HU226254B1 - Genetically engineered cell culture adapted infections bursal diseases virus (ibdv) mutants - Google Patents
Genetically engineered cell culture adapted infections bursal diseases virus (ibdv) mutants Download PDFInfo
- Publication number
- HU226254B1 HU226254B1 HU0000992A HUP0000992A HU226254B1 HU 226254 B1 HU226254 B1 HU 226254B1 HU 0000992 A HU0000992 A HU 0000992A HU P0000992 A HUP0000992 A HU P0000992A HU 226254 B1 HU226254 B1 HU 226254B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ibdv
- mutant
- cef
- pd78a
- cell culture
- Prior art date
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 58
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 43
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 58
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 title description 3
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims description 183
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 51
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 37
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 36
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 26
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 22
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 9
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 claims 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 28
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 23
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 4
- 208000015636 celiac disease-epilepsy-cerebral calcification syndrome Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- -1 threonine amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N His-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FCPSGEVYIVXPPO-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N His-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UWSMZKRTOZEGDD-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N His-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YOSQCYUFZGPIPC-PBCZWWQYSA-N 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000034493 Mucous membrane disease Diseases 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101150082826 Segment-2 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100194052 Thogoto virus (isolate SiAr 126) Segment 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150042119 VP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046862 Vaccination failure Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical class O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás góntechnológiailag módosított, CEF-sejttenyészetben replikálódni képes, fertőző IBDV-mutáns, valamint ilyen IBDV-mutánst tartalmazó vakcina előállítására.
A találmány szerinti megoldás alkalmas szárnyasok IBDV-fertőzés okozta megbetegedésekkel szembeni védelmére.
A fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa (IBDV) a Birnaviridae-család tagja. A családhoz tartozó vírusoknak nagyon hasonló a genomi szerveződésük és hasonló a replikációs ciklusuk. Ezen vírusok genomjai dupla szálú (ds) RNS 2 szegmenséből állnak (A és B). A nagyobb A-szegmens egy polifehérjét kódol, amely autoproteolízissei hasad, az alábbi érett, természetes vlrusfehérjéket kialakítva: VP2, VP3 és VP4. A VP2 és a VP3 a virion fő strukturális fehérjéi. A VP2 a birnavírusok gazdaszervezetet védő, fő immunogénje, és semlegesítő ellenanyagok indukciójáért felelős, antigenikus régiókat tartalmaz. Úgy tűnik, hogy a VP4-fehérje vlruskódolt proteáz, és a VP2-, VP3- és VP4-fehérjék prekurzor-polifehérjéinek érésében játszik szerepet. A nagyobb, A-szegmens egy másik nyitott leolvasási fázissal (ORF) is rendelkezik, amely megelőzi és részlegesen átfed a polifehérjegénnel. Ez a másik nyitott leolvasási fázis egy ismeretlen funkcióval rendelkező VP5-fehérjét kódol, amely jelen van IBDV-fertőzött sejtekben. A kisebb, B-szegmens VP1-et kódol, amely 90 kDa méretű, polimeráz- és „cappíng”-enzimaktivitásokkal rendelkező, multifunkcionális fehérje.
Az IBDV két szerotípusa létezik, az 1. és 2. szerotipus. A két szerotípust vírusneutralizációs (VN) tesztek alkalmazásával lehet megkülönböztetni. Továbbá izolálták az 1. szerotípushoz tartozó altípusokat. Az 1. szerotípus ezen úgynevezett „variáns”-vírusait keresztneutralizációs tesztek alkalmazásával lehet azonosítani, monoklonális ellenanyagpanellel vagy RT-PCR-el. Az IBDV 1. szerotípusának ezen altípusait már szintén leírták az irodalomban, például: klasszikus, E-variáns, GLS-, RS593- és DS326-törzs [Van Loon és munkatársai, „Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia”, Rauischolzhausen, Germany, 179-187. old. (1994)].
A fertőző nyálkatömlő-betegség (IBD), melyet Gumboro-féle betegségnek is hívnak, akut, nagymértékben járványos vírusfertőzés limfoid szövettel rendelkező csirkékben, amely limfoid szövet a fertőzés elsődleges célpontja, a fertőzés szelektív tropizmussal rendelkezik Fabricius-nyálkatömlő (bursa Fabricii) sejtjeire. A megbetegedés aránya erre érzékeny állományban magas, gyors tömegvesztéssel és mérsékelt pusztulási aránnyal jár. A betegségből felgyógyult csirkék immunhiányosak lehetnek a Fabricius-nyálkatömlő károsodása miatt, amely létfontosságú a csirke védekezési mechanizmusához. Az IBD-vírus súlyos immunszuppressziót okoz 3 hétnél fiatalabb csirkékben, és nyálkatömlő-károsodásokat indukál 3 hónaposnál idősebb csirkékben.
A betegséget évek óta úgy lehet megelőzni, hogy nagy mennyiségű ellenanyagot indukálnak tenyésztett állományban inaktivált vakcina alkalmazásával olyan csirkékben, amelyeket korábban már szenzibilizáltak legyengített, élő IBDV-vakcinával. Ez az IBD által okozott gazdasági veszteséget minimumon tartotta. A vakcinával kezelt tenyészállatokból származó anyai ellenanyagok csirkékben megakadályozták a korai IBDVfertőzést és megszüntették az immunszuppresszióval asszociált problémákat. Továbbá legyengített, élő vakcinákat sikeresen alkalmaztak nagyüzemi csirketenyészetben azt követően, hogy az anyai ellenanyagok mennyisége lecsökkent.
A közelmúltban nagyon virulens IBDV-törzsek által okozott betegség nagymértékű pusztulási aránnyal járt Európában. A jelenleg alkalmazott vakcinációs programok nem védték meg a csirkéket kielégítően. A vakcinációs sikertelenségek főleg annak tulajdoníthatók, hogy az élő vakcinákkal nem voltak képesek megfertőzni a madarakat, mielőtt a virulens, természetben előforduló vírusok megjelentek.
Ezért állandó igény van a meglévő vakcinák javítására és új típusú vakcinák kifejlesztésére. Élő vakcinák kifejlesztéséhez legyengített formájú IBV-vírusokra van szükség. Ezt hagyományosan természetben előforduló IBDV-izolátumok megfelelő szubsztrátra való sorozatos passzálásával lehet elérni. Inaktivált IBDV-vakcinák kifejlesztéséhez megfelelő szubsztrátra van szükség nagy mennyiségű IBDV-antigéntömeg előállítása céljából, amelyet az IBD-vírusok szubsztráton való felszaporítása eredményez.
Ismeretes, hogy a természetben előforduló IBDV-k könnyen szaporíthatok in vivő megfertőzött madarak nyálkatömlőjében vagy embrionizált tojásokban. Azonban, bár leírtak néhány IBDV-törzs szaporításának sikeres adaptációját in vitro csirkeembrió-eredetű sejttenyészetre, általában elfogadott tény, hogy megfertőzött nyálkatömlőből izolált, természetben előforduló IBDVtörzs többsége, különösen az úgynevezett virulens vagy nagyon virulens IBDV-törzsek nem adaptálhatók csirkeembrió-eredetű sejttenyészetre, például csirkeembrióból származó fibroblasztokra (CEF) vagy más szervekből, például veséből és májból származó sejtekre [Brown és munkatársai, J. Gén. Virology 75, 675-680 (1994); van Loon és munkatársai, mint fent (1994)].
Az in vivő tenyészetszubsztrátok hátrányai nyilvánvalóak. Ilyen tenyésztési eljárások az állatok számára barátságtalanok, sok állatra van szükség, néha időigényesek és nem lehet azokat standardizált és szigorúan ellenőrzött körülmények között végrehajtani.
Továbbá korlátozott számú IBDV-törzs, amelyeket könnyen lehet adaptálni in vitro sejttenyészetben alkalmazott szubsztrátokra, azzal a hátránnyal rendelkezik, hogy az IBDV-törzsek adaptálásához vezető, sorozatos passzálási eljárások eredményeképpen random mutációkat visznek be kontrollálatlan módon a virusgenomjába. Ilyen mutációk befolyásolhatják a vírus olyan tulajdonságait, amelyek nem asszociáltak a vírusnak a sejttenyészethez való adaptálásával, például a vírus immunogenitásával összefüggő tulajdonságait. Ilyen további, random mutációk nemkívánatosak.
HU 226 254 Β1
IBDV-k adaptációja a vírus in vitro CEF-sejttenyészetbe való passzálásával a virulencia gyengülésével társult, melyet a vírus megfertőzött madarak nyálkatömlőjére kifejtett, károsodást indukáló képességének csökkenéseként szemléltettek. Yamaguchi és munkatársai [Virology 223, 219-223 (1996)] vizsgálták IBDvírusok virulenciájának molekuláris alapjait és ezen vírusok gyengülését, amely nyálkatömlőből származó IBDV-k CEF-sejttenyészetre való adaptációjának eredményeként jött létre. Azt a következtetést vonták le, hogy Yamaguchi és munkatársai által végzett kísérletekben a vad típusú IBDV-k gyengülésében szerepet játszó pontos mutációkat nem lehet azonosítani. Feltételezték, hogy az A-szegmens hosszú nyitott leolvasási fázisa által kódolt polifehérje 279. (Asp/Asn) és 284. (Ala/Thr) helyzetében lévő aminosavak fontosak a virutenciához és az IBDV CEF-sejtekben való szaporításához.
Ez utóbbit Lim, B-L. igazolta („Proceedings of the 4th Asia Pacific Poultry Health Conference”, 1998. november 22-26., Ausztrália, 79. Absztrakt). Leírták, hogy IBDV-ből származó VP2-fehérjében a 279. (Asp->Asn) és 284. (Ala->Thr) helyzetben lévő aminosavak szubsztitúciója olyan IBDV-mutánst eredményez, amely szaporítható CEF-sejttenyészetben. Azonban ezt megelőzően nem közöltek ehhez hasonló típusú, és ilyen minimális számú aminosavmutációt, amely szükséges és elegendő nyálkatömlőből származó IBDV CEF-sejttenyészetre való adaptációjának lehetővé tételéhez.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki általánosan alkalmazható eljárás kidolgozását fertőzött madarak nyálkatömlőjében csak in vivő növekedni képes IBDV-izolátumok adaptációjára sejttenyészetben való növesztésre.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során további célul tűztük ki eljárás kidolgozását gyengített IBDV-mutánsok előállítására, amelyben beviszünk mutációkat az IBDV-genomba ellenőrzött módon.
Továbbá a találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki géntechnológiailag módosított IBDV-mutáns előállítását, amely olyan megfelelő aminosavakat tartalmaz, amelyek lehetővé teszik a mutáns növesztését sejttenyészetben.
Azt találtuk, hogy ezeket a célokat egy olyan eljárás elégíti ki, amelyben előállítunk CEF-sejttenyészetben replikálódni képes, fertőző IBDV-mutánst az alábbi lépésekben:
(i) előállítunk CEF-sejttenyészetben replikálódni nem képes IBDV A és B-szegmensének megfelelő genom cDNS-ét tartalmazó DNS-konstrukciót, külön-külön, (ii) beviszünk mutációt:
(a) E-variáns vagy klasszikus IBDV-törzs VP2-génjében a 253. és 284. aminosavat kódoló, egy vagy több kodonba, vagy (b) GLS-IBDV-törzs VP2-génjében a 284. aminosavat kódoló kodonba, az A-szegmenst tartalmazó cDNS-be, fgy E-variáns vagy klasszikus IBDV-törzs esetén a mutáns VP2-gén 253. és 284. aminosavának megfelelő kodon hisztidint és treonint kódol, sorrendben, vagy GLS-IBDV-törzs esetén a mutáns VP2-gén 284. aminosavának megfelelő kodon treonint kódol, (iii) lehetővé tesszük, hogy az A-szegmenst és a B-szegmenst tartalmazó cDNS RNS-transzkriptumai az IBDV-mutáns szaporodását iniciálják tenyésztési tápközegben lévő gazdasejtekben, és (iv) izoláljuk az IBDV-mutánst a tenyészetből.
A találmány szerinti megoldás elsőként azonosítja azokat az aminosavakat, amelyek szükségesek és elégségesek IBDV CEF-sejttenyészetben való szaporodásának lehetővé tételéhez. Míg nyálkatömlőből izolált legtöbb IBDV-VP2-fehórje a 253. helyzetben Gln-t, a 284. helyzetben Ala-t és 330. helyzetben Ser-t tartalmaz, az E-variáns vagy a klasszikus IBDV-mutáns, melyekben a 253. és 284. helyzetnek megfelelő kodonokat kicseréltük, most 253. és 284. aminosavként His-t és Thr-t kódolnak, képesek CEF-sejttenyészetben növekedni. GLS-IBDV-mutáns esetén azt találtuk, hogy elegendő megváltoztatni a 284. helyzetnek megfelelő kodont, amely most a 284. aminosavhelyzetben Thr-t kódol. Azt is felismertük, hogy a 330. aminosavhelyzet nem kritikus a klasszikus vagy Ε-variáns IBDV-mutáns szaporodásához CEF-ben. Azonban a találmány szerint szerin, arginin vagy lizin a legkedvezőbb aminosav ebben a helyzetben. Továbbá azt találtuk, hogy a 253. aminosavhelyzet nem kritikus a GLS-IBDV-mutáns szaporodásához, és ez rendszerint glutamin. Ennélfogva, egy előnyös eljárásban olyan IBDV-mutánst állítunk elő, amely ezen három aminosav közül bármelyiket tartalmazza, különösen Arg-t a VP2-fehérje 330. helyzetében. GLS-IBDV-mutáns esetén a 253. helyzetben az előnyös aminosav glutamin.
1. táblázat
| IBDV | Aminosavcserék | CEF növe- kedés | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78/E-variáns szülő | Gin | Alá | Ser | - |
| Mutáns | His | Alá | Ser | - |
| Mutáns | Gin | Thr | Ser | - |
| Mutáns | Gin | Alá | Arg | - |
| Mutáns | His | Thr | Ser | + |
| Mutáns | Gin | Thr | Arg | - |
| Mutáns | His | Alá | Arg | - |
| Mutáns | His | Thr | Arg | + |
Azt találtuk, hogy korábban kizárólag csak fertőzött csirkék nyálkatömlőjében replikálódni képes (kiméra) E-variáns IBDV (D78/E-variáns) genomjában két változtatás szükséges az IBDV-izolátumok adaptációjára CEF-sejttenyészetre. Ezen helyzetek közé tartozik a 253. és 284. aminosav. Ezekben a helyzetekben hisztidin és treonin aminosavak, sorrendben, lehetővé teszik az IBDV-mutáns számára CEF-sejttenyészetben való szaporodást (1. táblázat és 1. példa). Továbbá azt ta3
HU 226 254 Β1 láltuk, hogy CEF-sejttenyészetre adaptált IBDV-mutánsok a találmány szerinti eljárás alkalmazásával gyengítette is váltak (2. példa).
Annak további igazolása céljából, hogy klasszikus IBDV-törzsek nyálkatömlőből CEF-sejtekre való adaptációját a két aminosav határozza meg, CEF-sejttenyészetben replikálódni képes, D78 jelű IBDV-törzs kodonjait megváltoztattuk a 253., 284. és 330. helyzetben. Az eredményeket bemutatjuk a 2A. táblázatban.
2A. táblázat
| IBDV | Aminosavcserék | CEF növekedés | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78 szülő | His | Thr | Arg | + |
| Mutáns | Gin | Thr | Arg | - |
| Mutáns | His | Alá | Arg | - |
| Mutáns | His | Thr | Ser | + |
| Mutáns | Gin | Alá | Ser | - |
Klasszikus „nagyon virulens” (VV) UK661 jelű európai izolátum [Brown és munkatársai, J. Gén. Virology 75, 675-680 (1994); Brown és Skinner, Virus Rés. 40, 1-15 (1996)] nem szaporítható In vitro, ezért csirkékben kellett szaporítani in vivő. A csirkéket meg kellett fertőzni W-törzzsel, és néhány nappal a fertőzés után a túlélő csirkéket elpusztítják, és a nyálkatömlőt eltávolítják. A vírust azután extrahálni lehet a nyálkatömlő-homogenizátumból további felhasználás céljára. A találmány szerinti megoldás alapjául szolgáló kísérletekben bemutatjuk, hogy a fentebb definiáltak szerint, aminosavcserék a 253. és 284. helyzetben lehetővé teszik az UK661 jelű W-törzs számára, hogy sejttenyészetben növekedjen. Ezen klasszikus IBDV-törzzsel végzett mutagenezis és transzfekciós kísérletek eredményeit a 2B. táblázatban foglaljuk össze.
2B. táblázat
| IBDV | Aminosavcserék | CEF növekedés | ||
| 253 | 279 | 330 | ||
| D78 szülő | Gin | Asp | Alá | - |
| Mutáns | Gin | Asn | Thr | +* |
| Mutáns | His | Asp | Alá | - |
| Mutáns | Gin | Asp | Thr | - |
| Mutáns | His | Asp | Thr | + |
* a replikádéi nagyon lassú.
Ezek az adatok további bizonyítékot jelentenek arra nézve, hogy a 253. és 284. helyzetben lévő aminosavcserék lehetővé teszik nyálkatömlőből származó, klasszikus IBDV-törzsek számára, hogy sejttenyészetben növekedjenek. Az összes többi más mutáció azt eredményezi, hogy a mutánsok nem replikálódnak sejttenyészetben, vagy nagyon rosszul replikálódnak [lásd még Lim és munkatársai, J. Virol. 73, 2854-62 (1999)].
Továbbá meghatároztuk, hogy GLS-IBDV-ben egyetlen aminosav cseréje a 284. helyzetben elegendő volt ahhoz, hogy lehetővé tegye nyálkatömlőből származó IBDV adaptációját CEF-sejteken való szaporodásra (3. táblázat).
3. táblázat
| IBDV | Aminosavcserék | CEF nőve- kedés | ||
| 253 | 284 | 330 | ||
| D78/GLS-BU | Gin | Alá | Ser | - |
| D78/GL-CEF | Gin | Thr | Ser | + |
Ennélfogva a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi nyálkatömlőből izolált IBDV adaptációját sejttenyészetben való növesztésre, rekombináns DNS technikák alkalmazásával. A találmány szerinti eljárás előnye az, hogy az adaptációs eljárás eredményeképpen csak mutációkat viszünk be az IBDV-genomban a 253. és 284. helyzetnek megfelelő, egy vagy több kodonba. A számok a polifehérje aminosavhelyzeteit, és az IBDV-genom A-szegmensében a nagy nyitott leolvasási fázis kodon helyzeteit jelölik [Mundt és Müller, J. Gén. Virol. 77, 437-443 (1995); NCBI nyilvántartási szám X84034],
CEF-sejttenyészeten nem szaporodó legtöbb, de nem az összes IBDV-törzs tartalmaz a 253 (Gin), 284 (Alá) és 330 (Ser) kodonokat a VP2-génben. CEF-sejttenyészeten nem növekvő, néhány E-variáns vagy klasszikus IBDV-törzs már rendelkezhet a szükséges, 253 (His) és 284 (Thr) kodonok egyikével. Ezért a találmány szerinti eljárásban beviszünk mutációt a fentebb említett, szükséges egy vagy több kodonba, így az eredményül kapott IBDV-mutáns a VP2-gónben olyan kodonokat tartalmaz, amelyek 253 (His) és 284 (Thr) aminosavakat kódolnak.
Előnyösebben a találmány szerinti eljárást olyan IBDV-re alkalmazzuk, amely nem képes CEF-sejttenyészeten replikálódni, és amely 253 (Gin) és 284 (Alá) aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmaz, sőt, még előnyösebben 330 (Ser) aminosavnak megfelelő kodont tartalmaz. Klasszikus és E-variáns törzs esetén olyan mutációkat viszünk be a VP2-gén két vagy három kodonjába, amelynek eredményeképpen a kodonok (His) és 284 (Thr) és adott esetben 330 (Arg) aminosavakat kódolnak. Ezen helyzetekben lévő aminosavaknak megfelelő, új kodonok lehetnek: His-re (CAT vagy CAC), Thr-ra (ACT, ACC, ACA, ACG) és Arg-re (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG).
Sőt, még előnyösebben a találmány szerinti eljárást olyan IBDV-re alkalmazzuk, amely nem képes CEFsejttenyészeten replikálódni, és amely Gin 253 (CAA), Alá 284 (GCC) aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmaz, és adott esetben Ser 330 (AGT) kodonokat tartalmaz, vagy ezek bármilyen kombinációját tartalmazza.
HU 226 254 Β1
A találmány szerinti eljárást különösen olyan IBDV-re alkalmazzuk, amely nem képes CEF-sejttenyészeten replikálódni, és amely 253 (CAA), 284 (GCC) és 330 (AGT) kodonokat tartalmaz.
IBDV-mutáns előállítására szolgáló, találmány szerinti eljárásban a közelmúltban birnavírusokra kidolgozott [Mundt és Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11 131-11 136 (1996); és WO 98/09646. számú nemzetközi közzétételi irat], „fordított (reverz) genetikai” rendszert alkalmazunk. Ez a fordított genetikai rendszer megnyitotta a lehetőséget mutációk bevitelére IBD-vírus RNS-genomjába. A találmány szerinti fordított genetika elve az, hogy a genomi, A és B RNSszegmenst izoláljuk a vírusból, ezt az RNS-ek reverz transzkripciója követi cDNS-é, miután a cDNS-eket átírjuk RNS-é. A kívánt mutáció(k) bevitele a vírus A (vagy B) szegmensébe cDNS-szinten történik. Ebben a fordított genetikai rendszerben fontos lépés olyan elkülönített DNS-konstrukciók előállítása, amelyek DNS-vektormolekulát (például plazmidot) és az IBDV A- vagy B-szegmensének teljes hosszúságú cDNS-klónjait tartalmazzák. Az A- vagy B-szegmensnek megfelelő cDNS-t, beleértve ezen mindkét szegmens 5'- és 3’-végi nukleotidjait tartalmazó DNS-konstrukciókat Mundt és Vakharia (1996, mint fent) által leírt eljárás szerint lehet előállítani. A fordított genetikai eljárásban a következő lépésben alkalmas gazdasejteket transzfektálunk az A- és B-szegmensnek megfelelő genetikai anyaggal, így a transzfektált gazdasejtekben az A- és B-szegmensnek megfelelő cDNS RNS-transzkriptumai képesek iniciálni a vírus replikációját, fertőző IBDV-t eredményezve, amelyet izolálni lehet abból a tápközegből, amelyben a gazdasejteket tenyésztjük.
A fordított genetikai rendszer utóbbi lépésére számos eljárást alkalmaznak. A találmány szerinti eljárásban előnyösen az A- és B-szegmensnek megfelelő mindkét cDNS-ből szintetikus RNS-transzkriptumokat állítunk elő in vitro. Ebben az esetben a DNS-konstrukció RNS-polimeráz-promotert tartalmaz működőképesen kapcsolva valamelyik szegmenshez. A promoter lehet T7-, SP6- vagy T3-polimeráz promotere, a T7-promotert részesítjük előnyben. Az A- és B-szegmens szintetikus transzkriptumait izoláljuk és alkalmazzuk alkalmas gazdasejtek transzfektálására.
Más módszer szerint olyan eljárást alkalmazunk, amelyben RNS-polimerázt expresszálni képes gazdasejteket tartalmazó sejtvonalat állítunk elő, és amelyeket a B-szegmensnek megfelelő cDNS-t és RNS-polimeráz-promotert tartalmazó DNS-konstrukcióval transzformálunk, így a B-szegmens RNS-transzkriptumait konstitutíven expresszáljuk. Miután ilyen sejteket mutáns A-szegmenst tartalmazó cDNS szintetikus RNS-transzkriptumával transzfektáltunk, az IBDV-mutáns szaporodása iniciálódik a gazdasejtekben. Különösen olyan gazdasejteket lehet alkalmazni, amelyek bakteriofág T7-DNS-függő RNS-polimerázt képesek expresszálni, például citoplazmatikusan, rekombináns tehénhimlővírusból (vakciniavírusból).
A VP2-génbe a kívánt mutációkat szakember által általánosan ismert, erre a célra szolgáló eljárások alkalmazásával lehet bevinni. A mutáció(ka)t különösen helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával visszük be. Mutációknak az IBDV-genomba való bevitelére szolgáló eljárásokat a leírásban ismertetünk, de a technika jelenlegi állása szerint általánosan alkalmazzák is azokat [Mundt és Vakharia, mint fent (1996); Yao és munkatársai, J. Virology 12, 2647-2654 (1998); Mundt és munkatársai, 0887.412 számú európai közzétételi irat; és „Current Protocols in Molecular Biology”, szerk. F. M. Ausubel és munkatársai, Wiley N. Y., 1995. évi kiadás, 8.5.1.-8.5.9. old.].
A találmány szerinti eljárást valamennyi olyan IBDV-törzsre lehet alkalmazni, amelyek nem képesek replikálódni CEF-sejttenyészetben, és amelyek az IBDV klasszikus, E-variáns vagy GLS antigenikus altípusai.
Továbbá a találmány szerinti eljárást valamennyi olyan IBDV-törzsre lehet alkalmazni, amelyek nem képesek replikálódni CEF-sejttenyészetben, függetlenül a törzsek virulenciájától, és ez vonatkozik nagyon virulens törzsekre (például CS89 és UK661), virulens törzsekre (például F52/70 és STC) és vakcinatörzsekre (például 228E és 2512). Sejttenyészetben való szaporodásra adaptált, nagyon virulens és virulens törzsekből származó IBDV mutánsok kevésbé virulensek lesznek, és élő vakcinatörzsként lehet azokat alkalmazni. Más módszer szerint, ilyen IBDV-mutánsokat kényelmesen lehet szaporítani sejttenyészetben, és inaktivált vakcinaként lehet azokat kiszerelni.
A találmány szerinti eljárást előnyösen lehet alkalmazni olyan gyengített IBDV-törzsekre, amelyek nem képesek CEF-sejttenyészetben replikálódni. Ilyen gyengített vírusokból származó mutánsokat sejttenyésztő rendszerekben lehet alkalmazni vakcina előállítására, in vivő termelő rendszer alkalmazása helyett.
A találmány tárgya egy további vonatkozásában eljárás olyan „kiméra” IBDV-mutáns előállítására, amely CEF-sejttenyészetben képes replikálódni. Az eljárás egy további lépést tartalmaz, amelyben beviszünk egy mutációt egy első IBDV-ből származó, előnyösen VP2gén A-szegmensének génjébe, amelynek eredményeképpen olyan fehérje expresszálódik ezen gén által, amely egy második IBDV-epitópdeterminánst tartalmaz.
Kiméra IBDV olyan vírus, amely genetikai vázként egy első antigenikus altípus A-szegmensét vagy VP2génjét tartalmazza, és továbbá egy második antigenikus IBDV-altípus epitópdeterminánsát kódoló genetikai információt tartalmaz. Ilyen kiméra IBDV-k különösen az első antigenikus altípushoz tartozó IBDV-ből származó VP2-fehérjén található, egy vagy több további epitópdeterminánst expresszálnak. Ilyen kiméra IBDV előnye az, hogy egyetlen immunogénként lehet alkalmazni, amely immunitást indukál legalább két antigenikus IBDV-altípus ellen.
Főleg olyan IBDV-mutánsokat állítunk elő, amelyek klasszikus, GLS vagy E-variáns IBDV-ből származó A szegmensvázat vagy VP2-gént tartalmaznak. Különböző IBDV-törzsekből származó A-szegmensek teljes kódoló régióját tartalmazó cDNS-klónokat elő lehet áll í5
HU 226 254 Β1 tani a szakirodalomban leírt, standard klónozóműveletek és -eljárások alkalmazásával [Vakharia és munkatársai, Avian Diseases 36, 736-742 (1992); J, Gén. Virology 74, 1201-1206 (1993)]. Különböző IBDV-törzsekből származó A-szegmensek aminosavszekvenciáit és nukleotidszekvenciáit már leírták [például WO 95/26196. számú nemzetközi közzétételi irat; és Vakharia és munkatársai, Avian Diseases 36, 736-742 (1992)].
Továbbá a WO 95/26196 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetik az IBDV antigenikus altípusok néhány olyan epitópdeterminánsának aminosavszekvenciáját, amelyek jellemzőek az egyes antigenikus altípusokra. Továbbá a WO 95/26196 számú nemzetközi közzétételi iratban leírják különböző IBDV-törzsek antigenikus jellemzőit reaktivitásuk alapján, semlegesítő monoklonális ellenanyagokat tartalmazó panellel. Fontos megemlíteni, hogy ilyen semlegesítő monoklonális ellenanyagokkal reaktív epitópdeterminánsok az alábbiak; B69 (klasszikus altípus), R63 és 67 (E-variáns) és 57 (GLS) epitópdeterminánsok. Vakharia és munkatársai [Virus Rés. 31, 265-273 (1994)] leírták a VP2-fehérje ezen epitópdeterminánsokat tartalmazó régiójának aminosavszekvenciáját.
A találmány szerinti eljárásban előnyösen CEFsejttenyészetben replikálódni képes, kiméra IBDV-mutánst állítunk elő, amely klasszikus A-szegmens-vázat és E-variánsból származó, 67 jelű epltópdeterminánst vagy GLS-ből származó 57 jelű epltópdeterminánst kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz. Más módszer szerint, a kiméra IBDV-mutáns GLS-vázat és B69, R63 vagy 67 jelű epltópdeterminánst kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban különösen olyan kiméra IBDV-törzset (D78/E-variáns) állítunk elő, amely D78-törzsből (kereskedelemben beszerezhető az Intervet International Β. V. cégtől, Hollandia) származik, amelyben (i) a VP2-gént helyettesítjük E-variáns törzsből származó VP2-génnel, és (ii) a 253., 284. és 330. helyzetben lévő aminosavaknak megfelelő kodonokat a fentebb definiáltak szerint megváltoztatjuk (1. példa). Az első IBDV A-szegmensének vázában lévő epitópdeterminánsokat kódoló nukleotidszekvenciák bevitelének lépései alapvetően és lényegében ugyanazok, mint a fentebb meghatározott mutációk bevitelére szolgáló lépések. Ezt úgy lehet a legkönnyebben elvégezni, hogy előállítjuk az A- és B-szegmens genomjának cDNS-ét, és (i) helyettesítjük az első IBDV epitópdeterminánsát kódoló szekvenciát egy második IBDV ilyen szekvenciájával, vagy (ii) megváltoztatjuk az IBDV-ben lévő specifikus kodont helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával. Ilyen módszereket leírnak a WO 95/26196 számú nemzetközi közzétételi iratban. Végül, ezen cDNSmolekulák RNS-transzkriptumai lehetővé teszik replikáció iniciálását transzfektált gazdasejtben, így fertőző, kiméra IBDV-hez jutunk.
A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint olyan eljárást alkalmazunk, amelyben előállítjuk a fentebb definiált IBDV-mutánst, és az eredményül kapott IBDV-mutáns tartalmaz más olyan mutációkat is, amelyek gyengítik a vírust. Ilyen mutációk például az IBDV-genom A-szegmensének VP5-génjében lévő mutáció, amely olyan IBDV-mutánst eredményez, amely nem képes natív VP5-fehérjét expresszálni. (VP5_)-IBDV-mutáns előállítását leírják a 887.412 számú európai közzétételi iratban.
A találmány tárgya további vonatkozásában géntechnológiailag módosított, fertőző, CEF-sejttenyészetben replikálódni képes IBDV-mutáns, amely a klasszikus vagy E-variáns törzs VP2-génjének 253. helyzetében His-t és a 284. helyzetében Thr-t, és adott esetben a 330. helyzetében Arg-t kódoló kodonokat tartalmaz, vagy a GLS-törzsben, a 284. helyzetben Thr-t kódoló kodonokat tartalmaz.
Ilyen IBDV-mutánsok még tartalmazzák nyálkatömlőből származó, CEF-sejttenyészetben replikálódni nem képes IBDV-k genetikai információit, kivéve a fentebb említett új kodonokat, amelyeket ellenőrzött módon bevittünk géntechnológiai technikák alkalmazásával.
A találmány tárgyát különösen a fentebb definiált E-variáns IBDV-mutáns képezi, amely nem rendelkezik glicin- és/vagy valincsoporttal a 318. és 325. helyzetben, sorrendben. Géntechnológiailag módosított E-variáns-mutánsok a legelőnyösebben aszparaginsavval és/vagy metioninnal rendelkeznek ezekben a helyzetekben, sorrendben.
A találmány előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti, géntechnológiailag módosított IBDV-mutáns kiméra IBDV-mutáns, különösen D78törzsből származó kiméra IBDV-mutáns, amely E-variáns-törzsből származó VP2-t kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, és a fentebb meghatározott három új kodont tartalmazza.
A találmány tárgyát képezi IBDV-vakcinák könnyű előállításának lehetősége olyan IBDV-törzsekből, amelyek korábban nehezen replikálódtak in vitro sejttenyészetben. A találmány szerinti megoldás további előnye az, hogy IBDV-ket (tovább) lehet gyengíteni ellenőrzött módon, a fentebb leírt eljárás szerint. Ilyen gyengített IBDV-mutánsokat lehet alkalmazni élő IBDV-vakcinák hatóanyagaiként.
Ennélfogva a találmány tárgya másik vonatkozásában vakcina baromfi védelmére, IBDV-fertőzés eredményeként kialakult betegség ellen alkalmazva. A vakcina a fentebb leírtak szerint előállított, géntechnológiailag módosított IBDV-mutánst tartalmaz gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy hígítószerrel együtt.
Az IBDV-mutánst élő, legyengített vagy inaktivált vírusként lehet beépíteni a vakcinába.
A találmány szerinti vakcinát szokásos eljárásokkal lehet előállítani, például kereskedelemben rendelkezésre álló, élő és inaktivált IBDV-vakcinákra általánosan alkalmazott módszerekkel. Röviden összefoglalva, érzékeny szubsztrátot beoltunk a találmány szerinti IBDV-mutánssal, és addig szaporítjuk, amíg a vírus a kívánt fertőzési titerig replikálódik, azután az IBDV-t tartalmazó anyagot elkülönítjük.
Minden olyan szubsztrátot lehet alkalmazni a találmány szerinti vakcina előállítására, amely képes IBDV6
HU 226 254 Β1 mutánsok replikációját fenntartani, beleértve (madárból származó) primer sejttenyészeteket, például csirkeembrióból származó fibroblasztsejteket (CEF) vagy csirkeembrióból származó májsejteket (CÉL), emlőssejtvonalakat, például VERO-sejtvonalat vagy a BGM-70-sejtvonalat, vagy madárból származó sejtvonalakat, például QT-35-öt, QM-7-et vagy LMH-t. A sejtek beoltása után a vírust rendszerint 3-10 napig szaporítjuk, miután a sejttenyészet felülúszóját elkülönítjük, és kívánt esetben szűrjük vagy centrifugáljuk a sejttörmelékek eltávolítása céljából.
Más módszer szerint, az IBDV-mutánst embrionizált csirketojásokban szaporítjuk. A szubsztrát, amelyen ezeket az IBDV-ket szaporítjuk, főleg SPF-embrionizált tojás. Embrionizált tojásokat beolthatunk például 0,2 ml IBDV-mutánssal, amely tojásonként legalább 102 TCID50-et tartalmazó szuszpenziót vagy homogenizátumot tartalmaz, ezt követően 37 °C-on inkubáljuk. Körülbelül 2-5 nap múlva IBD-vírustermékhez úgy juthatunk, hogy elkülönítjük az embriókat és/vagy a membránokat és/vagy az allantois folyadékot, melyet ezen anyag megfelelő homogenizálása követ. A homogenizátumot azután centrifugálhatjuk 10 percig, 2500*g-n, azután a felülúszót szűrőn (100 pm) szűrjük.
A találmány szerinti, élő vírust tartalmazó vakcinát előállíthatjuk szuszpenzió formájában vagy liofilizált formában, és az tartalmazhat továbbá ilyen készítményekben általánosan alkalmazott, gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert. Hordozók lehetnek stabilizátorok, tartósítószerek és pufferek. Alkalmas stabilizátor lehet például SPGA, szénhidrátok (például szorbit, mannit, keményítő, szacharóz, dextrán, glutamát vagy glükóz), fehérjék (például szárított tejszérum, albumin vagy kazein) vagy ezek lebomlási termékei. Alkalmas pufferek például alkálifém-foszfátok. Alkalmas tartósítószer például timerozál, mertiolát és gentamicin. Hígítószerek lehetnek például víz, vizes puffer (például pufferolt sóoldat), alkoholok és poliolok (például glicerin).
A találmány szerinti, élő vakcinák kívánt esetben tartalmazhatnak adjuvánst. Adjuváns-aktivitással rendelkező, alkalmas vegyületek és készítmények megegyeznek a lentebb leírtakkal.
Bár a találmány szerinti, élő vakcinákat be lehet adni injekcióval, például intramuszkulárisan, szubkután, a vakcinát előnyösen olcsó, nagy mennyiséget alkalmazó beviteli technikával adjuk be, amely általánosan alkalmazott technika IBDV-vakcinációra. Ilyen technikák lehetnek IBDV-vakcinákra ivóvízzel való beadás és spray-vakcináció.
Az élő vakcinák beadására szolgáló más technika lehet tojásba való beadás, szemcsepp és csőrbemerítéssel történő beadás.
A találmány tárgya másik vonatkozásában IBDVmutánst inaktivált formában tartalmazó vakcina. Az inaktivált vakcina fő előnye, hogy nagy mennyiségű, védőhatású ellenanyag tartós termelődését lehet elérni.
A szaporítási lépés után elkülönített vírusok inaktiválásának célja a vírusok reprodukciójának kiküszöbölése. Kémiai inaktiválást végezhetünk úgy, hogy a vírusokat például enzimekkel, formaldehiddel, β-propiolaktonnal, etiléniminnel vagy ezek származékaival kezeljük. Ha szükséges, az inaktiváló vegyületet ezután semlegesítjük. Formaldehiddel inaktivált anyagokat például tioszulfáttal lehet semlegesíteni. Fizikai inaktiválást végezhetünk például úgy, hogy a vírusokat energiagazdag sugárzásnak, például UV fény vagy röntgensugárzás hatásának teszünk ki. Kívánt esetben kezelés után a pH-t körülbelül 7-es értékre állíthatjuk.
Inaktivált IBDV-mutánst tartalmazó vakcina tartalmazhat például egy vagy több, erre a célra megfelelő, fentebb említett, gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert.
A találmány szerinti, inaktivált vakcina előnyösen tartalmazhat egy vagy több adjuváns-aktivitással rendelkező vegyületet. Erre a célra megfelelő vegyületek és készítmények lehetnek például alumínium-hidroxid, -foszfát vagy -oxid, „olaj a vízben vagy „víz az olajban” emulzió, amely például ásványi olajra, például Bayol F® vagy Marcol 52®, vagy étolajra alapul, például E-vitamin-acetát és szaponinok.
A találmány szerinti vakcina hatóanyagként az IBDV-mutáns hatékony dózisát tartalmazza, azaz akkora mennyiségű immunizáló IBDV-anyagot, amely immunitást indukál a beoltott madarakban virulens vírus által okozott fertőzés ellen. Az immunitást egy madárpopulációban itt szignifikánsan nagyobb mértékű védelem indukálódásaként definiáljuk vakcináció után, vakcinát nem kapott csoporthoz hasonlítva.
A találmány szerinti élő vakcinát tipikusan állatonként 102—109 TCID50 dózisban (fertőző dózis50, TCID50) adhatjuk be, előnyösen 1O5·0—1O7·0 TCID50 dózistartományban, és az inaktivált vakcinák állatonként 105-109 TCID50 antigenikus ekvivalenst tartalmazhatnak.
Inaktivált vakcinákat rendszerint parenterálisan, például intramuszkulárisan vagy szubkután adunk be.
Bár a találmány szerinti IBDV-vakcina hatékonyan alkalmazható csirkékben, más baromfi és szárnyas, például pulyka, gyöngytyúk és fogoly is sikeresen oltható a vakcinával. A csirkékhez csibék, reprodukciós állomány és tojók tartoznak.
A találmány szerinti élő vagy inaktivált vakcinát kapott állatok kora ugyanannyi, mint a hagyományos élő vagy inaktivált IBDV-vakcinát kapott állatok kora. Például csibéket (amelyek anyától származó ellenanyagokat, rövidítve MDA-t nem tartalmaznak) egynapos korukban lehet oltani, míg nagyobb mennyiségű MDA-t tartalmazó csibéket előnyösen 2-3 hetes korukban lehet oltani. Kevés MDA-t tartalmazó tojókat vagy reprodukciós állományt 1-10 napos korukban lehet oltani, melyet ismétlő vakcinációk követnek inaktivált vakcinával 6-8 és 16-20 hetes korukban.
A találmány tárgyát képezi vakcinák kombinációja is, amely a fentebb leírt IBDV-mutánson kívül tartalmaz más, baromfira vagy halra fertőző, patogénből származó egy vagy több immunogént, sorrendben.
A kombinációs vakcina előnyösen tartalmaz továbbá fertőző bronchitisvírus (IBV), Newcastle-betegség vírusának (NDV), tojásejtő („egg drop”) szindróma víru7
HU 226 254 Β1 sának (EDS), pulyka rhinotracheitisvírus (TRTV) vagy reovírus egy vagy több vakcinatörzsét.
1. példa
IBDV-mutánsok előállítása és szaporodási tulajdonságaik CEF-sejttenyészetben Anyagok és módszerek
Klasszikus, E-variáns vagy GLS IBDV-törzsekből származó VP2 variábilis régióját tartalmazó, (intergenerikus) IBDV-plazmidok előállítása (i) Klasszikus IBDV-törzsből származó VP2
D78
Az alábbi helyspecifikus mutagenezis alapja pUC18plazmid módosítása volt. Ebből a célból pUC18-plazmidot Ndel/BamHI-enzimekkel hasítottunk, elektroeluáltuk, Klenow-enzimmel tompa végűvé alakítottuk, és újra ligáltuk, így jutottunk a pUC18 ANdel-BamHI-hez (pUC18/ANB). A pAD78/EK-plazmidot [Mundt és munkatársai, J. Virology 71, 5647-51 (1997)] EcoRI/Kpnlenzimekkel hasítottuk, így jutottunk a D78-törzs I. szerotípusából származó A-szegmens teljes hosszúságú nukleotidszekvenciájához, amely T7-RNS-polimeráz-promoterhelyet tartalmazott. Ezt a fragmenst EcoRI/Kpnlenzimekkel hasított pUC18/ANB-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ANB-hez (1. ábra). A pD78A/ANB-plazmidot alkalmaztuk vázként a klónozási és helyspecifikus mutagenezis eljárásokhoz.
UK661
A pD78-E/DEL-plazmidot (lásd lentebb) alkalmaztuk az UK661-törzs A-szegmensének szekvenciáit tartalmazó, kiméra plazmidok előállítására. A vírus-RNS kicsapása után reverz transzkripciót és PCR-t végeztünk standardeljárásokat követve, UK661AFor1- és UK661ARev1-oligonukleotidok [Brown és Skinner, Vírus Rés. 40, 1-15 (1996); szensz 621-644. számú nukleotidok és antiszensz 1201-1223. számú nukleotidok, sorrendben] alkalmazásával. Az eredményül kapott PCR-fragmenseket tompa végűvé alakítva klónoztuk Smal-enzimmel hasított pUC18-vektorba (Pharmacia, Sweden), így jutottunk p661Apart-hoz. Miután szekvenáltuk a p661Apart-ot, Ndel/Spel jelű restrikciós enzimekkel hasítottuk a 667. és 1182. nukleotidnál, sorrendben (a számozás a P2-törzs teljes hosszúságú szekvenciájára leírtakat követi: NCBI nyilvántartási száma: X 84034), így 535 bp méretű fragmenshez jutottunk, amely tartalmazta az UK661-törzsből származó VP2 variábilis régiójának kódolószekvenciáját. Ndel/Spel-enzimekkel hasított pD78-E/DEL-be való ligálás után előállítottuk a kiméra, teljes hosszúságú pD78A-E-661-plazmidot, amely tartalmazta a D78-, E/Del- és UK661-törzs A-szegmensének szekvenciáit (4. ábra).
(ii) E-variáns IBDV-törzsből származó VP2
IBDV-specifikus szekvenciák szubsztitúciója céljából olyan plazmidot alkalmaztunk, amely az E-variáns, E/Del-törzs teljes kódoló régióját tartalmazta [pEDEL22Bacll, Vakharia, Biotechnology annual review 3, 151-168 (1997)]. A pEDEL22Bacll-plazmidot (1 A. ábra) Ndel/Sall jelű restrikciós enzimekkel hasítottuk a 647. és 1725. nukleonoknál, sorrendben, a
P2-törzs teljes hosszúságú szekvenciája szerint (NCBI nyilvántartási száma X 84034), így 1078 bp méretű fragmenshez jutottunk, amely tartalmazta az E/Deltörzsből származó VP2 variábilis régiójának kódolószekvenciáját és a VP4 szekvenciáját. Ndel/Sall-enzimekkel hasított pD78A/ANB-be való ligálás után előállítottuk a kiméra, teljes hosszúságú pD78A/ANB-E/Delplazmidot (1 A. ábra), amely tartalmazta a D78-törzs, valamint az E/Del-törzs A-szegmensének szekvenciáit. A pD78A/ANB- és pD78A/ANB-E/Del-plazmidokat használtuk helyspecifikus mutagenezishez.
(iii) GLS-IBDV-törzsből származó VP2
A továbbiakban előállítottunk egy plazmidpárt, amely a GLS-B és GLS-TC variábilis régióját tartalmazta, sorrendben. A hipervariábilis régió klónozása céljából GLS-TC-t CEF-ben szaporítottunk, és ultracentrifugálással tisztítottunk. GLS-B nyálkatömlő-homogenizátumát alacsony sebességű centrifugálással tisztítottuk, és a felülúszót az alábbi eljárásban alkalmaztuk. Nátrium-dodecil-szulfátot (SDS, 0,5%) jelenlétében, proteináz-K-val (0,5 mg/ml) való emésztés után vírusRNS-t tisztítottunk, reverz transzkripcióval átírtuk cDNS-re és polimeráz-láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk standardeljárások szerint, A14- és A44-oligonukleotidok alkalmazásával (4. táblázat). Az amplifikációs terméket tompa végűvé alakítva klónoztuk és megfelelő PCR-fragmenseket tartalmazó plazmidokat szekvenáltuk. A GLS-TC vagy GLS-B inszertjét tartalmazó plazmidokat (pGLS-TC vagy pGLS-B, sorrendben) alkalmaztuk az alábbi kísérletekben. Intergenerikus A-szegmens előállítása céljából a pD78A/ANB-E/Del jelű teljes hosszúságú kiónt alkalmaztuk. pGLS-TC-t és pGLS-B-t, sorrendben, Sacl- és Spel-enzimmel emésztettünk. Elektroeluált fragmenseket előzőleg Sacl/Spel-enzimekkel emésztett pD78A/ANB-E/Del-be ligáltuk, így jutottunk pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC-hez és pD78A/ANB-E/Del-GLS-B-hez, sorrendben. A két plazmid térképét bemutatjuk az 1B. ábrán.
Helyspecifikus mutagenezis
Helyspecifikus mutagenezist PCR-rel végeztünk. Az oligonukleotidok aminosavcserékhez és restrikciós hasítóhelyek hozzáadásához vezető mutációkat tartalmaztak (4. táblázat). pAD78/ANB-, pAD78/ANB-E/Delés pAD78-E-661-plazmidok, sorrendben, alkalmazásával végzett PCR-amplifikáció után a fragmenseket tompa végűvé alakítva klónoztuk és szekvenáltuk (pfrag). Mutáns kodonokat tartalmazó kiónokat előzőleg hasított plazmidokba ligáltuk az alábbiak szerint:
(i) E-variáns IBDV
Az A-szegmens teljes hosszúságú kiónjainak megfelelő, mutáns kodonokat tartalmazó pAD78/ANBE/Del-plazmid előállítása céljából előállítottuk az alábbi PCR-fragmenseket: E/Del-MutQH és A14 (pfragQH), E/Del-MutAT és A14 (pfragAT), E/Del-MutSR és P21F (pfragSR) láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk a megfelelő, egyetlen aminosavcserét (Q253H, A284T és S330R, sorrendben) tartalmazó, E-Del-szekvencia fragmenseinek előállítására. PfragQH-t és pfragSR-t Sacl/Spel-enzimekkel hasítottuk, és előzőleg Sacl/Spel-enzimekkel emésztett pD78A/ANB-E/Del-be
HU 226 254 Β1 ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-E/Del-QH-hoz (1C. ábra) és pD78A/ÁNB-E/Del-SR-hez (1C. ábra), sorrendben. pD78A/ANB-E/Del-AT (1C. ábra) előállítása céljából pfragAT-t Narl/Spel-enzimekkel hasítottuk, azt követően előzőleg hasított pD78A/ANB-E/Del-be ligáltuk. Két mutáns kodont tartalmazó plazmidok előállítása céljából az alábbi PCR-t végeztük: E/Del-MutQH és E/Del-MutSR, valamint E/Del-MutAT és E/DelMutSR láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk pD78A/ANB-E/Del-en lévő fragQH-SR és fragAT-SR amplifikálására, sorrendben. A pfragQH-SR klónozása és szekvenálása után Sacl/Spel-enzimekkel emésztettük, és azt követően előzőleg hasított pD78A/ÁNBE/Del-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-E/DelQH-SR-hez (1D. ábra). pD78A/ANB-E/Del-AT-SR (1D. ábra) előállítása céljából pfragAT-SR-plazmidot Narl/Spel-enzimekkel hasítottuk, és ugyanezekkel az enzimekkel hasított pD7 βΑ/ΔΝΒ-Ε/Del-be ligáltuk. Két aminosavcserét (Q253H; A284T) kódoló, mutáns kodonokat tartalmazó plazmidok előállítása céljából PCR-t végeztünk pD78A/ÁNB-E/Del-AT-plazmid és E/Del-MutQH; A14 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. Az így kapott pfragQH-AT plazmidot Sacl/Spel-enzimekkel hasítottuk és pD78A/ANBE/Del-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-E/DelQH-AT-hoz (1D. ábra). Mindhárom aminosavcserét (Q253H, A284T és S330R) kódoló, mutáns kodonokat tartalmazó plazmid klónozása céljából E/Del-MutQH és E/Del-MutSR láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk pD78A/ÁNB-E/Del-AT-n lévő fragQH-AT-SR amplifikálására. Miután a pfragQH-AT-SR-t Sacl/Spel-enzimekkel hasítottuk, az eluált fragmenst Sacl/Spel-enzimekkel hasított pD78A/ANB-E/Del-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-E/Del-QH-AT-SR-hez (1E. ábra).
(ii) Klasszikus IBDV
D78
Az A-szegmens teljes hosszúságú kiónjainak megfelelő, mutáns kodonokat tartalmazó pAD78/ANB-plazmid előállítása céljából a pAD78/ÁNB Ndel/HindlII-fragmensét előzőleg Ndel/HindlII-enzimekkel hasított pUC19-be szubklónoztuk, egyetlen restrikciós enzim hasítóhelyének létrehozására, az alábbi eljáráshoz (PUC19/NH-D78A). D78-MutHQ és A14 (pfragHQ), D78-MutTA és A14 (pfragTA), D78-MutRS és P21F (pfragRS) oligonukleotidokat alkalmaztunk a PCRamplifikációhoz, amelyben a megfelelő, egyetlen aminosavcserét (Q253H, A284T és S330R, sorrendben) tartalmazó, D78-szekvencia fragmenseihez jutottunk. A pfragHQ-fragmenst Sacl/Styl-enzimekkel hasítottuk, a pfragTA-fragmenst Narl/Styl-enzimekkel hasítottuk, a pfragRS-fragmenst Sacl/Styl-enzimekkel hasítottuk, és újraligáltuk megfelelően hasított pUC19/NH-D78A-ba. A mutáns kodont tartalmazó pUC19/NH-D78A-plazmidot Ndel/Sacll-enzimekkel hasítottuk, a megfelelő fragmenseket elektroeluáltuk, és előzőleg Ndel/Sacll-enzimekkel hasított pD78/ÁNB-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-HQ-hoz, pD78A/ANB-TA-hoz és a pD78A/ANB-RS-hez, sorrendben. Mindhárom aminosavcseréhez (Q253H, A284T és S330R) vezető nukleotidszubsztitúciókat tartalmazó, teljes hosszúságú klón előállítása céljából PCR-t végeztünk D78-MutHQ-, D78-MutRS-oligonukleotidok és pD78A/ÁNB-TA-plazmid alkalmazásával. Az így kapott PCR-fragmenst tompa végűvé alakítva klónoztuk, így jutottunk a pfragHQTA-RS-hez. A pfragHQ-TA-RS Sacl/Styl-enzimekkel való hasítása után az elektroeluált fragmenst Sacl/Stylenzimekkel hasított pUC19/NH-D78A-ba klónoztuk. Az így kapott plazmidot Ndel/Sacll-enzimekkel hasítottuk, a megfelelő fragmenst elektroeluáltuk, és végül előzőleg Ndel/Sacll-enzimekkel hasított pD78A/ÁNB-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A/ÁNB-HQ-TA-RS-hez. Az így kapott mutáns plazmidok nukleotidszekvenciáit szekvenálással igazoltuk. A szekvenciákat „Wisconsin Package, version 8” (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) alkalmazásával analizáltuk. A pD78A/ÁNBHQ-, pD78A/ÁNB-TA-, pD78A/ÁNB-RS és pD78A/ÁNBHQ-TA-RS-plazmidokat bemutatjuk a 2. ábrán.
UK661
Helyspecifikus mutagenezis céljából pD78A-EUK661-plazmidot EcoRI/Kpnl-enzimekkel hasítottuk, és ezt követően a teljes hosszúságú A-szegmenst tartalmazó fragmenst EcoRI/Kpnl-enzimekkel hasított pBS_plazmidvektorba (Stratagene) ligáltuk. Az eredményül kapott pBSD78A-E-661-plazmidot alkalmaztuk helyspecifikus mutageneziskísérletekre, korábban már leírt eljárást követve [Kunkel és munkatársai, Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)]. Lim és munkatársai (1999, mint fent) eredményeire építve, a pBSD78A-E661-plazmidban, a 279. és 284. aminosavat kódoló nukleotidszekvenciát kicseréltük (D279N, A284T) antiszensz orientációjú Mut1 -oligonukleotid alkalmazásával (Brown és Skinner, mint fent; 947-1001., 946-966. számú nukleotidok: AAC, és 979-981. számú nukleotidok: ACG, amely D279N és A284T aminosavszubsztitúciót eredményez). Az eredményül kapott pBSD78AΕ-661-DN-AT-plazmid megfelelő részletét szekvenáltuk. Miután a pBSD78A-E-661-DN-AT-t Ndel/Spel-enzimekkel hasítottuk, az 535 bp méretű fragmenst a megfelelően hasított pD78A-E-661-be ligáltuk, így jutottunk a pD78A-E-661-DN-AT-hez.
A továbbiakban a Q253-aminosavat kódoló nukleotidszekvenciát kicseréltük H253-at kódoló nukleotidszekvenciára, antiszensz orientációjú Mut2-oligonukleotid (Brown és Skinner, mint fent; 874-900., 886-888. számú nukleotidok: CAT, amely Q253H aminosavszubsztitúciót eredményez) alkalmazásával. Az eredményül kapott pD78A-E-661-QH-plazmid tartalmazta a Q253H-aminosav-cserét. A 284. aminosav cseréjét (A284T) antiszensz orientációjú Mut3-oligonukleotid (Brown és munkatársai, mint fent; 966-993., 979-981. számú nukleotidok: ACC, amely A284T aminosavszubsztitúciót eredményez) alkalmazásával végeztük, amelynek eredménye a pD78A-E-661-AT-plazmid volt. A negyedik, mindkét aminosav cseréjét (Q253H, A284T) tartalmazó pD78A-E-661-QH-AT-plazmidot mindkét oligonukleotid (Mut2, Mut3) alkalmazásával állítottuk elő egy helyspecifikus mutagenezisreakcióban. A p661Apart-, PD78A-E-661-, pD78A-E-661-DN-AT-, PD78A-E-661-QH-, pD78A-E-661-AT- és pD78A-E661-QH-AT-plazmidokat bemutatjuk a 4. ábrán.
HU 226 254 Β1
4. táblázat
Aminosavszubsztitúciókat tartalmazó IBDV-A-szegmens teljes hosszúságú cDNS-klónjainak előállítására alkalmazott oligonukleotidok9
| Oligo. jele | Nukleotidszekvencia |
| P21F | CGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTC |
| Sacl | |
| E/Del-MutQH | GAGAGCICGTGTTCAAAACAAGCGTCCAtAG |
| Narl | |
| E/Del-MutAT | GGGCGCCACCATCTACCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGG |
| TAATCACCAGAGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGaCC | |
| GGCATCGACAATCTTAT | |
| Spel | |
| E/Del-MutSR | CGTAGGCTACIAGTGTGACGGGACGGAGGGCTCCTGGATAG |
| TTGCCACCATGGATCGTCACTGCTAGGCTCCCcCgTGCCGA | |
| CCATGACATCTGTTCCCC | |
| Sacl | |
| D78-MutHQ | GAGAGCTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCAaGG |
| Narl | |
| D78-MutTA | GGGCGCCACCATCTACCTCATAGGCTTTGATGGGACAACGG |
| TAATCACCAGGGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGgCC | |
| GGCACCGACAACCTTATG | |
| Styl | |
| D78-MutRS | CGGAGGGCCCCTGGATAGTTGCCACCATGGATCGTCACTG |
| CTAGGCTCCCaCTTGC | |
| A44 | CAAGCCTCAGCGTTGGGGGAGAGC |
| A14 | GATCAGCTCGAAGTTGCTCACCCCA |
4. táblázat (folytatás)
| Oligo. jele | Orientáció | A. savszubsztitúció | Nukleotidszám |
| P21F | szensz | nincs | 601-622 |
| E/Del-MutQH | szensz | Q253H | 861-891 |
| E/Del-MutAT | szensz | A284T | 901-999 |
| E/Del-MutSR | antiszensz | S330R | 1094-1193 |
| D78-MutHQ | szensz | H253Q | 861-891 |
| D78-MutTA | szensz | T284 A | 901-1000 |
| D78-MutRS | antiszensz | R330S | 1115-1170 |
| A44 | szensz | nincs | 833-866 |
| A14 | antiszensz | nincs | 1228-1252 |
a Helyspecifikus mutagenezishez és klónozáshoz alkalmazott láncindító oligonukleotidok összetétele és elhelyezkedése. A felhasznált restrikciós hasítóhelyek alá vannak húzva, fölötte a megfelelő restrikciós enzim neve látható. Mutagenezis céljából megváltoztatott oligonukleotidok kis betűvel vannak szedve, és a kódolónukleotid-triplett vastag betűtípussal van szedve. A pozíciók, ahol a láncindító nukleotidok kötődnek (lásd nukleotidszám), valamint az aminosavak számozása P2-törzs közölt (Mundt és Müller, 1995, mint fent; NCBI nyilvántartási száma: X 84034) szekvenciájára leírtak szerint történt.
B-szegmens teljes hosszúságú cDNS-klónjának előállítása D78-törzs
A D78-törzs I. szerotípusából származó B-szegmens teljes hosszúságú cDNS-klónjának előállítása cél- 60 jából vírust szaporítottunk CEF-ben és ultracentrifugálással tisztítottuk. D78-törzsből származó, genomi vitális RNS-t tisztítottunk, reverz transzkripcióval cDNS-sé alakítottuk, és polimeráz-láncreakcióval (PCR) amplifi10
HU 226 254 Β1 káltuk, standardeljárásokat követve, leírt (Mundt és Vakharia, 1996) oligonukleotidokat alkalmazva. Az amplifikációs terméket tompa végűvé alakítva klónoztuk és megfelelő PCR-fragmenseket tartalmazó plazmidokat szekvenáltuk. A B-szegmens teljes hosszúságú cDNS-ét (T7-RNS-polimeráz-promoter vezérlete alatt) tartalmazó plazmid (pUC18BD78) előállítására szolgáló klónozóeljárás megfelelt Mundt és Vakharia (1996, mint fent) által a P2-törzs B-szegmensére leírt eljárásnak (3. ábra).
UK661-törzs
Három oligonukleotidpárt alkalmaztunk, amelyek Brown és Skinner (1996, mint fent) által leírt szekvenciainformációkból származtak:
i) UK661BFor1 (B5’-P2-oligonukleotid szerinti szekvencia, Mundt és Vakharia, 1996, mint fent), antiszensz orientációjú UK661BRev1 (708-736. számú nukleotidok). Az UK661BRev1-oligonukleotid 5’-vége: az UK-661-törzs B-szegmensének szekvenciájához hozzá van adva Xbal jelű restrikciós enzim hasítóhelyét tartalmazó szekvencia, amely 5’-CTCTAGAGG nonaszekvenciát tartalmaz;
ii) UK661BFor2 (751-677. számú nukleotidok), antiszensz orientációjú UK661Brev2 (2089-2113. számú nukleotidok). Az UK661BRev2-oligonukleotid 5’-vége: az UK-661-törzs B-szegmensének szekvenciájához hozzá van adva Xbal jelű restrikciós enzim hasítóhelyét tartalmazó szekvencia, amely 5’-CTCTAGAGG nonaszekvenciát tartalmaz;
iii) UK661BFor3 (2011-2035. számú nukleotidok), antiszensz orientációjú UK661BRev3 (Mundt és Müller, 1995, mint fent, 2804-2827. számú nukleotidok). Az UK661BRev3-oligonukleotid 5’-vége: az UK-661-törzs B-szegmensének szekvenciájához hozzá van adva Xbal jelű restrikciós enzim hasítóhelyét tartalmazó szekvencia, amely 5'-TCTAGAGCCC nonaszekvenciát tartalmaz. Itt a CCC-triplet Smal-hasítóhelyet hoz létre a B-szegmens virális genomi szekvencia utolsó három nukleotidjával (2825-2827. számú nukleotidok) együtt. Ezt a három pár oligonukleotidot (UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2 és UK661BFor3; UK661BRev3) alkalmazva RT-PCR-ben három cDNS-fragmenst amplifikáltunk, és tompa végűvé alakítva Smal-enzimmel emésztett pUC18-vektorba klónoztuk, így jutottunk a pUK661B1-hez, pUK661B2höz és pUK661B3-hoz, sorrendben. A három inszertált fragmens szekvenálása után a pUK661B2-t Agel/Xbalenzimekkel hasítottuk, így 1441 bp méretű fragmenshez jutottunk, amelyet ezután Agel/Xbal-enzimekkel hasított pUK661B1-be ligáltunk, így jutottunk a pUK661B12-höz. A B-szegmens teljes hosszúságú cDNS-klónjának előállítása céljából a pUK661B3-at BstBI/Xbal-enzimekkel hasítottuk, és az így kapott 694 bp méretű fragmenst BstBI/Xbal-enzimekkel hasított pUK661B12-be ligáltuk. Az eredményül kapott pB661-plazmid tartalmazta az UK661-törzsből származó B-szegmens teljes hosszúságú cDNS-szekvenciáját, T7-promoter vezérlete alatt. A pB661-et az 5. ábrán bemutatjuk [a számozás Mundt és Müller által (1995, mint fent) a P2-törzsre leírtak szerint történt].
Vírus kinyerése szövettenyészetben lévő cRNS-ből
RNS in vitro transzkripciójához a pAD78/ANB-, PAD78/ANB-HQ-, pAD78/ANB-TA-, pAD78/ANB-RS-, pAD78/ANB-TA-RS-, pAD78/ANB-E/Del-, pAD78/ANBΕ/Del-QH-, pAD78/ANB-E/Del-AT-, pAD78/ANB-E/DelSR-, pAD78/ANB-E/Del-QH-AT-, pAD78/ANB-E/DelAT-SR-, pAD78/ANB-E/Del-QH-SR-, pAD78/ANBE/Del-QH-AT-SR- és a pAD78-plazmidokat BsrGIvagy Pstl-enzimes hasítással linearizáltunk. A linearizált DNS további kezelését és a transzkripciót Mundt és Vakharia (1996) által leírtak szerint végeztük, két kivétellel: i) a transzkripciós keverékeket nem tisztítottuk fenol/kloroformmal, és (ii) QM-7-sejteket alkalmaztunk transzfekciós kísérletekre. Két nappal a transzfekció után a sejteket fagyasztottuk/felolvasztottuk, 700*g-n centrifugáltuk a celluláris törmelékek eltávolítása céljából, és az így kapott felülúszókat tovább tisztítottuk 0,45 pm-es szűrőn való szűréssel, és -70 °C-on tároltuk. Immunfluoreszcenciát alkalmazó kísérletekhez QM-7-sejteket steril fedőlemezeken növesztettünk.
RNS in vitro transzkripciójához UK661-ből származó A-szegmenst tartalmazó plazmidokat linearizáltunk BsrGI-enzimes hasítással. A D78-törzs B-szegmensét Pstl-enzimmel linearizáltuk, míg az UK661-törzs B-szegmensét Smal-enzimmel linearizáltuk. A linearizált DNS további kezelését és a transzkripciót a fentebb leírtak szerint végeztük.
IBDV-antigén detektálása
IBDV-antigént közvetett immunfluoreszcenciát alkalmazó vizsgálati eljárással (IFA) és nyúlban termeltetett anti-IBDV-antiszérumot alkalmazó Westem-blottal detektáltunk. IFA-hoz fedőlemezeken növesztett CEF-et inkubáltuk a passzáláshoz alkalmazott, transzfektált QM-7-, CEF- és CAM-felülúszókkal, sorrendben. 16 órás inkubációs idő eltelte után a CEF-et acetonnal fixáltuk és előkészítettük IFA-ra. IBDV-replikáció vizsgálata céljából, fedőlemezeken növesztett QM-7sejteket transzfekció után 24—48 óra hosszáig inkubáltunk, acetonnal fixáltunk és kezeltünk IFA-hoz.
Eredmények
Transzfekciós kísérletek intergenerikus cRNS-sel
Transzfekciós kísérletekhez D78-törzsből származó A-szegmens teljes hosszúságú cDNS-klónját (pD78A/ANB) és intergenerikus A-szegmenst (pD78A/ANB-E/Del) átírtunk szintetikus cRNS-re, és QM-7-sejtekbe, valamint párhuzamosan CEF-be kotranszfektáltuk B-szegmens (pD78B) teljes hosszúságú cRNS-ével. A transzfekció után két nappal a sejteket fagyasztottuk/felolvasztottuk, és az eredményül kapott felülúszókat kétszer passzáltuk CEF-re. CEF-et öt napig inkubáltunk a fertőzés után az egyes passzálások esetén. Fagyasztás/felolvasztás után az egyes transzfekciós felülúszókat, valamint az egyes transzfekciók egyes passzálásokat IBDV-antigénre teszteltük IFAval, CEF alkalmazásával. A transzfekciós kísérleteket háromszor megismételtük. Előállítottunk vírust a pD78B-plazmidból és a pAD78/ANB-plazmidból származó cRNS-kombináció transzfekciója után, amely a D78r-törzs előállításához vezetett. Ezzel ellentétben, a pD78A/ANB-E/Del-ből és a pD78B-ből származó cRNS
HU 226 254 Β1 alkalmazásával végzett transzfekciós kísérletek után nem tudtunk izolálni szövettenyészetet fertőző vírust. Annak analizálása céljából, hogy vajon a transzfekciót követte-e replikáció, transzfekciót végeztünk fedőlemezeken növesztett QM-7-sejtek alkalmazásával. Itt mindkét esetben detektáltunk vírusantigént 24 órával a transzfekció után, IFA alkalmazásával. Ezzel igazoltuk, hogy mindkét esetben történt vírusreplikáció, de csak a D78r esetén lehetett előállítani szövettenyészetet fertőző IBDV-t.
Transzfekciós kísérletek mutáns cRNS-sel
A szekvenciaösszehasonlítás eredményeire alapozva, előállítottunk számos, mutáns, teljes hosszúságú cDNS-klónt helyspecifikus mutagenezis alkalmazásával.
(I) E-variáns IBDV
Előállítottunk mutáns pD78A/ANB-E/Del-plazmidokat, amelyek a 253., 284. és 330. helyzetben aminosavszubsztitúciókat kódoltak az összes lehetséges, hét kombinációban (5. táblázat). Transzfekciós kísérleteket és passzálást végeztünk háromszor, párhuzamosan CEF-en és QM-7-sejteken. Az így kapott felülúszókat fertőzőképességre analizáltuk IFA-val. Miután pAD78/ANB-E/Del-, pAD78/ANB-E/Del-QH-, pAD78/ANB-E/Del-AT-, pAD78/ANB-E/Del-SR-, pAD78/ANB-E/Del-AT-SR- és pAD78/ANB-E/DelQH-SR-plazmidoknak megfelelő cRNS-sel, kombinációban pD78B-cRNS-sel QM-7-sejteket vagy CEF-et transzfektáltunk, nem tudtunk fertőző vírust izolálni. Ha pAD78/ANB-E/Del-QH-AT-ból vagy pAD78/ANB-E/DelQH-AT-SR-ből származó cRNS-el transzfektáltunk, fertőző vírus (D78A-E/Del-QH-AT és D78A-E/Del-QHAT-SR) képződéséhez vezetett. A specifitást IFA-val igazoltuk CEF-en, valamint QM-7-sejteken. Ez azt mutatta, hogy IBDV-ből származó VP2 kritikus szerepet játszik szövettenyészet fertőzésében. Az aminosavszubsztitúciók [(BU) Q-253-H (TC) és (BU) A-284-T (TC)] szükségesek és elégségesek voltak az alkalmazott szövettenyészetekre fertőző IBDV képződéséhez. A három aminosavszubsztitúcióval rendelkező IBDVmutánst (CEF-adaptált D78/E-variáns) alkalmaztuk további kísérletekben (2. példa).
(ii) Klasszikus IBDV
D78
Ezen eredmények igazolása céljából előállítottunk egy második készlet plazmidot, pAD78/ANB-t alkalmaztunk a helyspecifikus mutagenezishez olyan plazmidok előállítása céljából, amelyek egyetlen aminosavszubsztitúciót (pAD78/ANB-HQ, pAD78/ANB-TA, pAD78/ANB-RS) vagy az összes három aminosavszubsztitúcióját tartalmazták (pAD78/ANB-HQ-TA-RS). Ezt a négy plazmidot transzfekciós kísérletekben alkalmaztuk pD78B-vel kombinációban a fentebb leírtak szerint. Fertőző IBDV-t tudtunk előállítani pAD78/ANBRS-ből származó cRNS transzfekciója után, IFA-val detektálva. Ismételten megemlítjük, hogy a 330. aminosavnak nincs semmilyen hatása az előállított vírusra, szövettenyészetet fertőző képessége tekintetében.
A transzfekció után valamennyi konstrukciót teszteltük replikációra IFA-val. IBDV-antigént tudtunk specifikusan detektálni a transzfekció után 24 és 48 órával, ahol tipikusan nagy, intenzíven festődő aggregátumokat figyeltünk meg a citoplazmában.
UK661
Transzfekciós kísérletekhez kiméra A-szegmensek teljes hosszúságú cDNS-klónjait (pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E661-AT és pD78A-E-661-QH-AT) átírtuk szintetikus cRNS-re, és kotranszfektáltuk D78-törzsböl származó B-szegmens vagy UK661-törzsből származó B-szegmens teljes hosszúságú cRNS-ével QM-7-sejtekbe, valamint párhuzamosan CEC-be. A transzfekció után két nappal a sejteket fagyasztottuk/felolvasztottuk, és az eredményül kapott felülúszókat egyszer passzáltuk CEC-re. CEC-et 24 vagy 48 óra hosszáig inkubáltunk a fertőzés után, fixáltuk és kezeltük immunfluoreszcenciához. Előállítottunk CEC-re fertőző vírust a pD78A-E661-QH-AT-plazmidból és mindkét másik plazmidból (pD78B és pB661) származó cRNS-kombinációval való transzfekciója után, amely a D78A-E-661-QH-AT jelű, kiméra IBDV előállításához vezetett. Ezzel ellentétben, pD78A-E-661-ből, pD78A-E-661-DN-AT-ből, pD78A-E-661-QH-ból és pD78A-E-661-AT-böl származó cRNS-t, akár pBD78-ból vagy akár pB661-ből származó cRNS-el kombinálva alkalmazott transzfekciós kísérletek után nem tudtunk izolálni szövettenyészetet fertőző vírust. A fertőzés után a transzfekciós felülúszó 72 órás inkubálásával egyetlen fertőzött CEF volt detektálható D78-E-661-DN-AT esetén.
(iii) GLS-IBDV
Intergeneríkus, valamint mutáns plazmidok alkalmazásával végzett transzfekciós kísérletek eredményeinek igazolása céljából kihasználtuk a természetesen előforduló IBDV-törzspár előnyeit. Nyálkatömlőből származó GLS-törzs (GLS-B) és a szövettenyészetre adaptált GLS-TC-variánsból származó VP2 variábilis régióját amplifikáltuk, klónoztuk és analizáltuk. A pGLS-B-ből és pGLS-TC-ből kapott két GLS-törzs aminosavszekvenciájának összehasonlításával kimutattuk, hogy a két szekvencia között egy aminosaveltérés van a 284. helyzetben [(GLS-B)A-»T(GLS-TC)] (1B. ábra). A 253. (Q) és 330. (S) helyzetben lévó aminosavak azonosak voltak a fentebb leírt BU-csoport aminosavaival. Annak analizálása céljából, hogy a 284. helyzetben lévő csere (A—»T) elegendő-e fertőző vírus keletkezéséhez, előállítottuk mindkét GLS-variáns VP2-jének hipervariábilis régióját tartalmazó, két plazmidot (pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC és pD78A/ANBE/Del-GLS-B). A pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC-ből és a pD78A/ANB-E/Del-GLS-B-ből származó cRNS-eket QM-7-sejtekbe, valamint párhuzamosan CEF-be transzferáltuk, kombinálva pD78B-cRNS-sel. A felülúszók szövettenyészetbe való passzálása után fertőző vírust tudtunk detektálni IFA-val, valamint CPE-vel a pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC cRNS-sével való transzfekció után. A pD78A/ANB-E/Del-GLS-B-ből származó cRNS-sel végzett számos kísérletben nem tudtunk szövettenyészetre fertőző IBDV-t tartalmazó felülúszót előállítani. Mindkét, pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC- és pD78A/ANB-E/Del-GLS-B-plazmiddal végzett in vitro transzkripcló/transzláció alkalmazásával kimutattuk a
HU 226 254 Β1 polifehérjék teljes processzálódását. Mindkét plazmidból származó cRNS és pD78B-ből származó cRNS kombinációjával végzett transzfekció után vírusantigént detektáltunk IFA-val. Tehát mindkét kiméra esetén bebizonyosodott, hogy replikációkompetensek. Mindent egybevetve, a VP2 hipervariábilis régiójának 284. helyzetében lévő csere elegendő volt fertőző, intergenerikus IBDV előállítására.
5. táblázat
IBDV-A-szegmensének teljes hosszúságú, intergenerikus cDNS-klónjai által tartalmazott aminosavszubsztitúciók összegzése.
| Plazmid8 | 253. | 284. | 330. | Szövettenyészet | |
| Aminosavb | Traszf.c | Passzálás0 | |||
| pD78A/ÁNB-E/Del | Q | A | S | + | - |
| pD78A/ÁNB-E/Del-QH | H | A | S | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-AT | Q | T | S | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-SR | Q | A | R | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-QH-AT | H | T | S | + | + |
| pD78AMNB-E/Del-AT-SR | Q | T | R | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-QH-SR | H | A | R | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-QH-AT-SR | H | T | R | + | + |
| pD78A/ÁNB | H | T | R | + | + |
| PD78A/ÁNB-HQ | Q | T | R | + | - |
| PD78AMNB-TA | H | A | R | + | - |
| PD78A/ANB-RS | H | T | S | + | + |
| pD78A/ANB-HQ-TA-RS | Q | A | S | + | - |
| pD78A/ANB-E/Del-GLS-TC | 0 | T | s | + | + |
| pD78A/ÁNB-E/Del-GLS-BU | Q | A | s | + | - |
a A plazmidok szövettenyészethez adaptált, I. szerotípusú D78-törzs A-szegmensének teljes hosszúságú cDNS-klónjaira alapultak. Nyálkatömlöből származó, I. szerotípushoz tartozó GLS-BU-törzs, Delaware-E-törzs (E/Del) és szövettenyészethez adaptált, I. szerotípusú GLS-TC-törzs szekvenciáit D78-szekvenciákkal szubsztituáltuk.
b Az aminosavak számozása P2-törzs közölt (Mundt és Müller, 1995, mint fent; NCBI nyilvántartási száma: X 84034) szekvenciájára leírtak szerint történt. Természetesen előforduló aminosavak dőlt betűvel vannak jelölve és a megváltoztatott aminosavak vastag betűvel vannak jelölve.
0 Csirkeembriósejteket (CEF), valamint QM-7-sejteket alkalmaztunk a transzfekciós kísérletekhez. IBDV-antigént indirekt immunfluoreszcencia felhasználásával, nyúlban termeltetett anti-IBDV-szérum (Mundt és munkatársai, 1995) alkalmazásával detektáltunk 24 órával a transzfekció után. Antigén pozitív (+), antigén negatív (-).
d CEF-et alkalmaztunk transzfekciós felülúszók passzálására. IBDV-antigént indirekt immunfluoreszcencia felhasználásával, nyúlban termeltetett anti-IBDV-szérum (Mundt és munkatársai, 1995) alkalmazásával detektáltunk CEF-re passzálás után. Antigén pozitív (+), antigén negatív (-).
2. példa
CEF-adaptált, E-variáns IBDV-mutáns biológiai tulajdonságai
Anyagok és módszerek
IBDV-vakcinák előállítása 50
Kiméra D78/E-variáns (nyálkatömlőre adaptált)
9-12 napos SPF-tojásokat fertőztünk kiméra
D78/E-variáns/D78-al (D78/E-variáns/D78 a 3 aminosavcsere nélkül a Q253H, A284T és S330R helyzetekben) chorioallantois-membránon keresztül (CAM). öt 55 nappal a fertőzés után a CAM-ot és az embriót elkülönítettük és homogenizáltuk. A homogenizátumot CAM-on titráltuk. A felülúszót úgy hígítottuk, hogy 1O2'° EID50/állat vakcinadózist eredményezzen szemcsepp formájában alkalmazva. 60
Kiméra D78/E-variáns (CEF-adaptált)
Primer, csirkeembrióból származó fibroblasztokat (CEF) preparáltunk 2x106/ml végkoncentrációban. A sejteket 5% magzati borjúszérumot tartalmazó, Eagles-féle esszenciális minimáltápközegben tenyésztettük. 15 ml ilyen sejtszuszpenzióhoz hozzáadtunk 0,1 ml IBDV-vírust (D78/E-variáns/D78 a 3 aminosavcserével a Q253H, A284T és S330R helyzetekben), melyet 1 ml-ben oldottunk fel. 3-6 napig inkubáltuk magas nedvességtartalmú inkubátorban 37 °C-on, azután a felülúszót úgy hígítottuk, hogy 105·3 * vagy 103·5 TCID50/állat vakcinadózist eredményezzen szemcsepp vagy intramuszkuláris injekció formájában alkalmazva, sorrendben.
HU 226 254 Β1
Kereskedelemben elérhető, klasszikus IBDVvakcina: Nobilis D78-törzs A vakcinát úgy hígítottuk, hogy 103’3 TCID50/állat vakcinadózist eredményezzen szemcsepp formájában alkalmazva.
IBDV-vakcinák azonosítása panelteszt alkalmazásával
Mindkét IBDV-törzset ELISA-ban, különböző monoklonális ellenanyagok alkalmazásával azonosítottuk Van Loon és munkatársai [Van Loon, A.A.W.M., D. Lütticken 10 és D. B. Snyder, „Rapid quantification of infectious bursal disease (IBD) challenge, tieid or vacdne vírus strains. International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anémia, Rauischhilzhausen, Németország, 179-187. old. (1994)] által leírtak szerint.
Növesztés CEF-en
Mindkét IBDV-törzset CEF fertőzésére alkalmaztuk.
Az IBDV-k specifikus CPE-t (citopatikus hatást) indukáló képességét mikroszkopikusan vizsgáltuk 6 napos periódusban.
Vakcináció
Meghatároztuk különböző vakcinák hatását olyan fertőzés elleni rezisztencia mérésével, melyet fertőző vírus (virulens E-variáns IBDV-törzs) beadásával váltottunk ki 14 nappal a vakcináció után. Kiméra
D78/E-variáns (nyálkatömlőre adaptált) vakcinát alkalmaztunk szemcsepp formájában (1O2’° EID50/állat), kéthetes életkorban. Kiméra D78/E-variáns (CEFadaptált) vakcinát (105·5 vagy 103·5 TCID50/állat) alkal5 máztunk szemcsepp vagy intramuszkuláris injekció formájában, sorrendben, kéthetes életkorban. Kereskedelemben elérhető klasszikus vakcinát, Nobilis D78-törzset (Intervet International Β. V., Hollandia) (103·3 TCID50/állat) alkalmaztunk szemcsepp formájában, kéthetes életkorban. Öt állatból álló csoport esetén vizsgáltuk IBDV jelenlétét a Fabricius-nyálkatömlőben és mikroszkopikus sérüléseket a nyálkatömlőben 3, 7, 10 és 13 nappal a vakcináció és 3 nappal a fertőzés után. Meghatároztuk a fertőzés elleni védettséget.
Eredmények
IBDV-vakcinák azonosítása panelteszt alkalmazásával
Amint a 6. táblázatban látható, kiméra D78/E-variáns (nyálkatömlőre adaptált) és kiméra D78/E-variáns 20 (CEF adaptált) azonos reakciós mintázatot mutatott különböző MCA-val. Ez azt jelenti, hogy a 3 aminosavcserének nincs hatása a víruson lévő epitópokra, melyet különböző MCA-val határoztunk meg. A klasszikus, kereskedelemben elérhető vakcina eltérő reakciós 25 mintázattal rendelkezik különböző MCA-val.
6. táblázat
Különböző IBDV-vírusok panelmintázata különböző MCA-val. + epitóp jelen van a víruson; - epitóp nincs jelen a víruson.
| Vírus/MCA | B29 | 8 | R63 | BK9 | 67 | 57 | B69 |
| Kiméra D78/E-variáns (nyálkatömlő) | + | + | + | + | + | - | - |
| Kiméra D78/E-variáns (CEF) | + | + | + | + | + | - | - |
| Nobilis D78-törzs | + | + | + | - | - | - | + |
| Kontroll IBDV-törzsek | |||||||
| Klasszikus | + | + | + | - | - | - | + |
| E-variáns | + | + | + | + | + | - | - |
| GLS | + | + | - | - | - | + | - |
Növesztés CEF-en
Amint a 7. táblázatban látható, kiméra D78/E-variáns (nyálkatömlő) nem képes CEF-en növekedni. Mind a kiméra D78/E-variáns (CEF), mind a klasszikus, kereskedelemben elérhető Nobilis D78-vakcinatörzs képes CEF-en replikálódni, CPE-t indukálva.
7. táblázat
CEF-en való növekedés és specifikus IBDV-CPE indukálás képessége.
+=nem indukál CPE-t CEF-en;
-=nem okoz CPE-t CEF-en.
| Vírus | CEF-növekedés |
| Kiméra D78/E-variáns (nyálkatömlő) | - |
| Kiméra D78/E-variáns (CEF) | + |
| Nobilis D78-törzs | + |
Mikroszkopikus sérülések átlagos mérete a nyálkatömlőben 3, 7, 10 és 13 nappal vakcináció után, és 3 és 10 nappal fertőzés után
Az eredményeket a 8. táblázatban mutatjuk be. Amint a 3. táblázatban látható, nem CEF-adaptált, D78/E-variáns (nyálkatömlő) kiméra törzs virulens, és teljes limfocitikus kimerülést indukál már 7 nappal a 50 vakcináció után. Ezzel ellentétben, (CEF) szövettenyészete adaptált D78/E-variánstörzs nem indukált sérüléseket vakcináció után. A kereskedelemben elérhető vakcina enyhe-mérsékelt sérüléseket indukált vakcináció után. Az egyedi adatok azt mutatják, hogy kiméra
D78/E-variánssal (nyálkatömlő) vagy D78-cal oltott állatok védettek voltak fertőzés ellen. Kiméra D78/E-variánssal okulárisan vagy intramuszkulárisan oltott állatok szintén védettséget élveztek 3 nappal a fertőzés után, bár kevésbé, mint a virulens szülői törzzsel való indukálás esetén.
HU 226 254 Β1
8. táblázat
Sérülések átlagos mérete a nyálkatömlőben
| Napok vakcináció után | Napok fertőzés után | |||||
| Vírus | 3 | 7 | 10 | 13 | 3 | 10 |
| D78/E-variáns/D78 | 3,2 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 4,4C | 4,7 |
| D98/VP5+ (oc) | 0 | 0 | 0 | 0 | 3,0A | 4,1 |
| D98/VP5+ (im) | 0 | 0 | 0 | 0 | 1,0A | 2,8 |
| Nobilis D78-törzs | 0,2 | 2,2 | 2,0 | 1,8 | 2,8C | 1,9 |
| Nem oltott kontrollok | 5,0A |
(oc)=okulárisan; (im)=intramuszkulárisan; C=krónikus sérülések: A=akut sérülések.
SZEKVENCIALISTA <210> 1 <211> 25 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 1 gatcagctcg aagttgctca cccca <210>2 <211 >24 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 2 caagcctcag cgttggggga gagc <210>3 <211 >99 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 3 gggcgccacc atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcaaacaat gggctgacga ccggcatcga caatcttat <210>4 <211> 2531 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400>4 gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag g <210>5 <211> 22
HU 226 254 Β1 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 5 cgtcctagta ggggaagggg te 22 <210 6 <211> 31 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400 6 gagagetegt gttcaaaaca agcgtccata g 31 <210>7 <211> 56 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 7 cggagggccc ctggatagtt gccaccatgg atcgtcactg ctaggctccc acttgc 56 <210>8 <211> 100 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 8 egtaggetae tagtgtgacg ggacggaggg ctcctggata gttgccacca tggategtea 60 ctgctaggct cccccgtgcc gaccatgaca tctgttcccc 100 <210> 9 <211>100 <212> DNS <213> fertőző nyálkatömlő-betegség vírusa <400> 9 gggcgccacc atctacctca taggetttga tgggacaacg gtaatcacca gggctgtggc 60 cgcaaacaat gggetgaegg ccggcaccga caaccttatg 100
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás CEF-sejttenyészetben replikálódni képes, 50 fertőző IBDV-mutáns előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) külön-külön előállítunk CEF-sejttenyészetben az IBDV replikálódni nem képes A- és B-genomszegmensének megfelelő cDNS-t tartalmazó DNS-konstrukció- 55 kát, (Ii) mutációt hozunk létre:(a) E-variáns vagy klasszikus IBDV-törzs VP2-génjében a 253. és 284. aminosavat kódoló, egyik vagy mindkét kodonban, vagy 60 (b) GLS-IBDV-törzs VP2-génjében a 284. aminosavat kódoló kodonban, az A-szegmenst tartalmazó cDNS-ben, így E-variáns vagy klasszikus IBDV-törzs esetén a VP2-gén 253. és 284. aminosavának megfelelő mutánskodon-sorrendben hisztidint és treonint kódol, vagy GLS-IBDV-törzs esetén a mutáns VP2gén 284. aminosavának megfelelő kodon treonint kódol, (iii) lehetővé tesszük, hogy az A-szegmenst és a B-szegmenst tartalmazó cDNS RNS-transzkriptumai az IBDV-mutáns szaporodását iniciálják tenyésztési tápközegben lévő gazdasejtekben, és (iv) izoláljuk az IBDV-mutánst a tenyészetből.HU 226 254 Β1
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy CEF-sejttenyészethez adaptált olyan IBDV-mutánst alkalmazunk, amelyben a VP2-fehérje a 330. helyzetben szerint, arginint vagy lizint, előnyösen arginint tartalmaz.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy klasszikus vagy E-variáns IBDV VP2génjébe, a 253., 284. és 330. helyzetnek megfelelő kodonok mindegyikében kialakítunk mutációt.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 253 (Gin), 284 (Alá) és 330 (Ser) kodonjaiban alakítunk ki mutációkat.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutáns A-szegmenst tartalmazó cDNS-ből és a B-szegmenst tartalmazó cDNSből szintetikus RNS-transzkriptumokat állítunk elő, azután gazdasejteket transzfektálunk a szintetikus RNStranszkriptumokkal.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás további lépéseiben kiméra IBDV-t állítunk elő.
- 7. Géntechnológiailag módosított, fertőző, CEFsejttenyészetben replikálódni képes IBDV-mutáns, amely egy E-variáns IBDV VP2-génjében a 253. helyzetben His és a 284. helyzetben Thr, és adott esetben a 330. helyzetben Arg aminosavaknak megfelelő kodonokat tartalmaz, azzal a feltétellel, hogy a VP2-ptotein nem tartalmaz glicin és/vagy valin aminosavat sorrendben a 318. és/vagy 325. pozíciókban.
- 8. A 7. igénypont szerinti géntechnológiailag módosított, fertőző IBDV-mutáns, amelyben a VP2-ptotein aszparaginsavat és/vagy metionint tartalmaz sorrendben a 318. és/vagy 325. pozíciókban.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti, géntechnológiailag módosított, fertőző IBDV-mutáns, amely kiméra IBDV-mutáns.
- 10. A 9. igénypont szerinti, géntechnológiailag módosított, fertőző IBDV-mutáns, amely D78/E-variáns mutáns (CEF-adaptált).
- 11. Vakcina, baromfi IBDV-fertőzés eredményeként kialakult betegség elleni védelmére történő alkalmazásra, amely 7-10. igénypontok bármelyike szerinti géntechnológiailag módosított IBDV-mutánst tartalmaz, gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy hígítószerrel együtt.
- 12. Eljárás baromfi IBDV-fertőzés eredményeként kialakult betegség elleni védelmére alkalmas vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított fertőző, CEF-sejttenyészetben replikálódni képes IBDV-mutánst gyógyászatllag elfogadható hordozóval vagy hígítószerrel kombinálunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99200647 | 1999-03-05 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0000992D0 HU0000992D0 (en) | 2000-05-28 |
| HUP0000992A2 HUP0000992A2 (hu) | 2000-11-28 |
| HUP0000992A3 HUP0000992A3 (en) | 2005-06-28 |
| HU226254B1 true HU226254B1 (en) | 2008-07-28 |
Family
ID=8239949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0000992A HU226254B1 (en) | 1999-03-05 | 2000-03-03 | Genetically engineered cell culture adapted infections bursal diseases virus (ibdv) mutants |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6492148B1 (hu) |
| EP (1) | EP1035203B1 (hu) |
| JP (2) | JP4675447B2 (hu) |
| KR (1) | KR100709077B1 (hu) |
| AT (1) | ATE266097T1 (hu) |
| BR (1) | BR0001011B1 (hu) |
| CA (1) | CA2298956C (hu) |
| DE (1) | DE60010358T2 (hu) |
| DK (1) | DK1035203T3 (hu) |
| ES (1) | ES2220333T3 (hu) |
| HU (1) | HU226254B1 (hu) |
| PL (1) | PL198981B1 (hu) |
| PT (1) | PT1035203E (hu) |
| ZA (1) | ZA200001069B (hu) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL136232A0 (en) * | 2000-05-18 | 2001-05-20 | Bar Ilan University Res Author | Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population |
| CN1592794A (zh) * | 2001-03-09 | 2005-03-09 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于合成感染性丙型肝炎病毒的细胞培养系统 |
| EP1438385A1 (en) * | 2001-10-25 | 2004-07-21 | Bar-Ilan University | Interactive transparent individual cells biochip processor |
| IL154677A0 (en) * | 2003-02-27 | 2003-09-17 | Univ Bar Ilan | A method and apparatus for manipulating an individual cell |
| US8597597B2 (en) | 2003-06-26 | 2013-12-03 | Seng Enterprises Ltd. | Picoliter well holding device and method of making the same |
| US9200245B2 (en) * | 2003-06-26 | 2015-12-01 | Seng Enterprises Ltd. | Multiwell plate |
| WO2004113492A1 (en) * | 2003-06-26 | 2004-12-29 | Molecular Cytomics Ltd. | Improved materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chip coats, processed cell-chips and uses thereof |
| US7888110B2 (en) | 2003-06-26 | 2011-02-15 | Seng Enterprises Ltd. | Pico liter well holding device and method of making the same |
| US7982751B2 (en) * | 2003-07-11 | 2011-07-19 | The University Of North Carolina | Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop |
| US20050064524A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-24 | Mordechai Deutsch | Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same |
| JP2007520546A (ja) * | 2004-02-03 | 2007-07-26 | ケマジス リミティド | モンテルカストナトリウムの安定な非晶質性形態 |
| US7403647B2 (en) * | 2004-09-13 | 2008-07-22 | Seng Enterprises Ltd. | Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| EP1763665A1 (en) * | 2004-07-07 | 2007-03-21 | Seng Enterprises Limited | Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| US20080009051A1 (en) * | 2004-08-25 | 2008-01-10 | Seng Enterprises Ltd. | Method and Device for Isolating Cells |
| ES2352344T3 (es) | 2005-01-25 | 2011-02-17 | Seng Enterprises Limited | Dispositivo de microfluido para estudio de células. |
| DE102005034043B4 (de) * | 2005-07-18 | 2019-12-12 | Südzucker Aktiengesellschaft Mannheim/Ochsenfurt | Gemisch, enthaltend L-Carnitin und Trehalulose, sowie Produkt enthaltend das Gemisch |
| US20070141555A1 (en) * | 2005-10-11 | 2007-06-21 | Mordechai Deutsch | Current damper for the study of cells |
| WO2007052245A1 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-10 | Seng Enterprises Ltd. | Method and device for studying floating, living cells |
| US20060223999A1 (en) * | 2006-05-10 | 2006-10-05 | Chemagis Ltd. | Process for preparing montelukast and precursors thereof |
| US9975118B2 (en) | 2007-11-15 | 2018-05-22 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| US9145540B1 (en) | 2007-11-15 | 2015-09-29 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| EP2407534A1 (en) | 2010-07-14 | 2012-01-18 | Neo Virnatech, S.L. | Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions |
| CN102258777B (zh) * | 2011-06-30 | 2012-09-26 | 河南农业大学禽病研究所 | 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 |
| CN111235117B (zh) * | 2020-02-13 | 2021-08-27 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一株自然适应体外细胞培养的鸡传染性法氏囊病病毒经典株及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5788970A (en) * | 1994-03-29 | 1998-08-04 | The University Of Maryland College Park | Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon |
| US5871744A (en) * | 1996-09-05 | 1999-02-16 | University Of Maryland-Biotechnology Inst. | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
-
2000
- 2000-02-25 US US09/513,487 patent/US6492148B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 PT PT00200709T patent/PT1035203E/pt unknown
- 2000-02-28 DE DE60010358T patent/DE60010358T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 ES ES00200709T patent/ES2220333T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 EP EP00200709A patent/EP1035203B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-28 DK DK00200709T patent/DK1035203T3/da active
- 2000-02-28 AT AT00200709T patent/ATE266097T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-02 ZA ZA200001069A patent/ZA200001069B/xx unknown
- 2000-03-02 CA CA002298956A patent/CA2298956C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-02 JP JP2000057146A patent/JP4675447B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-03 BR BRPI0001011-1A patent/BR0001011B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-03-03 PL PL338773A patent/PL198981B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-03-03 HU HU0000992A patent/HU226254B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-03-04 KR KR1020000010849A patent/KR100709077B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-07-10 US US10/192,469 patent/US6569422B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-09-08 JP JP2010201298A patent/JP2011036255A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU0000992D0 (en) | 2000-05-28 |
| JP4675447B2 (ja) | 2011-04-20 |
| ATE266097T1 (de) | 2004-05-15 |
| BR0001011B1 (pt) | 2011-05-17 |
| DE60010358T2 (de) | 2004-09-23 |
| ES2220333T3 (es) | 2004-12-16 |
| KR20010069175A (ko) | 2001-07-23 |
| PT1035203E (pt) | 2004-08-31 |
| PL338773A1 (en) | 2000-09-11 |
| KR100709077B1 (ko) | 2007-04-19 |
| CA2298956C (en) | 2009-12-01 |
| DE60010358D1 (de) | 2004-06-09 |
| US6569422B1 (en) | 2003-05-27 |
| HUP0000992A2 (hu) | 2000-11-28 |
| ZA200001069B (en) | 2000-10-20 |
| HUP0000992A3 (en) | 2005-06-28 |
| DK1035203T3 (da) | 2004-08-30 |
| CA2298956A1 (en) | 2000-09-05 |
| EP1035203B1 (en) | 2004-05-06 |
| JP2011036255A (ja) | 2011-02-24 |
| JP2000312593A (ja) | 2000-11-14 |
| BR0001011A (pt) | 2001-07-03 |
| PL198981B1 (pl) | 2008-08-29 |
| US6492148B1 (en) | 2002-12-10 |
| EP1035203A1 (en) | 2000-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU226254B1 (en) | Genetically engineered cell culture adapted infections bursal diseases virus (ibdv) mutants | |
| JP4670025B2 (ja) | 合成ｒｎａ転写物からのビルナウイルスの生成方法 | |
| US6231868B1 (en) | Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts | |
| US9273287B2 (en) | Avian reoviridae and vaccines thereof | |
| JP4316025B2 (ja) | 組換えビルナウイルスワクチン | |
| EP0887412A1 (en) | Recombinant birnavirus vaccine | |
| JP4646903B2 (ja) | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）の変異株およびワクチン | |
| US6699479B1 (en) | Recombinant newcastle disease virus as an embryo vaccine | |
| KR100759769B1 (ko) | 광범위한 감염성 활액낭 질병 바이러스 백신 | |
| EP1170302B1 (en) | Infectious bursal disease virus vaccines | |
| KR102421249B1 (ko) | 국내 분리 미주형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 | |
| KR102421251B1 (ko) | 국내 분리 중국형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 | |
| WO2001092486A1 (en) | Serotype chimeric ibdv strains | |
| EP1074614B1 (en) | A recombinant Newcastle disease virus for in ovo vaccination | |
| MXPA00002278A (en) | Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal diseases virus (ibdv) mutants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |