PL190220B1 - Sposób otrzymywania żywego Birnawirusa, wirus wytworzony tym sposobem oraz szczepionka zawierająca wymieniony wirus - Google Patents

Sposób otrzymywania żywego Birnawirusa, wirus wytworzony tym sposobem oraz szczepionka zawierająca wymieniony wirus

Info

Publication number
PL190220B1
PL190220B1 PL97332184A PL33218497A PL190220B1 PL 190220 B1 PL190220 B1 PL 190220B1 PL 97332184 A PL97332184 A PL 97332184A PL 33218497 A PL33218497 A PL 33218497A PL 190220 B1 PL190220 B1 PL 190220B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
ibdv
rna
leu
segments
Prior art date
Application number
PL97332184A
Other languages
English (en)
Other versions
PL332184A1 (en
Inventor
Vikram N. Vakharia
Egbert Mundt
Original Assignee
Univ Maryland Biotech Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Maryland Biotech Inst filed Critical Univ Maryland Biotech Inst
Publication of PL332184A1 publication Critical patent/PL332184A1/xx
Publication of PL190220B1 publication Critical patent/PL190220B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/10011—Birnaviridae
    • C12N2720/10051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/826—Bacterial vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1 Sposób otrzymywania zywego Birnawirusa, w którym Birnawirusem jest wirus zakaznej choroby kalet- kowej (IBDV), znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy. - otrzymanie cD N A segmentu A i segmentu B genomu Birnawirusa, - przetworzenie wym ienionego cDNA w celu wyprodukowania syntetycznych transkryptów RNA, gdzie wspomniane transkrypty RNA sa dodatnio polarnymi transkryptami RNA wspomnianych segmentów A i B, - dokonanie transfekcji komórek zywicielskich wspomnianymi syntetycznymi transkryptami RNA, - inkubacje wspomnianych komórek zywicielskich w pozywce kulturowej oraz - wyizolowanie zyw ego, zakaznego Birnawirusa ze wspomnianej pozywki kulturowej 7 Zywy, chimeryczny wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV), gdzie wymieniony wirus jest wytwo- rzony sposobem, obejmujacym etapy - otrzymywania cD N A wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV) segmentów A i B, - kopiowania wym ienionego cDNA w celu wytworzenia syntetycznych transkryptów RNA wymienionych segmentów A i B, - transfekcje komórki zywiciela wymienionymi transkryptami syntetycznego RNA, - inkubacji wymienionych komórek zywiciela w pozywce, oraz - wyizolowania zywego, chimerycznego wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV) z wymienionej pozywki 9 Szczepionka, zawierajaca zywy, chimeryczny wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV), znamienna tym, ze wspomniany wirus wytworzony jest sposobem, obejmujacym etapy - otrzymywania cD N A wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV) segmentów A i B, - kopiowania wym ienionego cDNA w celu wytworzenia syntetycznych transkryptów RNA wymienionych segmentów A i B, - transfekcje komórki zywiciela wymienionymi transkryptami syntetycznego RNA, - inkubacji wymienionych komórek zywiciela w pozywce, oraz - wyizolowania zyw ego, chimerycznego wirus zakaznej choroby kaletkowej (IBDV) z wymienionej pozywki, w której wymieniony zywy chimeryczny Birnawirus jest przed podaniem pozbawiany aktywnosci lub oslabiany PL 190220 B 1 PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka dla drobiu przeciw IBDV zawierająca ochronną ilość wyprodukowanego przez rekombinację wirusa lub jego części, w której wirus jest pozbawiony aktywności lub zmodyfikowany w taki sposób, ze nie jest on wirulentny.
Wirus może zostać pozbawiony aktywności za pomocą metod chemicznych lub fizycznych. Chemiczne pozbawienie aktywności może być dokonane poprzez poddanie wirusa działaniu np. enzymów, aldehydu mrówkowego, beta-propiolaktonu, iminy etylenowej lub jej pochodnej, rozpuszczalnika organicznego (chlorowanego węglowodoru) lub detergentu.
Jeżeli zachodzi taka potrzeba, substancja pozbawiająca aktywności może zostać zneutralizowana po pozbawieniu wirusa aktywności.
Fizyczne pozbawianie aktywności może zostać przeprowadzone przez poddanie wirusa promieniowaniu takiemu jak światło UV, promieniowaniu rentgenowskiemu łub promieniowaniu gamma.
Wirus może zostać atenuowany znanymi metodami, takimi jak wielokrotne pasazowanie, delecja sekwencji kwasu nukleinowego oraz ukierunkowana mutageneza, zarówno przed jak i po wyprodukowaniu zakaźnego wirusa w celu otrzymania wirusa, który zachowuje wystarczającą antygenowość a jednocześnie posiada zredukowaną wirulencję.
Akceptowalne fizjologicznie nośniki szczepionek dla drobiu są znane technice i nie zachodzi potrzeba ich dalszego opisu w niniejszym tekście.
Oprócz tego, ze nośnik musi być możliwy do fizjologicznego przyjęcia przez drób, nie może on ingerować w odpowiedź immunologiczną wywoływaną przez szczepionkę oraz/lub w wydzielanie przez nią produktu polipeptydowego.
Szczepionka według wynalazku może zawierać także inne dodatki, takie jak m. m. środki wspomagające i stabilizatory, w ilościach znanych technice. Środki wspomagające takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, oleje roślinne i zwierzęce itp., powinny być stosowane ze szczepionką w ilościach wystarczających do wzmocnienia immunologicznej odpowiedzi na IBDV. Ilość dodawanych do szczepionki środków wspomagających będzie zrózni190 220 cowana w zalezności od rodzaju środka, najczęściej sięga ona od około 0,1 do około 100 razy ciężar EBDV, najbardziej pożądana ilość to od około 1 do około 10 razy ciężar IBDV.
Szczepionka według wynalazku może także zawierać różne stabilizatory. Użyty może zostać każdy odpowiedni stabilizator, m.in. węglowodany takie jak D-sorbitol, mannitol, skrobia, sacharoza, dekstryna czy glukoza; białka takie jak albumina lub kazeina; oraz bufory jak alkaliczny fosforan metalu, itp. Stabilizator jest szczególnie korzystny gdy przygotowuje się preparat w postaci suchej szczepionki poprzez liofilizację.
Szczepionka według wynalazku może być podawana w każdy stosowny, znany sposób szczepienia drobiu m.in. przez nos, przez oczy, w zastrzyku, w pitnej wodzie, w pożywieniu, przez ekspozycję itp. Najlepiej aby szczepionka była podawana poprzez techniki masowego szczepienia takie jak umieszczanie szczepionki w wodzie pitnej lub przez rozpylanie w pomieszczeniu ze zwierzętami. W przypadku szczepienia w zastrzyku, szczepionkę najlepiej podawać pozajelitowo. Podanie pozajelitowe w powyższym znaczeniu oznacza szczepienie przez zastrzyk dożylny, podskórny, domięśniowy lub wewnątrzotrzewny.
Obecnie wynaleziona szczepionka jest podawana u drobiu w celu zapobiegania IBVD zarówno przed jak i po wylęgu. Najlepiej jest, gdy szczepionka podawana jest przed narodzeniem, i po 6 tygodniu życia. Do drobiu zalicza się m.in. kurczęta, koguty, kury, broilery, roastery, reproduktory, nioski, indyki i kaczki.
Szczepionka według wynalazku może być dostępna w sterylnych pojemnikach w postaci opakowań jednostkowych lub w innych ilościach Powinna być przechowywana w zamrożeniu, poniżej -20°C, najlepiej poniżej -70°C. Przed użyciem powinna być rozmrożona, zaraz po tym może być ponownie zamrożona. W celu podawania leku dla drobiu, wyprodukowany poprzez rekombinację wirus, może być zawieszony w nośniku w ilości około 104 do 107 pfu/ml, a bardziej preferowana ilość to około 105 do 106 pfu/ml w nośniku takim jak roztwór soli. Unieaktywniona szczepionka może zawierać antygenowy równoważnik 104 do 107 pfu/ml zawieszony w nośniku. Mogą być także stosowane inne nośniki, zgodnie ze znanym stanem nauki. Przykładami farmaceutycznie akceptowalnych nośników są rozcieńczalniki i chemicznie obojętne nośniki farmaceutyczne, znane technice. Najlepiej, aby nośnik lub rozcieńczalnik dał się pogodzić z podawaniem szczepionki przy pomocy technik masowego szczepienia Nośnik lub rozcieńczalnik może tez być zgodny z innymi metodami podawania szczepionki, takimi jak zastrzyk, krople do oczu, krople do nosa itp.
Przedmiot wynalazku może być także zastosowany do produkcji kombinacji szczepionki z materiałem IBDV. Materiał IBDV może być kombinowany z materiałem antygenowym wirusa Newcastle Disease Virus Infectious Bronchitis, wirusa Reo, wirusa Adeno i/lub wirusa Marek.
Powyższe zastosowania obecnego wynalazku są dalej opisane w przykładach. Wynalazek nie jest ograniczony do podanych przykładów i możliwe są różne odchylenia w przykładach znanych w nauce, nie mające bezpośredniego związku z dziedziną obecnego wynalazku.
Figura 1 jest schematycznym diagramem konstruktów cDNA używanych do syntezy pozytywnych cząsteczek ssRNAs wirusa IBDV za pomocą polimerazy T7 RNA. Konstrukt pUC19FLAD78 zawiera cDNA segmentu A szczepu D78 IBDV a zrekombinowany plazmid pUC18FLA23 zawiera pełnej długości cDNA segmentu A szczepu 23/82 IBDV. Segment A koduje poliproteinę (VP2-VP4-VP3) i ostatnio zidentyfikowane białko VP5. Plazmid pUC18FLBP2 zawiera cDNA szczepu P2 segmentu B, który koduje polimerazę RNA zalezną od RNA (VP1). Specyficzne sekwencje wirusa są podkreślone a sekwencja T7 promotora pisana kursywą. Miejsca restrykcyjne są pogrubione i zaznaczone. Miejsca przecięcia zlinearyzowanych plazmidów pokazano w postaci pionowych strzałek natomiast kierunki transkrypcji są zaznaczone poziomymi strzałkami.
Figura 2 pokazuje analizę zelu agarowego produktów reakcji transkrypcji które zostały użyte do transfekcji komórek Vero. Syntetyczne RNA transkrybowano in vitro przy użyciu polimerazy T7 RNA i zlinearyzowanych plazmidów, odpowiednio z pUC19FLAD78 (linie 2, 4 i 6), zawierającego cząsteczkę cDNA segmentu A szczepu D78 IBDV oraz z pUC18FLBP2 (linie 1, 3 i 5) zawierającego cDNA segmentu B szczepu P2. Po transkrypcji, mieszaniny reakcyjne były albo poddane działaniu DN-azy (linie 1 i 2), RN-azy (linie 3 i 4) lub pozostawio8
190 220 ne nieruszone (linie 5 i 6). Dwa μl produktów reakcji zostały przeanalizowane na 1% żelu agarozowym. Jako markera użyto lambda DNA, pocięte enzymami Hindlll/EcoR I.
Figura 3 pokazuje porównanie sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów RT-PCR z segmentów A i B chimerycznego szczepu 23A/P2B IBDV (tłusta czcionka) ze znanymi sekwencjami segmentów A i B odpowiednio szczepu 23/82 serotypu I i szczepu P2 serotypu I. Tożsame nukleotydy są połączone dwukropkiem.
Figura 4 pokazuje sekwencję DNA pUC18FLA23.
Figura 5 pokazuje sekwencję DNA pUC19FLAD78.
Figura 6 pokazuje sekwencję DNA pUC18FLBP2.
Przykłady
Wirusy i komórki.
Dwa szczepy serotypu IIBDV, osłabiony szczep P2 z Niemiec i szczep D78 szczepionki (Intervet International) oraz jeden szczep serotypu II, apatogeniczny szczep 23/82, zostały rozmnożone w komórkach embrionu kurczaka (CEC) oraz oczyszczone (Mundt, E, et al, Virology, 209, 10-18 (1995); Vakharia, VN, et al, Yirus Res, 31, 265-273 (1994)) Komórki Vero zostały wyhodowane w środowisku M199 uzupełnionym 5% fetal calf serum (FCS) oraz użyte w eksperymentach transfekcji. Dalsze rozmnażanie otrzymanego wirusa i badania immunofluorescencyjne były prowadzone w komórkach Vero (Mundt, E., et al, JGen Yirol, 76, 437-443, (1995)). Do analizy na płytkach wykorzystano pojedynczą warstwę komórek zarodkowych kurczaka (CEC) (Muller, H , et al , Viuus Rss, 4, 297-309 (1986)).
Konstrukcja klonów cDNAo pełnej długości'genomu IBDV.
Klony cDNAo segmentach A i B pełnej długości były przygotowywane niezależnie. Klon cDNA zawierający cały odcinek kodujący RNA segmentu A ze szczepu D78 został przygotowany przy zastosowaniu standardowych procedur i metod klonowania (Vakharia, V.N., et al., Virus Res., 31, 165-173 (1994)). Porównując sekwencje końcowe D78 z ostatnio opublikowanymi sekwencjami końcowymi innych szczepów IBDV (Mundt, E., et al., Virology, 209, 10-18 (1995)), zaobserwowano, ze klony D78 cDNA nie posiadały odpowiednio, pierwszych 17 i ostatnich 10 nukleotydów na każdym końcu 5' i 3' sekwencji. Dlatego, do budowy klonu cDNA o pełnej długości segmentu A, zsyntetyzowane zostały dwie pary starterów (A5'-D78, A5-IPD78 i A3'-IPD78) i użyte w reakcji PCR (tabela 1). Segmenty DNA zostały zamplifikowane zgodnie z protokołem dostawcy (New England Biolabs) przy użyciu „Deep Vent Polymerase” (polimerazy DNA o wysokiej wierności). Zamplifikowane fragmenty zostały wklonowane do miejsca EcoR I w wektorze pCRII (Invitrogen Corp.) aby otrzymać odpowiednio plazmidy pCRD78A5' i pCRD78A3'. W celu otrzymania plazmidu pUC19FLAD78 (SEQ ID NOS:27 AND 29), który zawiera pełnej długości kopię cDNA segmentu A kodującego wszystkie białka strukturalne (VP2, VP4 i VP3, SEQ iD NO:30) oraz niestrukturalne białko VP5 (SEQ ID NO:28) (fig. 1), każdy plazmid został przecięty enzymami EcoR I i Sal I, a otrzymane fragmenty zostały doligowane do wektora pUC19 przeciętego enzymem EcoR I.
Dwie pary starterów (A5'-23,A5IP23 i A3-23, A3-IP23; zobacz tabela 1) zostały zastosowane do odwrotnej transkrypcji (RT) dsRNA genomu wirusowego szczepu 23/82 z wykorzystaniem „SuperScript RT II” (odwrotna transkryptaza ze zredukowaną aktywnością RN-azy H, GIBCO/BRL). Produkty reakcji RT-PCR zostały oczyszczone przez ekstrakcję fenol/chloform i wytrącenie w etanolu. W celu otrzymania dwóch fragmentów cDNA ograniczonych przez odpowiednie pary starterów A5'-23, A5-IP23 i A3'-23, A3-IP23, produkty reakcji RT zostały zamplifikowane w reakcji PCR przy użyciu „Deep Vent polymerase”. Zarówno reakcja Rt jak i PCR zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem dostawcy. Otrzymane fragmenty PCR mające tępe końce, zostały doligowane do wektora pUCIS przeciętego enzymem Sma I, co pozwoliło na otrzymanie plazmidów pUC23A5' i pUC23A3'. Koniec 3' segmentu A zawarty w plazmidzie pUC23A3 został następnie doligowany do plazmidu pUC23A5' porzeciętego eznymem Hind III-BsiB I, w celu utworzenia pełnej długości cDNA segmentu A szczepu 23/82. Otrzymany plazmid został nazwany pUC18FLA23 (SEQ ID NOS: 31 AND 33) (fig. 1) i koduje on białka strukturalne VP2, VP3 i VP4 (SEQ ID NO: 32) oraz niestrukturalne białko VP5 (SEQ ID NO: 34).
190 220
W celu otrzymania klonów cDNA segmentu B szczepu P2, stworzone zostały dwie pary starterów (B5'-P2, B5-IPP2 i B3'-P.2, B3-IPP2) zgodnie z opublikowanymi sekwencjami, po czym zostały one użyte do reakcji RT-PCR (tabela 1). Jako matrycy użyto genomowe dsRNA a fragmenty cDNA, zostały zamplifikowane zgodnie z protokołem dostawcy (Perkin-Elmer Cetus). W celu otrzymania klonów pBSP2B5' i pBSP2B3', zamplifikowane fragmenty, mające tępe końce, zostały doligowane do wektora pBS (Stratagene) przeciętego enzymem Sma I. Aby skonstruować pełnej długości klon segmentu B, najpierw sklonowano fragment 5' plazmidu pBSP2B5 w obszar między miejscami EcoR I i Pst I wektora pUCIS, co doprowadziło do otrzymania pUCP2B5'. Następnie, fragment 3' końcowy plazmidu pBSP2B3' został wstawiony między unikalne obszary Bgl II i Pst I plazmidu pUCP2B5', aż do otrzymania pełnej długości plazmidu pUC18FLBP2 (SEQ ID NO:25), który koduje białko VP1 (SEQ ID NO:26) (fig. 1). Plazmidy pUC18FLBP2, pUC18FLA23 ipUC19FLAD78 zostały całkowicie zsekwencjonowane przy użyciu systemu sekwencjonowania DNA „Sequenase” (U.S. Biochem.), dane sekwencyjne analizowane były przy użyciu programów „dNaSIS” (Pharmacja) lub „PC/Gene” (Intelligenetics). Integralność konstruktów o pełnej długości została sprawdzona w systemie transkrypcji in vitro i translacji w lizacie retikulocytów przy użyciu polimerazy T7 rNa (Promega).
Transkrypcja i translacja syntetycznych RNA.
Plazmidy pUC19FLAD 78, pUC18FLA23 i pUC18FLBP2 zostały przecięte odpowiednio enzymami BsrG I, Nsi I i Pst I (zobacz fig. 1), oraz wykorzystane jako matryca dla transkrypcji in vitro, z użyciem polimerazy T7 RNA (Promega). W skrócie, próby do cięcia enzymami zostały dostosowane do 0,5% SDS i poddane procesowi inkubacji z proteinazą K (0,5 mg/ml) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
Zlinearyzowane matryce DNA (~3 ug) zostały odzyskane po wytrąceniu etanolem i dodane oddzielnie do mieszaniny reakcji transkrypcji (50 ul) zawierającej 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM NaCl, 6 mM MgCE, 2 mM spermidyny, po 0,5 mM ATP, CTP i UTP każdy, 0,1 mM GTP, 0,25 mM cap analog [m7G(5') PPP(5') G], 120 jednostek RN-azyny (inhibitor rybonukleazy), 150 jednostek polimerazy T7 RNA (Promega), oraz poddane procesowi inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
Syntetyczne transkrypty RNA zostały oczyszczone przez ekstrakcję z mieszaniną fenol/chloroform i wytrącenie etanolem. Dla kontroli, produkty transkrypcji zostały poddane działaniu DNazy lub RNazy (Promega), przed przeprowadzeniem oczyszczania.
Komórki Vero hodowano, aż do 80% zgromadzenia się na 60 mm płytkach i jednokrotnie przepłukano buforowanym fosforanami roztworem solanki (PBS). Trzy ml „OPTI-MEM I” (środowisko zredukowanego płynu surowiczego zawierające bufor HEPES, dwuwęglan sodowy, hipoksantynę, tymidynę, pirogronian sodowy, L-glutaminę, pierwiastki śladowe, czynniki wzrostu i fenol J&&; z GIBCO/BRL) zostały dodane do warstwy komórek na powierzchni pożywki i komórki zostały poddane inkubacji w 37°C przez 1 godzinę w inkubatorze CO2. Równocześnie, 0,15 ml „OPTI-MEM I” zostało poddanych inkubacji z 1,25 ng z odczynnikiem „Lipofectin” (chlorek (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniowy i dwuoleoilofosfatydyletanolaminy, GIBCO/BRL) na 45 min. w rurze polistyrenowej w temperaturze pokojowej.
Syntetyczne transkrypty RNA obu segmentów, zawieszono w 0,15 ml wody traktowanej DEPC (diethyl pyrocarbonate), po czym zostały one dodane do mieszanki OPTI-MEMLipofectin, delikatnie zamieszane i poddane inkubacji w lodzie przez 5 min Po usunięciu „OPTI-MEM” z warstwy komórek znajdujących się na powierzchni pożywki w 60 mm szalkach i zastąpieniu go świeżym roztworem „OPTI-MEM” w ilości 1,5 ml, mieszaninę zawierającą kwas nukleinowy dodawano kroplami do komórek Vero i delikatnie zamieszano. Po dwóch godzinach inkubacji w 37°C mieszanina została zastąpiona środkiem M199 [CaCE (bezwodny), Fe(NO3)3, 9H2O, KCl, MgSO4 (bezwodny), NaCl, NałEPOflEO, NaHCO3, L-Alanina, L-Arginina HCl, kwas L-Aspartowy, L-Cysteina HCl H2O, L-Cysteina 2HC1, kwas L-Glutamowy, L-Glutamina, Glicyina, L-Histydyna HCl H2O, L-Hydroksyprolina, L-Isoleucyna, L- Leucyna, 1-Lizyna HCl, 1-Metionina, L-Fenyloalanina L-Prolina, L-Seryna, L-Threonina, L-Tryptofan, L-Tyrozyna 2 Na 2 H2O, L-Valina, Alpha tocoferol PO4 Na2, kwas
190 220
Ascorbinowy, Biotyn, Calferol, pantotenian wapnia D-Calcium, chlorek choliny, kwas foliowy, I-Inozytol, Menandion NaHSOa 3 H2O, Niacyna, amid kwasu nikotynowego, kwas p-aminobenzoesowy, Pyridoxyna HCl, Ryboflawina, Tiamine HCl, Yitamin A octan, Adenina SO4, kwas adenylinowy, ATP, Na2, Cholesterol, 2-Deoksy-D-Ryboza, d-Glucoza, Glutacjon, Guanina HCl, Hypoksantyna Na, Fenol Red Na, Ryboza, octan sodu (bezwodny), Tymina, Tween 80, Uracyl, i Ksantyna Na; z Mediatech, Inc] zawierającym 5% FCS (bez przepłukiwania komórek), a następnie komórki były inkubowane w temperaturze 37°C w pożądanych odstępach czasu.
Identyfikacja wygenerowanego wirusa IBDV.
Komórki CEC zostały zainfekowane przefiltrowanym (0,2 ul) supematantem z komórek Vero poddanych transfekcji z transkryptami pUC18FLA23 ipUC18FLP2B. W 16 godzin po infekcji, przeprowadzono izolację wszystkich kwasów nukleinowych z komórki (Mundt, E. et al., Virology, 209, 10-18 (1995)). Zaprojektowano startery zgodnie z opublikowanymi sekwencjami i przeprowadzono reakcję RT-PCR, a otrzymane fragmenty zostały sklonowane i zsekwencjonowane (Mundt, E. et al., Virology, 209, 10-18 (1995)). Dane sekwencji były analizowane przy użyciu programu „DNASIS”.
Immunofluorescencja.
Komórki Vero, hodowane na szkiełkach nakrywkowych do momentu 80% złączenia się, zostały zainfekowane supernatantami otrzymanymi z poddanych transfekcji komórek Vero (po rozmrożeniu) a następnie inkubowane w temperaturze 37°C przez dwa dni. Następnie komórki zostały przepłukane, utrwalone acetonem i poddane działaniu poliklonalnej króliczej surowicy przeciw-IBDV. Po przepłukaniu, komórki poddano reakcji z przeciwciałem goatanti-rabbit wyznakowanym fluoresceiną (Kirkegaard & Perry Lab.) i sprawdzone w mikroskopie fluorescencyjnym.
Analiza płytek.
Warstwa drugorzędowych komórek CEC, wzrastająca na płytkach 60 mm, została zaszczepiona supernatantami pochodzącymi z transfekowanych komórek Vero. Po 1 godzinie od zainfekowania, komórki zostały jednokrotnie przepłukane roztworem PBS i pokryte 0,8% Agarem noble (Difco) zawierającym 10% pożywkę tryptozo-fosforanową, 2% FCS, 0,112% NaHCO3, 103 jednostek penicyliny, 103 (ug/ml streptomycyny, 0,25 ug/ml fungizone, 0,0005% neutral red, 0,0015% phenol red. Komórki były inkubowane w temperaturze 37°C przez 2 do 3 dni, do czasu aż wzrost na płytkach mógł zostać zaobserwowany, a miejsca, gdzie nastąpiło zniszczenie komórek przez wirus policzone (Muller, H., et al., Yirus Res, 4, 297-309(1986)).
Konstrukcja klonów cDNAo pełnej długości.
W celu wykorzystania systemu odwrotnej genetyki dla wirusów dsRNA IBDV, skonstruowano dwa niezależne klony cDNA zawierające segment A szczepu D78 i segment B szczepu P2 (fig. 1). Każdy z plazmidów kodował albo prekursor białek strukturalnych (VP2, VP4, VP3) iVP5 albo tylko białko VP1 (zależną od RNA polimeraze RNA). Plazmid pUC18FLB2 poddany cięciu enzymem Pst I i transkrypcji in vitro przez polimerazę T7 RNA, mógł dać RNA zawierający poprawne końce 5' i 3'. Z kolei plazmid pUC19FLAD78 poddany cięciu enzymem BsrG I i transkrypcji dawał cząsteczkę RNA zawierająca poprawny koniec 5', ale z dodatkowymi czterema nukleotydami na końcu 3'. Przeprowadzona łącznie transkrypcja i translacja powyższych plazmidów w systemie retikulocytów królika, dała produkty białkowe, które były prawidłowo przetworzone i po przeprowadzeniu frakcjonowania w żelu SDSpoliakryloamidowym i autoradiografii okazało się, że migrowały łącznie z markerem białek IBDV (dane nie pokazane).
Transkrypcja, transfekcja i powstawanie wirusa zakaźnego.
Transkrypty pozytywnego RNA z segmentu A i B IBDV zostały osobno zsyntetyzowane in vitro przy pomocy polimerazy T7 RNA i przy użyciu zlinearyzowanych plazmidów cDNA o pełnej długości jako matryc (zob. fig 2). Mimo, ze dla segmentu B zostały zaobserwowane dwa rodzaje transkryptów RNA w neutralnym żelu (linie 1 i 5), to frakcjonowanie tych dwóch próbek w żelu denaturującym dało tylko jeden prążek specyficzny dla transkryptu (dane nie pokazane). W celu wykazania, ze transkrypty pozytywnego RNA obu segmentów były potrzebne dla wygenerowania wirusa zakaźnego, mieszaniny transkrypcyjne były inkubowane
190 220 z różnymi nukleazami, jak pokazano w fig. 2. Syntetyczne RNA odzyskane po poddaniu produktów transkrypcji działaniu DNazy (linie 1+2), RNazy (linie 3+4) lub nietraktowane (linie 5+6), zostały użyte do transfekcji komórek Vero. Jako ślepej próby użyto tylko Lipofektyny. Pięć dni po transfekcji, efekt cytopatyczny (CPE) widoczny był tylko w komórkach Vero poddanych transfekcji z połączonymi transkryptami niepotraktowanymi lub produktami transkrypcji poddanymi działaniu DNazy, ale nie z mieszaniną transkrypcyjną poddaną działaniu RNazy lub kontroli transfekowanej ślepą próbą. Ponadto żaden efekt CPE nie został wykryty po poddaniu komórek Vero transfekcji cząsteczkami RNA tylko segmentu A lub B (dane nie pokazane). Te wyniki pokazują, ze replikacja IBDV następowała po transfekcji komórek Vero cząsteczkami pozytywnego ssRNA obu segmentów IBDV. Aby sprawdzić, ze czynnikiem powodującym efekt CPE w komórkach Vero był naprawdę IBDV, poddane transfekcji komórki Vero były rozmrazane, a supematanty były oczyszczane przez wirowanie i użyte do zainfekowania komórek CEC lub komórek Vero. Komórki CEC zainfekowane supematantem wyprowadzonym z transfekowanych komórek Vero mieszaniną transkrypcyjną niepotraktowaną lub potraktowaną DNazą wykazały efekt CPE w dzień po inokulacji (tabela 2). Natomiast, żaden efekt CPE nie był wykrywalny, nawet po pięciu dniach inkubacji z supematantem z komórek Vero transfekowanych mieszaniną transkrypcyjną potraktowaną RNazą, mieszaniną segmentów A lub B nietraktowaną oraz w para-transfekowanych komórkach Vero. Podobnie, gdy komórki Vero na szkiełkach nakrywkowych zostały zainfekowane tymi samymi supematantami jak opisane powyżej i przebadane po 2 dniach przy pomocy barwienia immunofluorescencyjnego, pozytywny sygnał immunofluorescencji dały tylko supematanty wyprowadzone z komórek Vero transfekowanych mieszaninami transkrypcyjnymi, które były albo niepotraktowane w ogóle lub potraktowane DNazą (tabela 2).
Otrzymywanie transfekcyjnego wirusa.
W celu określenia momentu otrzymania wirusa zakaźnego, komórki Vero zostały poddane transfekcji z połączonymi transkryptami RNA segmentów A i B. Supematanty były poddane badaniu na obecność transfekcyjnego wirusa poprzez testy zakazalności i analizę płytek, w 4, 8, 16, 24, i 48 godziny po transfekcji, jak pokazano w tabeli 3. Nasze rezultaty wskazują, że wirus mógł być otrzymany juz w 36 godzin po transfekcji. Miano wirusa wynosiło
2,3-102 pfu/ml, które okazuje się spadać w próbkach otrzymanych później niz 48 godzin po transfekcji.
Generowanie wirusa chimerycznego.
Aby udowodnić, ze cząsteczki pozytywnego ssRNA obu segmentów IBDV są wystarczające do otrzymania wirusa zakaźnego, wygenerowano chimeryczny IBDV. Plazmid pUC18FLA23 zawierający sekwencję segmentu A pełnej długości pochodzącą ze szczepu serotypu II został zlinearyzowany przez cięcie enzymem Nsi I a ssRNA został zsyntetyzowany in vitro przy użyciu polimerazy T7 RNA. Transkrypt ssRNA posiada prawidłowy koniec 5' ale zawiera jedną dodatkową resztę na końcu 3'. Komórki Vero zostały poddane transfekcji cząsteczkami ssRNA segmentu A szczepu 23/82 serotypu II i cząsteczkami segmentu B szczepu P2 serotypu I. 5 dni po transfekcji, gdy widoczny był efekt CPE, supernatant został oczyszczony (po rozmrożeniu) i zastosowany do zainfekowania komórek CEC. Po drugim pasazowaniu w CEC, genomowe RNA wirusa zostało zanalizowane przez reakcję RT-PCR i sekwencjonowanie produktów PCR. Startery dla segmentu A zostały zaprojektowane tak, aby specyficznie amplifikować tylko sekwencje segmentu A pochodzące ze szczepu serotypu II. Startery dla segmentu B przyłączały się do sekwencji obu serotypów. Zamplifikowane produkty były klonowane i sekwencjonowane.
Otrzymane sekwencje segmentu A okazały się być identyczne ze znanymi sekwencjami segmentu A serotypu II szczepu 23/82, podczas gdy sekwencje segmentu B wykazały dokładną homologię do opublikowanych sekwencji segmentu B szczepu P2 serotypu I (fig. 3).
190 220
Tabela 1. Oligonukleotydy użyte do budowy pełnowymiarowych klonów cDNA z segmentów genomów IBDV A i B
190 220
Tabela 2
Wytwarzanie infekcji IBDV z syntetycznych RNA segmentów A i B
Transfekowany materiał CPE Immunfluorescencja
ssRNA A+B, traktowany Dnase + +
ssRNA A+B, traktowany Dnase - -
ssRNA A+B, nietraktowany + +
ssRNA A, nietraktowany - -
ssRNA B, nietraktowany - -
Tylko lipofektyna - -
Komórki Vero były transfekowane syntetycznymi RNA segmentów A i B otrzymanymi w wyniku transkryptywnych reakcji, które były potraktowane lub niepotraktowane DNase lub RNase. Po upływie 5 dni, supernatanty zostały zebrane, oczyszczone przez odwirowanie i analizowane na obecność wirusa. Zakażalność uzyskanego wirusa została określona w CEC przez wystąpienie efektu cytopatycznego (CPE) w 1 -2 dni po sczepieniu. Specyficzność uzyskanego wirusa została określona przez immunofluorescencyjne barwienie zakażonych komórek Vero króliczym serum anty-IBDV.
Tabela 3
Uzyskiwanie wirusa w różnym czasie po transfekcji
Czas w godzinach po transfekcji CPE Immunofluorescencja pfu/ml
4 - - 0
8 - - 0
16 - - 0
24 - - 0
36 + + 2,3 x 102
48 + + 6,0 x 102
Jak opisano, komórki Vero były wszczepiane do segmentów A i B syntetycznych RNAs. Zakażalność i specyficzność uzyskanego wirusa były wykrywane odpowiednio przez CPE i CEC oraz immunofluorescencję odbarwienia w komórkach Vero. Monowarstwy drugorzędnego CEC były zastosowane do płytki porównawczej po zaszczepieniu komórek supematantami wywodzących się z transfekowanych komórek Vero. Przybliżone miano wirusa zostało obliczone na płytkach powstałych jednostek w mililitrach (pfu/ml).
190 220
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJACY: VAKHARIA, Vikram N.
MUNDT, Egbert (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: SPOSÓB WYTWARZANIA BIRNAVIRUSA
Z SYNTETYCZNYCH TRANSKRYPTORÓW RNA (iii) LICZBA SEKWENCJI: 34 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: NIKAIDO, MARMELSTEIN, MURRAY & ORAM
LLP (B) ULICA: 655 Fifteeth Street, N. W, Suite 330 - G Street Lobby (C) MIASTO: Washington (D) STAN: DC (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY: 20005-5701 (v) WYMAGANIA DO ODCZYTU:
- (A) TYP NOŚNIKA,: dyskietka FDD (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (vi) DANE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US (B) DATA PRZYJĘCIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(vii) DANE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA:
(A) NAZWISKO: KITTS, Monica C.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 36,105 (C) NUMER UPRAWNIEŃ/ZEZWOLENIA: P8172-6002 (viii) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: 202/638-5000 (B) TELEFAKS: 202/638-4810
190 220 (2) INFORMACJE O SEKWENCJI ID NO: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 46 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI, numer identyfikacyjny sekwencji: 1:
GAATTCGGCT TTAATACGAC TCACTATAGG ATACGATCGG- TCTGAC 46 (2) INFORMACJE O SEKWENCJI ID NO: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 41 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 2
AATTGGATCC GTTCCCGCGT CCCCTGTACA AAGCCGAATT C 41 (3) INFORMACJE O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA, kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji. 3:
CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC 36 (4) INFORMACJE O SEQ ID NO: 416
190 220 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI · (A) DŁUGOŚĆ· 44 pary podstawowe (B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· podwójna (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI· cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 4:
GTCAGACCGA TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT CTCT 44 (5) INFORMACJE O SEQ ID NO· 5· (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 33 pary podstawowe (B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· podwójna (D) TOPOLOGIA· kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI· cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI- numer identyfikacyjny sekwencji· 5TTGCATGCCT GCAGGGGGCC CCCGCAGGCG AAG 33 (6) INFORMACJE O SEQ ID NO· 6· (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI(A) DŁUGOŚĆ· 31 par podstawowych (B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· podwójna (D) TOPOLOGIA kolista (ii) TYP CZĄSTECZKI· cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji. 6
TCGTATCCTA TAGTGAGTCG TATTAGAATT C (7) INFORMACJE O SEQ ID NO 7· (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ 120 par podstawowych (B) TYP· kwas nukleinowy
190 220 (C) SKRĘTNOŚĆ- pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwengj· 7:
GGAAGCCTGA GTGAGTTGAC TGACTACAGC TACAACGGGC TGATGTCAGC CACTGCGAAC 60
ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGG TGACTGTTCT CAGTCTACCG 120 (8) INFORMACJE O SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 par podstawowych (B) TYP· kwas nuklernowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 8:
GGAAGCCTGA GTGAGTTGAC TGACTACCAGC TACAACGGGC TGATGTCAGC CACTGCGAAC 60
ATCAACGACA AGATCGGGAA CGTTCTAGTT GGAGAAGGGGTGACTGTTCT
CAGTCTACC
119 (9) INFORMACJE O SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI numer identyfikacyjny sekwencji· 9:
190 220 ^AA^d^A GTGAACTGAC AGATGTTAGC TACAATGGGT TGATGTCTGC AACAGCCAAC 60
ATCAACGACA AAATTGGGAA CGTCCTAGTA GGCGAAGGGG TCACCGTCCT CAGCTTACCC 120 (10) INFORMACJE O SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: luiear (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI, numer identyfikacyjny sekwencji: 10·
TTTTCAATAG TCCACAGGCG CGAACGAAGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG 60
CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CCAAAGTCTG GGTGCCACCT CACCATCCGC 120 (11) INFORMACJE O SEQ ID NO, 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 120 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji. 11:
TTTTCAACAG TCCACAGGCG CCAA<CCACGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG 60
CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CTAAAGTTTG GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120 (12) INFORMACJE O SEQ ID NO. 12190 220 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 120 par podstawowych (B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI· DNA (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji: 12·
TTTTCAACAG TCCACAGGCG CGAAGCACGA TCTCAGCAGC GTTCGGCATA AAGCCTACTG 60
CTGGACAAGA CGTGGAAGAA CTCTTGATCC CTAAAGTTTG GGTGCCACCT GAGGATCCGC 120 (13) INFORMACJE O SEQ ID NO· 13· (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 48 par podstawowych.
(B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· pojedyncza (D) TOPOLOGIA· liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI- DNA (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji· 13·
TAATACGACT CACTATAGGA TACGATCGGT CTGACCCCGG GGGAGTCA 48 (14) INFORMACJE O SEQ ID NO· 14· (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI· (A) DŁUGOŚĆ· 44 pary podstawowe (B) TYP· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ· pojedyncza (D) TOPOLOGIA· liniowa (n)TYP CZĄSTECZKI· DNA (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji. 14·
AGAGAATTCT AATAGGACTC ACTATAGGAT ACGATCGGTC TGAC 44
190 220 (15) INFORMACJE O SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (h) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI, numer identyfikacyjny sekwencji· 15
TGTACAGGGG ACCCGCGAAC GGATCCAATT (16) INFORMACJE O SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 16
CGGCGAATTC ATGCATAGGG GACCCGCGAA CGGATC 36 (17) INFORMACJE O SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ. 20 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (n)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 17
CGTCGACTAC GGGATTCTGG 20 (18) INFORMACJE O SEQ ID NO· 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ 20 par podstawowych (B) TYP. kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
190 220 (ii)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 18.
CAGAGGCAGT ACTCCGTCTG (19) INFORMACJE O SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI(A) DŁUGOŚĆ: 20 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: lineinowy (n)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 19:
AGTCGACCGG ATTCTTGCTT (20) INFORMACJE O SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (n)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 20:
GAAGCTGTGC GAGAGGAC (21) INFORMACJE O SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 44 pary podstawowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 21·
AGAGAATTCT AATACGACTC ACTATAGGAT ACGATGGGTC TGAC 44
190 220 (22) INFORMACJE O SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI.
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary podstawowe (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (n)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwenqi: 22:
CGATCTGCTG CAGGGGGCCC CCGCAGGCGA AGG (23) INFORMACJE O SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary podstawowe (B) TYP- kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA liniowa (n)TYP CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 23
CTTGAGACTC TTGTTCTCTA CTCC 24 (24) INFORMACJE O SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (u)TYP CZĄSTECZKI· DNA (xi) OPIS SEKWENCJI, numer identyfikacyjny sekwencji. 7:
ATACAGCAAA GATCTCGGG 19 (25) INFORMACJE O SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 2827 par podstawowych (B) TYP: kwas nukleinowy
190 220 (C) ZWOJOWOŚĆ· pojedyncza (D) TOPOLOGIA· kolista (u) RODZAJ CZĄSTECZKI· cDNA (ix) WŁAŚCIWOŚCI· (A) NAZWA/KLUCZ· cds (B) POŁOŻENIE. 112.2745 (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji 25
GGATACGATG GGTCTGACCC TCTGGGAGTC ACGAATTAAC GTGGCTACTA GGGGCGATAC {0
CCGCCGCTGG CCGCCACGTT AGTGGCCC CTTCTTGATG ATTCTGCCAC C ATG AGT ΙΠ Met Ser
GAC ATT TTC AAC AGT CCA CCC GGC CCC Ad ACG ACC TCC. GGC GGC TTT 11^5;
Asp Ile Phe Asn Ser Pro Gln Ala JAg Ser TTh 11(2 Ssu Ala Ala PPh
S H 15
GGC Gly ATA Ile 20 AAG Lys CCT ACT Pro Thr GCC TGG aic Gly 22 CCA. GAC GTG (GA (GA CCT TTT Ad CCC 213
GGn 3Ap Vaa Glu Glu 30 Leu Ilu 11(2 Ppo
ACA GTT TGC GTG CCA CCC TGC GGC CCC3 (CC GCC Ad CCC ACG CCG CCG 261
Lys Val Trp Val Pro Pro Glu Alp Pr a Leu la Ser Ppo Ssu Air Lee
35 40 45 55
GCA AAG TTC CTC AGA GAG GAC Gd TAC TCA GCC TTG CCC CCC ccc; TTC 309
ALa Lys Phe Leu Arg Gic JAn Gly Ty Lys vaa Leu GGn Pr <5 Ig Ssu
55 60 65
CTG CCC GAG AAT GAG GAG TAT GAG ACC ggac (CCC ATA CC CCA GAC TTA 357
Leu Pro Glu Asn Glu Glu tyr Glu Thr Asp Gln He Lee Poco Alp Leu
70 75 80
GCA TGG ATG CGC CAG ATA GAC GGG GCT GTT TTA ACC CCC ACT CTA TCT 4θ0>
ALa Trp Met Arg Gln Ile- Glu Gly Ala Val Leu Lys Pro Thr Leu Ser
85 90 99
CTC CCT ATT GGA GAT CA3 GAG TAC TTC CCA JAG TAC TAC COC ACA CCC 453
Leu Pro Ile Gly Asp Gln Glu Tyr Phe Pro Lys ητ Tyr Pro Thr His
100 115, 110
CGC CCT AGC ACG GAG AAG CCC •ACT GCG TAC CCG CCC GAC ATC GICA CA 501
Arg Pro Ser Lys Glu Lys Pro Asn la Tjyc Pro Pro Asp Ile Ala Leu
115 120 125 130
190 220
CTC AAG CAG ATG ATT TAC CTG GTT Phe CCC 0ee CCG 0TT CCC GAG 0GC AU GGA 549
Leu Lys Gln Met Ile Tyr 135 LeL CGn 140 Cal CPO CGu Ala Cm 145 CGu
GGC CTA AAG GAT GAA GTA ACC CTC TTG ACC CAA AAC ATA GAC MG W
Cly Leu Lys Asp Glu Val Thr Leu Leu Thr Gln Asn Ile Arg Asp Lys
150 155 160
GCC TAT GGA AGT GGG ACC TAC ATC GGA GCA GCC. CAA CGG CCT CGG CGC 645
Ala Tyr Gly Ser Gly Thr TjGT Met Gly Gln Ala Am c\ao Ceu Cal Ml
165 170 117
ATG AAG GAG GTC GCC ACT GGA AGA AAC CCA AAC MG GAT CCT CTA AAG S93
Met Lys Glu Val Ala Thr Gly Arg Asn Pro Asn Lys Asp Pro Leu Lys
180 185 190
CTG GGG TAC ACT TTT GAG AGC ATC GCG CAG CTA CTT GAC ATC ACA CTA 744
Leu Gly Tyr Thr Phe Glu Ser Ile Ala Gln Leu Leu Asp Ile Ghr Leu
195 200 205 210
CCG GTA GGC CCA CCC GGT GAG GAT GAC AAG CCC TOG GTG CCA CTC ACA 7&9
Pro Val Gly Pro Pro Gly Glu Asp Asp Lys Pro Τη? Val Pro Leu Tlhr
215 220 225
AGA GTG CCV TCA CGG ATG TTG GTG CTG ACG GGA GAC GTA GAT GGC GAC 837
Arg Val Pro Ser Arg Met Leu Val Leu Thr Gly Asp Val Asp Gly Asp
230 235 240
TGT GAG GTT GAA GAT TAC CTT CCC AAA ATC AAC CTC AAG TCA GCA AGG 885
Phe Glu Val Glu Asp Tyr Leu Pro Lys Ile Asn Leu Lys Ser Ser Ser
245 25 0 255
GGA CTA CCA TAT GTA GGT CGC ACC AAA GGA GAG ACA ATT TTG GAG ATG 993
Gly Leu Pro Tyr Val Gly Arg Thr Lys Gly Glu Thr Ils Gly Glu Met
260 265 270
AGA GCT ATC TCA AAC CAG GTT CTC AGA GAG CGA GCA ACA CTC GGG AAG
Ile 275 Ala Ile Ser Asn Gln 250 Phe Leu Arg Glu Leu 255 Ser Thr Leu Leu Lys 290
CM GGG GCA TGT ACA MG TTT GCA AAC AAG MG MG CTA CTC AGC ATG
Gln Gly Ala Gly Thr Lys Gly Ser Asn Lys Lys Lys Leu Leu Ser Mec
295 300 305
TTA AGG TGG TAG GGG TAC GTA TCA TGC CTT TGG TTT CCA MG Gcr
Leu Ser Asp Tyr Top Gyo Leu Ser Cys Gly Leu Leu Phe Pro Lys Ala
310 315 320
GM ATT TAC GAC MA AGT ACA GGG CTC ACC HG ACC CGG AAC AGA TGG
Glu Arg Tyr Asp Lys Ser Ghr Grp Leu Thr Lys Ghr Arg Asn Ile Grp
325 330 335
9S1
1029
1077
1125
190 220
TCA GCT CCA TCC CCA ACA CAC CTC ATG ATC TCT ATG ATC ACC TGG Trp CCC Pro 1173
Ser Ala 340 Pro Ser Pro Thr His Leu 345 Met Ile Ser Ket 350 Ile Thr
GTG ATG TCC AAC AGC CCA AAT AAC GTG TTG AAC ATT GAA GGG TGT CCA 1221
Val Met Ser Asn Ser Pro Asn Asn Val Leu Asn Ile Glu Gly Cys Pro
355 3S0 365 370
TCA CTC TAC AAA TTC AAC CCG TTC AGA GGA GGG TTG AAC AGG ATC GTC 1269
Ser Leu Tyr Lys Phe Aen Pro Phe Arg Gly Gly Leu Asn Arg Ile Val
375 380 385
GAG TGG ATA TTG GCC CCG GAA GAA CCC AAG GCT CTT GTA TAT GCG GAC 1317
Glu Trp Ile Leu Ala Pro Glu Glu Pro Lys Ala Leu Val Tyr Ala Asp
390 395 400
AAC ATA TAC ATT GTC CAC TCA AAC ACG TGG TAC TCA ATT GAC CTA GAG 1355
Asn Ile Tyr Ile Val His Ser Asn Thr Trp Tyr Ser Ile Asp Leu Glu
405 410 415
AAG GGT GAG GCA AAC TGC ACT CGC CAA CAC ATG CAA GCC GCA ATG TAC 1413
Lys Gly Glu Ala Asn Cys Thr Arg Gln His Met Gln Ala Ala Met Tyr
420 425 430
TAC ATA CTC ACC AGA GGG TGG TCA GAC AAC GGC GAC CCA ATG TTC AAT 1461
Tyr Ile Leu Thr Arg Gly Trp Ser Asp Asn Gly Asp Pro Met Phe Asn
435 440 445 450
CAA ACA TGG GCC ACC TTT GCC ATG AAC ATT GCC CCT GCT CTA GTG GTG 1509
Gln Thr Trp Ala Thr Phe Ala Met Asn Ile Ala Pro Ala Leu Val Val
455 460 465
GAC TCA TCG TGC CTG ATA ATG AAC CTG CAA ATT AAG ACC TAT GGT CAA 1557
Asp Ser Ser Cys Leu Ile Met Asn Leu Gln Ile Lys Thr Tyr Gly Gln
470 475 480
GGC AGC GGG AAT GCA GCC ACG TTC ATC AAC AAC CAC CTC TTG AGC ACA 1605
Gly Ser Gly Asn Ala Ala Thr Phe Ile Asn Asn His Leu Leu Ser Thr
485 490 49S
CTA GTG CTT GAC CAG TGG AAC CTG ATG AGA CAG CCC AGA CCA GAC AGC 1653
Leu Val Leu Asp Gln Trp Asn Leu Met Arg Gln Pro Arg Pro Asp Ser
500 505 SIO
GAG GAG TTC AAA TCA ATT GAG GAC AAG CTA GGT ATC AAC TTT AAG ATT 1701
Glu Glu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Lys Leu Gly Ile Asn Phe Lys Ile
515 520 525 530
GAG AGG TCC ATT GAT GAT ATC AGG GGC AAG CTG AGA CAG CTT GTC CTC 1748
Glu Arg ser Ile Asp Asp Ile Arg Gly Lys Leu Arg Gln Leu Val Leu
535 540 54S
190 220
CTT GCA CCAA CCCc GGG TAC CTG TGT GGG GGG GTT GAA CCA GAA CAA TCC 1797
Leu Ala Gln Pro 550 Gly Gyy Leu Ses riy 555 Gly Vi1 Glu Pro Glu Gln 560 Ser
AGC CCA ACT GTT GAG CTT GAC CTA CTA GGG TGG TCA GCT ACA TAC AGC 184.5
Ser Pro Thr Val Glu Leu Asp Leu Leu GIl Trp Ser Ala Thr Tyr Ser
565 570 575
AAA GAT CTC GGG ATC TAT GTG CCG GTG CTT GAC AAG GAA CGC CTA TTT 1&93
Lys Asp Leu Gly Ile Tyr Val Pro Val Leu Asp Lys Glu Arg Leu Phe
580 585 590
TGT TCT GCT GCG TAT CCC AAG GGA GTA GAG AAC AAG AGT CTC AAG TCC 1941
Cys Ser Ala Ala Tyr Pro Lys Gly Val Glu Asn Lys Ser Leu Lys Ser
595 600 605 610
AAA GTC GGG ATC GAG CAG GCA TAC AAG GTA GTC AGG TAT GAG GCG TTG 1133
Lys Val Gly Ile Glu Gln Ala Tyr Lys Val Val Arg Tyr Glu Ala Leu
615 620 625
AGG TTG GTA GGT GGT TGG AAC TAC CCA CTC CTG AAC AAA GCC TGC AAG 2203
Arg Leu Val Gly Gly Trp Asn Tyr Pro Leu Leu Asn Lys Ala Cys Lys
630 635 640
AAT AAC GCA GGC GCC GCT CGG CGG CAT CTG GAG GCC AAG GGG TTC CCA 2085
Asn Asn Ala Gly Ala Ala Arg Arg Hls Leu Glu Ala Lys Gly Phe Pro
645 650 655
CTC GAC GAG TTC CTA GCC GAG TGG TCT GAG CTG TCA GAG TTC GGT GAG 2133
Leu Asp Glu Phe Leu Ala Glu Trp Ser Glu Leu Ser Glu Phe Gly Glu
660 665 670
GCC TTC GAA GGC TTC AAT ATC AAG CTG ACC GTA . ACA TCT GAG AGC CTA 2181
Ala Phe Glu Gly Phe Asn Ile Lys Leu Thr Val Thr Ser Glu Ser Leu
675 680 685 690
GCC Ala GAA CTG AAC Glu Leu Asn AAG Lys 695 CCA GTA CCC CCC AAG CCC CCA AAT GTC Pro Asn Val AAC Asn 705 AGA Arg 2223
Pro Val Pro Pro Lys 700 Pro
CCA GTC AAC ACT GGG GGA CTC AAG GCA GTC AGC AAC GCC CTC AAG ACC 2273
Pro Val Asn Thr Gly Gly Leu Lvs Ala Val Ser Asn Ala Leu Lys Thr
710 715 720
GGT CGG TAC AGG AAC GAA GCC GGA CTG AGT GGT CTC GTC CTT CTA GCC 2G25
Gly Arg .Tyr Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Gly Leu Val Leu Leu Ala
725 730 735
ACA GCA AGA AGC CGT CTG CAA GAT GCA GTT AAG GCC AAG GCA GAA GCC 2373
Thr Ala Arg Ser Arg Leu Gln Asp Ala Val Lys Ala Lys Ala Glu Ale
740 745 750
190 220
GAG AAA Glu Lvs 755 CTC Leu CAC AAG TCG AGG CAG GAG GGA GCC GGG GAT GGA TGG CTC 2421
His Ly s eer 770 Ly s Log .Asg Aa. Ppl 770 Aa. AGl Ga. Trp Phe 777
GAA AGA TCA GAA ACA CGC GCA GAC CTT CCT GGA JAGI GCC GAC ATC GCC 2263
Glu Arg Ser Glu Thr; Lgu S er Asp G eu Leu Glu Lys Ala Asp lis Ala
775 778 785
AGC AAG GTC GCC CAC TCT. GCA CTC GTC GAA AAC. AGC GAC GCC CCT GAA 2557
Ser Lys Val Ala His S ss All L eu Val Glu. TTu Ssr Ga. Ala Leu Glu
790 775 800
GCA GTT CAG TCG ACA? CCC GGT GAA AAC GCC JAAG TAC COA (GGA GTC AAG 2550
Ala Val Gln Ser Thr S er Vvl Gyy Ghr Gro Lys Tyr Pro Glu Val Lys
805 810 815
AAC CCA CAG ACC GCC TCC AAA GCC GGT GTT GCGG CTC CCAC CTG TTT GCC 2201
Asn Pro Gin Thr Ala S er Aa. Cpl rva Val Gly Leu His Leu Pro Ala
820 825 830
AAG AGA GCC ACC GGT GTC CCA GGC GCT CTT CTC GGA GCA GGA GCG AGC 2666.
Lys Arg Ala Thr Gly Val G Gn GAl GAl Leu Leu Gly Ala Gly Thr Ser
835 840 845 850
AGA CCA ATG GGG ATG GAG GGC GCC GAC CGG TCC AAG AAC GCC GCA AAA 2103
Arg Pro Met Gly Met Glu A Al gpl GTh .Arg Ser Lys Asn Ala Val Lys
855 880 055
ATG GCC AAA. GGG CGG CAA CGC CAA AAA GAA AAC CGC CAATAGTTAT 275S
Met Ala Lys Arg Arg Gln Arg Gln Lll GGu Gse Arg
870 875
GATGGGAACC ACTCAAGAAG AGGACACTAA TCCCAGACCC CGTATCCCCG GCCTTCGCCT 2815
GCAAGAATCC CC 2827 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ. 878 aminokwasów (B) RODZAJ aminokwas (C) TOPOLOGIA; liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY· proteina (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji· 26
Met Ser Asp He Ptie Asn Ser Pro Gin JALa Arg Ser Thr Ile Ser Ala
5 10 15
Ala Phe Gly Ile Lys Pro Thr Ala Gly Gin Asp Val Glu Glu Leu Leu
190 220
25 30
Ile Pro Lys ' 35 Val Trp Val Pro Pro Glu 40 Asp Pro Leu . Ala 45 Ser Pro Ser
Arg Leu 50 Ala Lys Phe Leu Arg 55 Glu Asn Gly Tyr Lys ' 60 Val Leu Gln Pro
Arg 65 Ser Leu Pro Glu Asn 70 Glu Glu Tyr Glu Thr Asp 75 Gln Ile Leu Pro 80
Asp Leu Al a Trp Met 85 Arg Gln Ile Glu Gly 90 Ala Val Leu Lys Pro 95 Thr
Leu Ser Leu Pro 100 Ile Gly Asp Gln Glu 105 Tyr Phe Pro Lys Tyr 110 Tyr Pro
Thr His Arg 115 Pro Ser Lys Glu Lys Pro 120 Asn Ala Tyr Pro 125 Pro Asp Ile
Ala Leu 130 Leu Lys Gln Met Ile 135 Tyr Leu Phe Leu Gln 100 Val Pro Glu Ala
Asn 145 Glu Gly Leu Lys Asp 150 Glu Val Thr Leu Leu Thr 155 Gln Asn Ile Arg 160
Asp Lys Ala Tyr Gly 165 Ser Gly Thr Tyr Met 170 Gly Gln Ala Asn Arg 175 Leu
Val Ala Met Lys 180 Glu Val Ala Thr Gly 185 Arg Asn Pro Asn Lys 190 Asp Pro
Leu Lys Leu 195 Gly Tyr Thr Phe Glu Ser 200 Ile Ala Gln Leu 205 Leu Asp Ile
Thr Leu 210 Pro Val Gly Pro Pro 215 Gly Glu Asp Asp Lys 220 Pro Trp Val Pro
Leu 225 Thr Arg Val Pro Ser 230 Arg Met Leu Val Leu Thr 235 Gly Asp Val Asp 200
Gly Asp Phe Glu Val 245 Glu Asp Tyr Lau Pro 250 Lys Ile Asn Leu Lys 255 Ser
Ser Ser Gly Leu 250 Pro Tyr Val Gly Arg 265 Thr Lys Gly Glu Thr 270 Ile Gly
Glu Met Ile 275 Ala Ile Ser Asn Gln Phe 280 Leu . Arg Glu Leu 285 Ser Thr Leu
Leu . Lys Gln . Gly • Ala . Gly Thr • Lys Gly Ser Asn Lys Lys Lys Leu i Leu
190 220
290 295 300
Ser 305 Met Leu Ser Asp Tyr Trp 310 Tyr Leu Ser Cis Gly Leu Leu Phe Prr
315 330
Lys Ala Glu Arg Tyr Asp Lys Ser Tir Trp Leu Thr Lys Tihr AArg Asn
325 330 335
Ile Trp Ser Ala Pro Ser Pro Tir His Leu Met Ile Ser Met Ile T!hr
340 345 350
Trp Pro VaU Met Ser Asn Ser Pro Asn Asn Val Leu Asn Ile Glu Gly
355 360 355
Cys Pro Ser Leu Tyr- Lys Płee Asn Pro Phe Arg Gly Gly Łeu Asn Mt)
370 375 330
Ile VaU Glu Trp Ile Leu Ala Pro Glu Glu Pro Lys Ala Leu Val TTir
385 390 395 400
Ala Asp Asn Ile Tyr- Ile Val His Ser Asn Thr Trp Tyr Ser Ile AAsp
405 440 440
Leu Glu Lys G ty Glu -ALa Asn Cys TThr Arg Gln His Met Gln -Aa -Aa
420 445 443
Met Tyr Tyr: I 1u Leu Thr AArg Gly Τιρ Ser AA;p Asn Gty AAp Pro MmI
435 440 444
Phe Asn Gln Thr Trp AALa TTr Phe Ala Met Asn Ile Ala -Pro Ala Leu
450 455 440
VaT Val Asp SSr Ser Cys Leu Ile Mee Asn Leu Gln Ho Lys eur Tyr
465 470 475 440
Gly Gln Gly Ser Gly Asn Ala Ala Tir Phe Ile Asn Asn His Leu Leu
48S 450 495
Ser Thr Leu Val Leu Asp Gln Τη? Asn Leu Met Arg Gln Pro Arg Pro
500 505 510
Asp Ser du C-lu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Lys Leu Gly Ile Asn Phe
SIS 520 525
Lys Ile Glu Arg Ser Ile Asp Asp Ile Arg Gly Lys Leu Arg Gln Leu
530 555 540
Val Leu Leu Ala Gln Puo Gly Ty- leu Ser Gly Gty Ual Glu Pr o Glu
545 550 55- 560
Gln Ser Ser Pro Thr Val Glu Leu A:p Leu Leu Gly Trp Ser Ala Thut
190 220
565 570 575
Tyr Ser Lys Asp 530 Leu Gly Ile Ty-r Val 505 Ppo Val Leu Asp Lys 560 Glu 5Ar
Leu Phe CCs 595 Ser Ma M.a TTyr Pro 600 Lys Gly aal Glu Asn 605 Lys See Leu
Lys Ser 610 Lys Val Gly Ile Glu 615 Gln Ma Tyr Lys aal 620 Val Mg Tyc Glu
Ala 625 Leu Arg Leu V al Gly 630 Gly Trp Asn ITyr Pro 665 Leu Leu Mn Lys Ml «40
Cys Lys Asn Asn Ala 645 Gly Ma Ma Arg Mg 650 His Leu Glu Ala Lys 655 dl
Phe Pro Leu Asp 660 Glu Phe Leu Ma Glu 665 Τηρ Ser Glu Leu Se5 770 Glu Phe
Gly Glu Ala 675 Phe Glu Gly Phe Asn 660 Ile Lys LeU Thr Vl5 660 Th5 Ser Glu
Ser Leu 690 Ala Glu Leu Asn Lys 695 Pro Val Pro P^o Lys 700 Pro Pro Asn V3l
Asn 705 Arg Pro Val Asn hhr 711 Gly Gly Leu Lys Ala 715 Val Ser Asn Ala Leu 722
Lys Thr Gly Arg hyr 725 Mg 5An Glu Ma Gly 773 Leu Ser Gly Leu aal 735 Llu
Leu Ala hhr Ala 740 Arg Ser Arg Leu Gln 745 AAp Ma Val Lys Ala 750 Lyy All
Glu Ala Glu 755 Lys Leu His Lys Ser 770 Lys Pro Asp Asp Pro 765 Asp Ma Alp
Trp Phu 770 Glu Mg Ser Glu Thr 77 5 Leu Sur Asp Leu Luu 700 Glu Lys Ala Asp
Ilu 785 Ma Ser Lys Val Ala 790 His Ser Ala Leu Val 795 Glu Thr Ser Asp Ma 800
Luu Glu Aia Val Gln 005 Ser Thr Ser aal hyr 301 hhr Pro Lys iCr Pro 801 Glu
aal Lys Asn Pro 020 Gln Thr Ala Ser Asn 805 Pro Val aal Gly Leu 830 His Leu
Pro Ala Lys Arg Ala Thr Gly Val Gln Ala Ala Leu Leu Gly Ala GXy
190 220
835 840 845
Thr Ser Arg Ppo MM: Gly Met GGu. AAa Pro Thr Arg Ser Lys .Asi JTa
850 855 860
Val Lys Met AAa lll AAg Arg Gln Arg Gln Lys Glu Se a Arg
865 870 87S (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym· 27 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (D) DŁUGOŚĆ· 3261 parpodstawowych (E) RODZAJ: kwas nukleinowy (F) SKRĘTNOŚ: pojedyncza (G) TOPOLOGIA.
(ii) RODZAJ MOLEKUŁY: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 27
GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGG-^i^TC ACCCGGGGAC AGGCCGTCAA GGCCTTGTTC 60
CAGGATGGGA CTCTTCCTTT TACAACGCTA TCATTG ATG GTT AGT AGA GAT CAG 114
Met Val 880 Ser Arg Asp Gln
ATA AAC GAT CGG AGC GAT GAC AAA CCT GCA AGA TCA AAA CCC ACTA GGA 116
Thr 885 Asn Asp Ar ęi Ser Asp 890 Asp Lys Pro Ala Arg 895 Ser AAn Pro Thr Aap 900
TGT TCC GTT CAT ACG GAG CCT TCT GAT GCC AAC AAC CCG AAC GGC GGT 220
Cys Ser Val His Thr 905 GGu Pro Ser Asp Ala 910 Asn Asn AAg Thr Gly 915 Val
CAT TCC GGA CTG OAC CCT GGA GAA GGA GAC TCT GGG CTC AAA GAC CTC 258
His Ser Gly •AAg 920 His Pro Gyy Glu Ala 925 His Ser Gln Val A^ 930 ΑΓρ Leu
GAC CTA CAA TTT GAC TGT GG ©AA GAC AG GTC AGG GCC AAT TGT CTT Ϊ06
Asp Leu Gln 935 Phe JAp Cys GLv Gyy 940 His Aao VZa 1 Agg AAa 945 AAJI Cys Lei’
TTT CCC TGG AAT CCC GGG TTC AAT GTT GGG GCC TAC CTA CTC ACT GCT. 354
Phe Pro 950 Trp Ili! Pro Tit? Leu 955 Asn Cys Gly Cys Ser 960 Leu His iThr \Al.
190 220
GGG CAA Gly Gln 965 TGG GGA CTA CAA GTT CC Arg TC GAT GGC CCC GGC TGG CCC GGA Pro CTu 980 400
T:t Glu Leu Gln 970 Val Ser Asp Ala 975 Pro Aap Ccs
CCT ACC GGC CCG TTA CCA CTA CTG CAG GCT ACT GAA TTC CG TCC CCA 450
Pro Thr Gly Gln Leu GGn Leu Leu Gln Ala Ser CTu Ser Glu Ser His
985 990 995
AGT GAG GTC CAA3 CAC ACT TCC TGG TG CGT TTA TGC ACT· «Λ CCA CC 498
Ser Hu Val Lys His Thr Ser Trp Trp Arg Leu Ccs Thr Lys Arg Hhs
1000 1005 1010
CAT AAA CGC CGT GAC CTT CCA AGG AAG CCT GAG TAlACTAACA l AATA,ΓTAACT 551
His Lys Arg Arg Asp Leu Pro Arg Lys Pro Glu
1015 1020
ACA^TGtG^^TT GATGTCTGCA ACAGCCAACA TCAACGACAA AATTGGGAAC GTCCTAGTAG 611
GGGAA(^<^GGT CACCGTCCTC AGCTTACCCA CATCATATGA TCTTGGGTAT GTGAGGCTTG 671
GTGACCCCAT TCCCGCAATA GGGCTTGACC CAAA.AATGGT AGCCACATGT GACAGCAGTG 731
AClAACCCA AGTCTACACC ATlACTACA CCGATCTTA CCAATTCTC TCCAGTACC 791
AlCCAAATAA AATAAClATC ACCTATTCT CAGCCACAT TAlTACClTC ACAlACCTCA 851
ACATTAAGAA AAlACTCATG TTTCAAACAA ACATCCACAA CCTΓATACTA AACACCACCl 911
TCTACCTCAT AAACTTTAAT AAAACAlCGA TUrCCCG AGCTATAACC ACAAlCAATA 971
AACΓAACAAC CAGCACCAAC AACCTTATGC CTTCATCT TATAATTCCA ACAlACAAAA 1031
TAlCCClACC AATCACATCC ATClAACTAA AAATAATAAC CΓCCAllCT AATAATClAA 1091
CHAGATC AATATCATAA TCAAClAAlA AAAACCTAAC ACTCCGATC CATAATAACA 1151
ACTATCCAAA G^CCCTCdT CCCGTCCGC TAATAACCTl ACAAClAAlT 1211
CCCTCCTTAC AATCACTAAA ATAAACllCT TCAlACTAlT CCCAATCCT AAlCTAAClA 1271
HAACCTUT TACAAlATAC AACCAATTTA ACCClAAAAC ClTGlACTAC ACAAlTTAA 1331
TlCTAAATC AAAGAACCAT AAACCATCTA ACCAAClAAA AlATlCACTA 1391
ACΓ'TTCATAA ATACTTCATG AAAATAACCA ACCTCACTC TCcCCTAlAA ATTACAAAAA 1451
C^TTCCACTT CAAAACTA ATCCAAACCA TlAAAlAAAT lACTATACCA ATAATCTCCA 1511
CAT^C^TTCCC ACCTACCACr CCCCTAGCCC lTACAATTGA AAAlAATCTA AlCTACCTAC 1571
TAAACAlTAA AACACAAACΓ ACTTCAAGAl CTACTCAAAC dCCTCm AAAAClAAAA 1631
190 220
CTGCCTCAGG CCGCATAAGG CAGCTGACTC TCGCCGCCGA CAAGGGGTAC GAGGTAGTCG 1691
CGAATCTATT CCAGGTGCCC CAGAATCCCG TAGTCGACGG gattcttgct TCACCTGGGG 1751
TACTCCGCGG TGCACACAAC CTCGACTGCG TGTTAAGAGA GGGTGCCACG CTATTCCCTG 1811
TGGTTATTAC GACAGTGGAA GACGCCATGA CACCCAAAGC ATTGAACAGC AAAATGTTTG 1871
CTGTCATTGA AGGCGTGCGA GAAGACCTCC AACCTCCATC TCAAAGAGGA TCCTTCATAC 1931
GAACTCTCTC TGGACACAGA GTCTATGGAT ATGCTCCAGA TGGGGTACTT CCACTGGAGA 1991
CTGGGAGAGA CTACACCGTT GTCCCAATAG ATGATGTCTG GGACGACAGC ATTATGCTGT 2051
CCAAAGATCC CATACCTCCT ATTGTGGGAA ACAGTGGAAA TCTAGCCATA GCTTACATGG 2111
ATGTGTTTCG ACCCAAAGTC CCAATCCATG TGGCTATGAC GGGAGCCCTC AATGCTTGTG 2171
GCGAGATTGA GAAAGTAAGC TTTAGAAGCA CCAAGCTCGC CACTGCACAC CGACTTGGCC 2231
TTAGGTTGGC TGGTCCCGGA GCATTCGATG TAAACACCGG GCCCAACTGG GCAACGTTCA 2291
TCAAACGTTT CCCTCACAAT CCACOCGACT GGGACAGGCT CCCCTACCTC AACCTACCAT 2351
ACCTTCCACC CAATGCAGGA CGCCAGTACC ACCTTGCCAT GGCTGCATCA GAGTTCAAAG 2411
AGACCCCCGA ACTCGAGAGT GCCGTCAGAG CAATGGAAGC AGCAGCCAAC GTGGACCCAC 2471
TATTCCAATC TGCACTCAGT GTGTTCATGT GGCTGGAAGA GAATGGGATT GTGACTGACA 2531
TGGCCAACTT CGCACTCAGC GACCCGAACG CCCATCGGAT GCGAAATTTT CTTGCAAACG 2591
CACCACAAGC AGGCAGCAAG TCGCAAAGGG CCAAGTACGG GACAGCAGGC TACGGAGTGG 2651
AGGCTCGGGG CCCCACACCA GAGGAAGCAC AGAGGGAAAA AGACACACGG ATCTCAAAGA 2711
AGATGGAGAC CATGGGCATC TACTTTGCAA CACCAGAATG GGTAGCACTC AATGGGCACC 2771
GAGGGCCAAG CCCCGGCCAG CTAAAGTACT GGCAGAACAC ACGAGAAATA CCGGACCCAA 2831
ACGAGGACTA TCTAGACTAC GTGCATGCAG AGAAGAGCCG GTTGGCATCA GAAGAACAAA 2891
TCCTAAGGGC agctacgtcg ATCTACGGGG CTCCAGGACA GGCAGAGCCA CCCCAAGCTT 2951
TCATAGACGA AGTTGCCAAA GTCTATGAAA TCAACCATGG ACGTGGCCCA AACCAAGAAC 3011
AGATGAAAGA TCTGCTCTTG ACTGCGATGG AGATGAAGCA TCGCAATCCC AGGCGGGCTC 3071
TACCAAAGCC CAAGCCAAAA CCCAATGCTC CAACACAGAG ACCCCCTGGT CGGCTGGGCC 3131
GCTGGATCAG GACCGTCTCT GATGAGGACC TTGAGTGAGG CTCCTGGGAG TCTCCCGACA 3191
190 220 ccacccgcgc aggtgtggac accaattcgg ccttacaaca tccccccttg gatccgtttg cgggtcccct (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 28 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (AjDŁUGOŚĆ: 145 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa TOPOLOGIA:
3250
3260 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 28
Met Val Ser 1 Ast Asp 5 dn GUr Asn Asp Arg 00 S er Asp A-p Lys: Pro 15 Ala
Arg Sit Asn Ppt Thr Asp Css Ser Val His TlVł G lu Pro S er Asp Ala
20 22 33
Asn Asn Arg Thr Gly Val His Ser Gly Arg His Pro Gly Glu Ala Hii
35 40 45
Ser Glr Val Arg -Asp Leu Asp Leu Gln Phe Asp (Ces Gly Gly His Act
50 55 60
Val Aat ALa Asn Cys Leu PPh Pro Ttt Ile iTro Trp Leu JAju Cvs Gly
6 S 70 75 00
Cys Sit Leu His Thr Aha CUy Gln Trp Glu Leu Gil V-1 U-g S er Asp
05 90 95
Ala Pro Asp CCes Pro GTo luo Thr Gly G ln Leu Gln Leu Leu Gln -Le
000 105 110
Sit Glu Ser Glu Ser His Ser to- nu- es- His Thr Ser Trp Trp Arg
H5 22 - 125
Leu Cys -Thr Lys Arg His His Lys Arg Arg Asp Leo Pro Arg Lys Pro
030 105 040
Glu
045 (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 29 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
190 220 (A) DŁUGOŚĆ : 3261 pary podttawowe (B) RODZAJ: KWAS NUKLEINOWY (C) ZWOJOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) WŁAŚCIWOŚCI:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 131..3166 (xi)OPIS SEKWENCJI numer identyfikacyjny sekwencji: 29
GGATACGATC GGTCTGACCC CGGGGGCGGC ACCCGGGGCC AGGCCGTCAA σC^<^(CG^Cy:G^<C 66
GAGGATCGGA GTGGTGGTTG TACACCGCGC TCCTTGCGGG TTA1TACAGA TCAGACAAAC 122
CATGCGACGC ATC AGA AAC CTG CAA GAT CCC AGG CAA CAG ATT GTT CCG 116
Mec Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro
150 155
TTC Phe ATA Ile 150 CGG Arg aga: ctc CTG ATG CCC ACGA ACC GGG CCC ACC ATC ATT CCG 2H
Ser Leu Lee. Met 115 Pro Thr Thr Gili Pro 110 Ala Ser Ile Pro
CAG GAC ACC CTG GAG AAG CAC ACT CTC JAG? TCC. GCC ACC AGC ACC TAC 226
Asp Asp Thr Leu G lu Lys His Thr Leu Arg SSr Glu Ghe Ser Thr Tyrr
175 118 118 110
AAT TTG ACT GTC5 GCG3 CCTC ACA CCC TCA GGG CTA ATT GTC TTT TTC CCT 311
Asn Leu Tir- V al G ly LTp Tlur Cly Ser Gly Leu Ile Val Phe Ihl^e Pro
195 200 205
GGA TTC CCT GGC T<TC ATT GTC GCT GCT ccc: TAC ACA CTG CGT GGC AAT 331
Cly Phe Pro G Igi S er Ile Val Cly Ala His TTla Thr Łw Hn Gly Asn
210 215 220
GGG AAC TAC AAG TTC GAT <CTG ATC CTC CTG ACT GCC CAG AAAC CTA GGG 409
Gly Asn Tyr Lys P he Asp Gln Met Leu leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro
225 230 235
GCC CCT TAC AAC TAC TGC AGG CTA <CTG AGT CCCC AGT CTC ACTA GTC A<G3 4S7
Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu val Ser Arg SeA Leu Thr ViA .Arg
240 245 250
TGC CCG ACA CTT CCT GGT GGC CTT TAT GCC CTA JATC GGC ACC ATT AAG 5CS
Ser Ser Thr Leu Pro G1 y Gly Val Tyr Ala Leu jA»n Gly Thr IIs Asn
255 220 265 220
GCC GTG ACC TTC CAA CCA ACC TCA CTA CAA CTG CCA CAG CGG AGC TAC 553
190 220
Ala VaL Ghr Phe Gln 275 Gly Ser Leu Sso Glu 280 Leu Cho Asp Val Ser 285 Tyr
MT GCT TGA AGC GCC GAC AK. CCC MC ATC MC GAC 0AA ATC GCT MC
Asn Gly Le C ee o So C aa c Thr CAa Mn Ile Mn Asp Lys He Gly Asn
290 295 300
GCC CTA TAC GGC AM CTC CTC ACC GTC CTC AGC ΤΓΑ CCC ACC! TCA TAT £63
Val Leu Vl 0 lSc lic lSc Vl 0 Tleć Val Leu Ser Leu Pro Tłuc Ser
305 310 315
GAC CTG GGC AAC GGC GGC CTT Ceu 32S CTT MC CCC Gly Asp Pro ATT CCC GCA ATA GCT Gly :CGT Leu 697
Asp Leu Gly Tyr VvV Mg Ile Pro 330 Ala I Ie
320
GAC GCA AM GTA GCC ACA TGT GAC AGC AGT G^C ACT CCG AGA CTC 77S
Asp Pro Lys Met Val Ala Thr cys Mp Ser Ser AAp CAg Phr Arg vaa
335 340 345 350
TAC ACC ATA ACT GM GCC GAT mt TAC CCA. TTC TCC. TCC. CGA AAG CGA. 773
Cyr GUt Ile TCur CALa CALa Asp A<s> TCs? Gln. Phe Ser See Gln Gyr Gln
355 360 365
CCA CTT GGG GTA AGA ATC AGA <CTG TTC TCA GCC MC ATA? GAT GGG ATC CM4
Pro Gly Gly VaL Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp ALa Ile
370 375 380
ACA AGC CTC AGC GTT GGG GGA GAG CTC GAG TTT (CA ACA AGC GAG CAC 889
Chr Ser Leu Ser VaL Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln TCur Ser Vaa His
385 390 395
GGC CGG CTA CAG CTG GGC AGC ACC GAC CTC AGA CTC TGAC GAT GCT ACA 9^3
Gly Leu VvV Leu Gly Ala Tho He Tyr Leu Ile Gly Phe Asp GLy Tho
400 405 410
ACT GGA ATCC ACC AGG GCT GTG GCC GCA one MT CTG CCG ACG ACC CTC 985
Tho vvL Ile Thr Arg CALa Val Kia Ala Asn Mn Gly Lls Thr Tho GGy
415 420 425 430
ACC GAC MC CTT ATG CCA • CTC MT CCT? GTG ATT CCA AK MC GAG ATA 1P33
Chr Asp Asn Leu Mec Pro Phe Asn Leu Va! Ile Ppo The Mn Glu ioa
435 440 445
ACC GAG CCA ATC ACA TCC ATC AM CTG GAG ATA GTG ACC TCC AM AGT 1081
Tho Gln Pro I 1<s Tho Seg Ils Lys Leu Glu Ile Val Tle: Ser Lys Ser
450 455 460
CTG CTG CAG GCA GGG GAT CUG ATG TCA TCT TCG GCA AGA GGG AGC CTA 1129
Gly Gly Gln ALa GLy Asp Gln Met Seg Top Ser Ala Arg Gly Seo Leu
465 470 475
190 220
GCA GTG ACG ATC CAC TGG TGC 5AA GAT CCC. AGG GCC CCT: CGT CCC GTC 1177
Ala Val 400 Tir- I le H ia giy yi. 405 Asn GTr Pro Gll Ala 460 Llu Mg Pro Gal
ACG CTA GTG GCC TAC GIGA AGG GTG GCCA ACCA GGA TCC GTC GIT ACG GTC 12:22
hhr Luu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ssu· Val Val Thr Val
465 500 505 710
gct UG GTG AGC AAC TTC -GAG CTG ATC CCCI IA.T CCT GJAA CTA GCCA jaag 1227
lla Gly Val S er Asn Phr Glu ILUU Ile Pro Mn Pro Glu Leu Ma Lys
515 520 525
AAC CTG GTT ACA C5GA TAC TCC CCGA TTT GAC CCCC GGA TCC ATG MAC TAC 1132
Asn Leu Val TM Glu Tyr Gly Mg Phe Mp Pro Gly Ma Met Asn Τι:
530 S5S 550
ACA AAA TTG ATA CTG AGT ATC GAC CCT CTT GGC ATC AAG ACC GTC 1136
Thr Lys Leu I 1.B Leu Ser Glu Mg Asp Mg Leu Gly Ile Lys Thr Val
545 555 555
tgc CCA ACA AGG GAG TAC ACT GAC CTT CGT C-AA TAC TTC ATG GAG GTG 1441
Top Pro Thr Arg G lu Tyr •Thr Asp Phe Mg Glu Tyr Phe Met Glu Val
560 S56 557
GCC GAC CTCT AAA 5TC 5CC CTT GAA GTTT GCC! TCA GCCA TTC GGC CTC jaaa 1446
Ala Asp Leu A is GSU Gro Alu Gyy Ile ALa Gly Gla Phu Gly PPe Ly!
575 550 585 556
GAC ATA ATC CCG 5GC aat ATC ATC GTA gct git; CCG GTG GTC TCC ACCA 1151
Asp Ile liii Arg Ala 5Ia Mg Mg Ile Ma vai Pro a.a Val Ser Thr
565 660 660
TTG TTC CCCC CCC ACC GCT CCC CTA GCC CCAT GCCA ATT GGG GlAA tct GTA 1156.
Luu Phu Pro P ro Ala Ala Pro Leu Ma His Ala Ile Gly Glu Gly Val
610 615 662
GAC TAC CTCT CTG TCC GAT GAG GCCA <CAG GCT GCT TCCA GGA ACT GCT CGA 1509
Asp Tyr Leu Leu Gly 5lp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Moj
625 660 663
GCC GCG TTC GGG aaa GGC AGA GCT GCC TCA GGC CGC ATA AGG CAG CTG 1657
Ala Ala SSr ag. Gyy Gla Arg Ala Ala Sur Gly Arg Ilu Arg Gln Leu
540 665 6S0
1CT CTC GCC g CC (GAC HAG GTC TAC GAG GTA GTC GCG Al.T CTA TTC CAG 1705
Tho Luu Ala Al a JA^J3 Lys Gly Tti: Glu Val Val Ala Asn Leu Phe Gln
655 660 65 I 670
GTG CCC CCG ’ AAT CCC GTA GTC GAC GTC ATT CTT GCT TCA CCT GGG GTA 1753
ViI Pro dl Asn. Pro Val Val Mp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Val
675 660 6Β5
190 220
CTC CGC GGT Gd (CAC AAC CTC GAC TGC GTG TTA Ad GAG (G3T GCC ACG isoi
Leu Arg Gly G^l^^ His Asn Leu Asp Cys Val Leu Arg Glu Gly Ala Tłrr
690 595 700
CTA TTC CCT GTG GTT ATT ACG Ad GTG GAA GAT GTT ATG Ad CCC AAA 184S
Leu Phe Pro Val Val Ile Tth· TłhT Val Glu Asp Ala Met Thr Pro Lys
705 710 715
GCA TTG AAC AGC AAA ATG TTC GCT GTC ATT GAA GGT CTG CGA GAA GAC 1837
Ala Leu Asn Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp
720 725 730
CTT CAA CCT CCA TCT CAA AGA GGA TCT TTC ATA TGA ACT CTC TTT GGA 1945
Leu Gln Pro Pro Ser Gln Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly
705 740 745 750
CAC AGA GTT TAT GGA TAT GTT CCA GAT GGG GTA CTT TTA CTG GAG ACT 1993
His Arg Val Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr
755 760 765
GGG AGA GAC TAT ACC GTT GTC CCA ATA GAT GAT GTT TGG GAC GAC AGC 22 04
Gly Arg Asp Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser
770 775 780
ATT ATG CTG TTT AAA GAT CCC ATA CTT TTT ATT GTG GGA AAC AGT GGA 2208
Ile Met Leu Ser Lys Asp Pro Ile Pro Pro -Ile Val Gly Asn Ser Gly
785 790 795
AAT CTA GCC ATA GCT TAC ATG GAT GTG TTT CGA CCC AAA GTC TCA ATC 2137
Asn Leu Ala Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe Arg Pro Lys Val Pro Ile
800 805 810
CAT GTG GTT ATG ACG GGA GCC CTC AAT GCT TGT GGT GAG ATT GAG AAA 2188
His Val Ala Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Cys Gly Glu Ile Glu Lys
815 820 825 830
GTA AGC TTT AGA . AGC ACC AAG • ero ' GCC C ACT GGT . GAC CGA . CTT <G3C ' CTT 2233
Val Ser Phe Arg Ser TTu: Lys Leu . All . GTr ' Aia a His Arg ' Leu . Gly • Leu
835 800 845
AGG TTG Arg Leu GCT GGT CTT GGA Pro Gly. GCA . Ala TTC (GAT GGA GUC AGC GGG CCC AAC TGG 22G1
Ala Gly 850 Phe (up Val inn 855 Thr Gly Pro 860 Asn Trp
GTA ACG TTC ATT AAA CGT TTC CCT CAC JAAT Cd TGT GAC TGG GAC AGG 2329
Ala Thr Phe Ile Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg
865 870 875
CTT TCT TAC CTT AAC CTA Cd TAC CTT CCA CCC AAT GCA GGA CGT CAG 23 77
Leu Pro Tyr Leu Asn Leu Pro -Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Gly Arg Gln
880 88S 890
190 220
TCC CAC CTT GCC ATG GCT GCC TCC GCG TTC ACC GAG ACC CCC GAC CTC Leu 910 244S
Tyr 395 His Leu AUn Met Aln 900 Ala Ser Glu Phe Lys 905 Glu Thr Pro Glu
GAG AGT GCC GTC AGA GCC ATG GAA GCC GCA GCC ACC GTG GAC CCA CTA 2243
GlV Ser Ala Vnl Arg 905 AUn Met Glu Ala Aln 920 Ala Asr Vnl Asp Pro 925 Leu
TTC CCA tct GCC CTC AGT GTG TTC ATG TGG CTG GCA GCG CAT GGG ATT 2221
Phe Gln Sit AUn 93 0 Leu Ser Val Phe Met 935 Trp Leu Glu Glu Csn 940 Gly lie
GTG ACT GAC ATG GCC ACC TTC GCA CTC CGC GCC CCG ACC GCC CAT CGG 2253
Val Thr Asp 945 Met Ala Asr Phe Ala 950 Leu Ser Asp Pro Asr 955 Aln His Arg
ATG CGA AAT TTT CTT GCC AAC GCA CCC CAC GCC GGC AGC ACG TCG CAA 2617
Met Arg 960 Asn Phe Leu Ala Asn 965 Ala Pro Gln Ala Gly 979 Ser Lys Ser Gln
AGG GCC AAG TAC GGG ACC GCA GGC TAC GGA GTG GAG GCT CGG GGC CCC 2265
Arg 975 Ala Lys Tyr Gly Thr 900 AUn Gly Tyr Gly Vyl 905 Glu Ala Arg Gly Pro 990
CCC CCA GAG GAA GCC CAG AGG GAA AAC GAC ACA CGG J/lC TCC ACG ACG 2770
Thr Pro Glu Glu AUn 995 Glr Arg Glu Lys Asp Thr 1000 Arg lie Sit Lys Lys H00
CTG GAG ACC ATG GGC ATC TAC TTT GCC ACA CCA GAC TGG GTA GCC CTC 2761
Met Glu Thr Met Gly 0000 He Tyr Phe Ala Thr 1005 Pro Glu Trp Vnl AUa 1020 Leu
CCT GGG CAC CGA GGG CCA AGC CCC GGC CAG CTC ACG TAC TGG CAG ACC 28 0 9
Csn Gly His Arg 0025 Gly Pro Ser Pro Gly 1030 Glr Leu Lys ryr Trp 1003 Glr Asn
ACC CGC GAC ATA CCG GAC CCC CAC GCG GAC TCT CTA GAC TAC GTG CAT 2^57
Thr Arg Glu 0040 lie Pro Asp Pro Asr 1045 Glu Asp Tyr Leu Asp 1050 Tyr Val His
GCC GAG CAG AGC CGG TTG GCC TCA GAC GAC CCC ATC CTA AGG GCA GCT 2905
Ala Glu 0055 Lys Sit Arg Leu Ala 10 60 Ser Glu Glu Gln Ile 1055 Leu Arg Ala AUn 1070
ACG TCG ATC TAC GGG GCT CCA GGA CAG GCA GAG CCA CCC CAA GCT TTC 2353
Thr ser lie Tyr Gly Aln 0075 Pro Gly Gln AUn Glu 0000 Pro Pro Glr Ala Phe 1085
ATA GAC GAA GTT GCC AAA GTC TAT GAA ATC CCC CAT GGC CGT GGC CCA 3000
ile Asp Glu Vnl Ala !090 Lys Vnl Tyr Glu lie 1055 Asn Has Gly Arg Gly 1500 Pro
190 220
AAC Asn CAA GAA CAG ATG AAA GAT CTG CTC TTG ACT GCG ATG GAG ATG AAG Lys 3049
Gln Glu Gln Mec 1105 Lys Asp Leu Leu 1110 Leu Thr Ala Met Glu 1115 Met
CAT CGC AAT CCC AGG CGG GCT CTA CCA AAG CCC AAG CCA AAA CCC AAT 3097
His Arg Asn Pro Arg Arg Ala Leu Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn
1120 112S 1130
GCT CCA ACA CAG AGA CCC CCT GGT CGG CTG GGC CGC TGG ATC AGG ACC 3145
Ala Pro Thr Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Thr
1135 1140 114S 1150
GTC TCT GAT GAG GAC CTT GAG TGAGGCTCCT GGGAGTCTCC CGACACCACC 3196
Val Ser Asp Glu Asp Leu Glu
1155
CGCGCAGGTG TGGACACCAA TTCGGCCTTA CAACATCCCA AATTGGATCC GTTCGCGC-GT 3256
CCCCT 3261 (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 30 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1012 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SKRĘTNOŚ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 30
Met 4 A. Thr Asn Leu Gln 5 Asp Gln Thr Gln Gln 10 Ile Val Pro Phe Ile 15 Arg
Ser Leu Leu Met 20 Pro Thr Thr Gly Pro 25 Ala Ser Ile Pro Asp 30 Asp Thr
Leu Glu Lys 35 His Thr Leu Arg Ser 40 Glu Thr Ser Thr Tyr 45 Asn Leu Thr
Val Gly 50 Asp Thr Gly Ser. Gly 55 Leu Ile Val Phe Phe 60 Pro Gly Phe Pro
Gly 65 Ser Ile Val Gly Ala 70 His Tyr Thr Leu Gln 75 Gly Asn Gly Asn Tyr 80
Lys Phe Asp Gln Met 35 Leu Leu Thr Ala Gln 90 Asn Leu Pro Ala Ser 95 Tyr
Asn Tyr Cys Arg 100 Leu val Ser Arg Ser 105 Leu Thr Val Arg Ser 110 Ser Thr
190 220
Leu Ppl Gly Gly Val 'jAnL Ala Leu Asn G1 y Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 112 112
Phe Gln GGy G er Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ssr Tyr JAn Gly Lee
130 133 114
Met Ser AAl Ghr Ala Ad Ile Ad Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu erl
125 150 115 HO
Gly Glu GGy Val Tbr Val Leu Ser Leu Pr o TłSf S er Ty Asp Leu GGy
105 170 175
Ty· Val Arg Leli Gly Asp Pro Ile Pro Al a Ile Gly Leu Asp Pro Ljs
180 :885 1^0
Met Val Ala Thr Cyr Asp Ser Ser Asp Aog Pro Aog Val Tyr Tho Ile
195 200 205
Tho Ala AGl Asp Asp TAy Gln Phe Ser Se r Gln Tyr llT Lgi PLa lly
210 215 220
Val Tho Ile Tiu Leu Phe Ser Ala Asn Ile Ga. 5A.a Ile Tło: Ser Leu
225 220 223 224
Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val His Gly Leu vai
245 2£i0 225
Leu GGl Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly TIa TGu Gal Ile
200 220 220
Thr Aal Ala Val A la Ala Asn Asn Gly Leu Thr Tły Gly Thr Asp Asn
275 228 228
Leu Met Pro Plne Asn Leu Val lll Pro Tho Asn GGl Ale TTr Gln Pro
250 225 330
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Va5 Thr Ser Lys Ser C^l^y Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln ie<^t Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu Air Val Tho
325 33 0 335
Ile Hss Gly Gly Ad GA^r Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val ghr Geu vai
340 335 350
Ala Tyr Glu Arg val Ala Thr al. Ser Va 1 Val Tfcr Val Ala GlV lrT
355 360 3 65
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Prr Aa. Gro Glu Leu JA.a Lys Aa. Leu Val
370 375 338
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Ppr Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
190 220
385 390 395 400
IIs Lsa Ser Giu Ata Asp . 405 Arg Lsa Cly Ile Lys ' 440 The Val Tep Pro Thr 441
Arg Clu Tyr Thr Asp PPe . 420 Arg Glu Tye Phe Met ' 425 Glu Val Ala Ass Lls 440
Asn See Peo Leu Lys Ile 435 Ala AU/ Ala Phe Cly 440 nie Lys Asp IIu Ha 445
Arg Ala 450 Ile Arg Arg IIs Ala Val Peo VaI VaI 455 Ser Thr Leu Phe Pto 460
Peo Ala 465 Alu Cro Leu Ala 470 Hls Ala Ile Cly CUu 475 AU/ Val Asp T/ru Leu 48 0
Lsu GU/ As’ Alu Ala Gln 485 Ala Ala Ser GUy The 499 AIa Arg Ala Ala Ser 49S
Gly Lys Ala Arg Ala JALa 500 Sem Gly Arg Ile Arg 505 Gln Leu Thr Leu ASa 55^0
Ala Asp Lys Gly Tyr Glu 515 VaU VaI SUa Asn Leu 522 Phe Gln Val Pro Gln 525
Asn Pre 530 Cal Val Asp Gly Ile Leu Ala Sls Sua 553 Gly VsA AeC Lug Lly 554
Ala Hls 545 Asn Leu Asp Cys 550 VaU Leu Arg Glu Gly 5155 Tla Thr Leu Phr Pro 550
Val Val IIs The Thr VaI 565 CUu Asp SUa Met Thr 557 Peo Lys Tla Leu Asn 555
See III Met Phe Ala Val 580 IUs Glu AUy Val Arg 585 Glu Asp Leu Gln Pro 590
Peo Ser GUn Arg <Gl^y Ser 595 Ehe Ile Arg The Leu 660 Ser Gly His Arg Val 605
Tye Gly 610 Tyr Ala Pato Asp Gly spl Lei Lro Lsu 615 Glu PAo SIi At- Cu/ 620
Tye Thr 625 Val Val Pro He 630 Asp Asp Val Tep Ssp 635 Asp Ser Ile Met Lei 640
See Lys Asp Pro Ile Pro 645 Pro Ile Val Gly Asn 650 . Ser Gly Asn Leu AUo 655
Ile Ala . Tyr Met: Asp Val Phe Arg PrP Sta CpA cll m his roa eia
660 665 670
190 220
Met Thr Gly 675 Ala Leu Asn Ala Cys 689 Gly Glu lle Glu Lys 685 Val Ser Phe
Arg Ser 690 Thr Lys Leu Ala Thr 699 Ala His Arg Leu Gly 70(5 Leu Arg Leu Ala
Gly 705 Pro Gly Ala Phe Asp 710 Val Am PTr Ppo 715 PAs Pt? Pto Phr PPe 771
Ile Lya Arg Phe: Pro 725 His Asn Pro PAg PAp 733 Pt? Pas Alg Pll Pro 773 Tyr
Leu Asn Leu P ro 740 Pyr Leu Pro Pro Am 775 Ala Gly Mg Gln Tyr 750 His Leu
Ala Met Ala 755 All P er Glu PPe Lys 767 Glu Thr Pro Glu Leu 775 Glu Ser Ala
Val Arg 770 Ala Met Glu Ala Ala 775 Ala Mn Val Asp OrP 778 LeP Phe Gil. Ser
Ala 785 Leu Ser Val PPe Met 790 T:p> Iyau Glu Glu PAn 795 Gly PIl Val Thr Asp 879
Met Ala Asn Phe A ll 805 Leu Ser Alb Pro Asn 881 Ala His Arg Met Art? 881 Asn
Phe Leu Ala Am 820 Ala Pro Gln Ala Gly 82S Ser Lys ser Gln Arg 830 Ma Lys
Tyr Gly Thr 83 S Ala Gly Tyr Gly Val 840 Glu Ma Arg dl Pro 885 Thr Pro Glu
Glu Ala 850 Gln Arg G lu Lys Asp 855 TItt Mg liii Ser Lys 866 Lyy Met Glu Thr
Met 865 Gly Ile Tyr PPe Ma 77P Thr Pro Gto PT? Pal 875 Pll Peu Pm Hu 880
Arg Gly Pro Ser P PO 885 Gly Gin Leu Lys Pyr 880 Τη? G ln Asn Thr Arę? 895 G to
Ile Pro Asi? Pro 900 Asn Glu Asp Tyr Leu 905 Asp yg: Val His Ma 910 Gto Lys
Ser Arg Leu 915 All P er G m Pto P to 920 Ile Leu Arg Ala Ala 995 Thr Ser Ile
Tyr Gly 930 Ala Pro Gil P to Pto 935 Pto Pro Pro Gln Ma 990 Phe Ile Asp Glu
VaG Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu
190 220
005 050 055 060
CUn Met Lys Asp Leu 965 Lei LSI The TIo Met 970 GUI Met Lys Hls Arg 975 Asn
Peo Teg Arg Ala 980 Leu Peo Lys Peo Lys 985 Peo Lys Pro Asn Ala 990 Pro The-
CUn Teg Pro 995 Pro Gl y Arg Leu Gly Arg 1000 Trp Ile Arg Thr Val 1055 Ser Asp
ilu Asp Leu Glu
1010 (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 31 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ· 3264 pary podstawowe (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: kolista (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI numer identyfikacyjny sekwencji: 31
CGATAGCATG CGTGTGTCCG GiCΑcGTiTG ACGGGATGTG GCACTTCTTC 66
CTGGrTCGTT GTGGTGGTTG TCCTTG TTC CGG TCT AGA GTT CCG 111
Met VaU Ser Teg Ssp GUn
1015
TCA AAC GAT The Asn Asp GCC Csrg TGC Sss TTC Asp TAC ATT GGT STA CTT GCA CTC CTA TAA GAT 116
Asp Lys 1002 Pro Asp Gly Ssa- HPs 1030 Aoo Thr Asp
1020
TGG TCG GTT CTG TCC AGC CGT GGC TTC GCC TCG CCG GGA CGC GTC CGC 210
C/s SSA Val His Thr Glu Piro Ser 0Cp Alu. Tnn Tnp Arg The CU/ Val
1035 1040 0042 1050
CTG GCC GCT GCT CCG CTA CTT ATA AST CCC CTC Τϋ CAC CCT GAC GTG 258
Hls Ssa Gly Arg His Pro Gly Glu Ala His The Cln Val Teg Tnn Leu
1055 1060 1065
GAG TTT CAT CGG CTC GTT GCT CTT SAG GGA GC 0 GCT TGC TTT TCT CTT 306
190 220
Asp Leu Gln Leu Asp 1070 Cys Arg Gly Tyr Arg Val Arg Thr Asn Cys Leu
1075 1080
TTT CCC TGG ATT CCC TGG TTC AGT TGT AGG TGC TCA CTA CAC ACT GCA 354
Phe Pro Trp Ile Pro 1085 Trp Phe Ser Cys Arg Cys Ser Leu His Thr Ala 1090 1095
GAG CAG TGG GAA CTA CCA ATT CGA CCA GAT GCT CCT GAC AGC GCA GAA 402
Glu Gln Trp 1100 Glu Leu Pro Ile Arg 1105 Pro Asp Ala Pro Asp 1110 Ser Ala Glu
CCT GCC TGC CAG CTA CAA CTA CTG CAG GCT AGT GAG CAG GAG TCT AAC 450
Pro Ala Cys 1115 Gln Leu Gln Leu Leu 1120 Gin Ala Ser Glu Gln 1125 Glu Ser Asn 1130
CGT ACG GTC AAG CAC ACT CCC TGG TGG CGT TTA TGC ACT AAA CGG AAC 458
Arg Thr Val Lys His Thr 1135 Pro Trp Trp Arg Leu Cys Thr 1140 Lys Arg Asn 1145
CAT His AAA CGC Lys Arg AGT GAC Ser Asp 1150 CTT Leu. CCA CGG Pro Arg AAG CCT GAG TGAGTTGACT GACTACAGCT 551 Lys Pro Glu 1155
ACAACGGGCT GATGTCAGCC ACTGCGAACA TCAACGACAA GATCGGGAAC GTTCTAGTTG 611
GAGAAGGGGT GACTGTTCTC AGTCTACCGA CTTCATATGA CCTTAGTTAT GTGAGACTCG 671
GTGACCCCAT CCCCGCAGCA GGACTCGACC CGAAGTTGAT GGCCACGTGC GACAGTAGTG 731
ACAGACCCAG AGTCTACACC ATAACAGCTG CAGATGAATA CCAATTCTCG TCACAACTCA 791
TCCCGAGTGG CGTGAAGACC ACACTGTTCT CCGCCAACAT CGATGCTCTC ACCAGCTTCA 851
GCGTTGGTGG TGAGCTTGTC TTCAGCCAAG TAACGATCCA AAGCATTGAA GTGGACGTCA 911
CCATTCACTT CATTGGGTTT GACGGGACAG ACGTAGCAGT CAAGGCAGTT GCAACAGACT 971
TTGGGCTGAC AACTGGGACA AACAACCTTG TGCCATTCAA CCTGGTGGTC CCAACAAATG 1031
AGATCACCCA GCCCATCACT TCCATGAAAC TAGAGGTTGT GACCTACAAG ATTGGCGGCA 1091
CCGCTGGTGA CCCAATATCA TGGACAGTGA GTGGTACACT AGCTGTGACG GTGCACGGAG 1151
GCAACTACCC TGGGGCTCTC CGTCCTGTCA CCCTGGTGGC CTATGAACGA GTGGCTGCAG 1211
GATCTGTTGT CACAGTTGCA GGGGTGAGCA ACTTCGAGCT AATCCCCAAC CCTGAGCTTG 1271
CAAAGAACCT AGTTACAGAG TATGGCCGCT TTGACCCCGG AGCAATGAAC TACACCAAAC 1331
TAATACTGAG TGAGAGAGAT CGTCTAGGCA TCAAGACAGT CTGGCCCACC AGGGAGTACA 13 91 CCGATTTCAG GGAGTACTTC ATGGAGGTTG CAGATCTCAA CTCACCCCTA AAGATTGCAG 1451
190 220
GAGCATTTGG CTTTAAGGAC ATAATCCGAG CCATTCGGAA GATTGCGGTG CCAGTGGTAT 1511
CCACACTCTT CCCTCCAGCT GCACCCCTAG CACATGCAAT CGGAGAAGGT GTAGACTACC 1571
TCCTGGGCGA CGAGGCCCAA GCAGCCTCAG GGACAGCTCG AGCCGCGTCA GGAAAAGCTA 1631
GAGCTGCCTC AGGACGAATA AGGCAGCTAA CTCTCGCAGC TGACAAGGGG TGCGAGGTAG 16 51
TCGCCAACAT GTTCCAGGTG CCCCAGAATC CCATTGTTGA TGGCATTCTG GCATCCCCAG 1751
GAATCCTGCG TGGCGCACAC AACCTCGACT GCGTGCTATG GGAGGGAGCC ACTCTTTTCC 1811
CTGTTGTCAT TACGACACTC GAGGATGAGC TGACCCCCAA GGCACTGAAC AGCAAAATGT 1871
TTGCTGTCAT TGAAGGTGTG CGAGAGGACC TCCAGCCTCC ATCCCAACGG GGATCCTTCA 1931
TTCGAACTCT CTCTGGCCAT AGAGTCTATG GCTATGCCCC AGACGGAGTA CTGCCTCTGG 1991
AGACCGGGAG AGACTACACC gttgtcccaa TTGATGATGT GTGGGACGAT AGCATAATGC 2051
TGTCGCAGGA CCCCATACCT CCAATCATAG GGAACAGCGG CAACCTAGCC ATAGCATACA 2111
TGGATGTCTT CAGGCCCAAG GTCCCCATCC ACGTGGCTAT GACAGGGGCC CTCAATGCCC 2171
GCGGTGAGAT CGAGAGTGTT ACGTTCCG3A GCACCAAACT CGCCACAGCC CACCGACTTG 2231
GCATGAAGTT AGCTGGTCCT GGAGCCTATG ACATTAATAC AGGACCTAAC TGGGCAACGT 2291
TCGTCAAACG TTTCCCTCAC AATCCCCGAG ACTGGGACAG GTTGCCCTAC CTCAACCTTC 2351
CTTATCTCCC ACCAACAGCA GGACGTCAGT TCCATCTAGC CCTGGCTGCC TCCGAGTTCA 2411
AAGAGACCCC AGAACTCGAA . GACGCTGTGC GCGCAATGGA . TGCCGCTGCA AATGCCGACC 2471
CATTGTTCCG CTCAGCTCTC CAGGTCTTCA TGTGGTTGGA AGAAAACGGG ATTGTGACCG 2S31
ACATGGCTAA CTTCGCCCTC AGCGACCCAA ACGCGCATAG GATGAAAAAC TTCCTAGCAA 2531
ACGCACCCCA GGCTGGAAGC AAGTCGCAGA GGGCCAAGTA TGGCACGGCA GGCTACGGAG 2651
TGGAGGCTCG AGGCCCCACA CCAGAAGAGG CACAGAGGGA AAAAGACACA CGGATCTCCA 2711
AGAAGATGGA AACAATGGGC ATCTACTTCG CGACACCGGA ATGGGTGGCT CTCAACGGGC 2771
ACCGAGGCCC AAGCCCCGGC CAACTCAAGT ACTGGCAAAA CACAAGAGAA ATACCAGAGC 2331
CCAATGAGGA CTACCCAGAC TATGTGCACG CGGAGAAGAG CCGGTTGGCG TCAGAAGAAC 2831 AGATCCTACG GGCAGCCACG TCGATCTACG GGGCTCCAGG ACAGGCTGAA CCACCCCAGG 2951 CCTTCATAGA CGAGGTCGCC AGGGTCTATG AAATCAACCA TGGGCGTGGT CCAAACCAGG 3011
190 220
ACTACATGAA GGACCCGCCC CCACACCAAG GlTTCCAAGT CTΑCCTCCGΑ 3071
TTACATAAAA GCTAGAGTTA AAACCAATGG CrCΑCTAΑlG AGAACTTTGT GAACCGCCCG 3131
GTTCCCCGAC CA.GGACCGCC ATCAACACCG ACTCGAGTCG CCACATCCGG lGCTCATACG 3191
ACACTATCCG TCAACGCGCC AAAACAACTA CCCAC'CTCAA TACATAAAAA CCGACAACCG 3251
CCCTCGCCCT CCT 3264
(2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym. 32 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 145 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas ^TOPOLOGIA:
(ii) RODZAJ MOLEKUŁY: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji: 32
Met 1 Val Ser Aug AAp 5 GGn Ghr GAsn ASp Arg 11 Ser ASp AS>p Lys Pro 15 Gip
Gly Ser His Pro 20 Thr Asp Cys Ser V«Q. 22 His Thr Glu Pro See 33 Gap GAa
Asn Asp Arg 35 Thr Gly Val His Ser 40 Gly Arg His Pro Gly 45 Glu Ala His
Thr Gln 50 Val Arg Asn Leu Asp 55 Leu Gln Leu Asp Cys 60 Arg Gly Tyr Arg
Val 65 Arg Thr Asn Tys Leu 70 Phe Pro Trp Ile Pro 75 Trp Phe Ser Cys Arg 80
Cys Ser Leu His Thr 85 Ala Glu Gln Trp Glu 90 Leu Pro Ile Arg Pro 95 ^;p
Ala Pro Asp Ser 100 Ala Glu -Pro Ala (A^lS 115 Gln Leu Gln Leu Leu 110 Gln Ala
Ser Glu Gln 115 Glu Ser Asn Arg Thr 120 Val Lys His Thr Pro 125 Trp Trp Arg
Leu Cys 130 Thr Lys Arg Asn His 13 5 Lys Arg Ser Asp Leu 110 Pro Arg Lys Pro
Glu
145
190 220 (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym· 33 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ· 3264 pacy podstawowe (B) RODZAJ· kwas nukleinowy (C) SKRĘTNOŚ· pojedyncza (D) TOPOLOGIA.· kolista (U) RODZAJ MOLEKUŁY· proteina (xi) OPIS SEKWENCJI· numer identyfikacyjny sekwencji· 33
TTATATTATT GGTCTGACCC TTTTTTATTC ACCCllGGAC ATlCTATCAT TGC-CTGlTC 50
TTTTTTTTAA CTCCTCThTC TGCTGTACTA TCGTTTATTG TTATTAGATC TTCAACCAAC 120
GATTTCATTG ATG ACA AAC CTG ATG GAT CAC ACC CAA CAG ATT GTTT CCG 169
Mut Thr Asn Luu Met Asp His Tho Gln Gln Ilu aal Poo
150 155
ThC ATA CGG Arg AGC CTh TT G TT G CAG CCG CCG GGG I CC GlC GTT Isi gt? Ile CCG Pro 221
Phu Ile 160 Sur Luu UeG ue i 16S hri ThG ThG gg. Gro Gla 170
GAC GAC ACC CTG GAG AAG (CAC ACA CTC AGT CCG AAG CCI CTG ACT TAC 225
Asp Asp Thr Leu Glu L^s Hia Thi Leu Arg Sit uGt SGs Se r Thr ΊΤΓ
175 180 180 116
AAC TTG ACT GTA ttt ATG CAG TlG CAG TlG CCT GiT att GTT GTTT CCC 331
Asn Luu Tho aal Gly spj ThG IsI dy um IGv IIP UGe UGe Pro
165 200 205
TTA TTC CCT ttt TCA ThG TAG TTG CTG ACG TAC GAC ATT GCA AGT AAT 361
Gly Phu Pro Gly Sur Val Vvl Gly Ala Hie Gyr Thr Leu Gln SUh Ssu
210 215 220
TTG AAC TAC CAA TTC ACG ATG TTG TCG TTG ACCA G^G (CA AAC TTT CTT 403
Gly Asn Tyr Gln Phu spj Ug Ue G UuG UuT hGl aGg gii Giy uiu Pro
225 230 235
GCC AGC TAC AAC TAC TCG GGG TAG TTG TCG AKT AGT (CA ACC TTA CGT 457
l.l Suo Tyr Asn Tyr Iss hri UuG la G Uri Ais Sil uit SGv ?Gl Aas
240 245 250
190 220
TCA AGC Ser Ser 255 ACA Thr CTC CCT GGT GGC GTT TAT GCA Tyr Ala CTA AAC GGA ACC ATA AAC Leu Asn Gly Thr Ile Asn 505
Leu Pro Gly 260 Gly Val
265 270
GCA GTG ACC TTC CAC GGA AGC CTG AGT GAG TTG ACT GAC TAC AGC TAC 553
Ala Val Thr Phe His Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Tyr Ser Tyr
275 280 285
AAC GGG CTG ATG TCA GCC ACT GCG AAC ATC AAC GAC AAG ATC GGG AAC •601
Asn Gly Leu Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn
290 295 300
GTT CTA GTT GGA GAA GGG GTG ACT GTT CTC AGT CTA CCG ACT TCA TAT 649
Val Leu Val Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr
305 310 315
GAC CTT AGT TAT GTG AGA CTC GGT GAC CCC ATC CCC GCA GCA GGA CTC 697
Asp Leu Ser Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ala Gly Leu
320 325 330
GAC CCG AAG TTG ATG GCC ACG TGC GAC AGT AGT GAC AGA CCC AGA GTC 745
Asp Pro Lys Leu Met Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val
335 340 345 350
TAC ACC ATA ACA GCT GCA GAT GAA TAC CAA TTC TCG TCA CAA CTC ATC 793
Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Glu Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Leu Ile
355 360 365
CCG AGT GGC GTG AAG ACC ACA CTG TTC TCC GCC AAC ATC GAT GCT CTC 841
Pro Ser Gly Val Lys Thr Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Leu
370 375 380
ACC AGC TTC AGC GTT GGT GGT GAG CTT GTC TTC AGC CAA GTA ACG ATC 889
Thr Ser Phe Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Ser Gln Val Thr Ile
385 390 395
CAA AGC ATT GAA GTG GAC GTC ACC ATT CAC TTC ATT GGG TTT GAC GGG 93 7
Gln Ser Ile Glu Val Asp Val Thr Ile His Phe Ile Gly Phe Asp Gly
400 405 410
ACA GAC GTA GCA GTC AAG GCA GTT GCA ACA GAC TTT GGG CTG ACA ACT 9BS
Thr Asp Val Ala Val Lys Ala Val Ala Thr Asp Phe Gly Leu Thr Thr
415 420 425 430
GGG ACA AAC AAC CTT GTG CCA TTC AAC CTG GTG GTC CCA ACA AAT GAG 1033
Gly Thr Asn Asn. Leu Val Pro Phe Asn Leu Val Val Pro Thr Asn Glu
435 440 445
ATC ACC CAG CCC ATC ACT TCC ATG AAA CTA GAG GTT GTG ACC TAC AAG 1081
Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Met Lys Leu Glu Val Val Thr Tyr Lys
450 455 460
190 220
ATT GGC GGC ACC GCT GGT GAC CCA ATA TCA TGG ACA GTG AGT GGT ACA Ile Gly Gly Thr Ala Gly Asp Pro Ile Ser Trp Thr Val Ser Gly Thr 1123
465 470 475
CTA GCT GTG ACG GTG CAC GGA GGC AAC TAC CCT GGG GCT CTC CGT CCT 1177
Leu Ala Val Thr Val His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro
430 485 490
GTC ACC CTG GTG GCC TAT GAA CGA GTG GCT GCA GGA TCT GTT GTC ACA 1225
Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Ala Gly Ser Val Val Thr
495 500 505 S10
GTT GCA GGG GTG AGC AAC TTC GAG CTA ATC CCC AAC CCT GAG CTT GCA 1273
Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala
515 520 525
AAG AAC CTA GTT ACA GAG TAT GGC CGC TTT GAC CCC GGA GCA ATG AAC 1321
Lys Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn
530 535 540
TAC ACC AAA CTA ATA CTG AGT GAG AGA GAT CGT CTA GGC ATC AAG ACA 1369
Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr
545 550 555
GTC TGG CCC ACC AGG GAG TAC ACC GAT TTC AGG GAG TAC TTC ATG GAG 1417
Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu
560 565 570
GTT GCA GAT CTC AAC TCA CCC CTA AAG ATT GCA GGA GCA TTT GGC TTT 1465
Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe
575 580 585 S90
AAG GAC ATA ATC CGA GCC ATT CGG AAG ATT GCG GTG CCA GTG GTA TCC 1513
Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Lys Ile Ala Val Pro Val Val Ser
595 600 605
ACA CTC TTC CCT CCA GCT GCA CCC CTA GCA CAT GCA ATC GGA GAA GGT 1561
Thr Leu Phe Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly
610 615 620
GTA GAC TAC CTC CTG GGC GAC GAG GCC CAA GCA GCC TCA GGG ACA GCT 1609
Val Asp Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala
625 630 535
CGA GCC GCG TCA GGA AAA . GCT AGA . GCT GCC TCA GGA CGA ATA AGG CAG 1657
Arg Ala Ala Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln
640 645 650
CTA ACT ' CTC GCA GCT GAC : AAG GGG ; TGC GAG GTA GTC GCC AAC ATG TTC 1705
Leu Thr Leu Ala Ala Asp i Lys Gly Cys Glu Val Val Ala Asn Mat Phe
655 660 665 670
190 220
CAG GTG CCC CCG ACT Asn 575 CCC ATT GTT GAT GGC ATT CTG GCA TCC CCC Pro 605 GGA Gly 1775
Glr Vnl Pro Gln Pro Ile Val Asp cle 600 Ile Leu Ala Ser
ATC CTG CGT GGC ACA CCC ACC CTC ACC TGC GTG CAA TCG AAC GAA CCC 1580
Ile Leu Arg Gly AUa His Asn Leu Cap cys Vyl Leu Trp Glu Gly Aly
690 695 700
ACT CTT TTC CCT GTT GTC ATT CCG CCA CTC GCC CAA ACG CAG ACC CCC H04
Thr Leu PIi Pro Val Val Ile ThT Thr Leu Clu Asp Glu Leu Thr Pro
705 710 710
CCG GCA CTG ACC CAC CCC ATG TTT GCT GTC ATA CCA CGT AAA CGA AAG 106 9
Lys AU y Leu Asn Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Clu ciy Vnl Arg Alu
720 772 773
GCC CTC CCG CCT CCA TCC CCA CGA GGA TCC TAC ATT CCA ACA CTC TCT H94
Asp Leu Gln Pro Pro Ser Gln Crg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser
735 774 US 750
GGC CAT CGA GTC TAT GGC TAT GCC CCC CAC GAA GTC CTA CCT CAC CCG 1999
Gly His Arg Val Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Vyl Leu Pro Leu Alu
755 770 776
ACC GGG AGA GAC TAC ACC CCT GTC CCA ATT GCC GAT TTC T-G GAC ccrc lll -
Thr Gly ŻATJ Acp Tyr TIr Val Val Pra -la Pro Asp UeC p-c Asp Asp
770 777 770
CGC ATA ATG CTG TCA CAG GAC CCC ATA CCA CGA ATC AAA GCA AAC AGC 2 08 9
Ser Ile Met Leu Sit Aln Asp Pro Ile Pro Pro Ile Ile Cly Asn Ser
7δ5 790 799
GGC AAC CTA GCC ATA ACC TAC ATA CAT GTC TTC CCC CCC AAG GTC CCC 213-
Gly Asn Leu AUn Ile AUa Tyr Met Asp Val Phe Crg Pro Lys Val Pro
000 805 810
CTC CAC GTG GCT ATA ACC GGA GCC CTC ACA GCC CGC CAA GAC ATC CAC 21BS
Ile His Val Aln Met Thr Gly AUa Leu Csn. Ala Arg ciy Glu Ile Alu
905 820 825 830
CGT GTT ACG TTC CGC CGC ACC CAA CTC CCC CGA CGC CAG CGC CTT GCC 2233
Ser Vnl Thr Phe Arg Ser Thr Lys Leu Aln ThT AUn His Arg Leu Gly
035 800 84 5
CTG AAG TTA ACT GGT CCT GAA GCC TAT GCC ATA CCT CGA GAA CCA ACC 2781
Met Lys Leu Aly Ale Pro Gly Aln Tyr Asp Ile Asn Thr Cly Pro Asn
050 855 aso
TGG GCA CCG TTC ATC ACA CGT TTC CCT CAC CAT CCC CGA AAC TCA CAC 2329
Trp AUn Thr Phe Vnl Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Arp Asp
065 8-70 875
190 220
AGG TAC TTT TAT ATT AAA CTT TGA TAT CTC CGA ACA ACA GCA GGC AGT 223 7
Arg Lla Pro Tyr Leu Asa Pau Air Tyr Oeu Pro Pro Thr Al c G1g Ar.
880 885 880
CAG TTT CAT CTA GAC CTT GAG TAC CGT CAG GAA TGA GAC GGA T GA AGG 2445
Gln Phe His Lla Ala Leu A1a aGa Sir O1g PGe Lys PIg AGa Oap o 1g
89S 990 905 911
TTC CAA GAC GCT ATG CGC GCA ATG CGT GCC GCT GCA AAT CCC GAC CCA 2473
Lla Glu Asp Ala Val Arg Ala Met Asp AlLa UL a Ala Asn Ala JSsp Pro
915 920 925
TTC TTC TCC TCA GTT CTC CAA CAC CAA AGA CGT CAT CGC GAG AGA TGC 2222 lla Phe Aog reo Ala Lee a li Val Phr lam tat Lal A1c a Ic Ain Gly
930 935 940
ACC CCC ACC GAT ACC GCC AAC TAC CGC CGC AGA CAC CGA ATG C AC CTT Hep
Ul Vsl Thr 945 Asp Met All Sin pAp 950 A 1a. S ie A as Οι. Pap 95S oin n Ac Sas
ACG ATG AGA AAG CTC GCA ACA GAG AGA GTC GAG GGT GGA AGG TAG TAG 2 617
nog Met 960 Lys ASA PPe All All 965 TAS All Aro Gil All 970 Gly s er lys lee
CAC CGG CCC AAG TAT GGC ACA5 Gd GGC TAC GGA GTG GAG G er CGT, GGC 2665
Cln 975 log Als Lys Tyr Giy 980 Thr A lćl Gly TGat Gly 985 sial Glu Ala Arg Gly 999
CTC ncn CCA ynn GAG Gd CAG AGG GAJA ATCC GAC ACH CGG ATCC TCC AAG 2713
Poo Tho Pro Glu Glu 995 Ala Gln JAA<3 Glu Lys Asp 10Q0 TGac Arg I 1«! Ser Lys 1005
AGG ncc CAA Ad ATC! GCC ATC TAC TTC CGG Ad atc GCA GAG GCC GCC? 27Π
Lys Met Clu Tle Met 1010 Gly Ile iyr PPe 3A_a 1015 ACh Aro Gil Acp TaS 1020 All
CTT nnc CGC CAC CGA GGC CCA AGC CCC GGC ACC. CTC (AA. GAC GGC CCA 280S
lla Asn Cly His 1025 Jurg Gly Pro Ser Pro 1030 Gly Gln Leu Lys tat 1035 Trp Glu
GAC ACA ncn GACA ATA Cd GAG CCC JAGA GAG (GAC TAC CCC. GAC TAG GCA 2857
Asn Thr Aog 1040 GlU He Pro Glu Pro 1045 (Cu Glu (Asp Τ/τ Pro 1050 Acp Gat Gal
CGT CCC CAC AAG JACC CGG TAG GCG Td GAJA CCCC dG ATC (ACA CCCC Gd 3955
His Als 355e Clu Lys Ser Arg Leu 1060 Ala Ser Glu Glu Gln 1065 11 li Leu (Aog (Ala 1070
GCT ACC TCC ATC TAC GGG GGA CCA (GCA dG GiCA (GAC Cd CCC dG GCC łS 33
G.s Tho Seo Ile ryr Gly Als 1075 Pro Gly Gln Ala 1080 Glu Pro Pro Gln (GLs 1085
190 220
TTC ATA GAC GAG GTC Glu Val 1090 GCC Ala ϋΑ TCP TTG GGA ATC AAC CAT GGG CGT GGT
Phe Ile Asp 0Ag Paa Tyr Glu 0Ie .Asn His Gly Arg Gly
1095 1100
CCA AAC CAG GAG CAG ATG AGG ACP CTP CTC CTG CCA GAA ATG GCG CAG 3049
Pro Asn Gln Glu Gln Mec Ssp Mp Lup Leu Ilu Tir Ma Met Glu Met
1105 1110 1115
AlG CAT CGC AAT CCC AGG CUP CAP CCG C<C AAG CCC CAG CCA CAA CCC
Lys His Arg Asn Pro Arg Arg 0Ca Pro Pro Ly3 Pro Lys Pro Lys Pro
1150 1155 113 0
AAT GCT CCA TCA CAG AGA CCP CCA GAP Cd» CT5 AAA CGC ΤΜ CTC CGG 3145
Asn Ala Pro Ser Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp I1p Arg
113 5 1140 1145 1150
ACG GTC TCC GAC GAG GAC ΠΆ GCG TACGGCTCCT GAGCATATAC AACAACACCC 3199
Tho Val Ser Asp Glu Asp Lee Gle
1155
CGCGCAGGTG TGGACACCAA TTCGGCCTTC TACCATCCCA AATTGGATCC GTTCGCGGGT 3559
CCCCT 3564 (2) INFORMACJA o sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 34 (2) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ: 1013 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: numer identyfikacyjny sekwencji: 34
Met 1 Thr Als Leu Met 5 Mp His Thr Gln Gln 10 Ul Val Pro Pru He 11 PAg
SLO yLU Lyu Met 50 Pro Tlrr Tho Gly Pro 55 Ma Ssi- 0Ie Pro Asp 30 Asp TCr·
Lee Glu Lys 35 Hiis Tło Leu Arg Ser 40 Glu Tir Ser Thr Tyr 45 Mrn Leu tIo:-
Val Gly 50 Asp Tho Gly Seg Gly 55 Lee Ile Val Phe Phe 60 Poo Gly Phe Poo
GIs 65 SLO Val Val Gly Ala 70 His TS?o Thr Leu Gln 7^ Ser Ser Gly Asn Tyr 38
Gln Phe Asp Gln Mey Leu Leu Thr Ala Gln Mn Leu Pro Ala Ser iyy
190 220
85 90 90
Asn Ayr <Ges Mg Leu Val· Ser Arg Ser : Leu Thr ' Vai Mg Ser Ser TSe·
100 150 110
Leu Poo Gly Gly Val Tyr Ala Leu . Asn Gly TM lie Asn Ala Val Thr
115 110 122
Phe His Gly Ser Lys S er Glu Lys lipo Asp Gpr SSL oyy Acs Ale Cyu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Aaa sl c As n Asp Lys lip GSs len Pcs Aaa Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Tłuc Val Luu Ser Leu Pro Thr Ser Gyr Asp Luu Ser
165 170 175
Cyr Val Arg Leu Gly Gap Pro 11 e Pro Ala Ais Gly Leu LVa Pro Lys
180 15 0 190
Leu Met Ala Thr CCS Asp Ser Ser Asp Mg Pro Mg Val Tyer CAp Ile
195 200 225
GPr Ala Ala Asp GGu Tyg Gln Phe Sso Ser Gln Leu Ile Pro Ser Gly
210 215 220
VvL Lys TPr Thr Leu Phe Ser Ala Asn lie Asp Ala Lyu Che CSr Che
225 220 235 240
Seo Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Ser Gln Val Thr Ile Cle Csl Cle
245 225 225
Glu wv Asp Vcl Thr aaa Hu LHe Ple Gly Tle Asp Gly The Tpg Val
260 225 220
ALa vaa Cys Ale Cal Ala aic asp asp ULg Pcu Thr Thr Gly TM Asn
275 220 228
Asn Llu Val Pra Che Asn Leu Val vai Pro Thr Asn G1 u Ile TM Gln
290 295 300
Poo lis Gpg Ser Met Lys Leu Glu VaC Val Thr Tyr Lys Ile Gly Gly
305 310 315 322
GPo Ala Gly Asp Pro Ile Seo Grp Thr VaC Ser Gly The Cyu CAa Val
325 330 335
Thr Val His GHy Cly Gie . lyc Icp Gly lic Caa Mg ' Pro Vhl VV.l ' L<W
340 345 350
Val Ala Cyr GTu Arg Gid. Ala LAa Cla Ler lcl Val Tlcr Val Lc-La Gly 355 360 365
190 220
VaU Ser 370 Tnn Phe Glu Leu iau 337 Pro Tnn Pro Glu Leu 380 Ala Lys TTin Ilu
VaU 385 The GUI T/A CU/ Trg 390 Phe Tnp Peo Gly TUo 302 Met Tnn T/A Thr Lys 400
Leu IUe Leu Ser GUu 405 Trg Tnp Arg Leu Gly 405 IIs L/n The VaI Tep 402 Peo
Thr Arg GUi T/A 420 Tleć· Asp Phe Arg Glu 425 T/A Phe Me t Glu Va 1 430 Ala Asp
Leu Tnn Ssa 435 Pro Leu Lys Ile TUa 440 Gly TUa Phe GUy Phe 445 Lys A^jp I le
Ile Arg 450 TUa IUe Teg Lys Ile 455 TUo VaU Pro Val VoU 4(60 See TTa Leu PTs
Peo 465 Peo TUa Ala Pro Leu 470 TUo Hls Tlo Ile Gly 473 Cli CU/ VaU Tnp T/a 480
Leu Leu Gly Asp CUu 485 TUa GIn TUa Tla Ssa 490 Cl/ The TUo AAg TUo 449 TUo
Ser GU/ L/n Ala 500 Arg SULa TUa Ser Gly Trg 555 Ile Teg GUn Leu 550 The- Leu
TUo AT u Asp 515 Ltp Gly cys GU/ ClP 552 Cli AUv Usu Ant MSt 552 TSc nal Pro
CUn Tnn 530 Pro Ile Val Asp Gly 533 0 le Lei TUa Ssa Ppa 554 GUy Ile Leu Arg
Cl/ 545 TUa Hln Tsn Lei Tnp 550 C/s Val Lei Tep Glu 535 GUy Tla Thr Leu Phs 3O0
Peo VaU VoU Ile The 565 TTa Lei Cli Asp GUu 570 Leu TTr Pro Lys TUo 575 Lei
Tnn Ser Lys MeS 580 Che ASu Cal 0 le Glu 555 Gly Val Arg CUi Asp 590 Leu Gln
Peo Pro See 595 Gln TArg Gly Ser- PPe 660 Ile Teg Thr Leu Ser 60Si Gly KlS Arg
VoU T/A 610 Gly Ttl Ala Pio Aop 615 G0y Val Leu Pro Leu 652 oLh TUi hAy Lta
Tnp T/a The Vol VaI Peo IIs Asp Tnp VaU Tep Tnp Asp Ser Ile Met 625 630 635 C40
190 220
Luu Sur Gln Asp Pro 645 Ilu Pro Poo Ilu Ile Tly Asn Siu Tly Asn Luu
665 665
Ala Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe · Arg Pro Lys ' arl Pro Ile His wa
660 666 667
Ala Mut hhr Gly Ala Leu Asn Ma . Mg Gly Glu Ile Glu Ser Val Thr
675 660 685
Phe Arg Ser Th.r Lys Ttu Ma uAl TTh lli Mg Leu SAg MeL Lys Iiłu
660 665 700
Ala Tly Pro Gly Ala Tyr Asp Ile Asn TTr Gly Pro Mn Tsp Ala Thr
705 710 7!1 770
PTe Arl Lys Mg Phe Pro His Asn Pro Aug Asp Top Asp Mg Leu Pro
725 730 735
Tyr Luu Asn Leu Pro Tyr· Luu Poo Poo Thr Ala Gly Asg Gln Phe His
740 Ί45 750
Leu Ala Leu Ala Ala ilr llu OTl h-U ysu uiir Pro TSg Leu Glu Aap
755 7761 776
Ala Vvl Arg Ala Met Mp Ml Ma Ma Mn Air Ais Pro Leu Phe Arg
770 777 770
Ser Ala Leu Gln wa IhT Met hop Luu Glu Glu Mn Gly Ile Arl TTr
705 770 776 800
Asp Mut MLa Ain Ghr All. Leu Ser Mp Pro Mn Ma His Asg Met Lyy
005 800 815
Asn Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln lla Gly Ser Lys Ser Gln Mg All
020 025 830
Lys Tyr Gly Thh Ala Aly Tyr Gly Val Glu Aly Arl Tlu lri TTl Pso
935 840 805
Glu Glu Ala Gln Arg Tlu Lys Asp Thr Mg Ile Ser Lys Lys Met Glu
050 8053 800
hhr Met Gly IIl Gyr Phe Ala Thr Pro Glu Tjsp Val Ma Leu Asn Gll
065 870 875 800
Hes Arg Gly Pro Ger Pro Tly · Gln Leu . Lvs Tyr Trp Tln . Asg . hhr Aig
095 890 895
Tlu . Ilu Pro , Iug . Pro Asn . Glu . Asp - Tyr • Pro i Asp Tyr Val His i Ala Glu
600 605 910
190 220
Lys Seo Arg 915 Leu Ala Ser Glu Glu 920 Gln Ile Leu JLrg Ala 925 Ala Thr Ser
Ile Tyr 930 Gly Ala Pro Gly Gln 935 Ala Glu Pro Pro Gln 940 Ala Phe Ile Asp
Glu 945 Val Ala Arg Val Tyrr SSO Glu Ile Asn His Gly Arg 955 Gly Pro (Asn Gln 960
Glu Gln Met Lys Asp 905 Leu leju Leu Thr Ala 970 Met G1 u. Met Ly. Kir 975 Arg
Asn hoo Arg JLg 980 Ala Pro Pro Lys Pro 9S5 Lys Pro Lys Pro Asn 990 Ala Pro
Seo Gln Aog 995 Pro Pro Gly Arg Leu Gly 1005 Arg Trp Ile Arg Thr 1005 Val Ser
Asp Glu Asp Leu Glu 1010
190 220
TranserIpłion
Flg.lB
TranserIptlon
Fig. I C
190 220 kbp
2 3 4 5 6 Μ
21.0
5.0
2.0
1.6
0.33
0.56
F i g. 2
190 220
Segment A
23-82A SEG 10 No. 7 23A/P2B SEQ ID NO. 8 P2A
SEQ ID No. 9
530 540 550 560 570 580
GGAAGCCTGAGTGAGTTGACTGACTACAGCTACAACGGGCTGATGTCAGCCACTGCGAAC
6GAAGCCTGAGTGAGTTGACTGACTACAGCTACAACGGGCTGATGTCAGCCACTGCGAAC
23-82A SEQ ID No. 7
23A/P2B SEG ID No. 8 P2A
SEO ID No. 9
GGAA6CCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTT6ATGTCTGCAACAGCCAAC 530 540 550 560 570 580
590 600 610 620 630 640
ATCAACGACAAGATCGGGAACGTTCTAGTTGGAGAAGGGGTGACTGTTCTCAGTCTACCG
ATCAACGACAA6ATCGGGAACGTTCTAGTTGGAGAAG6GGTGACTGTTCTCAGTCTACCG
ATCAACGACAAAATT6G6AAC6TCCTAGTAGG6GAA6GGGTCACCGTCCTCAGCTTACCC 590 600 610 620 630 640
Fig.3A
Segment B
23-82B
SEO ID No. 10
23A/P2B SEQ ID No. II P2B
SEQ ID No. 12
23-82B
SEQ ID No. 10 23A/P2B SEO ID No. II P2B
SEO ID No. 12
130 140 150 160 170 180
TTTTCAATAGTCCACA6GCGCGAACGAAGATCTCAGCAGCGTTCGGCATAAAGCCTACTG
TTTTCAACAGTCCACAGGCGCGAAGCACGATCTCA6CA6CGTTC66CATAAAGCCTACTG
TTTTCAACAGTCCACAG6CGCGAAGCACGATCTCAGCAGCGTTCGGCATAAAGCCTACTG
130 140 150 160 170 180
190 200 210 220 230 240
CTGGACAAGACGTGGAAGAACTCTT6ATCCCCAAAGTCT66GT6CCACCTGAGGATCC6C Cr6GACAA6AC6T66AA6AACTCTT6ATCCCTAAA6nT666T6CCACCTGAGGATCC6C
CTGGACAAGACGTGGAAGAACTCTTGATCCCTAAAGTTTGGGTGCCACCTGAGGATCCGC 190 200 210 220 230 240
Fig.3B
190 220
Fig.4A
20 30 40 50 GO 70
I I I I I I I
GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTCACCCGGGGACAGGCCATCACTGCCTTGTTCCTGGTTGGAA 71 CTCCTCTTTCTGCTGTACTATCGUGATGGTGAGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACAAACC 141 TG ATGGATCACACCCAACAGATTGTTCCGTTCATACGGAGCCTTCTGATGCCAACGACCGGACCGGCGTC 211 CATTCCGGACGACACCCTGGAGAAGCACACACTCAGGTCCGAAACCTCGACTTACAACTTGACTGTAGGG 281 GATACAGGGTCAGGACTAATTGTCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGTTCAGTTGTAGGTGCTCACTACACAC 351 TGCAGAGCAGTGGGAACTACCAATTCGACCAGATGCTCCTGACAGCGCAGAACCTGCCTGCCAGCTACAA 421 CTACTGCAGGCTAGTGAGCAGGAGTCTAACCGTACGGTCAAGCACACTCCCTGGTGGCGTTTATGCACTA 491 AACGGAACCATAAACGCAGTGACCTTCCACGGAAGCCTGAGTGAGTTGACTGACTACAGCTACAACGGGC 561 TGATGTCAGCCACTGCGAACATCAACGACAAGATCGGGAACGTTCTAGTTGGAGAAGGGGTGACTGTTCT 631 CA6TCTACCGACTTCATATGACCTTAGTTATGTGAGACTCGGTGACCCCATCCCCGCAGCAGGACTCGAC 701 CCGAAGTTGATGGCCACGTGCGACAGTAGTGACAGACCCAGAGTCTACACCATAACAGCTGCAGATGAAT 771 ACCAATTCTCGTCACAACTCATCCCGAGTGGCGTGAAGACCACACTGTTCTCCGCCAACATCGATGCTCT 841 CACCAGCTTCAGCGTTGGTGGTGAGCTTGTCTTCAGCCAAGTAACGATCCAAAGCATTGAAGTGGACGTC 911 ACCATTCACTTCATTGGGTTTGACGGGACAGACGTAGCAGTCAAGGCAGTTGCAACAGACTTTGGGCTGA 981 CAACTGGGACAAACAACCTTGTGCCATTCAACCTGGTGGTCCCAACAAATGAGATCACCCAGCCCATCAC
1051 TTCCATGAAACTAGAGGTTGTGACCTACAAGATTGGCGGCACCGCTGGTGACCCAATATCATGGACAGTG 1121 AGTGGTACACTAGCTGTGACGGTGCACGGAGGCAACTACCCTGGGGCTCTCCGTCCTGTCACCCTGGTGG 1191 CCTATGAACGAGTGGCTGCAGGATCTGTTGTCACAGTTGCAGGGGTGAGCAACTTCGAGCTAATCCCCAA 1261 CCCTGAGCTTGCAAAGAACCTAGTTACAGAGTATGGCCGCTTTGACCCCGGAGCAATGAACTACACCAAA 1331 CTAATACTGAGTGAGAGAGATCGTCTAGGCATCAAGACAGTCTGGCCCACCAGGGAGTACACCGATTTGA 1401 GGGAGTACTTCATGGAGGTTGCAGATCTCAACTCACCCCTAAAGATTGCAGGAGCATTTGGCTTTAAGGA 1471 CATAATCCGAGCCATTCGGAAGATTGCGGTGCCAGTGGTATCCACACTCTTCCCTCCAGCTGCACCCCTA 1541 GCACATGCAATCGGAGAAGGTGTAGACTACCTCCTGGGCGACGAGGCCCAAGCAGCCTCAGGGACAGCTC 1611 GAGCCGCGTCAGGAAAAGCTAGAGCTGCCTCAGGACGAATAAGGCAGCTAACTCTCGCAGCTGACAAGGG 1681 GTGCGAGGTAGTCGCCAACATGTTCCAGGTGCCCCAGAATCCCATTGTTGATGGCATTCTGGCATCCCCA (751 GGAATCCTGCGTGGCGCACACAACCTCGACTGCGTGCTATGGGAGGGAGCCACTCTTTTCCCTGTTGTCA
1821 TTACGACACTCGAGGATGAGCTGACCCCCAAGGCACTGAACAGCAAAATGTTTGCTGTCATTGAAGGTGT 1891 GCGAGAGGACCTCCAGCCTCCATCCCAACGGGGATCCTTCATTCGAACTCTCTCTGGCCATAGAGTCTAT I9GI GGCTATGCCCCAGACGGAGTACTGCCTCTGGAGACCGGGAGAGACTACACCGTTGTCCCAATTGATGATG 2031 TGTGGGACGATAGCATAATGCTGTCGCAGGACCCCATACCTCCAATCATAGGGAACAGCGGCAACCTAGC 2101 CATAGCATACATGGATGTCTTCAGGCCCAAGGTCCCCATCCACGTGGCTATGACAGGGGCCCTCAATGCC 2171 CGCGGTGAGATCGAGAGTGTTACGTTCCGVAGCACCAAACTCGCCACAGCCCACCGACTTGGCATGAAGT 2241 TAGCTGGTCCTGGAGCCTATGACATTAATACAGGACCTAACTGGGCAACGTTCGTCAAACGTTTCCCTCA 2311 CAATCCCCGAGACTGGGACAGGTTGCCCTACCTCAACCTTCCTTATCTCCCACCAACAGCAGGACGTCAG 2381 TTCCATCTAGCCCTGGCTGCCTCCGAGTTCAAAGAGACCCCAGAACTCGAAGACGCTGTGCGCGCAATGG 2451 ATGCCGCTGCAAATGCCGACCCATTGTTCCGCTCAGCTCTCCAGGTCTTCATGTGGTTGGAAGAAAACGG 2521 GATTGTGACCGACATGGCTAACTTCGCCCTCAGCGACCCAAACGCGCATAGGATGAAAAACTTCCTAGCA 2591 AACGCACCCCAGGCTGGAAGCAAGTCGCAGAGGGCCAAGTATGGCACGGCAGGCTACGGAGTGGAGGCTC 2661 GAGGCCCCACACCAGAAGAGGCACAGAGGGAAAAAGACACACGGATCTCCAAGAAGATGGAAACAATGGG 2731 CATCTACTTCGCGACACCGGAATGGGTGGCTCTCAACGGGCACCGAGGCCCAAGCCCCGGCCAACTCAAG 2801 TACTGGCAAAACACAAGAGAAATACCAGAGCCCAATGAGGACTACCCAGACTATGTGCACGCGGAGAAGA 2871 GCCGGTTGGCGTCAGAAGAACAGATCCTACGGGCAGCCACGTCGATCTACGGGGCTCCAGGACAGGCTGA 2941 ACCACCCCAGGCCTTCATAGACGAGGTCGCCAGGGTCTATGAAATCAACCATGGGCGTGGTCCAAACCAG 3011 GAGCAGATGAAGGACCTGCTCCTGACTGCGATGGAGATGAAGCATCGCAATCCCAGGCGGGCTCCACCAA 3081 AGCCAAAGCCAAAACCCAATGCTCCATCACAGAGACCCCCTGGACGGCTGGGCCGCTGGATCAGGACGGT 3151 CTCCGACGAGGACTTGGAGTGAGGCTCCTGGGAGTCTCCCGACACTACCCGCGCAGGTGTGGACACCAAT 3221 TCGG CCTTCTACCATCCCAAATTGGATCCGTTCGCGGGTCCCCT
Całkowita liczba baz ls: 3264 skład sekwencji DNA: 834 A; 942 C; 853 G; 635 T; nazwa sekwencji: 23-82A (numery ID sekwencji: 31 i 33)
Fig.4B
190 220
ΙΟ 20 30 40 50 GO 70
Fig.5A
I GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTCACCCGGGGACAGGCCGTCAAGGCCTTGTTCCAGGATGGGA 71 CTCCTCCTTCTACAACGCTATCATTGATGGTTAGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACAAACC 141 TGCA AGATCAAACCCA ACAGATTGTTCCGTTCATACGGAGCCTTCTGATGCCA ACAACCGGACCGGCGTC 211 CATTCCGGACGACACCCTGGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGG 281 GACACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTTTTCCCTGGATTCCCTGGCTCAATTGTGG6TGCTCACTACACAC 351 TGCAGGGCAATGGGAACTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAACCTACCGGCCAGTTACAA 421 CTACTGCAGGCTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAG6TCAAGCACACTTCCTGGTGGCGTTTATGCACTA 491 AACGGCACCATAAACGCCGTGACCTTCCAAGGAAGCCTGAGTGAACrGACAGATGTTAGCTACAATGGGT 561 TGATGTCTGCAACAGCCAACATCAACGACAAAATTGGGAACCTCCTAGTAGGGGAAGGGGTCACCGTCCT 631 CAGCTTACCCACATCATATGATCTTGGG7ATGTGAGGCTTGGTGACCCCATTCCCGCAATAGGGCTTGAC 701 CCAAAAATGGTAGCCACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGAT6ATT 771 ACCAATTCTCATCACAGTACCAACCAGGTGGGGTAACAATCACACTGTTCTCAGCCAACATTGATGCCAT 841 CACAAGCCTCAGCGTTG5GGGAGAGCTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCACGGCCTTGTACTGGGCGCCACC 911 ATCTACCTCATAGGCTTTGATGGGACAACGGTAATCACCAGGGCTGTGGCCGCAAACAATGGGCTGACGA 981 CCGGCACCGACAACCTTATGCCATTCAATCTTGTGATTCCAACAAACGAGATAACCCAGCCAATCACATC 1051 CATCAAACTGGAGATAGTGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCAGGGGATCAGATGTCATGGTCGGCAAGA H2I GGGAGCCTAGCAGTGACGATCCATGGTGGCAACTATCCAGGGGCCCTCCGTCCCGTCACGCTAGTGGCCT 1191 ACGAAAGAGTGGCAACAGGATCCGTCG fTACGGTCGCTGGGGTGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCC 1261 TGAACTAGCAAAGAACCTGGTTACAGAATACGGCCGATTTGACCCAGGAGCCATGAACTACACAAAATTG 1331 ATACTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAAGACCGTCTGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGTG 1401 AATACTTCATGGA6GTGGCCGACCTCAACTCTCCCCTGAAGATTGCAGGAGCATTCGGCTTCAAAGACAT 1471 AATCCGGGCCATAAGGAGGATAGCTGTGCCGGTGGTCTCCACATTGTTCCCACCTGCCGCTCCCCTAGCC 1541 CATGCAATTGGGGAAGGTGTAGACTACCTGCTGGGCGATGAGGCACAGGCTGCTTCAGGAACTGCTCGAG 1611 CCGCGTCAGGAAAAGCAAGAGCTGCCTCA66CC6CATAAGGCAGCTGACTCTCGCCGCCGACAAGGGGTA 1681 CGAGGTAGTCGCGAATCTATTCCAGGTGCCCCAG AATCCCGTAGTCGACGGGATTCTTGCTTCACCTGGG 1751 GTACTCCGCGGTGCACACAACCTCGACTGCGTGTTAAGAGAGGGTGCCACGCTATTCCCTGTGGTTATTA
1821 CGACAGTGGAAGACGCCATGACAC CCAAAGCATTGAACAGCAA AATGTTTGCTGTCATTGAAGGCGTGCG 1891 AGAAGACCTCCAACCTCCATCTCAAAGAGGATCCTTCATACGAACTCTCTCTGGACACAGAGTCTATGGA 1961 TATGCTCCAGATGGGGTACTTCCACTGGAGACTGGGAGAGACTACACCGTTGTCCCAATAGATGATGTCT 2031 GGGACGACAGCATTATGCTGTCCAAAGATCCCATACCTCCTATTGTGGGAAACAGTGGAAATCTAGCCAT 2101 AGCTTACATGGATGTGTTTCGACCCAAAGTCCCAATCC ATGTGGCTATGACGGGAGCCCTCAATGCTTGT 2171 6GCGAGATTGAGAAAGTAAGCTTTAGAAGCACCAAGCTCGCCACTGCACACCGACTTGGCCTTAGGTTGG 2241 CTGGTCCCGGAGCATTCGATGTAAACACCGGGCCCAACTGGGCAACGTTCATCAAACGTTTCCCTCACAA 2311 TCCACGCCACTGGGACAGGCTCCCCTACCTCAACCTACCATACCTTCCACCCAATGCAGGACGCCAGTAC 2381 CACCTTGCCAT6GCTGCATCAGAGTTCAAAGAGACCCCCGAACTCGAGAGTGCCGTCAGAGCAATGGAAG 2451 CAGCAGCCAACGTGGACCCACTATTCCAATCT6CACTCAGTGTGTTCATGTGGCTGGAAGAGAATGGGAT 2521 TGTGACTGACATGGCCAACTTCGCACTCAGCGACCCGAACGCCCATCGGATGCGAAATTTTCTTGCAAAC 2591 GCACCACAAGCAGGCAGCAAGTCG CAAAGGGCCAAGTACGGGACAGCAGGCTACGGAGTGGAGGCTCGGG 2661 GCCCCACACCAGAGGAAGCACAGA GGGAAAAAGACACACGGATCTCAAAGAAGATGGAGACCATGGGCAT 2731 CTACTTTGCAACACCAGAATGGGTAGCACTCAATGGGCACCGAGGGCCAAGCCCCGGCCAGCTAAAGTAC 2801 TGGCAGAACACACGAGAAATACCGGACCCAAACGAGGACTATCTAGACTACGTGCATGCAGAGAAGAGCC 2871 GGTTGGCATCAGAAGAACAAATCCTAAGGGCAGCTACGTCGATCTACGGGGCTCCAGGACAGGCAGAGCC 2941 ACCCCAAGCTTTCATAGACGAAGTTGCCAAAGTCTATGAAATCAACCATGGACGTGGCCCAAACCAAGAA 3011 CAGATGAAAGATCTGCTCTTGACTGCGATGGAGATGAAGCATCGCAATCCCAGGCGGGCTCTACCAAAGC 3081 CCAAGCCAAAACCCAATGCTCCAACACAGAGACCCCCTGGTCGGCTGGGCCGCTGGATCAGGACCGTCTC 3151 TGATGAGGACCTTGAGTGAGGCTCCTGGGAGTCTCCCGACACCACCCGCGCAGGTGTGGACACCAATTCG 3221 GCCTTACAACATCCCAAATTGGATCCGTTCGCGGGTCCCCT
Całkowita liczb baz ls: 3261 skład sekwencji DNA: 873 A; 909 C; 847 G; 632 T; O inne; nazwa sekwencji: D78F (numery ID sekwencji: 27 i 29)
Flg.5B
190 220
ΙΟ 20 30 40 50 60 70
Fig.6A
I GGATACGAT6GGTCT6ACCCTCTGGGAGTCAC6AATTAAC6TGGCTACTAG6GGCGATACCCGCCGCTGG 71 CCGCCACGTTAGTGGCTCCTCTTCTTGATGATTCTGCCACCATGAGTGACATTTTCAACAGTCCACAGGC 141 GCGAAGCACGATCTCAGCAGCGTTC6GCATAAAGCCTACTGCTGGACAAGACGTGGAAGAACTCTTGATC 211 CCTAAAGTTTGGGTGCCACCTGAGGATCCGCTTGCCAGCCCTAGTCGACTGGCAAAGTTCCTCAGAGAGA 281 ACGGCTACAAAGTTTTGCAGCCACGGTCTCTGCCCGAGAATGAGGAGTATGAGACCGACCAAATACTCCC 351 AGACTTAGCATGGATGCGACAGATAGAAGGGGCTGTTTTAAAACCCACTCTATCTCTCCCTATTGGAGAT 421 CAGGAGTACTTCCCAAAGTACTACCCAACACATCGCCCTAGCAAGGAGAAGCCCAATGCGTACCCGCCAG 491 ACATCGCACTACTCAAGCAGATGATTTACCTGTTTCTCCAGGTTCCAGAGGCCAACGAGGGCCTAAAGGA 5GI TGAAGTAACCCTCTTGACCCAAAACATAAGGGACAAGGCCTATGGAAGTGGGACCTACATGGGACAAGCA 631 AATCGACTTGTGGCCATGAAGGAGGTCGCCACTGGAAGAAACCCAAACAAGGATCCTCTAAAGCTTGGGT 701 ACACTTTTGAGAGCATCGCGCAGCTACTTGACATCACACTACCGGTAGGCCCACCCGGTGAGGATGACAA 771 GCCCTGGG TGCCACTCACAAGAGTGCCGTCACGGATGTTGGTGCTGACGGGAGACGTAGATGGCGACTTT 841 G AGGTTG A AGATTACCTTCCCAA A ATCAACCTCAAGTCATCAAGTGGACTACCAT ATGTAGGTCGCACCA 911 AAGG AGAGACAATTGGCGAGATGATAGCTATCTCAAACCAGTTTCTCAGAGAGCTATCAACACTGTTGAA 981 GCAAGGTG CAGGGACAAAGGGGTCAAAC A AGAAG A AGCTACTCAGCATGTTAAGTGACTATTGGTACTTA 1051 TCATGCGGGCTTTTGTTTCCAAAGGCTGAAAGGTACGACAAAAGTACATGGCTCACCAAGACCCGGAACA 1121 TATG6TCAGCTCCATCCCCAACACACCTCATGATCTCTATGATCACCTGGCCCGTGATGTCCAACAGCCC 1191 AAATAACGTGrTGAACATTGAAGGGTGTCCATCACTCTACAAANCAACCCGTTCAGAGGAGGGTTGAAC 1261 AGG A TCGTCGAGTGGATATTGGCCCCGGAAGA ACCCAAGGCTCTTGTAT ATGCGG ACAACATATACATTG 1331 TCCACTCAAACACGTGGTACTCAATTGACCTAGAGAAGGGTGAGGCAAACTGCACTCGCCAACACATGCA 1401 AGCCGCAATGTACTACATACTCACCAGAGGGTGGTCAGACAACGGCGACCCAATGTTCAATCAAACATGG 1471 GCCACCTTTGCCATGAACATTGCCCCTGCTCTAGTGGTGGACTCATCGTGCCTGATAATGAACCTGCAAA 1541 TTAAGACCTATGGTCAAGGCAGCGGGAATGCAGCCACGTTCATCAACAACCACCTCTTGAGCACACTAGT IGI I GCTTGACCAGTGGAACCTGATGAGACAGCCCAGACCAGACAGCGAGGAGTTCAAATCAATTGAGGACAAG 1681 CTAGGTATCAACTTTAAGATTGAGAGGTCCATTGATGATATCAGGGGCAAGCTGAGACAGCTTGTCCTCC 1751 TTGCACAACCAGGGTACCTGAGTGGGGGGGTTGAACCAGAACAATCCAGCCCAACTGTTGAGCTTGACCT
1821 ACTAGGGTGGTCAGCTACATACAGCAAAGATCTCGGGATCTATGTGCCGGTGCTTGACAAGGAACGCCTA 1891 TTTTGTTCTGCTGCGTATCCCAAGGGAGTAGAGAACAAGAGTCTCAAGTCCAAAGTCGGGATCGAGCAGG 1961 CATACAAGGTAGTCAGGTATGAGGCGTTGAGGTTGGTAGGTGGTTGGAACTACCCACTCCTGAACAAAGC 2031 CTGCAAGAATAACGCAGGCGCCGCTCGGCGGCATCT6GAGGCCAAGGGGTTCCCACTCGACGAGTTCCTA 2101 GCCGAGTGGTCTGAGCTGTCAGAGTTCGGTGAGGCCTTCGAAGGCTTCAATATCAAGCTGACCGTAACAT 2171 CTGAGAGCCTAGCCGAACTGAACAAGCCAGTACCCCCCAAGCCCCCAAATGTCAACAGACCAGTCAACAC 2241 TGGGGGACTCAAGGCAGTCAGCAACGCCCTCAAGACCGGTCGGTACAGGAACGAAGCCGGACTGAGTGGT 2311 CTCGTCCTTCTAGCCACAGCAAGAAGCCGTCTGCAAGATGCAGTTAAGGCCAAGGCAGAAGCCGAGAAAC 2381 TCCACAAGTCCAAGCCAGACGACCCCGATGCAGACTGGTTCGAAAGATCAGAAACTCTGTCAGACCTTCT 2451 GGAGAAAGCCGACATCGCCAGCAAGGTCGCCCACTCAGCACTCGTGGAAACAAGCGACGCCCTTGAAGCA 2521 GTTCAGTCGACTTCCGTGTACACCCCCAAGTACCCAGAAGTCAAGAACCCACAGACCGCCTCCAACCCCG 2591 TTGTTGGGCTCCACCTGCCCGCCAAGAGAGCCACCGGTGTCCAGGCCGCTCTTCTCGGAGCAGGAACGAG 2661 CAGACCAATGGGGATGGAGGCCCCAACACGGTCCAAGAACGCCGTGAAAATGGCCAAACGGCGGCAACGC 2731 CAAAAGGAGAGCCGCTAACAGCCATGATGGGAACCACTCAAGAAGAGGACACTAATCCCAGACCCCGTAT 2801 CCCCGGCCTTCGCCTGCGGGGGCCCCC
Całkowita liczba baz ls: 2827.
skład sekwencji DNA: 796 A; 770 C; 724 G; 537 T; o inne; nazwa sekwencji: P2B (numer ID sekwencji: 25)
Fig.6B
190 220
Fig ΙΔ
F i g. 1
F i g. 4
Fig. 5
Fig. 6
Fig. IB
Fig. IC
F ig. 4Δ
Fig.4B
Fig. 5A
Fig. 5B
Fig. 6A
Fig.68
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz Cena 6,00 zł

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób otrzymywania żywego Bimawirusa, w którym Bimawirusem jest wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV), znamienny tym, ze obejmuje następujące etapy:
    - otrzymanie cDNA segmentu A i segmentu B genomu Birnawirusa,
    - przetworzenie wymienionego cDNA w celu wyprodukowania syntetycznych transkryptów RNA, gdzie wspomniane transkrypty RNA są dodatnio polarnymi transkryptami RNA wspomnianych segmentów A i B,
    - dokonanie transfekcji komórek żywicielskich wspomnianymi syntetycznymi transkryptami RNA,
    - inkubację wspomnianych komórek żywicielskich w pożywce kulturowej oraz
    - wyizolowanie żywego, zakaźnego Birnawirusa ze wspomnianej pożywki kulturowej.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze wymienionymi komórkami żywiciela są komórki afrykańskiej małpy zielonej Vero.
  3. 3. Sposób wdług zastrz. 1, znamienny tym, że wymienionymi komórkami żywiciela są komórki drobiowe, korzystnie komórki fibroblastu embrionu kurczaka lub komórki nerkowe embrionu kurczaka.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienione segmenty A iB genomu Birnawirusa są otrzymywane niezależnie z różnych szczepów Birnawirusa.
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wymieniony segment A jest obecny w plazmidzie pUC19FLAD78 lub pUC18FLA23.
  6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wymieniony segment B jest obecny w plazmidzie pUC18FLBP2.
  7. 7. Żywy, chimeryczny wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV), gdzie wymieniony wirus jest wytworzony sposobem, obejmującym etapy
    - otrzymywania cDNA wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV) segmentów A i B,
    - kopiowania wymienionego cDNA w celu wytworzenia syntetycznych transkryptów RNA wymienionych segmentów A i B,
    - transfekcję komórki żywiciela wymienionymi transkryptami syntetycznego RNA,
    - inkubacji wymienionych komórek żywiciela w pożywce, oraz
    - wyizolowania żywego, chimerycznego wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV) z wymienionej pożywki.
  8. 8. Plazmid wybrany z grupy obejmującej pUC19FLAD78, pUC18FLA23 i pUC19FLBP2.
  9. 9. Szczepionka, zawierająca żywy, chimeryczny wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV), znamienna tym, ze wspomniany wirus wytworzony jest sposobem, obejmującym etapy
    - otrzymywania cDNA wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV) segmentów A i B,
    - kopiowania wymienionego cDNA w celu wytworzenia syntetycznych transkryptów RNA wymienionych segmentów A i B,
    - transfekcję komórki żywiciela wymienionymi transkryptami syntetycznego RNA,
    - inkubacji wymienionych komórek żywiciela w pożywce, oraz
    - wyizolowania żywego, chimerycznego wirus zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV) z wymienionej pożywki, w której wymieniony żywy chimeryczny Birnawirus jest przed podaniem pozbawiany aktywności lub osłabiany.
    190 220
    Wirus Zakaźnej Choroby Kaletkowej (IBDV), członek rodziny Birnaviridae, jest czynnikiem powodującym silną chorobę immunosupresyjną u młodych kurcząt (Kibenge, F.S.B., et al., J Gen Yirol,, 69, 1757-1775 (1988)). Zakaźna choroba kaletkowa (IBD) lub choroba Gumboro charakteryzuje się niszczeniem limfatycznych grudek chłonnych w kaletkach Fabrycjusza.
    W stadzie kurcząt w wieku 3-6 tygodni, charakteryzującym się całkowitym brakiem odporności, ta kliniczna choroba powoduje poważną immunosupresję i jest odpowiedzialna za straty spowodowane osłabieniem wzrostu, spadkiem skuteczności żywienia oraz śmiercią. Podatne kurczaki poniżej 3 tygodni nie wykazują zewnętrznych objawów choroby, ale posiadają wykrywalne zakażenie charakteryzujące się zmianami makroskopowymi kaletki.
    Wirus towarzyszący objawom choroby nazywany jest wirusem zakaźnej choroby kaletkowej (infectious bursal disease virus - IBDV). IBDV jest czynnikiem chorobotwórczymo poważnym znaczeniu ekonomicznym dla państwowego i światowego przemysłu drobiarskiego. Powoduje on poważny niedobór odpornościowy u młodych kurcząt poprzez zniszczenie w kaletce Fabrycjusza prekursorów komórek B (limfocytów B, przyp. AJ) produkujących przeciwciała. Immunosupresja powoduje zwiększenie podatności na inne choroby oraz staje na przeszkodzie skuteczności szczepienia przeciwko chorobie Newcastle'a, chorobie Marka oraz wirusom zakaźnego zapalenia oskrzeli.
    Istnieją dwa znane serotypy IBDV. Wirusy serotypu I są chorobotwórcze dla kurczaków, natomiast wirusy serotypu II zakażają kurczaki i indyki. Znaczenie kliniczne zakażenia indyków jest obecnie nieznane.
    IBDV należy do grupy wirusów zwanej Birnaviridae, która zawiera także inne dwusegmentowe wirusy RNA, takie jak wirus zakaźnej martwicy trzustki (ryby), tellina virus i oyster virus (mięczaki dwuskorupowe) oraz drosophila X virus (muszka owocowa). Wszystkie te wirusy zawierają dwuniciowe genomy RNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym (MW).
    Kapsyd wirionu IBDV składa się z kilku białek strukturalnych. Opisanych zostało dziewięć białek strukturalnych, ale istnieją dowody, ze niektóre z nich mogą wykazywać związki substrat-produkt (Kibenge, F.S.B., et al., JGen Yirol,, 69, 1757-1775 (1988)). Poniżej przedstawiono oznaczenia oraz ciężar cząsteczkowy białek wirusowych (viral protein-VP).
    Białko wirusowe Ciężar cząsteczkowy VP1 90 kDa VP2 41 kDa VP3 32 kDa VP4 28 kDa VP5 17 kDa
    Dwa segmenty dwuniciowego RNA zostały zidentyfikowane w genomie IBDV. Genom IBDV składa się z dwóch segmentów dwuniciowego (ds)RNA, których długość waha się od 2827 (segment B) do 3261 (segment A) par zasad (Mundt, E. et al., Virology, 209, 10-18 (1995)). Większy segment A koduje poliproteinę, która jest rozszczepiana przez autoproteolizę, co prowadzi do uformowania dojrzałych białek wirusowych VP2, VP3 i VP4 (Hudson, P.J. et al., Nucleic Acids Res, 14, 5001-5012 (1986)). VP2 i VP3 są głównymi białkami strukturalnymi wirionu. VP2 jest głównym immunogenem chroniącym żywiciela IBDV i zawiera odcinki antygenowe odpowiedzialne za indukcję przeciwciał neutralizujących wirus (Azad, et al., Virology, 161,145-152 (1987)).
    Druga otwarta ramka odczytu (ORF), poprzedzająca i częściowo zachodząca na gen poliproteinowy, koduje białko (VP5) o nieznanej funkcji, które jest obecne w komórkach zainfekowanych wirusem IBDV (Mundt, E, et al., J Gen Yirol, 76, 437-443, (1995)). Mniejszy segment B koduje VP1, wielofunkcyjne białko o ciężarze cząsteczkowym 90 kDa, wykazujące aktywność polimerazy i enzymu syntezy czapeczki (mRNA 5'-CAP, przyp. AJ) (Spies, U., et al., Virus Res, 8, 127-140 (1987), Spies, U., et al., J Gen Yirol, 71, 977-981 (1990)).
    190 220
    Wykazano, że białko VP2 jest głównym immunogenem chroniącym żywiciela IBDV oraz, ze zawiera on obszar antygenowy odpowiedzialny za wywołanie przeciwciał neutralizujących wirus. Obszar zawierający część neutralizującą okazał się bardzo zalezny od struktury przestrzennej. Białko VP3 jest uważane za antygen grupowo-specyficzny, ponieważ jest on rozpoznawalny przez przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw niemu ze szczepów obydwóch serotypów wirusa-1 i II. Białko VP4 okazuje się być proteazą wirusowo-kodowaną, która jest zaangażowana w przetwarzanie prekursorów poliprotein białek VP2, VP3 i VP4.
    Mimo iz sekwencje nukleotydowe dla segmentów A i B genomu różnych szczepów IBDV zostały opublikowane, to dopiero niedawno określone zostały kompletne sekwencje niekodujące 5' i 3' obydwu segmentów. Odcinek niekodujący 5' segmentów A i B IBDV zawiera zgodną sekwencję 32 nukleotydów, podczas gdy 3'-końcowe sekwencje niekodujące obydwu segmentów są nie powiązane, ale zachowane pomiędzy szczepami IBDv tego samego serotypu (Mundt, E et al, Yirology, 209, 10-18 (1995)). Odcinki te mogą zawierać sekwencje istotne w upakowaniu oraz w regulacji ekspresji genów IBDV, jak to zostało zademonstrowane dla innych wirusów zawierających dsRNA takich jak reowirusy ssaków i roślin oraz rotawirusy (Anzola, et al., Proc Natl. Acad. Sci USA, 84, 8301-8305 (1987); Zou, S., et al., Virology, 186, 377-388 (1992); Gorziglia, M.I., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5784-5788 (1992)).
    W ostatnich latach ze sklonowanego cDNA, wytworzono wiele zakaźnych zwierzęcych wirusów RNA przy użyciu transkryptów produkowanych przez polimerazę RNA zalezną od DNA (Boyer, J.C., et al., Virology, 198, 415-426 (Γ994)). Przykładem mogą być: wirus choroby Heinego-Mcdina (reovirus), wirus polio typu (+)RNA; wirus grypy - segmentowany wirus (-)RNA; wirus wścieklizny - niesegmentowany wirus (-)RNA; wszystkie one zostały otrzymane ze sklonowanego cDNA, z ich poszczególnych genomów (van der Werf, S., et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 83, 2330-2334 (1986); Enami, M., et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 87, 3802-3805 (1990); Schnell, M.J., et al., EMBOJ, 13, 4195-4205 (1994)).
    W przypadku reowirusa pokazano, ze transfekcja komórek kombinacją ssRNA, dsRNA i produktów translacji in vitro reowirusa, wygenerowała zakaźny reowirus po uzupełnieniu wirusem pomocniczym z innego serotypu (Roner, M.R., et al., Virology, 179, 845-852 (1990)). Mimo tego, po dzień dzisiejszy, nie ukazało się żadne doniesienie o odzyskaniu wirusa choroby zakaźnej o podzielonym na segmenty genomie dsRNA jedynie z syntetycznych łańcuchów RNA.
    Wynalazek ten dotyczy wirusa zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV), który towarzyszy chorobie Gumoro u młodych kurcząt. W szczególności, wynalazek ten dotyczy systemu wytwarzania wirusa zakaźnej choroby kaletkowej (IBDV) przy wykorzystaniu syntetycznych transkryptów, wyprowadzonych ze sklonowanych cząsteczek cDNA. Obecny wynalazek ułatwi badania nad regulowaniem ekspresji genów wirusowych, patogenezą oraz zaprojektowaniem nowej generacji szczepionek czynnych, zawierających atenuowane drobnoustroje oraz szczepionek unieaktywnionych.
    Aby zastosować system odwrotnej genetyki dla IBDV, skonstruowano odpowiednio trzy niezalezne klony cDNA o pełnej długości, które zawierają odpowiednio segment A szczepu D78 serotypu I lub szczepu 23/82 serotypu II oraz segment B szczepu P2 serotypu I. Syntetyczne RNA segmentów A i B zostały wytworzone poprzez reakcję transkrypcji in vitro na zlinearyzowanych plazmidach przy użyciu polimerazy T7 RNA. Transkrypty tych segmentów, nie poddane lub poddane działaniu DN-azy lub RN-azy, zostały przebadane pod względem generowania wirusów zakaźnych poprzez transfekcję komórek Vero.
    Wykazano, że syntetyczne transkrypty wyprowadzone ze sklonowanego DNA, odpowiadającego całemu genomowi segmentowanego dsRNA wirusa zwierzęcego, mogą prowadzić do replikacji wirusa. Regeneracja wirusa zakaźnego po transfekcji komórek syntetycznymi cząsteczkami pozytywnego RNA, wyprowadzonymi ze sklonowanych cDNA wirusao genomie dsRNA (IBÓV), jest ostatnim krokiem w odwróconym systemie zakaźnym dla wirusów RNA. W wielu przeprowadzanych badaniach wytworzono zakaźne wirusy zwierzęce RNA ze sklonowanego cDNA (Boyer, J.C., et al., Virology, 198, 415-426 (1994)). Van der Werf et al. był pierwszym, który wygenerował wirus choroby Heinego-Medina (wirus polio) wirus typu (+)RNA, wykorzystując syntetyczny RNA produkowany przez polimerazę T7
    190 220
    RNA na sklonowanym, matrycowym cDNA (Van der Werf, S., et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 83, 2330-2334 (1986)). Później Enami i współpracownicy otrzymali wirus grypy, segmentowany wirus (-)RNA (Enami, M., et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990)); oraz Schnell i inni wygenerowali wirus wścieklizny, niepodzielony (-)RNA wirus, ze sklonowanych cząsteczek cDNa (Schnell, M.J., et al., EMBO J, 13, 4195-4205 (1994)). Roner i inni stworzyli układ zakaźny dla segmentowanego dsRNA reowirusa poprzez transfekcję komórek kombinacją syntetycznego ssRNA, dsRNA, i produktów translacji in vitro reowirusa, uzupełnionych przez wirus pomocniczy innego serotypu (Roner, M.R., et al., Virology, 179, 845-852 (1990)). Powstały wirus był odróżniany od wirusa pomocniczego poprzez analizę na płytkach. W tym systemie konieczne było stosowanie wirusa pomocniczego. W przeciwieństwie do niego, opisywany obecnie system odwrotnej genetyki dla IBDV nie wymaga wirusa pomocniczego ani innych białek wirusowych. Transfekcja komórek cząsteczkami pozytywnego RNA obu segmentów była wystarczająca do wygenerowania wirusa zakaźnego (IBDV). Przeznaczenie odpowiednio jednego lub czterech dodatkowych nukleotydów, transkrybowanych na końcu 3' segmentu A, nie było określone. Niemniej jednak, nie przeszkadzało to w replikacji dsRNA wirusa. Podobne zjawisko dla wirusów typu (+)RNA zostało zaobserwowane przez różnych badaczy (Boyer, J.C., et al., Virology, 198, 415-426 (1994)).
    Dla udanego odzysku IBDV konieczna była transfekcja obydwu segmentów pozytywnego RNA do tej samej komórki. Poddane transfekcji RNA z obu segmentów musiafy ulec translacji przez komórkowy mechanizm translacyjny. Poliproteina segmentu A była przypuszczalnie przetwarzana w białka VP2, VP3 i VP4, które tworzą kapsyd wirusa. Powstałe w wyniku translacji białko VP1 segmentu B prawdopodobnie spełniało funkcje polimerazy RNA zależnej od RNA i transkrybowało nici ujemne z syntetycznych nici dodatnich obydwóch segmentów, a produkty reakcji formowały dsRNA. Dobos poinformował ostatnio, ze transkrypcja in vitro wirusa zakaźnej martwicy trzustki (infectious pancreatic necrosis virus IPNV), prototypowego wirusa rodziny Birnaviridae, przeprowadzana przez wirusową polimerazę RNA zależną od RNA, jest rozpoczynana przez białko VP1 i następnie przechodzi poprzez asymetryczny, semikonserwatywny mechanizm podziału nici prowadzący do syntezy tylko dodatnich nici podczas replikacji genomu wirusowego (Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)).
    Obecna metoda ukazuje, ze synteza ujemnych nici przebiega na niciach dodatnich. To, czy powstała stranskrybowana ujemna nić RNA służy jako matryca dla transkrypcji nici dodatnich lub nie, pozostaje przedmiotem dalszych badań.
    Aby udowodnić, ze zakaźny IBDV, zawarty w supematantach komórek poddanych transfekcji, naprawdę pochodził z syntetycznych transkryptów, wygenerowano sztuczną chimerę zawierającą segment A szczepu serotypu II oraz segment B szczepu serotypu I. Za pomocą analiz sekwencyjnych zweryfikowano tą kombinację genomów. Rezultat wskazuje także, ze opisane przez Mundta i Muller'a, sekwencje końcowe, są prawdopodobnie odpowiedzialne za replikację, sortowanie i upakowanie genomu wirusa (Mundt, E. Et al, Virology, 209, 10-18 (1995)). Obecność sekwencji końcowych specyficznych dla serotypu nie uniemożliwia prawidłowej replikacji segmentu A serotypu II poprzez działanie RNA-zależnej polimerazy RNA VP1 z segmentu B serotypu I.
    Możliwość tworzenia rekombinowanych wirusów będzie bardzo przydatna do analizy funkcji sekwencji końcowych specyficznych dla serotypów oraz serotypowo ogólnych.
    Otrzymywanie zakaźnego IBDV pokazuje, ze tylko nici RNA pozytywnego obydwu segmentów są wystarczające do zainicjowania replikacji dsRNA. Rezultaty te są zgodne z ogólnymi cechami replikacji reowirusów i rotawirusów, w których cząsteczki RNA pozytywnego służą jako matryce dla syntezy potomnych nici - negatywnych i wytwarzania dsRNA (Schonberg, M., et al., Proc. Natl Acad Sci. Patton, J.T., Yirus Res., 6, 217-233 (1986); Chen, D., et al., J Yirol, 68, 7030-7039 (1994)).
    Mimo tego, zaproponowane przez Spies'a i innych oraz Dobos'a semikonserwatywne mechanizmy podziału nici, nie mogą być wykluczone (Spies, U., et al, Yirus Res., 8, 127-140 (1987); Dobos, P., Virology, 208, ID-25 (1995)). Rozwinięcie systemu odwrotnej genetyki dla wirusa IBDV bardzo ułatwi przyszłe badania nad ekspresją genów, patogenezą oraz pomoże
    190 220 w projektowaniu nowej generacji szczepionek zawierających atenuowane drobnoustroje i unieaktywnianych szczepionek przeciw IBDV.
    Użyty w obecnym zastosowaniu termin „syntetyczny” odnoszący się do kwasów nukleidowych, wskazuje, że jest to kwas nukleidowy stworzony przez człowieka w przeciwieństwie do kwasu nukleidowego występującego naturalnie. Termin ten nie zawiera żadnych ograniczeń co do sposobu wytwarzania, który może być chemiczny lub biologiczny, w zakresie w jakim metoda wytwarzania zawiera interwencję człowieka.
    Termin „cDNA” oznacza każdy cDNA zawierający segmenty A i B oraz 5' i 3' niekodujące odcinki segmentów A i B.
    Termin „zakaźny” stosowany do wirusów oznacza, ze wirus posiada zdolność do reprodukcji. Wirus może być chorobotwórczy lub nie, ale pozostaje „zakaźny”.
    Obecny wynalazek dostarcza metodę wytwarzania wirusa zakaźnej choroby kaletkowej przy użyciu syntetycznych transkryptów RNA. Metoda ta może być zastosowana do badania regulacji ekspresji genów wirusowych, patogenezy, oraz do projektowania nowej generacji szczepionek żywych i unieczynnionych.
    Obecny wynalazek dostarcza zrekombinowany wektor wirusa zawierającego przynajmniej jedną kopię cDNA stosownie do obecnego wynalazku.
    Zrekombinowany wektor może także zawierać inne konieczne sekwencje, takie jak sekwencje kontrolujące ekspresję, markery, zamplifikowane geny, sekwencje sygnalizujące, promotory i tym podobne znane technice. Uzytecznymi dla tych celów wektorami są plazmidy oraz wirusy takie jak baculovirusy, wirusy opryszczkowe (HVT), wirusy ospy, wirus ospy ptaków i tym podobne.
    W niniejszym opisie występuje także komórka żywiciela stransformowana zrekombinowanym wektorem według wynalazku lub komórka żywiciela, poddana transfekcji z syntetycznym RNA według wynalazku. Komórka żywiciela może być komórką eukariotyczną lub prokariotyczną. Odpowiednimi przykładami są E coli, linie komórek owadów, takie jak Sf-9 i tym podobne, oraz korzystnie komórki fibroblastu embrionu kurczaka (CEF), komórki nerkowe embrionu kurczaka (CEK), komórki afrykańskiej zielonej małpy Vero, i tym podobne.
PL97332184A 1996-09-05 1997-07-31 Sposób otrzymywania żywego Birnawirusa, wirus wytworzony tym sposobem oraz szczepionka zawierająca wymieniony wirus PL190220B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/708,541 US5871744A (en) 1996-09-05 1996-09-05 Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
PCT/US1997/012955 WO1998009646A1 (en) 1996-09-05 1997-07-31 A method for generating birnavirus from synthetic rna transcripts

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL332184A1 PL332184A1 (en) 1999-08-30
PL190220B1 true PL190220B1 (pl) 2005-11-30

Family

ID=24846203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97332184A PL190220B1 (pl) 1996-09-05 1997-07-31 Sposób otrzymywania żywego Birnawirusa, wirus wytworzony tym sposobem oraz szczepionka zawierająca wymieniony wirus

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5871744A (pl)
EP (2) EP0959901A4 (pl)
JP (1) JP4670025B2 (pl)
KR (1) KR100475427B1 (pl)
CN (1) CN1168500C (pl)
AT (1) ATE460178T1 (pl)
AU (1) AU741055B2 (pl)
BR (1) BR9712012B1 (pl)
CA (1) CA2264488C (pl)
CZ (1) CZ299417B6 (pl)
DE (1) DE69739805D1 (pl)
ES (1) ES2342325T3 (pl)
HU (1) HUP9904365A3 (pl)
IL (2) IL128804A0 (pl)
NO (1) NO991074L (pl)
NZ (1) NZ334667A (pl)
PL (1) PL190220B1 (pl)
WO (1) WO1998009646A1 (pl)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596280B1 (en) * 1997-07-31 2003-07-22 University Of Maryland Biotechnology Institute Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
WO1999050419A2 (en) * 1998-03-31 1999-10-07 University Of Maryland Biotechnology Institute A method for generating nonpathogenic, infectious pancreatic necrosis virus (ipnv) from synthetic rna transcripts
WO2000012677A2 (en) * 1998-09-01 2000-03-09 The University Of Hong Kong Generation of recombinant infectious bursal disease viruses by reverse genetics technology and the use of the recombinant viruses as attenuated vaccines
HUP9802974A1 (hu) * 1998-12-19 2000-09-28 Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Fertőző bursitis elleni DNS-vakcina
US6492148B1 (en) * 1999-03-05 2002-12-10 Akzo Nobel Nv Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal disease virus (IBDV) mutants
US6468984B1 (en) 1999-06-08 2002-10-22 Innovo Biotechnologies Ltd. DNA vaccine for protecting an avian against infectious bursal disease virus
EP1069187A1 (en) * 1999-07-14 2001-01-17 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mosaic Infectious Bursal Disease Virus vaccines
US7431930B2 (en) * 2002-03-01 2008-10-07 Intervet International B.V. Infectious bursal disease virus (IBDV) mutant expressing virus neutralising epitopes specific for classic-and variant IBDV strains
ES2217967B1 (es) * 2003-03-31 2006-01-01 Consejo Sup. Investig. Cientificas Procedimiento de produccion de particulas virales vacias (vlps) del virus inductor de la bursitis infecciosa (ibdv), composiciones necesarias para su puesta a punto y su uso en la elaboracion de vacunas frente al ibdv.
ES2307346B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
ES2307345B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
US7244432B2 (en) * 2004-12-08 2007-07-17 University Of Maryland Biotechnology Institute Infectious bursal disease virus (IBDV) variant from Georgia
ES2310062B1 (es) * 2005-07-15 2009-11-13 Bionostra, S.L. Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones.
KR100757541B1 (ko) * 2005-11-08 2007-09-10 엘지전자 주식회사 플라즈마 디스플레이 장치 및 그의 화상 처리방법
WO2008068661A1 (en) * 2006-12-01 2008-06-12 Hepc Biotechnológiai Kutató És Fejleszto Kft. Compositions and methods for the treatment of viral hepatitis
CN101016547B (zh) * 2007-01-25 2010-07-28 浙江大学 海洋双rna病毒mabv重组蛋白的制备方法与应用
EP2407534A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
CN109321583B (zh) * 2018-09-29 2023-08-15 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法
AU2020329166A1 (en) 2019-08-09 2022-03-03 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530831A (en) * 1982-11-02 1985-07-23 Akzo N.V. Infectious Bursal Disease vaccine
CA1334941C (en) * 1985-05-30 1995-03-28 Ahmed Azad Azad Cloning and expression of a host-protective immunogens of ibdv
AU602875B2 (en) * 1985-12-18 1990-11-01 British Technology Group Limited Newcastle disease virus gene clones
US5192539A (en) * 1988-07-21 1993-03-09 Akzo N.V. Infectious bursal disease virus production in continuous cell lines
US5518724A (en) * 1988-08-02 1996-05-21 University Of Maryland Infectious bursal disease virus
NZ235474A (en) * 1989-10-18 1992-12-23 Univ Maryland Virus capable of inducing infectious bursal disease; assay and vaccine
JPH05501064A (ja) * 1990-05-04 1993-03-04 ユニバーシティ　オブ　メリーランド　アット　カレッジ　パーク Ｉｂｄｖタンパク質に関連する特異的ｄｎａ配列並びにベクター、宿主およびワクチン
EP0597016A4 (en) * 1991-07-26 1996-04-24 Virogenetics Corp Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine.
US5788970A (en) * 1994-03-29 1998-08-04 The University Of Maryland College Park Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon

Also Published As

Publication number Publication date
CN1168500C (zh) 2004-09-29
IL128804A0 (en) 2000-01-31
NO991074L (no) 1999-04-29
NZ334667A (en) 2000-09-29
IL128804A (en) 2006-08-01
ATE460178T1 (de) 2010-03-15
BR9712012B1 (pt) 2009-08-11
HUP9904365A2 (hu) 2000-04-28
JP4670025B2 (ja) 2011-04-13
KR100475427B1 (ko) 2005-03-10
CA2264488C (en) 2009-04-07
JP2001501082A (ja) 2001-01-30
WO1998009646A1 (en) 1998-03-12
US5871744A (en) 1999-02-16
CA2264488A1 (en) 1998-03-12
EP0959901A4 (en) 2002-11-04
DE69739805D1 (de) 2010-04-22
CN1229358A (zh) 1999-09-22
KR20010029487A (ko) 2001-04-06
PL332184A1 (en) 1999-08-30
NO991074D0 (no) 1999-03-04
BR9712012A (pt) 2000-01-18
EP1930026A1 (en) 2008-06-11
CZ74299A3 (cs) 1999-08-11
EP1930026B1 (en) 2010-03-10
AU741055B2 (en) 2001-11-22
AU3891897A (en) 1998-03-26
HUP9904365A3 (en) 2001-06-28
EP0959901A1 (en) 1999-12-01
CZ299417B6 (cs) 2008-07-16
ES2342325T3 (es) 2010-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL190220B1 (pl) Sposób otrzymywania żywego Birnawirusa, wirus wytworzony tym sposobem oraz szczepionka zawierająca wymieniony wirus
JP4675447B2 (ja) 遺伝的に操作された細胞培養適応感染性嚢胞疾患ウイルス（ｉｂｄｖ）突然変異体
Fodor et al. Induction of protective immunity in chickens immunised with plasmid DNA encoding infectious bursal disease virus antigens
US10821170B2 (en) Duck Enteritis Virus and the uses thereof
US6231868B1 (en) Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts
EP1069187A1 (en) Mosaic Infectious Bursal Disease Virus vaccines
Wang et al. Comparison of four infectious bursal disease viruses isolated from different bird species
US6596280B1 (en) Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts
Vakharia Development of recombinant vaccines against infectious bursal disease
CA2351010C (en) A broad spectrum infectious bursal disease virus vaccine
EP1170302B1 (en) Infectious bursal disease virus vaccines
MXPA99002187A (en) A method for generating birnavirus from synthetic rna transcripts
US20040001863A1 (en) Immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications therein
JP3693075B2 (ja) 組み換えウイルス、その作製法およびその利用
Marshall Experimental in ovo transmission of avian reoviruses and characterization of embryo-generated isolates

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120731