KR20010069175A - 유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병비루스(ｉｂｄｖ) 돌연변이체 - Google Patents

유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병비루스(ｉｂｄｖ) 돌연변이체 Download PDF

Info

Publication number
KR20010069175A
KR20010069175A KR1020000010849A KR20000010849A KR20010069175A KR 20010069175 A KR20010069175 A KR 20010069175A KR 1020000010849 A KR1020000010849 A KR 1020000010849A KR 20000010849 A KR20000010849 A KR 20000010849A KR 20010069175 A KR20010069175 A KR 20010069175A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ibdv
δnb
amino acid
variant
pd78a
Prior art date
Application number
KR1020000010849A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100709077B1 (ko
Inventor
룬에이에이더블유엠반
문트이
Original Assignee
에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크
악조 노벨 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크, 악조 노벨 엔.브이. filed Critical 에프.지.엠. 헤르만스 ; 이.에이치. 리링크
Publication of KR20010069175A publication Critical patent/KR20010069175A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100709077B1 publication Critical patent/KR100709077B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material

Abstract

본 발명은 CEF 세포 배양에서의 증식에 감염성 활액낭 질병 비루스(IBDV)를 적응시키는 방법에 관한 것이다. 아미노산 잔기 253(Gln) 및 284(Ala)에 대한 코돈을 253(His) 및 284(Thr)에 대한 코돈으로 변화시키면, 활액낭 적응된 고전적 및 변형체-E IBDV가 CEF 세포 배양에서 증식하였다. GLS IBDV의 경우 아미노산 잔기 284에 대한 코돈의 단일의 변화만이 필요하였다.

Description

유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병 비루스(ＩＢＤＶ) 돌연변이체{GENETICALLY ENGINEERED CELL CULTURE ADAPTED INFECTIOUS BURSAL DISEASES VIRUS(IBDV) MUTANTS}
본 발명은 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 있는 감염성 IBDV 돌연변이를 제조하는 방법, 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체 뿐만 아니라 이러한 IBDV 돌연변이체를 함유하는 백신에 관한 것이다.
감염성 활액낭 질환 비루스(IBDV)는 비르나비리대(Birnaviridae) 과의 일원으로서, 이 과에 속하는 비루스들은 매우 유사한 게놈 구조와 유사한 복제 사이클을 갖고 있다. 이 비루스의 게놈은 2 분절(A 및 B)의 2본쇄(ds) RNA로 구성된다. 보다 큰 분절 A는 자가단백분해작용에 의해 절단되어 성숙 비루스 단백질 VP2, VP3 및 VP4를 형성하는 다중단백질을 암호화한다. VP2 및 VP3은 비리온의 주요 구조 단백질이다. VP2는 비르나비루스의 주요 숙주 예방 면역원으로, 중화 항체의 유도에 주요 역할을 하는 항원성 영역을 포함한다. VP4 단백질은 전구체 다중단백질의 VP2, VP3 및 VP4 단백질로의 프로세싱에 관여하는 비루스 암호성 프로테아제인 것으로 보인다. 또한, 보다 큰 분절 A는 다중단백질 유전자 앞에 선재하고 부분 중첩되는 제2의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 보유한다. 이 제2 오픈 리딩 프레임은 IBDV 감염 세포 중에 존재하는 기능이 알려지지 않은 단백질 VP5를 암호화한다. 보다 작은 분절 B는 폴리머라제 활성과 캡핑 효소 활성이 있는 90 kDa의 다기능성 단백질인 VP1을 암호화한다.
IBDV에는 2가지 혈청형인 혈청형 1과 혈청형 2가 존재한다. 이 2가지 혈청형은 비루스 중화(VN) 시험에 의해 구별될 수 있다. 또한, 혈청형 1의 아형도 분리되었다. 이와 같은 소위 혈청형 1의 "변형체" 비루스는 교차 중화 시험, 모노클로널 항체 패널 또는 RT-PCR에 의해 동정할 수 있다. 이와 같은 IBDV의 혈청형 1의 아형에 대해서는 문헌에 개시되어 있는데, 그 예로는 고전적, 변형체 E, GLS, RS593 및 DS326 균주가 있다(Van Loon, et al. Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany, 179-187, 1994).
굼보로(Gumboro) 질환이라고도 불리는 감염성 활액낭 질환(IBD)은 주요 표적으로 파브리시우스 낭 세포에 대하여 선택적 굴성이 있는 림프종 조직을 보유하고 있는 닭에 대한 급성 고도 전염성 비루스 감염증이다. 민감한 가축은 이병률이 높아서, 급속한 중량 감소와 완만한 치사율을 나타낸다. 닭는 이 질환에서 회복되어도 닭의 방어 기작에 필수적 역할을 하는 파브리시어스낭의 파괴로 인해 면역 결핍이 일어날 수 있다. IBD 비루스는 3주령 이하의 닭에 대하여 심각한 면역억제를 유발하고 최고 3개월령의 닭에 대해서는 활액낭 병변을 유도한다.
지금까지 이 질환은 약독화 생 IBDV 백신으로 초회항원자극된 닭에게 불활성 백신을 투여하여 축산 가축 중에 존재하는 항체 레벨을 증가시켜 예방하였다. 이 방법은 IBD에 의한 경제적 손실을 최소화시켰다. 예방접종된 축산 동물 유래의 닭가 보유하는 모체의 항체는 IBDV에 의한 초기 감염을 예방하고 면역억제와 관련된문제를 감소시킨다. 또한, 약독화 생 백신은 모체의 항체가 감소된 후의 시판 닭 집단에 대하여 성공적으로 사용되었다.
최근, IBDV의 극독성 균주는 유럽에서 치사율이 높은 질환의 발발을 유도하였다. 하지만, 현행의 예방접종 프로그램은 닭들을 충분히 예방하지 못하였다. 이러한 예방접종 실패의 주요 원인은 독성의 야생 비루스에 의해 공격받기 전에 닭에게 영향을 주는 생백신의 활성 상실 때문이었다.
따라서, 기존의 백신을 개량하고 새로운 종류의 백신 개발을 필요로 하는 요구가 계속되고 있다. 생백신의 개발을 위하여 약독형의 IBD 비루스가 요구되었다. 종래에는, 이와 같은 요구를, 적당한 기질에서 IBDV 야생 분리물을 연속 계대배양하여 달성하였다. 불활성화 IBDV 백신의 개발에는, IBD 비루스의 전파에 의해 얻어지는 다량의 IBDV 항원의 생산을 위해 적당한 기질이 필요로 되었다.
야생의 IBDV는 감염된 조류의 활액낭이나 부화란 중에서 용이하게 생체내 전파될 수 있는 것으로 알려지고 있다. 하지만, 일부 IBDV 균주를 닭 배 기원의 시험관내 세포 배양물에서 전파시킬 수 있는 성공적인 개량 방법이 보고되기도 하였지만, 야생에서 감염 활액낭으로부터 분리된 대부분의 IBDV 균주, 구체적으로 소위 독성 또는 극독성의 IBDV 균주는 닭 배 기원의 세포, 예컨대 닭 배 섬유아세포(CEF) 또는 신장 및 간과 같은 다른 기관 유래의 세포에 적응될 수 없다는 사실은 일반적으로 알려져 있다(Brown et al., J.Gen.Virology 75, 675-680, 1994; van Loon et al., 1994, 상기 문헌 참조).
생체내 배양 기질은 명백한 단점이 있다. 이와 같은 배양 방법은 많은 동물을 필요로 하고 많은 시간이 소요되며 표준화된 엄중 조건하에서 수행될 수 없기 때문에 동물에 부적당하다. 또한, 시험관내 세포 배양 기질에 적응되기가 어렵지 않은 제한된 수의 IBDV 균주는 연속 계대 공정을 통해 IBDV 균주를 적응시킨 결과로 비루스의 게놈 중에 비제어 방식으로 무작위 돌연변이가 도입된다는 단점을 갖고 있다. 이와 같은 돌연변이는 세포 배양물에 비루스를 적응시키는 것과 관련된 성질 이외의 다른 비루스 성질, 예컨대 비루스의 면역원성과 관련된 성질에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이와 같은 부가적인 무작위 돌연변이는 바람직하지 않다.
상기 비루스를 CEF 세포 배양물 중에 시험관내 계대 배양하여 IBDV를 적응시키는 방법은 감염된 조류의 활액낭에 병변부를 유도하는 비루스 활성의 감소를 통해 입증되듯이 독성의 약독화를 초래한다. 야마구치 등(Yamaguchi et al., Virology 223, 219-223, 1996)은 IBD 비루스의 독성에 대한 분자적 기본 및 활액낭 IBDV를 CEF 세포 배양물에 적응시킨 결과로 상기 비루스의 약독화에 대하여 조사하였다. 이와 같은 야마구치 등에 의해 실시된 연구는 야생형 IBDV의 약독화와 관련된 정확한 돌연변이가 동정될 수 없다는 결론을 짓고 있고, 또 분절 A의 긴 오픈 리딩 프레임이 암호화하는 다중단백질의 위치 279(Asp/Asn) 및 284(Ala/Thr)에 있는 아미노산 잔기가 CEF 세포에서의 IBDV의 전파 또는 독성에 중요하다는 것을 암시하고 있다. 이와 같이 암시된 내용은 문헌[Lim, B-L, Proceedings of the 4th Asia Pacific Poultry Health Conference, 22-26 November, 1998, Melbourne, Australia, Abst. 79]에서도 확인되었다. 이 문헌에서는 IBDV의 VP2 단백질 중에 존재하는 아미노산 잔기 279(Asp→Asn) 및 284(Ala→Thr)의 치환이 CEF 세포 배양물 중에서 전파될 수 있는 IBDV 돌연변이체를 생성한다고 개시하고 있다. 하지만, 이 종래 문헌에는 활액낭 IBDV를 CEF 세포 배양물에 적응시키는 데 필요하고 충분한 아미노산 돌연변이의 대체 종류와 최소 수에 대하여 교시되어 있지 않다.
본 발명의 제1 목적은 감염된 조류의 활액낭에서만 생체내 생육하는 IBDV 분리물을 세포 배양물에서 생육하도록 적응시키는 일반적으로 적용가능한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제2 목적은 IBDV 게놈 중의 돌연변이를 제어된 방식으로 도입시켜 약독화된 IBDV 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제3 목적은 세포 배양물 중에서 생육할 수 있도록 허용하는 적당한 아미노산 잔기를 포함하는 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체를 제공하는 것이다.
이러한 목적은
(i) CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 없는 IBDV의 게놈 분절 A 및 B의 cDNA를 포함하는 DNA 작제물을 별도로 제조하는 단계,
(ii) 분절 A를 포함하는 cDNA 상에 존재하는, a) 변형체 E 또는 고전적 IBDV 균주의 VP2 유전자 중 아미노산 잔기 253 및 284를 암호화하는 1개 또는 복수의 코돈 또는 b) GLS IBDV 균주의 VP2 유전자 중 아미노산 잔기 284를 암호화하는 코돈에 돌연변이를 도입시켜, 돌연변이된 VP2 유전자의 아미노산 잔기 253 및 284을 암호화하는 코돈이, 변형체 E 또는 고전적 IBDV 균주의 경우 각각 히스티딘과 트레오닌 잔기를 암호화하도록, 또는 돌연변이된 VP2 유전자의 아미노산 잔기 284를 암호화하는 코돈이 GLS IBDV 균주의 경우 트레오닌 잔기를 암호화하도록 유도하는 단계,
(iii) 분절 A 및 분절 B를 포함하는 cDNA의 RNA 전사체를 이용하여 배양액내의 숙주 세포 중에서 IBDV 돌연변이체의 복제를 개시시키는 단계,
(iv) 배양액으로부터 IBDV 돌연변이체를 분리하는 단계를 포함하여, CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 있는 감염성 IBDV 돌연변이체를 제조하는 방법에 의해 달성된다는 것을 발견하였다.
도 1a는 플라스미드 pEDEL22BacII, pD78A/ΔNB 및 pD78A/ΔNB-E/DEL를 도시한 것이다.
도 1b는 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B 및 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC를 도시한 것이다.
도 1c는 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del, pD78A/ΔNB-E/Del-QH, pD78A/ΔNB-E/DelAT 및 pD78A/ΔNB-E/Del-SR을 도시한 것이다.
도 1d는 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del, pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT, pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR 및 pD78A/ΔNB-E/Del-QH-SR을 도시한 것이다.
도 1e는 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del 및 pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR을 도시한 것이다.
도 2는 플라스미드 pD78A/ΔNB, pD78/ΔNB-HQ, pD78/ΔNB-TA, pD78/ΔNB-RS 및 pD78/ΔNB-HQ-TA-RS를 도시한 것이다.
도 3은 플라스미드 pUC18BD78을 도시한 것이다.
도 4는 플라스미드 pD78A-E/Del, p661Apart, pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT 및 pD78A-E-661-QH-AT를 도시한 것이다.
도 5는 플라스미드 pB661의 작제 과정을 도시한 것이다.
본 발명은 CEF 세포 배양물 중에서 IBDV의 복제를 허용하는데 충분하고, 필요한 아미노산 잔기를 최초로 동정한 것이다. 대부분의 IBDV 활액낭 분리물은 VP2 단백질 중 아미노산 잔기 253(Gln), 284(Ala) 및 330(Ser)을 포함하지만, 위치 253 및 284의 코돈이 아미노산 잔기 253(His) 및 284(Thr)를 암호화하도록 변화시킨 변형체 E 또는 고전적 IBDV 돌연변이체는 CEF 세포 배양물 중에서 생육할 수 있다. GLS IBDV 돌연변이체도, 위치 284의 코돈이 아미노산 잔기 284(Thr)를 암호화하도록 충분히 변화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 아미노산 위치 330은 CEF 중에서의 고전적 IBDV 돌연변이체 또는 변형체 E IBDV 돌연변이체의 복제에 중요하지 않다는 것을 발견하였다. 하지만, 본 발명에 따르면 상기 위치에 가장 바람직한 아미노산은 세린, 아르기닌 또는 리신이었다. 또한, GLS IBDV의 경우 아미노산 위치 253은 복제에 중요하지 않은 것으로, 보통 글루타민 잔기인 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 방법으로서 상기 3가지 아미노산 잔기 중 어느 하나의 잔기, 구체적으로 330(Arg)을 VP2 단백질 중 그 위치에 포함시켜 IBDV 돌연변이체를 제조한다. GLS IBDV 돌연변이체에 있어, 위치 253에 바람직한 아미노산 잔기는 글루타민이다.
IBDV 아미노산 변화 CEF 생육
253 284 330
D78/변형체E 모 균주 Gln Ala Ser -
변이체 His Ala Ser -
변이체 Gln Thr Ser -
변이체 Gln Ala Arg -
변이체 His Thr Ser +
변이체 Gln Thr Arg -
변이체 His Ala Arg -
변이체 His Thr Arg +
또한, 감염된 닭(D78/변형체 E)의 활액낭에서만 복제할 수 있는 변형체 E IBDV(키메라형)의 게놈에는 IBDV 분리물을 CEF 세포 배양물에 적응시키는데 필요한 2가지 변화가 있다는 것을 발견하였다. 이 위치는 아미노산 잔기 253과 284이다. 이 위치에 각각 아미노산 잔기 히스티딘과 트레오닌이 제공되면 IBDV 돌연변이체가 CEF 세포 배양물중에서 복제할 수 있게 된다(표 1 및 실시예 1). 또한, 본 발명의 방법에 따라 CEF 세포 배양물에 적응된 IBDV 돌연변이체 역시 약독성인 것으로 밝혀졌다(실시예 2).
활액낭에서 CEF 세포로의 고전적 IBDV 균주의 적응이 2개의 아미노산에 의해 결정되는 지를 더 입증하기 위하여, CEF 세포 배양물에서 복제할 수 있는 IBDV 균주 D78의 코돈을 위치 253, 284 및 330에서 변화시켰다, 그 결과를 표 2a에 제시한다.
IBDV 아미노산 변화 CEF 생육
253 284 330
D78 모균주 His Thr Arg +
변이체 Gln Thr Arg -
변이체 His Ala Arg -
변이체 His Thr Ser +
변이체 Gln Ala Ser -
고전적 "극독성"(VV)인 유럽 분리물 UK661(Brown et al., J.Gen.Virology 75, 675-680, 1994; Brown and Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996)은 시험관내에서 전파될 수 없고, 따라서 닭 생체내에서 전파시켜야만 한다. 따라서, VV 균주로 닭를 감염시키고, 감염후 2 내지 3일 동안 생존하는 닭를 죽이고 활액낭을 분리한다. 그 다음, 이후 사용을 위해 활액낭 균질액으로부터 상기 비루스를 추출할 수 있다. 본 발명의 기본이 되는 실험을 통해 전술한 바와 같은 위치 253 및 284의 아미노산을 변화시키면 VV 균주 UK661이 세포 배양물 중에서 생육할 수 있게 된다는 것이 입증되었다. 이와 같은 고전적 IBDV 균주를 이용한 돌연변이유발 및 형질감염 실험의 결과를 표 2b에 요약한다.
IBDV 아미노산 변화 CEF 생육
253 279 284
D78/661 모균주 Gln Asp Ala -
변이체 Gln Asp Thr +*
변이체 His Asp Ala -
변이체 Gln Asp Thr -
변이체 His Asp Thr +
* 매우 느리게 복제함.
이 데이터는 위치 253 및 284에서의 아미노산 변화이면 고전적 활액낭 IBDV 균주가 충분히 세포 배양물 중에서 생육할 수 있도록 허용한다는 것을 더욱 입증하는 것이다. 다른 모든 돌연변이는 세포 배양물에서 복제하지 않거나 매우 빈약하게 복제하는 돌연변이체를 생성한다(Lim et al., J. Virol, 73, 2854-62, 1999).
또한, GLS IBDV에서 위치 284의 아미노산을 단독 교환하는 경우에도 활액낭 적응된 IBDV가 CEF 세포 상에서 충분히 복제할 수 있는 것으로 확인되었다(표 3).
IBDV 아미노산 변화 CEF 생육
253 284 330
D78/GLS-BU Gln Ala Ser -
D78/GL-CEF Gln Thr Ser +
따라서, 본 발명에 기재된 방법은 재조합 DNA 기법에 의해 세포 배양물 중에서 생육하도록 IBDV 활액낭 분리물을 적응시킨다. 본 방법의 잇점은 적응 과정의 결과로서 IBDV 게놈 중에서 위치 253 및 284에 있는 1개 또는 복수의 코돈만이 돌연변이된다는 점이다. 이 번호는 각각 IBDV 게놈의 분절 A상에 있는 큰 오픈 리딩 프레임과 다중단백질의 아미노산 위치 및 코돈 위치를 나타내는 것이다(Mundt and Muller, J.Gen.Virol. 77, 437-443, 1995; NCBI 수탁 번호 X 84034).
CEF 세포 배양물에서 생육하지 못하는 IBDV 균주는 전부는 아니어도 대부분이 VP2 유전자 중에 코돈 253(Gln), 284(Ala) 및 330(Ser)을 포함한다. CEF 세포 배양물 상에서 생육하지 못하는 일부 변형체 E 또는 고전적 IBDV 균주는 필요 코돈 253(His) 및 284(Thr) 중 1개를 이미 보유하기도 한다. 따라서, 본 발명에 기재된 방법은 전술한 필요 코돈 중 1개 또는 2개에 돌연변이를 도입시키고, 그 결과 VP2 유전자 중에 아미노산 잔기 253(His) 및 284(Thr)를 암호화하는 코돈을 포함하는 IBDV 돌연변이체를 얻는 것을 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 방법은 아미노산 잔기 253(Gln) 및 284(Ala), 보다 더 바람직하게는 330(Ser)의 코돈을 포함하고 CEF 세포에서 복제할 수 없는 IBDV에 사용하는 것이 좋다. 고전적 균주 및 변형체 E 균주의 경우에는, 코돈 253(His) 및 284(Thr), 경우에 따라 330(Arg)이 형성되도록 VP2 유전자 중 2개 또는 3개의 코돈에 돌연변이를 도입시킨다. 이 위치에 올 수 있는 아미노산의 새로운 코돈은 His(CAT 또는 CAC), Thr(ACT, ACC, ACA, ACG) 및 Arg(CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG)일 수 있다.
보다 더 바람직하게, 본 발명의 방법은 CEF 세포 중에서 복제할 수 없고, 코돈 Gln 253(CAA), Ala 284(GCC) 및 경우에 따라 Ser 330(AGT) 또는 이것의 조합을 포함하는 IBDV에 사용되는 것이 좋다.
특히, 본 발명의 방법은 CEF 세포 중에서 복제할 수 없고 코돈 253(CAA), 284(GCC) 및 330(AGT)을 포함하는 IBDV에 사용되는 것이 좋다.
본 발명에 기재된 IBDV 돌연변이체를 제조하는 방법은 최근 확립된 비르나비루스의 "역 유전학" 시스템을 포함한다(Mundt and Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996 및 WO 98/09646). 이 역 유전학 시스템은 IBD 비루스의 RNA 게놈에 돌연변이를 도입시킬 수 있는 가능성을 제시하였다. 본 발명에 기재된 역 유전학 방법의 원리는 비루스로부터 게놈 RNA 분절 A 및 B를 분리하고, 이 RNA를 cDNA로 역전사시킨 뒤, 이 cDNA를 RNA로 전사시키는 것이다. 이 비루스의 분절 A(또는 B)로 필요 돌연변이의 도입은 cDNA 레벨에서 실시한다. 이 역 유전학 시스템의 주요 단계는 IBDV의 분절 A 또는 B의 전길이 cDNA 클론과 DNA 벡터 분자(예, 플라스미드)를 포함하는 별도의 DNA 작제물을 제공하는 것이다. 양 분절의 5' 말단 및 3' 말단의 뉴클레오티드를 비롯하여 분절 A 또는 B의 cDNA를 포함하는 DNA 작제물은 문헌[Mundt and Vakharia(1996, 상기 문헌 참조)]에 기재된 방법에 따라 생성할 수 있다. 이 역 유전학 방법의 후속 단계는 적절한 분절 A 및 B 유전자 물질로 적합한 숙주 세포를 형질감염시켜, 형질감염된 숙주 세포 중에서 cDNA 분절 A 및 B의 RNA 전사체가 비루스의 복제를 개시시키고, 그 결과 숙주 세포의 배양액 중에서 분리될 수 있는 감염성 IBDV를 얻는 것이다.
이와 같은 역 유전학 시스템의 후속 단계에는 여러 가지 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 양 분절 A 및 B의 cDNA 유래의 합성 RNA 전사체를 시험관내 제조하는 단계를 포함하는 것이 좋다. 이 경우, DNA 작제물은 어느 하나의 분절에 작동가능하게 결합된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. 이 프로모터로는 T7, SP6 또는 T3 폴리머라제의 프로모터가 가능하지만, T7 프로모터가 바람직하다. 분절 A 및 B의 합성 전사체는 분리하여 적합한 숙주 세포의 형질감염에 사용한다.
또는, RNA 폴리머라제를 발현할 수 있는 숙주 세포를 포함하는 세포주를 제공하는 단계 및 분절 B의 RNA 전사체가 구성적으로 발현되도록 RNA 폴리머라제 프로모터와 분절 B의 cDNA를 포함하는 DNA 작제물로 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법도 사용가능하다. 변이된 분절 A를 포함하는 cDNA의 합성 RNA 전사체로 상기 세포를 형질감염시킨 후에는, 숙주 세포 중에서 IBDV 돌연변이체의 복제를 개시시킨다. 구체적으로, 숙주 세포로는 예컨대 재조합 백시니아 비루스로부터 세포질 발현되는 박테리오파지 T7 DNA 의존적 RNA 폴리머라제를 발현할 수 있는 것이 사용가능하다.
VP2 유전자 중으로 목적 돌연변이의 도입은, 이 목적용으로 당해 기술 분야에 공지된 일반적 방법에 의해 수행할 수 있다. 구체적으로, 돌연변이는 부위 지시성 돌연변이유발법으로 도입시킨다. IBDV 게놈 중으로 돌연변이를 도입시키는 방법은 본 명세서에 기재하고 있으나, 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법이다(Mundt and Vakharia, 1996, 상기 문헌 참조; Yao et al., J.Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt et al. 유럽 특허 출원 0887,412 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M.Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 edition, pp.8.5.1.-8.5.9.).
본 발명에 기재된 방법은 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 없고 IBDV의 고전적 아형, 변형체 E 아형 또는 GLS 항원성 아형인 모든 IBDV 균주에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 기재된 방법은 균주의 독성과는 무관하게 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 없고, 예컨대 극독성 균주(예, CS89 및 UK661), 독성 균주(예, F52/70 및 STC) 및 백신 균주(예, 228E 및 2512)를 포함하는 모든 IBDV 균주에 사용가능하다. 극독성 균주 및 독성 균주 유래의 세포 배양물 중에서 복제하도록 적응된 IBDV 균주는 독성이 경감되어 생백신 균주로서 사용될 수 있다. 또는, 이와 같은 IBDV 돌연변이체를 세포 배양물 중에서 편리하게 전파시킨 뒤, 불활성화된 백신으로 조제할 수도 있다.
또한, 본 발명에 기재된 방법은 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 없는 IBDV 약독화된 균주에 유리하게 사용될 수 있다. 이와 같은 약독화된 비루스 유래의 돌연변이체는 백신 생산에 생체내 생산 시스템 대신 세포 배양물 시스템을 이용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 있는 "키메라" IBDV 돌연변이체의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 제1 IBDV중 분절 A의 유전자, 바람직하게는 VP2 유전자 중에 돌연변이를 도입시켜, 그 결과 제2 IBDV의 에피토프 결정인자를 포함하는 상기 유전자에 의해 발현되는 단백질을 얻는 추가 단계를 포함한다.
키메라 IBDV는 유전자 주쇄로 제1 항원성 아형의 분절 A 또는 VP2 유전자를 포함하고, 제2 IBDV 항원성 아형의 에피토프 결정인자를 암호화하는 유전자 정보를 더 포함하는 비루스이다. 구체적으로, 이와 같은 키메라 IBDV는 제1 항원성 아형인 IBDV의 VP2 단백질상에서 1개 또는 복수의 부가 에피토프 결정인자를 발현한다. 이와 같은 키메라 IBDV의 잇점은 IBDV의 2종 이상의 항원성 아형에 대하여 면역성을 유도하는 단일 면역원으로 사용될 수 있다는 점이다.
구체적으로, 고전적 IBDV, GLS IBDV 또는 변형체 E IBDV의 분절 A 주쇄 또는 VP2 유전자를 포함하는 IBDV 돌연변이체를 제조한다. 각 IBDV 균주의 분절 A에 존재하는 전체 암호 영역을 포함하는 cDNA 클론은 종래 기술에 개시된 표준 클로닝 절차 및 방법을 사용하여 제조할 수 있다(Vakharia etal., Avian Diseases 36, 736-742, 1992; J.Gen.Virology 74, 1201-1206, 1993). 각 IBDV 균주의 분절 A의아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 종래 기술에 개시되어 있다(예, WO 95/26196 및 Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736-742, 1992).
또한, WO 95/26196은 각 항원성 아형에 특징적인 IBDV 항원성 아형의 여러 에피토프 결정인자의 아미노산 서열을 개시하고 있다. 또한, WO 95/26196은 중화 모노클로널 항체 패널과의 반응성에 의해 각종 IBDV 균주의 항원성 특징에 대하여 개시하고 있다. 이러한 중화 Moab와 반응성인 주요 에피토프 결정인자는 B69(고전적 아형), R63과 67(변형체 E) 및 57(GLS) 에피토프 결정인자이다. 이 에피토프 결정인자의 아미노산 서열을 포함하는 VP2 단백질의 영역은 문헌(Vakharia et al., Virus Res. 31, 265-273, 1994)에 개시되어 있다.
바람직하게는, 본 발명에 기재된 방법에 있어 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 있는 키메라 IBDV 돌연변이체는 변형체 E 에피토프 결정인자 67 또는 GLS 에피토프 결정인자 57을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 고전적 분절 A 주쇄를 포함하도록 제조하는 것이 좋다. 또는, 키메라 IBDV 돌연변이체는 B69, R63 또는 67 에피토프 결정인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 GLS 주쇄를 포함하는 것이 좋다.
구체적으로, 본 발명에 기재된 방법은 (i) VP2 유전자가 변형체 E 균주의 VP2 유전자로 대체되고, (ii) 위치 253, 284 및 330의 코돈을 전술한 바와 같이 변형시킨(실시예 1), 균주 D78(네덜란드에 소재하는 Intervet International B.V.의 시판품) 유래의 키메라 IBDV 균주(D78/변형체 E)의 제조 단계를 포함한다.
기본적으로, 제1 IBDV의 주쇄 분절 A에 있는 에피토프 결정인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도입하는 단계는 실질상 전술한 돌연변이를 도입시키는 단계와 같다. 이것은 게놈 분절 A 및 B의 cDNA를 제공하고, (i) 제1 IBDV의 에피토프 결정인자에 대한 암호 서열을 제2 IBDV의 암호 서열로 대체하거나, 또는 (ii) 제1 IBDV 중의 특정 코돈을 부위 지시성 돌연변이로 변화시키므로써 가장 쉽게 수행할 수 있다. 마지막으로, 이 cDNA 분자의 RNA 전사체를 형질감염된 숙주 세포 중에서 복제 개시시켜 감염성 키메라 IBDV를 얻는다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 최종의 IBDV 돌연변이체가 이 비루스를 약독화시키는 기타 돌연변이를 더 포함하는 전술한 IBDV 돌연변이체 및 이의 제조 방법을 제공한다. 이러한 돌연변이의 예로는 천연 VP5 단백질을 발현할 수 없는 IBDV 돌연변이체를 생성시키는 IBDV 게놈 중 분절 A의 VP5 유전자 중의 돌연변이가 있다. IBDV VP5-돌연변이체의 제조에 대해서는 유럽 특허 출원 887,412호에 개시되어 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 고전적 균주 또는 변형체 E 균주의 VP2 유전자 중에 코돈 253(His) 및 284(Thr), 경우에 따라 330(Arg)을 포함하거나 GLS 균주의 코돈 284(Thr)를 포함하는 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 있는 유전자 조작된 감염성 IBDV 돌연변이체를 제공한다. 이러한 IBDV 돌연변이체는 유전자 조작 기법에 따라 제어된 방식에 의해 도입된 전술한 신규 코돈을 제외하고 CEF 세포 배양물 중에서 복제할 수 없는 활액낭 IBDV의 유전자 정보를 포함한다.
구체적으로, 전술한 변형체 E IBDV 돌연변이체는 각각 위치 318 및 325 상에글리신 및/또는 발린을 보유하지 않는다. 유전자 조작된 변형체 E 돌연변이체는 이들 위치에 각각 아스파르트산 및/또는 메티오닌을 보유하는 것이 가장 바람직하다.
바람직한 양태로서, 본 발명에 따라 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체는 전술한 3가지 신규 코돈을 보유하고, 변형체 E 균주의 VP2 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 IBDV 돌연변이체, 구체적으로 균주 D78 유래의 키메라 IBDV 돌연변이체이다.
본 발명은 시험관내 세포 배양물 중에서 복제하기 힘들었던 IBDV 균주로부터 IBDV 백신을 용이하게 제조할 수 있는 가능성을 제공한다. 본 발명의 또 다른 잇점은 전술한 방법에 의해 제어된 방식으로 더욱 약독화된 IBDV를 얻을 수 있다는 점이다. 이와 같이 약독화된 IBDV 돌연변이체는 IBDV 생백신의 활성 성분으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 IBDV 감염 질환에 대하여 가금류를 예방하는데 사용하기 위한 백신을 제공하는 것이다. 이 백신은 전술한 바와 같이 제조된 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체와 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함한다.
이 IBDV 돌연변이체는 생 약독화 비루스 또는 불활성화 비루스로서 백신 중에 포함될 수 있다.
본 발명에 기재된 백신은, 예컨대 시판되는 생 IBDV 백신 및 불활성화 IBDV 백신에 통상적으로 사용되었던 종래 방법으로 제조할 수 있다. 간략히 설명하면, 본 발명의 IBDV 돌연변이체를 감수성 기질에 접종하고, 이 비루스가 바람직한 감염 역가까지 복제하도록 전파시킨 다음, IBDV 함유 물질을 수거한다.
기질은 IBDV 돌연변이체의 복제를 지지할 수 있는 것이라면 모두 본 발명에 기재된 백신을 제조하는데 사용할 수 있고, 그 예로는 닭 배 섬유아세포(CEF) 또는 닭 배 간 세포(CEL)와 같은 원시(조류) 세포 배양물, VERO 세포주 또는 BGM-70 세포주와 같은 포유동물 세포주, 또는 QT-35, QM-7 또는 LMH와 같은 조류 세포주가 있다. 보통, 세포 접종 후 비루스는 3 내지 10 일 동안 전파시키고, 그 다음 세포 배양 상청액을 수거하고, 필요하다면 여과 또는 원심분리하여 세포 파편을 제거한다.
또는, IBDV 돌연변이체를 부화 계란 중에서 전파시킨다. 구체적으로, 이 IBDV를 전파시키는 기질로는 SPF 부화란이 있다. 부화란에, 예컨대 102TCID50/난 이상을 포함하는 IBDV 돌연변이체 함유 현탁액 또는 균질액을 0.2 ㎖ 접종하고, 이어서 37 ℃에서 접종한다. 약 2 내지 5일 후, 배액 및/또는 막액 및/또는 요막액을 수거한 뒤, 이들을 적절히 균질화하여 IBD 비루스 생성물을 수거할 수 있다. 이 균질액을 2500 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 상청액을 필터(100 ㎛)를 통해 여과한다.
본 발명에 기재된 생 비루스를 함유하는 백신은 현탁제형이나 동결건조형으로 제조 및 판매할 수 있고, 이러한 조성물에 통상적으로 사용되는 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 더 포함한다. 담체로는, 안정화제, 보존제 및 완충액을 포함한다. 적합한 안정화제로는, 예컨대 SPGA, 탄수화물(예, 소르비톨, 만니톨, 전분, 슈크로스, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코스), 단백질(예, 분유 혈청, 알부민또는 카제인) 또는 이것의 분해 산물을 포함한다. 적합한 완충액으로는, 예컨대 알칼리 금속 인산염이 있다, 적합한 보존제로는 티메로살, 머티올레이트 및 젠타마이신이 있다. 희석제로는, 물, 수성 완충액(예, 완충 식염수), 알코올 및 폴리올(예, 글리세롤)이 있다.
필요한 경우, 본 발명에 기재된 생 백신은 보조제를 포함할 수 있다. 보조 활성이 있는 적합한 화합물 및 조성물의 예는 하기 기재되는 바와 같다.
본 발명의 생 백신은 주사, 예컨대 근육내, 경피 주사하여 투여할 수 있지만, IBDV 예방접종에 통상적으로 사용되는 저렴한 집단 투여 기법으로 투여하는 것이 바람직하다. IBDV 예방접종에 사용되는 이러한 기법으로는 음용수 및 분무 예방접종을 포함한다.
또 다른 생백신 투여 방법으로는, 난 투여, 점안 투여 및 부리 침지 투여를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 불활성형 IBDV 돌연변이체를 포함하는 백신을 제공하는 것이다. 불활성 백신의 주요 잇점은 장기간 동안 고농도의 예방 항체가 지속될 수 있다는 점이다.
전파 단계 후 수거한 비루스를 불활성화시키는 목적은 비루스의 복제능을 제거하기 위한 것이다. 일반적으로, 이것은 화학적 수단 또는 물리적 수단에 의해 달성될 수 있다. 화학적 불활성화는 이 비루스를, 예컨대 효소, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 에틸렌이민 또는 이것의 유도체로 처리하여 실시할 수 있다. 필요한 경우, 불활성 화합물은 그후 중화시킨다. 예컨대, 포름알데히드로 불활성화된 물질은 티오설페이트로 중화시킬 수 있다. 물리적 불활성화는 고 에너지 방사선, 예컨대 자외선이나 γ선으로 비루스를 처리하여 실시하는 것이 바람직하다. 처리 후, 필요한 경우에는 pH를 약 7로 조정할 수 있다.
불활성화된 IBDV 돌연변이체를 포함하는 백신은, 예컨대 이 용도에 적합한 전술한 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 1종 또는 복수종 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 기재된 불활성화된 백신은 보조 활성이 있는 1종 또는 복수종의 화합물을 포함하여도 좋다. 이와 같은 목적에 적합한 화합물 또는 조성물로는, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 산화알루미늄, Bayol F(등록상표명) 또는 Marcol 52(등록상표명)와 같은 광유 또는 비타민 E 아세테이트와 같은 식물유를 주성분으로 하는 수중유 또는 유중수 유제 및 사포닌을 포함한다.
본 발명에 기재된 백신은 활성 성분으로 유효량의 IBDV 돌연변이체, 즉 독성 비루스에 의한 공격에 대하여 예방접종된 조류에 면역성을 유도하는 양의 면역화 IBDV 물질을 포함한다. 본 명세서에 기재된 면역성이란, 예방접종되지 않은 군에 비해 예방접종 후의 조류군에서 나타나는 훨씬 높은 레벨의 예방 유도를 의미한다.
일반적으로, 본 발명에 기재된 생백신은 102내지 109의 TCID50감염 투여량50(TCID50)/동물, 바람직하게는 105.0내지 107.0의 TCID50범위의 투여량으로 투여할 수 있고, 불활성화된 백신은 105내지 109의 TCID50/동물의 항원성 등가물을 포함할 수 있다.
불활성화된 백신은 보통 비경구적 투여, 예컨대 근육내 또는 경피 투여하는 것이 일반적이다.
본 발명에 기재된 IBDV 백신은 닭에 효과적으로 사용될 수 있으나, 기타 칠면조, 뿔닭 및 엽조 등의 가금도 상기 백신으로 성공적으로 예방접종될 수 있다. 닭로는 브로일러, 번식용 가축 및 산란용 가축을 포함한다.
본 발명에 기재된 생백신 또는 불활성화된 백신을 투여할 수 있는 동물의 연령은 종래의 생IBDV 백신이나 불활성화된 IBDV 백신을 투여하던 동물의 연령과 같다. 예컨대, 브로일러[모체 유래 항체(MDA)가 없음]는 1일령째 예방접종될 수 있는 반면, 높은 레벨의 MDA를 보유한 브로일러는 2 내지 3 주령째 예방접종되는 것이 바람직하다. 낮은 레벨의 MDA를 보유한 산란용 가축이나 번식용 가축은 1일령 내지 10일령째 예방접종된 후 6주령 내지 8주령 및 16주령 내지 20주령째 불활성화된 백신으로 추가 예방접종될 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 IBDV 돌연변이체 외에도, 가금이나 어류 감염성인 기타 병원균 유래의 1종 또는 복수 면역원을 각각 포함하는 조합 백신을 포함한다.
이 조합 백신은 감염성 기관지염 비루스(IBV), 뉴캣슬 질환 비루스(NDV), 낙란증(EDS) 비루스, 터키 비기관염 비루스(TRTV) 또는 레오비루스를 더 포함하는 것이 바람직하다.
실시예
실시예 1
IBDV 돌연변이체의 작제 및 CEF 세포 배양에서의 그 복제 특성
재료 및 방법
IBDV의 고전적인 변형-E 또는 GLS 균주의 VP2의 가변 영역을 포함하는 (속간) IBDV 플라스미드의 작제
(i) 고전적인 IBDV 균주의 VP2.
D78
다음과 같은 부위 지향성 돌연변이 유발의 선결 조건은 플라스미드 pUC 18의 변형이었다. 이 목적으로 pUC 18은NdeI 및BamH I로 절단하고, 전기 용출시킨 다음, 클리나우 효소로 블런트 단부를 만들고 재결찰하여 pUC18 ΔNdeI-BamH I(pUC18/ΔNB)을 얻었다. 플라스미드 pAD78/EK(Mundt 등, J. Virology 71, 5647-51, 1997)를EcoR I 및KpnI로 절단하여 T7-RNA 폴리머라제 프로모터 부위를 포함하는 혈청형 I 균주 D78의 분절 A의 전길이의 서열을 얻었다. 이 단편을 EcoR I 및 Kpn I으로 절단된 pUC18/ΔNB내로 결찰하여 pD78A/ΔNB(도 1a)를 얻었다. 플라스미드 pD78A/ΔNB를 클로닝 및 부위 지향성 돌연변이 유발 절차의 주쇄로서 사용하였다.
UK661
플라스미드 pD78-E/DEL(하기 참조)을 균주 UK 661의 분절 A의 서열을 보유하는 키메라 플라스미드의 작제에 사용하였다. 비루스 RNA를 침전시킨 후에, 올리고뉴클레오티드 UK661AFor1 및 UK661ARev1(Brown and Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996, 각각 뉴클레오티드 번호 621-644-센스- 및 1201-1223-안티센스)를 사용하여 표준 절차에 따라 역전사 및 PCR을 수행하였다. 생성된 PCR 단편을SmaI-절단된벡터 pUC 18(스웨덴 파마시아)내로 블런트 말단 상태로 클로닝하여 p661Apart를 얻었다. 서열 분석 후에, p661Apart는 뉴클레오티드 647 및 1182(숫자 매김은 균주 P2: NCBI 수탁번호 X 84034의 전길이의 서열에 따름)에서 각각 제한효소NdeI 및SpeI로 절단하여 균주 UK661의 VP2의 가변 영역의 암호 서열을 포함하는 535 bp 단편을 얻었다.NdeI-SpeI로 절단된 pD78-E/DEL내로 결찰 후에, 균주 D78, E/Del 및 UK661의 분절 A의 서열을 보유하는 키메라형의 전길이의 플라스미드 pD78A-E-661이 확립되었다(도 4).
(ii) 변형체-E IBDV의 VP2
IBDV 특이 서열의 치환을 위해, 변형체 E 균주 E/Del의 완전 암호 영역을 함유하는 플라스미드를 사용하였다(pEDEL22BacII, Vakharia, Biotechnology annual review 3, 151-168, 1997). pEDEL22BacII(도 1a)는 균주 P2(NCBI 수탁번호 X 84034)의 전길이 서열에 따라 뉴클레오티드 647 및 1725에서 각각 제한 효소 Nde I 및 Sal I로 절단하여 VP2의 가변 영역의 암호 서열 및 균주 E/Del의 VP4의 서열을 포함하는 1078 bp 단편을 얻었다.NdeI-SpeI로 절단된 pD78A/ΔNB내로 결찰 후에, 균주 D78 뿐만 아니라 E/Del의 분절 A의 서열을 보유하는 키메라형의 전길이의 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/DEL이 확립되었다(도 1a). 플라스미드 pD78/ΔNB 및 pD78A/ΔNB-E/DEL을 부위 지향성 돌연변이 유발에 사용하였다.
(iii) GLS IBDV의 VP2
또한 각각 GLS-B 및 GLS-TC의 가변 영역을 보유하는 한 쌍의 플라스미드를 작제하였다. 초가변 영역의 클로닝을 위해, GLS-TC는 CEF에서 증식시키고, 초원심분리로 정제하였다. GLS-B의 활액낭 균질물은 저속 원심분리로 정제하고, 상청액을 다음 절차에 사용하였다. 프로티나제 K(0.5 ㎎/㎖)/나트륨 도데실설페이트(SDS, 0.5) 분해 비루스 RNA를 정제한 후에, cDNA로 역전사시키고, 올리고뉴클레오티드 A14 및 A44(표 4)를 사용하여 표준 절차에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 증폭 생성물은 블런트 단부 형태로 클로닝하고, 적합한 PCR 단편을 보유하는 플라스미드를 서열 분석하였다. GLS-TC(pGLS-TC) 또는 GLS-B(pGLS-B) 삽입체를 각각 함유하는 플라스미드를 다음 실험에 사용하였다. 속간 분절 A의 작제를 ㅟ해, 전길이의 클론 pD78A/ΔNB-E/Del을 사용하였다. pGLS-TC 및 pGLS-B는 각각SacI 및SpeI로 처리하였다. 이어서, 전기 용출된 단편을 사전에SacI-SpeI로 처리한 pD78A/ΔNB-E/Del에 결찰시켜 각각 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC 및 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B를 얻었다. 두 플라스미드의 플라스미드 지도는 도 1b에 도시되어 있다.
부위 지향적 돌연변이 유발
PCR로 부위 지향적 돌연변이 유발을 수행하였다. 올리고뉴클레오티드는 아미노산 교환 및 추가의 제한효소 절단 부위를 초래하는 돌연변이를 보유하였다(표 4). 플라스미드 pAD78/ΔNB, pD78A/ΔNB-E/Del 및 pD78A-E-661을 각각 사용하는 PCR 증폭 후에, 단편을 블런트 말단 형태로 클로닝하고 서열 분석하였다(pfrag). 돌연변이된 코돈을 보유하는 클론을 다음과 같이 미리 절단된 플라스미드내로 결찰시켰다:
(i) 변형체-E IBDV
돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del의 분절 A의 전길이의 클론의 구축을 위해, 다음 PCR 단편을 얻었다: 프라이머 E/Del-MutQH 및 A14(pfragQH), E/Del-MutAT 및 A14(pfragAT), E/Del-MutSR 및 P21F(pfragSR)를 사용하여 E-Del 서열의 각각 적합한 단일 아미노산 교환 Q253H, A284T 및 S330R을 가진 단편을 얻었다. PfragQH 및 pfragSR은SacI 및SpeI로 절단하고, 미리SacI-SpeI 처리한 pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켜 각각 pD78A/ΔNB-E/DelQH(도 1c) 및 pD78A/ΔNB-E/DelSR(도 1c)을 얻었다. pD78A/ΔNB-E/DelAT(도 1c)를 작제하기 위해, pfragAT를NarI-SpeI로 절단하고, 이어서 미리 절단한 pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켰다. 두 개의 돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드를 얻기 위하여 다음과 같은 PCR을 수행하였다: 프라이머 E/Del-MutQH 및 E/Del-MutSR과 E/Del-MutAT 및 E/Del-MutSR을 pD78A/ΔNB-E/Del상에서 각각 fragQH 및 fragAT-SR의 증폭에 사용하였다. 클로닝 및 서열 분석 후에, pfragQH-SR을SacI-SpeI로 처리하고, 이어서 미리 절단한 pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켜 pD78A/ΔNB-E/DelQH-SR(도 1d)을 얻었다. pD78A/ΔNB-E/DelAT-SR(도 1d)의 작제를 위해, 플라스미드 pfragAT-SR을NarI 및SpeI로 처리하고 동일하게 절단한 pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켰다. 두 개의 아미노산 변화(Q253H; A284T)에 대한 돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드의 작제를 위해, 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/DelAT 및 프라이머 E/Del-MutQH; A14를 사용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 플라스미드 pfragQH-At를SacI-SpeI로 절단하고, pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켜 pD78A/ΔNB-E/DelQH-AT(도 1d)를 얻었다. 모두 3개의 아미노산 변화(Q253H, A284T 및 S330R)에 대한 돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드의 클로닝의 경우, 프라이머 E/Del-MutQH 및 E/Del-MutSR을 pD78A/ΔNB-E/Del-AT상에서 fragQH-AT-SR의 증폭에 사용하였다. Sac I 및 Spe I을 사용하여 pfragQH-AT-SR을 절단한 후에, 용출된 단편을 Sac I 및 Spe I로 절단된 pD78A/ΔNB-E/Del내로 결찰시켜 pD78A/ΔNB-E/DelQH-AT-SR을 얻었다.
(ii) 고전적 IBDV
D78
돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드 pD78A/ΔNB의 분절 A의 전길이의 클론의 구축을 위해, pD78A/ΔNB의NdeI -Hind III 단편을 미리NdeI -Hind III으로 절단한 pUC19내로 서브클로닝하여 다음 절차(pUC19/NH-D78A)에 대한 단일의 제한 효소 부위를 얻었다. 올리고뉴클레오티드 D78-MutHQ 및 A14(pfragHQ), D78-MutTA 및 A14(pfragTA), D78-MutRS 및 P21F(pfragRS)를 PCR 증폭에 사용하여 D78 서열의 적합한 단일 아미노산 변화 H253Q, T284A 및 R330S를 각각 가진 단편을 얻었다. 단편 PfragRS를 Sac I 및 Sty I로 절단하고, pfragTA를 Nar I 및 Sty I로 절단하며, pfragRS를 Sac I 및 Sty I로 절단한 다음, 적당하게 절단한 pUC19/NH-D78A내로 재결찰시켰다. 돌연변이된 코돈을 보유하는 플라스미드 pUC19/NH-D78A를 Nde I 및 Sac II로 절단하고, 적합한 단편을 전기 용출시킨 다음, Nde I 및 Sac II로 미리 절단한 pD78/ΔNB내로 결찰시켜 각각 pD78/ΔNB-HQ, pD78/ΔNB-TA 및 pD78/ΔNB-RS를 얻었다. 모두 3개의 아미노산 변화(H253Q, A284T, R330S)를 초래하는 뉴클레오티드 치환을 보유하는 전길이의 클론의 작제를 위해, 올리고뉴클레오티드 D78-MutHQ, D78-MutRS 및 플라스미드 pD78/ΔNB-TA를 사용하는 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 단편을 블런트 말단 상태로 클로닝하여 pfragHQ-TA-RS를 얻었다. Sac I 및 Sty I로 pfragHQ-TA-RS를 절단한 후에, 전기 용출된 단편을 Sac I 및 Sty I로 절단한 pUC19/NH-D78A내로 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드를 Nde I 및 Sac II로 절단하고, 적합한 단편을 전기 용출시킨 다음, 최종적으로 Nde I 및 Sac II로 미리 절단 pD78/ΔNB내로 결찰시켜 pD78/ΔNB-HQ-TA-RS를 얻었다. 얻어진 돌연변이된 플라스미드의 뉴클레오티드 서열은 서열 분석으로 확인하였다. 서열은 위스콘신 패키지 버젼 8(위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹)을 사용하여 분석하였다. 플라스미드 pD78/ΔNB-HQ, pD78/ΔNB-Ta, pD78/ΔNB-RS 및 pD78/ΔNB-HQ-TA-RS를 도 2에 도시하였다.
UK661
부위 지향성 돌연변이 유발을 위해, 플라스미드 pD78A-E-UK661을 EcoR I/Kpn I로 절단하고, 이어서 분절 A를 보유하는 단편의 전길이의 서열을 EcoR I/ Kpn I로 절단한 플라스미드 벡터 pBS-(스트라타진)내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pBSD78A-E-661을 공지된 방법(Kunkel 등, Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987)에 따라 부위 지향적 돌연변이 유발 실험에 사용하였다. Lim 등의 문헌(1999, 상기 참조)의 결과에 기초하여, 플라스미드 pBSD78A-E-661의 아미노산 279 및 284에 대한 뉴클레오티드 서열은 안티센스 배향된 올리고뉴클레오티드 Mut1(Brown 및 Skinner, 상기 참조; 뉴클레오티드 번호 947-1001, 946-966은 AAC이고, 979-981은 아미노산 치환 D279N 및 A284T를 일으키는 ACG임)을 사용하여 변화시켰다(D279N, A284T). 생성된 플라스미드 pBSD78A-E-661-DN-AT의 적합한 부분을 서열 분석하였다. pBSD78A-E-661-DN-AT의 Nde I/ Spe I 절단 후에, 535 bp 단편을 적합한 절단된 pD78A-E-661내로 결찰하여 pD78A-E-661-DN-AT를 얻었다.
또한, 아미노산 Q253의 뉴클레오티드 서열은 안틴센스 방향의 올리고뉴클레오티드 Mut2(Brown 및 Skinner, 상기 참조; 뉴클레오티드 번호 874-900, 886-888은 아미노산 치환 O253H를 일으키는 CAT임)을 사용하여 H253을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 변화시켰다(D279N, A284T). 생성된 플라스미드 pD78A-E-661-QH는 아미노산 변화 Q253H를 보유하였다. 아미노산 284(A284T)의 교환은 안티센스 방향의 올리고뉴클레오티드 Mu3(Brown 등, 상기 참조; 뉴클레오티드 번호 966-993, 979-981은 아미노산 치환 A284T를 일으키는 ACC임)을 사용하여 수행하여 플라스미드 pD78A-e-661-AT를 생성시켰다. 네번째 플라스미드 pD78A-E-661-QH-AT는 단일 부위 지향적 돌연변이 유발 반응에서 두 개의 올리고뉴클레오티드(Mut2, Mut3)를 사용하여 두 개의 아미노산(Q253H, A284T)의 변화를 보유하였다. 플라스미드 p661Apart, pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT 및 pD78A-E-661-QH-AT를 도 4에 도시하였다.
명칭 뉴클레오티드 서열 방향 아미노산 치환 뉴클레오티드 번호
P21F CGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTC 센스 무 601-622
E/Del-MutQH Sac IGAGAGCTCGTGTTCAAAACAAGCGTCCAtAG 센스 Q253H 861-891
E/Del-MutAT Nar IGGGCGCCACCATCTACCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGGTAATCACCAGAGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGaCCGGCATCGACAATCTTAT 센스 A284T 901-999
E/Del-MutSR Spe ICGTAGGCTACTAGTGTGACGGGACGGAGGGCTCCTGGATAGTTGCCACCATGGATCGTCACTGCTAGGCTCCCcCgTGCCGACCATGACATCTGTTCCCC 안티센스 S330R 1094-1193
D78-MutHQ Sac IGAGAGCTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCAaGG 센스 H253Q 861-891
D78-MutTA Nar IGGGCGCCACCATCTACCTCATAGGCTTTGATGGGACAACGGTAATCACCAGGGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGgCCGGCACCGACAACCTTATG 센스 T284A 901-1000
D78-Mut-RS Sty ICGGAGGGCCCCTGGATAGTTGCCACCATGGATCGTCACTGCTAGGCTCCCaCTTGC 안티센스 R330S 1115-1170
A44 CAAGCCTCAGCGTTGGGGGAGAGC 센스 무 833-866
A14 GATCAGCTCGAAGTTGCTCACCCCA 안티센스 무 1228-1252
a 부위 지향적 돌연변이 유발 및 클로닝에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조성 및 위치. 사용된 제한 효소 부위에는 밑줄을 그었고, 적합한 제한 효소명을 기입하였다. 돌연변이 유발을 위해 변형된 뉴클레오티드는 소문자 ㅇ마호이고, 암호 뉴클레오티드 3문자 코드는 굵은 활자로 표시하였다. 위치는 프라이머가 결합하는 위치(뉴클레오티드 수)이고, 아미노산의 번호는 P2 균주의 알려진 서열(Mundt 및 Muller, 1995, 상기 참조; NCBI 수탁 번호 X 84034)에 따라 매긴 것이다.
분절 B의 전길이 cDNA 클론의 작제
균주 D78
혈청형 I 균주 D78의 전길이 cDNA의 클로닝을 위해, 비루스는 CEF에서 증식시키고, 한외여과에 의해 정제하였다. 균주 D78의 게놈 비루스 RNA를 정제하고, cDNA로 역전사키며, 알려진 올리고뉴클레오티드(Mundt 및 Vakharia, 1996, 상기 참조)를 사용하는 표준 절차에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)로 증폭시켰다. 증폭 생성물은 블런트 말단 형태로 클로닝하고, 적합한 PCR 단편을 보유하는 플라스미드를 서열 분석하였다. T7-RNA 폴리머라제 프로모터의 제어하에 분절 B(pUC18BD78)의 전길이의 cDNA를 보유하는 플라스미드를 얻기 위한 클로닝 절차는 균주 P2의 분절(도 3)에 대해 Mundt 및 Vakharia(1996, 상기 참조)에 의해 기재된 절차에 상응하는 것이었다.
균주 UK661
Brown 및 Skinner의 문헌(1996, 상기 참조)의 서열 정보에서 유래한 올리고뉴클레오티드의 3종의 쌍을 사용하였다:
i) UK661BFor1(올리고뉴클레오티드 B5'-P2에 따른 서열, Mundt 및 Vakharia, 1996, 상기 참조), 안티센스 방향의 UK661BRev1(뉴클레오티드 번호 708-736). 올리고뉴클레오티드 UK661BRev1의 5' 말단은 균주 UK-661의 분절 B의 서열 외에도 노나 서열 5'-CTCTAGAGG를 보유하는 제한 효소 절단 부위 Xba I을 보유하고;
ii) UK661BFor2(뉴클레오티드 번호 751-677), 안티센스 방향의 UK661BRev2(뉴클레오티드 번호 2089-2113). 올리고뉴클레오티드 UK661BRev2의 5' 말단은 균주 UK-661의 분절 B의 서열 외에도 노나 서열 5'-CTCTAGAGG를 보유하는 제한 효소 절단 부위 Xba I을 보유하며;
iii) UK661BFor3(뉴클레오티드 번호 2011-2035), 안티센스 방향의 UK661BRev3(Mundt 및 Muller, 1995, 상기 참조 뉴클레오티드 번호 2804-2827). 올리고뉴클레오티드 UK661BRev3의 5' 말단은 균주 UK-661의 분절 B의 서열 외에도 노나 서열 5'-TCTAGACCC를 보유하는 제한 효소 절단 부위 Xba I을 보유한다. 여기서, 3문자 코드 CCC는 분절 B(뉴클레오티드 번호 2825-2827)의 게놈 서열의 마지막 3개뉴클레오티드와 함께 Sma I 절단 부위를 생성시켰다. RT-PCR중에 이들 3쌍의 올리고뉴클레오티드 UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2, UK661BFor3; UK661BRev3를 사용하여 3종의 cDNA 단편을 증폭시키고, Sma I로 절단한 벡터 pUC18내로 블런트 말단 형태로 클로닝하여 각각 UK661B1, UK661B2 및 UK661B3을 얻었다. 3종의 삽입된 단편을 서열 분석한 후에, UK661B2를 Age I 및 Xba I로 절단하여 1441 bp 단편을 얻고, 이어서 Age I 및 Xba I로 절단한 UK661B1내로 결찰하여 UK661B12를 얻었다. 분절 B의 전길이의 cDNA 클론을 작제하기 위해, UK661B3을 BstB I / Xba I로 절단하고, 얻어진 694 bp의 단편을 BstB I / Xba I로 절단한 pUK661B12내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pB661은 T7 프로모터의 제어하에 균주 UK661의 분절 B의 전길이의 cDNA 서열을 보유하였다. pB661은 도 5에 도시하였다(번호는 상기 Mundt 및 Muller, 1995 문헌의 P2 균주의 서열에 따름).
조직 배양에서 cRNA로부터 비루스의 회수
RNA 플라스미드의 시험관내 전사를 위해, pAD78/ΔNB, pAD78/ΔNB-HQ, pAD78/ΔNB-TA, pAD78/ΔNB-RS, pAD78/ΔNB-HQ-TA-RS, pAD78/ΔNB-E/Del, pAD78/ΔNB-E/Del-QH, pAD78/ΔNB-E/Del-AT, pAD78/ΔNB-E/Del-SR, pAD78/ΔNB-E/Del-QH-AT, pAD78/ΔNB-E/Del-AT-SR, pAD78/ΔNB-E/Del-QH-SR, pAD78/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR 및 pAD78을 BsrGI 또는 Pst I로 절단하여 선형화하였다. 선형화된 DNA의 추가 처리 및 전사는 다음과 같은 두 가지를 예외로 하고는 Mundt 및 Vakharia (1996)의 문허네 기재된 대로 수행하였다: i) 전사 혼합물은 페놀/클로로포름 정제하였고, ii) QM-7 세포는 형질감염 실험에 사용하였다. 형질감염 2일 후에 세포들을 동결/해동하고, 700 x g로 원심분리하여 세포 파편을 제거한 다음, 생성된 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하여 추가로 정제하고 -70℃에서 보관하였다. 면역 형광 연구를 위해 QM-7 세포를 멸균 커버 슬립상에서 증식시켰다.
UK661을 보유하는 RNA 플라스미드의 시험관내 전사를 위해, 분절 A(도 5)를 BsrGI로 절단하여 선형화하였다. 균주 D78의 분절 B를 Pst I로 선형화한 반면에, 균주 UK661의 분절 B를 Sma I로 선형화하였다. 선형화된 DNA 및 전사의 추가 처리를 상기한 바와 같이 수행하였다.
IBDV 항원의 검출
토끼의 항-IBDV 항혈청을 사용하여 간접 면역 형광 분석(IFA) 및 웨스턴 블롯에 의해 IBDV 항원을 검출하였다. IFA의 경우 커버 슬립상에서 증식한 CEF를 형질감염된 QM-7, CEF 및 CAM의 상청액과 함께 항온 배양하고, 계대 배양에 사용하였다. 16 시간 항온 배양한 후에, CEF를 아세톤으로 고정시키고, IFA를 위해 처리하였다. 형질감염 후 IBDV 복제의 검사를 위해, 커버 슬립상에서 증식한 QM-7 세포를 24 시간 또는 48 시간 동안 항온 배양하고, 아세톤으로 고정시킨 다음, IFA를 위해 처리하였다.
결과
속간 cRNA를 사용한 형질감염 실험
형질감염 실험을 위해, 균주 D78의 분절 A(pD78A/ΔNB) 및 속간 분절 A pD78A/ΔNB-E/Del의 전길이의 cDNA 클론을 합성 cRNA 내로 전사시키고, QM-7 세포 뿐만 아니라 CEF 내로 동시에 분절 B(pD78B) 전길이의 cRNA를 사용하여 동시 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에, 세포들을 동결/해동시키고, 생성된 상청액을 CEF 상에서 2회 계대 배양시켰다. CEF를 각 계대 배양에서 감염후 최고 5일까지 항온 배양하였다. 동결/해동 후에, 각 형질감염의 각각의 계대 배양물 뿐만 아니라 각각의 형질감염 상청액을 CEF를 사용하여 IFA에 의해 IBDV 항원에 대해 시험하였다. 형질감염 실험을 3회 반복하였다. 균주 D78r의 생성을 초래하는 pAD78ΔNB와 함께 플라스미드 pD78B로부터 cRNA의 형질감염 후에 비루스가 생성되었다. 대조적으로, pD78A/ΔNB-E/Del 및 pD78B로부터 cRNA를 사용하는 형질감염 실험 후에, 조직 배양 감염성 비루스를 분리할 수 있다. 형질감염 이후에 복제가 수반되는 지를 분석하기 위해, 형질감염은 커버 슬립 상에서 증식하는 QM-7 세포를 사용하여 수행하였다. 두 경우 모두 비루스 항원은 IFA를 사용한 형질감염 24 시간 후에 검출되었다. 따라서, 본 발명자들은 비루스 복제가 두 경우 모두 일어났으나, D78r의 경우에만 조직 배양 감염성 IBDV를 생성시킬 수 있음을 입증하였다.
돌연변이된 cRNA를 사용한 형질감염 실험
서열 비교 결과를 기초로, 다수의 상이한 돌연변이된 전길이의 cDNA 클론을 부위 지향적 돌연변이 유발에 의해 확립하였다.
(i) 변형체-E IBDV
모든 가능한 7종의 조합(표 5)에서 위치 253, 284 및 330에서 aa 산 치환을 보유하는 pD78A/ΔNB-E/Del의 돌연변이된 플라스미드가 생성되었다. 형질감염 실험 및 계대 배양은 CEF 및 QM-7 세포상에서 동시에 3회 수행하였다. 얻어진 상청액을 IFA로 감염성에 대해 분석하였다. 플라스미드의 cRNA의 형질감염 후에, pD78B QM-7세포 또는 CEF 감염성 비루스의 cRNA와 함께 pD78A/ΔNB-E/Del, pD78A/ΔNB-E/Del-QH, pD78A/ΔNB-E/Del-AT, pD78A/ΔNB-E/Del-SR, pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR 및 pD78A/ΔNB-E/Del-QH-SR을 분리할 수는 없었다. pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT 또는 pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR로부터 얻은 cDNA의 형질감염은 감염성 비루스(D78A-E/Del-QH-AT 및 D78A-E/Del-QH-AT-SR)의 생성을 초래하였다. 특이성은 CEF 뿐만 아니라 QM-7 세포상에서 IFA로 확인하였다. 이것은 IBDV의 VP2가 조직 배양 감염에서 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다. 아미노산 치환 (BU) Q-253-H(TC) 및 (BU) A-284-T(TC)이 필수적이고, 사용된 조직 배양에 대해 감염성인 IBDV를 생성시키기에 충분하였다. 3종의 아미노산 치환(D78/변형체-E CEF를 변형시킨 것)을 가진 IBDV 돌연변이를 추가의 실험(실시예 2)에 사용하였다.
(ii) 고전적인 IBDV
D78
상기 결과를 확인하기 위하여, 부위 지향적 돌연변이 유발용 pAD78/ΔNB를 사용하여 제2 세트의 플라스미드를 작제하여 단일의 aa(pAD78/ΔNB-HQ, pAD78/ΔNB-TA, pAD78/ΔNB-RS) 또는 모두 3개의 aa(pAD78/ΔNB-HQ-TA-RS)의 치환을 보유한 플라스미드를 얻었다. 이들 4종의 플라스미드를 상기한 바와 같이 pD78B와 함께 형질감염 실험에 사용하였다. 감염성 IBDV는 IFa로 검출되는 pAD78/ΔNB-RS로부터 cRNA를 형질감염시킨 후에 생성시킬 수 있다. 즉, aa 330은 생성된 비루스가 조직 배양을 감염시키는 능력에 아무런 영향을 끼치지 않았다.
모든 작제물은 IFA로 형질감염 후에 복제에 대해 시험하였다. IBDV 항원은형질감염 24 시간 및 48 시간 후에 특이적으로 검출할 수 있는데, 이는 세포질내에 전형적인 대형의 집중적으로 염색된 응집물의 존재를 나타내는 것이다.
UK661
형질감염 실험을 위해, 키메라 분절 A pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT 및 pD78A-E-661-QH-AT의 전길이의 cDNA 클론을 합성 cRNA내로 전사시키고, 균주 D78의 분절 B 또는 균주 UK661의 전길이의 cRNA의 분절 B를 사용하여 CEC 내로 뿐만 아니라 QM-7 세포 내로 동시에 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에 세포들을 동결/해동시키고 생성된 상청액을 CEC 상에서 한번 계대 배양하였다. 감염 24 또는 48 시간 후에 CEC를 항온 배양하고, 고정시키고 면역 형광 처리를 하였다. CEC에 대해 감염성인 비루스는 키메라 IBDV D78A-E-661-QH-AT를 생성시키는 pD78B 및 pB661과 함께 플라스미드 pD78A-E-661-QH-AT로부터 cRNA의 형질감염 후에 생성되었다. 대조적으로, pBD78 또는 pB661에서 유래한 RNA와 함께 pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT에서 유래한 cRNA를 사용하는 형질감염 실험 후에는, 조직 배양 감염성 비루스는 분리할 수 없었다. 감염 72 시간 후에 형질감염 상청액을 항온 처리하면, 단일의 감염된 CEF가 D78-E-661-DN-AT의 경우에 검출할 수 있다.
(iii) GLS IBDV
속간 플라스미드 뿐만 아니라 돌연변이된 플라스미드를 사용하는 형질감염 실험 결과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 IBDV 균주의 자연 발생쌍을 이용하였다. 활액낭에서 유래한 GLS 균주(GLS-B) 및 조직 배양 적응된 변형체 GLS-TC의 VP2의 가변 영역을 증폭시키고, 클로닝한 다음, 분석하였다. pGLS-B 및 pGLS-TC로부터 얻은 두 GLS-균주의 아미노산 서열을 비교한 결과 두 서열 사에의 위치 284[(GLS-B) A→T (GLS-TC)에서 하나의 아미노산 변화가 나타났다(도 1b). 아미노산 253(Q) 및 330(S)은 상기한 바와 같이 BU 그룹의 아미노산과 동일하였다. 위치 284(A→T)의 변화가 감염성 비루스의 생성에 충분한 지 여부를 분석하기 위하여, 두 GLS 변형체의 VP2의 초가변 영역을 보유하는 두 플라스미드(pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC 및 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B)를 작제하였다. pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC 및 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B의 cRNA를 CEF 뿐만 아니라 QM-7 세포내로 pBD78의 cRNA와 배합하여 동시에 형질 감염시켰다. 상청액의 계대 배양 후에, pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC의 cRNA의 형질감염 후 CPE 뿐만 아니라 IFA로 조직 배양 감염성 비루스를 검출할 수 있었다. 몇 가지 시도에서 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B로부터 cRNA의 형질감염은 조직 배양 감염성 IBDV를 보유하는 상청액을 생산하지 못했다. 두 플라스미드 pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC 및 pD78A/ΔNB-E/Del-GLSB의 시험관내 전사/해독은 다단백질의 완전한 가공을 나타냈다. pD78B에서 유래한 cRNA와 함께 두 플라스미드의 cRNA의 형질 감염 후에 비루스 항원을 IFA로 검출하였다. 따라서, 두 키메라는 복제능이 있는 것으로 입증되었다. 이와 함께 위치 284에서의 단일의 아미노산 변화를 초래하는 VP2의 초가변 영역의 교환은 감염성 속간 IBDV를 생성시키기에 충분하였다.
아미노산 치환을 보유하는 IBDV 분절 A의 속간 전길이의 cDNA 클론의 요약
플라스미드a aab253 aa 284 aa 330 조직 배양
형질감염c 계대 배양d
pD78A/ΔNB-E/Del Q A S + -
pD78A/ΔNB-E/Del-QH H A S + -
pD78A/ΔNB-E/Del-AT Q T S + -
pD78A/ΔNB-E/Del-SR Q A R + -
pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT H T S + +
pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR Q T R + -
pD78A/ΔNB-E/Del-QH-SR H A R + -
pD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SR H T R + +
pD78A/ΔNB H T R + +
pD78A/ΔNB-HQ Q T R + -
pD78A/ΔNB-TA H A R + -
pD78A/ΔNB-RS H T S + +
pD78A/ΔNB-HQ-TA-RS Q A S + -
pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TC Q T S + +
pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-BU Q A S + -
a 플라스미드는 조직 배양에 적응된 혈청형 I 균주 D78의 분절 A의 전길이의 cDNA클론에 기초한 것임. 활액낭에서 유래한 혈청형 I 균주 GLS-BU, 델라웨어 E(E/Del) 및 조직 배양에 적응된 혈청형 I 균주 GLS-TC의 서열은 D78 서열로 대체하였다.b 아미노산(aa)의 번호는 P2 균주의 공개된 서열에 따른 것이다(Mundt 및 Muller, 1995 상기 참조; NCBI 수탁 번호 X 84034). 자연 발생적 아미노산은 이탤릭체로 나타냈고, 변화된 아미노산은 굵은 글씨로 나타냄.c QM-7 세포 뿐만 아니라 병아리 배 세포(CEF)를 형질감염 실험에 사용하였다. IBDV항원은 형질감염 24 시간 후에 토끼의 항-IBDV 혈청(Mundt 등, 1995)을 사용하여 간접 면역형광법으로 검출하였다. 항원 양성(+), 항원 음성(-).d CEF는 형질감염 상청액의 계대 배양에 사용하였다. IBDV 항원은 CEF 상에서의 계대 배양 후에 토끼의 항-IBDV 혈청(Mundt 등, 1995)을 사용하여 간접 면역형광법으로 검출하였다. 항원 양성(+), 항원 음성(-).
실시예 2
CEF 적응된 변형체-E IBDV 돌연변이체의 생물학적 성질
재료 및 방법
IBDV 백신의 제조
키메라 D78/변형체-E(활액낭 적응된 것)
9 내지 12일령의 SPF 난을 강하된 코리온 알란토인산 막(CAM) 경로를 통해 키메라 D78/변형체-E/D78(Q253H, A284T 및 S330R에서 3종의 아미노산 교환 없는 D78/변형체-E/D78)로 형질감염시켰다. 감염 5일 후에, CAM 및 배를 수집하고 균질화하였다. 균질물을 CAM 상에서 적정하였다. 상청액을 희석하여 점안액 경로를 통해 도포하기 위해 102.0EID50/동물의 백신 투여량을 산출하였다.
키메라 D78/변형체-E(CEF 적응된 것)
1차 병아리 배 섬유아세포(CEF)를 최종 농도 2 x 106/㎖로 제조하였다. 세포들을 5태내 송아지 혈청을 함유하는 이글 최소 기본 배지에서 배양하였다. 이 세포 현탁액 15 ㎖에 1 ㎖에 용해된 IBDV(Q253H, A284T 및 S330R에서 3종의 아미노산 교환을 보유한 D78/변형체-E/D78) 비루스 0.1 ㎖를 첨가하였다. 37℃의 고습 항온기에서 3일 내지 6일 동안 항온 배양한 후에, 상청액을 희석하여 점안액 또는 근육내 주사 경로로 사용하기 위해 105.3또는 103.5TCID50/동물의 백신 투여량을 산출하였다.
시판되는 고전적 IBDV 백신 노빌리스 균주 D78
이 백신을 희석하여 점안액 경로용으로 103.3TCID50/동물의 백신 투여량을 산출하였다.
패널 시험에 의한 IBDV 백신의 확인
상이한 단일클론 항체를 사용하여 Van Loon 등의 문헌[Van Loon, A.A.W.M., D. Lutticken 및 D.B. Snyder. Rapid quantification of infectious bursal disease(IBD) challenge, field or vaccine virus strains. Internatioanl symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anemia,Rauischhilzhausen, Germany, 179-187, 1994]의 방법에 따라 ELISA에 의해 두 IBDV 균주를 동정하였다.
CEF 상에서의 증식
두 IBDV 균주를 사용하여 CEF를 감염시켰다. IBDV에 대해 특이적인 CPE(세포 변성 효과)의 유도를 6일 동안 현미경으로 검사하였다.
백신 접종
상이한 백신의 효과는 백신 접종 14일 후에 재투여 비루스(독성 IBDV 균주 변형체-E)를 투여하여 얻은 재투여에 대한 내성의 측정으로 평가하였다. 키메라 백신 D78/변형체-E(활액낭 적응된 것) 102.0EID50/동물을 2주령에서 점안 경로를 통해 적용하였다. 키메라 백신 D78/변형체-E(CEF 적응된 것) 105.5또는 103.5TCID50/동물을 2주령에서 점안 경로 또는 근육내 경로를 통해 적용하였다. 시판되는 고전적인 백신 노빌리스 균주 D78(네덜란드 인터벳 인터내셔널) 103.3TCID50/동물을 2주령에서 점안 경로를 통해 적용하였다. 파브리셔스의 활액낭의 존재 및 군당 5 마리의 동물의 활액낭에서 현미경적 병변의 존재를 백신 접종 3일, 7일, 10일 및 13일 후에, 그리고 재투여 3일 후에 조사하였다. 재투여에 대한 보호를 측정하였다.
결과
패널 시험에 의한 IBDV 백신의 확인
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 키메라 D78/변형체-E(활액낭 적응된 것) 및키메라 D78/변형체-E(CEF 적응된 것)는 상이한 MCA를 가진 동일한 반응 패턴을 가진다. 이것은 3종의 아미노산 변화가 상이한 MCA에 의해 측정되는 바와 같이 비루스상에 존재하는 에피토프에 영향을 미치지 않음을 의미한다. 고전적인 시판 백신은 상이한 MCA를 가진 상이한 반응 패턴을 가진다.
상이한 MCA를 가진 상이한 IBDV 비루스의 패널 패턴(+는 에피토프가 비루스상에 존재함을, -는 에피토프가 비루스상에 존재하지 않음을 나타냄)
비루스/MCA B29 8 R63 BK9 67 57 B69
키메라 D78/변형체-E(활액낭) + + + + + - -
키메라 D78/변형체-E(CEF) + + + + + - -
노빌리스 균주 D78 + + + - - - +
대조군 IBDV 균주
고전적 + + + - - - +
변형체-E + + + + + - -
GLS + + - - - + -
CEF 상에서의 증식
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 키메라 D78/변형체-E(활액낭)는 CEF 상에서 증식할 수 없다. 키메라 D78/변형체-E(CEF) 및 고전적 시판 백신 노빌리스 균주 D78은 둘다 CPE를 포함하는 CEF 상에서 복제할 수 있다.
CEF 상에서 증식하는 능력 및 특이 IBDV-CPE의 유도(+는 CEF 상에서 CPE를 유도하고, -는 CEF 상에서 CPE를 일으키지 않음)
비루스 CEF 증식
키메라 D78/변형체-E(활액낭) -
키메라 D78/변형체-E(CEF) +
노빌리스 균주 D78 +
백신 접종 3일, 7일, 10일 및 13일 후에 및 재투여 3일 및 10일 후에 활액낭에서 평균 현미경 병변 수치
결과를 표 8에 나타낸다. 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 비-CEF 적응된 균주 키메라 D78/변형체-E(활액낭)은 독성이 있고, 백신 접종 7일 후에 이미 완전한 림프구 고갈을 유도한다. 대조적으로, 조직 배양 적응된 균주 D78/변형체-E(CEF)는 백신 접종 후에 병변을 유도하지 않는다. 시판 백신은 백신 접종 후에 약한 병변 내지 보통의 병변을 유도한다. 개개의 데이터는 키메라 D78/변형체-E(활액낭) 또는 D78로 백신 접종된 동물이 재투여에 대해 보호되었음을 나타냈다. 안내 또는 근육내 경로를 통해 D78/변형체-E로 백신 접종된 동물은 또한 재투여 3일 후에 보호를 산출하였지만, 독성의 모균주에 의해 유도된 것보다는 더 적은 보호였다.
평균 활액낭 병변값
백신 접종후 일수 재투여후 일수
비루스 3 7 10 13 3 10
D78/변형체-E/D78 3.2 5.0 5.0 5.0 4.4C 4.7
D98/VP5+(oc) 0 0 0 0 3.0A 4.1
D98/VP5+(im) 0 0 0 0 1.0A 2.8
노빌리스 균주 D78 0.2 2.2 2.0 1.8 2.8C 1.9
백신 접종하지 않은 대조군 5.0A
(oc)= 안내 경로; (im)= 근육내 경로; C= 만성 병변; A= 급성 병변
본 발명에 의해 감염된 조류의 활액낭에서만 생체내 생육하는 IBDV 분리물을 세포 배양물에서 생육하도록 적응시킬 수 있다. 본 발명에 의해 IBDV 게놈 중의 돌연변이를 제어된 방식으로 도입시켜 약독화된 IBDV 돌연변이체를 제조할 수도 있다. 또한, 본 발명에 의하면 세포 배양물 중에서 생육할 수 있도록 허용하는 적당한 아미노산 잔기를 포함하는 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체를 얻을 수 있다.

Claims (10)

  1. CEF 세포 배양물에서 복제할 수 있는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법으로서,
    (i) CEF 세포 배양물에서 복제할 수 없는 IBDV의 게놈 분절 A 및 B의 cDNA를 포함하는 DNA 작제물을 별도로 제조하는 단계,
    (ii) a) 변형체 E 또는 고전적 IBDV 균주의 VP2 유전자 중 아미노산 잔기 253 및 284를 암호하는 1개 또는 복수의 코돈 또는 b) GLS IBDV 균주의 VP2 유전자 중 아미노산 잔기 284를 암호하는 코돈에 돌연변이를 도입시켜, 돌연변이된 VP2 유전자의 아미노산 잔기 253 및 284을 암호하는 코돈이 변형체 E 또는 고전적 IBDV 균주의 경우 각각 히스티딘과 트레오닌 잔기를 암호하도록, 또는 돌연변이된 VP2 유전자의 아미노산 잔기 284를 암호하는 코돈이 GLS IBDV 균주의 경우 트레오닌 잔기를 암호하도록 유도하는 단계,
    (iii) 분절 A 및 분절 B를 포함하는 cDNA의 RNA 전사체를 이용하여 배양액내의 숙주 세포 중에서 IBDV 돌연변이체의 복제를 개시시키는 단계,
    (iv) 배양액으로부터 IBDV 돌연변이체를 분리하는 단계
    를 포함하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, CEF 세포 배양물에 적응된 IBDV 돌연변이체가 세린, 아르기닌 또는 리신, 바람직하게는 VP2 단백질의 위치 330 상의 아미노산 잔기인 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 돌연변이가 고전적 또는 변형체-E IBDV의 VP2 유전자의 모든 코돈 253, 284 및 330에서 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 돌연변이가 코돈 253(Gln), 284(Ala) 및 330(Ser)에서 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 하나의 항에 있어서, 합성 RNA 전사체가 돌연변이된 분절 A 및 분절 B를 포함하는 cDNA로부터 제조한 다음, 합성 RNA 전사체로 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 특징으로 하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 하나의 항에 있어서, 키메라 IBDV를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 IBDV 돌연변이체의 제조 방법.
  7. 아미노산 253(His) 및 284(Thr)와, 경우에 따라서는 고전적 또는 변형체-E IBDV의 VP2 유전자내 330(Arg)에 대한 코돈 또는 GLS IBDV의 VP2 유전자내 아미노산 284(Thr)에 대한 코돈을 포함하여 CEF 세포 배양물에서 복제할 수 있는 유전자 조작된 감염성 IBDV 돌연변이체.
  8. 제7항에 있어서, 키메라 IBDV 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 감염성 IBDV 돌연변이체.
  9. 제7항에 있어서, 돌연변이체가 D78/변형체-E(CEF 적응된 것)인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 감염성 IBDV 돌연변이체.
  10. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 따라 제조된 유전자 조작된 IBDV 돌연변이체를 약학적 허용 담체 또는 희석제와 함께 포함하여 IBDV 감염에서 기인하는 질병에 대한 가금류의 보호에 사용하는 용도의 백신.
KR1020000010849A 1999-03-05 2000-03-04 유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병비루스(ｉｂｄｖ) 돌연변이체 KR100709077B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99200647.8 1999-03-05
EP99200647 1999-03-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010069175A true KR20010069175A (ko) 2001-07-23
KR100709077B1 KR100709077B1 (ko) 2007-04-19

Family

ID=8239949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000010849A KR100709077B1 (ko) 1999-03-05 2000-03-04 유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병비루스(ｉｂｄｖ) 돌연변이체

Country Status (14)

Country Link
US (2) US6492148B1 (ko)
EP (1) EP1035203B1 (ko)
JP (2) JP4675447B2 (ko)
KR (1) KR100709077B1 (ko)
AT (1) ATE266097T1 (ko)
BR (1) BR0001011B1 (ko)
CA (1) CA2298956C (ko)
DE (1) DE60010358T2 (ko)
DK (1) DK1035203T3 (ko)
ES (1) ES2220333T3 (ko)
HU (1) HU226254B1 (ko)
PL (1) PL198981B1 (ko)
PT (1) PT1035203E (ko)
ZA (1) ZA200001069B (ko)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL136232A0 (en) * 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
EP1421222A4 (en) * 2001-03-09 2004-07-07 Univ California CELL CULTURE SYSTEM FOR SYNTHESIS OF HEPATITIS C INFECTIOUS VIRUS
US20050014201A1 (en) * 2001-10-25 2005-01-20 Mordechai Deuthsch Interactive transparent individual cells biochip processor
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
US8597597B2 (en) 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US7888110B2 (en) 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
EP1654347B1 (en) * 2003-06-26 2014-06-04 Seng Enterprises Limited Improved materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chip coats, processed cell-chips and uses thereof
US7982751B2 (en) * 2003-07-11 2011-07-19 The University Of North Carolina Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop
US20050064524A1 (en) * 2003-08-11 2005-03-24 Mordechai Deutsch Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same
US7544805B2 (en) * 2004-02-03 2009-06-09 Chemagis Ltd. Stable amorphous forms of montelukast sodium
EP1763665A1 (en) * 2004-07-07 2007-03-21 Seng Enterprises Limited Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
US7403647B2 (en) * 2004-09-13 2008-07-22 Seng Enterprises Ltd. Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
EP1781404A2 (en) * 2004-08-25 2007-05-09 Seng Enterprises Limited Method and device for isolating cells
US8038964B2 (en) 2005-01-25 2011-10-18 Seng Enterprises Ltd. Device for studying individual cells
DE102005034043B4 (de) * 2005-07-18 2019-12-12 Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt Gemisch, enthaltend L-Carnitin und Trehalulose, sowie Produkt enthaltend das Gemisch
US20070141555A1 (en) * 2005-10-11 2007-06-21 Mordechai Deutsch Current damper for the study of cells
US8288120B2 (en) 2005-11-03 2012-10-16 Seng Enterprises Ltd. Method for studying floating, living cells
US20060223999A1 (en) * 2006-05-10 2006-10-05 Chemagis Ltd. Process for preparing montelukast and precursors thereof
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
EP2237887A2 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
EP2407534A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
CN102258777B (zh) * 2011-06-30 2012-09-26 河南农业大学禽病研究所 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法
CN111235117B (zh) * 2020-02-13 2021-08-27 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5788970A (en) * 1994-03-29 1998-08-04 The University Of Maryland College Park Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon
US5871744A (en) * 1996-09-05 1999-02-16 University Of Maryland-Biotechnology Inst. Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts

Also Published As

Publication number Publication date
PL338773A1 (en) 2000-09-11
ZA200001069B (en) 2000-10-20
CA2298956C (en) 2009-12-01
KR100709077B1 (ko) 2007-04-19
PL198981B1 (pl) 2008-08-29
DK1035203T3 (da) 2004-08-30
EP1035203B1 (en) 2004-05-06
JP2000312593A (ja) 2000-11-14
HU226254B1 (en) 2008-07-28
HUP0000992A2 (hu) 2000-11-28
BR0001011A (pt) 2001-07-03
JP4675447B2 (ja) 2011-04-20
DE60010358T2 (de) 2004-09-23
JP2011036255A (ja) 2011-02-24
HUP0000992A3 (en) 2005-06-28
PT1035203E (pt) 2004-08-31
US6569422B1 (en) 2003-05-27
HU0000992D0 (en) 2000-05-28
ATE266097T1 (de) 2004-05-15
BR0001011B1 (pt) 2011-05-17
ES2220333T3 (es) 2004-12-16
CA2298956A1 (en) 2000-09-05
US6492148B1 (en) 2002-12-10
DE60010358D1 (de) 2004-06-09
EP1035203A1 (en) 2000-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100709077B1 (ko) 유전자 조작된 세포 배양물에 적응된 감염성 활액낭 질병비루스(ｉｂｄｖ) 돌연변이체
JP4670025B2 (ja) 合成ｒｎａ転写物からのビルナウイルスの生成方法
US6274147B1 (en) Method for generating nonpathogenic infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from synthetic RNA transcripts
US6231868B1 (en) Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts
JP4316025B2 (ja) 組換えビルナウイルスワクチン
EP0887412B1 (en) Recombinant birnavirus vaccine
KR101085310B1 (ko) 감염성 점액낭병 바이러스 돌연변이체 및 백신
KR100759769B1 (ko) 광범위한 감염성 활액낭 질병 바이러스 백신
KR102421249B1 (ko) 국내 분리 미주형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물
EP1170302B1 (en) Infectious bursal disease virus vaccines
KR102421251B1 (ko) 국내 분리 중국형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물
WO2001092486A1 (en) Serotype chimeric ibdv strains
EP1074614B1 (en) A recombinant Newcastle disease virus for in ovo vaccination
MXPA00002278A (en) Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal diseases virus (ibdv) mutants

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
N231 Notification of change of applicant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120329

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130329

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160330

Year of fee payment: 10

LAPS Lapse due to unpaid annual fee