQ, pD78A/ΔNB-TA beziehungsweise pD78A/ΔNB-RS zu erhalten. Für die Herstellung eines volle Länge Klons, der die Nukleotidsubstitutionen enthält, die zu einem Austausch aller drei Aminosäuren (H253Q, A284T, R330S) führen, wurde eine PCR unter Verwendung der Oligonukleotide D78-MutHQ, D78-MutRS und Plasmid pD78A/ΔNB-TA durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Fragmente wurden mit stumpfen Enden kloniert, um pfragHQ-TA-RS zu erhalten. Nach dem Schneiden von pfragHQ-TA-RS mit Sac I und Sty I wurde das elektroeluierte Fragment in mit Sac I und Sty I geschnittenem pUC19/NH-D78A kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit Nde I und Sac II geschnitten, das entsprechende Fragment elektroeluiert und schliesslich in pD78A/ΔNB ligiert, das zuvor mit Nde I und Sac II geschnitten wurde, um pD78A/ΔNB-HQ-TA-RS zu erhalten. Die Nukleotidsequenzen der erhaltenen mutierten Plasmide wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die Sequenzen wurden mit dem Wisconsin Package, 8. Version (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) analysiert. Die Plasmide pD78A/ΔNB-HQ, pD78A/ΔNB-TA, pD78A/ΔNB-RS und pD78A/ΔNB-TA-RS sind in 2 dargestellt.
UK661
Für die gerichtete Mutagenese wurde das Plasmid pD78A-E-UK661 mit EcoR I/Kpn I geschnitten und das Fragment, das das volle Länge Segment A enthielt, anschliesssend in den mit EcoR I/Kpn I geschnittenen Plasmidvektor pBS^– (Stratagene) ligiert. Das daraus resultierende Plasmid pBSD78A-E-661 wurde für die gerichteten Mutagenese-Experimente, dem zuvor beschriebenen Verfahren folgend, verwendet (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367–382, 1987). Basierend auf den Ergebnissen von Lim et al. (1999, supra) wurde die Nukleotidsequenz für die Aminosäuren 279 und 284 des Plasmids pBSD78A-E-661 (D279N, A284T) unter Verwendung des im Gegensinn orientierten Oligonukleotids Mut1 ausgetauscht (Brown und Skinner, supra, Nukleotid Nr. 947-1001, 946-966 ist AAC und 979-981 ist ACG, was in einem Aminosäureaustausch D279N und A284T resultiert). Der entsprechende Teil des daraus resultierenden Plasmids pBSD78A-E-661-DN-AT wurde sequenziert. Nach der Nde I/Spe I-Spaltung von pBSD78A-E-661-DN-AT wurde das 535 Bp grosse Fragment in das entsprechend geschnittene pD78A-E-661 ligiert, um pD78A-E-661-DN-AT zu erhalten.
Weiterhin wurde die Nukleotidsequenz der Aminosäure Q253 gegen eine für H253 codierende Nukleotidsequenz getauscht, in dem das im Gegensinn orientierte Oligonukleotid Mut 2 verwendet wurde (Brown und Skinner, supra; Nukleotid Nr. 874-900, 886-888 ist CAT, was in der Aminosäuresubstitution O253H resultiert). Das daraus resultierende Plasmid pD78A-E-661-QH enthielt den Aminosäureaustausch Q253H. Der Austausch der Aminosäure 284 (A284T) wurde unter Verwendung des im Gegensinn orientierten Oligonukleotids Mut3 durchgeführt (Brown et al., supra, Nukleotid Nr. 966-993, 979-981 ist ACC, was in der Aminosäuresubstitution A284T resultiert), in dem Plasmid pD78A-E-661-AT resultierend. Das vierte Plasmid pD78A-E-661-QH-AT enthielt den Austausch beider Aminosäuren (Q253H, A284T) unter Verwendung beider Oligonukleotide (Mut2, Mut3) in einer gerichteten Mutagenesereaktion. Die Plasmide p661Apart, pD78A-E-661, pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT und pD78A-E-661-QH-AT sind in 4 dargestellt.
Konstruktion eines volle Länge cDNA-Klons von Segment B
Stamm D78
Zum Klonieren der volle Länge cDNA des Segments B vom Serotyp I Stamm D78, wurde das Virus in CEF vermehrt und durch Ultrazentrifugation gereinigt. Genomische virale RNA vom Stamm D78 wurde gereinigt, in cDNA revers transkribiert und durch Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäss Standardverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden wie beschrieben (Mundt und Vakharia, 1996) amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wurde mit stumpfen Enden kloniert und die die entsprechenden PCR-Fragmente enthaltenden Plasmide wurden sequenziert. Das Klonierungsverfahren zum Erhalt eines Plasmids, das die volle Länge cDNA des Segments B (pUC18BD78) unter der Kontrolle des T7-RNA Polymerase-Promoters enthält, entspricht dem von Mundt und Vakharia (1996, supra) beschriebenen Verfahren für das Segment B vom Stamm P2 (3).
Stamm UK661
Drei Oligonukleotidpaare, die von der Sequenzinformation in Brown und Skinner (1996, supra) stammen, wurden verwendet:

i) UK661BFor1 (Sequenz gemäss dem Oligonukleotid B5'-P2, Mundt und Vhakaria, 1996, supra), im Gegensinn orientierter UK661BRev1 (Nukleotid Nr. 708-736). Das 5'-Ende des Oligonukleotids UK661BRev1 enthält zusätzlich zu der Sequenz des Segments B des Stamms UK-661 die Spaltstelle für das Restriktionsenzym Xba I, die die Nonasequenz CTCTAGAGG enthält
ii) UK661BFor2 (Nukleotid Nr. 751-667), in Gegenrichtung orientierter UK661BRev2 (Nukleotid Nr. 2089-2113). Das 5'-Ende des Oligonukleotids UK661BRev2 enthält zusätzlich zu der Sequenz des Segments B des Stamms UK-661 die Spaltstelle für das Restriktionsenzym Xba I, die die Nonasequenz CTCTAGAGG enthält;
iii) UK661BFor3 (Nukleotid Nr. 2011-2035), in Gegerichtung orientierter UK661BRev3)(Mundt und Müller, 1995, supra, Nukleotid Nr. 2804-2827). Das 5'Ende des Oligonukleotids UK661BRev3 enthält zusätzlich zu der Sequenz des Segments B des Stamms UK-661 die Spaltstelle für das Restriktionsenzym Xba I, die die Nonasequenz 5'-TCTAGAGCCC enthält. Das Triplet CCC hat hier eine Sma I-Spaltstelle zusammen mit den drei letzten Nukleotiden der viralen genomischen Sequenz des Segments B (Nukleotid Nr. 2825-2827) gebildet. Unter Verwendung dieser drei Oligonukleotidpaare UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2 und UK661BFor3; UK661BRev3 in der RT-PCR wurden drei Fragmente amplifiziert und mit stumpfen Enden in dem mit Sma I geschnittenen Vektor pUC18 kloniert, um pUK661B1, pUK661B2 beziehungsweise pUK661B3 zu erhalten. Nach dem Sequenzieren dieser drei Insertions-Fragmente wurde pUK661B2 mit Age I und Xba I geschnitten, um ein 1441 Bp grosses Fragment zu erhalten, das anschliessend in das mit Age I/Xba I geschnittene pUK661B1 ligiert wurde, um pUK661B12 zu erhalten. Für die Konstruktion des volle Länge cDNA-Klons des Segments B wurde pUK661B3 mit BSTB I/Xba I geschnitten und das erhaltene 694 Bp grosse Fragment wurde in das mit BstB I/Xba I geschnittene pUK661B12 ligiert. Das daraus resultierende Plasmid pB661 enthielt die volle Länge cDNA Sequenz des Segments B des Stamms UK661 unter der Kontrolle des T7-Promoters. pB661 ist in 5 dargestellt (die Numerierung entsricht der Sequenz des P2-Stamms in Mundt und Müller, 1995, supra).

Virusgewinnung aus cRNA in Gewebekultur
Für eine in vitro-Transkription der RNA-Plasmide pAD78/ΔNB, pAD78/ΔNB-HQ, pAD78/ΔNB-TA, pAD78/ΔNB-RS, pAD78/ΔNB-HQ-TA-RS, pD78A/ΔNB-E/Del, pD78A/ΔNB-E/Del-QH, pD78R/ΔNB-E/Del-AT, pD78A/ΔNB-E/Del-SR, pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT, pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR, pD78A/ΔNB-E/Del-QH-SR, pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR und pD78B wurden durch Schneiden entweder mit BsrGI oder Pst I linearisiert. Die weitere Behandlung der linearisierten DNA und die Transkription wurden, wie von Mundt und Vakharia (1996) beschrieben, durchgeführt, jedoch mit zwei Ausnahmen: i) die Transkriptionsmischungen wurden nicht mit Phenol/Chloroform gereinigt und ii) für die Transfektions-Experimente wurden QM-7-Zellen verwendet. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen gefroren/getaut, bei 700 × g zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen und die daraus resultierenden Überstände wurden weiter durch Filtrieren durch 0,45 μm-Filter geklärt und bei –70°C aufbewahrt. Für Immunfluoreszen-Untersuchungen wurden die QM-7-Zellen auf sterilen Deckplättchen wachsen gelassen.
Für die in vitro-Transkription wurden die RNA-Plasmide, die das UK661-Segment A (5) enthielten durch Schneiden mit BsrGI linearisiert. Das Segment des Stamms D78 wurde mit Pst I linearisiert, wohingegen Segment B des Stamms UK 661 mit Sma I linearisiert wurde. Die weitere Behandlung der linearisierten DNA und die Transkription wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
Nachweis des IBDV-Antigens
Das IBDV-Antigen wurde durch einen indirekten Immunfluoreszenz-Assay (IFA) und Western Blot unter Verwendung Hasen-anti-IBDV-Antiserum nachgewiesen. Für das IFA auf Deckplättchen gewachsene CEF wurden mit Überständen der transfizierten QM-7, CEF beziehungsweise CAM inkubiert, die zum Passagieren verwendet wurden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden wurden die CEF mit Aceton fixiert und für das IFA weiter verarbeitet. Für die Untersuchung der IBDV-Replikation nach der Transfektion wurden auf Deckplättchen gewachsene QM-7-Zellen 24 oder 48 Stunden inkubiert, mit Aceton fixiert und für das IFA weiter verarbeitet.
Ergebnisse
Transfektionsexperimente mit intergenen cRNA
Für die Transfektionsexperimente wurde ein volle Länge cDNA-Klon des Segments A von Stamm D78 (pD78A/ΔNB) und ein intergenes Segment A pD78A/ΔNB-E/Del in synthetische cRNA transkribiert und mit der volle Länge cRNA des Segments B (pD78B) sowohl in QM-7-Zellen als auch parallel in CEF-Zellen co-transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen gefroren/getaut und die daraus resultierenden Überstände wurden zwei mal auf CEF passagiert. Die CEF wurden bis zu fünf Tagen nach der Infektion je Passage inkubiert. Nach dem Frieren/Tauen jedes Tranfektionsüberstands als auch nach jeder Transfektion wurde mittels IFA unter Verwendung von CEF auf IBDV-Antigene getestet. Die Transfektions-Experimente wurden drei mal wiederholt. Virus wurde nach der Transfektion der cRNA des Plasmids pD78B in Kombination mit pAD78/ΔNB gebildet und führte zu dem Stamm D78r. Im Gegensatz dazu wurden nach den Transfektions-Experimenten unter Verwendung der cRNA von pD78A/ΔNB-E/Del und pD78B kein Gewebekulturen infizierendes Virus isoliert. Um zu analysieren, ob auf die Transfektion eine Replikation folgte, wurde die Transfektion unter Verwendung von QM-7-Zellen durchgeführt, die auf Deckplättchen wachsen. In beiden Fällen wurde hier 24 Stunden nach der Transfektion unter Anwendung eines IFA Virusantigene nachgewiesen. Wir haben daher bewiesen, das in beiden Fällen eine Virus-Replikation auftrat, allerdings war es nur im Fall D78r möglich, Gewebekulturen infizierende IBDV herzustellen.
Transfektionsexperimente mit mutierter cRNA
Basierend auf den Ergebnissen des Sequenzvergleichs wurde mittels gerichteter Mutagenese eine Anzahl verschiedener volle Länge cDNA-Klone hergestellt.
(i) Variante E-IBDV
Mutierte Plasmide von pD78A/ΔNB-E/Del wurden hergestellt, die Aminosäuresubstitutionen in den Positionen 253, 284 und 330 in allen sieben möglichen Kombinationen (Tabelle 5) enthielten. Transfektion-Experimente und Passagen wurden drei mal parallel in CEF- und QM-7-Zellen durchgeführt. Die erhaltenen Überstände wurden mit einem IFA auf ihre Infektiosität untersucht. Nach der Transfektion von QM-7-Zellen oder CEF mit der cRNA der Plasmide pD78A/ΔNB-E/Del, pD78A/ΔNB-E/Del-QH, pD78A/ΔNB-E/Del-AT, pD78A/ΔNB-E/Del-SR, pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR und pD78A/ΔNB-E/Del-QH-SR in Kombination mit cRNA von pD78B konnte kein infektiöses Virus isoliert werden. Transfektion von cRNA, die von pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT oder pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR erhalten wurde, führte zur Bildung von infektiösem Virus (D78A-E/Del-QH-AT und D78A-E/Del-QH-AT-SR). Die Spezifität wurde mit einem IFA sowohl auf CEF als auch auf QM-7-Zellen bestätigt. Dies indiziert, dass das VP2 des IBDV eine kritische Rolle bei der Infektion von Gewebekulturen spielt. Die Aminosäuresubstitutionen (BU) Q-253-H (TC) und (BU) A-284-T (TC) waren notwendig und ausreichend infektiöses Virus für die verwendeten Gewebekulturen zu generieren. Die IBDV-Mutante, die die drei Aminosäureaustausche (D78/Variante-E CEF-adaptiert) besass, wurde für die weitere Untersuchung verwendet (Beispiel 2).
(ii) Klassisches IBDV
D78
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde ein zweites Plasmid-Set unter Verwendung von pAD78/ΔNB für eine gerichtete Mutagenese konstruiert, um entweder einen einzelnen Aminosäureaustausch (pAD78/ΔNB-HQ, pAD78/ΔNB-TA, pAD78/ΔNB-RS) oder alle drei Aminosäuren (pAD78/ΔNB-HQ-TA-RS) zu erhalten. Diese vier Plasmide wurden wie oben beschrieben für Transfektions-Experimente in Kombination mit pD78B verwendet. Infektiöse IBDV konnten nach der Transfektion der cRNA von pAD78/ΔNB-RS, wie mit einem IFA nachgewiesen, generiert werden. Wiederum hatte die Aminosäure 330 keine Wirkung auf die Fähigkeit des gebildeten Virus Gewebekulturen zu infizieren.
Alle Konstrukte wurden mittels eines IFA nach der Transfektion auf Replikation getestet. Das IBDV-Antigen konnte vor allem 24 Stunden und 48 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen werden, wobei sich typische grosse intensiv gefärbte Aggregate innerhalb des Cytoplasmas zeigten.
UK661
Für Transfektionsexperimente wurde ein volle Länge cDNA-Klon der chimären Segmente A pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT und pD78A-E-661-QH-AT in synthetische cRNA transkribiert und entweder mit einer volle Länge cRNA des Segments B des Stamms D78 oder des Segments B des Stamms UK661 sowohl in QM-7-Zellen als auch parallel in CEF co-transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen gefroren/getaut und der daraus resultierende Überstand wurde einmal in CEC passagiert. Die CEC wurden 24 oder 48 Stunden ab der Infektion inkubiert, fixiert und für eine Immunfluoreszenz weiterverarbeitet. Für CEC infektiöses Virus wurde nach Transfektion der cRNA des Plasmids pD78A-E-661-QH-AT in Kombination sowohl mit pD78B als auch pB661 generiert, was zu dem chimären IBDV D78A-E-661-QH-AT führte. Im Gegensatz dazu konnte nach Transfektionsexperimenten mit cRNA von pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH und pD78A-E-661-AT in Kombination mit cRNA entweder von pBD78 oder pB661 kein für Gewebekulturen infektiöses Virus isoliert werden. Nach 72-stündigem Inkubieren post infectionem des Transfektions-Überstands waren im Fall von D78-E-661-DN-AT einzelne infizierte CEF nachweisbar.
(ii) GLS IBDV
Um die Ergebnisse der Transfektionsexperimente sowohl intergener als auch mutierter Plasmide zu bestätigen, haben wir von einem natürlich auftretenden Paar von IBDV-Stämmen profitiert. Die variable Region des VP2 des aus der Bursa stammenden GLS-Stamms (GLS-B) und diejenige der an eine Gewebekultur adaptierten Variante GLS-TC wurde vermehrt, kloniert und analysiert. Ein Vergleich der Aminosäurensequenzen der beiden GLS-Stämme, die von pGLS-B beziehungsweise pGLS-TC stammten, zeigten einen Aminosäureaustausch in Position 284 [(GLS-B)A→T (GLS-TC)] zwischen beiden Sequenzen (1B). Aminosäure 253 (Q) und 330 (S) waren wie oben beschrieben mit der Aminosäure der BU-Gruppe identisch. Um zu analysieren, ob der Austausch in Position 284 (A→T) für die Bildung infektiöser Viren ausreichend ist, wurden zwei Plasmide (pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC und pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B) konstruiert, die die hypervariable Region von VP2 beider GLS-Varianten enthielt. cRNA von pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC beziehungsweise pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B wurde parallel zusammen mit der cRNA von pD78 sowohl in QM-7-Zellen als auch CEF transfiziert. Nach dem Passagieren der Überstände in einer Gewebekultur konnte sowohl mittels eines IFA als auch des CPE infektiöses Virus nach der Transfektion von cRNA des pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC nachgewiesen werden. Verschiedenen Transfektions-Versuche von cRNA des pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B produzierten keine für Gewebekulturen infektiöse IBDV. In vitro Transkription/Translation beider Plasmide pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC und pD78A/ΔNB-E/Del-GLSB zeigten eine vollständige Verarbeitung des Polyproteins. Nach der Transfektion der cRNA beider Plasmide zusammen mit cRNA von pD78B konnten virale Antigene mittels IFA nachgewiesen werden. Somit erwiesen sich beide Chimäre als Replikations-kompetent. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Austausch der hypervariablen Region von VP2, der zu einem einzelnen Aminosäureaustausch in Position 284 führte, für die Generierung von infektiösem intergenen IBDV ausreichend war.
Beispiel 2
Biologische Eigenschaften der an CEF adaptierten IBDV-Mutante der Variante E
Material und Methoden
Herstellung von IBDV-Impfstoffen
Chimäre D78/Variante E (Bursa adaptiert).
9–12 Tage alte SPF-Eier wurden mit der chimären D78/Variante E/D78 (D78/Variante E/D78 ohne die drei Aminosäureaustausche in Q253H, A284T und S330R) über den Weg der Chorioallantois-Membran (CAM) infiziert. Fünf Tage nach der Infektion wurden die CAM und die Embryonen geerntet und homogenisiert. Das Homogenat wurde auf der CAM titriert. Der Überstand wurde verdünnt und resultierte in einer Impfdosis von 10^2,0 EID₅₀/Tier für eine Anwendung mittels Augentropfen.
Chimäre D78/Variante E (CEF-adaptiert)
Primäre Hühnerembryofibroblasten (CEF) wurden in einer Endkonzentration von 2 × 10⁶/ml hergestellt. Die Zellen wurden in Eagles Minimum Essential-Medium mit 5% foetalem Kälberserum gezüchtet. Zu 15 ml dieser Zellsuspension wurde 0,1 ml IBDV (D78/Variante E/D78 mit den drei Aminosäureaustauschen in Q253H, A284T und S330R) gegeben, das in 1 ml verdünnt war. Nach einer 3–6 tägigen Inkubation bei 37°C in einem Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit, wurde der Überstand verdünnt und resultierte in einer Impfdosis von 10^5,3 oder 10^3,5 TCID₅₀/Tier für eine Anwendung mittels Augentropfen beziehungsweise muskulärer Injektion.
Im Handel erhältlicher klasssicher IBDV-Impfstoff Nobilis Stamm D/78.
Der Impfstoff wurde verdünnt und resultierte in einer Impfstoffdosis 10^3,3 TCID₅₀/Tier für eine Anwendung mittels Augentropfen.
Identifizierung von IBDV-Impfstoffen mittels Panel-Test
Beide IBDV-Stämme wurden mittels ELISA unter Verwendung verschiedener monoklonaler Antikörper nach Van Loon et al. (Van Loon, A.R.W.M., D. Lüttiken und D. B. Snyder. Rapid Quantification of Infectious Bursal Disease (IBD) Challenge, Field or Vaccine Virus Strains. International Symposium on Infectious Bursal Disease and Chicken Infectious Anemia, Rauischholzhausen, Deutschland, 179–189, 1994).
Wachstum auf CEF
Beide IBDV-Stämme wurden verwendet, um CEF zu infizieren. Die Induktion des CPE (zytopathischer Effekt) durch IBDV wurde mikroskopisch über einer Periode von 6 Tagen untersucht.
Impfung
Die Wirkung der verschiedenen Impfstoffe wurde 14 Tage nach einer Impfung durch die Messung der Resistenz gegenüber einem Challenge bestimmt, in dem ein Challenge-Virus (virulenter IBDV-Stamm Variante E) verabreicht wurde. Der chimäre Impfstoff D78/Variante E (Bursa adaptiert), 10^2,0 EID₅₀/Tier wurde mittels Augentropfen im Alter von zwei Wochen verabreicht. Der chimäre Impfstoff D78/Variante E (CEF-adaptiert), 10^5,5 oder 10^3,5 TCID₅₀/Tier wurde mittels Augentropfen beziehungsweise intramuskulärer Injektion im Alter von zwei Wochen verabreicht. Der im Handel erhältliche klassische Impfstoff Nobilis Stamm D78 (Intervet International B. V., Niederlande), 10^3,3 TCID₅₀/Tier wurde mittels Augentropfen im Alter von zwei Wochen verabreicht. Anwesenheit des IBDV in der Bursa fabricii und mikroskopische Läsionen in der Bursa von 5 Tieren pro Gruppe wurden 3,7, 10 und 13 Tage nach der Impfung und 3 Tage nach dem Challenge bestimmt.
Ergebnisse
Identifizierung von IBDV-Imfstoffen mittels Panel-Tests
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, zeigen die chimäre D78/Variante E (Bursa-adaptiert) und die chimäre D78/Variante E (CEF-adaptiert) mit den verschiedenen MCA ein identisches Reaktionsmuster. Das bedeutet, dass die drei Aminosäure-Austausche keinen Einfluss auf die Epitope des Virus haben, wie durch verschiedene MCA bestimmt wurde. Der klassische, im Handel erhältliche Impfstoff hat ein anderes Reaktionsmuster mit den verschiedenen MCA.
Tabelle 6. Panel-Muster verschiedener IBDV-Viren mit verschiedenen MCA. + Epitop auf Virus vorhanden, – Epitop nicht auf Virus vorhanden.
Wachstum auf CEF
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, ist die chimäre D78/Variante E (Bursa) nicht fähig auf CEF zu wachsen. Die chimäre D78/Variante E (CEF) und der klassische im Handel erhältliche Impfstoff Nobilis Stamm D78 sind beide fähig in CEF zu replieren und einen CPE zu induzieren.
Tabelle 7. Fähigkeit auf CEF zu wachsen und spezifische IBDV-CPE zu induzieren. + = induziert CPE auf CEF; – = verursacht keinen CPE auf CEF.
Durchschnittlicher Wert mikroskopischer Läsionen in der Bursa 3, 7, 10 und 13 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt. Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, ist der nicht an CEF adaptierte chimäre Stamm D78/Variante E (Bursa) virulent und induziert bereits 7 Tage nach der Impfung einen vollständigen lymphozytischen Abbau. Im Gegensatz dazu induziert der an Gewebekulturen adaptierte Stamm D78/Variante E (CEF) nach der Impfung keine Läsionen. Der im Handel erhältliche Impfstoff verursacht milde bis geringe Läsionen nach der Impfung. Einzelne Daten zeigen, dass Tiere, die mit der chimären D78/Variante E (Bursa) oder D78 geimpft wurden, gegenüber einem Challenge geschützt waren. Tiere, die mit der D78/Variante E über das Auge oder intramuskulär geimpft wurden, zeigten ebenfalls 3 Tage nach der Impfung einen Schutz, obwohl dieser geringer als derjenige war, der durch den virulenten Elternstamm induziert wurde.
Tabelle 8. Durchschnittlicher Wert der Läsionen in der Bursa

(oc): Okular
(im): intramuskulär
C: chronische Läsionen
A: akute Läsionen

Claims

Verfahren zur Herstellung einer infektiösen IBDV-Mutante, die fähig ist in CEF-Zellkulturen zu replizieren, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) getrennte Herstellung eines DNA-Konstrukts, das cDNA der Genomsegmente A und B eines IBDV umfasst, das nicht fähig ist in CEF-Zellkulturen zu replizieren; (ii) Einführen einer Mutation in: a eines oder beide Codons der Aminosäurereste 253 und 284 im VP2-Gen der Variante E oder des klassischen IBDV-Stamms, oder in b das Codon des Aminosäurerests 284 im VP2-Gen eines GLS-IBDV-Stammes, auf der cDNA, die das Segment A umfasst, in der Weise, dass die Codons der Aminosäurereste 253 und 284 des mutierten VP2-Gens im Fall einer Variante E oder eines klassischen IBDV-Stamms einen Histidin- beziehungsweise einen Threonin-Rest codieren, oder in der Weise, dass das Codon des Aminosäurerests 284 des mutierten VP2-Gens im Fall eines GLS-IBDV-Stamms einen Threonin-Rest codiert; (iii) Initiieren der Replikation der IBDV-Mutante in Wirtszellen in einem Kulturmedium durch RNA-Transkripte der cDNA, die das Segment A und das Segment B umfasst; und (iv) Isolieren der IBDV-Mutante aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die an CEF-Zellkulturen adaptierte IBDV-Mutante einen Serin-, Arginin- oder Lysin-, vorzugsweise einen Arginin-Aminosäurerest in Position 330 des VP2-Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in alle Codons 253, 284 und 330 des VP2-Gens eines klassischen IBDV oder einer Variante E eine Mutation eingeführt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutationen in die Codons 253 (Gln), 284 (Ala) und 330 (Ser) eingeführt sind.
Verfahren nach Ansprüchen 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass von der cDNA, die das mutierte Segment A und das Segment B umfasst, synthetische RNA-Transkripte hergestellt werden, die anschliessend in Wirtszellen transfiziert werden.
Verfahren nach Ansprüchen 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die zusätzlichen Schritte der Herstellung eines chimären IBDV umfasst.
Gentechnisch veränderte, infektiöse IBDV-Mutante, die fähig ist, in einer CEF-Zellkultur zu replizieren, welche Codons der Aminosäuren 253 (His) und 284 (Thr) in dem VP2-Gen eines Variante E IBDV und gegebenenfalls ein Codon der Aminosäure 330 (Arg) umfasst, mit der Massgabe, dass das VP2-Protein jeweils nicht die Aminosäuren Glycin und/oder Valin in den Positionen 318 und/oder 325 aufweist.
Gentechnisch veränderte, infektiöse IBDV-Mutante nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das VP2-Protein jeweils die Aminosäuren Asparaginsäure und/oder Methionin in den Positionen 318 und/oder 325 aufweist.
Gentechnisch veränderte, infektiöse IBDV-Mutante nach Ansprüchen 7–8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine chimäre IBDV-Mutante ist.
Gentechnisch veränderte, infektiöse IBDV-Mutante nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante vom Stamm D78 abgeleitet ist, wobei das VP2-Gen durch das VP2-Gen eines Variante-E-Stammes ersetzt ist.
Impfstoff zur Verwendung zum Schutz von Geflügel vor Krankheiten, die von einer IBDV-Infektion herrühren, welcher eine gemäss den Ansprüchen 7–10 gentechnisch veränderte IBDV-Mutante zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Verwendung zum Schutz von Geflügel vor Krankheiten, die von einer IBDV-Infektion herrühren, dadurch gekennzeichnet, dass es das Zusammenfügen einer infektiösen IBDV-Mutante, die fähig ist, in einer CEF-Zellkultur zu replizieren und die gemäss den Ansprüchen 1–6 hergestellt wurde, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel oder Verdünnungsmittel umfasst.