ES2342325T3 - Un metodo para generar virus de la bursitis infecciosa a partir de transcritos sinteticos de arn. - Google Patents
Un metodo para generar virus de la bursitis infecciosa a partir de transcritos sinteticos de arn. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para preparar Birnavirus vivos, en donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), que comprende los siguientes pasos: - preparar ADNc de los segmentos A y B del genoma del Birnavirus, - transcribir dichos ADNc para producir transcritos sintéticos de ARN, en donde dichos transcritos de ARN son transcritos de ARN de sentido positivo de dichos segmentos A y B, - transfectar células huésped con dichos transcritos sintéticos de ARN, incubar dichas células huésped en un medio de cultivo, y - aislar el Birnavirus infeccioso vivo de dicho medio de cultivo.
Description
Un método para generar virus de la bursitis
infecciosa a partir de transcritos sintéticos de ARN.
El virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un
miembro de la familia Birnaviridae, es el agente causante de
una enfermedad altamente inmunosupresora en pollos jóvenes (Kibenge,
F.S.B., et al., J. Gen. Virol., 69,
1757-1775 (1988)). La bursitis infecciosa (IBD) o
enfermedad de Gumboro se caracteriza por la destrucción de los
folículos linfoides en la bolsa de Fabricio. En una bandada de
pollos totalmente susceptible de 3-6 semanas de
edad la enfermedad clínica produce inmunosupresión grave y es
responsable de pérdidas debidas al crecimiento disminuido, descenso
en la eficacia de la alimentación y muerte. Los pollos susceptibles
de menos de 3 semanas de edad no muestran signos clínicos externos
de la enfermedad pero tienen una marcada infección caracterizada
por enormes lesiones de la
bolsa.
bolsa.
El virus asociado con los síntomas de la
enfermedad se denomina virus de la bursitis infecciosa (IBDV). El
IBDV es un patógeno de máxima importancia económica para las
industrias avícolas nacionales y mundiales. Produce
inmunodeficiencia grave en pollos jóvenes mediante la destrucción de
precursores de células B productoras de anticuerpos en la bolsa de
Fabricio. La inmunosupresión produce aumento de la susceptibilidad a
otras enfermedades e interfiere con la vacunación eficaz contra los
virus de la enfermedad de Newcastle, la enfermedad de Marek y la
bronquitis infecciosa.
Hay dos serotipos conocidos de IBDV. Los virus
de serotipo I son patogénicos para pollos mientras que los virus de
serotipo II infectan pollos y pavos. La infección de pavos es
actualmente de significancia clínica desconocida.
El IBDV pertenece a un grupo de virus
denominados Birnaviridae que incluye otros virus de ARN
bisegmentado tales como el virus de la necrosis pancreática
infecciosa (peces), virus de tellina y virus de ostra (moluscos
bivalvos) y virus X de drosophila (mosca de la fruta). Estos virus
contienen todos genomas de ARN bicatenario de alto peso molecular
(MW).
La cápside del virión de IBDV consiste en varias
proteínas estructurales. Se han descrito hasta nueve proteínas
estructurales pero hay evidencia de que algunas de estas pueden
tener relación precursor-producto (Kibenge, F.S.B.,
et al., J. Gen. Virol., 69, 1757-1775
(1988)). La designación y pesos moleculares de las proteínas
víricas (VP) son como se muestra a continuación
Se identificaron dos segmentos de ARN
bicatenario en el genoma de IBDV. El genoma de IBDV consiste en dos
segmentos de ARN(bc) bicatenario que varían entre 2827
(segmento B) y 3261 (segmento A) pares de bases de nucleótidos
(Mundt, E. et al., Virology, 209,
10-18 (1995)). El segmento A más largo codifica una
poliproteína que se corta por autoproteolisis para formar las
proteínas víricas maduras VP2, VP3 y VP4 (Hudson, P.J. et
al., Nucleic Acids Res., 14, 5001-5012
(1986)). VP2 y VP3 son las proteínas estructurales principales del
virión. VP2 es el principal inmunógeno protector del huésped de IBDV
y contiene las regiones antigénicas responsables de la inducción de
anticuerpos neutralizantes (Azad, et al., Virology,
161, 145-152 (1987)). Un segundo marco abierto de
lectura (ORF), que precede y parcialmente se solapa con el gen de la
poliproteína, codifica una proteína (VP5) de función desconocida
que está presente en células infectadas con IBDV (Mundt, E., et
al., J. Gen. Virol., 76, 437-443,
(1995)). El fragmento menor B codifica VP1, una proteína
multifuncional de 90 kDa con actividades enzimáticas de polimerasa
y de protección terminal (Spies, U., et al., Virus
Res., 8, 127-140 (1987); Spies, U., et
al., J. Gen. Virol., 71, 977-981
(1990)).
Se ha demostrado que la proteína VP2 es el
principal inmunógeno protector del huésped de IBDV y que contiene
la región antigénica responsable de la inducción de anticuerpos
neutralizantes. Se ha mostrado que la región que contiene el sitio
de neutralización depende mucho de la conformación. Se ha
considerado que la proteína VP3 es un antígeno específico de grupo
porque es reconocida por anticuerpos monoclonales dirigidos contra
ella de cepas tanto de virus de serotipo I como II. Parece que la
proteína VP4 es una proteasa codificada por el virus que está
implicada en el procesamiento de una poliproteína precursora de las
proteínas VP2, VP3 y VP4.
Aunque se han publicado las secuencias de
nucleótidos para los segmentos genómicos A y B de varias cepas de
IBDV, sólo recientemente se determinaron las secuencias 5' y 3' no
codificantes de ambos segmentos. La región 5' no codificante de los
segmentos A y B de IDBV contiene una secuencia consenso de 32
nucleótidos, mientras que las secuencias terminales 3' no
codificantes de ambos segmentos no están relacionadas, pero se
conservan entre cepas de IBDV del mismo serotipo (Mundt, E. et
al., Virology, 209, 10-18 (1995)). Estos
extermos terminales podrían contener secuencias importantes en
empaquetamiento y en la regulación de la expresión génica de IBDV,
como se ha demostrado para otros virus que contienen ARNbc tales
como reovirus de mamíferos y plantas y rotavirus (Anzola, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,
8301-8305 (1987); Zou, S., et al.,
Virology, 186, 377-388 (1992); Gorziglia,
M.I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,
5784-5788 (1992)).
En los últimos años, se han generado ciertos
virus ARN infecciosos de animales a partir de ADNc clonado usando
transcritos producidos por ARN polimerasa dependiente de ADN (Boyer,
J.C., et al., Virology, 198, 415-426
(1994)). Por ejemplo poliovirus, un virus ARN de cadena positiva;
virus de la gripe, un virus ARN segmentado de cadena negativa;
virus de la rabia, un virus ARN no segmentado de cadena negativa;
todos se recuperaron de ADNc clonados de sus respectivos genomas
(van der Werf S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83, 2330-2334 (1986); Enami, M., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805
(1990); Schnell, M.J., et al., EMBO J., 13,
4195-4205 (1994)). Para reovirus, se mostró que la
transfección de células con una combinación de ARNmc, ARNbc y
productos de reovirus traducidos in vitro generó reovirus
infecciosos cuando se complementaron con un virus auxiliar de un
serotipo diferente (Rover, M.R., et al., Virology,
179, 845-852 (1990)). Sin embargo, hasta la fecha,
no se ha descrito un virus infeccioso recuperado de genoma de ARNbc
segmentado a partir de ARN sintéticos
sólo.
sólo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención se refiere al virus de la
bursitis infecciosa (IBDV) que está asociado con la enfermedad de
Gumboro de pollos jóvenes. Más en particular, esta invención se
refiere a un sistema para la generación de virus de la bursitis
infecciosa (IBDV) usando transcritos sintéticos derivados de ADNc
clonado. La presente invención facilitará estudios de la regulación
de la expresión génica vírica, patogénesis y diseño de una nueva
generación de vacunas vivas e inactivadas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un esfuerzo para desarrollar un sistema de
genética inversa para IBDV, se construyeron tres clones
independientes de ADNc de longitud total que contienen el segmento
A de la cepa D78 del serotipo I o la cepa 23/82 del serotipo II y
el segmento B de la cepa P2 del serotipo I, respectivamente. Los ARN
sintéticos de los segmentos A y B se produjeron mediante reacción
de transcripción in vitro de plásmidos linearizados con ARN
polimerasa de T7. Los transcritos de estos segmentos, bien sin
tratar o tratados con DNasa o RNasa, se evaluaron para la
generación de virus infecciosos mediante la transfección de células
Vero.
Los inventores presentes han demostrado que los
transcritos sintéticos derivados de ADN clonado correspondiente al
genoma completo de un virus animal de ARNbc segmentado pueden dar
lugar a un virus replicante. La recuperación de virus infeccioso
después de transfectar células con ARN sintéticos de sentido
positivo derivados de ADNc de un virus con un genoma de ARNbc
(IBDV) completa la búsqueda de generar sistemas infecciosos inversos
para virus de ARN. Un número de investigadores han generado virus
ARN infecciosos de animales a partir de ADN clonado (Boyer, J.C.,
et al., Virology, 198, 415-426
(1994)). Van der Werf y col. fueron los primeros en generar
poliovirus, un virus ARN de cadena positiva, usando ARN sintético
producido mediante una ARN polimerasa de T7 sobre molde de ADNc
clonado (van der Werf, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 83, 2330-2334 (1986)). Después, Enami y
col. recuperaron virus de la gripe, un virus de ARN segmentado de
cadena negativa (Enami, M., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990)); y Schnell y
col. generaron virus de la rabia, un virus de ARN no segmentado de
cadena negativa, a partir de ADNc clonados de sus respectivos
genomas (Schnell, M.J., et EMBO J., 13,
4195-4205 (1994)). Roner y col. desarrollaron un
sistema infeccioso para un reovirus de ARNbc segmentado
transfectando células con una combinación de ARNmc, ARNbc sintéticos
y productos de reovirus traducidos in vitro, y completados
con un virus auxiliar de diferente serotipo (Rover, M.R., et
al., Virology, 179, 845-852 (1990)). El
virus resultante se discriminó del virus auxiliar mediante ensayo
en placa. Sin embargo, en este sistema el uso de un virus auxiliar
era necesario. Por el contrario, el sistema de genética inversa de
IBDV actualmente descrito no requiere un virus auxiliar ni otras
proteínas víricas. La transfección de células con los ARN de
sentido positivo de ambos segmentos fue suficiente para generar
virus infeccioso (IBDV). El destino de los uno a cuatro nucleótidos
adicionales, respectivamente, transcritos en el extremo 3' del
segmento A no se determinó. Sin embargo, esto no previno la
replicación del ARNbc vírico. Diferentes investigadores observaron
efectos similares para virus ARN de cadena positiva (Boyer, J.C.,
et al., Virology, 198, 415-426
(1994)).
La transfección de los ARN de sentido positivo
de ambos segmentos en la misma célula era necesaria para la
recuperación con éxito del IBDV. Los ARN transfectados de ambos
segmentos se tenían que traducir por la maquinaria celular de
traducción. La poliproteína del segmento A se procesó
presumiblemente a las proteínas VP2, VP3 y VP4 que forman la
cápside vírica. La proteína traducida VP1 del segmento B
probablemente actuó como una ARN polimerasa dependiente de ARN y
transcribiera las cadenas negativas a partir de las cadenas
positivas sintéticas de ambos segmentos, y los productos de
reacción formaran el ARNbc. Recientemente Dobos describió que la
transcripción in vitro por la ARN polimerasa dependiente de
ARN del virión del virus de la necrosis pancreática infecciosa
(IPNV), un virus prototipo de la familia Birnaviridae, está
cebada por VP1 y después sigue a través de un mecanismo asimétrico,
semiconservador de desplazamiento de la cadena para sintetizar sólo
las cadenas positivas durante la replicación del genoma vírico
(Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). El
sistema presente muestra que la síntesis de las cadenas negativas
sigue en las cadenas positivas. Si el ARN de cadena negativa
transcrito resultante sirve como molde para la transcripción de las
cadenas positivas o no permanece el sujeto de investigación
adicional.
adicional.
Para demostrar que el IBDV infeccioso contenido
en los sobrenadantes de células transfectadas realmente derivaba de
los transcritos sintéticos, se generó una quimera artificial que
contenía el segmento A de una cepa de serotipo II y el segmento B
de una cepa de serotipo I. El análisis de secuencia verificó esta
combinación de genoma. Los resultados también indican que los
motivos terminales de secuencia descritos por Mundt y Müller son
probablemente responsables de la replicación, separación y
empaquetamiento del genoma vírico (Mundt, E. et al.,
Virology, 209, 10-18 (1995)). La presencia de
secuencias terminales específicas de serotipo obviamente no
previene la replicación adecuada del segmento A de serotipo II por
la acción de la ARN polimerasa dependiente de ARN VP1 del segmento
B del serotipo I. La capacidad de crear virus recombinantes ayudará
mucho en analizar la función precisa de las secuencias terminales
específicas de serotipo y comunes a serotipos.
La recuperación de IBDV infeccioso demuestra que
sólo los ARN de cadena positiva de ambos segmentos son suficientes
para iniciar la replicación del ARNbc. De esta manera, los
resultados están de acuerdo con las características generales de la
replicación de reovirus y rotavirus donde los ARN de cadena positiva
sirven como molde para la síntesis de progenie de cadenas negativas
para producir el ARNbc (Schonberg, M., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. Patton, J.T., Virus Res., 6,
217-233 (1986); Chen, D., et al., J.
Virol., 68, 7030-7039 (1994)). Sin embargo, no
se pueden excluir los mecanismos semiconservadores de desplazamiento
de cadena propuestos por Spies y col. y Dobos (Spies, U., et
al., Virus Res., 8, 127-140 (1987);
Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). El
desarrollo de un sistema de genética inversa para IBDV facilitará
mucho los estudios futuros de la expresión génica, patogénesis y
ayudará en el diseño de nuevas generaciones de vacunas de IBDV vivas
e inactivadas.
Como se usa en la presente solicitud, el término
"sintético" aplicado a ácidos nucleicos indica que un ácido
nucleico hecho por el hombre en contraste a un ácido nucleico
natural. El término no implica limitación en el método de
producción, que puede ser químico o biológico, siempre que el método
de producción implique la intervención del hombre.
El término "ADNc" se pretende que abarque
cualquier ADNc que contenga los segmentos A y B y las regiones 5' y
3' no codificantes de los segmentos A y B.
El término "infeccioso" aplicado a virus
indica que el virus tiene la capacidad de reproducirse. El virus
puede ser patogénico o no patogénico y todavía ser infeccioso.
La presente invención proporciona un método para
preparar Birnavirus vivos como se describe en la reivindicación
1.
La presente invención proporciona un plásmido
como se describe en la reivindicación 6.
También se proporciona aquí un método para
preparar una vacuna contra IBDV como se describe en la
reivindicación 7.
También es parte de esta invención una vacuna
como se describe en la reivindicación 11.
El virus se puede inactivar por medios químicos
o físicos. La inactivación química se puede alcanzar tratando el
virus con, por ejemplo, enzimas, formaldehído,
\beta-propionolactona, etilenimina o un derivado
de la misma, un solvente orgánico (por ejemplo, hidrocarburo
halogenado) o un detergente. Si es necesario, la sustancia
inactivadora se puede neutralizar después de haber inactivado el
virus. La inactivación física se puede llevar a cabo sometiendo los
virus a radiación tal como luz UV, radiación X o radiación
\gamma.
El virus se puede atenuar por métodos conocidos
incluyendo pase en serie, deleción de secuencias de ácidos
nucleicos y mutagénesis dirigida antes o después de la producción
del virus infeccioso para producir un virus que mantenga suficiente
antigenicidad pero que tenga virulencia reducida.
Los soportes fisiológicamente aceptables para la
vacunación de aves de corral se conocen en la técnica y no se
necesita describirlos adicionalmente aquí. Además de ser
fisiológicamente aceptable para las aves de corral el soporte no
debe interferir con la respuesta inmunológica inducida por la vacuna
y/o con la expresión de su producto
polipeptídico.
polipeptídico.
La vacuna también puede contener otros aditivos,
tales como adyuvantes y estabilizantes, entre otros, en cantidades
conocidas en la técnica. Preferiblemente, se administran con la
vacuna adyuvantes tales como hidróxido de aluminio, fosfato de
aluminio, aceites vegetales y animales y similares en cantidades
suficientes para potenciar la respuesta inmune al IBDV. La cantidad
de adyuvante añadido variará dependiendo de la naturaleza del
adyuvante, variando en general desde alrededor de 0,1 hasta
alrededor de 100 veces el peso del IBDV, preferiblemente desde
alrededor de 1 hasta alrededor de 10 veces el peso del IBDV.
La vacuna de la presente invención también puede
contener varios estabilizantes. Se puede usar cualquier
estabilizante adecuado incluyendo hidratos de carbono tales como
sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrina o glucosa; proteínas
tales como albúmina o caseína; y tampones tales como fosfato de
metal alcalino y similares. Un estabilizante es particularmente
ventajoso cuando se prepara una preparación de vacuna seca mediante
liofiliza-
ción.
ción.
La vacuna se puede administrar por cualquier
método conocido de inocular aves de corral incluyendo por vía
nasal, oftálmica, mediante inyección, en el agua de beber, en el
pienso, mediante exposición y similares. Preferiblemente, la vacuna
se administra mediante técnicas de administración en masa tales como
colocando la vacuna en el agua de beber o rociando el entorno de
los animales. Cuando se administra mediante inyección, las vacunas
se administran preferiblemente por vía parenteral. Administración
parenteral, como se usa aquí, significa medios de administración
mediante inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o
intraperitoneal.
La vacuna de la presente invención se administra
a aves de corral para prevenir IBD en cualquier momento antes o
después de la eclosión. Preferiblemente, la vacuna se administra
antes del momento del nacimiento y después de que el animal tenga
alrededor de 6 semanas de edad. Se definen las aves de corral para
que incluyan pero no estén limitadas a pollos, gallos, gallinas,
pollos de engorde, pollos de asar, criadores, ponedoras, pavos y
patos.
La vacuna se puede suministrar en un envase
estéril en forma unitaria o en otras cantidades. Preferiblemente se
almacena congelada, por debajo de -20ºC, y más preferiblemente por
debajo de -70ºC. Se descongela antes del uso y se puede volver a
congelar inmediatamente después. Para la administración a aves de
corral el virus producido de forma recombinante se puede
resuspender en un soporte en una cantidad de alrededor de 10^{4}
a 10^{7} ufp/ml, y más preferiblemente alrededor de 10^{5} a
10^{6} ufp/ml en un soporte tal como solución salina. La vacuna
inactivada puede contener el equivalente antigénico de 10^{4} a
10^{7} ufp/ml resuspendido en un soporte. También se pueden
utilizar otros soportes como se conoce en la técnica. Los ejemplos
de soportes farmacéuticamente aceptables son diluyentes y soportes
farmacéuticos inertes conocidos en la técnica. Preferiblemente, el
soporte o diluyente es uno compatible con la administración de la
vacuna mediante técnicas de administración en masa. Sin embargo, el
soporte o diluyente también puede ser compatible con otros métodos
de administración tales como inyección, gotas oculares, gotas
nasales y similares.
Se pueden producir vacunas de combinación con el
material del IBDV. El material del IBDV se puede combinar con
material antigénico del virus de la enfermedad de Newcastle, el
virus de la bronquitis infecciosa, reovirus, adenovirus y/o el
virus de Marek.
Las formas de realización anteriores de la
presente invención se describen adicionalmente en los siguientes
ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada por
los ejemplos y las variaciones serán aparentes para los expertos en
la materia sin separarse del ámbito de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es un diagrama esquemático de las
construcciones de ADNc usadas para la síntesis de los ARNmc de
sentido positivo de IBDV con la ARN polimerasa de T7. La
construcción pUC19FLAD78 contiene el ADNc del segmento A de la cepa
D78 de IBDV y el plásmido recombinante pUC18FLA23 contiene el ADNc
de longitud total del segmento A de la cepa 23/82 de IBDV. El
segmento A de IBDV codifica la poliproteína
(VP2-VP4-VP3) y la proteína
recientemente identificada VP5. El plásmido pUC18FLBP2 contiene el
ADNc del segmento B de la cepa P2 que codifica la ARN polimerasa
dependiente de ARN (VP1). Las secuencias específicas del virus están
subrayadas y las secuencias del promotor de T7 están en cursiva.
Los sitios de restricción se muestran en negrita y se identifican.
Los sitios de corte de los plásmidos linearizados se muestran
mediante flechas verticales y las direcciones de transcripción se
marcan mediante flechas horizontales.
La figura 2 muestra un análisis en gel de
agarosa de los productos de la reacción de transcripción que se
usaron para la transfección de células Vero. ARN sintéticos
transcritos in vitro usando la ARN polimerasa de T7 y los
plásmidos linearizados pUC19FLAD78 (carriles 2, 4 y 6) que contienen
el ADNc del segmento A de la cepa D78 de IBDV y pUC18FLBP2
(carriles 1, 3 y 5) que contienen el ADNc del segmento B de la cepa
P2 de IBDV, respectivamente. Después de la transcripción, las
mezclas de reacción bien se trataron con DNasa (carriles 1 y 2),
RNasa (carriles 3 y 4) o se dejaron sin tratar (carriles 5 y 6). Se
analizaron dos \mul de los productos de reacción en un gel de
agarosa al 1%. Como marcador se usó ADN de lambda digerido con Hind
III/EcoR I (carril M).
La figura 3 muestra una comparación de las
secuencias de nucleótidos de los fragmentos clonados por
RT-PCR de los segmentos A y B de la cepa quimérica
de IBDV 23A/P2B (en negrita) con secuencias conocidas de los
segmentos A y B de la cepa 23/82 del serotipo II y la cepa P2 del
serotipo I, respectivamente. Las identidades de los nucleótidos se
marcan mediante dos puntos.
La figura 4 muestra la secuencia de ADN de
pUC18FLA23.
La figura 5 muestra la secuencia de ADN de
pUC19FLAD78.
La figura 6 muestra la secuencia de ADN de
pUC18FLBP2.
\vskip1.000000\baselineskip
Virus y células. Se propagaron en células
embrionarias de pollo (CEC) dos cepas de serotipo I de IBDV, la
cepa atenuada P2 de Alemania y la cepa de vacuna D78 (Intervet
International), y una cepa de serotipo II, la cepa apatogénica
23/82 y se purificaron (Mundt, E. et al., Virology,
209, 10-18 (1995); Vakharia, V.N., et al.,
Virus Res., 31, 265-273 (1994)). Se hicieron
crecer células Vero en medio M199 suplementado con suero fetal de
ternera (SFT) al 5% y se usaron para los experimentos de
transfección. La propagación adicional de los virus recuperados y
los estudios de inmunofluorescencia se llevaron a cabo en células
Vero (Mundt, E., et al., J. Gen. Virol., 76,
437-443, (1995)). Para los ensayos en placa, se
prepararon y usaron monocapas de CEC secundarias (Müller, H., et
al., Virus Res., 4, 297-309 (1986)).
Construcción de clones de ADNc del genoma
completo de IBDV. Se prepararon de forma independiente clones de
ADNc de longitud completa de los segmentos A y B de IBDV. Se
prepararon clones de ADNc que contenían la región codificante
entera del ARN del segmento A de la cepa D78 usando procedimientos y
métodos de clonación estándar (Vakharia, V.N., et al.,
Virus Res., 31, 265-273 (1994)). Al comparar
las secuencias terminales de D78 con las secuencias terminales
recientemente publicadas de otras cepas de IBDV (Mundt, E. et
al., Virology, 209, 10-18 (1995)), se
observó que los clones de ADNc de D78 carecían de los primeros 17 y
los últimos 10 nucleótidos conservados en los extremos 5' y 3',
respectivamente. Por lo tanto, para construir un clon de ADNc de
longitud completa del segmento A, se sintetizaron dos pares de
cebadores (A5'-D78, A5-IPD78 y
A3'-IPD78) y se usaron para la amplificación por
PCR (Tabla 1). Los segmentos de ADN se amplificaron según el
protocolo del suministrador (New England Biolabs) usando
"Polimerasa Deep Vent" (ADN polimerasa termofílica de alta
fidelidad). Los fragmentos amplificados se clonaron en el sitio EcoR
I de un vector pCRII (Invitrogen Corp.) para obtener los plásmidos
pCRD78A5' y pCRD78A3', respectivamente. Cada plásmido se digirió con
EcoR I y Sal I y los fragmentos resultantes se ligaron en pUC19
digerido con EcoR I para obtener el plásmido pUC19FLAD78 (SEQ ID
NO: 27 y 29) que ahora contiene una copia del ADNc de longitud
completa del segmento A que codifica todas las proteínas
estructurales (VP2, VP4 y VP3, SEQ ID NO: 30) así como la proteína
no estructural VP5 (SEQ ID NO: 28)
(Fig. 1).
(Fig. 1).
Se usaron dos pares de cebadores
(A5'-23, A5IP23 y A3'-23,
A3-IP23, véase la tabla 1) para la transcripción
inversa (RT) del ARNbc genómico vírico de la cepa 23/82 usando
"SuperScript RT II" (ADN polimerasa dirigida por ARN con
actividad RNasa H reducida, GIBCO/BRL). Los productos de la reacción
de RT se purificaron mediante extracción con fenol/cloroformo y
precipitación con etanol. Para obtener dos fragmentos de ADNc unidos
por los pares de cebadores A5'-23, A5IP23 y
A3'-23, A3-IP23, respectivamente,
los productos de la reacción de RT se amplificaron mediante PCR
usando la "polimerasa Deep Vent". Tanto la RT como la PCR se
llevaron a cabo según el protocolo del suministrador. Los
fragmentos de PCR resultantes se ligaron mediante extremos romos en
el vector pUC18 cortado con Sma I para obtener pUC23A5' y pUC23A3'.
El extremo 3' del segmento A contenido en el plásmido pUC23A3' se
ligó en el plásmido pUC23A5' cortado con Hind
III-BstB I para establecer el ADNc de longitud
completa del segmento A de la cepa 23/82. El plásmido resultante se
denominó pUC18FLA23 (SEQ ID NO: 31 y 33) (Fig. 1) y codifica las
proteínas estructurales VP2, VP4 y VP3 (SEQ ID NO: 32) así como la
proteína no estructural VP5 (SEQ ID NO: 34).
Para obtener clones de ADNc del segmento B de la
cepa P2, se diseñaron dos pares de cebadores
(B5'-P2, B5-IPP2 y
B3'-P2, B3-IPP2) según las
secuencias publicadas y se usaron para amplificación por
RT-PCR (véase la tabla 1). Usando ARNbc genómico
como molde, se sintetizaron fragmentos de ADNc y se amplificaron
según el protocolo del suministrador (Perkin-Elmer
Cetus). Los fragmentos amplificados se ligaron a través de extremos
romos en el vector pBS (Stratagene) cortado con Sma I para obtener
los clones pBSP2B5' y pBSP2B3'. Para construir un clon de longitud
completa del fragmento B, el fragmento del extremo 5' del plásmido
pBSP2B5' se subclonó primero entre los sitios EcoR I y Pst I del
vector pUC18 para obtener pUCP2B5'. Después el fragmento del extremo
3' del plásmido pBSP2B3' se insertó entre los sitios únicos Bgl II
y Pst I del plásmido pUCP2B5' para obtener un plásmido de longitud
completa pUC18FLBP2 (SEQ ID NO: 25) que codifica la proteína VP1
(SEQ ID NO: 26) (Fig. 1). Los plásmidos pUC18FLBP2, pUC18FLA23 y
pUC19FLAD78 se secuenciaron por completo usando el sistema de
secuenciación de ADN "Sequenasa" (U.S. Biochem), y los datos
de la secuencias se analizaron usando el software "DNASIS"
(Pharmacia) o "PC/Gene" (Intelligenetics). La integridad de las
construcciones de longitud completa se probó mediante transcripción
y traducción in vitro acoplada al sistema de lisado de
reticulocitos usando la ARN polimerasa de T7 (Promega).
Transcripción y transfección de ARN
sintéticos. Se digirieron los plásmidos pUC19FLAD78, pUC18FLA23
y pUC18FLBP2 con las enzimas BsrG I, Nsi I y Pst I (véase la figura
1), respectivamente, y se usaron como moldes para la transcripción
in vitro con ARN polimerasa de T7 (Promega). Brevemente, los
ensayos de corte con enzimas de restricción se ajustaron a SDS al
0,5% y se incubaron con proteinasa K (0,5 mg/ml) durante 1 hora a
37ºC. Los moldes de ADN linearizados (\sim3 \mug) se
recuperaron después de precipitar con etanol, y se añadieron por
separado a una mezcla de reacción de transcripción (50 \mul) que
contenía Tris-HCl 40 mM (pH 7,9), NaCl 10 mM,
MgCl_{2} 6 mM, espermidina 2 mM, ATP, CTP y UTP cada uno 0,5 mM,
GTP 0,1 mM, análogo del grupo de protección [m7G(5')
PPP(5') G] 0,25 mM, "RNasin" (inhibidor de ribonucleasa)
120 unidades, ARN polimerasa de T7 150 unidades (Promega), y se
incubaron a 37ºC durante 1 hora. Los transcritos de ARN sintético se
purificaron mediante extracción con fenol/cloroformo y
precipitación con etanol. Como controles, los productos de
transcripción se trataron con DNasa o RNasa (Promega) antes del
paso de purificación.
Se hicieron crecer células Vero hasta el 80% de
confluencia en placas de 60 mm y se lavaron una vez con solución
salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadieron tres ml de
"OPTI-MEM I" (medio con suero reducido que
contiene tampón HEPES, bicarbonato de sodio, hipoxantina, timidina,
piruvato de sodio, L-glutamina, oligoelementos,
factores de crecimiento y rojo fenol; de GIBCO/BRL) a las monocapas
y las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora en un incubador de
CO_{2}. Simultáneamente, se incubaron en un tubo de poliestireno
0,15 ml de "OPTI-MEM I" con 1,25 \mug de
reactivo "Lipofectina" (cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil-N,N,N-trimetilamonio
y dioleoilfosfatidiletanolamina, GIBCO/BRL) durante 45 minutos a
temperatura ambiente. Se añadieron los transcritos de ARN sintético
de ambos segmentos, resuspendidos en 0,15 ml de agua tratada con
pirocarbonato de dietilo, a la mezcla de
OPTI-MEM-Lipofectina, se mezclaron
suavemente y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Después de
eliminar el "OPTI-MEM" de las monocapas en las
placas de 60 mm y cambiarlo con 1,5 ml de
"OPTI-MEM" fresco, la mezcla que contenía los
ácidos nucleicos se añadió gota a gota a las células Vero y se agitó
suavemente. Después de dos horas de incubación a 37ºC, la mezcla se
cambió por medio M199 [CaCl_{2} (anhídrido),
Fe(NO_{3})_{3} 9H_{2}O, KCl, MgSO_{4}
(anhídrido), NaCl, NaH_{2}PO_{4}H_{2}O, NaHCO_{3},
L-alanina, L-arginina HCl, ácido
L-aspártico, L-cisteína HCl
H_{2}O, L-cisteína 2HCl, ácido
L-glutámico, L-glutamina, glicina,
L-histidina HCl H_{2}O,
L-hidroxiprolina, L-isoleucina,
L-leucina, L-lisina HCl,
L-metionina, L-fenilalanina,
L-prolina, L-serina,
L-treonina, L-triptófano,
L-tirosina 2Na 2H_{2}O, L-valina,
alfa tocoferol PO_{4} Na_{2}, ácido ascórbico, biotina,
calciferol, pantotenato de D-calcio, cloruro de
colina, ácido fólico, I-inositol, menandiona
NaHSO_{3} 3H_{2}O, niacina, nicotinamida, ácido
para-aminobenzoico, piridoxina HCl, riboflavina,
tiamina HCl, acetato de vitamina A, adenina SO_{4}, ácido
adenílico, ATP, Na_{2}, colesterol,
2-desoxi-D-ribosa,
D-glucosa, glutatión, guanine HCl, hipoxantina Na,
rojo fenol Na, ribosa, acetato de sodio (anhídrido), timina, Tween
80, uracilo y xantina Na; de Mediatech, Inc.] que contenía SFT al 5%
(sin lavar las células) y las células se incubaron adicionalmente a
37ºC durante los intervalos de tiempo
deseados.
deseados.
Identificación de IBDV generados. Se
infectaron CEC con sobrenadante filtrado (0,2 \mum) de células
Vero transfectadas con los transcritos de pUC18FLA23 y pUC18FLP2B.
16 horas después de la infección se aislaron los ácidos nucleicos
totales de la célula (Mundt, E. et al., Virology, 209,
10-18 (1995)). Se diseñaron cebadores según las
secuencias publicadas y se amplificaron fragmentos por
RT-PCR, se clonaron y se secuenciaron (Mundt, E.
et al., Virology, 209, 10-18 (1995)).
Los datos de secuencia se analizaron usando el software
"DNASIS".
Inmunofluorescencia. Se infectaron
células Vero, crecidas en cubreobjetos hasta el 80% de confluencia,
con los sobrenadantes derivados de células Vero transfectadas
(después de congelación-descongelación) y se
incubaron a 37ºC durante dos días. Las células se lavaron después,
se fijaron con acetona y se trataron con suero policlonal de conejo
anti-IBDV. Después de lavar, las células se trataron
con un anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con
fluoresceína (Kirkegaarg & Perry Lab.) y se examinaron mediante
un microscopio confocal.
Ensayo en placa. Se inocularon monocapas
de CEC, crecidas en placas de 60 mm, con los sobrenadantes derivados
de células Vero transfectadas. Después de 1 hora de infección, las
células se lavaron una vez con PBS y se recubrieron con agar noble
(Difco) al 0,8% que contenía caldo de fosfato de triptosa al 10%,
SFT al 2%, NaHCO_{3} al 0,112%, penicilina 10^{3} unidades,
estreptomicina 10^{3} \mug/ml, fungizona 0,25 \mug/ml, rojo
neutro al 0,005%, rojo fenol al 0,0015%. Las células se incubaron a
37ºC durante 2 a 3 días hasta que se pudieron observar y contar las
placas (Müller, H., et al, Virus Res., 4,
297-309 (1986)).
Construcción de clones de ADNc del genoma
completo de IBDV. Para desarrollar un sistema de genética
inversa para el virus de ARNbc IBDV, se construyeron dos clones
independientes de ADNc que contenían el segmento A de la cepa D78 y
el segmento B de la cepa P2 (Fig. 1). Cada plásmido codificaba bien
el precursor de las proteínas estructurales (VP2, VP4, VP3) y VP5 o
sólo la proteína VP1 (ARN polimerasa dependiente de ARN). El
plásmido pUC18FLBP2 tras la digestión con Pst I y transcripción
in vitro mediante la ARN polimerasa de T7, produciría ARN
que contiene los extremos 5' y 3' correctos. Mientras que, tras
digestión con BsrG I y transcripción, el plásmido pUC19FLAD78
produciría ARN que contiene el extremo 5' correcto pero con cuatro
nucleótidos adicionales en el extremo 3'. La transcripción y
traducción acopladas de los plásmidos anteriores en un sistema de
reticulocitos de conejo produjo productos proteicos que se
procesaban correctamente y comigraron con las proteínas marcadores
de IBDV después de fraccionamiento en un gel de
SDS-poliacrilamida y autorradiografía (datos
no
mostrados).
mostrados).
Transcripción, transfección y generación de
virus infecciosos. Se sintetizaron por separado in vitro
transcritos de sentido positivo de los segmentos A y B de IBDV con
la ARN polimerasa de T7 usando plásmidos de ADNc de longitud
completa linearizados como moldes (véase la figura 2). Aunque se
observaron dos especies de transcritos de ARN para el segmento B en
un gel neutro (carriles 1 y 5), el fraccionamiento de estas muestras
en un gel desnaturalizante produjo sólo una banda de transcrito
específico (datos no mostrados). Para mostrar que los transcritos
de ARN de sentido positivo de ambos segmentos son necesarios para la
generación de virus infecciosos, las mezclas de transcripción se
incubaron con diferentes nucleasas, como se muestra en la figura 2.
Los ARN sintéticos recuperados después de tratar los productos de
transcripción con DNasa (carriles 1+2), RNasa (carriles 3+4) o sin
tratamiento (carriles 5+6) se usaron para la transfección de células
Vero. Como control de simulación, se usó Lipofectina sola. Cinco
después de la transfección, el efecto citopático (ECP) sólo era
visible en células Vero transfectadas con transcritos combinados de
productos de transcripción sin tratar o tratados con DNasa, pero no
con mezclas de transcripción tratadas con RNasa o el control de
transfección simulada. Además, no se detectó ECP cuando las células
Vero se transfectaron con ARN de sólo el segmento A o el B (datos
no mostrados). Estos resultados demuestran que la replicación de
IBDV sucedió después de la transfección de células Vero con ARNmc
de sentido positivo de ambos segmentos de IBDV. Para verificar que
el agente causante del ECP en células Vero era realmente el IBDV,
se congelaron-descongelaron células Vero
transfectadas, y los sobrenadantes se clarificaron mediante
centrifugación y se usaron para infectar CEC o células Vero. Las CEC
infectadas con los sobrenadantes derivados de células Vero
transfectadas de mezclas de transcripción sin tratar o tratadas con
DNasa produjeron ECP un día después de la inoculación (Tabla 2). Sin
embargo, no se pudo detectar ECP incluso después de cinco días en
CEC, con los sobrenadantes de células Vero transfectadas con mezclas
de transcripción tratadas con RNasa, mezclas de transcripción del
segmento A o B sin tratar y células Vero con transfección simulada.
De forma similar, cuando se infectaron células Vero en cubreobjetos
con los mismos sobrenadantes descritos anteriormente y se
examinaron mediante tinción de inmunofluorescencia después de dos
días, sólo los sobrenadantes derivados de células Vero transfectadas
con mezclas de transcripción sin tratar o tratadas con DNasa dieron
señal positiva de inmunofluorescencia
(Tabla 2).
(Tabla 2).
Recuperación de virus transfectante. Para
determinar el tiempo para la recuperación del virus infeccioso, se
transfectaron células Vero con transcritos combinados de ARN de los
segmentos A y B. A las 4, 8, 16, 24, 36 y 48 horas después de la
transfección, se examinó la presencia de virus transfectante en los
sobrenadantes mediante ensayos de infectividad y en placa, como se
muestra en la tabla 3. Los resultados indican que los virus se
pudieron recuperar tan pronto como 36 horas después de la
transfección. El título del virus era de 2,3 x 10^{2} ufp/ml que
parece caer para muestras obtenidas más de 48 horas después de la
transfección.
Generación de un virus quimérico. Para
demostrar que los ARNmc de sentido positivo de ambos segmentos de
IBDV son suficientes para la recuperación de virus infeccioso, se
generó un IBDV quimérico. Se linearizó el plásmido pUC18FLA23 que
contenía una secuencia de longitud completa del segmento A de una
cepa de serotipo II mediante digestión con Nsi I y se sintetizó
ARNmc in vitro usando la ARN polimerasa de T7. El transcrito
de ARNmc especifica el extremo 5' correcto pero contiene un residuo
adicional en el extremo 3' (Fig. 1). Se transfectaron células Vero
con el ARNmc del segmento A de la cepa 23/82 del serotipo II y el
ARNmc del segmento B de la cepa P2 de serotipo I. Cinco días
después de la transfección, cuando el ECP era evidente, se clarificó
el sobrenadante (después de
congelación-descongelación) y se usó para infectar
CEC. Después de un segundo pase en CEC, el ARN genómico del virus
se analizó mediante RT-PCR y secuenciación de los
productos de PCR. Se diseñaron cebadores para el segmento A para
amplificar específicamente sólo secuencias del segmento A derivadas
de la cepa de serotipo II. Los cebadores para el segmento B se
unían a secuencias de ambos serotipos. Los fragmentos amplificados
se clonaron y secuenciaron. Las secuencias del segmento A obtenidas
mostraron un emparejamiento perfecto con secuencias conocidas del
segmento A de la cepa 23/82 de serotipo II, mientras que la
secuencia del segmento B mostró homología completa a secuencias
publicadas del segmento B de la cepa P2 de serotipo I (Fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se transfectaron células Vero con los ARN
sintéticos de los segmentos A y B derivados de reacciones de
transcripción que se dejaron sin tratar o se trataron con DNasa o
RNasa. Después de 5 días se recogieron los sobrenadantes, se
clarificaron mediante centrifugación y se analizó la presencia del
virus. La infectividad del virus recuperado se determinó en CEC
mediante la aparición de efecto citopático (ECP) 1-2
días después de la inoculación. La especificidad del virus
recuperado se determinó mediante tinción de inmunofluorescencia de
células Vero infectadas con suero de conejo
anti-IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron células Vero con los ARN
sintéticos de los segmentos A y B como se ha descrito. La
infectividad y especificidad del virus recuperado se detectaron
mediante CPE en CEC y tinción de inmunofluorescencia en células
Vero, respectivamente. Se usaron monocapas de CEC secundarias para
el ensayo en placa después de inocular las células con los
sobrenadantes derivados de células Vero transfectadas. Se calculó el
título aproximado del virus como unidades formadoras de placa por
ml (ufp/ml).
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: VAKHARIA, Vikram N.
\hskip4cmMUNDT, Egbert
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN MÉTODO PARA GENERAR BIRNAVIRUS A PARTIR DE TRANSCRITOS DE ARN SINTÉTICOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 34
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: NIKAIKO, MARMELSTEIN, MURRAY & ORAM LLP
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 655, Fifttenth Steet, N.W., Suite 330 - G Street Lobby
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUIDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20005-5701
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD PRESENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KITTS, Monica C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.105
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P8172-6002
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFÓNO: 202/638-5000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 202/638-4810
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2827 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 112..2745
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 878 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3261 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 97..531
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3261 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 131..3166
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1012 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3264 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 97..531
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3264 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 131..3169
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1013 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Un método para preparar Birnavirus vivos, en
donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa (IBDV),
que comprende los siguientes pasos:
- -
- preparar ADNc de los segmentos A y B del genoma del Birnavirus,
- -
- transcribir dichos ADNc para producir transcritos sintéticos de ARN, en donde dichos transcritos de ARN son transcritos de ARN de sentido positivo de dichos segmentos A y B,
- -
- transfectar células huésped con dichos transcritos sintéticos de ARN, incubar dichas células huésped en un medio de cultivo, y
- -
- aislar el Birnavirus infeccioso vivo de dicho medio de cultivo.
2. El método según la reivindicación 1, en donde
dichas células huésped son células Vero de mono verde africano.
3. Un método para preparar Birnavirus quiméricos
vivos, en donde el Birnavirus es el virus de la bursitis infecciosa
(IBDV), el método comprende los pasos del método de la
reivindicación 1, en donde en el primer paso dichos ADNc de los
segmentos A y B del genoma de Birnavirus se preparan de forma
independiente a partir de diferentes cepas de Birnavirus.
4. El método de la reivindicación 3, en donde
dicho segmento A está presente en los plásmidos de SEQ ID NO: 27 y
29, o en SEQ ID NO: 31 y 33.
5. El método según la reivindicación 3, en donde
dicho segmento B está presente en el plásmido de SEQ ID NO: 25.
6. Un plásmido seleccionado del grupo que
consiste en SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 y 33.
7. Un método para preparar una vacuna contra
IBDV que comprende un IBDV quimérico vivo, dicho método comprende
el paso de mezclar el IBDV quimérico vivo obtenible mediante el
método de la reivindicación 3 con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
8. El método según la reivindicación 7, en donde
el IBDV quimérico está inactivado.
9. El método según la reivindicación 8, en donde
la inactivación del IBDV quimérico vivo se alcanza mediante
inactivación química.
10. El método según la reivindicación 8, en
donde la inactivación del IBDV quimérico vivo se alcanza mediante
sometimiento a radiación seleccionada de entre luz UV, radiación X y
radiación \gamma.
11. Una vacuna para la protección de aves de
corral contra IBDV, que comprende un IBDV quimérico vivo obtenible
mediante el método de la reivindicación 3.
12. La vacuna según la reivindicación 11, en
donde dicho IBDV está inactivado.
13. La vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 11 ó 12, que comprende además un estabilizante.
14. La vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 11-13, que comprende además un
adyuvante.
15. Uso de un IBDV quimérico vivo obtenible
mediante el método de la reivindicación 3, para la fabricación de
una vacuna para la protección de aves de corral contra IBDV.
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