JP2001501082A

JP2001501082A - 合成ｒｎａ転写物からのビルナウイルスの生成方法

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Publication number: JP2001501082A
Application number: JP10512643A
Authority: JP
Inventors: ヴァクハリア，ヴィクラム，エヌ．; ムント，エグバート
Original assignee: ユニバーシティオブメリーランド―バイオテクノロジーインスティテュート
Priority date: 1996-09-05
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2001-01-30
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: EP0959901A1; NO991074L; AU741055B2; EP1930026B1; CA2264488A1; DE69739805D1; AU3891897A; EP0959901A4; CZ299417B6; IL128804A0; ATE460178T1; HUP9904365A2; EP1930026A1; PL332184A1; WO1998009646A1; US5871744A; NZ334667A; BR9712012A; NO991074D0; CA2264488C

Abstract

(57)【要約】クローン化ＤＮＡ由来の合成転写物を用いて、ビルナウイルス科ファミリーのセグメント化二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルスである、感染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）のような活性ビルナウイルスの生成のための系が開発された。ＩＢＤＶのＲＮＡセグメントＡとＢの全コード及び非コード領域をそれぞれ含有する別々の全長ｃＤＮＡクローンが構築された。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた直鎖プラスミドのインビトロ（in vitro）での転写により、両セグメントの合成ＲＮＡが生成された。両セグメントの（＋）センス転写物結合ベロ細胞のトランスフェクションは、感染性ウイルスをトランスフェクション後３６時間という早い時期に生成した。ｄｓＲＮＡウイルスに関する逆方向遺伝系の開発は、ウイルス遺伝子発現の調節、病原論、並びに新世代の生ワクチン及び不活化ワクチンの設計についての研究を大いに促進する。

Description

【発明の詳細な説明】合成ＲＮＡ転写物からのビルナウイルスの生成方法発明の背景ビルナウイルス(Birnaviridae)科ファミリーである感染性嚢疾患ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｄｅａｓｅｖｉｒｕｓ；ＩＢＤＶ）は、若いニワトリにおける高免疫抑制疾患の原因因子である（Kibenge，F.S.B. ，et al.，J．Gen．Virol.，69，1757-1775（1988））。感染性嚢疾患（ＩＢＤ）又はガンボロ病は、ファブリキウス嚢中のリンパ濾胞の破壊を特徴とする。３〜６週齢の十分に感染しやすいニワトリの群れにおいて、臨床的疾患は重度の免疫抑制を引き起し、成長障害、食餌効率の低減及び死亡による損失に関与する。３週齢未満の感染しやすいニワトリは、外面上疾患の臨床的徴候を示さないが、しかし嚢の全体的病変を特徴とする顕著な感染が認められる。疾患の症状に関連したウイルスは、感染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）と呼ばれる。ＩＢＤＶは、国内及び世界的家禽産業に大きな経済的重要性を有する病原体である。それはファブリキウス嚢内の抗体産生Ｂ細胞の前駆体の破壊により、若いニワトリに重篤な免疫不全を引き起こす。免疫抑制は、他の疾患に対する易罹患性を増大し、ニューカッスル病、マレック病及び感染性気管支炎疾患ウイルスに対する有効なワクチン接種を妨げる。ＩＢＤＶには２つの公知の血清型がある。血清型Ｉウイルスはニワトリに対して病原性であり、一方血清型ＩＩウイルスはニワトリ及び七面鳥に感染する。七面鳥の感染は、目下、臨床的意義が不明である。ＩＢＤＶはビルナウイルスと呼ばれるウイルスの群に属し、これには、その他の２セグメント化ＲＮＡウイルス、例えば感染性膵臓壊死ウイルス（魚類）、ニッコウガイウイルス及びカキウイルス（二枚貝軟体動物）並びにショウジョウバエＸウイルス（ショウジョウバエ）が含まれる。これらのウイルスはすべて、高分子量（ＭＷ）二本鎖ＲＮＡゲノムを含有する。ＩＢＤＶビリオンのキャプシドは、いくつかの構造タンパク質から成る。９つもの構造タンパク質が報告されているが、しかしこれらのいくつかは前駆体−産生物の関係にあると示されている（Kibenge，F.S.B.，et al.，J．Gen．Virol. ，69，1757-1775（1988））。ウイルスタンパク質（ＶＰ）の名称及び分子量を以下に示す。二本鎖ＲＮＡの２つのセグメントは、ＩＢＤＶのゲノムにおいて同定された。ＩＢＤＶゲノムは、２８２７（セグメントＢ）〜３２６１（セグメントＡ）ヌクレオチド塩基対間で変化する二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグメントから成る（Mundt，E．et al.，Virology，209,10-18（1995））。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解により切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４を形成するポリプロテインをコードする（Hudson，P.J.et al.， Nucleic Acids Res.，14，5001-5012（1986））。ＶＰ２及びＶＰ３はビリオンの主要構造タンパク質である。ＶＰ２はＩＢＤＶの主な宿主保護免疫原で、中和抗体の誘導に関与する抗原領域を含有する（Azad，et al.,Virology，161，145- 152（1987））。ポリプロテイン遺伝子の前にあり、一部重複する二番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＩＢＤＶ感染細胞中に存在する未知の機能を有するタンパク質（ＶＰ５）をコードする（Mundt，E．et al.，J．Gen． Virol.，76，437-443（1995））。小セグメントＢは、ポリメラーゼ及びキャッピング酵素活性を有する９０ｋＤａの多機能タンパク質であるＶＰＩをコードする（Spies，U.，et al.，Virus Res.，8，127-140（1987）；Spies，U.，et al. ，J．Gen．Virol.,71，977-981（1990））。ＶＰ２タンパク質はＩＢＤＶの主な宿主保護免疫原であり、それは中和抗体の誘導に関与する抗原領域を含有する、ということが実証されている。中和部位を含有する領域は、高い構造依存性であることが示されている。ＶＰ３タンパク質は、それが血清型Ｉ及びＩＩウイルスの両方の株からそれに対して向けられるモノクローナル抗体により認識されるため、群特異性抗原であると考えられている。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４タンパク質の前駆体ポリプロテインのプロセシングに関与する、ウイルスがコードする(virus-cod ed)プロテアーゼであると思われる。種々のＩＢＤＶ株のゲノムセグメントＡとＢに関するヌクレオチド配列が公表されているけれども、両セグメントの完全な５’−及び３’−非コード配列が確定されたのは、最近に過ぎない。ＩＢＤＶセグメントＡとＢの５’−非コード領域は３２ヌクレオチドの共通配列を含有し、一方両セグメントの３’−非コード末端配列は無関係であるが、しかし同一血清型のＩＢＤＶ株の間に保持される（ Mundt，E．et al.，Virology，209，10-18（1995））。これらの末端は、哺乳類及び植物のレオウイルス及びロタウイルスのようなウイルスを含有するその他のｄｓＲＮＡに関して実証されているように、パッケージング及びＩＢＤＶ遺伝子発現の調節に重要な配列を含有し得る（Anzola，et al.，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，84，8301-8305（1987）；Zou，S.，et al.，Virology，186，377-388（ 1992）；Gorziglia，M.I．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89，5784-578 8（1992））。近年、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより産生される転写物を用いてクローン化ｃＤＮＡから、多数の感染性動物ＲＮＡウイルスが生成されている（Boye r，J.C.，et al.，Virology，198，415-426（1994））。例えば、（＋）鎖ＲＮＡウイルスであるポリオウイルス、セグメント化（−）鎖ＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルス、非セグメント化（−）鎖ＲＮＡウイルスである狂犬病ウイルス、すべてはそのそれぞれのゲノムのクローン化ｃＤＮＡから再生された（van der Werf，S.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，2330-2334（1 986）;Enami，M.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87，3802-3805（1990 ）；Schnell，M.J.，et al.，EMBO J.，13，4195-4205（1994））。レオウイルスに関しては、ＳＳＲＮＡＮｄｓＲＮＡ及びインビトロ（in vitro）翻訳化レオウイルス産生物の組合せによる細胞トランスフェクションは、異なる血清型由来のヘルパーウイルスで相補される場合、感染性レオウイルスを産生する、ということが示されている（Roner，M.R.，et al.，Virology，179,845-852（1990））。しかしながら、今日まで、合成ＲＮＡのみから再生されたセグメント化ｄｓＲＮＡゲノムの感染性ウイルスについての報告はない。発明の概要本発明は若いニワトリのガンボロ病に関与する感染性嚢疾患ウィルス（ＩＢＤＶ）に関する。特に、本発明は、クローン化ｃＤＮＡ由来の合成転写物を用いた感染性嚢疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）の生成のための系に関する。本発明は、ウイルス遺伝子発現の調節、病原論、並びに新世代の生ワクチン及び不活化ワクチンの設計についての研究を促す。発明の詳細な説明ＩＢＤＶに関する逆方向遺伝系を開発するための努力において、血清型ＩＤ７８株又は血清型ＩＩ２３／８２株のセグメントＡ、及び血清型ＩＰ２株のセグメントＢそれぞれを含有する３つの別々の全長ｃＤＮＡが構築された。セグメントＡとＢの合成ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでの直鎖プラスミド上インビトロ（in vitro）での転写反応により産生された。ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅで処理または未処理のこれらのセグメントの転写物を、ベロ細胞のトランスフェクションによる感染性ウイルスの生成に関して評価した。本発明者らは、セグメント化ｄｓＲＮＡ動物ウイルスの全ゲノムに対応するクローン化ＤＮＡ由来の合成転写物が複製ウイルスを生じ得る、ということを実証した。ｄｓＲＮＡゲノム（ＩＢＤＶ）を有するウイルスのクローン化ｃＤＮＡ由来合成（＋）センスＲＮＡによる細胞のトランスフェクション後の感染性ウイルスの再生は、ＲＮＡウイルスに関する逆感染系の生成についての探求を完結させるものである。多数の研究者が、クローン化ｃＤＮＡから感染性動物ＲＮＡウイルスを生成した（Boyer，J.C.，et al.，Virology，198，415-426（1994））。v an der Werf等は、最初に、クローン化ｃＤＮＡ鋳型上でＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより産生された合成ＲＮＡを用いて、（＋）鎖ＲＮＡウイルスであるポリオウイルスを生成した（van der Werf，S.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，83，2330-2334（1986））。後に、Enami等は、セグメント化（−）鎖ＲＮＡウイルスであるインフルエンザウイルスを生成し（Enami，M.，et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA，87．3802-3805（1990））、Schnell等は、それぞれのゲノムのクローン化ｃＤＮＡから非セグメント化（−）鎖ＲＮＡウイルスである狂犬病ウイルスを生成した（Schnell，M.J.，et al.，EMBO J.，13，4195-4205（199 4））。 Roner等は、合成ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、インビトロ（in vitro）での翻訳化レオウイルス産生物の組合せによる細胞をトランスフェクションを行い、異なる血清型のヘルパーウイルスで相補させることによりセグメント化ｄｓＲＮＡレオウイルスに関する感染系を開発した（Roner，M.R.，et al.，Virology，1 79，845-852（1990））。その結果生じたウイルスを、プラークアッセイによりヘルパーウイルスと区別した。しかしながら、この系では、ヘルパーウイルスの使用が必要であった。これに対比して、ここに記載したＩＢＤＶの逆方向遺伝系は、ヘルパーウイルス又はその他のウイルスタンパク質を必要としない。両セグメントの（＋）センスＲＮＡによる細胞のトランスフェクションは、感染性ウイルス（ＩＢＤＶ）を生成させるのに十分であった。セグメントＡの３’末端でそれぞれ転写された付加的な１か４個のヌクレオチドの結果は、確定されなかった。しかしながら、これはウイルスｄｓＲＮＡの複製を妨げない。同様の作用は、（＋）鎖ＲＮＡウイルスに関して、異なる研究者によって観察された（Boyer，J .C.，et al.，Virology，198，415-426（1994））。両セグメントの（＋）センスＲＮＡの同一細胞へのトランスフェクションは、ＩＢＤＶを首尾よく再生するために必要であった。両セグメントのトランスフェクトされたＲＮＡは、細胞の翻訳組織で翻訳されねばならなかった。セグメントＡのポリプロテインは、おそらく、ウイルスキャプシドを構成するＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４タンパク質にプロセシングされたと考えられる。セグメントＢの翻訳されたタンパク質ＶＰ１は、おそらく、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用し、両セグメントの合成（＋）鎖から（−）鎖を転写し、その反応産生物がｄｓＲＮＡを生成したと思われる。近年、Dobosは、ビルナウイルス科ファミリーの原型ウイルスである感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）のビリオンＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ（in vitro）での転写が、ＶＰ１により開始されて、次に不斉半保存性鎖置換メカニズムを介して進行し、ウイルスゲノムの複製中に（＋）鎖のみを合成する、と報告した（Dobos，P.，Virolog y，208,10-25（1995））。本発明の系は、（−）鎖の合成が（＋）鎖上で進行することを示す。その結果生じる転写された（−）鎖ＲＮＡが（＋）鎖の転写のための鋳型として役立つか否かは、依然としてさらなる研究対象である。トランスフェクションを行った細胞の上清中に含有される感染性ＩＢＤＶが実際に合成転写物に由来することを立証するために、血清型ＩＩ株のセグメントＡ及び血清型Ｉ株のセグメントＢを含有する人工キメラを生成した。配列分析により、このゲノムの組合せが立証された。その結果はさらに、Mundt及びM ullerが記載した末端配列モチーフがおそらくはウイルスゲノムの複製、分類及びパッケージングに関与することを示す（Mundt，E．et al.，Virology，209，1 0-18（1995））。血清型特異性末端配列の存在は、明らかに、血清型ＩセグメントＢのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＶＰ１の作用による血清型ＩＩセグメントＡの適正な複製を妨げない。組換えウイルスを作る能力は、血清型特異的及び血清型共通末端配列の厳密な機能を分析するのに大いに役立つ。感染性ＩＢＤＶの再生は、両セグメントの（＋）鎖ＲＮＡのみでｄｓＲＮＡの複製を開始するには十分であることを実証する。したがって、その結果は、（＋）鎖ＲＮＡがｄｓＲＮＡを産生するための後代（−）鎖の合成のための鋳型として役立つレオウイルス及びロタウイルスの複製の一般的特徴と一致する（Schonb erg，M.,et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．Patton．J.T.，Virus Res.，6，217- 233（1986）；Chen，D.，et al.，J．Virol.，68，7030-7039（1994））。しかしながら、Spies等及びDobosが提案した半保存的鎖置換メカニズムは、除外されない（Spies，U.,et al.，Virus Res.，8,127-140（1987）;Dobos，P.，Virolog y，208，10-25（1995））。ＩＢＤＶに関する逆方向遺伝系の開発は、遺伝子発現、病原論の将来的研究を大いに促進し、そして新世代の生ＩＢＤＶワクチン及び不活化ＩＢＤＶワクチンの設計に役立つ。本明細書中で用いられる「合成」という用語は、核酸に適用される場合、天然の核酸に対比してそれが人工の核酸であることを示す。この用語は、製造方法を限定するものではなく、製造方法が人の介入を包含する限りにおいては、化学的又は生物学的なものでありうる。「ｃＤＮＡ」という用語は、セグメントＡとＢ、並びにセグメントＡとＢの５ ’及び３’非コード領域を含有するあらゆるｃＤＮＡを包含するものとする。「感染性」という用語は、ウイルスに適用する場合、ウイルスが繁殖する能力を有することを示す。ウイルスは病原性又は非病原性であるが、感染性であることに変わりはない。本発明は、合成ＲＮＡ転写物を用いて感染性嚢疾患ウイルスの生成のための系を提供する。この系は、ウイルス遺伝子発現の調節、病原論を研究するために、そして新世代の生ＩＢＤＶワクチン及び不活化ＩＢＤＶワクチンの設計のために用いられ得る。本発明は、本発明のｃＤＮＡの少なくとも１つのコピーを含有する組換えベクターを提供する。組換えベクターはさらに、当分野で公知のように、その他の必要な配列、例えば発現コントロール配列、マーカー、増幅遺伝子、シグナル配列、プロモーター等を包含する。このための有用なベクターは、プラスミド、並びにバキュウロウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）及び鶏痘ウイルス等のポックスウイルスなどのウイルスである。さらに、本明細書中で提供されるのは、本発明の組換えベクターで形質転換した宿主細胞、又は本発明の合成ＲＮＡでトランスフェクトされた宿主細胞である。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞性宿主細胞である。適切な例は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｆ−９等の昆虫細胞株、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ胚腎（ＣＥＫ）細胞、アフリカミドリザルベロ細胞等である。本発明のさらなる一部は、家禽保護量の組換えにより生成されたウイルス又はウイルスの一部を包含するＩＢＤＶ家禽ワクチンであって、この場合、ウイルスはもはや有毒でないように、不活化又は修飾される。ウイルスは、化学的又は物理学的手段によって不活性化され得る。化学的不活性化は、ウイルスを、例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミン又はその誘導体、有機溶媒（例えばハロゲン化炭化水素）および／または洗剤を用いてウイルスを処理することにより成し遂げ得る。必要な場合、ウイルスが不活性化された後に、不活性化物質を中和し得る。物理学的不活性化は、ウイルスに放射線、例えば紫外線、Ｘ線又はγ線を照射することにより実行し得る。感染性ウイルスの生成の前又は後に、公知の方法により、例えば連続継代、核酸の配列欠失及び部位特異的突然変異誘発によりウイルスは弱毒化され、十分な抗原性を保持するがビルレンスが減少したウイルスを生成し得る。家禽のワクチン接種のための製薬上可能な担体は当分野で公知であって、ここでさらに説明する必要はない。家禽に対して製薬上可能であるほかに、担体はワクチンにより引き出される免疫応答および／またはそのポリペプチド産生物の発現を妨げないものでなければならない。その他の添加剤、その中でも例えばアジュバント及び安定剤は、当分野で公知の量でワクチンに含入される。好ましくは、アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、植物及び動物油等が、ＩＢＤＶに対する免疫応答を増強するのに十分な量でワクチンとともに投与される。ワクチンに付加されるアジュバントの量は、アジュバントの性質によって、通常ＩＢＤＶの重量の約０．１〜約１００倍、好ましくは約１〜約１０倍の範囲で変化する。本発明のワクチンはさらに、種々の安定剤を含有する。あらゆる適切な安定剤が用いられるが、その例としては、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストリン又はグルコース；タンパク質、例えばアルブミン又はカゼイン；並びに緩衝剤、例えばアルカリ金属リン酸塩等が挙げられる。安定剤は、凍結乾燥法により乾燥ワクチン製剤が調製される場合に、特に有益である。ワクチンは、家禽にワクチン接種するためのあらゆる適切な公知の方法により、例えば鼻腔から、点眼的に、注射により、飲料水中に、食餌中に、曝露などにより投与される。好ましくは、ワクチンは、大量投与法により、例えばワクチンを飲料水中に入れるか、又は動物の周りに噴霧することにより投与される。注射で投与される場合、ワクチンは、好ましくは非経口的に投与される。非経口投与とは、本明細書中で用いる場合には、静脈内、皮下、筋肉内又は腹腔内注射による投与を意味する。本発明のワクチンは、孵化前後のあらゆる時期に、ＩＢＤを防止するために家禽に投与される。好ましくは、ワクチンは出生時前に及び動物が約６週齢になった後に投与される。家禽としては、ニワトリ（若鶏）、雄鶏、雌鶏、ブロイラー、ロースター、繁殖用鶏、産卵鶏、七面鳥、及び鴨が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンは、単位量で又はその他の量で、滅菌容器に入れて提供される。これは、好ましくは、−２０℃以下で、さらに好ましくは−７０℃以下で貯蔵される。それは使用前に解凍され、その直後に再凍結される。家禽に投与するためには、組換えにより生成されたウイルスを、生理的食塩水のような担体中に約１０⁴ 〜１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ、さらに好ましくは約１０⁵〜１０⁶ｐｆｕ／ｍｌの量で懸濁される。不活化ワクチンは、担体中に懸濁された１０⁴〜１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの抗原等価物を含有する。その他の担体も当分野で公知のように用い得る。製薬上可能な担体の例は、当分野で公知の希釈剤及び不活性製剤担体である。好ましくは、担体又は希釈剤は、大量投与法によるワクチン投与に適合するものである。しかしながら、担体又は希釈剤は、注射、点眼、点鼻等のようなその他の投与方法にも適合し得る。本発明はさらに、ＩＢＤＶ物質との組合せワクチンを生成させるために用い得る。ＩＢＤＶ物質は、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、レオウイルス、アデノウイルスおよび／またはマレックウイルスの抗原物質と組合せ得る。本発明の前記の態様を、以下の実施例でさらに説明する。しかしながら、本発明はそれらの実施例に限定されず、本発明の範囲を逸脱しない限り変更が可能であることは、当業者には明らかである。図面の簡単な説明図１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＩＢＤＶの（＋）センスｓｓＲＮＡの合成に用いられるｃＤＮＡ構築物の略図である。構築物ｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８は、ＩＢＤＶＤ７８株のセグメントＡのｃＤＮＡを含有し、組換えプラスミドｐＵＣ１８ＦＬＡ２３はＩＢＤＶ２３／８２株のセグメントＡの全長ｃＤＮＡを含有する。ＩＢＤＶのセグメントＡは、ポリプロテイン（ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３）、並びに近年同定されたＶＰ５タンパク質をコードする。プラスミドｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＶＰ１）をコードするＰ２株のセグメントＢのｃＤＮＡを含有する。ウイルス特異的配列には下線を施し、Ｔ７プロモーター配列はイタリック体で示す。制限部位は、肉太字体で示され、確認される。直鎖プラスミドの切断部位は垂直矢印で示し、転写方向は水平矢印で印をした。図２は、ベロ細胞のトランスフェクションに用いられた転写反応産生物のアガロースゲル分析を示す。Ｔ７ＲＮＡボリメラーゼ、並びにそれぞれＩＢＤＶＤ７８株のセグメントＡのｃＤＮＡを含有する直鎖プラスミドｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８（レーン２、４及び６）、及びＰ２株のセグメントＢのｃＤＮＡを含有するｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２（レーン１、３及び５）を用いてインビトロ（in vitro）で転写された合成ＲＮＡ。転写後、反応混合物は、ＤＮａｓｅ（レーン１及び２）、ＲＮａｓｅ（レーン３及び４）で処理するか、又は未処理（レーン５及び６）のまま残した。２μｌの反応産物を１％アガロースゲル上で分析した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したλＤＮＡを、マーカーとして用いた（レーンＭ）。図３は、それぞれ、血清型ＩＩ２３／８２株及び血清型ＩＰ２株のセグメントＡ及びＢの公知の配列とのキメラＩＢＤＶ２３Ａ／Ｐ２Ｂ株（太字）のセグメントＡとＢからのクローン化ＲＴ−ＰＣＲ断片のヌクレオチド配列の比較を示す。ヌクレオチド相同部は、コロンで印を付けた。図４は、ｐＵＣ１８ＦＬＡ２３のＤＮＡ配列を示す。図５は、ｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８のＤＮＡ配列を示す。図６は、ｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２のＤＮＡ配列を示す。実施例ウイルス及び細胞：ＩＢＤＶの２つの血清型Ｉ株、即ちドイツからの弱毒化Ｐ２株及びワクチンＤ７８株（Intervet International）、並びに−血清型ＩＩ株、即ち非病原性２３／８２株をニワトリ胚細胞（ＣＥＣ）中で増殖させて、精製した（Mundt，E．et al.，Virology，209，10-18（1995）；Vakharia，V.N.，et al.，Virus Res.，31，265-273（1994））。ベロ細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補足したＭ１９９培地中で増殖させて、トランスフェクション実験に用いた。再生ウイルスをさらに増殖させて、免疫蛍光試験をベロ細胞で実施した（Mundt，E.，et al.，J.Gen．Virol.，76，437-443（1995））。プラークアッセイのために、二次ＣＥＣの単一層を調製し、用いた（Muller，H.,et al.，Vir usRes.，4，297-309（1986））。ＩＢＤＶゲノムの全長ｃＤＮＡクローンの構築：ＩＢＤＶセグメントＡとＢの全長ｃＤＮＡクローンは別々に調製された。Ｄ７８株のＲＮＡセグメントＡの全コード領域を含有するｃＤＮＡクローンは、標準クローニング手順及び方法を用いて調製された（Vakharia，V.N.，et al.，Virus Res.，31，265-273（1994））。Ｄ７８末端配列を最近公表された他のＩＢＤＶ株の末端配列（Mundt，E．et al.，Virology，209，10-18（1995））と比較することにより、Ｄ７８ｃＤＮＡクローンが、５’−及び３’−末端のそれぞれ保存された最初の１７個及び最後の１０個のヌクレオチドを欠くということが観察された。したがって、セグメントＡの全長ｃＤＮＡを構築するために、２つのプライマー対（Ａ５’−Ｄ７８、Ａ５−ＩＰＤ７８及びＡ３’−ＩＰＤ７８）は合成され、ＰＣＲ増幅に用いられた（表１）。ＤＮＡセグメントは供給元（New England Biolabs）のプロトコールにしたがって、「ディープベントポリメラーゼ（Deep Vent Polymerase）」（高忠実性好熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて増幅された。増幅断片は、ｐＣＲＩＩベクター（Invitrogen Corp.）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされ、それぞれプラスミドｐＣＲＤ７８Ａ５’及びｐＣＲＤ７８Ａ３’を得た。各プラスミドはＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで切断され、その結果生じた断片は、ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１９に連結され、プラスミドｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８（配列番号：２７及び２９）を得た。これは、すべての構造タンパク質（ＶＰ２、ＶＰ４及びＶＰ３、配列番号：３０）並びに非構造ＶＰ５タンパク質（配列番号：２８）をコードするセグメントＡの全長ｃＤＮＡコピーを含有する（図１）。２つのプライマー対（Ａ５’−２３、Ａ５−ＩＰ２３及びＡ３’−２３、Ａ３ −ＩＰ２３；表１参照）は、「スーパースクリプトＲＴＩＩ（SuperScript ＲＴＩＩ）」（ＲＮａｓｅＨ活性低減を示すＲＮＡ特定ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））を用いる２３／８２株のウイルスゲノムｄｓＲＮＡの逆転写（ＲＴ）のために使用された。ＲＴ反応産生物は、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製された。プライマー対Ａ５’−２３、Ａ５−ＩＰ２３及びＡ３’−２３、Ａ３−ＩＰ２３それぞれにより結合される２つのｃＤＮＡ断片を得るために、ＲＴ反応産生物は、「ディープベントポリメラーゼ（Deep Vent polymerase）」を用いてＰＣＲにより増幅された。ＲＴ及びＰＣＲはともに、供給元のプロトコールにしたがって実施された。その結果生じたＰＣＲ断片はＳｍａＩ切断ｐＵＣ１８ベクターと平滑末端で連結され、ｐＵＣ２３Ａ５’及びｐＵＣ２３Ａ３’を得た。プラスミドｐＵＣ２３Ａ３’に含有されるセグメントＡの３’末端はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＢＩ切断プラスミドｐＵＣ２３Ａ５’ に連結され、２３／８２株のセグメントＡの全長ｃＤＮＡを確立した。その結果生じたプラスミドをｐＵＣ１８ＦＬＡ２３（配列番号：３１及び３３）（図１）と名付け、これは構造タンパク質ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４（配列番号：３２）並びに非構造タンパク質ＶＰ５（配列番号：３４）をコードする。Ｐ２株のセグメントＢのｃＤＮＡクローンを得るために、２つのプライマー対（Ｂ５’−Ｐ２、Ｂ５−ＩＰＰ２及びＢ３’−Ｐ２、Ｂ３−ＩＰＰ２）は公表された配列にしたがって設計され、ＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用された（表１参照）。鋳型としてゲノムｄｓＲＮＡを用いて、供給元（Perkin-Elmer Cetus）のプロトコールにしたがってｃＤＮＡ断片は合成され、増幅された。増幅断片はＳｍａＩ切断ｐＢＳベクター（Stratagene）に平滑末端で連結され、クローンｐＢＳＰ２Ｂ５’及びｐＢＳＰ２Ｂ３’を得た。セグメントＢの全長クローンを構築するために、プラスミドｐＢＳＰ２Ｂ５’の５’末端断片をｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位間で先ずサブクローニングして、ｐＵＣＰ２Ｂ５’を得た。次に、プラスミドｐＢＳＰ２Ｂ３’の３’末端断片をプラスミドｐＵＣＰ２Ｂ５’のユニークなＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ部位間に挿入して、全長プラスミドｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２（配列番号：２５）を得た。これはＶＰ１タンパク質（配列番号：２６）をコードする（図１）。「シーケナーゼ（Sequenase）」ＤＮＡシーケンシングシステム（U.S.Biochem.）を用いてプラスミドｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２、ｐＵＣ１８ＦＬＡ２３及びｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８は完全にシーケンシングされ、「ＤＮＡＳＩＳ」（Pharmacia）又は「ＰＣ／Ｇｅｎｅ」（Intelligenetics）ソフトウエアを用いて配列データは分析された。全長構築物の完全性は、網状赤血球ライゼート系を併用したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega）を用いたインビトロ（in vitro）転写及び翻訳により、試験された。合成ＲＮＡの転写及びトランスフェクション：プラスミドｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８、ｐＵＣ１８ＦＬＡ２３及びｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２は、それぞれＢｓｒＧＩ、ｓｉＩ及びＰｓｔＩ酵素で切断され（図１参照）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ Promega）を用いるインビトロ（in vitro）での転写のための鋳型として用いられた。要するに、制限酵素切断アッセイは０．５％ＳＤＳに調製され、プロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）とともに３７℃で１時間インキュベートされた。直鎖状ＤＮＡ鋳型（〜３μｇ）をエタノール沈殿後に回収し、別々に、４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、２ｍＭスペルミジン、各々０．５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ、０．１ｍＭＧＴＰ、０．２５ｍＭキャップアナログ［ｍ７Ｇ（５’）ＰＰＰ（５’ ）Ｇ］、１２０単位の「ＲＮアシン」（リボヌクレアーゼ阻害剤）、１５０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega）を含有する転写反応混合物（５０μｌ）に別々に添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。合成ＲＮＡ転写物はフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製された。対照として、転写産物は、精製工程前にＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅ（Promega）いづれかで処理された。ベロ細胞は増殖され６０ｍｍ皿中でコンフルエンス８０％とし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄された。３ｍｌの「ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ」（ＨＥＰＥＳ緩衝液、炭酸水素ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、微量元素、増殖因子及びフェノールレッドを含有する還元血清培地；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）は単一層に添加され、細胞はＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベートされた。同時に、０．１５ｍｌの「ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ」は、１．２５μｇの「リポフェクチン」試薬（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ− トリメチルアンモニウムクロリド及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））とともに、ポリスチレン試験管中室温で４５分間インキュベートされた。０．１５ｍｌのジエチルピロカルボネート処理水中に再懸濁された両セグメントの合成ＲＮＡ転写物をＯＰＴＩ−ＭＥＭ−リポフェクチン混合物に添加され、穏やかに混合され、氷上で５分間インキュベートされた。６０ｍｍ皿中の単一層から「ＯＰＴＩ−ＭＥＭ」を除去後、新しい１．５ｍｌの「ＯＰＴＩ−ＭＥＭ」に入れ換えて、核酸含有混合物をベロ細胞に滴下し、穏やかにかき混ぜた。３７℃で２時間インキュベート後、混合物は、５％ＦＣＳを含有するＭ１９９培地［ＣａＣｌ₂（無水物）、Ｆｅ（ＮＯ₃）₃・９Ｈ₂Ｏ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ₄（無水物）、ＮａＣｌ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ、ＮａＨＣＯ₃、Ｌ− アラニン、Ｌ−アルギニンＨＣｌ、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ、Ｌ−システイン２ＨＣｌ、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン２Ｎａ₂・Ｈ₂Ｏ、Ｌ−バリン、α−トコフェロールＰＯ₄・Ｎａ₂、アスコルビン酸、ビオチン、カルシフェロール、Ｄ−カルシウムパントテン酸塩、コリンクロリド、葉酸、１−イノシトール、メナンジオンＮａＨＳＯ₃・３Ｈ₂Ｏ、ナイアシン、ニコチンアミド、パラ−アミノ安息香酸、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＡアセテート、アデニンＳＯ₄、アデニル酸、ＡＴＰＮａ₂、コレステロール、２−デオキシ−Ｄ−リボース、Ｄ−グルコース、グルタチオン、グアニンＨＣｌ、ヒポキサンチンＮａ、フェノールレッドＮａ、リボース、酢酸ナトリウム（無水）、チミン、Ｔｗｅｅｎ８０、ウラシル及びキサンチンＮａ；Mediatech，Inc.］に置き換えられ（細胞を洗浄せず）、細胞はさらに３７℃で所望の時間インキュベートされた。生成ＩＢＤＶの同定：ＣＥＣは、ｐＵＣ１８ＦＬＡ２３及びｐＵＣＦＬＰ２Ｂの転写物でトランスフェクトされたベロ細胞からの濾過上清（０．２μｍ）で感染させた。感染後１６時間後、全細胞核酸は単離された（Mundt，E.，et al.,Vi rology，209，10-18（1995））。公表された配列にしたがってプライマーは設計され、ＲＴ−ＰＣＲ断片は増幅、クローニング、そしてシーケンシングされた（Mundt，E.，et al.,Virology，209，10-18（1995））。「ＤＮＡＳＩＳ」ソフトウエアを用いて、配列データを分析した。免疫蛍光法：カバーガラス上でコンフルエンス８０％に増殖させたベロ細胞を、トランスフェクトされたベロ細胞由来の上清で感染させ（凍結溶解後）、３７ ℃で２日間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、アセトンで固定して、ポリクローナルウサギ抗−ＩＢＤＶ血清で処理した。洗浄後、細胞をフルオレセイン標識化ヤギ抗ウサギ抗体（Kirkegaard & Perry Lab.）で処理し、蛍光顕微鏡で検査した。プラーク検定：６０ｍｍ皿中で増殖させた二次ＣＥＣの単一層を、トランスフェクトされたベロ細胞由来の上清で接種した。感染１時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１０％トリプトースホスフェートブロス、２％ＦＣＳ、０．１１２％ＮａＨＣＯ₃、１０³単位のペニシリン、１０³μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのフンギゾン（fungizone）、０．００５％ニュートラルレッド、０．００１５％フェノールレッドを含有する０．８％寒天（Agar noble ）（Difco）で上塗りした。プラークが観察されて計数し得るようになるまで、３７℃で２〜３日間、細胞をインキュベートした（Muller，H.，et al.，Virus Res.，4，297-309（1986））。ＩＢＤＶゲノムの全長ｃＤＮＡクローンの構築：ｄｓＲＮＡウイルスＩＢＤＶに関する逆方向遺伝系を開発するために、Ｄ７８株のセグメントＡ及びＰ２株のセグメントＢを含有する２つの別々のｃＤＮＡクローンが構築された（図１）。各プラスミドは、構造タンパク質（ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ３）及びＶＰ５の前駆体又はＶＰ１タンパク質のみ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）をコードした。ＰｓｔＩによる切断及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ（in vitro ）での転写におけるプラスミドｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２は、正しい５’−及び３’ −末端を含有するＲＮＡを産生する。ところが、ＢｓｒＧＩによる切断及び転写におけるプラスミドｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８は、正しい５’−末端を含有するが３’末端にさらに４つのヌクレオチドを有するＲＮＡを産生した。ウサギ網状赤血球系中での前記のプラスミドの転写及び翻訳により、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での分画及びオートラジオグラフィー処理後に正しくプロセシングされ、マーカーＩＢＤＶタンパク質と同時転位されるタンパク質産生物が産生された（データは示さず）。感染性ウイルスの転写、トランスフェクション及び生成：鋳型として直鎖状全長ｃＤＮＡプラスミドを用いて、ＩＢＤＶセグメントＡとＢの（＋）センス転写物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ（in vitro）で別々に合成された（図２参照）。中性ゲル上にセグメントＢに関してＲＮＡ転写物の２種が観察されたけれども（レーン１及び５）、変性ゲル上でのこれらのサンプルの画分からは、１つの転写物特異性バンドのみが生じた（データは示さず）。両セグメントの（＋）センスＲＮＡ転写物が感染性ウイルスの生成に必要であることを示すために、図２に示したような転写混合物を異なるヌクレアーゼとともにインキュベートした。ＤＮａｓｅ（レーン１＋２）、ＲＮａｓｅ（レーン３＋４）での転写産物の処理後に、又は処理をおこなわず（レーン５＋６）に回収された合成ＲＮＡを、ベロ細胞のトランスフェクションに用いた。擬似対照として、リポフェクチン単独を用いた。トランスフェクション後５日目に、細胞変性効果（ＣＰＥ）が未処理又はＤＮａｓｅ処理転写産物の組合せ転写物でトランスフェクトされたベロ細胞に認められただけで、ＲＮａｓｅ処理転写混合物又はトランスフェクトされた擬似対照では観察されなかった。さらに、セグメントＡとＢだけのＲＮＡでベロ細胞をトランスフェクトした場合には、ＣＰＥは検出されなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＩＢＤＶの複製が、ＩＢＤＶの両セグメントの（＋）センスｓｓＲＮＡによるベロ細胞のトランスフェクション後に続いて起きたということを実証する。ベロ細胞中にＣＰＥを引き起こす作因が実際にＩＢＤＶであったことを立証するために、トランスフェクトされたベロ細胞を凍結溶解し、上清を遠心分離により清澄化して、ＣＥＣ又はベロ細胞に感染させるために用いた。未処理又はＤＮａｓｅ処理転写混合物のトランスフェクトされたベロ細胞由来の上清で感染されたＣＥＣは、接種後１日でＣＰＥを生じた（表２）。しかしながら、ＲＮａｓｅ処理転写混合物、未処理セグメントＡ又はＢ転写混合物のトランスフェクトされたベロ細胞及びトランスフェクトされた擬似ベロ細胞からの上清による、ＣＥＣにおいては５日後でもＣＰＥは検出されなかった。同様に、カバーガラス上のベロ細胞が前記と同一の上清で感染され、２日後に免疫蛍光染色で検査された場合、未処理又はＤＮａｓｅ処理転写混合物のトランスフェクトされたベロ細胞由来の上清だけが陽性免疫蛍光シグナルを生じた（表２）。トランスフェクトウイルスの再生：感染ウイルスの再生のための時点を測定するために、ベロ細胞は、セグメントＡとＢの組合せＲＮＡ転写物でトランスフェクトされた。トランスフェクション後４、８、１６、２４、３６及び４８時間後に、表３に示すように、上清は、感染性及びプラークアッセイによりトランスフェクトウイルスの存在に関して検査された。我々の結果は、トランスフェクション後３６時間という早さでウイルスが再生される、ということを示す。ウイルス力価は２．３ｘ１０²ｐｆｕ／ｍｌで、この値はトランスフェクション後４８時間より後に得られたサンプルに関しては下がると思われる。キメラウイルスの生成：ＩＢＤＶの両セグメントの（＋）センスｓｓＲＮＡが感染性ウイルスの再生に十分であることを立証するために、キメラＩＢＤＶを生成した。血清型ＩＩ株のセグメントＡの全長配列を含有するプラスミドｐＵＣ１８ＦＬＡ２３は、ＮｓｉＩ切断により直鎖状にし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ（in vitro）でｓｓＲＮＡは合成された。ｓｓＲＮＡ転写物は正しい５’−末端を明示したが、しかし３’−末端に１つの付加残基を含有した（図１）。ベロ細胞は、血清型ＩＩ２３／８２株のセグメントＡのｓｓＲＮＡ及び血清型ＩＰ２株のセグメントＢのｓｓＲＮＡでトランスフェクトされた。ＣＰＥが明らかになったトランスフェクション後５日目に、上清は清澄化（凍結溶解後）され、ＣＥＣを感染させるために用いられた。ＣＥＣにおける二次継代後、ウイルスのゲノムＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ産生物のシーケンシングにより分析された。セグメントＡに関するプライマーは、血清型ＩＩ株由来のセグメントＡ配列のみを特異的に増幅するよう設計された。セグメントＢに関するプライマーは、両血清型の配列に結合した。増幅断片をクローン化し、シーケンシングした。得られたセグメントＡ配列は、血清型Ｉ１２３／８２株の公知のセグメントＡ配列と完全適合を示したが、一方セグメントＢ配列は血清型ＩＰ２株の公表されたセグメントＢ配列と完全相同性を示した（図３）。ベロ細胞は、未処理、あるいはＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅで処理した転写反応物由来のセグメントＡとＢの合成ＲＮＡでトランスフェクトされた。５日後、上清は収集され、遠心分離で清澄化され、そしてウイルスの存在に関して分析された。接種後１〜２日目の細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現により、ＣＥＣにおいて再生ウイルスの感染性が測定された。ウサギ抗ＩＢＤＶ血清で感染されたベロ細胞の免疫蛍光染色により、再生ウイルスの特異性が測定された。ベロ細胞は、前記のようにセグメントＡとＢの合成ＲＮＡでトランスフェクトされた。再生ウイルスの感染性及び特異性を、ＣＥＣにおいてはＣＰＥにより、ベロ細胞においては免疫蛍光染色により、それぞれ検出した。二次ＣＥＣの単一層は、トランスフェクトされたベロ細胞由来の上清を細胞に接種後、プラーク検定に用いられた。プラーク形成単位／ｍｌ（ｐｆｕ／ｍｌ）として、ウイルスのおよその力価を算出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．活性ビルナウイルスの調製方法であって、感染性嚢疾患ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）ゲノムセグメントＡとＢを含むｃＤＮＡを調製し；前記ｃＤＮＡを転写して合成ＲＮＡ転写物を生成させ；宿主細胞を前記合成ＲＮＡ転写物でトランスフェクトし；前記宿主細胞を培地中でインキュベートし；そして前記培地から活性感染性嚢疾患ウイルスを単離する、工程を含む方法。２．前記ビルナウイルスが感染性嚢疾患ウイルスである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記宿主細胞がアフリカミドリザルベロ細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。４．前記ｃＤＮＡの前記セグメントＡとＢが別々に調製される、請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記セグメントＡがプラスミドｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８またはｐＵＣ１８ＦＬＡ２３中に存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。６．前記セグメントＢがｐＵＣ１８ＦＬＢＰ２中に存在する、請求の範囲第４項に記載の方法。７．感染性嚢疾患ウイルスゲノムセグメントＡとＢを含むｃＤＮＡを調製し；前記ｃＤＮＡを転写して合成ＲＮＡ転写物を生成させ；宿主細胞を前記合成ＲＮＡ転写物でトランスフェクトし；前記宿主細胞を培地中でインキュベートし；そして前記培地から活性感染性嚢疾患ウイルスを単離する、工程を含む方法によって作られる、活性感染性嚢疾患ウイルス。８．感染性嚢疾患ウイルスのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４及びＶＰ５をコードする合成ＲＮＡ。９．請求の範囲第８項に記載の合成ＲＮＡでトランスフェクトされた宿主細胞。１０．感染性嚢疾患ウイルスのセグメントＡ、セグメントＢ、およびセグメントＡとＢから成る群から選択される感染性嚢疾患ウイルスゲノムの少なくとも一部を含むｃＤＮＡであって、前記セグメントの５’及び３’末端を含むｃＤＮＡ。１１．請求の範囲第１０項に記載のｃＤＮＡを含む組換えベクター。１２．前記ベクターがプラスミドである、請求の範囲第１１項に記載のベクター。１３．前記プラスミドは、ｐＵＣ１９ＦＬＡＤ７８、ｐＵＣ１８ＦＬＡ２３及びｐＵＣ１９ＦＬＢＰ２から成る群から選択される、請求の範囲第１２項に記載のベクター。１４．請求の範囲第１１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。１５．請求の範囲第７項に記載の感染性嚢疾患ウイルスを含むワクチンであって、前記感染性嚢疾患ウイルスが投与前に不活性化されるか、弱毒化されるワクチン。１６．活性感染性嚢疾患ウイルスワクチンを製造する方法であって、感染性嚢疾患ウイルスゲノムセグメントＡとＢを含む全長ｃＤＮＡを調製し；前記ｃＤＮＡを転写して合成ＲＮＡ転写物を生成させ；前記合成ＲＮＡ転写物を精製し；宿主細胞を前記精製ＲＮＡ転写物でトランスフェクトし；前記宿主細胞を培地中でインキュベートし；前記培地から活性感染性嚢疾患ウイルスを単離し；前記活性感染性嚢疾患ウイルスを弱毒化して減少したビルレンスを有するウイルスを生成させ；そして前記活性感染性嚢疾患ウイルスを製薬上可能な担体と組み合わせて、感染性嚢疾患ウイルス生ワクチンを生成する、工程を含む方法。１７．前記活性感染性嚢疾患ウイルスが連続継代または部位特異的突然変異誘発によって弱毒化される、請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．前記宿主細胞が家禽細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。１９．前記家禽細胞がニワトリ、七面鳥、またはウズラの細胞である、請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．前記家禽細胞がニワトリ胚繊維芽細胞またはニワトリ胚腎細胞である、請求の範囲第１９項に記載の方法。