ES2220333T3

ES2220333T3 - Mutantes del virus de la enfermedad infeccionsa de las bursas (ibdv) adaptados por ingenieria genetica para el cultivo celular.

Info

Publication number: ES2220333T3
Application number: ES00200709T
Authority: ES
Inventors: Adriaan Antonius Wilhelmus Maria Van Loon; Egbert Mundt
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2020-02-28
Also published as: PL338773A1; ZA200001069B; CA2298956C; KR100709077B1; PL198981B1; DK1035203T3; EP1035203B1; JP2000312593A; HU226254B1; HUP0000992A2; BR0001011A; JP4675447B2; DE60010358T2; JP2011036255A; HUP0000992A3; PT1035203E; US6569422B1; HU0000992D0; ATE266097T1; KR20010069175A

Abstract

Un método para la preparación de un mutante infeccioso del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF que comprende las etapas de: (i) preparar separadamente una construcción de ADN que contiene ADNc de los segmentos A y B genómicos de un IBDV que no es capaz de replicarse en un cultivo de células CEF, (ii) introducir una mutación en: a uno o ambos codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 de las cepas Variante-E o Clásica del IBDV, o en b el codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 de una cepa GLS del IBDV, en el ADNc que comprende el segmento A, de tal manera que los codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 mutado codifiquen un residuo de histidina y un residuo de treonina, respectivamente, en el caso de las cepas Variante-E o Clásica del IBDV, o de tal manera que el codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 mutado codifique un residuo de treonina en el caso de una cepa GLS del IBDV, (iii) permitir quelos transcritos de ARN del ADNc que comprende el segmento A y el segmento B inicien la replicación del mutante de IBDV en células huésped en un medio de cultivo, y (iv) aislar el mutante del IBDV del cultivo.

Description

Mutantes del virus de la enfermedad infecciosa de las bursas (IBDV) adaptados por ingeniería genética para el cultivo celular.

La presente invención tiene que ver con un método para la preparación de un mutante infeccioso del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF, con un mutante del IBDV producido mediante ingeniería genética así como con una vacuna que contiene tal mutante del IBDV.

El virus de la enfermedad infecciosa de la bursa (IBDV) es un miembro de la familia Birnaviridae. Los virus de esta familia tienen una organización genómica muy similar y un ciclo de replicación similar. Los genomas de estos virus constan de 2 segmentos (A y B) ARN de doble hebra (dh). El segmento A más grande codifica una poliproteína que es cortada mediante autoproteolisis para formar las proteínas víricas maduras VP2, VP3 y VP4. VP2 y VP3 son las proteínas estructurales principales del virión. La VP2 es el principal inmunógeno para la protección del huésped de los birnavirus, y contiene las regiones antigénicas responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes. La proteína VP4 parece ser una proteasa codificada por el virus que está implicada en el procesamiento de una poliproteína precursora de las proteínas VP2, VP3 y VP4. El segmento A más grande posee también un segundo marco de lectura abierto (ORF), que precede y se solapa parcialmente con el gen de la poliproteína. Este segundo marco de lectura abierto codifica una proteína VP5 de función desconocida que está presente en las células infectadas por IBDV. El segmento B más pequeño codifica VP1, una proteína multifuncional de 90 kDa con actividad polimerasa y con actividad de enzima formador de casquetes.

Para el IBDV, existen dos serotipos, el serotipo 1 y el serotipo 2. Los dos serotipos pueden ser diferenciados mediante análisis de neutralización del virus (NV). Además, se han aislado subtipos del serotipo 1. Estos llamados virus "variantes" de serotipo 1 pueden ser identificados mediante ensayos de neutralización cruzada, con un panel de anticuerpos monoclonales o con RT-PCR. Estos subtipos del serotipo 1 del IBDV han sido también descritos en la literatura, por ejemplo: las cepas Clásica, Variante-E, GLS, RS593 y DS326 (Van Loon y col., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Alemania, 179-187, 1994).

La Enfermedad Infecciosa de la Bursa (IBD), llamada también enfermedad de Gumboro, es una infección vírica aguda altamente contagiosa de los pollos, que tiene el tejido linfoide como su diana primaria, con un tropismo selectivo para las células de la bursa de Fabricio. La tasa de morbilidad en bandadas susceptibles es elevada, con una rápida pérdida de peso y tasas de mortalidad moderadas. Los pollos que se recuperan de la enfermedad pueden tener deficiencias inmunes debido a la destrucción de la bursa de Fabricio, que es esencial para el mecanismo de defensa de los pollos. El virus de la IBD produce una grave inmunosupresión en los pollos menores de 3 semanas de edad e induce lesiones en la bursa en los pollos de hasta 3 meses de edad.

Durante muchos años la enfermedad pudo ser prevenida mediante la inducción de niveles elevados de anticuerpos en las bandadas reproductoras mediante la aplicación de una vacuna inactivada a los pollos que habían sido estimulados con una vacuna de IBDV vivos atenuados. Esto ha mantenido las pérdidas económicas causadas por la IBD en un mínimo. Los anticuerpos maternos en los pollos derivados de reproductores vacunados previenen la infección temprana con IBDV y disminuyen los problemas asociados con la inmunosupresión. Además, las vacunas vivas atenuadas han sido utilizadas también con éxito en bandadas de pollos comerciales una vez que habían disminuido los anticuerpos maternos.

Recientemente, cepas de IBDV muy virulentas han causado brotes de la enfermedad con una alta mortalidad en Europa. Los programas actuales de vacunación no pudieron proteger a los pollos suficientemente. Los fallos de la vacunación fueron debidos principalmente a la incapacidad de las vacunas vivas para infectar a las aves antes del desafío con el virus de campo virulento.

Por tanto, existe una necesidad constante de mejorar las vacunas existentes y de desarrollar nuevos tipos de vacunas. Para el desarrollo de vacunas vivas se requieren virus de la IBD en forma atenuada. Convencionalmente, esto puede ser realizado mediante el pase seriado de aislados de campo del IBDV sobre un sustrato apropiado. Para el desarrollo de vacunas de IBDV inactivado es necesario un sustrato apropiado para la producción de grandes de cantidades de masa antigénica del IBDV resultante de la propagación de los virus de la IBD sobre el sustrato.

Se sabe que los IBDVs de campo pueden ser fácilmente propagados in vivo en la bursa de aves infectadas o en huevos con embrión. Sin embargo, aunque se ha descrito la adaptación y la propagación con éxito de algunas cepas de IBDV en un cultivo celular in vitro de origen embrionario de pollo, se reconoce de manera general que la mayoría de las cepas de IBDV aisladas de una bursa infectada en el campo, en particular las denominadas cepas del IBDV virulentas o muy virulentas, no pueden adaptarse a células de origen embrionario de pollo, tales como fibroblastos de embrión de pollo (CEF) o a células de otros órganos tales como el riñón y el hígado (Brown y col., J. Gen. Virology 75, 675-680, 1994; Van Loon y col., 1994, supra).

Los inconvenientes de los sustratos para el cultivo in vivo son obvios. Tales métodos de cultivo no son agradables para los animales, necesitan muchos animales, requieren mucho tiempo y no pueden ser llevados a cabo bajo condiciones estandarizadas y rigurosas.

Además, el número limitado de cepas del IBDV que no son refractarias a la adaptación a sustratos para el cultivo celular in vitro, padecen la desventaja de que como resultado del proceso de pases seriados que conduce a la adaptación de las cepas del IBDV, se introducen mutaciones aleatorias en el genoma del virus de manera incontrolada. Tales mutaciones pueden tener influencia sobre propiedades del virus distintas de las asociadas con la adaptación del virus al cultivo celular, por ejemplo propiedades relacionadas con la inmunogenicidad del virus. Tales mutaciones aleatorias adicionales no son deseadas.

La adaptación de los IBDVs mediante el pase del virus in vitro en cultivos de células CEF, ha sido asociada con una atenuación de la virulencia demostrada mediante una reducción de la capacidad del virus para inducir lesiones en la bursa del ave infectada. Yamaguchi y col. (Virology 223, 219-223, 1996) investigaron la base molecular de la virulencia de los virus de la IBD y de la atenuación de estos virus como resultado de la adaptación de IBDVs de la bursa al cultivo en células CEF. De estos estudios llevados a cabo por Yamaguchi y col. se concluyó que no pudieron identificarse las mutaciones precisas implicadas en la atenuación del IBDV de tipo salvaje. Se sugirió que los residuos de aminoácido en las posiciones 279 (Asp/Asn) y 284 (Ala/Thr) de la poliproteína codificada por el marco de lectura abierto largo del segmento A, son importantes para la virulencia o para la propagación del IBDV en células CEF.

Esto último fue confirmado por Lim, B.L. (Proceedings of the 4th Asia Pacific Poultry Health Conference, 22-26 de Noviembre de 1998, Melbourne, Australia, Resumen 79). En el mismo se describe que la sustitución de los residuos de aminoácido 279 (Asp\rightarrowAsn) y 284 (Ala\rightarrowThr) de la proteína VP2 de un IBDV tiene como resultado un mutante del IBDV que puede ser propagado en un cultivo de células CEF. Cao, Y.C. y col. (Avian Disease 42: 340-351, 1998) comparan las secuencias de aminoácidos de VP2 de varios aislados de IBDV, incluyendo las cepas Clásica, Variante-E y GLS. Sin embargo, la técnica anterior no describe una alternativa del tipo de mutaciones ni del número mínimo de mutaciones de aminoácidos que se requieren y son suficientes para permitir la adaptación del IBDV de la bursa al cultivo en células CEF.

Es un objeto de esta invención el proporcionar un método aplicable de manera general para la adaptación de aislados de IBDV que crecen solamente in vivo en la bursa de aves infectadas al crecimiento en un cultivo celular.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para preparar mutantes atenuados del IBDV mediante la introducción de mutaciones en el genoma del IBDV de manera controlada.

Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un mutante del IBDV manipulado genéticamente que contenga los residuos de aminoácido apropiados que permitan al mutante crecer en un cultivo celular.

Se ha encontrado que este objeto se ha cumplido mediante un método para la preparación de un mutante infeccioso del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF que comprende las etapas de,

(i): preparar separadamente una construcción de ADN conteniendo ADNc de los segmentos A y B del genoma de un IBDV que no es capaz de replicarse en un cultivo de células CEF,

(ii): introducir una mutación en:

a: uno o más codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 de las cepas de IBDV Variante-E o Clásica, o en

b: un codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 de una cepa GLS del IBDV, en el ADNc que comprende el segmento A, de tal manera que los codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 mutado codifiquen un residuo de histidina y un residuo treonina, respectivamente, en el caso de las cepas del IBDV Variante-E o Clásica, o de tal manera que el codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 mutado codifique un residuo de treonina en el caso de una cepa GLS del IBDV,

(iii): permitir que los transcritos de ARN del ADNc que comprende el segmento A y el segmento B inicien la replicación del mutante de IBDV en células huésped en un medio de cultivo, y

(iv): aislar el mutante de IBDV del cultivo.

La presente invención identifica por vez primera qué residuos de aminoácido se requieren y son suficientes para permitir que un IBDV se replique en un cultivo de células CEF. Mientras que la mayoría de los aislados de IBDV de la bursa comprenden los residuos de aminoácido 253 (Gln), 284 (Ala) y 330 (Ser) de la proteína VP2, los mutantes del IBDV Variante-E o Clásico cuyos codones en las posiciones 253 y 284 han sido cambiados de tal manera que ahora codifiquen los residuos de aminoácido 253 (His) y 284 (Thr), son capaces de crecer en un cultivo de células
CEF.

Para los mutantes del IBDV GLS se ha encontrado que es suficiente cambiar el codón en posición 284 de tal manera que ahora codifique el residuo de aminoácido 284 (Thr).

Se ha encontrado también que el aminoácido en posición 330 no es crítico para la replicación del mutante del IBDV Clásico o Variante-E en CEF. Sin embargo, los residuos de serina, arginina o lisina son los más favorecidos en esa posición en la presente invención.

Adicionalmente, se ha encontrado que para el IBDV GLS el aminoácido en posición 253 no es crítico para la replicación, y es normalmente un residuo de glutamina.

Por tanto, en un método preferido se prepara un mutante del IBDV que comprende cualquiera de estos tres residuos de aminoácido, en particular 330 (Arg), en esta posición en la proteína VP2. Para los mutantes GLS del IBDV el residuo de aminoácido preferido en la posición 253 es una glutamina.

TABLA 1

1

Se ha encontrado que en el genoma de un IBDV Variante-E (quimérico) que era capaz de replicarse solamente en la bursa de pollos infectados (D78/Variante-E), son necesarios dos cambios para adaptar los aislados de IBDV a un cultivo de células CEF. Estas posiciones implican a los residuos de aminoácido 253 y 284. Los residuos de aminoácido histidina y treonina en estas posiciones, respectivamente, permiten al mutante de IBDV replicarse en un cultivo de células CEF (Tabla 1 y Ejemplo 1). Además, se ha encontrado que los mutantes de IBDV adaptados al cultivo de células CEF de acuerdo con el método de la invención están también atenuados (Ejemplo 2).

Con el fin de probar adicionalmente que la adaptación desde la bursa a células CEF para las cepas Clásicas del IBDV está también determinada por los dos aminoácidos, los codones de la cepa D78 del IBDV que es capaz de replicarse en un cultivo de células CEF fueron cambiados en las posiciones 253, 284 y 330. Los resultados están mostrados en la Tabla 2A.

TABLA 2A

2

El aislado europeo Clásico UK661 "muy virulento" (VV) (Brown y col., J. Gen. Virology 75, 675-680, 1994; Brown y Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996) no puede ser propagado in vitro y tiene que ser por tanto propagado in vivo en pollos. Los pollos tienen que ser infectados con la cepa VV y unos cuantos días después de la infección se sacrifican las aves supervivientes y se extrae la bursa. El virus puede ser entonces extraído del homogenado bursal para su uso posterior. Los experimentos que sirven de base a la presente invención demostraron que los cambios de aminoácidos en las posiciones 253 y 284 según se definieron anteriormente permiten a la cepa VV UK661 crecer en cultivo celular. Los resultados de experimentos de mutagénesis y transfección con esta cepa Clásica del IBDV están resumidos en la Tabla 2B.

TABLA 2B

3

Estos datos demuestran además que los cambios de aminoácidos en las posiciones 253 y 284 son suficientes para permitir a las cepas Clásicas de IBDV de la bursa crecer en cultivo celular. Todas las demás mutaciones tienen como resultado mutantes que no se replican en cultivo celular o que se replican mal (ver también, Lim y col., J. Virol. 73, 2854-62, 1999).

Adicionalmente, se determinó que en IBDV GLS el cambio de un único residuo de aminoácido en posición 284 fue suficiente para permitir que un IBDV adaptado a la bursa se replicara en células CEF (Tabla 3).

TABLA 3

4

Por tanto, el método de acuerdo con la invención permite la adaptación de aislados de IBDV de la bursa al crecimiento en cultivo celular por medio de técnicas de ADN recombinante. La ventaja del presente método es que como resultado del proceso de adaptación se introducen mutaciones en el genoma del IBDV solamente en uno o más de los codones en posición 253 y 284. Los números indican las posiciones de los aminoácidos y de los codones de la poliproteína y del marco de lectura abierto grande en el segmento A del genoma del IBDV, respectivamente (Mundt y Müller, J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; número de acceso X 84034 del NCBI).

La mayoría de las cepas del IBDV, pero no todas, que no crecen en un cultivo de células CEF contienen los codones 253 (Gln), 284 (Ala) y 330 (Ser) en el gen de VP2. Algunas cepas del IBDV Variante-E o Clásica que no crecen en un cultivo de células CEF pueden tener ya uno de los codones 253 (His) y 284 (Thr) requeridos. Por tanto, el método de acuerdo con la invención comprende la introducción de una mutación en uno o dos de los codones requeridos anteriormente mencionados, de tal manera que el mutante del IBDV resultante contenga los codones en el gen de VP2 que codifica los residuos de aminoácido 253 (His) y 284 (Thr).

Más preferiblemente, el método de la invención es aplicado a un IBDV que no sea capaz de replicarse en células CEF y que contenga los codones para los residuos de aminoácido 253 (Gln) y 284 (Ala), e incluso más preferiblemente 330 (Ser). En el caso de las cepas Clásica y Variante-E, las mutaciones son introducidas en dos o tres de los codones del gen de VP2, teniendo como resultado los codones 253 (His) y 284 (Thr) y, opcionalmente, 330 (Arg). Los nuevos codones para los aminoácidos en estas posiciones pueden ser: para His (CAT o CAC), para Thr (ACT, ACC, ACA, ACG) y para Arg (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG).

Incluso más preferiblemente, el método de la invención es aplicado a un IBDV que no sea capaz de replicarse en células CEF y que contenga los codones Gln 253 (CAA), Ala 284 (GCC) y opcionalmente Ser 330 (AGT) o cualquier combinación de los mismos.

En particular, el método de la invención es aplicado a un IBDV que no es capaz de replicarse en células CEF y que contiene los codones 253 (CAA), 284 (GCC) y 330 (AGT).

El método para la preparación de un mutante del IBDV de acuerdo con la presente invención comprende el sistema de "genética inversa" recientemente establecido para los birnavirus (Mundt y Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996 y WO 98/09646). Este sistema de genética inversa abría la posibilidad de introducir mutaciones en el genoma de ARN de un virus de la IBD. El principio del método de genética inversa de acuerdo con la invención es que se aíslan del virus los segmentos A y B del ARN genómico, seguido por la transcripción inversa de los ARNs para dar ADNc, después de lo cual los ADNcs son transcritos a ARN. La introducción de la(s) mutación(es) requerida(s) en el segmento A (o B) del virus tiene lugar a nivel del ADNc. Una etapa importante en este sistema de genética inversa es proporcionar construcciones de ADN separadas que contengan una molécula vector de ADN (por ejemplo un plásmido) y clones de ADNc de longitud completa de los segmentos A o B del IBDV. Pueden generarse construcciones de ADN que contengan el ADNc del segmento A o B, incluyendo los nucleótidos de los extremos 5' y 3' de estos dos segmentos, de acuerdo con el método descrito por Mundt y Vakharia (1996, supra). La etapa siguiente del método de genética inversa es la transfección de células huésped adecuadas con el material genético apropiado del segmento A y B, de tal manera que en las células huésped transfectadas los transcritos de ARN procedentes del ADNc del segmento A y B puedan iniciar la replicación del virus, teniendo como resultado un IBDV infeccioso que puede ser aislado del medio en el cual han sido cultivadas las células huésped.

Pueden utilizarse varios métodos para esta última etapa del sistema de genética inversa. Preferiblemente, el método de acuerdo con la invención comprende la preparación de transcritos de ARN sintéticos procedentes de los ADNcs de ambos segmentos A y B in vitro. En este caso, las construcciones de ADN comprenden un promotor de la ARN polimerasa unido operativamente a cualquiera de los segmentos. El promotor puede ser el promotor para la polimerasa de T7, SP6 ó T3, prefiriéndose el promotor de T7. Los transcritos sintéticos de los segmentos A y B son aislados y utilizados para transfectar células huésped adecuadas.

Alternativamente, se proporciona un método en el cual se suministra una línea celular que comprende células huésped capaces de expresar una ARN polimerasa y que son transformadas con una construcción de ADN que comprende el ADNc del segmento B y un promotor de la ARN polimerasa, de tal manera que se expresen constitutivamente transcritos de ARN del segmento B. Después de la transfección de tales células con un transcrito de ARN sintético procedente del ADNc que comprende el segmento A mutado, se inicia en las células huésped la replicación del mutante del IBDV. En particular, pueden utilizarse células huésped que sean capaces de expresar ARN polimerasa dependiente de ADN del bacteriófago T7, expresada por ejemplo citoplásmicamente a partir de virus vaccinia recombinante.

Las mutaciones deseadas pueden ser introducidas en el gen de VP2 mediante métodos para este fin conocidos generalmente en la técnica. En particular, la(s) mutación(es) es(son) introducida(s) por medio de mutagénesis dirigida a un sitio. En la presente se describen métodos para introducir una mutación en el genoma del IBDV, pero son también utilizados generalmente en la técnica (Mundt y Vakharia, 1996, supra; Ya y col., J. Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt y col., Solicitud de Patente Europea nº 0887.412 y Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F.M. Ausubel y col., Wiley N.Y., edición de 1995, páginas 8.5.1.-8.5.9.).

El método de acuerdo con la invención puede ser aplicado a todas las cepas de IBDV que no sean capaces de replicarse en un cultivo de células CEF, y que sean de los subtipos antigénicos Clásico, Variante-E o GLS del IBDV.

Además, el método de acuerdo con la invención puede ser aplicado a todas las cepas de IBDV que no sean capaces de replicarse en un cultivo de células CEF, independientemente de la virulencia de las cepas, e incluye cepas muy virulentas (tales como CS89 y UK661), cepas virulentas (tales como F52/70 y STC) y cepas vacuna (tales como 228E y 2512). Los mutantes de IBDV que son adaptados para replicarse en cultivo celular derivados de cepas muy virulentas y virulentas serán menos virulentos y podrán ser utilizados como cepas vacuna vivas. Alternativamente, tales mutantes del IBDV pueden ser propagados convenientemente en cultivo celular y formulados como vacunas inactivadas.

El método de acuerdo con la invención puede ser también aplicado de manera ventajosa a cepas del IBDV atenuadas que no sean capaces de replicarse en un cultivo de células CEF. Los mutantes derivados de tales virus atenuados pueden ser utilizados en un sistema de cultivo celular para la producción de vacunas en lugar de en un sistema de producción in vivo.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para la preparación de un mutante del IBDV "quimérico" capaz de replicarse en un cultivo de células CEF. El método comprende la etapa adicional de introducir una mutación en un gen del segmento A, preferiblemente el gen de VP2, de un primer IBDV, como resultado de lo cual la proteína expresada por ese gen contiene un determinante epitópico de un segundo IBDV.

Un IBDV quimérico es un virus que contiene como esqueleto genético el segmento A o el gen de VP2 de un primer subtipo antigénico, y contiene adicionalmente la información genética que codifica un determinante epitópico de un segundo subtipo antigénico del IBDV. En particular, tales IBDVs quiméricos expresan uno o más determinantes epitópicos adicionales en la proteína VP2 del IBDV del primer subtipo antigénico. La ventaja de tal IBDV quimérico es que puede ser utilizado como un único inmunógeno que induce inmunidad frente a al menos dos subtipos antigénicos del IBDV.

En particular, se preparan mutantes del IBDV que contienen el esqueleto del segmento A o el gen de VP2 del IBDV Clásico, GLS o Variante-E. Los clones de ADNc que contienen la región codificadora completa del segmento A de las diferentes cepas de IBDV pueden ser preparados utilizando procedimientos y métodos de clonaje estándar descritos en la técnica anterior (Vakharia y col., Avian Diseases 36, 736-742, 1992; J. Gen. Virology 74, 1201-1206, 1993). Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos del segmento A de varias cepas del IBDV están descritas en la técnica anterior (por ejemplo, WO 95/26196 y Vakharia y col., Avian Diseases 36, 736-742, 1992).

Además, WO 95/26196 describe la secuencia de aminoácidos de varios determinantes epitópicos de los subtipos antigénicos del IBDV que son característicos para cada subtipo antigénico. Además, WO 95/26196 describe la caracterización antigénica de varias cepas del IBDV por su reactividad con un panel de anticuerpos monoclonales neutralizantes. Y lo que es más importante, los determinantes epitópicos reactivos con tales Moabs neutralizantes son los determinantes epitópicos B69 (subtipo Clásico), R63 y 67 (Variante-E) y 57 (GLS). La región de la proteína VP2 que contiene las secuencias de aminoácidos para estos determinantes epitópicos está descrita en Vakharia y col. (Virus Res. 31, 265-273, 1994).

Preferiblemente, en el método de acuerdo con la presente invención se prepara un mutante quimérico del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF, mutante que contiene un esqueleto del segmento A Clásico y la secuencia de nucleótidos que codifica el determinante epitópico 67 de la Variante-E, o el determinante epitópico 57 de GLS. Alternativamente, el mutante quimérico del IBDV contiene un esqueleto de GLS y secuencias de nucleótidos que codifican los determinantes epitópicos B69, R63 ó 67.

En particular, el método de acuerdo con la invención comprende la preparación de una cepa quimérica del IBDV (D78/Variante-E) derivada de la cepa D78 (disponible comercialmente en Intervet International B.V., Países Bajos) en la cual (i) el gen de VP2 es sustituido por el gen de VP2 de una cepa Variante-E y (ii) los codones en las posiciones 253, 284 y 330 son alterados según se definió anteriormente (Ejemplo 1).

Básicamente, las etapas para la introducción de secuencias de nucleótidos que codifican los determinantes epitópicos en el segmento A del esqueleto de un primer IBDV son en esencia las mismas que para la introducción de las mutaciones anteriormente definidas. Esto se realiza muy fácilmente proporcionando ADNc de los segmentos A y B del genoma y (i) sustituyendo la secuencia que codifica el determinante epitópico del primer IBDV por la del segundo IBDV, o (ii) alterando un codón específico en el primer IBDV mediante mutagénesis dirigida a un sitio. Tales métodos están también descritos en WO 95/26196. Finalmente, se deja que los transcritos de ARN de estas moléculas de ADNc inicien la replicación en una célula huésped transfectada para obtener un IBDV quimérico infeccioso.

En otra realización de la invención se proporciona un método para la preparación de un mutante del IBDV según se definió anteriormente, en la cual el mutante del IBDV resultante contiene también otras mutaciones que atenúan el virus. Un ejemplo de tal mutación es una mutación en el gen de VP5 del segmento A del genoma del IBDV que tiene como resultado un mutante del IBDV que no es capaz de expresar una proteína VP5 nativa. La preparación de un mutante VP5^{-} del IBDV está descrita en la Solicitud de Patente Europea Nº 887.412.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona un mutante del IBDV infeccioso, manipulado genéticamente, capaz de replicarse en un cultivo de células CEF, que contiene los codones 253 (His) y 284 (Thr) y, opcionalmente, 330 (Arg) en el gen de VP2 de las cepas Clásica o Variante-E, o el codón 284 (Thr) de una cepa GLS. Tales mutantes del IBDV contienen todavía la información genética de los IBDVs de la bursa que no son capaces de replicarse en un cultivo de células CEF, con la excepción de los nuevos codones anteriormente mencionados que han sido introducidos de manera controlada por medio de técnicas de ingeniería genética.

En particular, se proporciona un mutante del IBDV Variante-E según se definió anteriormente que no tiene glicina y/o valina en las posiciones 318 y 325, respectivamente. Los mutantes de la Variante-E manipulados genéticamente que tienen ácido aspártico y/o metionina en estas posiciones, respectivamente, son los más preferidos.

En una realización preferida, el mutante del IBDV producido mediante ingeniería genética de acuerdo con la invención es un mutante quimérico del IBDV, en particular un mutante quimérico del IBDV derivado de la cepa D78, que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica el gen de VP2 de una cepa Variante-E y que tiene los tres nuevos codones anteriormente especificados.

La presente invención proporciona la posibilidad de preparar fácilmente vacunas de IBDV a partir de cepas de IBDV que previamente se resistían a la replicación en un cultivo celular in vitro. Una ventaja adicional de la presente invención es que los IBDVs pueden ser atenuados (adicionalmente) de manera controlada mediante el método anteriormente descrito. Tales mutantes atenuados del IBDV pueden ser utilizados como componentes activos en vacunas vivas de IBDV.

Por tanto, otro aspecto de esta invención es una vacuna para ser utilizada en la protección de aves de corral frente a la enfermedad resultante de la infección por IBDV. La vacuna comprende un mutante del IBDV producido mediante ingeniería genética según se preparó anteriormente, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El mutante del IBDV puede ser incorporado a la vacuna como un virus vivo atenuado o inactivado.

Una vacuna de acuerdo con la invención puede ser preparada mediante métodos convencionales tales como por ejemplo los comúnmente utilizados para las vacunas de IBDV vivo e inactivado comercialmente disponibles. Brevemente, un sustrato susceptible es inoculado con un mutante del IBDV de acuerdo con la invención y propagado hasta que el virus se haya replicado hasta un título infeccioso deseado, después de lo cual se recoge el material que contiene el IBDV.

Todos los sustratos que son capaces de soportar la replicación de los mutantes del IBDV pueden ser utilizados para preparar la vacuna de acuerdo con la presente invención, incluyendo cultivos celulares primarios (aviares), tales como células fibroblásticas de embrión de pollo (CEF) o células de hígado de embrión de pollo (CEL), líneas celulares de mamífero tales como la línea de células VERO o la línea celular BGM-70, o líneas celulares aviares tales como QT-35, QM-7 o LMH. Normalmente, después de la inoculación de las células, el virus es propagado durante 3-10 días, después de lo cual se recoge el sobrenadante del cultivo celular y si se desea se filtra o se centrifuga con el fin de eliminar los desechos celulares.

Alternativamente, el mutante del IBDV es propagado en huevos de gallina con embrión. En particular, el sustrato sobre el cual se propagan estos IBDVs son huevos con embrión SPF. Los huevos embrionados pueden ser inoculados con, por ejemplo, 0,2 ml de suspensión u homogenado que comprenda el mutante de IBDV conteniendo al menos 10^{2} DICT_{50} por huevo, y posteriormente incubados a 37ºC. Después de 2-5 días aproximadamente, el producto con el virus de la IBD puede ser recolectado recogiendo el embrión y/o las membranas y/o el fluido alantoideo del embrión seguido por una homogeneización apropiada de este material. El homogenado puede ser centrifugado posteriormente durante 10 minutos a 2500 x g, seguido por la filtración de sobrenadante a través de un filtro (100 \mum).

La vacuna de acuerdo con la invención conteniendo el virus vivo puede ser preparada y comercializada en forma de suspensión o en forma liofilizada, y contiene adicionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable utilizado habitualmente para tales composiciones. Los vehículos incluyen estabilizantes, conservantes y tampones. Son estabilizantes adecuados, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero de leche seca, albúmina o caseína) o productos de degradación de los mismos. Son tampones adecuados por ejemplo los fosfatos de metales alcalinos. Los conservantes adecuados son timerosal, mertiolato y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, tampón acuoso (tal como solución salina tamponada), alcoholes y polioles (tal como glicerol).

Si se desea, las vacunas vivas de acuerdo con la invención pueden contener un adyuvante. Ejemplos de compuestos y composiciones adecuadas con actividad adyuvante son los mismos que se mencionan más adelante.

Aunque es posible la administración mediante inyección, por ejemplo intramuscular, subcutánea, de la vacuna viva de acuerdo con la presente invención, la vacuna es administrada preferiblemente mediante las técnicas baratas de aplicación en masa utilizadas comúnmente para la vacunación contra el IBDV. Para la vacunación contra el IBDV, estas técnicas incluyen el agua de bebida y la vacunación mediante pulverización.

Métodos alternativos para la administración de la vacuna viva incluyen la administración in ovo, mediante gotas oculares y mediante la inmersión del pico.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que contiene el mutante del IBDV en forma inactivada. La ventaja principal de una vacuna inactivada son los niveles elevados de anticuerpos protectores de larga duración que pueden ser conseguidos.

El objetivo de la inactivación de los virus recogidos después de la etapa de propagación es eliminar la reproducción de los virus. En general, esto puede realizarse mediante medios químicos o físicos. La inactivación química puede ser realizada tratando los virus con, por ejemplo, enzimas, formaldehído, \beta-propiolactona, etilenimina o un derivado de los mismos. Si es necesario, el compuesto inactivante es neutralizado posteriormente. El material inactivado con formaldehído puede ser neutralizado con, por ejemplo, tiosulfato. La inactivación física puede ser llevada a cabo preferiblemente sometiendo los virus a una radiación de alta energía, tal como luz UV o rayos \gamma. Si se desea, después del tratamiento el pH puede ser ajustado a un valor de 7 aproximadamente.

Una vacuna conteniendo el mutante del IBDV inactivado puede contener, por ejemplo, uno o más de los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables anteriormente mencionados adecuados para este fin.

Preferiblemente, una vacuna inactivada de acuerdo con la invención contiene uno o más compuestos con actividad adyuvante. Los compuestos o composiciones adecuados para este fin incluyen hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, una emulsión aceite-en-agua o agua-en-aceite basada en, por ejemplo, un aceite mineral tal como Bayol F® o Marcol 52®, o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E, y saponinas.

La vacuna de acuerdo con la invención contiene una dosis eficaz del mutante del IBDV como componente activo, esto es una cantidad de material IBDV inmunizante que inducirá inmunidad en las aves vacunadas frente al desafío por un virus virulento. En la presente se define inmunidad como la inducción de un nivel de protección significativamente más elevado en una población de aves después de la vacunación en comparación con un grupo no vacunado.

Típicamente, la vacuna viva de acuerdo con la invención puede ser administrada en una dosis de 10^{2}-10^{9} dosis infecciosas_{50} (DICT_{50}) por animal, preferiblemente en una dosis que varíe desde 10^{5,0} a 10^{7,0} DICT_{50}, y una vacuna inactivada puede contener el equivalente antigénico de 10^{5}-10^{9} DICT_{50} por animal.

Las vacunas inactivadas son administradas normalmente por vía parenteral, por ejemplo intramuscularmente o subcutáneamente.

Aunque la vacuna contra el IBDV de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada eficazmente en pollos, otras aves de corral tales como pavos, gallinas de guinea y perdices pueden ser también vacunadas con éxito con la vacuna. Los pollos incluyen los pollos para carne, las cepas de reproductores y las cepas de ponedoras.

La edad de los animales que reciben una vacuna viva o inactivada de acuerdo con la invención es la misma que la de los animales que reciben las vacunas contra el IBDV vivas o inactivadas convencionales. Por ejemplo, los pollos para carne (libres de anticuerpos derivados de la madre - ADM) pueden ser vacunados cuando tienen un día de edad, mientras que los pollos para carne con niveles elevados de ADM son vacunados preferiblemente a las 2-3 semanas de edad. Las cepas para puesta de huevos o las cepas reproductoras con niveles bajos de ADM pueden ser vacunadas a los 1-10 días de edad, seguido por vacunaciones de refuerzo con la vacuna inactivada a las 6-8 y 16-20 semanas de edad.

La invención incluye también vacunas combinadas que contienen, además del mutante del IBDV descrito anteriormente, uno o más inmunógenos derivados de otros patógenos infecciosos para las aves de corral o para los peces, respectivamente.

Preferiblemente, la vacuna combinada contiene adicionalmente una o más cepas vacuna del virus de la bronquitis infecciosa (IBV), del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), del virus del síndrome de la caída de la puesta (EDS), del virus de la rinotraqueitis del pavo (TRTV) o reovirus.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de mutantes del IBDV y sus propiedades de replicación en un cultivo de células CEF Material y Métodos Construcción de plásmidos del IBDV (intergenéricos) que contienen la región variable de VP2 de las cepas Clásica, Variante-E o GLS del IBDV (i) VP2 de la cepa Clásica del IBDV D78

Un prerrequisito para la mutagénesis dirigida a un sitio siguiente era la modificación del plásmido pUC18. Para este fin, el pUC18 fue cortado con NdeI y BamHI, electroeluido, hecho de extremos romos por el enzima Klenow y religado para obtener pUC18 \DeltaNdeI-BamHI (pUC18/\DeltaNB). El plásmido pAD78/EK (Mundt y col., J. Virology 71, 5647-51, 1997) fue cortado con EcoRI y KpnI para obtener la secuencia de longitud completa del segmento A de la cepa D78 del serotipo I que incluye el sitio del promotor de la ARN polimerasa de T7. Este fragmento fue ligado en pUC18/\DeltaNB cortado con EcoRI y KpnI para obtener pD78A/\DeltaNB (Fig. 1A). El plásmido pD78A/\DeltaNB fue utilizado como esqueleto para los procedimientos de clonaje y mutagénesis dirigida a un sitio.

UK661

Se utilizó el plásmido pD78-E/DEL (ver más adelante) para la construcción de plásmidos quiméricos que contenían secuencias del segmento A de la cepa UK661. Después de la precipitación del ARN del virus, se llevaron a cabo una transcripción inversa y una PCR siguiendo los procedimientos estándar mediante la utilización de los oligonucleótidos UK661AFor1 y UK661ARev1 (Brown y Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996, nucleótido nº 621-644-sentido y 1201-1223-antisentido, respectivamente). Los fragmentos de PCR resultantes fueron clonados con extremos romos en el vector pUC18 cortado con SmaI (Pharmacia, Suecia) para obtener p661Apart. Después de su secuenciación, p661Apart fue cortado con los enzimas de restricción NdeI y SpeI en los nucleótidos 647 y 1182, respectivamente (la numeración sigue la secuencia de longitud completa de la cepa P2: número de acceso del NCBI X 84034), para obtener un fragmento de 535 pb que incluía las secuencias codificadoras de la región variable de VP2 de la cepa UK661. Después de la ligadura en pD78-E/DEL cortado con NdeI-SpeI se estableció un plásmido quimérico de longitud completa, pD78A-E-661, que contenía secuencias del segmento A de la cepa D78, E/Del y UK661 (Fig. 4).

(ii) VP2 del IBDV Variante-E

Para la sustitución de secuencias específicas del IBDV se utilizó un plásmido que contenía la región codificadora completa de la cepa E/Del de la Variante-E (pEDEL22BacII, Vakharia, Biotechnology annual review 3, 151-168, 1997). El pEDEL22BacII (Fig. 1A) fue cortado con los enzimas de restricción NdeI y SalI, nucleótidos 647 y 1725, respectivamente, de acuerdo con la secuencia de longitud completa de la cepa P2 (número de acceso del NCBI X 84034) para obtener un fragmento de 1078 pb que incluía las secuencias codificadoras de la región variable de VP2 y secuencias de VP4 de la cepa E/Del. Después de la ligadura en pD78A/\DeltaNB cortado con NdeI-SalI se estableció un plásmido quimérico de longitud completa, pD78A/\DeltaNB-E/Del (Fig. 1A), que contenía secuencias del segmento A de la cepa D78 así como de E/Del. Los plásmidos pAD78/\DeltaNB y pD78A/\DeltaNB-E/Del fueron utilizados para mutagénesis dirigida a un sitio.

(iii) VP2 del IBDV GLS

Además, se construyó un par de plásmidos que contenían la región variable de GLS-B y GLS-TC, respectivamente. Para el clonaje de la región hipervariable, GLS-TC fue propagado en CEF y purificado por ultracentrifugación. El homogenado bursal de GLS-B fue purificado mediante centrifugación a baja velocidad y el sobrenadante fue utilizado para los procedimientos siguientes. Después de una digestión con proteinasa K (0,5 mg/ml)/dodecil sulfato de sodio (SDS, 0,5%) el ARN vírico fue purificado, transcrito de manera inversa a ADNc y amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguiendo procedimientos estándar y utilizando los oligonucleótidos A14 y A44 (Tabla 4). El producto de la amplificación fue clonado con extremos romos y los plásmidos que contenían los fragmentos de PCR apropiados fueron secuenciados. Los plásmidos que contenían cada uno un inserto de GLS-TC (pGLS-TC) o GLS-B (pGLS-B) fueron utilizados en los experimentos siguientes. Para la construcción del segmento A intergenérico se utilizó el clon de longitud completa pD78A/\DeltaNB-E/Del. El pGLS-TC y el pGLS-B, respectivamente, fueron digeridos con SacI y SpeI. Los fragmentos electroeluidos fueron ligados posteriormente en pD78A/\DeltaNB-E/Del previamente digerido con SacI-SpeI para obtener pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-TC y pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-B, respectivamente. Los mapas plasmídicos de ambos plásmidos están representados en la Figura 1B.

Mutagénesis dirigida a un sitio

La mutagénesis dirigida a un sitio fue realizada por PCR. Los oligonucleótidos contenían mutaciones que daban lugar a cambios de aminoácidos y a sitios de corte de enzimas de restricción adicionales (Tabla 4). Después de la amplificación por PCR utilizando los plásmidos pAD78/\DeltaNB, pD78A/\DeltaNB-E/Del y pD78A-E-661, respectivamente, los fragmentos fueron clonados con extremos romos y secuenciados (pfrag). Los clones que contenían los codones mutados fueron ligados en los plásmidos previamente cortados según sigue:

(i) IBDV Variante-E

Para el establecimiento de los clones de longitud completa del segmento A del plásmido pD78A/\DeltaNB-E/Del conteniendo los codones mutados, se obtuvieron los fragmentos de PCR siguientes: Se utilizaron los cebadores E/Del-MutQH y A14 (pfragQH), E/Del-MutAT y A14 (pfragAT), E/DelMutSR y P21F (pfragSR) para obtener fragmentos con los cambios de aminoácidos individuales apropiados Q253H, A284T y S330R, respectivamente, de la secuencia de E-Del. El pfragQH y el pfragSR fueron cortados con SacI y SpeI y ligados en pD78A/\DeltaNB-E/Del previamente digerido con SacI-SpeI para obtener pD78A/\DeltaNB-E/DelQH (Fig. 1C) y pD78A/\DeltaNB-E/DelSR (Fig. 1C), respectivamente. Para construir pD78A/\DeltaNB-E/DelAT (Fig. 1C), pfragAT fue cortado con NarI-SpeI y ligado posteriormente en pD78A/\DeltaNB-E/Del previamente cortado. Con el fin de obtener plásmidos conteniendo dos codones mutados se realizaron las PCR siguientes: Se utilizaron los cebadores E/Del-MutQH y E/Del-MutSR, y E/Del-MutAT y E/Del-MutSR para la amplificación de fragQH-SR y fragAT-SR en pD78A/\DeltaNB-E/Del, respectivamente. Después del clonaje y la secuenciación, pfragQH-SR fue digerido con SacI-SpeI y ligado posteriormente en pD78A/\DeltaNB-E/Del previamente cortado para obtener pD78A/\DeltaNB-E/DelQH-SR (Fig. 1D). Para la construcción de pD78A/\DeltaNB-E/DelAT-SR (Fig. 1D), el plásmido pfragAT-SR fue cortado con NarI y SpeI y ligado en pD78A/\DeltaNB-E/Del cortado idénticamente. Para la construcción de un plásmido conteniendo codones mutados para dos cambios de aminoácidos (Q253H; A284T) se llevó a cabo una PCR utilizando el plásmido pD78A/\DeltaNB-E/DelAT y los cebadores E/Del-MutQH; A14. El plásmido pfragQH-AT obtenido fue cortado con SacI-SpeI y ligado en pD78A/\DeltaNB-E/Del para obtener pD78A/\DeltaNB-E/DelQH-AT (Fig. 1D). Para el clonaje de un plásmido conteniendo codones mutados para los tres cambios de aminoácidos (Q253H, A284T y S330R), se utilizaron los cebadores E/Del-MutQH y E/Del-MutSR para la amplificación de fragQH-AT-SR en pD78A/\DeltaNB-E/Del-AT. Después del corte de pfragQH-AT-SR con SacI y SpeI, el fragmento eluido fue ligado en pD78A/\DeltaNB-E/Del cortado con SacI y SpeI para obtener pD78A/\DeltaNB-E/DelQH-AT-SR (Fig. 1E).

(ii) IBDV Clásico D78

Para el establecimiento de clones de longitud completa del segmento A del plásmido pD78A/\DeltaNB conteniendo los codones mutados, se subclonó un fragmento de NdeI-HindIII de pD78A/\DeltaNB en pUC19 previamente cortado con NdeI-HindIII con el fin de obtener sitios de enzimas de restricción individuales para los procedimientos siguientes (pUC19/NH-D78A). Se utilizaron los oligonucleótidos D78-MutHQ y A14 (pfragHQ), D78-MutTA y A14 (pfragTA), D-78-MutRS y P21F (pfragRS) para la amplificación por PCR con el fin de obtener fragmentos con los cambios de un solo aminoácido apropiados H253Q, T284A y R330S, respectivamente, de la secuencia de D78. El pfragHQ fue cortado con SacI y StyI, el pfragTA fue cortado con NarI y StyI, el pfragRS fue cortado con SacI y StyI y religados en pUC19/NH-D78A cortado apropiadamente. El plásmido pUC19/NH-D78A que contenía el codón mutado fue cortado con NdeI y SacII, los fragmentos apropiados fueron electroeluidos y ligados en pD78A/\DeltaNB, cortado previamente con NdeI y SacII, para obtener pD78A/\DeltaNB-HQ, pD78A/\DeltaNB-TA y pD78A/\DeltaNB-RS, respectivamente. Para la construcción de un clon de longitud completa conteniendo sustituciones de nucleótidos que dieran lugar al cambio de los tres aminoácidos (H253Q, A284T, R330S), se realizó una PCR utilizando los oligonucleótidos D78-MutHQ, D78-MutRS y el plásmido pD78A/\DeltaNB-TA. El fragmento de PCR obtenido fue clonado con extremos romos para obtener pfragHQ-TA-RS. Después del corte de pfragHQ-TA-RS con SacI y StyI, el fragmento electroeluido fue clonado en pUC19/NH-D78A cortado con SacI y StyI. El plásmido obtenido fue cortado con NdeI y SacII, el fragmento apropiado fue electroeluido y ligado finalmente en pD78A/\DeltaNB, previamente cortado con NdeI y SacII, para obtener pD78A/\DeltaNB-HQ-TA-RS. Las secuencias de nucleótidos de los plásmidos mutados obtenidos fueron confirmadas mediante secuenciación. Las secuencias fueron analizadas con el Wisconsin Package, versión 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Los plásmidos pD78A/\DeltaNB-HQ, pD78A/\DeltaNB-TA, pD78A/\DeltaNB-RS y pD78A/\DeltaNB-HQ-TA-RS están representados en la Fig. 2.

UK661

Para la mutagénesis dirigida a un sitio, el plásmido pD78A-E-UK661 fue cortado con EcoRI/KpnI y la secuencia de longitud completa del fragmento que contenía el segmento A fue ligada posteriormente en el vector plasmídico pBS^{-} (Stratagene) cortado con EcoRI/KpnI. El plásmido resultante, pBSD78A-E-661, fue utilizado para los experimentos de mutagénesis dirigida a un sitio siguiendo el método según se describió anteriormente (Kunkel y col., Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987). Sobre la base de los resultados de Lim y col. (1999, supra), se cambiaron las secuencias de nucleótidos para los aminoácidos 279 y 284 del plásmido pBSD78A-E-661 (D279N, A284T) utilizando el oligonucleótido Mut1 con orientación antisentido (Brown y Skinner, supra; nucleótido nº 947-1001, 946-966 es AAC y 979-981 es ACG, teniendo como resultado las sustituciones de aminoácidos D279N y A284T). La parte apropiada del plásmido resultante pBSD78A-E-661-DN-AT fue secuenciada. Después del corte con NdeI/SpeI de pBSD78A-E-661-DN-AT, el fragmento de 535 pb fue ligado en el pD78A-E-661 cortado apropiadamente para obtener pD78A-E-661-DN-AT.

Además, la secuencia de nucleótidos para el aminoácido Q253 fue cambiada por una secuencia de nucleótidos que codificaba H253 mediante la utilización del oligonucleótido Mut2 con orientación antisentido (Brown y Skinner, supra; nucleótido nº 874-900, 886-888 es CAT, teniendo como resultado la sustitución de aminoácido Q253H). El plásmido resultante pD78A-E-661-QH contenía el cambio de aminoácidos Q253H. El cambio del aminoácido 284 (A284T) fue realizado mediante la utilización del oligonucleótido Mut3 con orientación antisentido (Brown y col., supra; nucleótido nº 966-993, 979-981 es ACC teniendo como resultado la sustitución de aminoácidos A284T) dando lugar al plásmido pD78A-E-661-AT. El cuarto plásmido, pD78A-E-661-QH-AT, contenía el cambio de ambos aminoácidos (Q253H, A284T) mediante la utilización de ambos oligonucleótidos (Mut2, Mut3) en una reacción de mutagénesis dirigida a un sitio. Los plásmidos p661Apart, pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT y pD78A-E-661-QH-AT están representados en la Figura 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Oligonucleótidos utilizados para la construcción de los clones de ADNc de longitud completa del segmento A del IBDV conteniendo sustituciones de aminoácidos^{a}

\vskip1.000000\baselineskip

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}{150mm} ^{a} Composición y localización de
los cebadores oligonucleotídicos utilizados para la mutagénesis
dirigida a un sitio y el clonaje. Los sitios de restricción
utilizados están subrayados y se nombran los enzimas de restricción
apropiados. Los nucleótidos cambiados para la mutagénesis están en
código de minúsculas y los tripletes de nucleótidos codificadores
están marcados en negrita. Las posiciones en las que los cebadores
se unen (número de nucleótido) y la numeración de los aminoácidos
están de acuerdo con la secuencia publicada de la cepa P2 (Mundt y
Müller, 1995,  supra ; número de acceso del NCBI X
84034).\end{minipage} \cr}

Construcción de un clon de ADNc de longitud completa del segmento B Cepa D78

Para el clonaje del ADNc de longitud completa del segmento B de la cepa D78 de serotipo I, el virus fue propagado en CEF y purificado por ultracentrifugación. El ARN vírico genómico de la cepa D78 fue purificado, transcrito de manera inversa a ADNc y amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) siguiendo procedimientos estándar que utilizan oligonucleótidos según está descrito (Mundt y Vakharia, 1996). El producto de la amplificación fue clonado con extremos romos y se secuenciaron los plásmidos que contenían los fragmentos de PCR apropiados. El procedimiento de clonaje para obtener un plásmido conteniendo el ADNc de longitud completa del segmento B (pUC18BD78) bajo el control del promotor de la ARN polimerasa de T7, correspondía al procedimiento descrito por Mundt y Vakharia (1996, supra) para el segmento B de la cepa P2 (Figura 3).

Cepa UK661

Se utilizaron tres pares de oligonucleótidos derivados de la información sobre la secuencia presentada en Brown y Skinner (1996, supra).

i) UK661BFor1 (secuencia de acuerdo con el oligonucleótido B5'-P2, Mundt y Vakharia, 1996, supra), UK661
BRev1 orientado antisentido (nucleótidos n^{os} 708-736). El extremo 5' del oligonucleótido UK661BRev1 contiene adicionalmente a la secuencia del segmento B de la cepa UK661, el sitio de corte del enzima de restricción XbaI conteniendo la nonasecuencia 5'-CTCTAGAGG;

ii) UK661BFor2 (nucleótidos n^{os} 751-677), UK661BRev2 orientado antisentido (nucleótidos n^{os} 2089-2113). El extremo 5' del oligonucleótido UK661BRev2 contiene, adicionalmente a la secuencia del segmento B de la cepa UK661, el sitio de corte del enzima de restricción XbaI conteniendo la nonasecuencia 5'-CTCTAGAGG;

iii) UK661BFor3 (nucleótidos n^{os} 2011-2035), UK661BRev3 orientado antisentido (Mundt y Müller, 1995, supra, nucleótidos n^{os} 2804-2827). El extremo 5' del oligonucleótido UK661BRev3 contiene, adicionalmente a la secuencia del segmento B de la cepa UK661, el sitio de corte del enzima de restricción XbaI conteniendo la nonasecuencia 5'-TCTAGAGCCC. En la misma, el triplete CCC creaba un sitio de corte de SmaI junto con los tres últimos nucleótidos de la secuencia genómica vírica de segmento B (nucleótidos n^{os} 2825-2827). Mediante la utilización de estos tres pares de oligonucleótidos UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2 y UK661BFor3; UK661BRev3 durante la RT-PCR, tres fragmentos de ADNc fueron amplificados y clonados con extremos romos en el vector pUC18 cortado con SmaI para obtener pUK661B1, pUK661B2 y pUK661B3, respectivamente. Después de la secuenciación de los tres fragmentos insertados, pUK661B2 fue cortado con AgeI y XbaI para obtener un fragmento de 1441 pb que fue ligado posteriormente en pUK661B1 cortado con AgeI/XbaI para obtener pUK661B12. Para la construcción del clon de ADNc de longitud completa del segmento B, pUK661B3 fue cortado con BstBI/XbaI y el fragmento de 694 pb obtenido fue ligado en pUK661B12 cortado con BstBI/XbaI. El plásmido resultante, pB661, contenía la secuencia de ADNc de longitud completa del segmento B de la cepa UK661 bajo el control del promotor de T7. El pB661 está representado en la Figura 5 (la numeración está de acuerdo con la secuencia de la cepa P2 descrita en Mundt y Müller, 1995, supra).

Recuperación del virus a partir de ARNc en cultivo de tejidos

Para la transcripción in vitro a ARN, los plásmidos pAD78/\DeltaNB, pAD78/\DeltaNB-HQ, pAD78/\DeltaNB-TA, pAD78/
\DeltaNB-RS, pAD78/\DeltaNB-HQ-TA-RS, pD78A/\DeltaNB-E/Del, pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH, pD78A/\DeltaNB-E/Del-AT, pD78A/
\DeltaNB-E/Del-SR, pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-AT, pD78A/\DeltaNB-E/Del-AT-SR, pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-SR, pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-AT-SR y pD78B fueron linealizados mediante corte con BsrGI o PstI. El tratamiento del ADN linealizado y la transcripción posteriores se llevaron a cabo según está descrito por Mundt y Vakharia (1996), con dos excepciones: i) las mezclas de transcripción no fueron purificadas con fenol/cloroformo, y ii) se utilizaron células QM-7 para los experimentos de transfección. Dos días después de la transfección las células fueron congeladas/descongeladas, centrifugadas a 700 x g para eliminar los desechos celulares y los sobrenadantes resultantes fueron clarificados posteriormente por filtración a través de filtros de 0,45 \mum y almacenados a -70ºC. Para los estudios de inmunofluorescencia, se cultivaron células QM-7 sobre cubreobjetos estériles.

Para la transcripción in vitro a ARN, los plásmidos que contenían el segmento A de UK661 (Figura 5) fueron linealizados mediante corte con BsrGI. El segmento B de la cepa D78 fue linealizado con PstI, mientras que el segmento B de la cepa UK661 fue linealizado con SmaI. El tratamiento del ADN linealizado y la transcripción posteriores se llevaron a cabo según se describió anteriormente.

Detección del antígeno del IBDV

El antígeno del IBDV fue detectado mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y Transferencia Western utilizando un antisuero anti-IBDV de conejo. Para el IFA, CEF cultivadas sobre cubreobjetos fueron incubadas con los sobrenadantes de QM-7, CEF y CAM transfectadas, respectivamente, utilizadas para el pase. Después de un tiempo de incubación de 16 horas, las CEF fueron fijadas con acetona y procesadas para IFA. Para el examen de la replicación del IBDV después de la transfección, células QM-7 cultivadas sobre cubreobjetos fueron incubadas durante 24 horas o 48 horas, fijadas con acetona y procesadas para el IFA.

Resultados Experimentos de transfección con ARNc intergenérico

Para los experimentos de transfección, un clon de ADNc de longitud completa del segmento A de la cepa D78 (pD78A/\DeltaNB) y del segmento A intergenérico pD78A/\DeltaNB-E/Del fueron transcritos a ARNc sintético y cotransfectados con el ARNc de longitud completa del segmento B (pD78B) en células QM-7 así como en CEF en paralelo. Dos días después de la transfección, las células fueron congeladas/descongeladas y los sobrenadantes resultantes fueron pasados dos veces en CEF. Las CEF fueron incubadas hasta cinco días después de la infección en cada pase. Después de la congelación/descongelación, cada sobrenadante de la transfección, así como cada pase de cada transfección, fueron ensayados para determinar antígeno del IBDV mediante IFA utilizando CEF. Los experimentos de transfección fueron repetidos tres veces. Se generó virus después de la transfección del ARNc procedente del plásmido pD78B en combinación con pAD78/\DeltaNB, dando lugar a la generación de la cepa D78r. En contraste, después de los experimentos de transfección utilizando ARNc de pD78A/\DeltaNB-E/Del y pD78B, no pudo aislarse ningún virus que infectara el cultivo de tejidos. Con el fin de analizar si la transfección fue seguida por replicación, se llevó a cabo la transfección utilizando células QM-7 cultivadas sobre cubreobjetos. Aquí en ambos casos se detectó antígeno del virus 24 horas después de la transfección utilizando IFA. De este modo demostramos que en ambos casos tuvo lugar la replicación vírica, pero que solamente en el caso de D78r fue posible generar IBDV que infectaran el cultivo de tejidos.

Experimentos de transfección con ARNc mutado

Sobre la base de los resultados de la comparación de secuencias, se establecieron mediante mutagénesis dirigida a un sitio varios clones diferentes de ADNc de longitud completa mutados.

(i) IBDV Variante-E

Se generaron plásmidos mutados de pD78A/\DeltaNB-E/Del que contenían sustituciones de aminoácidos (aa) en las posiciones 253, 284 y 330 en todas las siete combinaciones posibles (Tabla 5). Se llevaron a cabo experimentos de transfección y pase tres veces en paralelo en células CEF y QM-7. Los sobrenadantes obtenidos fueron analizados para determinar su infectividad mediante IFA. Después de la transfección del ARNc de los plásmidos pD78A/\DeltaNB-E/Del, pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH, pD78A/\DeltaNB-E/Del-AT, pD78A/\DeltaNB-E/Del-SR, pD78A/\DeltaNB-E/Del-AT-SR y pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-SR en combinación con el ARNc de pD78B, no pudo aislarse virus que infectara las células QM-7 o CEF. La transfección del ARNc obtenido de pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-AT o pD78A/\DeltaNB-E/Del-QH-AT-SR condujo a la generación de virus infecciosos (D78A-E/Del-QH-AT y D78A-E/Del-QH-AT-SR). La especificidad fue confirmada mediante IFA en células CEF así como en células QM-7. Esto indicaba que VP2 de IBDV tiene un papel crítico en la infección de cultivos de tejidos. Las sustituciones de aa (BU) Q-253-H (TC) y (BU) A-284-T (TC) eran necesarias y suficientes para generar IBDV infecciosos para los cultivos de tejidos utilizados. El mutante del IBDV que tenía las tres sustituciones de aa (D78/Variante-E adaptado a CEF) fue utilizado para un examen posterior (Ejemplo 2).

(ii) IBDV Clásico D78

Para confirmar estos resultados, se construyó un segundo grupo de plásmidos utilizando pAD78/\DeltaNB para mutagénesis dirigida a un sitio con el fin de obtener plásmidos con sustituciones de un único aa (pAD78/\DeltaNB-HQ, pAD78/\DeltaNB-TA, pAD78/\Delta-RS) o de los tres aa (pAD78/\DeltaNB-HQ-TA-RS). Estos cuatro plásmidos fueron utilizados para los experimentos de transfección en combinación con pD78B según se describió anteriormente. Pudieron generarse IBDV infecciosos después de la transfección de ARNc procedente de pAD78/\DeltaNB-RS según se detectó mediante IFA. Una vez más, el aa 330 no tuvo ninguna influencia sobre la capacidad del virus generado para infectar el cultivo de tejidos.

Todas las construcciones fueron analizadas para determinar replicación después de la transfección mediante IFA. Pudo detectarse específicamente antígeno del IBDV 24 horas y 48 después de la transfección, mostrando los típicos agregados grandes intensamente teñidos en el citoplasma.

UK661

Para los experimentos de transfección, un clon de ADNc de longitud completa de los segmentos A quiméricos pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT y pD78A-E-661-QH-AT fue transcrito a ARNc sintético y cotransfectado con ARNc de longitud completa del segmento B de la cepa D78 o del segmento B de la cepa UK661 en células QM-7 así como en células CEC en paralelo. Dos días después de la transfección las células fueron congeladas/descongeladas y los sobrenadantes resultantes fueron pasados una vez en CEC. Las CEC fueron incubadas 24 ó 48 horas después de la infección, fijadas y procesadas para la inmunofluorescencia. Se generó un virus infeccioso para CEC después de la transfección del ARNc procedente del plásmido pD78A-E-661-QH-AT en combinación con pD78B y pB661, dando lugar al IBDV quimérico D78A-E-661-QH-AT. En contraste, después de los experimentos de transfección utilizando ARNc procedente de pD78A-E-661, pD78A-E-661-DN-AT, pD78A-E-661-QH, pD78A-E-661-AT en combinación con ARNc de pBD78 o de pB661, no pudo aislarse virus que infectara el cultivo de tejidos. Después de incubar el sobrenadante de la transfección 72 horas después de la infección, son detectables CEF individuales infectadas en el caso de D78-E-661-DN-AT.

(iii) IBDV GLS

Con el fin de confirmar los resultados de los experimentos de transfección utilizando plásmidos intergenéricos así como plásmidos mutados, nos aprovechamos de un par de cepas de IBDV que existen de forma natural. La región variable de VP2 de la cepa GLS derivada de la bursa (GLS-B) y de la variante GLS-TC adaptada al cultivo de tejidos fueron amplificadas, clonadas y analizadas. La comparación de las secuencias de aminoácidos de las dos cepas GLS obtenidas de pGLS-B y pGLS-TC, respectivamente, reveló un cambio de aminoácidos en la posición 284 [(GLS-B) A\rightarrowT (GLS-TC)] entre ambas secuencias (Fig. 1B). El aa 253 (Q) y el 330 (S) eran idénticos a los aa del grupo BU según se describió anteriormente. Para analizar si el cambio en la posición 284 (A\rightarrowT) era suficiente para generar virus infecciosos, se construyeron dos plásmidos (pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-TC y pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-B) que contenían la región hipervariable de VP2 de ambas variantes de GLS. Los ARNcs de pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-TC y pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-B, respectivamente, fueron transfectados en paralelo combinados con ARNc de pD78B en células QM-7 así como en CEF. Después del pase de los sobrenadantes en cultivo de tejidos, pudieron detectarse mediante IFA virus infecciosos así como ECP después de la transfección del ARNc de pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-TC. En varios intentos, la transfección de ARNc procedente de pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-B no consiguió producir sobrenadantes que contuvieran IBDV infecciosos para el cultivo de tejidos. La transcripción/traducción in vitro de ambos plásmidos, pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-TC y pD78A/\DeltaNB-E/Del-GLS-B, mostró un procesamiento completo de las poliproteínas. Después de la transfección del ARNc de ambos plásmidos junto con el ARNc de pD78B, se detectó antígeno vírico mediante IFA. De este modo, ambas quimeras demostraron ser competentes respecto a la replicación. Tomados los resultados en conjunto, el cambio de la región hipervariable de VP2 que condujo al cambio de un único aa en la posición 284 fue suficiente para generar IBDV intergenéricos infecciosos.

TABLA 5 Resumen de los clones de ADNc intergenérico de longitud completa del segmento A del IBDV que contenían sustituciones de aminoácidos

6

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \begin{minipage}{150mm}  ^{a} Los plásmidos están basados en
el clon de ADNc de longitud completa del segmento A de la cepa D78
serotipo I adaptada al cultivo de tejidos.\end{minipage} \cr 
\+ \begin{minipage}{150mm} Las secuencias de las cepas de
serotipo I derivadas de la bursa GLS-BU, Delaware E
(E/Del) y de la cepa de serotipo I adaptada al cultivo de tejidos
GLS-TC  fueron sustituidas con secuencias de
D78.\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{150mm}  ^{b} La
numeración de los aminoácidos (aa) está de acuerdo con la secuencia
publicada de la cepa P2 (Mundt y Müller, 1995,  supra ; número
de acceso del  NCBI X 84034). Los aminoácidos que existen de forma
natural están en cursiva y los aminoácidos cambiados están marcados
en negrita.\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{150mm}
 ^{c} Se utilizaron células de embrión de pollo (CEF) así como
células QM-7 para los experimentos de transfección.
El antígeno del IBDV fue detectado  mediante inmunofluorescencia
indirecta utilizando un suero anti-IBDV de conejo
(Mundt y col., 1995) 24 horas después de la transfección. Positivo
para el antígeno (+), negativo para el antígeno
(-).\end{minipage} \cr  \+ \begin{minipage}{150mm}  ^{d} Se
utilizaron CEF para el pase de los sobrenadantes de la transfección.
El antígeno del IBDV fue detectado mediante inmunofluorescencia
indirecta  utilizando un suero anti-IBDV de conejo
(Mundt y col., 1995,  supra ) después del pase en CEF. Positivo
para el antígeno (+), negativo para el antígeno
(-).\end{minipage} \cr}

Ejemplo 2 Propiedades biológicas del mutante del IBDV Variante-E adaptado a CEF Materiales y Métodos Preparación de vacunas de IBDV Quimérico D78/Variante-E (adaptado a la bursa)

Huevos SPF de 9-12 días de edad fueron infectados con el quimérico D78/Variante-E/D78 (D78/Variante-E/D78 sin los tres cambios de aminoácidos en Q263H, A284T y S330R) a través de la membrana corioalantoidea (CAM) desprendida. Cinco días después de la infección la CAM y los embriones fueron recogidos y homogeneizados. El homogenado fue valorado en CAM. El sobrenadante fue diluido para dar como resultado una dosis de vacuna de 10^{2,0} DIE_{50}/animal, para ser aplicada por la vía de gotas oculares.

Quimérico D78/Variante-E (adaptado a CEF)

Se prepararon células fibroblásticas primarias de embrión de pollo (CEF) a una concentración final de 2 x 10^{6}/ml. Las células fueron cultivadas en medio mínimo esencial de Eagle que contenía un 5% de suero de ternera fetal. A 15 ml de esta suspensión celular se añadieron 0,1 ml de virus IBDV (D78/Variante-E/D78 con tres cambios de aminoácidos en Q253H, A284T y S330R) que estaba disuelto en 1 ml. Después de incubación durante 3-6 días en un incubador a 37ºC con humedad elevada, el sobrenadante fue diluido para dar como resultado una dosis de vacuna de 10^{5,3} o 10^{3,5} DICT_{50}/animal para aplicación por medio de gotas oculares o inyección intramuscular, respectivamente.

Vacuna de IBDV Clásico comercialmente disponible Nobilis cepa D78

La vacuna fue diluida para dar como resultado una dosis de vacuna de 10^{3,3} DICT_{50}/animal para ser aplicada mediante gotas oculares.

Identificación de vacunas de IBDV mediante análisis con un panel

Ambas cepas de IBDV fueron identificadas por medio de ELISA utilizando diferentes anticuerpos monoclonales de acuerdo con Van Loon y col. (Van Loon, A.A.W.M., D. Lütticken y D.B. Snyder. Rapid quantification of infectious bursal disease (IBD) challenge, field or vaccine virus strains. International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anemia, Rauischhilzhausen, Alemania, 179-187, 1994).

Crecimiento en CEF

Ambas cepas de IBDV fueron utilizadas para infectar CEF. La inducción de un ECP (efecto citopático) específico por el IBDV fue examinada microscópicamente durante un periodo de 6 días.

Vacunación

El efecto de las diferentes vacunas se determinó midiendo la resistencia al desafío obtenido por la administración de un virus de desafío (cepa de IBDV virulenta Variante-E), 14 días después de la vacunación. La vacuna quimérica D78/Variante-E (adaptada a la bursa), 10^{2,0} DIE_{50}/animal, fue aplicada a través de gotas oculares a las dos semanas de edad. La vacuna quimérica D78/Variante-E (adaptada a CEF), 10^{5,5} ó 10^{3,5} DICT_{50}/animal, fue aplicada mediante gotas oculares o mediante inyección intramuscular a las 2 semanas de edad, respectivamente. La vacuna Clásica comercialmente disponible Nobilis cepa D78 (Intervet International B.V., Países Bajos), 10^{3,3} DICT_{50}/animal fue aplicada mediante gotas oculares a las 2 semanas de edad. Se investigó la presencia de IBDV en la bursa de Fabricio y de lesiones microscópicas en la bursa de 5 animales por grupo, 3, 7, 10 y 13 días después de la vacunación y 3 días después del desafío. Se determinó la protección frente al desafío.

Resultados Identificación de las vacunas de IBDV mediante análisis con un panel

Como puede verse en la Tabla 6, la vacuna quimérica D78/Variante-E (adaptada a la bursa) y la vacuna quimérica D78/Variante-E (adaptada a CEF) tienen un patrón de reacción idéntico con los diferentes MCA. Esto significa que los 3 cambios de aminoácidos no tienen influencia sobre los epítopos presentes en el virus según se determinó por los diferentes MCA. La vacuna comercial clásica tiene un patrón de reacción diferentes con los diferentes MCA.

TABLA 6 Patrón del panel de diferentes virus IBDV con diferentes MCA. + Epítopo presente en el virus, - epítopo no presente en el virus

8

Crecimiento en CEF

Como puede observarse en la Tabla 7, el virus quimérico D78/Variante-E (bursa) no es capaz de crecer en CEF. El virus quimérico D78/Variante-E (CEF) y la vacuna comercial Clásica Nobilis cepa D78 son ambos capaces de replicarse en CEF induciendo un ECP.

TABLA 7 Capacidad para crecer en CEF e inducir un ECP específico del IBDV. + = Induce ECP en CEF; - = no produce ECP en CEF

9

Puntuación media de las lesiones microscópicas en la bursa 3, 7, 10 y 13 días después de la vacunación y 3 y 10 días después del desafío

Los resultados están representados en la Tabla 8. Como puede verse en la Tabla 8, la cepa quimérica D78/Variante-E (bursa) no adaptada a CEF es virulenta e induce una disminución linfocítica completa, ya a los 7 días después de la vacunación. En contraste, la cepa D78/Variante-E (CEF) adaptada al cultivo de tejidos no induce lesiones después de la vacunación. La vacuna comercial induce lesiones de leve a moderadas después de la vacunación. Los datos individuales mostraban que los animales vacunados con la cepa quimérica D78/Variante-E (bursa) o con D78 fueron protegidos frente al desafío. Los animales vacunados con D78/Variante-E por vía ocular o intramuscular tuvieron también como resultado una protección 3 días después del desafío, aunque menor que la inducida por la cepa parental virulenta.

TABLA 8 Puntuación media de las lesiones de la bursa

10

(OC) = vía ocular; (im) = vía intramuscular; C = lesiones crónicas; A = lesiones agudas

Claims

1. Un método para la preparación de un mutante infeccioso del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF que comprende las etapas de,

(i) preparar separadamente una construcción de ADN que, contiene ADNc de los segmentos A y B genómicos de un IBDV que no es capaz de replicarse en un cultivo de células CEF,

(ii) introducir una mutación en:

a: uno o ambos codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 de las cepas Variante-E o Clásica del IBDV, o en

b: el codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 de una cepa GLS del IBDV,

: en el ADNc que comprende el segmento A, de tal manera que los codones para los residuos de aminoácido 253 y 284 del gen de VP2 mutado codifiquen un residuo de histidina y un residuo de treonina, respectivamente, en el caso de las cepas Variante-E o Clásica del IBDV, o de tal manera que el codón para el residuo de aminoácido 284 del gen de VP2 mutado codifique un residuo de treonina en el caso de una cepa GLS del IBDV,

(iii) permitir que los transcritos de ARN del ADNc que comprende el segmento A y el segmento B inicien la replicación del mutante de IBDV en células huésped en un medio de cultivo, y

(iv) aislar el mutante del IBDV del cultivo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el mutante de IBDV adaptado al cultivo de células CEF contiene un residuo de aminoácido serina, arginina o lisina, preferiblemente una arginina, en la posición 330 de la proteína VP2.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se introduce una mutación en todos los codones 253, 284 y 330 del gen de VP2 de un IBDV Clásico o Variante-E.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque las mutaciones son introducidas en los codones 253 (Gln), 284 (Ala) y 330 (Ser).

5. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque se preparan transcritos de ARN sintéticos a partir del ADNc que comprende el segmento A y el segmento B mutados, seguido por la transfección de células huésped con los transcritos de ARN sintéticos.

6. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el método comprende las etapas adicionales de preparación de un IBDV quimérico.

7. Un mutante infeccioso del IBDV producido mediante ingeniería genética capaz de replicarse en un cultivo de células CEF, que contiene codones para los aminoácidos 253 (His) y 284 (Thr) en el gen de VP2 de un IBDV Variante-E y, opcionalmente, un codón para el aminoácido 330 (Arg), con la condición de que la proteína VP2 no tenga los aminoácidos glicina y/o valina en las posiciones 318 y/o 325, respectivamente.

8. Un mutante infeccioso del IBDV producido mediante ingeniería genética de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína VP2 tiene los aminoácidos ácido aspártico y/o metionina en las posiciones 318 y/o 325, respectivamente.

9. Un mutante infeccioso del IBDV producido mediante ingeniería genética de acuerdo con las reivindicaciones 7-8, caracterizado porque es un mutante quimérico del IBDV.

10. Un mutante infeccioso del IBDV producido mediante ingeniería genética de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el mutante deriva de la cepa D78 en la cual el gen de VP2 es sustituido por el gen de VP2 de una cepa Variante-E.

11. Una vacuna para ser utilizada en la protección de aves de corral frente a la enfermedad resultante de una infección por IBDV, que comprende un mutante del IBDV producido mediante ingeniería genética de acuerdo con las reivindicaciones 7-10, junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para la preparación de una vacuna para ser utilizada en la protección de aves de corral frente a la enfermedad resultante de una infección por IBDV, caracterizado porque comprende la combinación de un mutante infeccioso del IBDV capaz de replicarse en un cultivo de células CEF preparado de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.