CZ74299A3 - Způsob přípravy Birnavirusu, živý virus, syntetická RNA, transfekce, cDNA, rekombinantní vektor, buňka, vakcína - Google Patents

Způsob přípravy Birnavirusu, živý virus, syntetická RNA, transfekce, cDNA, rekombinantní vektor, buňka, vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ74299A3
CZ74299A3 CZ99742A CZ74299A CZ74299A3 CZ 74299 A3 CZ74299 A3 CZ 74299A3 CZ 99742 A CZ99742 A CZ 99742A CZ 74299 A CZ74299 A CZ 74299A CZ 74299 A3 CZ74299 A3 CZ 74299A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leo
virus
alas
ser
cdna
Prior art date
Application number
CZ99742A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ299417B6 (cs
Inventor
Vikram N. Vakharia
Egbert Mundt
Original Assignee
University Of Maryland-Biotechnology Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Of Maryland-Biotechnology Institute filed Critical University Of Maryland-Biotechnology Institute
Publication of CZ74299A3 publication Critical patent/CZ74299A3/cs
Publication of CZ299417B6 publication Critical patent/CZ299417B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/826—Bacterial vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Virus infekční choroby bursy (IBDV), člen rodiny Birnaviridae, je kauzativní činitel imunosupresivních chorob mladých kuřat.
jiř , Dosavadní stav techniky
Virus infekční choroby bursy (IBDV), člen rodiny Birnaviridae, je kauzativní činitelem imunosupresivních chorob mladých kuřat (Kibenge, F.S.B., a kol., J.Gen. Vir.,
69, 1757-1775 (1988)). Infekční onemocnění bursy (IBD) nebo Gumboro nemoc jsou charakterizovány destrukcí lymfoidních folikulů ve Fabriciově burse. V plně přístupném_.
hejnu kuřat o stáří 3-6 týdnů způsobí klinická choroba těžkou imunosupresi a je odpovědná za ztráty kvůli zhoršenému růstu, sníženou efektivitu krmení a smrt. Citlivá kuřata mladší než 3 týdny nevykazují viditelné klinické znaky choroby, ale mají patrnou infekci charakterizovanou výrazným poškozením bursy.
Virus, který je spojený se symptomy choroby, se nazývá virus infekční choroby bursy (IBDV). IBDV je patogen s velkým ekonomickým významem z hlediska národního i světového drůbežářského průmyslu. Způsobuje silnou imunodeficienci u mladých kuřat destrukcí prekurzoru B buněk tvořících protilátky ve Fabriciově burse. Imunosuprese způsobí zvýšnou citlivost k jiným chorobám a ovlivňuje účinnost očkování proti Newcastle chorbě, Markově chorobě a virům infekční bronchitidy.
* Jsou známy dva serotypy IBDV. Viry serotypu I jsou patogenní pro kuřata, zatímco^ viry serotypu II infikují kuřata a krocany. Infekce krocanů nemá, v současnosti , klinický význam.
IBDV patři ke skupině virů nazývaných Birnaviridae, která obsahuje i další dvousegmentové RNA viry, jako virus infekční nekrózy pankreatu (ryba), tellina virus, ústřicový virus (mollusk ústřice) a virus X octomilky (ovocná muška). Tyto viry obsahují vysokomolekulární (MW) genom tvořený dvouvláknovou RNA.
Kapsida IBDV viru se skládá z několika strukturních proteinů. Bylo popsáno až devět struktur proteinů, ale je dokázáno, že některé z nich mohou mít vztah prekurzorprodukt (Kibenge, F.S.B., a kol., J. Gen. Virol., 69, 1757-1775 (1988)). Označení a molekulové hmotnosti virových proteinů (VP) jsou uvedeny níže.
• ···
0 ·*
Virový protein Molekulární hmotnost
VP1 90 kDa’
VP2 41 kDa
VP3 32 kDa
VP4 29 kDa
VP5 17 kDa
V genomu IBDV byly identifikovány dva úseky dvouvláknové RNA . Genom IBDV je tvořen dvěma úseky dvouvláknové RNA, která se mění mezi 2827 (část B) a 3261 (část A) párů nukleotidových baží (Mundt, E. a kol., Virology—20.9.-l-QM-8-f-l-99ó-))^Větší úsek A kóduje polyprotein, který je štěpen autoproteolýzou na zralou formu virových proteinů VP2, VP3 a VP4 (Hudson, P.J. a kol., Nucleic Acids Res., 14, 5001-5012 (1986). VP2 a VP3 jsou hlavní strukturní virové proteiny. VP2 je hlavní hostitelsky ochranný imunogen pro IBDV a obsahuje antigenní oblast zodpovědnou za indukci neutralizačních protilátek (Azad, a kol., Virology, 161, 145-152 (1987)). Druhý otevřený čtecí rámec (ORE), předcházející a částečně překrývající se polyproteinové geny, kóduje protein (VP5) neznámé funkce který je přítomný v infikovaných buňkách IBDV (Mundt, E., a kol., J. Gen. Virol., 76, 437-443, (1995)). Menší úsek B kóduje VP1, 90-kDa polyfunkční protein s polymerázou a čepičkovou enzymovou aktivitou (Spies, U., a kol., Vir Res., 8, 127-140 (1987); Spies, U., a kol., J. Gen. Virol., 71, 977-981 (1990)).
Bylo demonstrováno, že VP2 protein je důležitý hostitelský ochranný imunogen pro IBDV a že obsahuje antigenní oblast zodpovědnou za indukci neutralizačních protilátek. Oblast obsahující neutralizační místo je značně závislá na konformaci. VP3 protein byl považován skupinově specifický antigen, protože je rozpoznáván monoklonálními protilátkami působícími proti němu z linií obou serotypů I a II virů. VP4 protein se jeví jako virově kódovaná proteáza, která se účastní zpracování polyproteinového prekurzoru proteinů VP2, VP3 a VP4.
Ačkoliv byly publikovány nukleotidové sekvence pro genomové segmenty A a B různých IBDV linií až v poslední době byly kompletně určeny obě 5'- a 3'-nekódující • * · · ♦ · · ·
I úseky obou segmentů. 5'-nekódující oblast IBDV částí A a B obsahuje shodné úseky 32
I nukleotidů, zatímco 3'-nekódující koncové úseky obou částí jsou nepodobné, ale
I zachované mezi liniemi viru IBDV stejného serotypu (Mundt, E. a kol, Virology, 209, ΙΟΙ 18 (1995)). Tyto konce by mohli obsahovat úseky důležité při sbalování a při regulaci
I genové exprese viru IBDV, jak je to prokázáno u jiných dsRNA virů, jako reoviry savců a
I rostlin a rotaviry (Anzola, a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 8301-8305 (1987); Zou,
I S., a kol., Virology, 186, 377-388 (1992); Gorziglia, M.I., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.
USA, 89, 5784-5788 (1992)).
V posledních letech bylo vyrobeno množství infekčních zvířecích RNA virů z klonované cDNA použitím transkriptů produkovaných DNA-dependentní RNA polymeřázou (Boyer, J.C., a kol, Virology, 198, 415-426 (1994)). Například polioviry, /řetězcový RNA virus; chřipkový virus, segmentovaný -řetězcový RNA virus; virus vztekliny, nesegmentovaný -řetězcový RNA virus; všechny byly získány z klonované cDNA vlastních genomů (van der Werf, S., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 23302334 (1986); Enami, M., a kol., proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990); Schnell, M.J., a kol., EMBG J., 13, 4195-4205 (1994)). U reovirů bylo prokázáno, že transfekce buněk kombinací ssRNA, dsRNA a in vitro přeložený reovirus produkuje vytvořený infekční reovirus pokud je doplněn pomocným virem z rozdílného serotypu Roner, M.R., a kol., Virology, 179, 845-852 (1990)). Avšak doposud není žádná zpráva o získání infekčního viru z vytvořených segmentovaných dsRNA, pouze ze syntetické RNA.
j
Podstata vynálezu i!
Tento vynález se týká viru infekční choroby bursy (IBDV), který způsobuje Gumboro nemoc mladých kuřat. Konkrétně se tento vynález vztahuje k metodě pro konstrukci viru infekční choroby bursy (IBDV) použitím umělé transkripce odvozené z klonované cDNA. Předkládaný vynález usnadní studium regulace exprese genu virů, vytváření virových genů, patogenezi a způsob konstrukce nových typů živých a inaktivovaných vakcín.
Za účelem vyvinutí reverzního genetického systému pro IBDV byly zkonstruovány tři nezávislé klony úplné cDNA, které obsahují část A serotypu I kmene D78 nebo serotypu II kmene 23/82 a část B serotypu I kmene P2. Syntetická RNA částí A a B byla produkována in vitro transkripcí na lineárních plazmidech s T7 RNA • 0
polymerázou. Transkripce těchto částí, buď neupraveně nebo upravené DNasou nebo RNasou, byly určeny pro výstavbu infekčních virů transfekeí buněk Věro.
Současní vynálezci ukázali, že umělé transkripty odvozené z klonované DNA odpovídající úplnému genomu segmentové dsRNA živočišného viru může vést k replikace schopnému viru. Obnovení infekčního viru po transfekci buněk syntetickou +RNA odvozenou z klonované cDNA viru s dsRNA genomem (IBDV) uzavírá hledání reverzního infekčního systému pro RNA viry. Rada vynálezů vystavěla infekční živočišné RNA viry z klonované cDNA (Boyer, J.G., a kol., Virology, 198, 415-426 (1994)). Van der Werf a kol. byly první, kteří vytvořili poliovirus , +řetězcový RNA virus, použitím syntetické RNA vyprodukované T7 RNA polymerázou z nakloňovaného templátu cDNA (van der Werf, S., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 2330-2334 (1986)). Později Enami a kol. vyjmuli chřipkový virus, úsek -řetězcového RNA viru (Enami, M., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990)); a Chnell a kol. vytvořili virus vztekliny, nerozdělený -řetězcový RNA virus, z klonovaných cDNA jejieh genomů (Schnell, M. J., a kol., EMBO J., 13, 4195-4205 (1994)). Roner a kol. rozvinuly infekční metodu pro rozdělený dsRNA reovirus spočívající v transfekci buněk kombinací syntetických ssRNA, dsRNA, in vitro transkribované produkty reoviru produkty a spojený s pomocným virem rozdílného serotypu (Roner, M.R., a kol., Virology, 179, 845-852 (1990)). Výsledný virus byl rozlišen od pomocného viru destičkovým rozborem. Avšak v tomto systému bylo užití pomocného viru nutné. Na rozdíl od toho nyní popsaný reverzní genetický systém pro IBDV nevyžaduje pomocný virus nebo virové proteiny. Transfekce buněk +RNA obou segmentů úspěšně vytvořila infekční vir (IBDV). Původ přidaných jednoho nebo čtyř nukleotidů na 3'-konci části A nebyl zjištěn. Avšak toto nezabránilo replikaci virové dsRNA. Podobné efekty byly pozorovány u +řetězcových RNA virů v různých studiích (Boyer, J.C., a kol., Virology, 198, 415-426 (1994)).
Transfekce +RNA obou segmentů téže buňky byla nezbytná pro úspěšnou produkci IBDV. Transfektované RNA obou segmentů musely být přeloženy buněčným translačním aparátem. Polyprotein části A byl pravděpodobně transformován do proteinů VP2, VP3 a VP4, které tvoří virový kapsid. Translatovaný protein VP1 části B pravděpodobně fungoval jako RNA dependentní RNA polymeráza a vytvořil -řetězce podle syntetických +řetězců obou segmentů a následně vytvořil výslednou dsRNA. Dobos nedávno oznámil, že in vitro transkripce virionovou RNA-dependentní RNA polymerázou infekčního viru nekrózy pankreatu (IPNV), modelový virus čeledi Birnaviridae, je • · vybavený VP1 a potom přes nesouměmý, polokonzervativní, rozložený mechanizmus k syntéze pouze +řetězců během replikace virového genomu (Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). Současný způsob ukazuje, že se syntéza -řetězců provádí na +řetězcích. Jestli výsledná transkribovaná -řetězcová RNA slouží jako vzor pro transkripci +řetězce zůstává objektem dalšího výzkumu.
K potvrzení, že infekční IBDV obsažený v materiálu transfektovaných buněk byl opravdu odvozen z umělého transkriptu, byla vystavěna umělá představa obsahující A úsek kmene serotypu II a B usek kmene serotypu I. Sekvenční analýza ověřila tuto genomovou kombinaci. Výsledky také naznačují, že terminální sekvenční motivy popsané Mundtem a Mjllerem jsou pravděpodobně odpovědné za replikaci, třídění a sbalování virového genomu (Mundt, E. a kol., Virology, 209, 10-18 (1995). Přítomnost serotypově specifických terminálních sekvencí obvykle nezabrání celkové replikace serotypu II segmentu A působením RNA-dependentní RNA polymerázy VP1 serotypu I segmentu B. Schopnost vytvořit rekombinantní viry významně pomůže při analýze konkrétních přesných funkcí serotypově specifických a serotypově nespecifických terminálních sekvencí.
Obnovení infekčního IBDV ukazuje, že pouze +řetězcové RNA obou segmentů jsou schopné iniciovat replikaci dsRNA. Takže výsledky jsou ve shodě se základními rysy replikací reovirů a rotavirů., kde +řetezcové RNA slouží jako vzor pro syntézu progenních -řetězců k výtěžku dsRNA (Schonberg, M., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. Patton, J.T., Vir Res., 6, 217-233 (1986); Chen, D., a kol., J. Virol., 68, 7030-7039 (1994)). Nicméně semikonzervativní mechanismus řetězcového přemísťování navržený Spiesem a kol. a Dobosem nemůže být vyloučen (Spies, U., a kol., Vir Res., 8, 127-140 (1987); Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). Vývoj reverzního genetického systému pro IBDV hodně usnadní budoucí studium exprese genů, patogenezi a pomůže v návrhování nových generací živých a deaktivovaných IBDV vakcin.
Jak je použito v současné aplikaci, termín „syntetické“ v označení nukleových kyselin vyjadřuje, že nukleová kyselina je vytvořena člověkem, na rozdíl od nukleové kyseliny přírodního původu. Termín nepředpokládá omezení ve způsobu přípravy, který může být chemický či biologický pokud způsob zhotovení zahrnuje zásah člověka.
Termíne „cDNA“ zahrnuje jakékoliv cDNA obsahující segmenty A a B a 5' a 3' nekódované oblasti segmentů A a B.
Termín „infekční“, jak je použito u virů, označuje, že virus má schopnost reprodukce. Virus může být patogenní nebo nepatogenní a stále infekční.
Předložený vynález popisuje způsob pro tvoření viru infekčního onemocnění bursy použitím syntetické transkripce RNA. Tento způsob může být použit ke studiu regulace exprese virového genu, patogeneze a pro navržení nové generace živých nebo deaktivovaných IBDV vakcín.
Předložený vynález zahrnuje rekombinantní vektor obsahující alespoň jednu kopii cDNA ve shodě s předloženým vynálezem. Rekombinantní vektor může také nést další nezbytné sekvence jako sekvenci pro kontrolu exprese, značky, amplifikaČní geny, signální sekvence, promotory apod., jak je obecně známo. Použitelnými vektory pro tento účel jsou plazmidy a viry, jako baculoviry, herpes viry (HVT) a viry neštovic, například virus drůbežích neštovic apod.
Také je zde uvedena hostitelská přeměněná buňka s rekombinantním vektorem předloženého vynálezu nebo hostitelská přeměněná buňka se syntetickou RNA předloženého vynálezu. Hostitelská buňka může být eukaryotická nebo prokaryotičkáT Vhodné příklady jsou E. coli, např. hmyzí buněčná linie Sf-9, kuřecí embryová fibroblastová buňka, kuřecí embryová ledvinová buňka, Věro buňka kočkodana apod.
Částí tohoto vynálezu je také IBDV drůbeží vakcína tvořící drůbeží ochranu množstvím rekombinantně produkovaných virů nebo částí virů, v kterých je virus deaktivován nebo modifikován tak, že není virulentní.
Virus může být deaktivován chemicky nebo fyzikálně. Chemická deaktivace viru může být provedena například enzymy, formaldehydem, β-propiolaktonem, ethyleniminem nebo deriváty těchto látek či pomocí organického rozpouštědla (např. halogenovaného uhlovodíku) a nebo detergentu. Pokud je to nutné, deaktivující látka může být po deaktivaci viru zneutralizována. Fyzikální deaktivace může být provedena působením záření na virus jako je UV záření, rentgenové záření nebo γ záření.
Virus může být oslaben známými metodami zahrnující sériové části, delecí sekvencí nukleových kyselin a bodovou řízenou mutací buď před nebo po produkci infekčního viru, aby byl vytvořen virus, který si zachovává dostatečnou antigenní aktivitu, ale který má redukovanou virulenci.
Fyziologicky akceptovatelné nosiče pro vakcinaci drůbeže jsou obecně známé a není třeba je zde dále popisovat. Kromě toho, že nosič musí být fyziologicky • ·
akceptovatelný drůbeží, nesmí interferovat s imunologickou odpovědí vyvolanou vakcínou a/nebo s expresí jejího polypeptidového produktu.
Ve vakcíně jsou přítomny i další aditiva, jako pomocné látky a stabilizátory, a to v obvyklém množství. Jako nejlepší pomocné látky jsou hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, rostlinné a živočišné oleje apod., které jsou podávány s vakcínou v množství schopném podpořit imunní odpověď k IBDV. Množství pomocných látek přidávaných k vakcíně se bude měnit v závislosti na povaze pomocné látky, nejčastěji v rozsahu od 0.1 do 100 násobku hmotnosti IBDV, spíše však v rozmezí od 1 do 10 násobku hmotnosti IBDV.
Vakcína podle tohoto vynálezu může také obsahovat různé stabilizátory. Je možné použít jakýkoliv vhodný stabilizátor, který obsahuje sacharidy např. sorbitol, mannitol, škrob, sacharázu, dextrin nebo glukózu, rovněž může být použito proteinů např. albumin nebo kasein. Jako vhodný pufr se jeví alkalický fosforečnan apod. Stabilizátor je obzvláště výhodný pokud je suchá vakcína připravena lyofilizací.
Vakcína může být podána jakýmkoliv známým způsobem ockóvaňí”dřuběže např.” ústně, injekčně, pitnou vodou, potravou, působením apod. Výhodné je podat vakcínu hromadně, umístěním vakcíny do pitné vody nebo rozprášením do prostředí zvířat. Pokud je podávána injekcí, je upřednostňováno pareňterální podávání. Pareňterální podávání tak, jak je zde užito, znamená podání intravenosní, intramuskulární nebo intraperitoneální injekcí.
Vakcína podle tohoto vynálezu je podána drůbeži k prevenci IBD kdykoliv před nebo po vylíhnutí. Je obzvláště vhodné pokud je vakcína podána před narozením a následovně ještě v 6 týdnech. Drůbež je definována tak, aby nezahrnovala pouze kohouty, slepice, brojlery, ale i selata, pěstitele, křížence, krocany a kachny.
Vakcína může být uchována ve sterilní nádobě ve formě jednotky nebo jiného množství. Výhodné je uchovávat při teplotě pod -20°C nebo ještě lépe pod -70°C. Vakcína je rozmražena před použitím a může být ihned potom opět zmražena. Pro podávání rekombinantně vyrobeného viru drůbeži, může být suspendován v nosiči v množství od 104 do 107 pfú/ml, a ještě lépe od 105 do 106 pfú/ml v nosiči, kterým může být např. fyziologický roztok. Deaktivovaná vakcína může obsahovat antigeny od 104 do 107 pfú/ml rozpuštěné v nosiči. Jsou použity i jiné nosiče, které jsou obecně známé. Příklady farmaceuticky akceptovatelných nosičů jsou rozpustidla a inertní farmaceutické nosiče, které jsou obvykle užívány. Je výhodné, aby byl nosič nebo rozpustidlo využitelné
pro skupinové podání. Avšak nosič nebo rozpustidlo by měly být také slučitelné s jinými způsoby podávání jako, injekcí, očními kapkami, nosními kapkami, apod.
Vynález může být také použit k produkci kombinovaných vakcín s IBDV. IBDV může být kombinován s antigenovým materiálem viru Newcastle choroby, bronchiálního viru, Reo viru, Adeno viru a/nebo Markova viru.
Předchozí vyčlenění tohoto vynálezu jsou dále popsaná v následujících příkladech. Avšak tento vynález je nejen omezen příklady a odchylky od nich budou jasně kvalifikované v technice bez oddělení od pohledu současného vynálezu.
Podrobný popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 je schématický diagram cDNA použitých pro syntézu +ssRNA IBDV s T7 RNA polymerázou. Konstrukt pUC19FLAD78 obsahuje cDNA segmentu A IBDV kmene D78 a rekombinantní plazmid pUC18FLA23 obsahující úplnou cDNA segmentu A IBDV kmene 23/82. Segment A IBDV kóduje polyprotein (VP2-VP4-VP3) a nedávno identifikovaný VP5 protein. Plazmid pUCl8FLBP2 obsahuje cDNA segmentu B kmeneP2, který kóduje RNA-dependentní RNA polymerázu (VPl). Specifické sekvence viru jsou podtržené a T7 promotorová sekvence je psána kurzívou. Místa restrikce jsou vytištěna tučně a označen. Rozštěpená místa linearizovaných plazmidů jsou označena vertikálními šipkami a směr transkripce je označen horizontální šipkou.
Obrázek 2 ukazuje analýzu agarovým gelem produktů transkripce, které byly použity pro transfekci buněk Věro. Syntetické RNA transkribované in vitro použitím T7 RNA polymerázy a linearizovaného plazmidů pUC19FLAD78 (pruhy 2,4 a 6) obsahující cDNA segmentu A IBDV kmene D78 a pUC18FLBP2 (pruhy 1,3 a 5) obsahující cDNA segmentu B kmene P2. Po skončení transkripce byly reakční směsi upraveny DNasou (pruhy 1 a 2), RNasou (pruhy 3 a 4) nebo ponechány neupraveny (pruhy 5 a 6). Dva μί reakčních produktů byly analyzovány na 1% agarovém gelu. Lambda DNA, spojena s Hind III/EcodR I, byla použita jako značky (pruh M).
Obrázek 3 zobrazuje srovnání nukleotidové sekvence klonovaných RT-PCR fragmentů ze segmentů A a B IBDV kmene 23A/P2B (napsáno tučně) se známou sekvencí segmentů A a B serotypu II kmene 23/82 a serotypu I kmene P. Nukleotidová identita je označena dvojtečkou.
• ·· ·
Obrázek 4 ukazuje DNA sekvenci pUC18FLA23.
Obrázek 5 ukazuje DNA sekvenci pUC19FLAD78.
Obrázek 6 ukazuje DNA sekvenci pUC18FLBP2.
Příklady provedení vynálezu
Příklad I: Viry a buňky
Dva serotypy I kmene IBDV, oslabený P2 kmen z Německa a vakcína kmene D78 (Intervet International) a jeden kmen serotypu II, apatogenní 23/82 kmen, byly namnoženy v embryových buňkách kuřat (CEC) a vyčištěny (Mundt, E. a kol., Virology, 209, 10-18 (1995); Vakharia, V.N., a kol., Vir Res., 31, 265-273 (1994)). Buňky Věro byly pěstovány v substrátu Ml99 doplněném 5 % telecím plodovým sérem (FCS) a použity pro transfekční experimenty. Další propagace získaného viru a imunofluorescenění studie byly prováděny ve Věro buňkách (Mundt, E., a kol., J. Gen. Virol., 76, 437-443, (1995)). Pro destičkovou zkoušku byly připraveny a použity monovrstvy druhotné CEC (Muller, H., a kol., Vir Res., 4, 297-309(1986)).
Příklad 2; Konstrukce kompletních cDNA klonů IBDV genomu
Nezávisle byly připraveny kompletní cDNA klony segmentů A a B viru IBDV. cDNA klony obsahující úplný úsek kódující RNA segmentu A kmene D78 byly připraveny použitím standardních klonovacích postupů a metod (Vakharia, V.N., a kol., Vir Res., 31, 265-273 (1994)). Při srovnáním terminálních sekvenci kmene D78 s nedávno publikovanými terminálními sekvencemi dalších IBDV kmenů (Mundt, E. a kol., Virology, 209, 10-18 (1995)) bylo zjištěno, že D78 cDNA klony postrádají prvních 17 a posledních 10 nukleotidů na 5'-, resp. 3 -koncích. Proto bylo pro konstrukce úplného cDNA klonu segmentu A použito dvou základních párů (A5 -D78, A5-IPD78 a A3'IPD78), které byly syntetizovány a použity pro PCR amplifíkaei (Tabulka 1). DNA segmenty byly amplifíkovány podle protokolu dodavatele (New England Biolabs) použitím „Deep Vent Polymerase“ (vysoce přesná teplomilná DNA polymeráza). Amplifíkované fragmenty byly klonovány na místo EcoRI vektoru pCRII (Invitrogen Corp.), čímž byly získány plazmidy pCRD78A5' a pCRD78A3 '. Všechny plazmidy byly ··«· in ······
-iu- · · · · · ··· · ·· ··· rozděleny EcoR I a Sal I a výsledné fragmenty byly navázány na EcoR I obsahující pUC19, aby byl získán plazmid pUC19FLAD78 (SEQ Π) NOS.27 a 29), který nyní obsahuje úplnou cDNA kopii segmentu A kódující všechny strukturní proteiny (VP2, VP4 a VP3, SEQ ID NO:30), stejně jako nestruktumí VP5 protein (SEQ Π) NO.28) (Obr.I).
Dva základní páry (A5 '-23, A5IP23 a A3 '-23, A3-IP23, tabulka 1) byly použity pro reverzní transkripci (RT) virové genomové dsRNA kmene 23/82 použitím „SuperScript RT Π“ (RNA dependentní DNA polymeráza se sníženou RNasou H aktivitou, GEBCO/BRL). RT reakční produkty byly čištěny extrakcí v systému fenol/chloroform a vysráženy etanolem. K získání dvou cDNA fragmentů ohraničených základními páry A5 -23, A5-EP23 a A3'-23, A3-IP23, byly reakční produkty RT amplifikovány pomocí PCR použitím ,,Deep Vent polymerázy“ RT a PCR byly provedeny podle dodavatelského protokolu. Výsledné PCR fragmenty byly navázány se zarovnanými konci na Srna I rozštěpeného pUC 18 vektoru, aby byly získány pUC23 A' a pUC23 A33 'konec segmentu A obsažený v plazmidu pUC23A' byl navázán na Hind ΙΠ-BstB I rozštěpený plazmid pUC23A5', aby zavedl úplnou cDNA segmentu A kmene 23782. Výsledný plazmid byl označen pUC18FLA23 (SEQ ID NOS:31 a 33) (Obr.I) a kóduje strukturní protein VP2, VP3 a VP4 (SEQ ID NO;32) a nestruktumí protein VP5 (SEQ ID NO:34).
K přípravě cDNA klonů segmentu Β P2 kmene, byly vytvořeny dva základní páry (B5'-P2, B5-IPP2 a B3 -P2, B3-IPP2) podle publikovaných sekvencí a použity pro RT-PCR amplifikaci (Tab. 1). Použitím genómu dsRNA jako vzoru, byly syntetizovány cDNA fragmenty a amplifikovány podle protokolu výrobce (Perkin-Elmer Cetus). Rozšířené fragmenty byly koncově zarovnané navázané na Srna I rozštípnutém pBS vektoru (Stratagen), aby byly získány klony pBSP2B5' a pBSP2B3'. Ke konstrukci úplného klonu segmentu B byl nakloňován 5'-koncový fragment plazmidu pBSP2B3'mezi EcoR I a Pst I místa vektoru pUC18, čímž byl získán pUCP2B5'. Potom byl 3'-konec fragmentu plazmidu pUCP2B3' vsazen mezi jednotlivé Bgl II a Pst I místa plazmidu pUCP2B5' a tak byl získán úplný plazmid pUC18FLBP2 (SEQ ID NO:25), který kóduje VP1 protein (SEQ ID NO:26) (Obr.I). Ke kompletní sekvenaci plazmidů pUC18FLBP2, pUC18FLA23 a pUC19FLAD78 byl použit DNA sekvenční systém „SEQUENASE“ (U.S. Biochem.) a sekvenční data byla analyzována použitím software „DNASIS“ (Pharmacia) nebo „PC/Gene“ (Intelligenetics). Celistvost úplných konstruktů byla testována in vitro ···· • A • A
transkripcí a translací spojeného systému lysátu retikulocytů použitím T7 RNA polymerázy (Promega).
Příklad 3; Transkripce a transfekce syntetických RNA
Plazmidy pUC19FLAD78, pUC18FLA23 a pUC18FLBP2 byly sloučeny s ezymy BsrG I, Nsi I a Pst I (Obr.l) a použity jako templáty pro transkripci in vitro s T7 RNA polymerasou (Promega). Stručně, zkoušky omezení rozštěpu enzymu byly nastaveny 0.5 % SDS a inkubovány proteasou K (0.5 mg/ml) jednu hodinu při 37 °C. Linearizované DNA templáty (-3pg) byly získány srážením etanolem a po oddělení byly přidány k transkripční reakční směsi (50 μΐ) obsahující 40 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCI, 6 mM MgCh, 2 mM spermidinu, 0.5 mM ATP, CTP a UTP každého, 0.1 mM GTP, 0.25 mM analogické čepičky [m7G(5') PPP(5') G], 120 jednotek „RNasinu“ (ribonukleásový inhibitor), 150 jednotek T7 RNA polymerasy (Promega) a inkubovány při 37 °C jednu hodinu. Syntetické RNA transkripty byly vyčištěny extrakcí v systému fenol/chloroform a srážením etanolem. Pro kontrolu byly ještě před čištěním produkty transkripce zpracovány DNasou nebo RNasou (Promega).
Věro buňky byly pěstovány do nárůstu 80 % v 60 mm misce a jednou promyty fosforečnanem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS). Tři ml „OPTI-MEM I“ (redukované sérum obsahující HEPES pufr, uhličitan sodný, hypoxantín, thymin, pyruvát sodný, L-glutamin, stopové prvky, růstový faktor a fenolovou červeň; od firmy GIRCO/BRL) byly přidány k monovrsvě a buňky byly inkubovány při 37 °C jednu hodinu v CO2 inkubátoru. Současně bylo 0 15 ml „OPTI-MEM I“ inkubováno 45 minut v polystyrénové zkumavce při pokojové teplotě s 1.25 pg činidla „Lipofectin“, které obsahuje (N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylammonium chlorid a dioleoylphosphatidyletanolamin, GIBCO/BRL). Syntetické RNA transkripty obou segmentů byly opět suspendovány v 0.15 ml vody obsahující dietyl pyrokarbonát a přidány ke směsi OPTI-MEM-Lipofectin. Tato směs byla pomalu míchána a inkubována 5 minut v ledu. Po odstranění „OPTI-MEM“ z monovrstvy v 60 mm miskách a nahrazení čerstvými 1.5 ml „OPTI-MEM“, byla směs obsahující nukleové kyseliny přidána po kapkách k Věro buňkám a jemně otáčena. Po dvou hodinách inkubace při 37 °C byla směs nahrazena substrátem M199 [CaCL (bezvodý), Fe(NO3)3.9H2O, KCI, MgSO4 (bezvodý), NaCI, NaH2PO4H2O, NaHCO3, L-Alanin, L-Arginin HCl, L-aspartámová kyselina, L-
• fe ·.·»
-12Cystein HCl H2O, L-Cystein 2HC1, L-Glutamová kyselina, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin HCl H2O, L-Hydroxyprolin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin HCl, L-Methionin, LFenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptofan, L-Tyrosin 2Na 2H2O, L-Valin, Alfa tokoferol PO4 Na2, kyselina askorbová, Biotin, Kalciferol, D-Kalcium pantotenát, Cholin chlorid, Kyselina listová, I-Inositol, Menandion NaHSCbJHzO, Niacin, Nicotin amid, Para-aminobenzoová kyselina, Pyridoxin HCl, Riboflavin, Thiamin HCl, Vitamín A Acetát, Adenin SO4, kyselina adenyliková, ATP, Na2, Cholesterol, 2-deoxy-D-ribosa, Dglukosa, Glutathion, Guanin HCl, Hypoxantin Na, Fenolová červeň Na, ribosa, suchý octan sodný, thymin, tween 80, Uráčil a xantin Na; od Mediatech, lne.], který obsahoval 5 % FCS (bez promíchávaných buňek) a buňky byly dále inkubovány při 37 °C v žádoucích časových intervalech.
Identifikace vyrobeného IBDV
CEC byly nakaženy zfiltrovanými materiály Věro buněk tranfektovaných transkripty pUC18FLA23 a pUC18FLP2B. 16 hodin po infekci byly izolovány neporušené buněčné nukleové kyseliny (Mundt, E. a kol., Virology, 209, 10-18 (1995)). Základy byly navrženy podle publikovaných sekvencí a RT-PCR fragmenty byly amplifikovány, nakloňovány a uspořádány (Mundt, E. a kol., Virology, 209, 10-18 (1995)). Sekvenční data byla analyzována použitím software „DNASIS“
Immunofluorescence
Věro buňky vypěstované na krycím sklíčku na 80 %, byly infikovány materiály získanými z transfektovaných Věro buněk (po suchém rozmražení) a inkubovány při 37 °C dva dny. Buňky byly potom promyty, fixovány acetonem a zpracovány s polyklonálním králičím anti-IBDV sérem. Po promytí byly buňky zpracovány s fluoresceinem značenou protilátkou koza-anti-králík (Kirkegaard &Perry Lab.) a zkoumány fluorescenčním mikroskopem.
Destičková zkouška
Monovrstvy sekundární CEC, pěstované na 60 mm misce, byly naočkovány materiály z transfektovaných Věro buněk. Po jedné hodině infekce byly buňky jednou promyty PBS a převrstveny 0.8 % čistým Agarem (Difco) obsahujícím 10 % živný roztok fosforečnanu tryptosy, 2% FCS, 0.112 % NaHCO3, 103 jednotek penicilinu, 103 pg/ml streptomycinu, 0.25 pg/ml řungizonu, 0.005 % neutální červeně, 0.0015 % fenolové červeně. Buňky byly inkubovány při 37 °C 2 až 3 dny dokud se nedaly plaky pozorovat a počítat (Míiller, H., a kol., Vir Res., 4, 297-309 (1986)).
-13• 4444 »4 4444 44' ·· • · · · 4 4 4 4 4 4 • · · *4 4« 4 4 4.4 · «4 4 4 4 »44 44 4 • 4 4 4 « 4 4 ·< · · 44 44« 4» 44
Konstrukce úplných cDNA klonů IBDV genomu
K vyvinutí reverzního genetického systému pro dsRNA viru IBD V, byly zkonstruovány dva nezávislé cDNA klony, které obsahovaly segmenty A kmene D78 a segment B kmene P2 (Obr. 1) Každý plazmid kódoval buď prekurzor strukturních proteinů (VP2, VP4, VP3) a VP5 nebo jenom VP1 protein (RNA-dependentní RNA polymeraza). Plazmid pUC 18FLBP2 při vylouhování s Pst I a transkripcí in vitro pomocí T7 RNA polymerázy by poskytoval RNA obsahující správné 5 - a 3 - konee. Zatímco při vylouhování s BsrG I a trankripci by plazmid pUC19FLAD78 poskytoval RNA obsahující správný 5'-konec, ale s připojenými čtyřmi nukleotidy na 3'-konci. Spojená transkripce a translace zmíněných plazmidů v králičím systému retikulocytů poskytl proteinové produkty, které byly přesně zpracovány a přemístěny značkovacími IBDV proteiny po rozdělení v SDS-polyakrylamidovém gelu a autoradiografií (data nejsou ukázána).
Transkripce, transfekce a produkce infekčního viru.
+transkripty IBDV segmentů A a B byly syntetizovány samostatně in vitro s T7 RNA polymerázou použitím linearizovaných úplných cDNA plazmidů jako templátu (Obř7 2). Ačkoliv v neutrálním gelu byly pozorovány dva druhy RNA transkriptů pro segmenty B (pruhy 1 a 5), dělení vzorků v denaturovaném gelu poskytlo jen jeden transkripčněspecifický pruh (data nejsou poskytnuta). Za účelem ukázat, že +RNA transkripty obou segmentů jsou potřebné pro produkci infekčního viru, byly přepsané směsi inkubovány s různými nukleázami, jak je ukázáno na obr.2. Syntetické RNA po zpracování produktů transkripce s DNasou (pruhy 1+2), RNasou (pruhy 3+4) nebo bez zpracování (pruhy 5+6), byly použity pro transfekei Věro buněk. K napodobení kontroly byl použit pouze Lipofectin. Pět dni po transfekei byl jen v buňkách Věro, transfektovaných sdruženými transkripcemi nezpracovaných nebo DNasou-zpracovaných produktů transkripce, viditelný cytopatický efekt (CPE), ale ne s RNasou-zpraco vanou transkripční směsí nebo zdánlivětranfektovanou kontrolou. Navíc, žádný CPE nebyl detekován, když byly Věro buňky transfektovány RNA pouze segmentu A nebo B (data nejsou poskytnuty). Tyto výsledky demonstrují replikaci IBDV následovanou po transfekei Věro buněk +ssRNA obou segmentů IBDV. K ověření, že činitel způsobující CPE ve Věro buňkách byl opravdu IBDV, byly transfektované Věro buňky zmraženy-rozmraženy a materiál byl vyčištěn odstředěním a použit pro infekci CEC nebo Věro buněk. CEC infikovaný materiál získaný z Věro transfektovaných buněk nezpracovaných nebo DNasou-zpracovaných transkripčních směsí produkujících CPE v prvním dnu po naočkování (Tab.2). Avšak • ·*»· ··«*> ·· tt » · · · · · 4··« • · · · ··< · · « · , . ····*·· 4«4 »· *
-14- 9 9 9 9 9 4 4
9 4 4 9 499 . 99 ·· žádné CPE nemohly být objeveny ani po pěti dnech v CEC s materiálem z transfektovaných VĚRO buněk RNasou zpracovaných transkripčních směsí, nezpracovaných segmentů A nebo B transripčních směsí a simulované transfektovaných Věro buněk. Podobně, když byly Věro buňky infikovány na krycích sklíčkách stejnými materiály jak je popsáno výše a zkoušeny imunofluorescencí prováděnou po dvou dnech, pouze materiály získané z transfektovaných Věro buněk nezpracovaných nebo DNasou zpracovaných transkripčních směsí poskytly positivní imunofluorescenční signál (Tabulka 2).
Obnovení transfektálního viru
K určení časového bodu pro obnovení infekčního viru byly Věro buňky transfektovány rekombinantními RNA transkripcemi segmentů A a B. Po 4, 8, 16, 24, 36 a 48 hodinách transfekce byl materiál podroben zkoušce, zda obsahuje transfektující virus, pomocí infekční a destičkové zkoušky, jak je ukázáno v tabulce 3. Naše výsledky ukazují, že vir může být obnoven již 36 hodin po transfekci. Virový titr byl 2.3. ÍO2 píu/ml, který byl kapán na vzorky získané později než 48 hodin po transfekci.
Vytvoření chimérických virů
K ověření, že +ssRNA obou segmentů IBDV jsou výhodné pro obnovení infekčních virů, byl vytvořen chimérický IBDV vir. Plazmid pUC18FLA23 obsahující úplnou sekvenci segmentu A serotypu kmene II, byl linearizován Nsi I vylouhováním a ssRNA byla syntetizována in vitro použitím T7 RNA polymerázy. SsRNA transkripce specifikuje opravu 5-konce, ale obsahuje jeden přidaný zbytek na 3-konci (Obr.l). Věro buňky byly transfektovány ssRNA segmentu A serotypu II kmene 23/82 a ssRNA segmentu B serotypu I kmene P2. Pět dní po transfekci, když byl CPE zřejmý, byl materál vyčištěn (po zmražení-rozmražení) a použit pro infekci CEC. Po druhé pasáži v CEC, genomová RNA viru byla analyzována RT-PCR a sekvenací PCR produktů. Bylo nutné, aby primery pro segment A amplifikovály pouze segment A získaný ze serotypu kmene II.
Primer segmentu B se váže na sekvence obou serotypů. Amplifikované fragmenty byly klonovány a seřazeny. Získaný segment A sekvencí vykazující dokonalý pár se známým segmentem A sekvencí serotypu II kmene 23/82, zatímco segment B sekvence vykazoval kompletní homologii k publikovanému segmentu B sekvencí serotypu I kmene P2 (Obr.3).
-15Místa, kde jsou báze navázány (nukleotidové číslo), jsJu podle publikovaných sekvencí kmene P2 (2).
cz>
<V
CO
X- O < N<
§,
O o
(Λ o
c o
£
N<
n>>
P
Ό
O £3.
o o
W
O £
ε o
o
C“♦J—» .
oo o
tr £, cr cn p,
U U, cz>
O £
P
-o< 2 £
o<
Ok
O £
<?o
ÍT sr d
O
O < o 3
O
O o<
t/3
Λ
O
O &
o :=r o>
5* cr ω,
M o
O
P s
P o<
P •-i
O o
O <*
OK o
<
o p
o o>
o c
p
P
Ό
5*
N <f
O
Γ
3'
O r
OK
CZ)
Ό
O o
Bí
O
Ok
Ví
-V ~O *υ
K)
Oo co co
I d
i > o > o —i o d
o
CD oi
I
T)
D řO
Ol i
—, IO GJ CO
O
O >
-I
O —I o
o
Gl
O >
ω gi
Gl o
o o
o o
o o
Gl o
>
gi o
o gi £Gi o
>
o >
o £
d §
o δ
o o
Gl
G) >
>
O
Gl“ d
ω gi Gl —I o -4 Gl > P
Gl
Gl —4
Gl
O
Gl
Ϊ»
Gl >
Gl
G) >
O
Gl —4 o
O
Ϊ» o
Gl
Gl
Gl
3>
d o
d
G)
O d
O >
G) >
p
Gl
O >>
Gl p
—I o
o o
-I o
Gl
P Gl —I o Gl > d
3>
O
Gl
Gl
Gl >
G)
Gl o
O o
£ o
>
—4
Gl o
$ >
Cl
Gl
Gl
Gl >
p o
o
Gl
O
Gl £
oGli
Gl d
P
Gl
O >
O
Gl
Gl
Gl >
O o
o
Gl
O
Gl £
o
Gl p
>
—4
O
O í£ d
>
Gl1 >
Gl >
o o
δ o
o
P
Gl >
p_
Gl >
o
Gl d
O —I Gl > P
CD ω
to ro oo o
ro co ro
-i ro
Ol
Γ
O ro >
£
GJ
CD
CD ω
to o
o >
GJ
I m
o
-i c»
-o ro to
I . i
-o
-£ ro >
m ro
Gl >
Ol m
α
-o ca >
GJ ro
GJ >
GJ
Γ σ
-o ca >
qi
Γ
N) tu <n
-o to to o
Ό
GJ o
CO to
-U ro i
GJ ro
CD
GJ ro
GJ
-o i
GJ ro
O)
L ca >» .12 o
δ
Cl o
P
Gl >
—4 >
O
Gl >
—4
O
Gl
Gl
-Η o
o >
o o
o o
Gl
Gl
Gl p
Gl >
Gl
O >
&
Ó ca
GJ
Z c
£2.
ro o
CL
Cb ω
n>
XI c
fl>
□ o
Σ3.
ω n
g o* □
2:
c
Q.
o>
o rQl (P c
cr
Π)
Tabulka 1. Oligonukleotídy použité pro konstrukci úplných cDNA klonů EBDV genomových segmentů A a B
Tabulka 2. Vytváření infekčního IBDV ze syntetických RNA segmentů A a B
Materiál Transfected CPE Immunofluoroescence
ssRNA A+B, DNase-treated + +
ssRNA A+B, RNase-treated - -
ssRNA A+B, untreated - + +
ssRNA A, untreated -
ssRNA B, untreated - -
Llpofeclin only - -
Věro buňky byly transfektovány syntetickými RNA segmentů A a B získaných z transkripčních reakcí, které byly nezpracovány nebo zpracovány s DNasou nebo RNasou. Po pěti dnech byly materiály spojeny, vyčištěny odstředěním a analyzovány, zda osahují virus. Infekčnost obnoveného viru byla určena v CEC zjišťováním cytopatického efektu (CPE) 1 až 2 dny po naočkování. Schopnost obnoveného viru byla určena imunofluorescencí zavedením králičího anti-IBDV séra do infikovaných Věro buněk.
• · ·
-17Tabulka 3. Obnovení Viru po různých časech po transfekci.
Time in houra CPE Immunofluorescence post-tranšfection pfu/ml
4 - - 0
8 - - 0
16 - - 0
24 - - 0
36 4· + 2.3 x 10’·
48 + 6.0 x 10'
Věro buňky byly transfektovány syntetickými RNA segmentů A a B jak bylo již popsáno. Infekčnost a specifita obnoveného viru byla zjištěna pomoci CPE v CEC a imunofluorescencí v buňkách Věro. Monovrstvy sekundární CEC byly použity pro destičkovou zkoušku po naočkování buněk materiálem získaným z transfektovaných buněk Věro. Přibližný titr viru byl počítán jako destičková tvorba jednotek na ml (pfu/ml).
-18• · ·
SEZNAM SEKVENCÍ
1.ZÁKLADNÍ INFORMACE
PŘEDKLADATEL: VAKHARIA, VIKRAM N.
MUNDT, EGBERT
NÁZEV VYNÁLEZU: ZPŮSOB PŘÍPRAVY BIRANVTRU ZE SYNTETICKÝCH TRANSKRIPTŮ RNA
POČET SEKVENCÍ: 34
ADRESA PRO KORESPONDENCI
ADRESA: NIKAIDO, MARMELSTEIN, MURRAY & ORAM LLP ULICE: 655 Fifteenth Street, N. W., Suitě 330 - G Street Lobby MĚSTO: Washington
STÁT: DC
ZEMĚ: USA PSČ: 20005-5701
POČÍTAČOVÉ POŽADAVKY NOSIČ: FLOPPY DISK POČÍTAČ: IBM PC KOMPATIBILNÍ OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verze #1.30
SOUČASNÁ PŘEDKLÁDANÁ DATA: PŘEDKLÁNÉ ČÍSLO: US REGISTRAČNÍ DATUM:
TŘÍDĚNÍ:
INFORMACE O ZMOCNĚNCI/ZÁSTUPCI:
JMÉNO: KITTS, Monica C.
REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 36,105
REFERENČNÍ/ SOUDNÍHO REJSTŘÍKU ČÍSLO: P8172-6002
···· ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · ··· ···
TELEFONNÍ INFORMACE:
TELEFON: 202/638-5000
TELEFAX: 202/638-4810
INFORMACE PRO SEKVENCI ID NO: 1:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: DÉLKA: 46 PÁRŮ BÁZÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: DVOJITÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
GAATTCGGCT TTAATACGAC TCACTATAGG ATACGATCGG TCTGAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 41 PÁRŮ BÁZÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: DVOJITÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
AATTGGATCC GTTCGCGGGT CCCCTGTACA AAGCCGAATT C
INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 36 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: DVOJITÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC
INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 44 PÁRŮ BAŽÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: DVOJITÝ
TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
GTCAGACCGA TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT CTCT
INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 33 PÁRŮ BAŽÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: DVOJITÝ
TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
TTGCATGCCT GCAGGGGGCC CCCGCAGGCG AAG INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 31 PÁRŮ BAŽÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: DVOJITÝ
TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT C
INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ
TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:
GGAAGCCTGA GTGAGTTGAC TGACTACAGC TACAACGGGC TGATGTCAGC CACTGCGAAC 60
ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGG TGACTGTTCT CAGTCTACCG
120 • ·«·
-22INFORMACE PRO SEQ ID N0:8:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:
ggaagcctga gtgagttgac tgactacagc tacaacgggc tgatgtcagc cactgcgaac ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGG TGACTGTTrrr--CAGTGTACC-1
INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:
GGAAGCCTGA GTGAACTGAC AGATGTTAGC TACAATGGGT TGATGTCTGC AACAQCCAAC 60
ATCAACGACA AAATTGGGAA CGTCCTAGTA GGGGAAGGGG TCACCGTCCT CAGCTTACCC 120
-23• · · · · · ···.· » · · · · · · · · » · · · · · · ·· · » · · · · ·· ··· ·· ··
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
TTTTCAATAG TCCACAGGCG CGAACGAAGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG 60
CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCG CCAAAGTCTG GGTGCCACCT GAGGAT-CCGC-1-20--INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:
TTTTCAACAG TCCACAGGCG CGAAGCACGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG 60
CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CTAAAGTTTG GGTGCCACCT GAGGÁTCCGC 120
···'· ··' ··::♦«' ·· ···· · ·· ·· >:♦·..
• · ·9 . . 9 9 9··· 9 999 ' 9- · ·· ·. · ··· 9 9 9 9
9 9 9 9--.9 9 99 9 999 · · · · · · • 99 9 -99 999 9 9 99INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 120 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:
TTTTCAACAG TCCACAGQCGCaAAaCACOA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG-60
CTGGACAAGA cgtggaagaa ctcttgatcc ctaaagtttg GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 13;
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 48 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:
TAATACGACT CACTATAGGA TACGATCGGT CTGACCCCGG GGGAGTCA • 0 00 • 0 0 ·
0 0 0
000 000
4 t 40
0* 0044
0 0
0 000
0 0
0 0 • 0 000
0004
-25INFORMACE PRO SEQ ID NO: 14:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 44 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:
0 • 4
0 0 • ·
040 0
AGAGAATTCT AATACGACTC ACTATAGGAT ACGATCGGTC TGAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 15:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 30 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:
“í * · ·
TGTACAGGGG ACCCGCGAAC GGATCCAATT
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 16:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 36 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
-26·· · · · · · · ·
ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ
TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 17: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 20 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁKYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17: CGTCGACTAC GGGATTCTGG
INFORMACE PRO SEQ DD NO: 18: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 20 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18: CAGAGGCAGT ACTCCGTCTG
INFORMACE PRO SEQ ID NO: 19: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 20 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ
• ·
-27TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
AGTCGACGGG ATTCTTGCTT
INFORMACE PRO SEQ ID NO:20: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 18 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:
GAAGGTGTGC GAGAGGAC
INFORMACE PRO SEQ ID NO:21: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 44 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY:DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:
INFORMACE PRO SEQ ID NO:22: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 33 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY: DNA
-28POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:
CGATCTGCTG CAGGGGGCCC CCGCAGGCGA AGG
INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 24 PÁRŮ BAŽÍ
TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ
TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: DNA
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:
CTTGAGACTC TTGTTCTCTA CTCC
INFORMACE PRO SEQ ID NO:24: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 19 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ TYP MOLEKULY: DNA POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:
ATACAGCAA GATCTCGGG
INFORMACE PRO SEQ ID NO:25: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 2827 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA
ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA ZNAKY: JMÉNO/KLÍČ: CDS UMÍSTĚNÍ: 112..2745 POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:
GGATACGATG GGTCTGACCC TCTGGGAGTC ACGAATTAAC GTGGCTACTA GGGGCGATAC 60
CCGCCGCTGG CCGCCACGTT AGTGGCTCCT CTTCTTGATG ATTCTGCCAC C ATG AGT 117
Met Ser
GAC ATT TTC AAC AGT Ser CCA CAG GCG CGA AGC ACG ATC TCA GCA GCG TTC Phe 165
Λερ Ile Phe 5 Asn Pro Gin Ala 10 Arg Ser Thr Ile Ser 15 Ala Ala
GGG -ATA- -AAG- CCT ACT -GCT—GGA CAA -GAC-GTG-GAA- GAA- CTC-TTG- -ATC“ CCT 2T3
Gly Ile 20 Lys Pro Thr Alči Gly Gin 25 Asp Val Glu Glu 30 Leu Leu Ile Pro
AAA GTT TGG GTG CCA CCT GAG GAT CCG CTT GCC AGC CCT AGT CGA CTG 261
Lya 35 val Trp Val Pro Pro 40 Glu Asp Pro Leu Ala 45 ser Pro Ser Arg Leu 50
GCA AAG TTC CTC AGA GÁG AAC GGC TAC AAA GTT TTG CAG CCA CGG TCT 309
Ala Lys Phe Leu Arg 55 Glu Asn Gly Tyr Lya Val 60 Leu Gin Pro Arg 65 Ser
CTG CCC GAG AAT GAG GAG TAT GAG ACC GAC CAA ATA CTC CCA GAC TTA 357
Leu Pro Glu Asn 70 GlU Glu Tyr Glu Thr 75 Asp Gin Ile Leu Pro 80 Asp Leu
GCA TGG ATG CGA CAG ATA GAA GGG GCT GTT TTA AAA CCC ACT CTA TCT 40S
Ala Trp Met Θ5 Arg Gin Ile Glu Gly 90 Ala Val Leu Lya Pro 9S Thr Leu Ser
CTC CCT ATT GGA GAT CAG GAG TAC TTC CCA AAG TAC TAC CCA ACA CAT 453
Leu Pro 100 Ile Gly ASp Gin Glu Tyr 105 Phe Pro Lya Tyr 110 ΪΥΪ Pro Thr His
CGC CCT AGC AAG GAG AAG CCC AAT GCG TAC CCG CCA GAC ATC GCA CTA 501
Arg 115 Pro Ser Lya Glu Lya 120 Pro Asn Ala Tyr Pro 125 Pro Asp Ile Ala Leu 130
CTC AAG Leu Lys CAG Gin ATG ATT TAC Tyr CTG TTT CTC CAG GTT CCA GAG GCC AAC Glu Ala Asn 145 GAG Glu 549
Met Ile 135 Leu Phe Leu Gin 140 Val Pro
GGC CTA AAG GAT GAA GTA ACC CTC TTG ACC CAA AAC ATA AGG GAC AAG 597
Gly Leu Lys ASp Glu Val Thr Leu Leu Thr Gin Asn Ile Arg Asp Lys
150 155 160
GCC TAT GGA AGT GGG ACC TAC ATG GGA CAA GCA AAT CGA CTT GTG GCC 645
Ala Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Met Gly Gin Ala Asn Arg Leu Val Ala
165 170 175
ATG AAG GAG GTC GCC ACT GGA AGA AAC CCA AAC AAG GAT CCT CTA AAG 693
Met Lys Glu Val Ala Thr Gly Arg Asn Pro Asn Lys Asp Pro Leu Lys
180 165 190
ctt GGG TAC ACT TTT GAG AGC ATC GCG CAG CTA CTT GAC ATC ACA CTA 741
Leu Gly Tyr Thr Phe Glu Ser Ile Ala Gin Leu Leu Asp Ile Thr Leu
195 200 205 210
CCG GTA GGC CCA ccc GGT GAG GAT GAC AAG CCC TGG GTG CCA CTC ACA 78 9
Pro Val Gly Pro pro Gly Glu Asp Asp Lys Pro Trp Val Pro Leu Thr
215 220 225
AGA GTG CCG TCA CGG ATG TTG GTG CTG ACG GGA GAC GTA GAT GGC GAC 837
Arg Val Pro Ser Arg Met Leu Val Leu Thr Gly Asp Val Asp Gly Asp
230 235 240
TTT GAG GTT GAA GAT TAC CTT CCC AAA ATC AAC CTC AAG TCA TCA AGT 085
Phe Glu Val Glu Asp Tyr Leu Pro Lys Ile Asn Leu Lys Ser Ser Ser
245 • 250 255
GGA CTA CCA TAT GTA GGT CGC ACC AAA GGA GAG ACA ATT GGC GAG ATG 933
Gly Leu Pro Tyr Val Gly Arg Thr Lys Gly GlU Thr Ile Gly Glu Mg t
260 265 270
ATA GCT ATC TCA AAC CAG TTT CTC AGA GAG CTA TCA ACA CTG TTG AAG 981
Ile Ala Ilo Ser Asn Gin Phe Leu Arg Glu Leu Ser Thr Leu Leu Lys
275 280 285 290
CAA GGT GCA GGG ACA AAG GGG TCA AAC AAG AAG AAG CTA CTC AGC ATG 1029
Gin Gly Ala Gly Thr Lys Gly Ser Asn Lys Lys Lys Leu Leu Ser Met
295 300 305
, , - TTA AGT GAC TAT TGG TAC TTA TCA TGC GGG CTT TTG TTT CCA AAG GCT 1077
Leu Ser Asp Tyr Trp Tyr Leu Ser Cys Gly Leu Leu Phe Pro Lys Ala
• 310 315 320
GAA AGG TAC GAC AAA AGT ACA TGG CTC ACC AAG ACC CGG AAC ATA TGG 1125
Glu Arg Tyr Asp Lys Ser Thr Trp Leu Thr Lys Thr Arg Asn Ile Ttp
325 330 335
• ·
-*-'· -·· . _···.·—. ;· “Τ'/*'-; .
• · · · · · · · · · · • · <·♦.·· • · · · · · · • · · 9 · ·
-31- • · · · · 99 9 9 99 999
TCA GCT CCA TCC Ser CCA Pro ACA CAC CTC ATG ATC Ile TCT ATG ATC ACC TGG Trp CCC Pro 1173
Ser Ala 340 Pro Thr His 345 Leu Met Ser Met 350 Ile Thr
GTG ATG TCC AAC AGC CCA AAT AAC GTG TTG AAC ATT GAA ggg TGT CCA 1221
Val Mot Ser Asn Ser Pro Asn Asn Val Leu Asn Ile Glu Gly Cys Pro
3S5 360 365 370
TCA CTC TAC AAA TTC AAC CCG TTC AGA GGA GGG TTG AAC AGG ATC GTC 1269
Ser Leu Tyr Lys Phe Asn Pro Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Ile Val
3 75 380 385
GAG TGG ATA TTG GCC CCG GAA GAA CCC AAG GCT CTT GTA TAT GCG GAC 1317
Olu Trp Ile Leu Ala Pro G1U Glu Pro Lys Ala Leu Val Tyr Ala Asp
3 90 335 400
AAC ATA TAC ATT GTC CAC TCA AAC ACG TGG TAC TCA ATT GAC CTA GAG 1365
Asn Ile Tyr Ile Val His Ser Asn Thr Trp Tyr Ser Ile Asp Leu Glu
405 410 415
AAG GGT GAG GCA AAC TGC ACT CGC CAA CAC ATG caa GCC GCA ATG TAC 1413
Lys Gly Glu Ala Asn Cys Thr Arg Gin Hi.s Me.t- -Gin- -Ala- -Ala- -Met- -T-yr-
420 425 430
TAC ATA CTC ACC AGA GGG TGG TCA GAC AAC GGC GAC CCA ATG TTC AAT 1461
Tyr Ile Leu Thr Arg Gly Trp Ser Asp Asn Gly Asp Pro Met Phe Asn
435 440 445 450
CAA ACA TGG GCC ACC TTT GCC ATG AAC ATT GCC CCT GCT CTA GTG GTG 1509
Gin Thr Trp Ala Thr Phe Ala Met Asn Ile Ala Pro Ala Leu Val Val
455 1 460 46S
GAC TCA TCG TGC CTG ATA ATG AAC CTG CAA ATT AAG ACC TAT GGT CAA 1557
Asp Ser Ser Cys Leu Ile Met Asn Leu Gin Ile Lys Thr Tyr Gly Gin
470 475 400
GGC AGC GGG AAT GCA GCC ACG TTC ATC AAC AAC CAC CTC TTG AGC ACA 1605
Gly Ser Gly Λεη Ala Ala Thr Phe Ile Asn Asn His Leu Leu Ser Thr
405 490 495
CTA GTG CTT GAC CAG TGG AAC CTG ATG AGA CAG CCC AGA CCA GAC AGC 1653
Leu Val Leu Asp Gin. Trp Asn Leu Met Arg Gin Pro Arg Pro Asp Ser
500 505 510 « ·
GAG GAG TTC AAA TCA ATT GAG GAC AAG CTA GGT ATC AAC TTT AAG ATT 1701
Glu Glu Phe Lys Ser Ile GlU Asp Lys Leu Gly Ile Asn Phe Lys Ile
515 520 525 530
GAG AGG TCC ATT GAT GAT ATC AGG GGC AAG CTG AGA CAG CTT GTC CTC 1749
Glu Arg Ser Ile Asp Asp ile Arg Gly Lys Leu Arg Gin Leu Val Leu
535 540 545
• · · · • · ..··♦ ·
999 9 99 9
CTT GCA CAA Gin CCA Pro 550 GGG TAC Gly Tyr CTG AGT GGG GGG GTT GAA CCA GAA CAA TCC Ser 1797
Leu Ala Leu Ser Gly 555 Gly Val Glu Pro Glu 560 Gin
AGC CCA ACT GTT GAG CTT GAC CTA CTA GGG TGG TCA GCT ACA TAC AGC 1845
Ser Pro Thr val Glu Leu Asp Leu Leu Gly Trp Ser Ala Thr Tyr Ser
565 570 575
AAA GAT CTC GGG ATC TAT GTG CCG GTG V. A X rt* π Vrtů GAA CGC CTA TTT 1893
Lys Asp Leu Gly Ile Tyr Val Pro Val Leu Asp Lys Glu Arg Leu Phe
580 585 590
TGT TCT GCT GCG TAT CCC AAG GGA GTA GAG AAC AAG AGT CTC AAG TCC 1941
Cys Ser Ala Ala Tyr Pro Lys Gly Val Glu Asn Lys Ser Leu Lys Ser
595 600 605 610
AAA GTC GGG ATC GAG CAG GCA TAC AAG GTA GTC AGG TAT GAG GCG TTG 1989
Lys Val Gly Ile Glu Gin Ala Tyr Lys Val Val Arg Tyr Glu Ala Leu
615 620 625
AGG TTG GTA GGT GGT TGG AAC TAC CCA CTC CTG AAC AAA GCC TGC AAG 2037
Arg Leu Val Gly 630 Gly Trp Asn Tyr Pro 6.3.5 Leu Leu Asn Lys Ala -640- Cys Lys
AAT AAC GCA GGC GCC GCT CGG CGG CAT CTG GAG GCC AAG GGG TTC CCA 2005
Asn Asn Ala Gly Ala Ala Arg Arg His Leu Glu Ala Lys Gly Phe Pro
645 650 655
CTC GAC GAG TTC CTA GCC GAG TGG TCT GAG CTG TCA GAG TTC GGT GAG 2133
Leu Asp Glu Phe Leu Ala Glu Trp Ser Glu Leu ser Glu Phe Gly Glu
660 665 670
GCC TTC GAA GGC TTC ÁAT ATC AAG CTG ACC GTA ACA TCT GAG AGC CTA 2181
Ala Phe GlU Gly Phe Asn Ile Lys Leu Thr Val Thr Ser Glu Ser Leu
675 680 685 690
GCC GAA CTG AAC AAG CCA GTA CCC CCC AAG CCC CCA AAT GTC AAC AGA 2229
Ala Glu Leu Asn Lys Pro Val Pro Pro Lys Pro Pro Asn Val Asn Arg
695 700 705
CCA GTC AAC ACT GGG GGA CTC AAG GCA GTC AGC AAC GCC CTC AAG ACC 2277
Pro Val Asn Thr Gly Gly Leu Lys Ala Val Ser Asn Ala Leu Lys Thr
710 715 720
GGT CGG TAČ AGG AAC GAA GCC GGA CTG AGT GGT CTC GTC CTT CTA GCC 2325
Gly Arg Tyr Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Gly Leu Val Leu Leu Ala
725 730 735
ACA GCA AGA AGC CGT CTG CAA GAT GCA GTT AAG GCC AAG GCA GAA GCC 2373
Thr Ala Arg Ser Arg Leu Gin Asp Ala Val Lys Ala Lys Ala Glu Ala
740 74S 750
GAG AAA CTC CAC AAG TCC AAG CCA GAC Asp GAC CCC GAT GCA GAC TGG TTC 2421
Glu 755 Lye Leu Hifí Lys Ser 760 Lys Pro Asp Pro 765 Asp Ala Asp Trp Phe 770
GAA AGA TCA GAA ACT CTG TCA GAC CTT CTG GAG AAA GCC GAC ATC GCC 24 69
Glu Arg Ser GlU Thr 775 Leu Ser Asp Leu Leu 700 Glu Lys Ala Asp Ile 705 Ala
AGC AAG GTC GCC CAC TCA GCA CTC GTG GAA ACA AGC GAC GCC CTT GAA 2517
Ser Lys Val Ala 7 S 0 His ser Ala Leu Val 735 Glu Thr ser Asp Ala 000 Leu Glu
GCA GTT CAG TCG ACT TCC GTG TAC ACC CCC AAG TAC CCA GAA GTC AAG 2565
Ala Val Gin 005 ser Thr Ser Val Tyr 810 Thr Pro Lys Tyr Pro 815 Glu Val Lys
AAC CCA CAG ACC GCC TCC AAC CCC GTT GTT GGG CTC CAC CTG CCC GCC 2613
Asn Pro Θ20 Gin Thr Ala Ser Asn 025 Pro Val Val Gly Leu 830 His Leu Pro Ala
AAG AGA GCC ACC GGT GTC CAG GCC GCT CTT CTC GGA GCA GGA ACG AGC 2661
Lyo 035 Arg Ala Thr Gly Val 840 Gin Ala Ala Leu Leu 045 Gly Ala Gly Thr Ser 050
AGA_C-CA_ATG—GGG—ATG—GAG—GCC—CCA—AGA—GGG—TGG—AAG—AAG—GGG—GTG-AAA-2709
Arg Pro Met Gly Met Glu 855 Ala Pro Thr Arg 860 Ser Lys Asn Ala Val Lys 865
ATG GCC AAA CGG CGG CAA CGC CAA AAG GAG AGC CGC TAACAGCCAT 275S
Met Ala Lys Arg Arg Gin Arg Gin Lys Glu Ser Arg
070 075
GATGGGAACG ACTCAAGAAG AGGACACTAA TCCCAGACCC CGTATCCCCG GCCTTCGCCT 2015
GCGGGGGCCC CC 2027
INFORMACE PRO SEQ ID NO:26;
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA; 878 AMINOKYSELIN TYP: AMINOKYSELINA TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: protein POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:
Met ser Asp Ile Phe Asn Ser Pro Gin Ala Arg Ser Thr Ile Ser Ala 15 10 15
Ala phe Gly Ile Lys Pro Thr Ala Gly Gin Asp Val Glu Glu Leu Leu
-3420
pro Lys 35 Val Trp Val Pro Pro 40 Glu ASp Pro Leu Ala 45 Ser Pro Ser
Leu Ala Lys Plie Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Lys Val Leu Gin Pro
50 55 60
Ser Leu Pro Glu Asn Glu Glu Tyr Glu Thr Asp Gin Ile Leu Pro
70 75 80
Leu Ala Trp Met Arg Gin Ile Glu Gly Ala Val Leu Lys Pro Thr
05 90 95
Ser Leu Pro Ile Gly Asp Gin Glu Tyr Phe Pro Ly3 Tyr Tyr Pro
100 105 110
His Arg Pro Ser Lys Glu Lys Pro Asn Ala Tyr Pro Pro Asp Ile
115 120 125
Leu Leu Lys Gin Met Ile Tyr Leu Phe Leu Gin Val Pro Glu Ala
130 135 140
Glu Gly Leu Lys Asp Glu Val Thr Leu Leu Thr Gin Asn Ile Arg
Lys Ala Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Met J- oo Gly Gin Ala Asn Arg i 60 Leu
165 170 175
Ala Met Lys Glu Val Ala Thr Gly Arg Asn Pro Asn Lys Asp Pro
1Θ0 1 105 190
Lys Leu Gly Tyr Thr Phe Glu Ser Ile Ala Gin Leu Leu Asp Ile
195 200 205
Leu Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Asp Λερ Lys Pro Trp Val Pro
210 215 220
Thr Arg Val Pro Ser Arg Met Leu Val Leu Thr Gly Asp Val Asp
230 235 240
Asp Phe Glu Val Glu Asp Tyr Leu Pro Lys Ile Asn Leu Lys Ser
245 250 255
Ser Gly Leu Pro Tyr Val Gly Arg Thr Lys Gly Glu Thr Ile Gly
260 265 270
Met Ile Ala Ile Ser Asn Gin Phe Leu Arg Glu Leu Ser Thr Leu
275 200 205
Lys Gin Gly Ala Gly Thr Lya Gly Ser Asn Lys Lys Lys Leu Leu
• · ·
-.
• 0 ·
290 295 300
Ser Met Leu Ser Asp Tyr Trp Tyr Leu Ser Cys Gly Leu Leu Phe Pro
30S 310 315 320
hyn Ala Glu Arg Tyr Asp Lys Ser Thr Trp Leu Thr Lys Thr Arg Asn
325 330 335
Ile Trp Ser Ala Pro Ser Pro Thr His Leu Met Ile Ber Met Ile Thr
340 345 350
Trp Pro Val Met Ser Asn Ser Pro Asn Asn Val Leu Asn Ile Glu Gly
355 360 365
Cys Pro Ser Leu Tyr bys Phe Asn Pro Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg
370 375 3 80
Ile Val Glu Trp Ile Leu Ala Pro Glu Glu Pro LyB Ala Leu Val Tyr
385 390 395 400
Ala Asp Asn Ile Tyr Ile Val His Ser Asn Thr Trp Tyr Ser Ile Asp
405 410 415
Leu Olu LyB Oly Glu Ala Asn CVS Thr Arg Gin His Met Gln -Ala -Ala
420 425 430
Met Tyr Tyr Ile Leu Thr Arg Gly Trp Ser Asp Asn Gly Asp Pro Met
435 440 445
Phe hun Gin Thr Trp Ala Thr Phe Ala Met Asn Ile Ala Pro Ala Leu
4S0 1 4 55 460
Val Val Acp Ser Ser Cys Leu Ile Met Asn Leu Gin Ile Lys Thr Tyr
465 470 475 480
Oly oln Gly Ser Gly Asn Ala Ala Thr Phe Ile Asn Asn His Leu Leu
485 490 495
Ser Thr Leu Val Leu Asp Gin Trp Asn Leu Met Arg Gin Pro Arg Pro
500 5 05 510
Asp Ser Glu Glu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Lys Leu Gly Ile Asn Phe
515 520 525
Lye Ile GlU Arg Ser Ile Asp Ašp Ile Arg Gly Lys Leu Arg Glň Leu
530 535 540
Val Leu Leu Ala Gin Pro Gly Tyr Leu Ser Gly Gly Val Glu Pro Glu
545 550 555 56 0
Gin Ber Ser Pro Thr Val Glu Leu Asp Leu Leu Gly Trp Ser Ala Thr
• *
565 570 57S
Tyr Ber Lys Asp Leu Gly Ile Tyr Val Pro Val Leu Asp Lys Glu Arg
580 585 590
Leu Phe Cys Ser Ala Ala Tyr Pro Lys Gly Val Glu Asn Lys Ser Leu
595 600 605
Lyn Ser Lya Val Gly Ile Glu Gin Ala Tyr Lys Val Val Arg Tyr Glu
CIO 615 620
Ala Leu Arg Leu Val Gly Gly Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Asn Lys Ala
625 630 635 640
Cys Lys Asn Asn Ala Gly Ala Ala Arg Arg His Leu Glu Ala Lys Gly
645 650 655
Phe Pro Leu Asp Glu Phe Leu Ala Glu Trp Ser Glu Leu Sei- Glu Phe
660 665 670
Gly GlU Ala Phe Glu Gly Phe Asn Ile Lys Leu Thr Val Thr Ser Glu
675 680 685
8«r Leu Ala Glu Leu Asn Lys Pro Val Pro Pro Lys Pro Pro Asn Val
Asn Arg Pro Val Asn Thr Gly Gly Leu Lys Ala -7 0 0 Val Ser Asn Ala Leu
705 710 715 720
Lys Thr Gly Arg Tyr Arg Asn Glu Ala Gly Leu Sor Gly Leu Val Leu
725 730 735
Leu Ala Thr Ala Arg Ser Arg Leu Gin Asp Ala Val Lya Ala Lys Ala
740 745 750
Glu Ala Glu Lys Leu líis Lys Ser Lys Pro Asp Asp Pro Asp Ala Asp
755 760 765
Trp Phe Glu Arg Ser Glu Thr Leu Ser Asp Leu Leu Glu bys Ala Asp
770 775 780
Ile Ala Ser Lys Val Ala His ser Ala Leu val Glu Thr Ser Asp Ala
705 790 795 800
Leu Glu Ala Val Gin Ser· Thr Ger Val Tyr Thr Pro Lys Tyr Pro Glu
- - - - OOS 810 015
Val Lys Asn Pro Gin Thr Ala Ser Asn Pro Val Val Gly Leu His Leu
8 20 025 830
-Pro Ala bys Arg Ala Thr Gly Val Gin Ala Ala Leu Leu Gly Ala Gly • ·
-37835 840 845
Thr Ser 850 Arg Pro Met Gly Met 855 Glu Ala Pro Thr Arg B60 Ser Lys Asn Ala
Val 865 Lys Met Ala Lys Arg 810 Arg Gin Arg Gin Lys 875 Glu Ser Arg
INFORMACE PRO SEQ ID NO:27:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 3261 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA ZNAKY: JMÉNO/KLÍČ: CDS UMÍSTĚNÍ: 97..531 POPIS SEKVENCE: SEQ ID NQ:27:
GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC AGGCCGTCAA GGCCTTGTTC 60
CAGGATGGGA CTCCTCCTTC TACAACGCTA TCATTG ATG GTT AGT AGA GAT CAG 114
1 Met Val 800 Ser Arg Asp Gin
AGA AAC GAT CGC AGC GAT GAC ΛΛΑ CCT GCA AGA TCA AAC CCA ACA GAT 162
Thr Asn Asp Arg Ser Asp Asp Lys Pro Ala Arg Ser Asn Pro Thr Asp
805 090 095 900
TGT TCC GTT CAT ACG GAG CCT TCT GAT GCC AAC AAC CGG ACC GGC GTC 210
Cys Ser Val His Thr Glu Pro Ser Asp Ala Asn Asn Arg Thr Gly Val
905 910 915
CAT TCC GGA CGA CAC CCT GGA GAA GCA CAC TCT CAG GTC AGA GAC CTC 258
His Ser Gly Arg His Pro Gly Glu Ala His Ser Gin Val Arg Asp Leu
920 925 930
GAC CTA CAA TTT GAC TGT GGG GGA CAC AGG GTC AGG GCT ΛΑΤ TGT CTT 306
Asp Leu Gin Phe Asp Cys Oly Gly His Arg Val Arg Ala Asn Cys Leu
935 940 945
TTT ccc TGG ATT CCC TGG CTC ΛΛΤ TGT GGG TGC TCA CTA CAC ACT GCA 354
Phe Pro Trp Ile Pro Trp Leu Asn Cys Gly Cys Ser Leu llis Thr Ala
9S0 955 960
-38• ·-· ·
GGG Gly 965 CAA Gin TGG Trp GAA GlU CTA CAA Leu Gin 970 GTT Val CGA TCA GAT GCT CCT GAC TGC Cya CCA Pro GAA Glu 9Θ0 402
Arg Ser Asp Ala 975 Pro Asp
CCT ACC GGC CAG TTA CAA CTA CTG CAG GCT AGT GAG TCG GAG TCT CAC 450
Pro Thr Gly Gin Leu Gin Leu Leu Gin Ala Ser Glu Ser Glu Ser Ilia
9Θ5 990 995
AGT GAG GTC AAG CAC ACT TCC TGG TGG CGT TTA TGC ACT ΛΛΛ CGG CAC 490
Ser Glu Val Lys His Thr Ser Trp Trp Arg Lau Cya Thr Lye Arg His
1000 1005 lóio
CAT ΛΛΑ CGC CGT GAG CTT CCA AGG AAG CCT GAG TGAACTGACA GATGTTAGCT 551
His l»yB Arg Arg Asp Leu Pro Arg Lys Pro GlU
1015 1020
ACAATGGGTT GATGTCTGCA ACAGCCAACA TCAACGACAA AATTGGGAAC GTCCTAGTAG 611
GGGAAGGGGT CACCGTCCTC AGCTTACCCA CATCATATGA TCTTGGGTAT GTGAGGCTTG 671
GTGACCCCAT TCCCGCAATA GGGCTTGACC CAAAAATGGT AGCCACATGT GACAGCAGTG 731
ACAGGCCCAG AGTCTACACC ATAACTGCAG CCGATGATTA CCAATTCTCA TCACAGTACC 791
AACCAGGTGG GGTAACAATC ACACTGTTCT CAGCCAACAT TGATG-CCAT-C- -ACAAGCeTCA— —851
GCGTTGGGGG AGAGCTCGTG TTTCAAACAA GCGTCCACGG CCTTGTACTG GGCGCCACCA 911
TCTACCTCAT AGGCTTTGAT GGGACAACGG TAATCACCAG GGCTGTGGCC GCAAACAATG 971
GGCTGACGAC CGGCACCGAC AACCTTATGC I CATTCAATCT TGTGATTCCA ACAAACGAGA 1031
TAACCCAGCC AATCACATCC ATCAAACTGG AGATAGTGAC CTCCAAAAGT ggtggtcagg 1091
CAGGGGATCA GATGTCATGG TCGGCAAGAG GGAGCCTAGC AGTGACGATC CATGGTGGCA 1151
ACTATCCAGG GGCCCTCCGT CCCGTCACGC TAGTGGCCTA CGAAAGAGTG GCAACAGGAT 1211
CCGTCGTTAC GGTCGCTGGG GTGAGCAACT TCGAGCTGAT CCCAAATCCT gaactagcaa 1271
AGAACCTGGT TACAGAATAC GGCCGATTTG ACCCAGGAGC CATGAACTAC acaaaattga 1331
TACTGAGTGA GAGGGACCGT CTTGGCATCA AGACCGTCTG GCCAACAAGG gagtacactg 1391
ACTTTCGTGA ATACTTCATG GAGGTGGCCG ACCTCAACTC TCCCCTGAAG ATTGCAGGAG 14 51
CATTCGGCTT CAAAGACATA ATCCGGGCCA TAAGGAGGAT AGCTGTGCCG GTGGTCTCCA 1511
CATTGTTCCC ACCTGCCGCT CCCCTAGCCC ATGCAATTGG GGAAGGTGTA GACTACCTGC 1571
TGGGCGATGA GGCACAGGCT GCTTCAGGAA CTGCTCGAGC CGCGTCAGGA AAAGCAAGAG 1631
• 0
-39- 0 · 0 0 0 0 0 · • · • · · • 0 000 0 „ 0000 00 ·· 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 · · · · • 0 00 000 00· 0 0 0 · ’ · 0 0 0*0 0· ··.
CTGCCTCAGG CCGCATAAGG CAGCTGACTC TCGCČGCCGA CAAGGGGTAC GAGGTAGTCG 1691
CGAATCTATT CCAGGTGCCC CAGAATCCCG TAGTCGACGG QATTCTTGCT TCACCTGGGG 1751
TACTCCGCGG TGCACACAAC CTCGACTGCQ TGTTAAGAGA GGGTGCCACG CTATTCCCTG 1011
TGGTTATTAC GACAGTGGAA GACGCCATGA CACCCAAAGC ATTGAACAGC AAAATGTTTG 1071
CTGTCATTGA AGGCGTGCGA GAAGACCTCC AACCTCCATC TCAAAGAGGA TCCTTCATAC 1931
GZvACTCTCTC TGGACACAGA GTCTATGGAT ATGCTCCAGA TGGGGTACTT CCACTGGAGA 1991
CTGGGAGAGA CTACACCGTT GTCCCAATAG ATGATGTCTG GGACGACAGC ATTATGCTGT 2 051
CCAAAGATCC CATACCTCCT ATTGTGGGAA ACAGTGGaAA TCTAGCCATA GCTTACATGG 2111
ATGTGTTTCG ACCCAAAGTC CCAATCCATG TGGCTATGAC GGGAGCCCTC AATGCTTGTG 2171
GCGAGATTGA GAAAGTAAGC TTTAGAAGCA CCAAGCTCGC CACTGCACAC CGACTTGGCC 2231
TTAGGTTGGC TGGTCCCGGA GCATTCGATG TAAACACCGG GCcCAACTGQ GCAACGTTCA 2291
TCAAACGTTT CCCTCACAAT CCACGCGACT GGGACAGGCT CCCCTACCTC AACCTACCAT 2351
ACCTTCCACC. jCAATGCAGGA- -CGCCAG-T-ACG- -accttgccat- “GGCTGCATCA“ GAGTTCAAAG 2411
AGACCCCCGA ACTCGAGAGT GCCGTCAGAG CAATGGAAGC AGCAGCCAAC GTGGACCCAC 2471
TATTCCAATC TGCACTCAGT GTGTTCATGT GGCTGGAAGA GAATGGGATT GTGACTGACA 2531
TGGCCAACTT CGCACTCAGC GACCCGAACG CCCATCGGAT GCGAAATTTT CTTGCAAACG 2591
CACCACAAGC AGGCAGCAAG TCGCAAAGGG CCAAGTACGG GACAGCAGGC TACGGAGTGG 2651
AGGCTCGGGG CCCCACACCA GAGGAAGCAC AGAGGGAAAA AGACACACGG ATCTCAAAGA 2711
AGATGGAGAC CATGGGCATC TACTTTGCAA CACCAGAATG GGTAGCACTC AATGGGCACC 2771
GAGGGCCAAG CCCCGGCCAG CTAAAGTACT GGCAGAACAC ACGAGAAATA CCGGACCCAA 2031
ACGAGGACTA TCTAGACTAC GTGCATGCAG AGAAGAGCCG GTTGGCATCA GAAGAACAAA 2091
TCCTAAGGGC AGCTACGTCG ATCTACGGGG CTCCAGGACA GGCAGAGCCA CCCCAAGCTT 2951
TCATAGACGA AGTTGCCAAA GTCTATGAAA TCAACCATGG ACGTGGCCCA AACCAAGAAC 3011
AGATGAAAGA TCTGCTCTTG ACTGCGATGG AGATGAAGCA TCGCAATCCC AGGCGGGCTC 3071
TACCAAAGCC CAAGCCAAAA CCCAATGCTC CAACACAGAG ACCCCCTGGT CGGCTGGGCC 3131
GCTGGATCAG GACCGTCTCT GATGAGGACC TTGAGTGAGG CTCCTGGQAG TCTCCCGACA 3191
CCACCCGCGC AGGTGTGGAC ACCAATTCGG CCTTACAACA TCCCAAATTG GATCCGTTCG 3251
CGGGTCCCCT
3261
-40·· 99
9 9 9 .9 9 9 9
999 999
9
99
INFORMACE PRO SEQ ID NO:28:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 145 AMINOKYSELIN TYP: AMINOKYSELINA TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: protein POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:
Met 1 Val Ser Arg Asp 5 Gin Thr Asn Asp Arg Ser Asp Asp 10 Lys Pro Ala 15
Arg Ber Asn Pro 20 Thr Asp Cys Sor Val 25 His Thr Glu Pro Ser 30 Asp Ala
Asn Asn Arg Thr Gly Val Híb -Sex Gly_Arg—His—Pro-Gl-y- -Glu- Ala líis
3S 40 45
Ser Gin 50 Val Arg Asp Leu Asp 55 Leu Gin Phe Asp Cys 60 Gly Gly His Arg
Val 65 Arg Ala Asn Cys Leu 70 Phe Pro Trp Ile Pro 75 Trp Leu Αεη Cys Gly 80
Cys Ser Leu His Thr 85 Ala Λ Gly Gin Trp Glu 90 Leu Gin Val Arg Ser 95 Asp
Ala Pro Asp Cys 100 Pro Glu Pro Thr Gly 105 Gin Leu Gin Leu Lev» 110 Gin Ala
Ser Glu Ser 115 Glu Ser His Ser Glu 120 Val Lys His Thr Ser 12S Trp Trp Arg
Leu Cys 130 Thr Lys Arg His His 135 Lys Arg Arg Asp Leu 140 Pro Arg Lys Pro
GlU
5
-41«··· ·'«* ··** ·· *.· »» · · < · · · · • · · ··· ' · · · · • fefe · · · <»· ··· > fe fe · fe fe « fefe fefefe fefe fefe
INFORMACE PRO SEQ ID NO:29:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 3261 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA ZNAKY: JMÉNO/KLÍČ: CDS UMÍSTĚNÍ: 131..3166 POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:
GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC AGGCCGTCAA GGCCTTGTTC 60 —GAGGATGGGA— CTCCTCCTTC_T7fCAACGCTA TCATTGATGG TTAGTAGAGA TCAGACAAAC 120
GATCGCAGCG ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC CAA CAG ATT GTT CCG 16 9
Met Thr Asn Leu Gin Aep Gin Thr Gin Gin Xle Val Pro
150 155
TTC ΛΤΛ CGG AGC CTT CTG ATG CCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC ATT CCG 217
Phe Ilo Arg Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro
160 165 170
GAC GAC ACC CTG GAG AAG cac ACT CTC AGG TCA GAG ACC TCG ACC TAC 265
Asp Asp Thr Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr
175 100 105 190
AAT TTG ACT GTG GGG GAC ACA GGG TCA GGG CTA ATT GTC TTT TTC ccr 313
Asn Leu Thr Val Gly Ašp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro
195 200 2 05
GGA TTC CCT GGC TCA ATT GTG GGT GCT CAC TAC ACA CTG CAG GGC AAT 361
Gly Phe Pro Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gin Gly Asn
210 215 220
GGG AAC TAC AAG TTC GAT CAG ATG CTC CTG ACT GCC CAG AAC CTA CCG 409
Gly Asn Tyr Lys Phe Asp Gin Met Leu Leu Thr Ala Gin Asn Leu Pro
22S 230 23S
GCC AGT TAC AAC TAC TGC AGG CTA GTG AGT CGG AGT CTC ACA GTG AGG 457
Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg
240 245 250
TCA AGC ACA CTT CCT GGT GGC GTT ΤΛΤ GCA CTA AAC GGC ACC ΛΤΛ AAC 505
Ser Ser Thr Leu pro Gly Gly Val Tyr Ala LeU Asn Gly Thr Ile Asn
255 260 265 270
GCC GTG ACC TTC CAA GGA AGC CTG AGT GAA CTG ACA GAT GTT AGC TAC 553
• · · ·
Ala Val Thr Phe Gin 275 Gly Ser Leu Ser Glu 200 Leu Thr Asp Val Ser 205 Tyr
ΑΛΤ GGG TTG ATG TCT GCA ACA GCC AAC ATC AAC GAC AAA ATT GGG AAC 601
Asn Gly Leu Met 290 Ser Ala Thr Ala Asn 295 Ile Asn Asp Lys Ile 300 Gly Asn
GTC CTA GTA GGG GAA GGG GTC ACC GTC CTC AGC ΤΤΛ CCC ACA TCA TAT 649
Val Leu Val 305 Gly Glu Gly Val Thr 310 Val Leu Ser Leu Pro 315 Thr Ser Tyr
t* * GAT Asp CTT Leu 3 20 GGG Gly TAT GTG AGG CTT Leu 325 GGT Gly GAC Asp CCC ATT CCC GCA ATA GGG CTT Leu 697
Tyr Val Arg Pro Ile Pro 330 Ala Ile Gly
GAC CCA AAA ATG GTA GCC ACA TGT GAC AGC AGT GAC AGG CCC AGA GTC 745
Asp Pro Lys Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val
335 340 345 350
TAC ACC ATA ACT GCA GCC GAT GAT TAC CAA TTC TCA TCA CAG TAC CAA 793
Tyr Thr Ile Thr Ala 35S Ala Asp Asp Tyr Gin 3-6Ό Phe Ser Ser Gin Tyr 3-6-5 Gin
CCA GGT GGG Gly GTA ACA ATC Ile ACA CTG TTC TCA GCC AAC ATT Ile GAT Asp 380 GCC Ala ATC Ile 041
Pro Gly Val 370 Thr Thr Leu Phe 375 Ser Ala Asii
ACA AGC CTC AGC GTT GGG GGA GAG CTC GTG TTT CAA ACA AGC GTC CAC 009
Thr Ser Iieu Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gin Thr Ser Val lilo
385 • 390 395
GGC CTT GTA CTG GGC GCC ACC ATC TAC CTC ATA GGC TTT GAT GGG ACA 937
Gly Leu Vnl Lou Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr
400 405 410
ACG GTA ATC ACC AGG GCT GTG GCC GCA AAC AAT GGG CTG ACG ACC GGC 985
Thr Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly
415 420 425 430
ACC GAC AAC CTT ATG CCA TTC AAT CTT GTG ATT CCA ACA AAC GAG ATA 1033
Thr Asp Asn Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile
435 440 445
ACC CAG CCA ATC ACA TCC ATC AAA ČŤG GAG ATA GTG ACC TCC AAA AGT 1001
Thr Gin Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr ser Lys Ser
450 455 460
GGT GGT CAG GCA GGG GAT CAG ATG TCA TGG TCO GCA AGA GGG AGC CTA 1129
Gly Gly Gin Ala Gly Asp Gin Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu
465 470 475
• ·· · · · · ·
-43- ··· ·* ·* ···
GCA Ala GTG Val 400 ACG Thr ATC Ile CAT GGT GGC AAC TAT CCA GGG GCC CTC CGT Arg CCC GTC 1177
His Gly Gly Asn 405 Tyr Pro Gly Ala 490 Leu Pro Val
ACG CTA GTG GCC TAC GAA AGA GTG GCA ACA GGA TCC GTC GTT ACG GTC 1225
Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val
495 500 505 510
GCT GGG GTG AGC AAC TTC GAG CTG ATC CCA AAT CCT GAA CTA GCA AAG 1273
Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro GlU Leu Ala Lys
515 520 525
AAC CTG GTT ACA GAA TAC GGC CGA TTT GAC CCA GGA GCC ATG AAC TAC 1321
Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr
530 535 540
ACA AAA TTG ΛΤΑ CTG AGT GAG AGG GAC CGT CTT GGC ATC AAG ACC GTC 13 69
Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg Aep Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val
545 550 555
TGG Cca ACA AGG GAG TAC ACT GAC TTT CGT GAA TAC TTC ATG GAG GTG 1417
Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val
560 565 570
GGG—GAG- -e-TC- AAC—TCT- CCC“ “CTG“ -AAG' ATT GCA GGA GCA TTC GGC TTC AAA 14 65
Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys
575 580 505 590
GAC ΑΤΛ ATC CGG GCC ΛΤΛ AGG AGG ΛΤΛ GCT GTG CCG GTG GTC TCC ACA 1513
Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr
595 600 605
TTG TTC CCA CCT GCC GCT CCC CTA GCC CAT GCA ATT GGG GAA GGT GTA 1561
Leu Phe Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val
610 615 620
GAC TAC CTG CTG GGC GAT GAG GCA CAG GCT GCT TCA GGA ACT GCT CGA 1609
Asp Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gin Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg
625 630 635
GCC GCG TCA GGA AAA GCA AGA GCT GCC TCA GGC CGC ΛΤΛ AGG CAG CTG 1657
Ala Ala Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gin. Leu
640 64 5 650
ACT CTC GCC GCC GAC AAG GGG TAC GAG GTA GTC GCG AAT CTA TTC CAG· 170S
Thr Leu Ala Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe Gin
655 660 665 670
GTG CCC CAG AAT CCC GTA GTC GAC GGG ATT CTT GCT TCA CCT GGG GTA 1753
Val Pro Gin Asn Pro Val Val Aep Gly Ile Leu Ala Ser Pťo Gly Val
675 600 605
• · • · · ·
CTC CGC GGT GCA Ala 690 CAC Kl.3 AAC Asn CTC Leu GAC Asp TGC Cys 695 GTG Val ΤΤΛ AGA GAG Leu Arg Glu GGT Glý 700 GCC Ala ACG Thr 1801
Leu Arg Gly
CTA TTC CCT GTG GTT ATT ACG ACA GTG GAA GAC GCC ATG ACA CCC ΑΑΛ 1849
Leu Phe Pro Val Val Ile Thr Thr Val Glu Asp Ala Met Thr Pro Lys
705 710 715
GCA TTG AAC AGC ΛΑΛ ATG TTT GCT GTC ATT GAA GGC GTG CGA GAA GAC 1097
Ala Leu Asn Ser LyB Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp
720 725 730
CTC CAA CCT CCA TCT CAA AGA GGA TCC TTC ΛΤΛ CGA ACT CTC TCT GGA 1945
Leu Gin Pro Pro Ser Gin Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly
735 740 745 750
CAC AGA GTC TAT GGA TAT GCT CCA GAT GGG GTA CTT CCA CTG GAG ACT 1993
His Arg Val Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr
755 760 76 5
GGG AGA GAC TAC ACC GTT GTC CCA aťa GAT GAT GTC TGG GAC GAC AGC 2041
Gly Arg Asp Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser
770 -ΑΑΛ- Lys -GAT- Asp -GCG- Pro 775 GTG- Val GGA“ Gly 780
Ile Met Leu Ser Ile -CCT Pro CCT Pro ATT Ile AUT Ásn Ser GGA Gly 2009
785 790 795
ΑΛΤ CTA GCC ΑΤΛ GCT TAC ATG GAT GTG TTT CGA CCC ΛΛΑ GTC CCA ATC 213 7
Asn Leu Ala Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe Arg Pro Lys Val Pro Ile
800 < 80 S 810
CAT GTG GCT ATG ACG GdA GCC CTC ΛΛΤ GCT TGT GGC GAG ATT GAG ΛΛΛ 2185
HÍS Val Ala Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Cys Gly Glu Ile Glu Lys
815 820 025 830
GTA AGC TTT AGA AGC ACC AAG CTC GCC ACT GCA CAC CGA CTT GGC CTT 2233
Val Ser Phe Arg Ser Thr Lys Leu Ala Thr Ala His Arg Leu Gly Leu
835 840 045
AGG TTG GCT GGT CCC GGA GCA TTC GAT GTA AA.C ACC GGG CCC AAC TGG 2281
Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ala Phe Asp Val Asn Thr Oly Pro Asn Trp
850 855 860
GCA ACG TTC ATC ΛΑΑ CGT TTC CCT CAC ΛΛΤ CCA CGC GAC TGG GAC AGG 2329
Ala Thr Phe Ile Lys Arg Phe Pro Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg
065 870 875
CTC CCC TAC CTC AAC CTA CCA TAC CTT CCA CCC ΑΛΤ GCA GGA CGC CAG 2377
Leu Pro Tyr Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Gly Arg Gin
ΘΒΟ 8 05 890
-45• · * · í-
TAC Tyr Θ95 CAC His CTT GCC ATG GCT GCA TCA GAG TTC ΑΛΛ GAG Glu ACC Thr CCC Pro GAA Glu CTC Leu 910 2425
Leu Ala Met Ala 900 Ala Ser Glu Phe Lys 905
GAG AGT GCG GTC AGA GCA ATG OZVA GCA GCA GCC AAC GTG GAC CCA CTA 2473
Glu Ser Ala Val Arg 915 Ala Met Glu Ala Ala 920 Ala Asn Val Asp Pro 925 Leu
TTC CAA TCT GCA CTC AGT GTG TTC ATG TGG CTG GAA GAG AAT GGG ATT 2521
Phe Gin Sor Ala 930 IjQU 6e v Val Píie Met 935 Τ’V rk a. IiG Va Glu GlU Tl r.^ non 940 Gly ile
GTG ACT GAC ATG GCC AAC TTC GCA CTC AGC GAC CCG AAC GCC CAT CGG 2569
Val Thr Asp 945 Met Ala Asn Phe Ala Leu 950 Ser Asp Pro Asn 955 Ala His Arg
ATG CGA AAT TTT CTT GCA AAC GCA CCA CAA GCA GGC AGC AAG TCG CAA 2617
Met Arg 960 Asn Phe Leu Ala Asn 955 Ala Pro Gin Ala Gly 970 Ser Lys Ser Gin'
AGG GCC AAG TAC GGG ACA GCA GGC TAC GGA GTG GAG GCT CGG GGC CCC 2665
Arg 975 Ala Lys Tyr Gly Thr 900 Ala Gly Tyr Gly Val 985 Glu Ala Arg Gly Pro 990
ACA CCA GAG GAA GCA CAG AGG GAA AAA GAC ACA CGG ATC TCA AAG AAG 2713
Thr Pro Glu Glu Ala 99S Gin Arg Glu Lys Asp Thr 1000 Arg Ile Ser Lys Lys 1005
ATG GAG ACC ATG GGC ATC TAC TTT GCA ACA CCA GAA TGG GTA GCA CTC 2761
Met Glu Thr Met Gly 1010 Ile Tyr Phe Ala Thr 1015 Pro Glu Trp Val Ala 1020 Leu
A AT GGG CAC CGA GGG CCA AGC CCC GGC CAG CTA AAG TAC TGG CAG AAC 2809
Asn Gly His Arg 1025 Gly Pro Ser Pro Gly 1030 Gin Leu LyS Tyr Trp 103 5 Gin Asn
ACA CGA GAA ATA CCG GAC CCA AAC GAG GAC TAT CTA GAC TAC GTG CAT 2057
Thr Arg Glu 1040 Ile Pro Asp Pro Asn Glu 1045 Asp Tyr Leu Asp 1050 Tyr Val His
GCA GAG AAG AGC CGG TTG GCA TCA GAA GAA CAA ATC CTA AGG GCA GCT 2 905
Ala Glu 1055 Lys Ser Arg LeU Ala 1060 Ser Glu Glu Gin Ile 1065 Leu Arg Ala Ala 1070
ACG TCG ATC TAC GGG GCT CCA GGA CAG GCA GAG CCA CCC CAA' GCT TTC 2953
Thr Ser Ile Tyr Gly Ala 1075 Pro Gly Gin Ala Glu 1080 Pro Pro Gin Ala Phe 1005
ATA GAC GAA GTT GCC ΑΛΑ GTC ΤΛΤ GAA ATC AAC CAT GGA CGT GGC CCA 3 001
Ile Aůp GlU Val Ala 1090 Lys Val Tyr Glu Ile 1095 Asn His Gly Arg Gly 1100 Pro
-46- • · • • • • · · • · · » • • 4 · • • ·· · · · · ·'· · · · • · · · · · 9 ···· ·' ·· 9 · ··.··· · · • · β · • · 9 9 9 9 9 9 9
AAC CAA GAA CAG ATG ΑΛΑ GAT CTG CTC TTG ACT GCG ATG GAG ATG AAG 3049
Aen Gin Glu Gin Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys
110E 1110 1115
CAT CGC ΛΑΤ CCC AGG CGQ GCT CTA CCA AAG CCC AAG CCA ΛΛΛ CCC ΛΑΤ 3 097
His Arg Aen Pro Arg Arg Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn
1120 1125 1130
GCT CCA ACA CAG AGA CCC CCT GGT CGG CTG GGC CGC TGG ATC AGG ACC 3145
Ala Pro Thr Gin Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr
113 5 1140 1145 1150
GTC TCT GAT GAG GAC CTT GAG TGAGGCTCCT GGGAGTCTCC CGACACCACC 3196
Val Ser Asp Glu Asp Leu Glu
1155
CGCGCAGGTG TGGACACCAA TTCGGCCTTA CAACATCCCA AATTGGATCC GTTCGCGGGT 3256
CCCCT 3261
INFORMACE PRO SEQ ID NO:30:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 1012 AMINOKYSELIN TYP: AMINOKYSELINA TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: protein POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:
Met 1 Thr Asn Leu Gin 5 Asp Gin Thr Gin Gin 10 Ile Val Pro Phe ile 15 Arg
Ger Leu Leu Met 20 Pro Thr Thr Gly Pro 25 Ala Ser Ile Pro Asp Asp 30 Thr
Leu Glu Lys 35 His Thr Leu Arg Ser 40 Glu Thř Seř Thr Tyr 45 Asn Leví Thr
Val Gly 50 Asp Thr Gly Ser Gly 55 Leu Ile Val Phe Phe 60 Pro Gly Phe Pro
Gly 65 Sor Ile Val Gly Ala 70 His Tyr Thr Leu Gin 75 Gly Asn Gly Asn Tyr 80
Lya Pho Asp Gin Met Leu Leu Thr Ala Gin Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Sex- Thr 100 105 HO
Leu Pro Gly 115 Gly Val Tyr Ala Leu 120 Asn Gly Thr Ile Asn 125 Ala Val Thr
Phe Gin 130 Gly Ser Leu Ser Glu 135 Leu Thr Asp Val Ser 140 Tyr Asn Gly Leu
Met 145 Ser Ala Thr Ala Asn 150 Ile Asn Asp Lys Ile 155 Gly Asn Val Leu Val 160
Gly Glu Gly Val Thr 165 Val Leu Ser Leu Pro 170 Thr Ser Tyr Asp Leu 175 Gly
Tyr Val Arg Leu 180 Gly Asp Pro Ile Pro 185 Ala Ile Gly Leu Asp 190 Pro Lys
Met Val Ala 195 Thr cys Asp Ser Ser 200 Asp Arg Pro Arg Val 205 Tyr Thr Ile
Thr Ala 210 Ala Asp Asp Tyr Gin 215 Phe Ser Ser Gin Tyr 220 Gin Pro Gly Gly
Val 225 Thr Ile Thr Leu Phe 23 0 Ser Ala Asn Ile Asp 235 Ala Ile Thr Ser Leu 240
Ger Val Gly Gly Glu 245 Leu val Phe Gin Thr 250 ser Val His Gly Leu 255 val
Leu Gly Ala Thr 260 Ile Tyr Leu Ile Gly 265 Phe Asp Gly Thr Thr 270 Val Ile
Thr Arg Ala 275 Val Ala Ala 1 Asn Asn 200 Gly Leu Thr Thr Gly 285 Thr Asp Asn
Leu Met 290 Pro Phe Asn Leu Val 295 Ile Pro Thr Asn Glu 300 Ile Thr Gin Pro
Ile 305 Thr Ser Ile Lys Leu 310 Glu Ile Val Thr Ser 3X5 Lys Ser Gly Gly Gin 320
Ala Gly Asp Gin Met 325 Ser Trp Ser Ala Arg 330 Gly Ser Leu Ala Val 335 Thr
Ile His Gly Gly 340 Asn Tyr Pro Gly Ala 345 Leu Arg Pro Val Thr 350 Leu val
Ala Tyr Glu 355 Arg Val Ala Thr Gly 360 Ser Val val Thr Val 3 65 Ala Gly Val
Ser Asn 370 Phe Glu Leu Ile Pro 375 Asn Pro Glu Leu Ala 380 Lys Asn Leu Val
Thr GlU Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr • Thr Lys Leu
385 390 395 400
ile Leu Ser Glu Arg 405 Asp Arg Leu Gly ile 410 Lys Thr Val Trp Pro 415 Thr
Arg Glu Tyr Thr 420 Asp Phe Arg Glu Tyr 425 Phe Met Glu Val Ala 430 Asp Leu
Asn Ser Pro 435 Leu Lys Ile Ala Gly 440 Ala Phe Gly Phe Lys 445 Asp Ile Ile
Arg Ala 450 Ile Arg Arg Ile Ala 455 Val Pro Val Val Ser 460 Thr Leu Phe Pro
Pro 465 Ala Ala Pro Leu Ala 470 His Ala Ile Gly Glu 475 Gly Val Asp Tyr Leu 480
Leu Gly Asp Glu Ala 485 Gin Ala Ala Ser Gly 490 Thr Ala Arg Ala Ala 495 Ser
Gly Lys Ala Arg 500 Ala Ala Ser Gly Arg 505 Xle Arg Gin Leu Thr 510 Leu Ala
Ala TAsp Lys 515 Gly Tyr Glu Val Val 520 Ala Asn Leu Phe Gin 525 Val Pro Gin
Asn Pro 530 Val Val Asp Gly Ile 535 Leu Ala Ser Pro Gly 540 Val Leu Arg Gly
Ala 545 Híe Asn Leu Asp Cys 550 Val Leu Arg Glu Gly 555 Ala Thr Leu Phe Pro 560
Val Val Ile Thr Thr 56 5 Val Glu Asp Ala Met 570 Thr Pro Lys Ala Leu 575 Asn
Ser Lys Met Phe 580 Ala Val Ile Glu Gly 585 Val Arg Glu A-sp Leu 590 Gin Pro
Pro Ser Gin 595 Arg Gly Ser Phe Ile 600 Arg Thr Leu Ser Gly 605 His Arg Val
Tyr Gly 610 Tyr Ala Pro Asp Gly 615 Val Leu Pro Leu Glu 620 Thr Gly Arg Asp
, Tyr 625 Thr Val Val Pro Ile 630 Asp Asp Val Trp -Asp 635 -Asp Ser Ile Met Leu. 640
Ser Lys Asp Pro Ile 645 Pro Pro Ile Val Gly 650 Asn Ser Gly Asn Leu 655 Ala
Ile Ala Tyr Met 660 Asp Val Phe Arg Pro 665 Lys Val Pro Ile His 670 Val Ala
ιΐ·Λ·χυ»..<·“»ΊΛ • · · ·
Met Thr Gly 675 Ala Leu Asn Ala Cys 680 Gly GlU Ile Glu Lya 6BS Val Ser Phe
Arg Ser 690 Thr Lys Leu Ala Thr 695 Ala His Arg Leu Gly 700 Leu Arg Leu Ala
Gly 705 Pro Gly Ala Phe Asp 710 Val Asn Thr Gly Pro 715 Asn Trp Ala Thr Phe 720
Ile Lys Arg Phe Pro 725 His Asn Pro Arg Λερ 730 Trp Asp Arg Leu Pro 73 5 Tyr
Leu Asn Leu Pro 740 Tyr Leu Pro Pro Asn 745 Ala Gly Arg Gin Tyr 750 His Leu
Ala Met Ala 755 Ala Glu Phe Lys 760 Glu Thr pro Glu Leu 765 Glu Ser Ala
Val Arg 770 Ala Met GlU Ala Ala 775 Ala Asn val Asp Pro 780 Leu Phe Gin Ser
Ala 785 Leu Ser Val Phe Met 790 Trp Leu Glu Glu Asn 795 Gly Ile val Thr Asp 800
Met Ala Asn Phe Ala 005 Leu Ser Asp Pro Asn 010 Ala Hio Arg Met Arg 815 Asn
Phe Leu Ala Asn 820 Ala Pro Gin Ala Gly 825 Ser Lya Ser Gin Arg 830 Ala Lys
Tyr Gly Thr 835 Ala Gly Tyr 1 { Gly Val 040 Glu Ala Arg Gly Pro 845 Thr Pro Glu
Glu Ala 850 Gin Arg Glu Lys Asp 055 Thr Arg Ile Ser Lys 860 Lys Met Glu Thr
Met 065 Gly Ile Tyr Phe Ala 870 Thr Pro Glu Trp val 875 Ala Leu Asn Gly His 880
Arg Gly Pro Ser Pro 005 Gly Gin Leu Lys Tyr 890 Trp Gin Asn Thr Arg 095 Glu
Ile Pro Asp Pro 900 Asn Glu Asp Tyr Leu 905 Asp Tyr Val His Ala 910 Glu LyB
Ser Arg Leu 915 Ala Ser Glu Glu Gin 920 Ile Leu Arg Al.a ,.Ala 925 . Thr Ser Ile
Tyr Gly 930 Ala Pro Gly Gin Ala 935 Glu Pro • Pro Gin Ala 940 Phe Ile Asp Glu
Val Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn , His Gly Arg Gly Pro > Asn i Gin i Glu
-50···· ·· · · • · 9 9 9 9
945 950 955 960
Gin Met Lys Asp Leu 965 Leu Leu Thr Ala Met 970 Glu Met Lys His Arg 975 Asn
Pro Arg Arg Ala 980 Leu Pro Lys Pro Lys 985 Pro Lys Pro Asn Ala 990 Pro Thr
Gin Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr Val Ser Asp
995 1000 1005
Glu Asp Leu Glu 1010
INFORMACE PRO SEQ ID NO:31: SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 3264 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA ZNAKY: JMÉNO/KLÍČ: CDS UMÍSTĚNÍ: 97..531 POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:
GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC
AGGCCATCAC TGCCTTGTTC
114
CTGGTTGGAA CTCCTCTTTC TGCTGTACTA TCGTTG ATG
GTG AGT AGA GAT CAG
Met Val Ser 1015 Arg Asp Gin
AGA AAC GAT CGC AGC GAT GAC ΛΛΛ CCT GAT GGA TCA CAC CCA ACA GAT
Thr Asn Asp Arg Ser Asp AGp Lyo Pro Asp Gly Ser His Pro Thr Asp
1020 1025 103 0
TGT TCG GTT GAT ACG GAG CCT TCT GAT GCC AAC GAC CGG ACC GGC GTC.
Cys Ser Val His Thr Glu pro Ser Asp Ala Asn Asp Arg Thr Gly Val
1035 1040 1045 1050
GAT TCC GGA CGA GAC CCT GGA GAA GCA CAC ACT CAG GTC CGA AAC CTC
Hifl Ser Gly Arg His Pro Gly Glu Ala His Thr Gin Val Arg Asn Leu
1055 1060 1065
GAC ΤΤΛ CAA CTT GAC TGT AGG GGA TAC AGG GTC AGG ACT ΑΛΤ TGT CTT
162
210
250
306
-51£
ÍT'
Asp Leu Gin Leu 1070 Asp Cys Arg Gly Tyr Arg 1075 Val Arg Thr Asň Cys ιοβο Leu
TTT CCC TGG ATT CCC TGG TTC AGT TGT AGG TGC TCA CTA CAC ACT GCA 354
Phe Pro Trp Ile Pro Trp Phe Ser Cys Arg Cys Ser Leu His Thr Ala
10BE 1090 1095
GAG CAG TGG GAA CTA CCA ATT CGA CCA GAT GCT CCT GAC AGC GCA GAA 402
Glu Gin Trp GlU Leu Pro Ile Arg Pro Asp Ala Pro Asp Ser Ala Glu
1100 1105 1110
CCT GCC TGC CAG CTA CAA CTA CTG CAG GCT AGT GAG CAG GAG TCT AAC 4S0
Pro Ala Cys Gin Leu Gin Leu Leu Gin Ala Ser Glu Gin GlU Ser Asn
1115 1120 1125 1130
CGT ACG GTC AAG CAC ACT CCC TGG TGG CGT TTA TGC ACT AAA CGG AAC 498
Arg Thr Val Lys His Thr Pro Trp Trp Arg Leu cys Thr LyB Arg Asn
1135 1140 1145
CAT AAA CGC AGT GAC CTT CCA CGG AAG CCT GAG TGAGTTGACT GACTACAGCT 551
His Lys Arg Ser Asp Leu Pro Arg Lys Pro Glu
1150 1155
acaacgggct GATGTCAGCC ACTGCGAACA TCAACGACAA GATCGGGAAC GTTCTAGTTG Gll
GAGAAGGGGT GACTGTTCTC agtctaccga CTTCATATGA CCTTAGTTAT GTGAGACTCG 671
GTGACCCCAT CCCCGCAGCA GGACTCGACC CGAAGTTGAT GGCCACGTGC GACAGTAGTG 731
ACAGACCCAG AGTCTACACC ATAACAGCTG CAGATGAATA CCAATTCTCG TCACAACTCA 791
TCCCGAGTGG CGTGAAGACC ACACTGTTCT CCGCCAACAT CGATGCTCTC ACCAGCTTČA 851
GCGTTGGTGG TGAGCTTGTC TTCAGCCAAG TAACGATCCA aagcattgaa GTGGACGTCA 911
CCATTCACTT CATTGGGTTT GACGGGACAG ACGTAGCAGT CAAGGCAGTT GCAACAGACT 971
TTGGGCTGAC AACTGGGACA AACAACCTTG TGCCATTCAA CCTGGTGGTC CCAACAAATG 1031
AGATCACCCA GCCCATCACT TCCATGAAAC TAGAGGTTGT GACCTACAAG ATTGGCGGCA 1091
CCGCTGGTGA CCCAATATCA TGGACAGTGA GTGGTACACT AGCTGTGACG GTGCACGGAG 1151
GCAACTACCC TGGGGCTCTC CGTCCTGTCA CCCTGGTGGC CTATGAACGA GTGGCTGCAG 1211
GATCTGTTGT CACAGTTGCA GGGGTGAGCA ACTTCGAGCT AATCCCCAAC CCTGAGCTTG 1271
CAAAGAACCT AGTTACAGAG TATGGCCGCT TTGACCCCGG AGCAATGAAC TACACCAAAC 1331
TAATACTGAG TGAGAGAGAT cgtctaggca TCAAGACAGT CTGGCCCACC AGGGAGTACA 1391
CCGATTTCAG GGAGTACTTC ATGGAGGTTG CAGATCTCAA CTCACCCCTA AAGATTGCAG 1451
-52- ♦ · • · · · • · • · · · ·
GAGCATTTGG CTTTAAGGAC ATAATCCGAG CCATTCGGAA GATTGCGGTG CCAGTGGTAT 1511
CCACACTCTT CCCTCCAGCT GCACCCCTAG CACATGCAAT CGGAGAAGGT GTAGACTACC 1571
TCCTGGGCGA CGAGGCCCAA GCAGCCTCAG GGACAGCTCG AGCCGCGTCA GGAAAAGCTA 1631
GAGCTGCCTC AGGACGAATA AGGCAGCTAA CTCTCGCAGC TGACAAGGGG TGCGAGGTAG 1691
TCGCCAACAT GTTCCAGGTG CCCCAGAATC CCAITGTTGA TGGCATTCTG GCATCCCCAG 17 51
GAATCCTGCG TGGCGCACAC AACCTCGACT GCGTGCTATG ggagggagcc ACTCTTTTCC 1011
CTGTTGTCAT TACGACACTC GAGGATGAGC TGACCCCCAA GGCACTGAAC AGCAAAATGT 1071
TTGCTGTCAT TGAAGGTGTG CGAGAGGACC TCCAGCCTCC ATCCCAACGG GGATCCTTCA 1931
TTCGAACTCT CTCTGGCCAT AGAGTCTATG GCTATGCCCC AGACGGAGTA CTGCCTCTGG 1991
AGACCGGGAG AGACTACACC GTTGTCCCAA TTGATGATGT GTGGGACGAT AGCATAATGC 2051
TGTCGCAGGA CCCCATACCT CCAATCATAG GGAACAGCGG CAACCTAGCC ATAGCATACA 2111
TGÚATGTCTT CAGGCCCAAG GTCCCCATCC ACGTGGCTAT GACAGGGGCC CTCAATGCCC 2171
GCGGTGAGAT CGAGAGTGTT ACGTTCCGCA GCACCAAACT CGCCACAGCC CACCGACTTG 2231
GCATGAAGTT AGCTGGTCCT GGAGCCTATG ACATTAATAC AGGACCTAAC TGGGCAACGT 2291
TCGTCAAACG TTTCCCTCAC AATCCGCGAG ACTGGGACAG GTTGCCCTAC CTCAACCTTC 2351
CTTATCTCCC ACCAACAGCA GGACGTCAGT t TCCATCTAGC CCTGGCTGCC TGCGAGTTCA 2411
AAGAGACCCC AGAACTCGAA Óacgctgtgc gcgcaatgga TGCCGCTGCA AATGCCGACC 2471
CATTGTTCCG CTCAGCTCTC CAGGTCTTCA TGTGGTTGGA AGAAAACGGG ATTGTGACCG 2531
ACATGGCTAA CTTCGCCCTC AGCGACCCAA ACGCGCATAG GATGAAAAAC TTCCTAGCAA 2591
ACGCACCCCA GGCTGGAAGC AAGTCGCAGA gggccaagta TGGCACGGCA GGCTACGGAG 2651
TGGAGGCTCG AGGCCCCACA CCAGAAGAGG CACAGAGGGA AAAAGACACA CGGATCTCCA 2711
AGAAGATGGA AACAATGGGC ATCTACTTCG CGACACCGGA ATGGGTGGCT CTCAACGGGC 2771
ACCGAGGCCC AAGCCCCGGC CAACTCAAGT ACTGGCAAAA CACAAGAGAA ataccagagc 2031
CCAATGAGGA CTACCCAGAC TATGTGCACG CGGAGAAGAG CCGGTTGGCG TCAGAAGAAC 2091
AGATCCTACG GGCAGCCACG TCGATCTACG GGGCTCCAGG ACAGGCTGAA CCACCCCAGG 2951
CCTTCATAGA CGAGGTCGCC AGGGTCTATG AAATCAACGA TGGGCGTGGT CCAAACCAGG 3011
-53··♦· ·· ♦·♦· 00 • ··· 0 · ·
AGCAGATGAA GGACCTGCTC CTGACTGCGA TGGAGATGAA GCATCGCAAT CCCAGGCGGG 3071
CTCCACCAAA GCCAAAGCCA AAACCCAATG CTCCATCACA GAGACCCCCT GGACGGCTGG 3131
GCCGCTGGAT CAGGACGGTC TCCGACGAGG ACTTGGAGTG AGGCTCCTGG GAGTCTCCCQ 3191
ACACTACCCG CGCAGGTGTG GACAGCAATT CGGCCTTCTA CCATCCCAAA TTGGATCCGT 3 251
TCGCGGGTCC CCT 3264
INFORMACE PRO SEQ ID NO:32:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 145 AMINOKYSELIN TYP: AMINOKYSELINA TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: protein_
POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:32:
Met 1 Val Ser Arg Asp 5 Gin Thr Asn Asp Arg 10 ser Asp Asp Lys Pro 15 Asp
Gly Ser His Pro 20 Thr Asp Cys Ser Val 25 His Thr Glu Pro Ser 30 Asp Ala
Asn Asp Arg 35 Thr Gly Val His Ser 4 0 Gly Arg His Pro Gly 45 Glu Ala His
Thr Gin 50 Val Arg Asn Leu Asp 55 Leu Gin Leu Asp Cys 60 Arg Gly Tyr Arg
Val 65 Arg Thr Asn Cys Leu 70 Phe Pro Trp Ile Pro 75 Trp Phe Ser Cys Arg 0 0
* Cys Ser Leu His Thr B5 Ala Glu Gin Trp Glu 90 Leu Pro Ile Arg Pro 95 Asp
Ala Pro Asp Ser 100 Ala Glu Pro Ala Cys 10S Gin Leu Gin Leu Leu 110 Gin Ala
Ser Glu Gin 115 Glu Sei’ Asn Arg Thr 120 Val Lys His Thr Pro 125 Trp Trp Arg
. Leu Cys 130 Thř Lys Arg Asn His 135 Lya Arg Ser Asp Leu 140 Pro Arg Lys Pro
Glu
145
• ·
-54INFORMACE PRO SEQ ID NO:33:
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY DÉLKA: 3264 PÁRŮ BAŽÍ TYP: NUKLEOVÁ KYSELINA ŘETĚZEC: JEDNODUCHÝ TYPOLOGIE: KRUHOVÁ
TYP MOLEKULY: cDNA ZNAKY: JMÉNO/KLÍČ: CDS UMÍSTĚNÍ: 131..3169 POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:33:
GGATACOATC GGTCTGACCC CGGGGGAGTC ACCCGGGGAC AGGCCATCAC TGCCTTGTTC 60
CTGGTTGGAA CTCCTCTTTC TGCTGTACTA TCGTTGATGG TGAGTAGAGA TCAGACAAAC 120
GATCGCAGCG ATG ACA AAC CTG ATG GAT CAC ACC CAA CAG ATT GTT CCG 16 9
Met Thr Asn Leu Met Asp His Thr Gin Gin Ile Val Pro
150 155
TTC ATA CGG Arg AGC Seť CTT Leu CTG ATG CCA Pro ACG Thr ACC Thr GGA CCG GCG TCC ATT CCG Pro 217
Phe Ile 160 Leu Met 165 Gly Pro 170 Ala Ser Ile
GAC GAC ACC CTG GAG AAG CAC ACA CTC AGG TCC GAA ACC TCG ACT TAC 265
Asp Asp Thr Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Tlil- Ser Thr Tyr
175 180 105 190
AAC TTG ACT GTA GGG GAT ACA GGG TCA GGA CTA ATT GTC TTT TTC CCT 313
Asn Leu Thr Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro
195 200 205
GGA TTC CCT GGT TCA GTT GTA GGT GCT CAC TAC ACA CTG CAG AGC AGT 361
cly Phe Pro Gly Ser Val Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gin Ser ser
210 - - . 215 220
GGG AAC TAC CAA TTC GAC CAG ATG CTC CTG ACA GCG CAG AAC CTG CCT 409
Gly Asn Tyr Gin Phe Asp Gin Met Leu Leu Thr Ala Gin Asn Leu Pro
22S 230 235
GCC AGC TAC AAC TAC TGC AGG CTA GTG AGC AGG AGT CTA ACC GTA CGG 457
Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg
240 245 250
TCA ACC ACA CTC CCT Pro GGT GGC GTT TAT GCA CTA AAC GGA ACC Thr ATA Ile AAC Asn 270 505
6er 2S5 ser Thr Leu dy 260 Gly Val Tyr Ala Leu 265 Asn Gly
GCA GTG ACC TTC CAC GGA AGC CTG AGT GAG TTG ACT GAC TAC AGC TAC 553
Ala Val Thr Phe His Gly Ser Leu Ser GlU Leu Thr Asp Tyr Ser Tyr
275 2Θ0 285
AAC GGG CTG ATG TCA GCC ACT GCG AAC ATC AAC GAC AAG ATC GGG AAC 601
Aan Gly Leu Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn
250 2 95 300
GTT CTA GTT GGA GAA GGG GTG ACT GTT CTC AGT CTA CCG ACT TCA TAT 649
Val Leu Val Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr
305 310 315
GAC Asp CTT AGT TAT GTG AGA Arg CTC Leu 325 GGT GAC CCC Pro ATC CCC GCA GCA GGA CTC Leu 697
Leu 320 Ser Tyr Val Gly Asp Ile Pro 330 Ala Ala Gly
GAC CCG AAG TTG ATG GCC ACG TGC GAC AGT AGT GAC AGA CCC AGA GTC 745
Asp Pro Lys Leu Met Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val
335 340 345 350
T-AC ACC- -ATA- ACA- GCT GCA GAT GAA TAC CAA TTC TCG TCA CAA CTC ATC 793
Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Glu Tyr Gin Phe Ser Ser Gin Leu Ile
355 360 365
ccg AGT GGC GTG AAG ACC ACA CTG TTC TCC GCC AAC ATC GAT GCT CTC 041
Pro ser oly Val Lys Thr Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Leu
370 375 380
ACC AGC TTC AGC GTT ř GGT GGT GAG CTT GTC TTC AGC CAA GTA ACG ATC 009
Thr Ser Phe Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe ser Gin Val Thr Ile
385 390 395
CAA AGC ATT GAA GTG GAC GTC ACC ATT CAC TTC ATT GGG TTT GAC GGG 937
Gin Ser Ile Olu val Asp Val Thr Ile His Phe Ile Gly Phe Asp Gly
400 405 410
ACA GAC GTA GCA GTC AAG GCA GTT GCA ACA GAC TTT GGG CTG ACA ACT 985
Thr Asp Val Ala Val Lys Ala Val Ala Thr Asp Phe Gly Leu Thr Thr
415 420 425 430
GGG ACA AAC AAC CTT GTG CCA TTC AAC CTG GTG GTC CCA ACA AAT GAG 1033
Gly Thr Asn Asn Leu Val Pro Phe Asn Leu Val Val Pro Thr Asn Glu
435 440 445
ATC ACC CAG CCC ATC ACT TCC ATG AAA CTA GAG GTT GTG ACC TAC AAG 1081
Ile Thr Gin Pro Ile Thr Ser Met Lys Leu Glu Val Val Thr Tyr Lys
450 455 460
···· · · *··« ·« · · • · · ·
-56- TGG ACA GTG AGT Ser
ATT GGC GGC ACC GCT GGT GAC Asp CCA ATA TCA
Ile Gly Gly Thr Ala Gly Pro 470 Ile Ser Trp Thr Val 475
465
CTA GCT GTG ACG GTG CAC GGA GGC AAC TAC CCT GGG GCT CTC
Leu Ala Val Thr Val Hia Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu
400 485 490
GGT ACA 1123 Gly Thr
CGT CCT 1177 Arg Pro
GTC ACC CTG GTG GCC TAT GAA CGA GTG GCT GCA GGA TCT GTT
Val 495 Thr Leu Val Ala Tyr 500 Glu Arg Val Ala Ala 505 Gly Ser Val
GTT GCA GGG GTG AGC AAC TTC GAG CTA ATC CCC AAC CCT GAG
Val Ala Gly Val Ser 515 Asn Phe Glu Leu Ile 520 Pro Asn Pro Glu
GTC ACA 1225 Val Thr
510
CTT GCA 1273
Leu Ala
525
AAG Lys AAC CTA GTT ACA Thr GAG Glu TAT Tyr GGC Gly CGC Arg 535 TTT GAC CCC GGA Pro Gly GCA Ala 540 ATG Met AAC Asn 1321
Asn Leu Val 530 Phe Asp
TAC ACC ΑΑΛ CTA ATA CTG AGT GAG AGA GAT CGT CTA GGC ATC AAG ACA 1369
Tyr Thr Lya Leu Ile Leu ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr
545 550 555
—GTC TGfí CCC ACC AGG GAG TAC ACC GAT TTC AGG GAG TAC TTC ATG GAG 1417
Val Trp Pro Thr Arg GlU Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu
560 565 570
GTT GCA GAT CTC AAC TCA CCC CTA AAG ATT GCA GGA GCA TTT GGC TTT 1465
Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe
S75 500 585 590
AAG GAC ATA ATC CGA GCC ATT CGG AAG ATT GCG GTG CCA GTG GTA TCC 1513
.Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Lys Ile Ala Val Pro Val Val Ser
595 600 605
ACA CTC TTC CCT CCA GCT GCA CCC CTA GCA CAT GCA ATC GGA Gaa GGT 1561
Thr Leu Phe Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly
610 615 620
GTA GAC TAC CTC CTG GGC GAC GAG GCC CAA GCA GCC TCA GGG ACA GCT 1609
Val Asp Tyr I.eu Leu Gly Asp Glu Ala Gin Ala Ala Ser Gly Thr Ala
625 630 635
CGA GCC GCG TCA GGA AAA GCT AGA GCT GCC TCA GGA CGA ATA AGG CAG 1657
Arg Ala Ala Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gin
640 645 650 ·: r 1. ···.»:·
CTA ACT CTC GCA GCT GAC AAG GGG TGC GAG GTA GTC GCC AAC ATG TTC 1705
Leu Thr Leu Ala Ala Asp Lya Gly Cys Glu Val Val Ala Asn Met Phe
655 66 0 665 670
-57• ···'.' · · · · • · ···* · · · · • · · · ·· '··· · · · • · · · · · • ···«« · · · ·
CAG Gin GTG Val CCC Pro CAG Gin ΛΑΤ Asn 675 CCC Pro ATT GTT GAT GGC ATT Ile CTG Leu GCA Ala TCC Ser CCA Pro 685 GGA Gly I7S3
Ile Val Asp Gly 600
atc CTG CGT GGC GCA CAC AAC CTC GAC TGC GTG CTA TGG GAG GGA GCC 18 01
Ile Leu Arg Gly 690 Ala HÍS Asn Lau Asp 695 Cys Val Leu Trp Glu 700 Gly Ala
ACT CTT TTC CCT GTT GTC ATT ACG ACA CTC GAG GAT GAG CTG ACC CCC 1849
Thr Leu Phe 705 Pro Val Val Ile Thr 710 Thr Leu Glu Asp Glu 715 Leu Thr Pro
AAG GCA CTG AAC AGC AAA ATG TTT GCT GTC ATT GAA GGT GTG CGA GAG 1897
Lye Ala 72 0 Leu Asn Ser Lye Met 725 Phe Ala Val Ile Glu 730 Gly Val Arg Glu
GAC CTG CAG CCT CCA TCC CAA CGG GGA TCC TTC ATT CGA ACT CTC TCT 1945
Asp 735 Lau Gin Pro Pro Ser 740 Gin Arg Gly Ser Phe 745 Ile Arg Thr Leu Ser 750
GGC CAT AGA GTC TAT GGC TAT GCC CCA GAC GGA GTA CTG CCT CTG GAG 1993
Gly His Arg Val Tyr 755 Gly Tyr Ala Pro Asp 760 Gly Val Leu Pro Leu 765 Glu
ACC Thr GGG Gly AGA Arg GAC Asp 770 TAC Tyr ACC Thr GTT Val GTC Val CCA Pro 775 ATT GAT GAT GTG TGG Trp 780 GAC Asp GAT Asp 2 041
Ile Asp Asp Val
AGC ΛΤΑ ATG CTG TCG CAG GAC CCC ΛΤΑ CCT CCA ATC ΛΤΑ GGG AAC AGC 20B9
Ser Ile Mot 785 Leu Ser Gin 1 Asp Pro 790 Ile Pro Pro Ile Ile 795 Gly Asn Ser
GGC AAC CTA GCC ΑΤΛ GCA TAC ATG GAT GTC TTC AGG CCC AAG GTC CCC 2137
Gly Asn 800 Leu Ala Ile Ala Tyr 005 Met Asp Val Phe Arg 010 Pro Lys Val Pro
ATC CAC GTG GCT ATG ACA GGG GCC CTC ΛΛΤ GCC CGC GGT GAG ATC GAG 2185
Ile 815 His Val Ala Met Thr 820 Gly Ala Leu Asn Ala 825 Arg Gly Glu Ile Glu 830
AGT GTT ACG TTC CGC AGC ACC AAA CTC GCC ACA GCC CAC CGA CTT GGC 2233
ser val Thť Phe Arg 835 Ser Thr Lys Leu Ala 040 Thr Ala His Arg Leu 045 Gly
ATG AAG ΤΤΛ GCT GGT CCT GGA GCC TAT GAC ATT ΛΛΤ ACA GGA CCT AAC 22 81
Met Lys Leu Ala 850 Gly Pro Gly Ala Tyr 855 Asp Ile Asn Thr Gly 860 Pro Asn
TGG GCA ACG TTC GTC AAA CGT TTC CCT CAC ΛΑΤ CCC CGA GAC TGG GAC 2329
Trp Ala Thr Phe Val Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp
865 070 075 • · * ··»· · ···* ·· • · · · · · · 9 · · · · · · · ·
-58- ··· •
AGG TTG CCC TAC CTC AAC CTT CCT TAT CTC CCA CCA ACA GCA GGA CGT 23 77
Arg Leu Pro Tyr Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Thr Ala Gly Arg
880 885 890
CAG TTC CAT CTA GCC CTG GCT GCC TCC GAG TTC AAA GAG ACC CCA GAA 2425
Gin Phe His Leu Ala Leu Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu
895 900 905 910
CTC GAA GAC GCT GTG CGC GCA ATG GAT GCC GCT GCA AAT GCC GAC CCA 2473
Leu Glu Asp Ala Val Arg Ala Met ASp Ala Ala Ala Asn Ala Asp Pro
915 920 925
TTG TTC CGC TCA GCT CTC CAG GTC TTC ATG TGG TTG GAA GAA AAC GGG 2521
Leu Phe Arg Ser Ala Leu Gin Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Oly
930 935 940
ΑΤΓ GTG ACC GAC ATG GCT AAC TTC GCC CTC AGC GAC CCA AAC GCG CAT 2 56 9
Ile Val Thr Asp Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His
945 950 955
AGG ATG AAA AAC TTC CTA GCA AAC GCA CCC CAG GCT GGA AGC AAG TCG 2617
Arg Met Lys Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gin Ala Gly Ser Lys Ser
960 965 970
CAG-AGG—GCC—AAG—TAT— GGC-AGG—GGA—GGG—T-AG—GGA—GTG—GAG—GCT—GGA-GGG-26 65
Gin 975 Arg Ala Lys Tyr Gly 98 0 Thr Ala Gly Tyr Gly 905 val GlU Ala Arg Gly 990
CCC ACA CCA GAA GAG GCA CAG AGG GAA AAA GAC ACA CGG ATC TCC AAG 2713
Pro Thr Pro Glu Glu 995 Ala t Gin Arg Glu Lys Asp 1000 Thr Arg Ile Ser 100S Lys
AAG ATG GAA ACA ATG GGC ATC TAC TTC GCG ACA CCG GAA TGG GTG GCT 2761
Lys Met Glu Thr Met 1010 Gly Ile Tyr Phe Ala 1015 Thr Pro Glu Trp Val 1020 Ala
CTC AAC GGG CAC CGA GGC CCA AGC CCC GGC CAA CTC AAG TAC TGG CAA 2B09
Leu Asn Gly His 1025 Arg Gly Pro Ser Pro 1030 Gly Gin Leu Lys Tyr 1035 Trp Gin
AAC ACA AGA GAA ATA CCA GAG CCC AAT GAG GAC TAC CCA GAC TAT GTG 2857
Asn Thr Arg 1040 Glu Xle Pro Glu Pro 1045 Asn Glu Asp Tyr Pro 1050 Asp Tyr Val
CAC GCG GAG AAG AGC CGG TTG GCG TCA GAA GAA CAG ATC CTA CGG GCA 2905
His Ala 1055 Glu Lys. Ser Arg Leu 1060 Ala Ser Glu Glu Gin 1065 Ile Leu Arg Ala 1070
GCC ACG TCG ATC TAC GGG GCT CCA GGA CAG GCT GAA CCA CCC CAG GCC 2953
Ala Thr Ser Ile Tyr Gly Ala Pro Gly Gin Ala Glu Pro Pro Gin Ala
1075 1080 1085 r · • · • · ··« ··
-59• ···» '··»* ·· · · · · • « · ···· • · · · · ft f> · · · · fl·· · ·· ··· * ··· fl·
TTC Phe ΛΤΑ Ile GAC Λερ GAG GTC Glu Val 1090 GCC Ala AGO Arg GTC Val TAT GAA Tyr Glu 1095 ATC Ile AAC Asn CAT His GGG CGT Gly Arg 1100 GGT Gly 3001
CCA AAC CAG GAG CAG ATG AAG GAC CTG CTC CTG ACT GCG ATG GAG ATG 3049
Pro Asn Gin Glu Gin Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met GlU Met
1105 1110 1115
AAG CAT CGC AAT CCC AGG CGG GCT CCA CCA AAG CCA AAG CCA ΆΛΑ CCC 3097
Lyo His Arg Aen Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro
1120 1125 1130
AAT GCT CCA TCA CAG AGA CCC CCT GGA CGG CTG GGC CGC TGG ATC AGG 3145
Asn Ala Pro Ser Gin Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg
1135 1140 1145 1150
ACG GTC TCC GAC GAG GAC TTG GAG TGAGGCTCCT GGGAGTCTCC CGACACTACC 3199
Thr Val Ser Asp Glu Aep Leu Glu
1155
CGCGCAGGTG TGGACACCAA TTCGGCCTTC TACCATCCCA AATTGGATCC GTTCGCGGGT 3259
CCCCT 3264 ťNFORMAGE-PR0-SEQ-ID-NO434^_
SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY
DÉLKA: 1013 AMINOKYSELIN
TYP: AMINOKYSELINA
TYPOLOGIE: LINEÁRNÍ
TYP MOLEKULY: protein POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:
Met 1 Thr Asn Leu Met 5 Asp His Thr Gin Gin 10 Ile Val Pro Phe Ile 15 Arg
Ser Leu Leu Met 20 Pro Thr Thr Gly Pro 25 Ala Ser Ile Pro Asp 30“ Λερ Thr
Leu Glu Lys 35 His Thr Leu Arg Ser 40 Glu Thr Ser Thr Tyr 45 Asn Leu Thr
Val Gly 50 Aap Thr Gly Ser Gly 55 Leu Ile Val Phe Phe 60 Pro Gly Phe Pro
Gly 65 Ser Val Val Gly Ala 70 Hle Tyr Thr Leu Gin 75 Ser Ser Gly Asn Tyr 00
Qln Pho Asp Gin Met Leu Leu Thr Ala Gin Λεη Leu Pro Ala Ser Tyr
-6085 90 95
Asn Tyr Cys Arg 100 Leu Val Sor Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Sex- Thr
105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe His Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Tyr Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Aen Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Ser
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ala Gly Leu Asp Pro Lys
180 18 5 190
Leu Met Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
19S 200 205
Thr Ala Ala Asp Glu Tyr Gin Phe Ser Ser Gin Leu -TTe-Pro—Ser—Gly-
210 215 220
Val Lys Thr Thr Leu Phe Ser Ala ASII Ile Asp Ala Leu Thr Ser Phe
22S 230 235 240
Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Ser Gin Val Thr Ile Gin Ser Ile
245 1 250 255
Glu Val Asp Val Thr 116 His Phe Ile Gly Phe Αερ Gly Thr Asp Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Val Ala Thr Asp Phe Gly Leu Thr Thr Gly Thr Asn
275 280 205
Asn Leu Val Pro Phe Asn Leu Val Val Pro Thr Asn Glu Ile Thr Gin
2 90 295 300
Pro Ile Thr Ser Met Lys Leu Glu Val Val Thr Tyr Lys Ile Gly Gly
305 310 315 320
Thr Ala Gly Asp Pro Ile Ser Trp Thr Val Ser Gly ThrLeu Ala Val
325 330 335
Thr Val His Gly Gly Asn Tyr Pra i Gly Ala Leu Arg • Pro Val Thr Leu
340 345 350
Val Ala . Tyr Glu Arg Val Ala Ala Gly Ser Val Val . Thr Val Ala Gly
355 360 365
Val Ser 370 Asn Phe Glu Leu Ile 3 75 Pro Asn Pro Glu Leu 380 Ala Lys Asn Leu
Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp pro Gly Ala Met Aen Tyr Thr Lys
305 390 395 400
Leu Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro
405 410 415
Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp
420 425 430
Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Aop Ilo
435 440 445
Ile Arg Ala Ile Arg Lys Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe
450 455 460
Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr
465 470 475 480
Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gin Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala
485 490 495
Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gin Leu Tlít Leu
50 0 505 510
Ala Ala Asp Lys Gly Cys GlU Val Val Ala Asn Met Phe Gin Val Pro
515 520 525
Gin Asn Pro Ile Val Asp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Ile Leu Arg
530 535 540
Gly Ala His Asn Leu Asp Cys Val Leu Trp Glu Gly Ala Thr Leu Phe
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Thr Thr Leu Glu Asp Glu Leu Thr Pro Lys Ala Leu
565 S70 575
Asn Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp Leu Gin
500 585 590
Pro Pro Ser Glil Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ber Gly Hie Arg
595 600 605 .. , -
Val Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu . Thr Gly Arg
610 615 620
Asp Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser Ile Met 625 630 635 640
·· 0 0 0 0 0 0 ·· • · · · · · 0 • ···· · · · · • 0 0 r 000 -000
0 0 · 0 • 0 0*0 0 0 · ·
Leu Ser Gin Asp Pro 645 Ile Pro Pro Ile Ile 650 Gly Asn Ser Gly Asn 655 Leu
Ala Ile Ala Tyr 660 Met Asp Val Phe Arg 665 pro Lys Val Pro Ile 670 Híb Val
Ala Met Thr 675 Gly Ala Lev» Asn Ala 680 Arg Gly Glu Ile Glu 685 Ser Val Thr
Phe Arg 690 Ser Thr Lys Leu Ala 695 Thr Ala Híb Arg Leu 700 Gly Met Lys Leu
4 Ala 705 Gly Pro Gly Ala Tyr 710 Asp Ile Asn Thr Gly 715 Pro Asn Trp Ala Thr 720
Phe Val Lys Arg Phe 725 Pro His Asn Pro Arg 730 Asp Trp Λερ Arg Leu 73 5 Pro
Tyr Leu Asn Leu 740 Pro Tyr Leu Pro Pro 745 Thr Ala Gly Arg Gin 750 Phe His
Leu Ala Leu 75Λ. Ala Ala Ser Glu Plve 760 Lys Glu Thr Pro Glu 765 Leu Glu Asp
Ala Val 770 Arg Ala Met Asp Ala 775 Ala Ala Asn Ala Asp 780 Pro Leu Phe Arg
Ser 785 Ala Leu Gin Val Phe 790 Met Trp Leu Glu Glu 795 Asn Gly Ile Val Thr 800
Asp Met Ala Asn Phe BOS Ala Leu Ser Asp Pro 010 Asn Ala His Arg Met 815 Lys
Agu Phe Leu Ala 820 Asn Ala Pro Gin Ala 825 Gly Ser Lys Ser Gin 830 Arg Ala
Lys Tyr Gly 835 Thr Ala Gly Tyr Gly 040 Val Glu Ala Arg Gly 045 Pro Thr Pro
Glu Glu 850 Ala Gin Arg Glu Lys 855 Asp Thr Arg Ile Ser 060 Lys Lys Met Glu
Thr 865 Met Gly Ile Tyr Phe 870 Ala Thr Pro Glu Trp 875 Val Ala Leu Αεη Gly 880
HÍC! Arg Gly Pro Ser 085 Pro Gly Gin Leu Lys 090 Tyr Trp Gin ASil Thr 8 95 Arg
Glu Ile Pro Glu 900 Pro Asn GlU Asp Tyr 905 Pro Asp Tyr Val His 910 Ala Glu
Lys Ser Arg 915 Leu Ala Ser Glu Glu 920 Gin Ile Leu Arg Ala 925 Ala Thr Ser
Ile Tyr 930 Gly Ala Pro Gly Gin 935 Ala Glu Pro Pro Gin 940 Ala Phe Ile Asp
Glu 94 5 Val Ala Arg Val Tyr 950 Glu Ile Asn His Gly 955 Arg Gly Pro Asn Gin 960
Glu Gin Met Lys Asp 965 Leu Leu Leu Thr Ala 970 Met Glu Met Lys His 975 Arg
» Asn Pro Arg Arg 90 0 Aln Pro Pro Lys Pro 905 Lys Pro Lys Pro Asn 990 Ala Pro
Ser Gin Arg 995 Pro Pro Gly Arg Leu Gly 1000 Arg Trp Ile Arg Thr 1005 Val Ser
Anp Glu Asp 1010 Leu Glu
• φ • φφ· φφ φ·φ· « φφφ φφφ

Claims (20)

1. Způsob přípravy živého Birnavirusu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:
přípravu cDNA obsahující genomové segmenty A a B viru infekční nemoci bursy, transkripci cDNA určenou pro produkci syntetických transkriptů RNA, transfekci hostitelských buněk syntetickými transkripty RNA, inkubaci hostitelských buněk na živné půdě a isolaci živého viru infekční nemoci ze živné půdy.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Birnavirus je virus infekční nemoci bursy.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou Věro
-buňk-y-Afr-ického-kočkodana,___
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že segmenty A a B cDNA jsou připraveny nezávisle.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že segment A je přítomen v piazmidu pUC19FLAD78 nebo pUC18FLA23.
6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že segment B je přítomen v piazmidu pUC18FLBP2.
7. Živý virus infekční nemoci bursy, kde virus je zkonstruován způsobem zahrnující kroky přípravy genomových segmentů A a B cDNA, která obsahuje virus infekční nemoci bursy, transkripci cDNA určenou pro produkci syntetického transkriptů RNA, transfekci hostitelské buňky syntetickým transkriptem RNA, inkubaci hostitelské buňky na živné půdě a isolaci živého viru infekční nemoci z živné půdy.
8. Syntetická RNA kódující proteiny VP1, VP2, VP3, VP4, a VP5 viru infekční nemoci bursy.
9. Transfekce syntetické RNA do hostitelské buňky podle nároku 8.
10. cDNA obsahující alespoň část genomu viru infekční nemoci bursy vybraná ze skupiny skládající se ze segmentu A, segmentu B a segmentů A a B viru infekční nemoci bursy, kde cDNA obsahuje 5' a 3' konce segmentů.
• · · · * to··
-65• to • ··
11. Rékombinantní vektor obsahující cDNA podle nároku 10.
12. Vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že vektor je plazmid
13. Vektor podle nároku 12, vyznačující se tím, že plazmid je vybrán ze skupiny, která se skládá z pUC19FLAD78, pUC18FLA23 a pUC19FLBP2.
14. Hostitelská buňka transformována vektorem podle nároku 11.
15. Vakcína obsahující virus infekční nemoci bursy podle nároku 7, vyznačující se tím, že virus infekční nemoci bursy je neaktivní nebo dříve oslabený k použití.
16. Způsob přípravy vakcíny živého viru infekční nemoci bursy, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
přípravu úplné cDNA, která obsahuje genomové segmenty A a B viru infekční nemoci bursy, transkripci cDNA pro produkci syntetických transkriptů RNA,
-v-včištění-svntetických transkriptů RNA,_ transfekci hostitelských buněk vyčištěnými transfekty RNA, inkubaci hostitelských buněk v živné půdě, isolaci živého viru infekční nemoci bursy ze živné půdy, oslabení živého viru infekční nemoci bursy, pro produkci viru s redukovanou virulencí a kombinaci živých virů infekční nemoci bursy s farmaceuticky přijatelným nosičem pro produkci živé vakcíny viru infekční nemoci bursy.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že živý virus infekční nemoci bursy je oslaben sériovým úsekem nebo místem kontrolovaným mutací.
18. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hostitelské buňky jsou drůbeží buňky.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že drůbeží buňky jsou buňky kuřat, krocanů nebo křepelek.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že drůbeží buňky jsou buňky kuřecích embryových fíbroblastů nebo buňky embryových ledvin.
CZ0074299A 1996-09-05 1997-07-31 Zpusob prípravy živého Birnaviru, kterým je virusinfekcní choroby bursy, plasmid a zpusob prípravyvakcíny CZ299417B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/708,541 US5871744A (en) 1996-09-05 1996-09-05 Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
PCT/US1997/012955 WO1998009646A1 (en) 1996-09-05 1997-07-31 A method for generating birnavirus from synthetic rna transcripts

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ74299A3 true CZ74299A3 (cs) 1999-08-11
CZ299417B6 CZ299417B6 (cs) 2008-07-16

Family

ID=24846203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0074299A CZ299417B6 (cs) 1996-09-05 1997-07-31 Zpusob prípravy živého Birnaviru, kterým je virusinfekcní choroby bursy, plasmid a zpusob prípravyvakcíny

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5871744A (cs)
EP (2) EP0959901A4 (cs)
JP (1) JP4670025B2 (cs)
KR (1) KR100475427B1 (cs)
CN (1) CN1168500C (cs)
AT (1) ATE460178T1 (cs)
AU (1) AU741055B2 (cs)
BR (1) BR9712012B1 (cs)
CA (1) CA2264488C (cs)
CZ (1) CZ299417B6 (cs)
DE (1) DE69739805D1 (cs)
ES (1) ES2342325T3 (cs)
HU (1) HUP9904365A3 (cs)
IL (2) IL128804A0 (cs)
NO (1) NO991074L (cs)
NZ (1) NZ334667A (cs)
PL (1) PL190220B1 (cs)
WO (1) WO1998009646A1 (cs)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596280B1 (en) * 1997-07-31 2003-07-22 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
WO1999050419A2 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 University Of Maryland Biotechnology Institute A method for generating nonpathogenic, infectious pancreatic necrosis virus (ipnv) from synthetic rna transcripts
WO2000012677A2 (en) * 1998-09-01 2000-03-09 The University Of Hong Kong Generation of recombinant infectious bursal disease viruses by reverse genetics technology and the use of the recombinant viruses as attenuated vaccines
HUP9802974A1 (hu) * 1998-12-19 2000-09-28 Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Fertőző bursitis elleni DNS-vakcina
US6492148B1 (en) * 1999-03-05 2002-12-10 Akzo Nobel Nv Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal disease virus (IBDV) mutants
US6468984B1 (en) 1999-06-08 2002-10-22 Innovo Biotechnologies Ltd. DNA vaccine for protecting an avian against infectious bursal disease virus
EP1069187A1 (en) * 1999-07-14 2001-01-17 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mosaic Infectious Bursal Disease Virus vaccines
US7431930B2 (en) * 2002-03-01 2008-10-07 Intervet International B.V. Infectious bursal disease virus (IBDV) mutant expressing virus neutralising epitopes specific for classic-and variant IBDV strains
ES2217967B1 (es) * 2003-03-31 2006-01-01 Consejo Sup. Investig. Cientificas Procedimiento de produccion de particulas virales vacias (vlps) del virus inductor de la bursitis infecciosa (ibdv), composiciones necesarias para su puesta a punto y su uso en la elaboracion de vacunas frente al ibdv.
ES2307346B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
ES2307345B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
US7244432B2 (en) * 2004-12-08 2007-07-17 University Of Maryland Biotechnology Institute Infectious bursal disease virus (IBDV) variant from Georgia
ES2310062B1 (es) * 2005-07-15 2009-11-13 Bionostra, S.L. Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones.
KR100757541B1 (ko) * 2005-11-08 2007-09-10 엘지전자 주식회사 플라즈마 디스플레이 장치 및 그의 화상 처리방법
WO2008068661A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Hepc Biotechnológiai Kutató És Fejleszto Kft. Compositions and methods for the treatment of viral hepatitis
CN101016547B (zh) * 2007-01-25 2010-07-28 浙江大学 海洋双rna病毒mabv重组蛋白的制备方法与应用
EP2407534A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
CN109321583B (zh) * 2018-09-29 2023-08-15 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法
AU2020329166A1 (en) 2019-08-09 2022-03-03 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530831A (en) * 1982-11-02 1985-07-23 Akzo N.V. Infectious Bursal Disease vaccine
CA1334941C (en) * 1985-05-30 1995-03-28 Ahmed Azad Azad Cloning and expression of a host-protective immunogens of ibdv
AU602875B2 (en) * 1985-12-18 1990-11-01 British Technology Group Limited Newcastle disease virus gene clones
US5192539A (en) * 1988-07-21 1993-03-09 Akzo N.V. Infectious bursal disease virus production in continuous cell lines
US5518724A (en) * 1988-08-02 1996-05-21 University Of Maryland Infectious bursal disease virus
NZ235474A (en) * 1989-10-18 1992-12-23 Univ Maryland Virus capable of inducing infectious bursal disease; assay and vaccine
JPH05501064A (ja) * 1990-05-04 1993-03-04 ユニバーシティ　オブ　メリーランド　アット　カレッジ　パーク Ｉｂｄｖタンパク質に関連する特異的ｄｎａ配列並びにベクター、宿主およびワクチン
EP0597016A4 (en) * 1991-07-26 1996-04-24 Virogenetics Corp Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine.
US5788970A (en) * 1994-03-29 1998-08-04 The University Of Maryland College Park Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon

Also Published As

Publication number Publication date
CN1168500C (zh) 2004-09-29
IL128804A0 (en) 2000-01-31
NO991074L (no) 1999-04-29
NZ334667A (en) 2000-09-29
IL128804A (en) 2006-08-01
ATE460178T1 (de) 2010-03-15
BR9712012B1 (pt) 2009-08-11
HUP9904365A2 (hu) 2000-04-28
JP4670025B2 (ja) 2011-04-13
KR100475427B1 (ko) 2005-03-10
CA2264488C (en) 2009-04-07
JP2001501082A (ja) 2001-01-30
WO1998009646A1 (en) 1998-03-12
US5871744A (en) 1999-02-16
CA2264488A1 (en) 1998-03-12
EP0959901A4 (en) 2002-11-04
DE69739805D1 (de) 2010-04-22
CN1229358A (zh) 1999-09-22
KR20010029487A (ko) 2001-04-06
PL332184A1 (en) 1999-08-30
NO991074D0 (no) 1999-03-04
BR9712012A (pt) 2000-01-18
EP1930026A1 (en) 2008-06-11
EP1930026B1 (en) 2010-03-10
AU741055B2 (en) 2001-11-22
PL190220B1 (pl) 2005-11-30
AU3891897A (en) 1998-03-26
HUP9904365A3 (en) 2001-06-28
EP0959901A1 (en) 1999-12-01
CZ299417B6 (cs) 2008-07-16
ES2342325T3 (es) 2010-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ74299A3 (cs) Způsob přípravy Birnavirusu, živý virus, syntetická RNA, transfekce, cDNA, rekombinantní vektor, buňka, vakcína
Mundt et al. Synthetic transcripts of double-stranded Birnavirus genome are infectious.
Fodor et al. Induction of protective immunity in chickens immunised with plasmid DNA encoding infectious bursal disease virus antigens
ES2220333T3 (es) Mutantes del virus de la enfermedad infeccionsa de las bursas (ibdv) adaptados por ingenieria genetica para el cultivo celular.
KR20010053000A (ko) 뉴캐슬병 바이러스 감염성 클론, 백신 및 진단 분석방법
CN109825517B (zh) 呼肠弧病毒家族病毒的疫苗病毒株的制造方法
JP2009203242A (ja) インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）マルチプルｄｎａワクチンと多価ｄｎａワクチン
US6231868B1 (en) Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts
AU725129B2 (en) Recombinant birnavirus vaccine
US6596280B1 (en) Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
CN112301042B (zh) A型塞内卡病毒全长感染性cDNA克隆及其构建方法及应用
US6485940B2 (en) Broad spectrum infectious bursal disease virus vaccine
CN110917343A (zh) 一种新城疫与传染性法氏囊病二联亚单位疫苗
MXPA99002187A (en) A method for generating birnavirus from synthetic rna transcripts
CN110129286A (zh) 重组传染性法氏囊病病毒毒株及其制备方法
CLUBBE MOLECULAR STUDIES TOWARDS IMPROVED AVIAN METAPNEUMOVIRUS VACCINES
Dhama Functional characterization of VP1 of Infectious Bursal Disease Virus

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20110731