JP2000312593A - 遺伝的に操作された細胞培養適応感染性嚢胞疾患ウイルス(ibdv)突然変異体 - Google Patents

遺伝的に操作された細胞培養適応感染性嚢胞疾患ウイルス(ibdv)突然変異体

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Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】CEF細胞内で増殖する感染性嚢胞疾患ウイルス
(IBDV)突然変異体の製造方法の提供。 【解決手段】VP2遺伝子のアミノ酸残基253(Gln)及び2
84(Ala)のコドンから253(His)及び284(Thr)のコ
ドンの変化は、嚢に適応した古典的及び変異体E IBDVが
CEF細胞培養内で増殖することを可能にした。GLS IBDV
の場合には、アミノ酸残基284の変化だけが必要であっ
た。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、CEF細胞培養内で
複製する能力を有する感染性IBDV突然変異体の製造方
法、遺伝的に操作されたIBDV突然変異体、およびそのよ
うなIBDV突然変異体を含むワクチン関する。
【0002】
【従来の技術】感染性嚢胞疾患ウイルス(IBDV)はビル
ナウイルス科のメンバーである。この科のウイルスは、
非常に類似したゲノム体制および類似した複製周期を有
する。これらのウイルスのゲノムは、二本鎖(ds)RNA
の2つのセグメント(AおよびB)よりなる。大きい方の
セグメントAは、自己タンパク質分解により切断されて
成熟ウイルスタンパク質VP2、VP3およびVP4を形成する
ポリタンパク質をコードする。VP2およびVP3は、ビリオ
ンの主要構造タンパク質である。VP2はビルナウイルス
の主要な宿主防御免疫原であり、中和抗体の誘導を引き
起こす抗原領域を含有する。VP4タンパク質は、VP2、VP
3およびVP4タンパク質の前駆体ポリタンパク質のプロセ
シングに関与するウイルスコード化プロテアーゼである
らしい。大きい方のセグメントAはまた、該ポリタンパ
ク質遺伝子に先行する及び部分的に重複する第2のオー
プンリーディングフレーム(ORF)を有する。この第2の
オープンリーディングフレームは、IBDV感染細胞内に存
在する未知機能のタンパク質VP5をコードする。小さい
方のセグメントBは、ポリメラーゼおよびキャッピング
酵素活性を有する90kDaの多機能タンパク質であるVP1を
コードする。
【0003】IBDVには、血清型1および2の2つの血清型
が存在する。それらの2つの血清型はウイルス中和(V
N)試験により識別されうる。さらに、血清型1の亜型が
既に分離されている。血清型1のこれらのいわゆる「変
異(体)」ウイルスは、交差中和試験、モノクローナル
抗体のパネル、またはRT-PCRにより同定されうる。ま
た、IBDVの血清型1のこれらの亜型、例えば、古典的、
変異体E、GLS、RS593およびDS326株が文献に記載されて
いる(Van Loonら, Proceedings of the International
symposium on infectious bursal disease and chicke
n infectious anaemia, Rauischholzhausen, Germany,
179-187, 1994)。
【0004】ガンボロー病とも称される感染性嚢胞疾患
(IBD)は、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択指向
性を有しリンパ系組織を一次標的とする、ニワトリにお
ける高伝染性急性ウイルス感染症である。感受性集団に
おける罹患率は高く、急激な体重減少および中等度の死
亡率を伴う。該疾患から回復したニワトリは、ニワトリ
の防御機構に不可欠であるファブリキウス嚢の破壊のた
め、免疫不全を有することがある。IBDウイルスは、3週
齢未満のニワトリにおいては重篤な免疫抑制を引き起こ
し、3月齢までのニワトリにおいては嚢の病変を誘発す
る。
【0005】該疾患は、弱毒化生IBDVワクチンで初回抗
原刺激されたニワトリに対する不活化ワクチンの適用に
より種禽(breeder)集団において高レベルの抗体を誘
導することにより長年にわたり予防されうる。このた
め、IBDにより引き起こされる経済的損失が最小限に維
持されている。ワクチン接種された種禽に由来するニワ
トリにおける移行抗体は、IBDVによる初期感染を予防
し、免疫抑制に伴う問題を減少させる。さらに、移行抗
体が減弱した後の商業用のニワトリ集団においても、弱
毒化生ワクチンが成功裡に使用されている。
【0006】最近、ヨーロッパにおいて、非常にビルレ
ントなIBDV株が、高い死亡率の疾患の発生を引き起こし
た。現在のワクチン接種計画では、ニワトリを十分に防
御することができなかった。ワクチン接種の失敗は、主
として、ビルレントな野外ウイルスによる攻撃の前に生
ワクチンがニワトリに感染できなかったことによるもの
であった。
【0007】したがって、既存のワクチンを改良し、新
規タイプのワクチンを開発することが絶えず要求されて
いる。生ワクチンの開発のためには、弱毒化形態のIBD
ウイルスが必要とされる。通常、これは、適当な基質上
でのIBDV野外分離体の連続継代により得ることができ
る。不活化IBDVワクチンの開発のためには、該基質上で
のIBDウイルスの増殖から生じる大量のIBDV抗原塊の作
製のための適当な基質が必要である。
【0008】野外IBDVは、感染したトリの嚢内または発
育鶏卵内でインビボで容易に増殖しうることが公知であ
る。一方、ニワトリ胚由来のインビトロ細胞培養にいく
つかのIBDV株の増殖を適応させるのに成功したことが報
告されているにもかかわらず、野外の感染嚢から分離さ
れたほとんどのIBDV株、特に、いわゆるビルレントまた
は非常にビルレントなIBDV株は、ニワトリ胚繊維芽細胞
(CEF)などのニワトリ胚由来の細胞または腎臓、肝臓
などの他の器官に由来する細胞には適応させることがで
きないことが一般に認められている(Brownら, J. Gen.
Virology 75,675-680, 1994, van Loonら, 1994, 前
掲)。
【0009】インビボ培養基質の欠点は明らかである。
そのような培養方法は、動物に対する思いやりがない方
法であり、多数の動物を必要とし、長時間を要し、標準
化されたストリンジェントな条件下で行なうことができ
ない。また、インビトロ細胞培養基質に対する適応に不
応性でない限られた数のIBDV株は、IBDV株の適応につな
がる連続継代法の結果、ランダムな突然変異が該ウイル
スのゲノム内に無制御に導入されるという欠点を有す
る。そのような突然変異は、細胞培養に対するウイルス
の適応に関連したもの以外のウイルスの特性、例えば、
ウイルスの免疫原性に関連した特性に影響を及ぼしう
る。そのような追加的なランダムな突然変異は望ましく
ない。
【0010】CEF細胞培養内のインビトロでのウイルス
の継代によるIBDVの適応は、感染したトリの嚢内の病変
を該ウイルスが誘発する能力の減少により示されるとお
り、ビルレンスの弱毒化を伴う。Yamaguchiら(Virolog
y 223, 219-223, 1996)は、IBDウイルスのビルレンス
に関する、およびCEF細胞培養に対する嚢IBDVの適応の
結果としてこれらのウイルスが弱毒化されることに関す
る分子的根拠について検討している。野生型IBDVの弱毒
化に関与する明確な突然変異を同定することはできない
と、Yamaguchiらが行なった研究から結論づけられた。
セグメントAの長いオープンリーディングフレームにコ
ードされるポリタンパク質の279位(Asp/Asn)および28
4位(Ala/Thr)のアミノ酸残基が、CEF細胞内でのIBDV
のビルレンスまたは増殖に重要であると示唆された。後
者は、Lim, B-L(Proceedings of the4th Asia Pacific
Poultry Health Conference, 22-26, 1998年11月, Mel
bourne, Australia, Abst. 79)により確認された。IBD
VのVP2タンパク質内のアミノ酸残基279および284の置換
(それぞれAsp→AsnおよびAla→Thr)は、CEF細胞培養
内で増殖しうるIBDV突然変異体を与える、と該刊行物に
開示されている。しかしながら、先行技術においては、
CEF細胞培養に対する嚢IBDVの適応を可能にするのに必
要かつ十分であるアミノ酸の突然変異のタイプおよび最
小数の別態様は開示されていない。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】感染したトリの嚢内に
おいてインビボでしか増殖しないIBDV分離体を、細胞培
養内での増殖に適応させるために一般に適用可能な方法
を提供することが、本発明の目的である。
【0012】突然変異をIBDVゲノム内に制御的に導入す
ることによる弱毒化IBDV突然変異体の製造方法を提供す
ることが、本発明のもう1つの目的である。
【0013】さらに、遺伝的に操作されたIBDV突然変異
体であって、該突然変異体が細胞培養内で増殖すること
を可能にする適当なアミノ酸残基を含むことを特徴とす
るIBDV突然変異体を提供することが、本発明の目的であ
る。
【0014】
【課題を解決するための手段】この目的は、以下の工程
を含んでなる、CEF細胞培養内で複製されうる感染性IBD
V突然変異体の製造方法により達成されることが判明し
た: (i)CEF細胞培養内で複製する能力を有さないIBDVのゲ
ノムセグメントAおよびBのcDNAを含むDNA構築物を別々
に調製し、(ii)該セグメントAを含むcDNA上の、(a)
変異体Eまたは古典的IBDV株のVP2ゲノムのアミノ酸残基
253および284の1以上のコドン内または(b)GLS IBDV株
のVP2遺伝子のアミノ酸残基284のコドン内に突然変異を
導入して、変異体Eまたは古典的IBDV株の場合には、該
突然変異VP2遺伝子のアミノ酸残基253および284のコド
ンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコード
するようにし、あるいはGLS IBDV株の場合には、該突然
変異VP2遺伝子のアミノ酸残基284のコドンがトレオニン
残基をコードするようにし、(iii)該セグメントAと該
セグメントBとを含むcDNAのRNA転写産物に、培地内の宿
主細胞内で該IBDV突然変異体の複製を開始させ、(iv)
該培養から該IBDV突然変異体を分離する。
【0015】
【発明の実施の形態】本発明は、いずれのアミノ酸残基
が、CEF細胞培養内でIBDVの複製を可能にするのに必要
かつ十分であるかを、初めて同定するものである。ほと
んどのIBDV嚢分離体はVP2タンパク質のアミノ酸残基253
(Gln)、284(Ala)および330(Ser)を含むが、253位
および284位のコドンがアミノ酸残基253(His)および2
84(Thr)をコードするように変化している変異体Eまた
は古典的IBDV突然変異体はCEF細胞培養内で増殖しう
る。GLS IBDV突然変異体の場合、284位のコドンがアミ
ノ酸残基284(Thr)をコードするように該コドンを変化
させることで十分であることが判明している。また、ア
ミノ酸330位は、CEF内での古典的または変異体E IBDV突
然変異体の複製に決定的に重要ではないことが判明して
いる。しかしながら、本発明においては、その位置にセ
リン、アルギニンまたはリシン残基が存在するのが最も
好ましい。また、GLS IBDVの場合には、アミノ酸253位
は複製に決定的に重要ではなく、それは通常はグルタミ
ン残基であることが判明している。したがって、好まし
い方法においては、VP2タンパク質内のこの位置に、こ
れらの3つのアミノ酸残基のいずれか、特に330(Arg)
を含むIBDV突然変異体を製造する。GLS IBDV突然変異体
の場合、253位の好ましいアミノ酸残基はグルタミンで
ある。
【0016】
【表1】
【0017】感染したニワトリの嚢内のみで複製する能
力を有していた(キメラ)変異体EIBDV(D78/変異体E)
のゲノムにおいては、CEF細胞培養に対するIBDV分離体
の適応のためには2つの変化が必要であることが判明し
ている。これらの位置はアミノ酸残基253および284を含
む。これらの位置のそれぞれのアミノ酸残基ヒスチジン
およびトレオニンは、該IBDV突然変異体がCEF細胞培養
内で複製するのを可能にする(表1および実施例1)。
さらにまた、本発明方法によりCEF細胞培養に適応したI
BDV突然変異体は弱毒化されることが判明している(実
施例2)。
【0018】古典的IBDV株における嚢からCEF細胞への
適応がそれらの2つのアミノ酸によっても決定されるこ
とを更に確認するために、CEF細胞培養内で複製する能
力を有するIBDV株D78のコドンを253、284および330位で
変化させた。その結果を表2Aに示す。
【0019】
【表2】
【0020】古典的な「非常にビルレントな」(VV)欧
州分離体UK661(Brownら, J. Gen.Virology 75, 675-68
0, 1994; Brown and Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1
996)はインビトロでは増殖できないため、ニワトリに
おいてインビボで増殖させる必要がある。ニワトリにVV
株を感染させる必要があり、感染の数日後、生存したト
リを殺し、その嚢を摘出する。ついで、さらなる使用の
ために、該ウイルスを嚢ホモジネートから抽出すること
ができる。本発明を裏付ける実験は、前記のとおりの25
3位および284位のアミノ酸変化が、VV株UK661が細胞培
養内で増殖するのを可能にすることを示した。古典的IB
DV株に関する突然変異誘発およびトランスフェクション
実験の結果を、表2Bに要約する。
【0021】
【表3】
【0022】これらのデータは更に、古典的嚢IBDV株が
細胞培養内で増殖するのが可能となるためには253位お
よび284位のアミノ酸変化で十分であることを示してい
る。他のすべての突然変異は、細胞培養内で複製されな
いか又は非常に不十分にしか複製されない突然変異体を
与える(Limら, J. Viol. 73, 2854-62, 1999)。
【0023】また、GLS IBDVにおいては、嚢に適応した
IBDVがCEF細胞内で複製されるのが可能となるためには2
84位における単一のアミノ酸残基の置換で十分であるこ
とが確認された(表3)。
【0024】
【表4】
【0025】したがって、本発明の方法は、組換えDNA
技術を用いて、細胞培養内での増殖に対するIBDV嚢分離
体の適応を可能にする。本発明の利点は、該適応方法の
結果、専ら、IBDVのゲノム内の253位および284位のコド
ンの1以上に突然変異が導入されることである。それら
の番号は、該ポリタンパク質およびIBDVゲノムのセグメ
ントA上の大きなオープンリーディングフレームの、そ
れぞれアミノ酸およびコドンの位置を示している(Mund
tおよびMuller. J. Gen. Virol. 77, 437-443,1995; NC
BI受託番号X84034)。
【0026】CEF細胞培養上で増殖しない全てではなく
ともほとんどのIBDV株は、VP2遺伝子内にコドン253(Gl
n)、284(Ala)および330(Ser)を含有する。CEF細胞
培養上で増殖しないいくつかの変異体Eまたは古典的IBD
V株は、必要なコドンである253(His)および284(Th
r)の1つを既に有しているかもしれない。したがって、
本発明の方法は、生じるIBDV突然変異体が、アミノ酸残
基253(His)および284(Thr)をコードするコドンをVP
2遺伝子内に含むよう、前記の必要なコドンの1以上にお
いて突然変異を導入することを含む。
【0027】より好ましくは、本発明の方法は、CEF細
胞内で複製する能力を有さずアミノ酸残基253(Gln)お
よび284(Ala)、より一層好ましくは330(Ser)のコド
ンを含むIBDVに適用する。古典的および変異体E株の場
合には、VP2遺伝子のコドンの2または3つにおいて突然
変異を導入して、コドン253(His)および284(Thr)、
そして所望により330(Arg)を得る。これらの位置にお
けるアミノ酸の新たなコドンは、His(CATまたはCA
C)、Thr(ACT、ACC、ACA、ACG)およびArg(CGT、CG
C、CGA、CGG、AGA、AGG)であってもよい。
【0028】より一層好ましくは、本発明の方法は、CE
F細胞内で複製する能力を有さずコドンGln253(CAA)、
Ala284(GCC)および所望によりSer330(AGT)またはそ
れらの任意の組合せを含むIBDVに適用する。
【0029】特に、本発明の方法は、CEF細胞内で複製
する能力を有さずコドン253(CAA)、284(GCC)および
330(AGT)を含むIBDVに適用する。
【0030】本発明のIBDV突然変異体の製造方法は、ビ
ルナウイルスに関する最近確立された「逆遺伝学(reve
rse genetics)」系(MundtおよびVakharia, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996ならびにWO
98/09646)を含む。この逆遺伝学系は、IBDウイルスのR
NAゲノム内に突然変異を導入する可能性を開いた。本発
明の逆遺伝学法の原理は、ゲノムRNAセグメントAおよび
Bを該ウイルスから単離し、ついで該RNAからcDNAへの逆
転写を行ない、ついで該cDNAをRNAに転写させるという
ものである。該ウイルスのセグメントA(またはB)内へ
の必要な突然変異の導入は、cDNAレベルで生じる。この
逆遺伝子学系における重要な工程は、DNAベクター分子
(例えば、プラスミド)とIBDVのセグメントAまたはBの
完全長cDNAクローンとを含む別々のDNA構築物を準備す
ることである。これらの両方のセグメントの5’および
3’末端のヌクレオチドを含む、セグメントAまたはB cD
NAよりなるDNA構築物は、MundtおよびVakharia(1996,
前掲)に記載の方法に従い作製することができる。該逆
遺伝学法における後続の工程においては、適当なセグメ
ントAおよびB遺伝物質を適当な宿主細胞にトランスフェ
クトし、それにより該トランスフェクト化宿主細胞内
で、cDNAセグメントAおよびBのRNA転写産物に該ウイル
スの複製を開始させて感染性IBDVを得、それを、該宿主
細胞が培養される培地から単離することができる。
【0031】逆遺伝学系の最終工程には、いくつかの方
法を用いることができる。好ましくは、本発明の方法
は、セグメントAおよびBの両方のcDNAからインビトロで
合成RNA転写産物を調製することを含む。この場合、該D
NA構築物は、それらのセグメントのいずれかに作動的に
結合したRNAポリメラーゼプロモーターを含む。該プロ
モーターは、T7、SP6またはT3ポリメラーゼのプロモー
ターであってもよく、T7プロモーターが好ましい。Aお
よびBセグメントの合成転写産物を単離し、それを使用
して適当な宿主細胞にトランスフェクトする。
【0032】あるいは、提供するもう1つの方法におい
ては、セグメントBのRNA転写産物が構成的に発現される
よう、セグメントBのcDNAとRNAポリメラーゼプロモータ
ーとを含むDNA構築物で形質転換された、RNAポリメラー
ゼを発現しうる宿主細胞を含む細胞系を提供する。突然
変異セグメントAを含むcDNAの合成RNA転写産物でそのよ
うな細胞をトランスフェクトした後、IBDV突然変異体の
複製を宿主細胞内で開始させる。特に、バクテリオファ
ージT7 DNA依存性RNAポリメラーゼを発現しうる(例え
ば、これは組換えワクチンウイルスから細胞質的で発現
される)宿主細胞を使用することができる。
【0033】所望の突然変異は、この目的のために当技
術分野で一般に知られている方法によりVP2遺伝子内に
導入することができる。特に、部位特異的突然変異誘発
により突然変異を導入する。IBDVゲノム内に突然変異を
導入するための方法は、本明細書に記載されているが、
当技術分野においても一般に用いられている(Mundtお
よびVakharia, 1996, 前掲; Yaoら, J. Virology 72, 2
647-2654, 1998; Mundtら, 欧州特許出願第0887,412号
およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M.
Ausubelら編, Wiley N.Y., 1995版, p.8.5.1-8.5.
9.)。
【0034】本発明の方法は、CEF細胞培養内で複製す
る能力を有さない、IBDVの古典的、変異体EまたはGLS抗
原亜型である全てのIBDV株に適用することができる。
【0035】さらに、本発明の方法は、株のビルレンス
とは無関係に、非常にビルレントな株(例えば、CS89お
よびUK661)、ビルレント株(例えば、F52/70およびST
C)およびワクチン株(例えば、228Eおよび2512)を含
む、CEF細胞培養内で複製する能力を有さない全てのIBD
V株に適用することができる。非常にビルレントな及び
ビルレントな株に由来する細胞培養内での複製に適応し
たIBDV突然変異体は、それより低いビルレンスを有する
こととなり、生ワクチン株として使用することができ
る。あるいは、そのようなIBDV突然変異体は、細胞培養
内で簡便に増殖させることができ、不活化ワクチンとし
て製剤化することができる。
【0036】また、本発明の方法は、CEF細胞培養内で
複製する能力を有さないIBDV弱毒化株に有利に適用する
ことができる。そのような弱毒化ウイルスに由来する突
然変異体を、ワクチンの製造のために、インビボ産生系
の代わりに細胞培養系内で使用することができる。
【0037】もう1つの態様において、本発明は、CEF細
胞培養内で複製する能力を有する「キメラ」IBDV突然変
異体の製造方法を提供する。該方法は、第1 IBDVのセグ
メントAの遺伝子(特に、VP2遺伝子)内に突然変異を導
入する追加的工程を含み、その結果、その遺伝子により
発現されるタンパク質は、第2 IBDVのエピトープ決定基
を含む。
【0038】キメラIBDVは、第1抗原亜型のセグメントA
またはVP2遺伝子を遺伝子バックボーンとして含み、さ
らに、第2 IBDVエピトープ決定基をコードする遺伝情報
を含むウイルスである。特に、そのようなキメラIBDV
は、第1抗原亜型のIBDVのVPタンパク質上に1以上の追加
的エピトープ決定基を発現する。そのようなキメラIBDV
の利点は、それが、IBDVの少なくとも2つの抗原亜型に
対する免疫を誘導する単一の免疫原として使用可能なこ
とである。
【0039】特に、古典的、GLSまたは変異体E IBDVの
セグメントAバックボーンまたはVP2遺伝子を含むIBDV突
然変異体を製造する。種々のIBDV株のセグメントAの全
コード領域を含有するcDNAクローンを、標準的なクロー
ニング法および当技術分野において記載されている方法
(Vakhariaら, Avian Diseases 36, 736-742, 1992;J.
Gen. Virology 74, 1201-1206, 1993)を用いて調製す
ることができる。種々のIBDV株のセグメントAのアミノ
酸配列およびヌクレオチド配列が、当技術分野において
開示されている(例えば、WO 95/26196およびVakharia
ら, Avian Diseases 36, 736-742, 1992)。
【0040】さらに、WO 95/26196は、各抗原亜型に特
徴的なIBDV抗原亜型のいくつかのエピトープ決定基のア
ミノ酸配列を開示している。また、WO 95/26196は、中
和モノクローナル抗体のパネルに対する反応性により、
種々のIBDV株の抗原の特徴づけを開示している。そのよ
うな中和モノクローナル抗体に反応性である重要なエピ
トープ決定基は、B69(古典的亜型)、R63および67(変
異体E)および57(GLS)エピトープ決定基である。これ
らのエピトープ決定基のアミノ酸配列を含むVP2タンパ
ク質の領域は、Vakhariaら, Virus Res. 31, 265-273,
1994に記載されている。
【0041】好ましくは、本発明の方法においては、古
典的セグメントAバックボーンと変異体Eエピトープ決定
基67またはGLSエピトープ決定基57をコードするヌクレ
オチド配列とを含む、CEF細胞培養内で複製する能力を
有するキメラIBDV突然変異体を製造する。あるいは、該
キメラIBDV突然変異体は、GLSバックボーンとB69、R63
または67エピトープ決定基をコードするヌクレオチド配
列とを含む。
【0042】特に、本発明の方法は、(i)該VP2遺伝子
が変異体E株のVP2遺伝子により置換されている、および
(ii)253、284および330位のコドンが前記のとおりに
改変されている(実施例1)、株D78(Intervet Intern
ational B.V., the Netherlandsから商業的に入手可
能)に由来するキメラIBDV株(D78/変異体E)の製造を
含む。
【0043】基本的には、第1 IBDVのバックボーンセグ
メントA内に、該エピトープ決定基をコードするヌクレ
オチド配列を導入するための工程は、前記の突然変異を
導入するための工程と実質的に同じである。これは、ゲ
ノムセグメントAおよびBのcDNAを準備し、(i)第1 IBD
Vのエピトープ決定基のコード配列を、第2 IBDVのもの
により置換し、あるいは(ii)部位特異的突然変異誘発
により第1 IBDV内の特定のコドンを改変することによ
り、最も簡便に行われる。そのような方法もまた、WO 9
5/26196に記載されている。最後に、これらのcDNA分子
のRNA転写産物に、該トランスフェクト化宿主細胞内で
複製を開始させて、感染性キメラIBDVを得る。
【0044】本発明のもう1つの実施形態においては、
前記のIBDV突然変異体の製造方法であって、得られるIB
DV突然変異体が、該ウイルスを弱毒化する他の突然変異
をも含むことを特徴とする製造方法を提供する。そのよ
うな突然変異の一例は、天然VP5タンパク質を発現する
能力を有さないIBDV突然変異体を与える、IBDVゲノムの
セグメントAのVP5遺伝子内の突然変異である。IBDV VP5
-突然変異体の製造は欧州特許出願第887,412号に記載さ
れている。
【0045】もう1つの態様においては、本発明は、古
典的または変異体E株のVP2遺伝子内にコドン253(His)
および284(Thr)、そして所望により330(Arg)を、あ
るいはGLS株のコドン284(Thr)を含む、CEF細胞培養内
で複製する能力を有する遺伝的に操作された感染性IBDV
突然変異体を提供する。そのようなIBDV突然変異体は、
遺伝子操作技術により制御的に導入された前記の新たな
コドンを除き、CEF細胞培養内で複製する能力を有さな
い嚢IBDVの遺伝情報を依然として含む。
【0046】特に、318位および325位にそれぞれグリシ
ンおよび/またはバリンを有さない前記の変異体E IBDV
突然変異体を提供する。これらの位置にそれぞれアスパ
ラギン酸および/またはメチオニンを有する遺伝的に操
作された変異体E突然変異体が、最も好ましい。
【0047】好ましい実施形態においては、変異体E株
のVP2遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前
記で特定した3つの新たなコドンを有する、本発明の遺
伝的に操作されたIBDV突然変異体は、キメラIBDV突然変
異体、特に、株D78に由来するキメラIBDV突然変異体で
ある。
【0048】本発明は、インビトロ細胞培養内での複製
に予め不応性であったIBDV株からIBDVワクチンを容易に
製造する可能性を与える。本発明の追加的な利点は、IB
DVが、前記方法により制御的に(さらに)弱毒化されう
ることである。そのような弱毒化IBDV突然変異体は、生
IBDVワクチン内の有効成分として使用することができ
る。
【0049】したがって、本発明のもう1つの態様は、I
BDV感染により生じる疾患に対して家禽を防御するのに
使用するためのワクチンである。該ワクチンは、前記の
とおりに製造された遺伝的に操作されたIBDV突然変異体
と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む。
【0050】該IBDV突然変異体は、生弱毒化または不活
化ウイルスとして該ワクチン内に含有させることができ
る。
【0051】本発明のワクチンは、例えば、商業的に入
手可能な生および不活化IBDVワクチンに一般に用いられ
る方法などの通常の方法により製造することができる。
簡単に説明すると、感受性基質に本発明のIBDV突然変異
体を接種し、所望の感染力価まで該ウイルスが複製され
るまで該基質を増殖させ、ついでIBDV含有物質を収穫す
る。
【0052】本発明のワクチンを製造するために、IBDV
突然変異体の複製を支持しうる各基質を使用することが
でき、それらには、初代(トリ)細胞培養、例えば、ニ
ワトリ胚繊維芽細胞(CEF)またはニワトリ胚肝細胞(C
EL)、哺乳動物細胞系、例えばベロ細胞系またはBGM-70
細胞系、またはトリ細胞系、例えばQT-35、QM-7またはL
MHが含まれる。通常、該細胞の接種後、該ウイルスを3
〜10日間増殖させ、ついで該細胞培養上清を収穫し、所
望により濾過または遠心分離して細胞残渣を除去する。
【0053】あるいは、該IBDV突然変異体を発育鶏卵内
で増殖させる。特に、これらのIBDVを増殖させる基質と
して、SPF発育卵が挙げられる。発育卵に、例えば、少
なくとも102 TCID50/卵を含む懸濁液またはホモジネー
トを含有する0.2mlのIBDV突然変異体を接種し、ついで
該卵を37℃でインキュベートする。約2〜5日後、該胚お
よび/または該膜および/または該尿膜腔液を集め、こ
の物質を適当にホモジナイズすることにより、該IBDウ
イルス産物を収穫することができる。ついで該ホモジネ
ートを2500 x gで10分間遠心分離し、該上清をフィルタ
ー(100μm)で濾過することができる。
【0054】該生ウイルスを含有する本発明のワクチン
は、懸濁液の形態または凍結乾燥形態で製造し販売する
ことができ、そのような組成物に一般に用いられる医薬
上許容される担体または希釈剤を更に含有する。担体に
は、安定化剤、保存剤およびバッファーが含まれる。適
当な安定化剤としては、例えば、SPGA、炭水化物(例え
ば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、
デキストラン、グルタマートまたはグルコース)、タン
パク質(例えば、乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼイ
ン)またはそれらの分解産物が挙げられる。適当なバッ
ファーとしては、例えば、アルカリ金属ホスファターゼ
が挙げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、
メルチオラートおよびゲンタマイシンが挙げられる。希
釈剤には、水、水性バッファー(例えば、緩衝食塩
水)、アルコールおよびポリオール(例えば、グリセロ
ール)が含まれる。
【0055】所望により、本発明の生ワクチンはアジュ
バントを含有しうる。アジュバント活性を有する適当な
化合物および組成物としては、例えば、後記のものと同
様のものが挙げられる。
【0056】本発明の生ワクチンの注射(例えば、筋肉
内、皮下)による投与は可能であるが、該ワクチンは、
好ましくは、IBDVのワクチン接種に一般に用いられる安
価な大量適用技術により投与する。IBDVのワクチン接種
のためのこれらの技術には、飲水および噴霧ワクチン接
種が含まれる。
【0057】該生ワクチンの投与のためのもう1つの方
法には、卵内、点眼および嘴の浸漬による投与が含まれ
る。
【0058】本発明のもう1つの態様においては、不活
化形態のIBDV突然変異体を含むワクチンを提供する。不
活化ワクチンの大きな利点は、得られうる長期持続性の
防御抗体のレベルが高いことである。
【0059】増殖工程後に収穫したウイルスの不活化の
目的は、該ウイルスの再生を排除することである。一般
に、これは、化学的または物理的手段により達成するこ
とができる。化学的不活化は、例えば酵素、ホルムアル
デヒド、β-プロピオラクトン、エチレン-イミンまたは
それらの誘導体で該ウイルスを処理することにより行な
うことができる。必要に応じて、後で該不活化化合物を
中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例え
ば、チオスルファートで中和することができる。物理的
不活化は、好ましくは、該ウイルスを高エネルギー放射
(例えば、UV光またはγ線)に付すことにより行なうこ
とができる。所望により、処理後、該pHを約7の値に調
節することができる。
【0060】該不活化IBDV突然変異体を含有するワクチ
ンは、例えば、この目的に適した前記の医薬上許容され
る担体または希釈剤の1以上を含んでいてもよい。
【0061】好ましくは、本発明の不活化ワクチンは、
アジュバント活性を有する1以上の化合物を含む。この
目的のための適当な化合物または組成物には、水酸化、
リン酸または酸化アルミニウム、例えば鉱油(例えばBa
yol F(登録商標)またはMarcol 52(登録商標))また
は植物油(例えばビタミンEアセタート)に基づく水中
油滴型または油中水滴型エマルション、およびサポニン
が含まれる。
【0062】本発明のワクチンは、有効成分としての該
IBDV突然変異体の有効量(すなわち、ワクチン接種され
た鳥において、ビルレントウイルスによる攻撃に対して
免疫を誘導する免疫性IBDV物質の量)を含む。本発明に
おいては、免疫は、ワクチン接種後の鳥集団において、
非ワクチン接種群と比べて有意に高いレベルの防御を誘
導することと定義される。
【0063】典型的には、本発明の生ワクチンは、102
〜109 TCID50(50%組織培養感染量)/動物の用量、好
ましくは105.0〜107.0 TCID50の用量で投与することが
可能であり、不活化ワクチンは、105〜109 TCID50/動物
の抗原相当量を含有していてもよい。
【0064】不活化ワクチンは、通常、非経口的(例え
ば、筋肉内または皮下)に投与する。
【0065】本発明のIBDVワクチンはニワトリにおいて
有効に使用することができ、他の家禽(例えば、シチメ
ンチョウ、ホロホロチョウおよびウズラ)にも該ワクチ
ンを成功裡に接種することができる。ニワトリには、ブ
ロイラー、繁殖ストックおよび産卵ストックが含まれ
る。
【0066】本発明の生または不活化ワクチンを投与す
る動物の齢は、通常の生または不活化IBDVワクチンを投
与する動物の齢と同じである。例えば、ブロイラー(母
親に由来する抗体MDAを有さないもの)には1日齢でワク
チン接種することが可能であり、一方、高レベルのMDA
を有するブロイラーには、好ましくは、2〜3週齢でワク
チン接種する。低レベルのMDAを有する産卵ストックま
たは繁殖ストックには、1〜10日齢でワクチン接種し、
ついで6〜8週齢および16〜20週齢で不活化ワクチンをブ
ースター接種することができる。
【0067】本発明はまた、前記のIBDV突然変異体と、
それぞれ家禽または魚類に対して感染性である他の病原
体に由来する1以上の免疫原とを含んでなる混合(combi
nation)ワクチンを含む。
【0068】好ましくは、該混合ワクチンは更に、伝染
性気管支炎ウイルス(IBV)、ニューカッスル病ウイル
ス(NDV)、産卵低下症候群(EDS)ウイルスおよびシチ
メンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)のワクチン株の1
以上を含む。
【0069】
【実施例】実施例1 IBDV突然変異体の構築およびCEF細胞培養内でのそ
れらの複製特性 材料および方法IBDVの古典的、変異体EまたはGLS株のVP2の可変領
域を含む(属間)IBDV プラスミドの構築 (i)古典的IBDV株のVP2D78 以下の部位特異的突然変異誘発のための必要条件は、プ
ラスミドpUC18の修飾であった。この目的のために、pUC
18をNdeIおよびBamHIで切断し、電気溶出し、クレノウ
酵素により平滑末端化し、再連結して、pUC18 ΔNde I-
BamH I(pUC18/ΔNB)を得た。プラスミドpAD78/EK(Mu
ndtら, J. Virology 71, 5647-51, 1997)をEcoRIおよ
びKpnIで切断して、T7-RNAポリメラーゼプロモーター部
位を含む血清型I株D78のセグメントAの完全長配列を得
た。この断片を、EcoRIおよびKpnIで切断されたpUC18/
ΔNB中に連結して、pD78A/ΔNBを得た(図1A)。プラ
スミドpD78A/ΔNBを、クローニングおよび部位特異的突
然変異誘発法のためのバックボーンとして使用した。
【0070】UK661 プラスミドpD78-E/DEL(後記を参照されたい)を、株UK
661のセグメントAの配列を含有するキメラプラスミドの
構築のために使用した。ウイルスRNAの沈降後、標準的
な方法に従い、オリゴヌクレオチドUK661AFor1およびUK
661ARev1(BrownおよびSkinner, Virus Res. 40, 1-15,
1996, それぞれヌクレオチド番号621-644-センスおよ
び1201-1223-アンチセンス)を使用することにより、逆
転写およびPCRを行なった。得られたPCR断片を平滑末端
化し、SmaIで切断されたベクターpUC 18(Pharmacia, S
weden)中にクローニングしてp661Apartを得た。配列決
定後、p661Apartを制限酵素NdeIおよびSpeIでそれぞれ
ヌクレオチド647および1182で切断して(番号づけは、
株P2:NCBI受託番号X 84034の完全長配列に基づいてい
る)、株UK661のVP2の可変領域のコード配列を含む535b
pの断片を得た。NdeI-SpeIで切断されたpD78-E/DEL中へ
の連結後、株D78、E/DelおよびUK661のセグメントAの配
列を含有するキメラ完全長プラスミドpD78A-E-661を得
た(図4)。
【0071】(ii)変異体E IBDVのVP2 IBDV特異的配列の置換のためには、変異体E株E/Delの完
全なコード領域を含有するプラスミドを使用した(pEDE
L22BacII, Vakharia, Biotechnology annual review 3,
151-168, 1997)。pEDEL22BacII(図1A)を制限酵素
NdeIおよびSalIでそれぞれヌクレオチド647および1725
(株P2(NCBI受託番号X 84034)の完全長配列に基づ
く)で切断して、VP2の可変領域のコード配列および株E
/DelのVP4の配列を含む1078bpの断片を得た。NdeI-SalI
で切断されたpD78A/ΔNB中への連結後、株D78およびE/D
elのセグメントAの配列を含有するキメラ完全長プラス
ミドpD78A/ΔNB-E/Del(図1)を得た。プラスミドpAD7
8/ΔNBおよびpD78A/ΔNB-E/Delを部位特異的突然変異誘
発に使用した。
【0072】(iii)GLS IBDVのVP2 さらに、それぞれGLS-BおよびGLS-TCの可変領域を含有
する1対のプラスミドを構築した。超可変領域のクロー
ニングのために、GLS-TCをCEF内で増殖させ、超遠心に
より精製した。GLS-Bの嚢ホモジネートを低速遠心によ
り精製し、該上清を以下の操作に使用した。プロテイナ
ーゼK(0.5mg/ml)/ドデシル硫酸ナトリウム(SDS, 0.5
%)での消化の後、ウイルスRNAを精製し、cDNAに逆転写
し、標準的な方法に従いオリゴヌクレオチドA14およびA
44(表4)を使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によ
り増幅した。増幅産物を平滑末端化によりクローニング
し、適当なPCR断片を含有するプラスミドを配列決定し
た。GLS-TC(pGLS-TC)およびGLS-B(pGLS-B)のいずれ
かの各インサートを含有するプラスミドを以下の実験に
使用した。属間セグメントAの構築には、完全長クロー
ンpD78A/ΔNB-E/Delを使用した。pGLS-TCおよびpGLS-B
をそれぞれSacIおよびSpeIで消化した。ついで、電気溶
出された断片を、予めSacI-SpeIで消化されたpD78A/ΔN
B-E/Del中に連結して、それぞれpD78A/ΔNB-E/Del-GLS-
TCおよびpD78A/ΔNB-E/Del-GLS-Bを得た。両方のプラス
ミドのプラスミド地図を図1Bに示す。
【0073】部位特異的突然変異誘発 PCRにより部位特異的突然変異誘発を行なった。オリゴ
ヌクレオチドは、アミノ酸の置換をもたらす突然変異お
よび追加的な制限酵素切断部位を含有していた(表
4)。それぞれpD78A/ΔNB、pD78A/ΔNB-E/DelおよびpD
78A-E-661を使用するPCR増幅の後、断片を平滑末端化に
よりクローニングし、配列決定した(pfrag)。突然変
異したコドンを含有するクローンを、以下のとおり予め
切断されたプラスミド中に連結した。
【0074】(i)変異体E IBDV 突然変異したコドンを含有するプラスミドpD78A/ΔNB-E
/DelのセグメントAの完全長クローンの樹立のために、
以下のPCR断片を得た:プライマーE/Del-MutQHおよびA1
4(pfragQH)、E/Del-MutATおよびA14(pfrag AT)、E/
Del-MutSRおよびP21F(pfragSR)を使用して、E-Del配
列の適当な単一アミノ酸置換(それぞれQ253H、A284Tお
よびS330R)を有する断片を得た。PfragQHおよびpfragS
RをScaIおよびSpeIで切断し、予めSacI-SpeIで消化され
たpD78A/ΔNB-E/Del中に連結して、それぞれpD78A/ΔNB
-E/DelQH(図1)およびpD78A/ΔNB-E/DelSR(図1C)
を得た。pD78A/ΔNB-E/DelAT(図1C)を構築するため
に、pfragATをNarI-SpeIで切断し、ついで、予め切断さ
れたpD78A/ΔNB-E/Del中に連結した。2個の突然変異コ
ドンを含有するプラスミドを得るために、以下のPCRを
行なった。プライマーE/Del-MutQHおよびE/Del-MutSR、
ならびにE/Del-MutATおよびE/Del-MutSRを、pD78A/ΔNB
-E/Del上のそれぞれfragQH-SRおよびfragAT-SRの増幅に
使用した。クローニングおよび配列決定の後、pfragQH-
SRをScaI-SpeIで消化し、ついで、予め切断されたpD78A
/ΔNB-E/Del中に連結して、pD78A/ΔNB-E/DelQH-SR(図
1D)を得た。pD78A/ΔNB-E/DelAT-SR(図1D)の構
築のために、プラスミドpfragAT-SRをNarIおよびSpeIで
消化し、同じように切断されたpD78A/ΔNB-E/Del中に連
結した。2個のアミノ酸置換(Q253H; A284T)のための
突然変異コドンを含有するプラスミドの構築のために、
プラスミドpD78A/ΔNB-E/DelATおよびプライマーE/Del-
MutQH; A14を使用してPCRを行なった。得られたプラス
ミドpfragQH-ATをSacI-SpeIで切断し、pD78A/ΔNB-E/De
l中に連結して、pD78A/ΔNB-E/DelQH-AT(図1D)を得
た。全3個のアミノ酸置換(Q253H、A284TおよびS330R)
のための突然変異コドンを含有するプラスミドのクロー
ニングのために、プライマーE/Del-MutQHおよびE/Del-M
utSRを、pD78A/ΔNB-E/Del-AT上でのfrag QH-AT-SRの増
幅のために使用した。pfrag QH-AT-SRをSacIおよびSpeI
で切断した後、溶出した断片を、SacIおよびSpeIで切断
されたpD78A/ΔNB-E/Del中に連結して、pD78A/ΔNB-E/D
el-AT-SR(図1E)を得た。
【0075】(ii)古典的IBDVD78 突然変異コドンを含有するプラスミドpD78A/ΔNBのセグ
メントAの完全長クローンの樹立のために、pD78A/ΔNB
のNdeI-HindIII断片を、予めNdeI-HindIIIで切断された
pUC19中にサブクローニングして、以下の操作のための
単一の制限酵素部位(pUC19/NH-D78A)を得た。オリゴ
ヌクレオチドD78-MutHQおよびA14(pfragHQ)、D78-Mut
TAおよびA14(pfragTA)、D78-MutRSおよびP21F(pfrag
RS)をPCR増幅に使用して、D78配列の適当な単一のアミ
ノ酸置換(それぞれH253Q、T284AおよびR330S)を有す
る断片を得た。断片pfragHQをSacIおよびStyIで切断
し、pfragTAをNarIおよびStyIで切断し、pfragRSをSacI
およびStyIで切断し、適当に切断されたpUC19/NH-D78A
中に再連結した。該突然変異コドンを含有するプラスミ
ドpUC19/NH-D78AをNdeIおよびSacIIで切断し、適当な断
片を電気溶出し、予めNdeIおよびSacIIで切断されたpD7
8/ΔNB中に連結して、それぞれpD78A/ΔNB-HQ、pD78A/
ΔNB-TAおよびpD78A/ΔNB-RSを得た。全3個のアミノ酸
(H253Q、A284T、R330S)の置換につながるヌクレオチ
ド置換を含有する完全長クローンの構築のために、オリ
ゴヌクレオチドD78-MutHQ、D78-MutRSおよびプラスミド
pD78/ΔNB-TAを使用するPCRを行なった。得られたPCR断
片を平滑末端化によりクローニングして、pfragHQ-TA-R
Sを得た。pfragHQ-TA-RSをSacIおよびStyIで切断した
後、電気溶出した断片を、SacIおよびStyIで切断された
pUC19/NH-D78A中にクローニングした。得られたプラス
ミドをNdeIおよびSacIIで切断し、適当な断片を電気溶
出し、最後に、予めNdeIおよびSacIIで切断されたpD78A
/ΔNB中に連結して、pD78A/ΔNB-HQ-TA-RSを得た。得ら
れた突然変異プラスミドのヌクレオチド配列を配列決定
により確認した。配列は、Wisconsin Package, バージ
ョン8(Genetics Computer, Madison, Wis.)で分析し
た。プラスミドpD78A/ΔNB-HQ、pD78A/ΔNB-TA、pD78A/
ΔNB-RSおよびpD78A/ΔNB-HQ-TA-RSを図2に示す。
【0076】UK661 部位特異的突然変異誘発のために、プラスミドpD78A-E-
UK661をEcoRI/KpnIで切断し、ついでセグメントAを含有
する断片の完全長配列を、EcoRI/KpnIで切断されたプラ
スミドベクターpBS-(Stratagene)中に連結した。得ら
れたプラスミドpBSD78A-E-661を、既に記載されている
方法(Kunkelら, Methods Enzymol. 154, 367-382, 198
7)に従い部位特異的突然変異誘発実験で使用した。Lim
ら(1999 前掲)の結果に基づき、アンチセンス配向オ
リゴヌクレオチドMut 1(BrownおよびSkinner前掲; ヌ
クレオチド番号947-1001, 946-966はAAC、および979-98
1はACGであり、アミノ酸置換D279NおよびA284Tを引き起
こす)を使用してプラスミドpBSD78A-E-661のアミノ酸2
79および284のヌクレオチド配列を置換(D279N, A284
T)した。得られたプラスミドpBSD78A-E-661-DN-ATの適
当な部分を配列決定した。pBSD78A-E-661-DN-ATをNdeI/
SpeIで切断した後、535bpの断片を、適当に切断されたp
D78A- E-661中に連結して、pD78A- E-661-DN-ATを得
た。
【0077】さらに、アンチセンス配向オリゴヌクレオ
チドMut 2(BrownおよびSkinner,前掲; ヌクレオチド番
号874-900、886-888は、アミノ酸置換O253Hを与えるCAT
である)を使用して、アミノ酸Q253のヌクレオチド配列
を、H253をコードするヌクレオチド配列に置換した。得
られたプラスミドpD78A- E-661-QHは、アミノ酸置換Q25
3Hを含有していた。アンチセンス配向オリゴヌクレオチ
ドMut 3(Brownら,前掲; ヌクレオチド番号966-993、97
9-981は、アミノ酸置換A284Tを与えるACCである)を使
用することにより、アミノ酸284の置換(A284T)を行な
って、プラスミドpD78A-E-661-ATを得た。第4のプラス
ミドであるpD78A-E-661-QH-ATは、1つの部位特異的突然
変異誘発反応において両方のオリゴヌクレオチド(Mut
2, Mut3)を使用することによる両アミノ酸(Q253Hおよ
びA284T)の置換を含有していた。プラスミドp661Apar
t、pD78A-E-661、pD78A-E-661-DN-AT、pD78A-E-661-Q
H、pD78A-E-661-ATおよびpD78A-E-661-QH-ATを図4に示
す。
【0078】
【表5】 a 部位特異的突然変異誘発およびクローニングに使用す
るオリゴヌクレオチドプライマーの組成および位置。用
いる制限部位には下線が付されており、適当な制限酵素
が表示されている。突然変異誘発で変更されたヌクレオ
チドは小文字で示されており、コードヌクレオチドトリ
プレットは太字で示されている。該位置は、プライマー
結合(ヌクレオチド番号)であり、アミノ酸の番号づけ
は、P2株の公開されている配列(MundtおよびMuller, 1
995, 前掲; NCBI受託番号 X84034)に基づいている。
【0079】セグメントBの完全長cDNAクローンの構築 株D78 血清型I株D78のセグメントBの完全長cDNAのクローニン
グのために、ウイルスをCEF内で増殖させ、超遠心によ
り精製した。株D78のゲノムウイルスRNAを精製し、cDNA
に逆転写し、標準的な方法に従い、記載されているオリ
ゴヌクレオチド(MundtおよびVakharia, 1996)を使用
してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。増
幅産物を平滑末端化によりクローニングし、適当なPCR
断片を含有するプラスミドを配列決定した。T7-RNAポリ
メラーゼプロモーターの制御下でセグメントBの完全長c
DNAを含有するプラスミド(pUC18BD78)を得るためのク
ローニング法は、株P2のセグメントBに関してMundtおよ
びVakharia(1996 前掲)により記載されている方法に
対応するものであった(図3)。
【0080】株UK661 BrownおよびSkinner(1996, 前掲)に記載の配列情報か
ら導き出した以下の3対のオリゴヌクレオチドを使用し
た。i)UK661BFor1(オリゴヌクレオチド配列B5’-P2
(MundtおよびVakharia, 1996 前掲)に基づく配列)、
アンチセンス配向のUK661BRev1(ヌクレオチド番号708-
736)。オリゴヌクレオチドUK661BRev1の5’末端は、株
UK-661のセグメントBの配列に加え、9ヌクレオチド配列
5’-CTCTAGAGGを含有する制限酵素切断部位XbaIを含有
する。ii)UK661BFor2(ヌクレオチド番号751-677)、
アンチセンス配向のUK661Rev2(ヌクレオチド番号2089-
2113)。オリゴヌクレオチドUK661BRev2の5’末端は、
株UK-661のセグメントBの配列に加え、9ヌクレオチド配
列5’-CTCTAGAGGを含有する制限酵素切断部位XbaIを含
有する。iii)UK661BFor3(ヌクレオチド番号2011-203
5)、アンチセンス配向のUK661Rev3(MundtおよびMulle
r, 1995, 前掲, ヌクレオチド番号2804-2827)。オリゴ
ヌクレオチドUK661BRev3の5’末端は、株UK-661のセグ
メントBの配列に加え、9ヌクレオチド配列5’-TCTAGAGC
CCを含有する制限酵素切断部位XbaIを含有する。この場
合、トリプレットCCCは、セグメントBのウイルスゲノム
配列の最後の3ヌクレオチド(ヌクレオチド番号2825-28
27)と共にSmaI切断部位を生成した。RT-PCR中にこれら
の3対のオリゴヌクレオチドUK661BFor1;UK661BRev1、UK
661BFor2;UK661BRev2およびUK661BFor3;UK661BRev3を使
用することにより、3個のcDNA断片を増幅し、SmaIで切
断されたベクターpUC18中に平滑末端化によりクローニ
ングして、それぞれpUK661B1、pUK661B2およびpUK661B3
を得た。それらの3個の挿入断片の配列決定後、pUK661B
2をAgeIおよびXbaIで切断して、1441bpの断片を得、つ
いでそれを、AgeI/XbaIで切断されたpUK661B1中に連結
して、pUK661B12を得た。セグメントBの完全長cDNAクロ
ーンの構築のために、pUK661B3をBstBI/XbaIで切断し、
得られた694bpの断片を、BstBI/XbaIで切断されたpUK66
1B12中に連結した。得られたプラスミドpB661は、T7プ
ロモーターの制御下で株UK661のセグメントBの完全長cD
NA配列を含有していた。pB661を図5に示す(番号づけ
は、MundtおよびMuller, 1995, 前掲に記載のP2株の配
列に基づく)。
【0081】組織培養内のcRNAからのウイルスの回収 RNAのインビトロ転写のために、プラスミドpAD78/ΔN
B、pAD78/ΔNB-HQ、pAD78/ΔNB-TA、pAD78/ΔNB-RS、pA
D78/ΔNB-HQ-TA-RS、pD78/ΔNB-E/Del、pD78A/ΔNB-E/D
el-QH、pD78A/ΔNB-E/Del-AT、pD78A/ΔNB-E/Del-SR、p
D78A/ΔNB-E/Del-QH-AT、pAD78A/ΔNB-E/Del-AT-SR、pD
78A/ΔNB-E/Del-QH-SR、pAD78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SRお
よびpD78Bを、BsrGIまたはPstIで切断することにより線
状化した。線状化DNAの更なる処理および転写は、i)該
転写混合物をフェノール/クロロホルム精製に付さなか
ったこと及びii)QM-7細胞をトランスフェクション実験
に使用したことの2点を除き、MundtおよびVakharia (19
96)に記載のとおりに行なった。トランスフェクション
の2日後、細胞を凍結/融解し、700 x gで遠心分離して
細胞残渣を除去し、得られた上清を0.45μmフィルター
で更に清澄化し、-70℃で保存した。免疫蛍光研究のた
めに、QM-7細胞を無菌カバーグラス上で増殖させた。RN
Aのインビトロ転写のために、UK661のセグメントAを含
有するプラスミド(図5)を、BsrGIで切断することに
より線状化した。株D78のセグメントBはPstIで線状化
し、一方、株UK661のセグメントBはSmaIで線状化した。
線状化DNAの更なる処理および転写を前記のとおりに行
なった。
【0082】IBDV抗原の検出 IBDV抗原を、ウサギ抗IBDV抗血清を使用する間接免疫蛍
光アッセイ(IFA)およびウエスタンブロット法により
検出した。IFAの場合には、カバーグラス上で増殖させ
たCEFを、継代のために使用したそれぞれトランスフェ
クト化QM-7、CEFおよびCAMの上清と共にインキュベート
した。16時間のインキュベーション時間の後、CEFをア
セトンで固定し、IFAのために加工した。トランスフェ
クション後のIBDVの複製を調べるために、カバーガラス
上で増殖させたQM-7細胞を24時間または48時間インキュ
ベートし、アセトンで固定し、IFAのために加工した。
【0083】結果属間cRNAでのトランスフェクション実験 トランスフェクション実験のために、株D78のセグメン
トAの完全長cDNAクローン(pD78A/ΔNB)および属間セ
グメントA pD78A/ΔNB-E/Delを合成cRNAへ転写させ、セ
グメントB(pD78B)の完全長cRNAと共にQM-7細胞内およ
びCEF内に同時にコトランスフェクトした。トランスフ
ェクションの2日後、細胞を凍結/融解し、得られた上
清をCEF上で2回継代した。CEFを、各継代において感染
後5日間までインキュベートした。凍結/融解後、各ト
ランスフェクションの各トランスフェクション上清およ
び各継代を、CEFを使用するIFAにより、IBDV抗原に関し
て試験した。トランスフェクション実験を3回繰返し
た。株D78rの生成をもたらすpAD78/ΔNBおよびプラスミ
ドpD78BからのcRNAのトランスフェクション後、ウイル
スを得た。これに対して、pD78/ΔNB-E/DelおよびpD78B
からのcRNAを使用するトランスフェクション実験の後で
は、ウイルスに感染した組織培養を全く単離することが
できなかった。トランスフェクションの後に複製が生じ
たか否かを分析するために、カバーガラス上で増殖中の
QM-7細胞を使用してトランスフェクションを行なった。
ここではどちらの場合においても、トランスフェクショ
ンの24時間後にIFAでウイルス抗原が検出された。この
ように、本発明者らは、どちらの場合にもウイルスの複
製が生じるが、D78rの場合のみにおいて、組織培養に感
染したIBDVを得るのが可能であることを確認した。
【0084】突然変異cRNAでのトランスフェクション実
配列の比較の結果に基づいて、多数の異なる突然変異完
全長cDNAクローンを部位特異的突然変異誘発により樹立
した。
【0085】(i)変異体E IBDV 可能なすべての7つの組合せにおいて253、284および330
位にアミノ酸(aa)の置換を含有するpD78A/ΔNB-E/Del
の突然変異プラスミドを作製した(表5)。トランスフ
ェクション実験および継代を、CEFおよびQM-7細胞上で
同時に3回行なった。得られた上清を、IFAにより感染性
に関して分析した。プラスミドpD78A/ΔNB-E/Del、pD78
A/ΔNB-E/Del-QH、pD78A/ΔNB-E/Del-AT、pD78A/ΔNB-E
/Del-SR、pD78A/ΔNB-E/Del-AT-SRおよびpD78A/ΔNB-E/
Del-QH-SRのcRNAをpD78BのcRNAと共にトランスフェクト
した後は、QM-7細胞またはCEF感染ウイルスを単離する
ことができなかった。pD78A/ΔNB-E/Del-QH-ATまたはpD
78A/ΔNB-E/Del-QH-AT-SRから得たcRNAのトランスフェ
クションは、感染性ウイルス(D78A-E/Del-QH-ATおよび
D78A-E/Del-QH-AT-SR)の生成を引き起こした。CEFおよ
びQM-7細胞上でのIFAにより特異性が確認された。これ
は、IBDVのVP2が、組織培養への感染において決定的に
重要な役割を果たしていることを示している。アミノ酸
置換(BU)Q-253-H(TC)および(BU)A-284-T(TC)
は、使用した組織培養に対して感染性のIBDVを得るため
に必要かつ十分であった。3個のアミノ酸置換を有するI
BDV突然変異体(D78/変異体E CEF適応)を、さらなる検
査に使用した(実施例2)。
【0086】(ii)古典的IBDVD78 これらの結果を確認するために、部位特異的突然変異誘
発のためにpAD78/ΔNBを使用してもう1組のプラスミド
を構築して、単一のアミノ酸(pAD78/ΔNB-HQ、pAD78/
ΔNB-TA、pAD78/ΔNB-RS)または全3個のアミノ酸(pAD
78/ΔNB-HQ-TA-RS)の置換プラスミドを得た。これらの
4個のプラスミドをpD78Bと共に、前記のとおりにトラン
スフェクション実験に使用した。pAD78/ΔNB-RSからのc
RNAのトランスフェクションの後、感染性IBDVの生成をI
FAにより検出することができた。この場合もまた、アミ
ノ酸330は、組織培養への生成ウイルスの感染能に何ら
影響を及ぼさなかった。
【0087】トランスフェクション後、IFAにより全て
の構築物を複製に関して試験した。トランスフェクショ
ンの特に24時間および48時間後にIBDV抗原を検出するこ
とができた。これは、濃く染色された典型的な細胞質内
集合体を示している。
【0088】UK661 トランスフェクション実験のために、キメラセグメント
A pD78A-E-661、pD78A-E-661-DN-AT、pD78A-E-661-QH、
pD78A-E-661-ATおよびpD78A-E-661-QH-ATの完全長cDNA
クローンを合成cRNAに転写し、株D78のセグメントBまた
は株UK661のセグメントBの完全長cRNAと共にQM-7細胞内
およびCEC内に同時にコトランスフェクトした。トラン
スフェクションの2日後、細胞を凍結/融解し、得られ
た上清をCEC上で1回継代した。CECを、感染後24または4
8時間インキュベートし、固定し、免疫蛍光法のために
加工した。キメラIBDV D78A-E-661-QH-ATを与えるpD78B
およびpB661の両方とプラスミドpD78A-E-661-QH-ATとか
らのcRNAのトランスフェクションの後、CECに対して感
染性のウイルスを得た。これに対して、pBD78またはpB6
61のいずれかからのcRNAと共にpD78A-E-661、pD78A-E-6
61-DN-AT、pD78A-E-661-QH、pD78A-E-661-ATからのcRNA
を使用するトランスフェクションの後では、組織培養に
感染したウイルスは単離することができなかった。D78-
E-661-DN-ATの場合には、感染の72時間後、該トランス
フェクション上清のインキュベーションに際して単一の
感染CEFが検出可能である。
【0089】(iii)GLS IBDV 属間および突然変異プラスミドを使用するトランスフェ
クション実験の結果を確認するために、本発明者らは、
天然に存在する1対のIBDV株を利用した。嚢由来のGLS株
(GLS-B)のVP2の可変領域および組織培養適応変異体GL
S-TCを増幅し、クローニングし、分析した。それぞれpG
LS-BおよびpGLS-TCから得た2つのGLS株のアミノ酸配列
の比較は、284位における1つのアミノ酸の両配列間での
置換 [(GLS-B)A→T(GLS-TC)]を示した(図1B)。アミ
ノ酸253(Q)および330(S)は、前記のとおりBU群のア
ミノ酸と同一であった。感染性ウイルスの生成のために
は284位における置換(A→T)で十分であるか否かを分
析するために、それらの両方のGLS変異体のVP2の超可変
領域を含有する2つのプラスミド(pD78A/ΔNB-E/Del-GL
S-TCおよびpD78A/ΔNB-E/Del-GLS-B)を構築した。それ
ぞれpD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TCおよびpD78A/ΔNB-E/Del-
GLS-BのcRNAを、pD78BのcRNAと共にQM-7細胞内およびCE
F内に同時にトランスフェクトした。組織培養内の上清
の継代後、IFAによる感染性ウイルスの検出が、また、p
D78A/ΔNB-E/Del-GLS-TCのcRNAのトランスフェクション
後、CPEの検出が可能であった。何回かの試みにおい
て、pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-BからのcRNAのトランスフェ
クションは、組織培養に感染性のIBDVを含有する上清を
産生しなかった。pD78A/ΔNB-E/Del-GLS-TCおよびpD78A
/ΔNB-E/Del-GLSBの両プラスミドのインビトロ転写/翻
訳は、該ポリタンパク質の完全なプロセシングを示し
た。両プラスミドのcRNAをpD78BからのcRNAと共にトラ
ンスフェクションした後、ウイルス抗原がIFAにより検
出された。したがって、両方のキメラ体は複製適合性で
あることが判明した。この場合を総合すると、284位に
おける単一のアミノ酸置換につながるVP2の超可変領域
の置換は、感染性属間IBDVの生成に十分なものであっ
た。
【0090】
【表6】 a プラスミドは、組織培養適応血清型I株D78のセグメン
トAの完全長cDNAクローンに基づく。嚢由来血清型I株GL
S-BU、Delaware E(E/Del)および組織培養適応血清型I
株GLS-TCの配列をD78配列で置換した。b P2株の公開されている配列(MundtおよびMuller, 199
5, 前掲; NCBI受託番号X84034)に基づくアミノ酸(a
a)の番号づけ。天然に存在するアミノ酸はイタリック
で表示されており、変化したアミノ酸は太字で表示され
ている。c トランスフェクション実験にはニワトリ胚細胞(CE
F)およびQM-7細胞を使用した。トランスフェクション
の24時間後、ウサギ抗IBDV血清(Mundtら, 1995)を使
用する間接免疫蛍光法によりIBDV抗原が検出された。抗
原陽性(+)、抗原陰性(-)。d トランスフェクション上清の継代にはCEFを使用し
た。CEF上への継代後、ウサギ抗IBDV血清(Mundtら, 19
95, 前掲)を使用する間接免疫蛍光法によりIBDV抗原が
検出された。抗原陽性(+)、抗原陰性(-)。
【0091】実施例2 CEF適応変異体E IBDV突然変異体の生物学的特
性 材料および方法IBDVワクチンの製造 キメラD78/変異体E(嚢適応) 9〜12日齢のSPF卵に、滴下(dropped)漿尿膜(CAM)経
路によりキメラD78/変異体ED(Q253H、A284TおよびS330
Rにおける3つのアミノ酸置換を有さないD78/変異体E/D7
8)を感染させた。感染の5日後、該CAMおよび胚を集
め、ホモジナイズした。該ホモジネートをCAM上で力価
測定した。該上清を希釈して、点眼経路による適用のた
めの102.0EID50/動物のワクチン用量を得た。
【0092】キメラD78/変異体E(CEF適応体) 初代ニワトリ胚繊維芽(CEF)細胞を2×106/mlの最終濃
度で調製した。該細胞を、5%ウシ胎仔血清を含有する
イーグルの最小必須培地内で培養した。この細胞懸濁液
15mlに、1ml中に溶解されたIBDV(Q253H、A284TおよびS
330Rにおける3つのアミノ酸置換を有するD78/変異体E/D
78)ウイルス0.1mlを加えた。高加湿インキュベーター
内で37℃で3〜6日間のインキュベーションの後、該上清
を希釈して、点眼または筋肉内注射による適用のための
それぞれ105.3または103.5TCID50/動物のワクチン用量
を得た。
【0093】商業的に入手可能な古典的IBDVワクチンNo
bilis株D78 該ワクチンを希釈して、点眼経路による適用のための10
3.3TCID50/動物のワクチン用量を得た。
【0094】パネル試験によるIBDVワクチンの同定 両IBDV株を、(Van Loon, A.A.W.M., D. Luttickenおよ
びD.B. Snyder. RapidQuantification of infectious b
ursal disease (IBD) challenge, field or vaccine vi
rus strains. International symposium on infectious
bursal disease and chicken infetious anemia, Raui
schhilzhausen, Germany, 179-187, 1994)に従い、異
なるモノクローナル抗体を使用するELISAにより同定し
た。
【0095】CEF上での増殖 両IBDV株を使用してCEFに感染させた。IBDVに関する特
異的CPE(細胞変性効果)の誘導を、6日間顕微鏡検査し
た。
【0096】ワクチン接種 ワクチン接種の14日後、攻撃ウイルス(ビルレントIBDV
株変異体E)の投与から得られる攻撃に対する抵抗性の
測定により、種々のワクチンの効果を評価する。キメラ
ワクチンD78/変異体E(嚢適応体)(102.0EID50/動物)
を、2週齢の時点で点眼経路で適用した。キメラワクチ
ンD78/変異体E(CEF適応体)(105.5または103.5TCID50
/動物)を、2週齢の時点でそれぞれ点眼経路または筋肉
内注射により適用した。商業的に入手可能な古典的ワク
チンNobilis株D78(Intervet International B.V., the
Netherlands)(103.3TCID50/動物)を、2週齢の時点
で点眼経路により適用した。ワクチン接種の3、7、10お
よび13日後ならびに攻撃の3日後、5匹/群におけるファ
ブリキウス嚢内のIBDVおよび該嚢内の顕微鏡的病変の存
在を調べた。攻撃に対する防御が確認された。
【0097】結果パネル試験によるIBDVワクチンの同定 表6に示されるとおり、キメラD78/変異体E(嚢適応
体)およびキメラD78/変異体E(CEF適応体)は、異なる
MCAに対して同一の反応パターンを有する。このこと
は、3アミノ酸の変化が、種々のMCAによる測定におい
て、該ウイルス上に存在するエピトープに何ら影響を及
ぼさないことを意味する。古典的な市販ワクチンは、異
なるMCAに対して異なる反応パターンを有する。
【0098】
【表7】
【0099】CEF上での増殖 表7に示されるとおり、キメラD78/変異体E(嚢)はCEF
上で増殖する能力を有していない。キメラD78/変異体E
および古典的な市販ワクチンNobilis株D78は共にCEF上
で複製する能力を有し、CPEを誘導しうる。
【0100】
【表8】
【0101】ワクチン接種の3、7、10および13日後なら
びに攻撃の3および10日後の嚢における平均顕微鏡的病
変指数 結果を表8に示す。表8に示されるとおり、非CEF適応株
キメラD78/変異体E(嚢)はビルレントであり、ワクチ
ン接種の7日後には既に完全なリンパ球喪失を誘発す
る。これに対して、組織培養適応株D78/変異体E(CEF)
はワクチン接種後に病変を誘発しない。該市販ワクチン
は軽度ないしは中等度の病変を誘発する。個々のデータ
は、キメラD78/変異体E(嚢)またはD78でワクチン接種
された動物が攻撃に対して防御されたことを示してい
る。眼または筋肉内経路によりD78/変異体Eでワクチン
接種された動物も、ビルレントな親株による誘導より弱
かったものの攻撃の3日後に防御を示した。
【0102】
【表9】
【図面の簡単な説明】
【図1A】pEDEL22BacII、pD78A/ΔNBおよびpD78A/ΔNB
-E/DELの線状プラスミド地図を示す。
【図1B】pD78A/ΔNB-E/DEL-GLS-BおよびpD78A/ΔNB-E
/DEL-GLS-TCの線状プラスミド地図を示す。
【図1C】pD78A/ΔNB-E/DEL、pD78A/ΔNB-E/DEL-QH、p
D78A/ΔNB-E/DEL-ATおよびpD78A/ΔNB-E/DEL-SRの線状
プラスミド地図を示す。
【図1D】pD78A/ΔNB-E/DEL、pD78A/ΔNB-E/DEL-QH-A
T、pD78A/ΔNB-E/DEL-AT-SRおよびpD78A/ΔNB-E/DEL-QH
-SRの線状プラスミド地図を示す。
【図1E】pD78A/ΔNB-E/DELおよびpD78A/ΔNB-E/DEL-Q
H-AT-SRの線状プラスミド地図を示す。
【図2】pD78A/ΔNB、pD78A/ΔNB-QH、pD78A/ΔNB-TA、
pD78A/ΔNB-RSおよびpD78A/ΔNB-QH-TA-SRの線状プラス
ミド地図を示す。
【図3】pUC18BD78の線状プラスミド地図を示す。
【図4】pD78A-E/DEL、p661Apart、pD78A-E-661、pD78A
-E-661-DN-AT、pD78A-E-661-QH、pD78A-E-661-E-ATおよ
びpD78A-E-661-QH-ATの線状プラスミド地図を示す。
【図5】pUK661B1、pUK661B2、pUK661B3およびpB661の
線状プラスミド地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 15/01 C12P 21/02 C // C07K 14/08 C12N 5/00 B C12P 21/02 15/00 E

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (i)CEF細胞培養内で複製する能力を有
    さないIBDVのゲノムセグメントAおよびBのcDNAを含むDN
    A構築物を別々に調製し、 (ii)該セグメントAを含むcDNA上の、 (a)変異体Eまたは古典的IBDV株のVP2遺伝子のアミノ
    酸残基253および284の1以上のコドン内または(b)GLS
    IBDV株のVP2遺伝子のアミノ酸残基284のコドン内に突然
    変異を導入して、変異体Eまたは古典的IBDV株の場合に
    は、該突然変異VP2遺伝子のアミノ酸残基253および284
    のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基を
    コードするようにし、あるいはGLS IBDV株の場合には、
    該突然変異VP2遺伝子のアミノ酸残基284のコドンがトレ
    オニン残基をコードするようにし、 (iii)該セグメントAと該セグメントBとを含むcDNAのR
    NA転写産物に、培地内の宿主細胞内で該IBDV突然変異体
    の複製を開始させ、 (iv)該培養から該IBDV突然変異体を単離する工程を含
    んでなる、CEF細胞培養内で複製する能力を有する感染
    性IBDV突然変異体の製造方法。
  2. 【請求項2】 CEF細胞培養に適応したIBDV突然変異体
    が、セリン、アルギニンまたはリシン、好ましくはアル
    ギニンアミノ酸残基を該VP2タンパク質の330位に含む、
    請求項1に記載の製造方法。
  3. 【請求項3】 古典的または変異体E IBDVのVP2遺伝子
    のコドン253、284および330のすべてに突然変異を導入
    する、請求項1または2に記載の製造方法。
  4. 【請求項4】 コドン253(Gln)、284(Ala)および33
    0(Ser)内に該突然変異を導入する、請求項3に記載の
    製造方法。
  5. 【請求項5】 該突然変異セグメントAと該セグメントB
    とを含むcDNAから合成RNA転写産物を調製し、該合成RNA
    転写産物を宿主細胞にトランスフェクトする、請求項1
    〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
  6. 【請求項6】 キメラIBDVを調製する追加的な工程を含
    む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
  7. 【請求項7】 古典的または変異体E IBDVのVP2遺伝子
    内にアミノ酸253(His)および284(Thr)、そして所望
    により330(Arg)のコドンを、あるいはGLS IBDVのVP2
    遺伝子内にアミノ酸284(Thr)のコドンを含んでなる、
    CEF細胞培養内で複製する能力を有する遺伝的に操作さ
    れた感染性IBDV突然変異体。
  8. 【請求項8】 キメラIBDV突然変異体である、請求項7
    に記載の遺伝的に操作された感染性IBDV突然変異体。
  9. 【請求項9】 該突然変異体がD78/変異体E(CEF適応
    体)である、請求項7に記載の遺伝的に操作された感染
    性IBDV突然変異体。
  10. 【請求項10】 前記請求項のいずれか1項に記載のと
    おりに製造された遺伝的に操作されたIBDV突然変異体
    と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含んでな
    る、IBDV感染により生じる疾患に対して家禽を防御する
    のに使用するためのワクチン。
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