KR100475427B1 - 합성 ｒｎａ 전사체로부터 버나바이러스를 생산하는 방법 - Google Patents
합성 ｒｎａ 전사체로부터 버나바이러스를 생산하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
클로닝된 DNA로부터 유도된 합성 전사체를 이용함으로써, Birnavirdae 패밀리의 분절화된 이중-가닥 (ds) RNA 바이러스인 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)와 같은 살아있는 버나바이러스를 생산하기 위한 시스템을 개발하였다. IBDV의 RNA 세그먼트 A 및 B의 전체 코딩 여영역과 비-코딩 영역을 각각 함유한 별도의 완전한 길이의 cDNA 클론을 구축하였다. 두가지 모두의 세그먼트의 합성 RNA를 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 선형 플라스미드를 생체외 전사시킴으로써 제조하였다. 두가지 모두의 세그먼트의 결합된 플러스-센스 전사체로 Vero 세포를 형질도입시킴으로써, 형질도입 후 36시간만에 감염성 바이러스를 생산하였다. dsRNA 바이러스의 역유전 시스템의 개발은 바이러스 유전자 발현 조절 연구, 병원발생학, 및 살아있는 불활성화 백신의 새로운 제조방법의 고안 등에 큰 도움이 될 것이다.
Description
Birmaviridae 패밀리의 일종인 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV: Infectious bursal disease virus)는 병아리에 있어서 강력한 면역억압 질환의 원인이 되는 물질이다 (Kibenge, F.S.B. 외, J. Gen. Virol., 69, 1757-1775 (1988)). 감염성 점액낭 질환 (IBD) 또는 Gumboro 질환은 Fabricius의 점액낭에서 임파절을 파괴시킨다는 특징을 갖는 질병이다. 3-6주령의 완전히 민감한 병아리떼에 있어서, 이 임상 질환은 심각한 면역억압을 일으키고, 손상된 성장으로 인한 발육부진을 야기시키며 소화율을 떨어뜨려 죽음에 이르게 한다. 3주 미만의 민감한 병아리들은 외부적으로는 이 질환의 임상적 징후를 나타내지 않지만 점액낭의 전체적으로 병변화된다는 특징을 갖는다.
이 질환의 증상과 연관되어 있는 바이러스는 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)라 불리운다. IBDV는 국내뿐 아니라 전세계적으로 가금류 산업상 경제적으로 큰 영향을 미치는 중요한 병원균이다. 이것은 Fabricius의 점액낭에서 항체-생산 B 세포의 전구체를 파괴시킴으로써 병아리에게 심각한 면역결핍증을 야기시킨다. 이러한 면역억압은 다른 질환에 대한 감수성도 증가시키며, Newcastle 질환, Marek's 질환 및 감염성 기관지 질환 바이러스에 대한 효과적인 면역화도 방해한다.
IBDV에는 2가지 혈청형이 알려져 있다. 혈청형 I 바이러스는 병아리에게 병을 일으키는 반면, 혈청형 II 바이러스는 닭과 칠면조를 감염시킨다. 칠면조 감염은 현재 그다지 알려지지는 않았지만 임상적으로 중요한 의미를 갖는다.
IBDV는 감염성 췌장 괴사 바이러스 (어류), 텔리나 바이러스 및 굴 바이러스 (쌍각류 연체동물) 및 드로조필라 X 바이러스 (과실 파리)와 같은 이절 (bisegmented) RNA 바이러스를 비롯한 Birnaviridae라 불리우는 일단의 바이러스에 속한다. 이 바이러스들은 모두 고분자(MW) 이중-사슬 RNA 게놈을 함유한다.IBDV 바이러스의 캡시드는 몇개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 9개나 되는 구조 단백질이 보고된 바 있지만 이들 중 몇몇은 전구체-생성물 관계에 있다는 증거가 있다 (Kibenge, F. S. B 외, J. Gen. Virol., 69, 1757-1775 (1988)). 이 바이러스 단백질 (VP)의 표시와 분자량은 다음과 같다.
| 바이러스 단백질 | 분자량 |
| VP1 VP2 VP3 VP4 VP5 | 90 kDa 41 kDa 32 kDa 28 kDa 17 kDa |
IBDV의 게놈에서 이중-사슬 RNA의 2 세그먼트가 동정되었다. IBDV 게놈은2827 (세그먼트 B) 내지 3261 (세그먼트 A) 뉴클레오타이드 염기쌍 사이에서 변화화는 이중-사슬 (ds: double-stranded) RNA의 2개 분절로 이루어진다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995)). 큰 세그먼트 A는 자기단백질분해에 의해 절단된 폴리단백질 (polyprotein)을 코딩하여 성숙한 바이러스 단백질 VP2, VP3 및 VP4를 형성한다 (Hudson, P.J. 외, Nucleic Acids Res., 14, 5001-5012 (1986)). VP2와 VP3는 이 바이러스의 주요한 구조 단백질들이다. VP2는 IBDV의 주요 숙주-보호 면역원으로서, 항체 무력화를 유도하는 역할을 하는 항원 대역을 함유한다 (Azad 외, Virology, 161, 145-152 (1987)). 폴리단백질 유전자를 선도하고 이것과 일부 중복되는 제 2의 오픈 리딩 프레임 (ORF: open reading frame)은 2-감염 세포에 존재하는 미지 기능을 갖는 단백질을 코딩한다 (Mundt, E. 외, J. Gen. Virol., 76, 437-443 (1995)). 이보다 작은 세그먼트 B는 폴리머라제 및 캐핑 효소 활성과 함께 90-kDa 다기능 단백질인 VP1을 코딩한다 (Spies, U.외, Virus Res., 8, 127-140 (1987); Spies, H.외, J. Gen. Virol., 71, 977-981 (1990)).
VP2 단백질이 IBDV의 주요한 숙주 보호 면역원이라는 것과, 이것이 무력화 항체를 도입하는 역할을 하는 항원 영역을 함유한다는 것이 입증된 바 있다. 무력화 부위를 함유하는 영역은 고도로 배위-의존적인 것으로 나타났다. VP3 단백질은 그룹-특이적 항원인 것으로 여겨지는데, 이는 이것이 혈청형 I 및 II 바이러스 두가지 모두의 균주로부터 그에 지향된 모노클로날 항체에 의해 인식되기 때문이다. VP4 단백질은 VP2, VP3 및 VP4 단백질의 전구체 폴리단백질의 프로세싱에 관여하는 바이러스-코딩된 프로테아제인 것으로 보인다.
여러가지 IBDV 균주의 게놈 세그먼트 A와 B에 대한 뉴클레오타이드 서열이 공표되었지만, 두가지 모두의 세그먼트의 완전한 5'- 및 3'-논코딩 (noncoding) 서열이 결정된 것은 최근의 일이다. IBDV 세그먼트 A 및 B의 5'-논코딩 영역은 32 뉴클레오타이드의 콘센서스 서열을 함유하는 반면, 이들 두가지 세그먼트의 3'-논코딩 말단 서열은 연관성이 없고, 동일 혈청형의 IBDV 균주사이에 보존되어 있다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995)). 이들 말단들은 포유류 및 식물의 레오바이러스 및 로타바이러스와 같은 기타 ds RNA 함유 바이러스에서 입증된 바와 같이, IBDV 유전자 발현의 패키징 및 조절에 중요한 서열들을 함유할 수 있다 (Anzola 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8301-8305 (1987); Zou, S.외, Virology, 186, 377-388 (1992); Gorziglia, M.I., 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5784-5788 (1992)).
최근, 클로닝된 cDNA로부터 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 전사체를 이용하여 몇몇 감염성 동물 RNA 바이러스가 생산된 바 있다 (Boyer, J.C.외, Virology, 198, 415-426 (1994)). 예컨대, 폴리오바이러스, 플러스-스트랜드 RNA 바이러스; 인플루엔자 바이러스; 절단된 음성-스트랜드 RNA 바이러스등은 모두 상응하는 그들의 게놈의 클로닝된 cDNA로부터 회수된 것들이다 (van der Werf, S.,외, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2330-2334 (1986); Enami, M. 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805 (1990); Schenell, M.J. 외, EMBO J., 13, 4195-4205 (1994)). 레오바이러스의 경우, SSRNA, ds RNA 및 생체외 번역된 레오바이러스 산물과의 조합으로 세포를 형질도입시키면 상이한 혈청형으로부터 헬퍼 바이러스와 상보되는 경우 감염성 레오바이러스가 생산된다 (Roner, M.R.외, Virology, 179, 845-852 (1990)). 그러나, 오늘날까지, 합성 RNA 만으로부터 분절된 (segmented) dsRNA 게놈의 감염성 바이러스를 회수한 예는 보고된 바 없다.
발명의 요약
본 발명은 병아리의 Gumboro 질병과 관련이 있는 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은, 클로닝된 cDNA로부터 유도된 합성 전사체를 이용하여 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)를 생산하는 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 바이러스 유전자 발현의 조절, 병원론 및 살이있는 불활성화 백신의 새로운 생산법의 고안등에 관한 연구를 용이하게 해 줄 수 있을 것이다.
도 1은 T7 RNA 폴리머라제와 IBDV의 플러스-센스 ssRNA의 합성에 이용된 cDNA 구축의 개략적 다이아그램이다. pUC19FLAD78의 구축물은 IBDV 균주 D78의 세그먼트 A의 cDNA를 함유하고 재조합 플라스미드 pUC18FLA23은 IBDV 균주 23/82의 세그먼트 A의 완전한 길이의 cDNA를 함유한다. IBDV의 세그먼트 A는 폴리단백질 (VP2-VP4-VP3)과 최근 동정된 VP5단백질을 코딩한다. 플라스미드 pUC18FLBP2는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (VP1)을 코딩하는 균주 P2의 세그먼트 B의 cDNA를 함유한다. 바이러스 특이 서열에 밑줄 표시하였으며 T7프로모터 서열은 이탤릭체로 표시하였다. 제한부위는 굵은문자로 표시하였다. 선형 플라스미드의 절단 부위들은 수직 화살표로 나타내고 전사 방향은 수평 화살표로 표시하였다.
도 2는 Vero 세포의 형질도입에 사용된 전사 반응 산물의 아가로스 겔 분석을 나타낸 도면이다. T7RNA 폴리머라제를 이용하여 생체외 전사된 합성 RNA와 IBDV 균주 D78의 세그먼트 A의 cDNA를 함유하는 선형 플라스미드 pUC19FLAD78 (레인 2, 4, 및 6) 및 균주 P2의 세그먼트 B의 cDNA를 함유하는 pUC18FLBP2 (레인 1, 3 및 5)를 각각 도시하였다. 전사 후, 반응 혼합물을 DNase (레인 1 및 2), RNAse (레인 3 및 4)로 처리하거나 또는 처리하지 않은채로 방치하였다 (레인 5 및 6). 반응상물 2 μlfmf 1% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. Hind III/EcoRI으로 절단한 람다 DNA를 마커로서 이용하였다 (레인 M).
도 3은키메릭 IBDV 균주 23A/P2B의 세그먼트 A 및 B로부터의 클로닝된 RT-PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열 (굵은 글씨체)과 혈청형 II 균주 23/82 및 혈청형 I 균주 P2의 공지 서열을 각각 비교한 것이다. 뉴클레오타이드 정체성은 콜론으로 표시하였다.
도 4는 pUC18FLA23의 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 5는 pUC19FLAD78의 DNA 서열을 도시한 것이다.
도 6은 pUC18FLBP2의 DNA 서열을 도시한 것이다.
IBDV을 위한 역유전 시스템을 개발하려는 노력의 일환으로, 혈청형 I 균주 D78 또는 혈청형 II 균주 23/82의 세그먼트 A 또는 혈청형 I 균주 P2의 세그먼트 B를 각각 함유하는 3가지 독립적인 완전한 길이의 cDNA 클론을 구축하였다. 세그먼트 A 및 B의 합성 RNA를 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 선형화 플라스미드 상에 생체외 전사 반응에 의해 생산하였다. 이들 세그먼트의 전사체들을 DNase 또는 RNase로 처리 또는 미처리하고 이를 Vero 세포의 형질도입에 의한 감염성 바이러스 생산에 대해 평가하였다.
본 발명자들은 분절된 dsRNA 동물 바이러스의 전체 게놈에 해당하는 클로닝된 DNA로부터 유도된 합성 전사체가 바이러스를 복제시킬 수 있음을 입증하였다. dsRNA 게놈을 이요하여 클로닝된 바이러스의 cDNA로부터 유도된 합성 플러스 -센스 RNA로 세포를 형질도입시킨 후 감염성 바이러스를 회수함으로써 RNA 바이러스에 대한 역감염 시스템의 탐색을 완료할 수 있다. 몇몇 연구자들은 클로닝된 cDNA로부터 감염성 동물 RNA 바이러스를 생산한 바 있다 (Boyer, J.C.외, Virology, 198, 415-426 (1994)). Van der Werf 등은 클로닝된 cDNA 템플레이트 상에 T7 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 합성 RNA를 이용함으로써 플러스-스트랜드 RNA 바이러스인 폴리오바이러스를 최초로 생산하였다 (van der Werf, S.외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2330-2334 (1986)). 후에, 각각의 상응하는 게놈의 클로닝된 cDNA로부터, Enami 등은 인플루엔자 바이러스, 즉 분절화된 음성-스트랜드 RNA 바이러스 (Enami, M.외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805 (1990))를 제조하고; Schnell 등은 라비 바이러스, 즉 비-분절화된 음성 스트랜드 RNA 바이러스를 생산한 바 있다 (Schenell, M.J.외, EMBO J., 13, 4195-4205 (1994)). Roner 등은 합성 ssRNA, dsRNA, 생체외 번역된 레오바이러스 산물, 및 상이한 혈청형의 헬퍼 바이러스와 상보된 것들의 조합을 이용하여 세포를 형질도입시킴으로써 분절된 dsRNA 레오바이러스에 대한 감염성 시스템을 개발하였다 (Roner, M.R.외, Virology, 179, 845-852 (1990)). 얻어진 바이러스는 플라크 분석에 의해 헬퍼 바이러스로부터 구별하였다. 그러나, 이 시스템에서는, 헬퍼 바이러스가 필요하다. 이와 대조적으로 본문에 설명하고자 하는 IBDV의 역유전 시스템은 헬퍼바이러스나 기타 바이러스 단백질을 필요로 하지 않는다. 즉 두가지 모두의 세그먼트의 플러스-센스 RNA로 세포를 형질도입시키는 것만으로 감염성 바이러스 (IBDV)가 생산되었다. 세그먼트 A의 3'-말단에 각각 전사된 부가적인 하나 또는 네개의 뉴클레오타이드의 운명은 결정되지 않았다. 다른 연구자들에 의해 플러스-스트랜드 RNA 바이러스에서 유사한 효과가 관찰되었다 (Boyer, J.C. 외, Virology, 198, 415-426 (1994)).
IBDV의 성공적인 회수를 위해서는 동일한 세포내로 두가지 모두의 세그먼트의 플러스-센스 RNA를 전사하는 것이 필요하였다. 두가지 모두의 세그먼트의 형질도입된 RNA들을 세포 번역 기계에 의해 번역시켜야만 하였다. 세그먼트 A의 폴리단백질은 바이러스 캡시드를 형성하는 VP2, VP3 및 VP4 단백질로 프로세싱된 것으로 추정되었다. 세그먼트 B의 번역된 단백질 VP1은 아마도 RNA-의존성 RNA 폴리머라제로서 작용하고 양 세그먼트의 합성 플러스-스트랜드로부터의 전사된 마이너스-스트랜드 및 반응 산물은 dsRNA를 형성하였다. 최근, Dobos는 Birnaviridae 패밀리의 원형 바이러스인 감염성 췌장 괴사 바이러스 (IPNV)의 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의한 생체외 전사가 VP1에 의해 프라이밍되어, 비대칭, 반보존성, 스트랜드-축출 메카니즘을 경유하여 바이러스 게놈의 복제시 오직 플러스 스트랜드만이 합성됨을 보고하였다 (Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). 본 시스템은 마이러스-스트랜드의 합성이 플러스-스트랜드상에서 진행함을 보여준다. 결과적으로 전사된 마이너스-스트랜드 RNA가 플러스 스트랜드의 전사를 위한 템플레이트 역할을 하는지의 여부는 추후의 연구과제이다.
형질도입된 세포의 상등액 중에 함유된 감염성 IBDV가 실제로 합성 전사체로부터 유도된 것임을 입증하기 위해, 혈청형 II 균주의 세그먼트 A와 혈청형 I 균주의 세그먼트 B를 함유하는 인공 키메라를 제조하였다. 이들을 서열분석하자 이 게놈의 조합이 입증되었다. 결과 역시 Mundt와 Muller에 의해 설명된 말단 서열 모티프가 바이러스 게놈의 복제, 분류 및 저장에 어떤 역할을 한다는 것을 가리켜준다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995)). 혈청형-특이적 말단 서열의 존재는 혈청형 I 세그먼트 B의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 VP1의 작용에 의한 혈청형 II A 세그먼트의 적절한 복제를 명백히 방지하지는 않는다. 재조합 바이러스의 생산 능력은 혈청형-특이적 및 혈청형-공통적 말단 서열의 정확한 기능을 분석하는데 큰 도움이 될 것이다.
감염성 IBDV의 회수는 두가지 세그먼트 중 오직 플러스-스트랜드 RNA만으로도 ds RNA의 복제를 개시하는데 충분함을 입증해준다. 따라서, 이러한 결과는 플러스-스트랜드 RNA가 자손대의 마이너스-스트랜드의 합성시 템플레이트 역할을 하여 dsRNA를 생산하는 레오바이러스 및 로타바이러스 복제의 일반적인 특성과도 잘 일치하는 것이다 (Schonberg, M.외, Proc. Natl. Acad. Sci. Patton, J.T., Virus Res., 6, 217-233 (1986); Chen, D., 외, J. Virol., 68, 7030-7039 (1994)). 그러나, Spies 등 및 Dobos가 제안한 반보존성, 스트랜드 축출 메카니즘은 배제될 수 없다 (Spies, U.외, Virus Res., 8, 127-140 (1987); Dobos, P., Virology, 208, 10-25 (1995)). IBDV에 있어서 역유전 시스템의 개발은 장차, 살아있는 불활성화 IBDV 백신의 새로운 생산법 고안, 유전자 발현, 병원학등의 연구에 커다란 도움이 될 것이다.
본 발명에서 핵산에 적용되는 "합성"이라는 용어는 자연발생적인 핵산과 대조적으로 인공 핵산을 가리키는 것이다. 이 용어는 인간이 관여하는 제조방법인 한, 화학적이든 생물학적이든 그 제조방법에 의해 한정되지 않는다.
"cDNA"라는 용어에는 세그먼트 A 및 B와 세그먼트 A 및 B의 5' 및 4' 논코딩 영역을 함유하는 모든 cDNA가 포함된다.
바이러스에 적용되는 "감염성"이라는 용어는 그 바이러스가 재생능력이 있음을 가리키는 것이다. 이 바이러스는 병원성일수도 있고 비병원성인한편 여전히 감염성일 수도 있다.
본 발명은 합성 RNA 전사체를 이용하여 감염성 점액낭 질환을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 바이러스 유전자 발현, 병원발생학의 연구, 및 살아있는 불활성 IBDV 백신의 새로운 생산방법을 고안하는데 이용되리 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 cDNA를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 재조합 벡터는 발현 조절 서열, 마커, 증폭 유전자, 시그날 서열, 프로모터 등, 기술분야에 알려진 필요한 서열들을 함유할 수도 있다. 이 목적에 유용한 벡터는 플라스미드와 배큘로바이러스, 헤르페스 바이러스 (HVT) 및 폭스(pox) 바이러스, 예컨대 가금류 폭스 바이러스등과 같은 바이러스이다.
본 발명에 따라 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 또는 본 발명의 합성 RNA로 형질도입된 숙주세포도 제공된다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 숙주 세포일 수 있다. 적합한 예로는 E. coli, 곤충 세포주, 예컨대, Sf-9, 닭의 배 섬유아세포 (CEF: chicken embryo fibroblast), 닭의 배 신장 (CEK: chicken embryo kidney) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 Vero 세포등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 일부의 가금류 보호량을 함유하는 IBDV 가금류 백신을 제공하는데, 여기서 상기 바이러스는 더 이상 바이러스적이지 않도록 불활성화 또는 변형된 것이다.
바이러스는 화학적 또는 물리적 수단에 의해 불활성화시킬 수 있다. 화학적 불활성화는 예컨대 효소, 포름알데히드 β-프로피오락톤, 에틸렌-이민 또는 그 유도체, 유기 용매 (예컨대 할로겐화 탄화수소) 및 계면활성제 등으로 바이러스를 처리함으로써 수행할 수 있다. 필요한 경우, 바이러스를 불활성화시킨 후 불활성화제를 중화시킬 수 있다. 물리적 불활성화는 바이러스를 UV선, X-선, 또는 γ-선으로 조사함으로써 수행할 수 있다.
바이러스는 감염성 바이러스를 생산하기 전 또는 후에 계대, 핵산 서열의 결실 및 부위-지향적 돌연변이등의 처리에 의해 을 비롯한 공지방법에 의해 약화시킴으로써, 바이러스 감염성은 감소된 반면 항원성은 충분히 유지된 바이러스를 생산할 수 있다.
가금류의 백신화에 생리적으로 허용가능한 담체가 기술분야에 알려져 있으며 따라서 본문에 설명할 필요는 없을 것이다. 담체는 가금류에 대해 생리적으로 허용가능하여야 할 뿐만 아니라 백신 및/또는 그의 폴리펩티드 산물의 발현에 의해 도출된 면역학적 응답을 간섭하지 않아야만 한다.
그 중에서도 어쥬번트 및 안정화제와 같은 기타 첨가제를 기술분야에 알려진 양으로 백신에 첨가시킬 수 있다. 바람직하게는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 식물성유 및 동물성유 등과 같은 보조제를 IBDV에 대한 면역응답을 증가시키는데 충분한 양으로 백신과 함께 투여한다. 백신에 첨가되는 어쥬번트의 양은 어쥬번트의 특성에 따라 달라지며, 일반적으로 IBDV 중량의 약 0.1 내지 약 100배, 바람직하게는 IBDV 중량의 약 1 내지 약 10배인 것이 좋다.
본 발명의 백신은 또한 여러가지 안정화제를 함유할 수 있다. 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로스, 덱스트린 또는 글루코스와 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인과 같은 단백질; 및 알칼리 금속 포스페이트과 같은 완충액을 비롯한 적절한 안정화제가 이용될 수 있다. 안정화제는 특히 동결건조에 의해 건조한 백신 제제를 제조할 경우 유리하다.
백신은 주사에 의해 가금류의 코, 눈에 접종하거나, 식수, 사료중에, 또는 노출에 의해 가금류에 접종할 수 있다. 바람직하게는, 식수에 백신을 넣거나 또는 동물의 주변에 분무하는 등의 대량 투여기술에 의해 투여하는 것이 좋다. 주사에 의해 투여할 경우, 비경구적으로 백신을 투여하는 것이 좋다. 본문에 설명된 바와 같은 비경구 투여수단은 정맥내, 피내, 근육내 또는 복강내 주사를 의미한다.
본 발명의 백신은 부화 전 또는 후의 어느 시점에서든 IBD를 예방하기 위해 가금류에게 투여한다. 바람직하게는, 태어나기 전과 약 6주가량 되었을 때 투여하는 것이 좋다. 가금류에는 병아리, 수탉, 암탉, 구이용 영계 (broilers), 통째로 굽기 위한 병아리 (roasters), 종축(breeders), 알 낳는 닭 (layers), 칠면조 및 오리등이 포함되나 이에 한정하지 않는다.
백신은 단위 투여 형태로 멸균 용기에 제공되거나 또는 기타 다른 양으로 제공될 수 있다. -20℃ 미만, 더욱 바람직하게는 -70℃ 미만에서 냉동보관하는 것이 좋다. 사용전에 이를 해동시키고 그 직후 재냉동할 수 있다. 가금류에 투여하기 위해 재조합적으로 생산된 바이러스를 염수 용액과 같은 담체 중에 약 104 내지 107pfu/ml, 더욱 바람직하게는 약 105 내지 106pfu/ml의 양으로 현탁시킬 수 있다. 불활성화 백신은 담체에 희석된 항원량 104 내지 107pfu/ml를 함유할 수 있다. 기타 담체들도 공지 기술에 알려진 바에 따라 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 기술분야에 알려진 희석제와 불활성 약학적 담체이다. 바람직하게는 대량 투여 기술에 의해 백신과 함께 병용투여가능한 담체나 희석제인 것이 좋다. 그러나, 담체 또는 희석제는 주사, 눈 점적제, 코 점적제 등과 같은 기타 투여방법에 이용할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 IBDV 물질과 함께 조합 백신을 생산하는데 이용될 수도 있다. IBDV 물질은 뉴캐슬 질병 바이러스 감염성 기관지염 바이러스 (Newcastle Disease Virus Infectious Bronchitis virus), 레오 바이러스 (Reo virus), 아데노 바이러스 (Adeno virus) 및/또는 마렉 바이러스 (Marek virus)와 함께 조합사용될 수 있다.
본 발명의 상기 예들을 다음에 실시예들 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 여러가지 변형이 가능함을 당업자는 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
바이러스 및 세포. IBDV의 2가지 혈청형 I 균주, 독일에서 입수한 약독화된 P2 균주 및 백신 균주 D78 (Intervet International), 및 한가지 혈청형 II 균주, 비병원성 23/82 균주를 병아리 배 세포 (CEC:chicken embryo cells) 중에서 증식시킨 다음 정제하였다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995); Vakharia, V.N.외, Virus Res., 31, 265-273 (1994)). Vero 세포들을 5% 소의 태아 혈청 (FCS)이 보강된 M199 배지에서 생육시켜 형질도입 실험에 이용하였다. Vero 세포에서, 회수된 바이러스의 추가적인 증식과 면역형광 연구를 수행하였다 (Mundt, E.외, J. Gen. Virol., 76, 437-443 (1995)). 플라크 분석을 위해, 2차 CEC의 단층을 준비하여 사용하였다 (Muller, H. 외, Virus Res., 4, 297-309 (1986)).
IBDV 게놈의 완전한 길이의 cDNA 클론의 구축. IBDV 세그먼트 A 및 B의 완전한 길이의 cDNA 클론을 별도로 준비하였다. 표준 클로닝 공정 및 방법 (Vakharia, V.N.외, Virus Res., 31 265-273 (1994))에 따라 균주 D78의 RNA 세그먼트 A의 전 코딩 영역을 함유하는 cDNA 클론을 제조하였다. D78 말단 서열을 최근 공표된 다른 IBDV 균주의 말단 서열 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995))과 비교하자, D78 cDNA는 각각 5'- 및 3'-말단에 보존된 처음 17개 및 마지막 10개 뉴클레오타이드가 결여되었음이 관찰되었다. 따라서, 세그먼트 A의 완전한 길이의 cDNA 클론을 구축하기 위해, 2개의 프라이머 쌍 (A5'-D78, A5-IPD78 및 A3'-IPD78)을 합성하여 PCR 증폭에 이용하였다 (표 1). DNA 세그먼트들을 공급자 (New England Biolabs)의 프로토콜에 따라 "Deep Vent Polymerase" (고성능 친열성 DNA 폴리머라제)를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 단편들을 pCRII 벡터 (Invitrogen Corp.)의 EcoRI 부위에 클로닝시켜 플라스미드 pCRD78A5'과 pCRD78A3'을 각각 얻었다. 각각의 플라스미드를 EcoRI과 SalI으로 절단하고 얻어진 단편들을 EcoRI 절단된 pUC18에 접합시킴으로써, 비-구조적 VP5 단백질 (서열 No. 28) 뿐 아니라 모든 구조 단백질 (VP2, VP4 및 VP 3, 서열 No. 30)을 코딩하는 세그먼트 A의 완전한 길이의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pUC19FLAD78 (서열 Nos. 27 및 29)를 얻었다 (도 1).
"SuperScript RT II"(RNAse H 활성이 감소된 RNA 지향 DNA 폴리머라제, GIBCO/BRL)를 이용하여 균주 23/82의 바이러스 게놈 dsRNA를 역전사 (RT)하는데 2개의 프라이머 (A5'-23, A5IP23 및 A3'-23, A3-IP23; 표 1 참조)를 사용하였다. RT 반응 산물을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 각각의 프라이머쌍 A5'-23, A5-IP23 및 A3'-23, A3-IP23에 의해 결합된 2개의 cDNA 단편을 얻기 위해, "Deep Vent 폴리머라제:를 이용하여 PCR에 의해 RT반응 산물을 증폭시켰다. RT와 PCR 두가지 모두를 공급자 프로토콜에 따라 수행하였다. 얻어진 PCR 단편을 SmaI 절단된 pUC18 벡터내에 블런트-엔드 접합시켜 pUC23A5'와 pUC23A3를 얻었다. 플라스미드 pUC23A3'에 함유된 세그먼트 A의 3'-말단을 HindIII-BstBI 절단된 플라스미드 pUC23A5'에 접합시켜 균주 23/82의 세그먼트 A의 완전한 길이의 cDNA를 수립하였다. 얻어진 플라스미드를 pUC18FLA23 (서열 Nos. 31 및 33)이라 명명하였으며 (도 1), 이것은 구조 단백질 VP2, VP3 및 VP4 (서열 No. 32) 및 비-구조 단백질 Vp5 (서열 No. 34)를 코딩하였다.
P2 균주의 세그먼트 B의 cDNA 클론을 얻기 위해, 2개의 프라이머 쌍 (B5'-P2, B5-IPP2 및 B3'-P2, B3-IPP2)을 공표된 서열에 따라 고안하여 RT-PR 증폭에 사용하였다 (표 1 참조). 템플레이트로서 게놈 dsRNA를 이용하여, cDNA 단편들을 합성하고 공급자 프로토콜 (Perkin-Elmer Cetus)에 따라 증폭시켰다. 증폭된 단편들을 Sma I 절단된 pBS벡터 (Strategene)내로 블런트-엔드 접합시켜 클론 pBSP2B5' 및 pBSP2B3'을 얻었다. 세그먼트 B의 완전한 길이의 클론을 얻기 위해, pUC18 벡터의 EcoRI과 PstI 위치 사이에 플라스미드 pBSP2B5'의 5'-말단 단편을 먼저 서브클로닝시켜 pUCP2B5'을 얻었다. 이어서 플라스미드 pBSP2B3'의 3'-말단 단편을 플라스미드 pUCP2B5'의 독특한 BgI II 및 Pst I 위치 사이에 삽입하여 VP1 단백질 (서열 No. 26)을 코딩하는 완전한 길이의 플라스키드 pUC18FLBP2 (서열 No. 25)를 얻었다 (도 1). "Sequenase" DNA 서열분석 시스템 (U.S. Biochem.)을 이용함으로써 플라스미드 pUC18FLBP2, pUC18FLA23 및 pUC19FLAD78의 서열을 완전히 결정하고, 서열 데이타를 "DNASIS"(Pharmacia) 또는 "PC/Gene" (Intelligenetics) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. T7 RNA 폴리머라제 (Promega)를 이용하여 생체외 전사 및 번역 커플링된 망상적혈구 용균물 시스템에 의해 완전한 길이의 구축물의 정체를 시험하였다.
합성 RNA의 전사 및 형질도입. 플라스미드 pUC19FLAD78, pUC18LA23 및 pUC18FLBP2를 각각 BsrGI, NsiI 및 pST I 효소를 이용하여 절단하고 (도 1 참조), T7 RNA 폴리머라제 (Promega)를 이용한 생체외 전사에 템플레이트로서 사용하였다. 간단히, 제한효소 절단 분석물을 0.5% SDS로 조정하고 37℃에서 1시간 동안 프로테이나제 K (0.5 mg/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 에탄올 침전 후 선형 DNA 템플레이트 (~3μg)를 회수하고, 이를 40 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCl, 6mM MgCl2, 2mM 스퍼미딘, 0.5 mM 씩의 ATP, CTP 및 UTP, 0.1 mM GTP, 0.25 mM 캡 아날로그 [m7G(5')G], "RNasin" (리보뉴클리아제 억제제) 120 단위, T7RNA 폴리머라제 (Promega) 150단위를 함유하는 반응 혼합물 (50μl)에 별도로 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 합성 RNA 전사체를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 대조군으로서, 전사 산물을 정제 단계에 앞서 DNase 또는 RNase (Promega)로 처리하였다.
60 mm 접시에 Vero 세포들을 80% 집합도까지 생육시키고 인산염-완충염수 (PBS)로 1회 세정하였다. "OPTI-MEM I" 3 ml (HEPES 완충액, 중탄산나트륨, 하이포잔틴, 티미딘, 피루브산나트륨, L-글루타민, 미량원소, 성장인자 및 페놀 레드; GIBCO/BRL)을 함유하는 감소된 혈청 배지)로 세정하여 모노레이어에 첨가하고, 세포를 ℃에서 1시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 동시에, "OPTI-MEMI" 0.15 ml를 1.25μg의 "Lipofectin" 시약 (N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드와 다이올레이포르파티딜에탄올아민, BIPCO/BRL)과 함께 폴리스티렌 튜브 중, 실온에서 45분간 인큐베이션시켰다. 디에틸 피로카보네이트-처리수 0.15 ml에 재현탁시킨 양 세그먼트 모두의 합성 RNA 전사체를 OPTI-MEM-리포펙틴-혼합물에 첨가하여 가볍게 혼합하고, 얼음과 함께 5분간 인큐베이션시켰다. 60 mm 디쉬 중의 모노레이어로부터 "OPTI-MEM"을 제거한 후 이를 1.5 ml의 신선한 "OPTI-MEM"으로 대체시키고, 핵산함유 혼합물을 Vero 세포에 적가한다음 가볍게 교반하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션한 후, 혼합물을 5% FCS를 함유하는 M199배지 [CaCl2(무수물), Fe(NO3)3, 9H2O, KCl, MgSO4(무수물), NaCl, NaH2PO4H2O, NaHCO3, L-알라닌, L-아르기닌 HCl, L-아스파르트산, L-시스테인 HCl H2O, L-시스테인 2HCl, L-글루탐산, L-글루타민, 글라이신, L-히스티딘 HClH2O, L-히드록시프롤린, L-이소류신, L-류신, L-라이신 HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 2Na2H2O, L-발린, 알파 토코페롤 PO4Na2, 아스코르브산, 바이오틴, 칼시페롤, D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, I-이노시톨, 메난디온 NaHSO3 3H2O, 나이아신, 니코틴아미드, 파라-아미노벤조산, 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 A 아세테이트, 아데닌 SO4, 아데닐산, ATP, Na2, 콜레스테롤, 2-데옥시-D-리보스, D-글루코스, 글루타티온, 구아닌 HCl, 하이포잔틴 Na, 페놀 레드 Na, 리보스, 소듐 아세테이트 (무수물), 티민, Tween 80, 우라실, 및 잔틴 Na; Mediatech, Inc.제품]로 대체하고 (세포를 세정하지 않고), 세포를 다시 37℃에서 원하는 시간 간격을 두고 인큐베이션시켰다.
생산된 IBDV의 동정. pUC18FLA23 및 pUC18FLP2B의 전사체로 형질도입된 Vero 세포로부터의 여과 (0.2 μm) 상등액으로 CEC를 감염시켰다. 감염 16시간 후, 전 세포의 핵산을 분리하였다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995)). 공표된 서열에 따라 프라이머를 디자인하고 RT-PCR 단편을 증폭, 클로닝 및 서열결정하였다 (Mundt, E.외, Virology, 209, 10-18 (1995)). 서열 데이타를 "DNASIS" 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
면역형광. 커버 슬립 상에서 80% 집합도까지 생육된 Vero 세포들을 형질도입된 Vero 세포로부터 유도된 상등액으로 감염시키고 (동결-해동 후) 37℃에서 2일간 인큐베이션시켰다. 세포를 세정하고 아세톤으로 고정한 다음 폴리클로날 토끼 항-IBDV 혈청으로 처리하였다. 세정 후, 세포를 플루오레신 표지된 염소-항-토끼 항체 (Kirkegaard & Perry Lab)으로 처리하고 형광 현미경으로 검사하였다.
플라크 분석. 60 mm 접시에서 생육시킨 2차 CEC 모노레이어에 형질도입된 Vero 세포로부터 유도된 상등액을 접종하였다. 감염 1시간 후, 세포를 PBS로 1회 세정하고 10% 트립토스 포스페이트 브로쓰, 2% FCS, 0.112% NaHCO3, 103 단위 페니실린, 103μg/ml 스트렙토마이신, 0.25 μg/ml 펑기존, 0.005% 중성 레드, 0.0015% 페놀 레드를 함유하는 0.8% Agar 노블 (Difco)와 함께 오버레이시켰다. 세포들을 37℃에서 플라크가 관찰될 때까지에서 2 내지 3일간 인큐베이션시킨 다음 계수하였다 (Muller, H., 외, Virus Res., 4, 297-309 (1986)).
IBDV 게놈의 완전한 길이의 cDNA 클론의 구축. dsRNA 바이러스 IBDV의 역유전 시스템을 개발하기 위해, 균주 D78의 세그먼트 A와 균주 P2의 세그먼트 B를 함유하는 2개의 별도 cDNA 클론을 구축하였다 (도 1). 각각의 플라스미드는 구조 단백질 (VP2, VP4, VP3)의 전구체와 VP5를 코딩하거나 또는 오직 VP1 단백질 (RNA-의존성 RNA 폴리머라제)만을 코딩하였다. PstI을 이용하여 절단하고 T7 RNA 폴리머라제에 의해 생체외 전사한 플라스미드 pUC18FLBP2는 정확한 5'- 및 3'-말단을 함유하는 RNA를 생산한다. 반면, BsrGI으로 절단 및 전사시키면, 플라스미드 pUC19FLAD78을 정확한 5'-말단을 함유하나 3' 말단에 부가적으로 4개의 뉴클레오타이드를 함유하는 RNA를 생산하게 된다. 토끼의 망상적혈구 시스템에서 상기 플라스미드를 커플링된 전사 및 번역시키자, 정확히 프로세싱되고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 오토라디오그래피 상에서 분획화시킨 후 마커 IBDV 단백질과 함께 이동하는 단백질 산물이 생산되었다 (데이타 나타내지 않음).
감염성 바이러스의 전사, 형질도입 및 생산.
선형화된 완전한 길이의 cDNA 플라스미드를 템플레이트로서 사용하여 IBDV 세그먼트 A및 B의 플러스-센스 전사체를 생체외에서 T7 RNA 폴리머라제와 함께 생체외에서 별도로 합성하였다 (도 2 참조). RNA 전사체 2 종이 중성 겔상의 세그먼트 B에 대해 관찰되었지만 (레인 1 및 5), 변성 겔 상에서 이들 샘플의 분획화는 오직 하나의 전사-특이 밴드만을 생산하였다 (데이타 도시하지 않음). 감염성 바이러스를 생산하는데 두가지 모두의 세그먼트의 플러스-센스 RNA 전사체가 요구됨을 보여주기 위해, 전사 혼합물을 도 2에 도시된 바와 같이 상이한 뉴클리아제와 함께 인큐베이션시켰다. 전사 산물을 DNase 처리 (레인 1+2), RNase 처리 (레인 3+4) 또는 미처리 (레인 5+6)한 후 회수된 합성 RNA를 Vero 세포의 형질도입에 이용하였다. 모의 대조군으로서, 리포펙틴만을 사용하였다. 형질도입 5일 후, 미처리 또는 DNase-처리된 전사 산물의 결합 전사체로 형질도입된 Vero 세포에서는 세포변성 효과 (CPE: cytopathic effect)만이 관찰되었으나 RNase-처리된 전사 혼합물 또는 모의-형질도입된 대조군의 경우에는 그렇지 않았다. 또한, Vero 세포를 오직 A 또는 B의 RNA로 형질도입시키자 CPE가 전혀 관찰되지 않았다 (데이타 나타내지 않음). 이러한 결과는 IBDV의 두가지 모두의 세그먼트의 플러스-센스 ssRNA로 Vero 세포를 형질도입시킨 후 IBDV의 복제가 뒤따름을 입증하는 것이다. Vero 세포에서 CPE를 야기시키는 물질이 실제로 IBDV임을 입증하기 위해, 형질도입된 Vero 세포를 냉동-해동하고, 상등액을 원심분리에 의해 청정화한 다음, CEC 또는 Vero 세포를 감염시키는데 사용하였다. 미처리 또는 DNase- 처리된 전사 혼합물의 Vero 형질도입 세포로부터 유도된 상등액으로 감염된 CEC는 접종 1일 후 CPE를 발생시켰다 (표 2). 그러나, RNase-처리된 전사 혼합물, 미처리 세그먼트 A 또는 B 전사 혼합물의 형질도입 Vero 세포 및 모의-형질도입된 Vero 세포의로부터의 상등액의 CEC 중에서는 5일 후에도 CPE가 검색되지 않았다. 마찬가지로, 커버 슬립상의 Vero 세포를 상술한 바와 같은 동일한 상등액으로 감염시키고 2일 후 면역형광 염색에 의해 검사하자, 미처리 또는 DNA-se처리된 전사 혼합물의 형질도입된 Vero 세포의 상등액만이 양성 면역형광 시그날을 나타내었다 (표 2).
형질도입체 바이러스의 회수. 감염성 바이러스의 회수를 위한 시점을 결정하기 위해, 세그먼트 A 및 B의 결합된 RNA 전사체로 Vero 세포를 형질도입시켰다. 형질도입한지 4, 8, 16, 24, 36 및 48시간 경과 후, 도 3에 나타낸 바와 같이 감염성 및 플라크 분석에 의해 형질도입체 바이러스의 존재여부에 대해 상등액을 검사하였다. 본 발명자들의 결과는 바이러스가 형질도입 후 36시간만 지나면 회수될 수 있음을 가리킨다. 바이러스 역가는 2.3 x 102 pfu/ml였으며 이는 형질도입 48시간 후 얻어진 샘플에 대해 드롭되는 것으로 나타났다.
키메릭 바이러스의 생산. IBDV의 두가지 세그먼트 모두의 플러스-센스 ssRNA만으로 감염성 바이러스를 회수하는데 충분함을 입증하기 위해, 키메릭 IBDV를 생산하였다. 혈청형 II 균주의 세그먼트 A의 완전한 길이의 서열을 함유하는 플라스미드 pUC18FLA23을 NsiI 절단에 의해 선형화하고 ssRNA를 T7RNA 폴리머라제를 이용하여 생체외 합성하였다. ssRNA 전사체는 정확한 5'-말단을 나타내었으나 3'-말단에 하나의 부가적인 잔기를 추가로 함유한다 (도 1). Vero 세포를 혈청형 II 균주 23/82의 세그먼트 A의 ssRNA와 혈청형 I 균주 P2의 세그먼트 B의 ssRNA로 형질도입시켰다. CPE가 농후해질 때인 형질도입 5일 후, 상등액을 청정화 (냉동-해동 후)시켜 CEC를 감염시키는데 사용하였다. CEC에서 2차 계대 후, 바이러스의 게놈 RNA를 RT-PCR에 의해 분석하고 PCR 산물의 서열을 결정하였다. 혈청형 II 균주로부터 유도된 세그먼트 A 서열만을 특이적으로 증폭시키도록 세그먼트 A의 프라이머를 고안하였다. 세그먼트 B에 대한 프라이머는 두가지 모두의 혈청형 서열에 결합하였다. 증폭된 단편들을 클로닝시켜 서열결정하였다. 얻어진 세그먼트 A 서열은 혈청형 II 균주 23/82의 공지 세그먼트 A와 완전히 일치한 것으로 나타난 반면, 세그먼트 B 서열은 혈청형 I 균주 P2의 공표된 세그먼트 B 서열과 완전히 상동성을 나타내었다 (도 3).
클로닝에 이용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 조성 및 위치. T7 프로모터 서열은 이탤릭체로, 바이러스 특이 서열은 밑줄표시, 제한효소 위치는 굵은 글씨체로 나타내었다. 프라이머의 바이러스 특이서열의 배향은 센스 (+)와 안티센스(-)로 나타내었다. 프라이머가 결합하는 위치 (뉴클레오타이드 번호)는 P2균주의 공표된 서열에 따랐다 (2)
미처리 또는 DNase나 RNase로 처리한 전사 반응물로부터 유도된 세그먼트 A 및 B의 합성 RNA로 Vero 세포를 형질도입시켰다. 5일 후, 상등액을 수집하여 원심분리에 의해 청정화하고 바이러스의 존재여부에 대해 분석하였다. CEC에 대해, 회수된 바이러스의 감염성을 접종 1-2일 후 세포변성 효과 (CPE)가 나타나는지에 의해 결정하였다. 회수된 바이러스의 특이성을 토끼 항-IBDV 혈청으로 염색된 Vero 세포의 면역형광에 의해 측정하였다.
설명한 바와 같이 세그먼트 A 및 B의 합성 RNA로 Vero 세포를 형질도입시켰다. 회수된 바이러스의 감염성과 특이성을 각각 CEC 중 CPE 및 Vero 세포 중 면역형광 염색에 의해 검색하였다. 형질도입된 Vero 세포로부터 유도된 상등액을 세포에 접종한 후 2차 CEC의 모노레이어를 플라크 분석에 이용하였다. ml 당 플라크 형성 단위 (pfu/ml: plaque forming units)로서 대략적인 바이러스의 역가를 계산하였다.
서열목록
(1) 일반 정보:
(i) 출원인: VAKHARIA, Vikram N.
MUNDT, Egbert
(ii) 발명의 명칭: 합성 RNA 전사체로부터 버나바이러스를 생산하는 방법
(iii) 서열의 수: 34
(iv) 통신 주소:
(A) 주소: NIKAIDO, MARMELSTEIN, MURRAY & ORAM LLP
(B) 거리: 655 Fifteenth Street, N.W., Suite 330-G Street Lobby
(C) 시: Washingwon
(D) 주: DC
(E) 국가: USA
(F) 우편번호:20005-5701
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 종류: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 구동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30
(vi) 현재 출원 데이타:
(A) 출원번호: US
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(C) 분류
(viii) 변리사/agent 정보
(A) 성명: KITTS, Monica C.
(B) 등록번호: 36,105
(C) 참조/Docket 번호: P8172-6002
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(B) 위치: 131..3166
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(2) 서열 No. 30의 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1012 아미노산
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(ii) 분자 종류: 단백질
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(2) 서열 No. 31의 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 3264 염기쌍
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(C) 가닥: 단일
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(ii) 분자 종류: cDNA
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(A) 명칭/키이: CDS
(B) 위치: 97..531
(xi) 서열 설명: 서열 No. 31:
(2) 서열 No. 32의 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 145 아미노산
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(D) 형태: 선형
(ii) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 No. 32:
(2) 서열 No. 33의 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 3264 염기쌍
(B) 종류: 핵산
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(D) 형태: 원형
(ii) 분자 종류: cDNA
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(B) 위치: 131..3169
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(2) 서열 No. 34의 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1013 아미노산
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(ii) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 설명: 서열 No. 34:
Claims (24)
- 버나바이러스 (Birnavirus) 게놈 세그먼트 A 및 B의 하나 이상의 cDNA를 제조하고,상기 하나 이상의 cDNA를 전사하여 합성 RNA 전사체를 제조하고, 이 때, 상기 RNA 전사체는 상기 세그먼트 A 및 B의 플러스 센스 RNA 전사체이며,숙주 세포를 상기 합성 RNA 전사체로 형질도입하고,상기 숙주 세포를 배양 배지에서 인큐베이션시킨 다음,상기 배양 배지로부터 살아있는 버나바이러스를 분리하는 단계로 이루어지는, 살아있는 버나바이러스의 생산방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 버나바이러스가 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV: Infectious Bursal Disease Virus)인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 아프리카 녹색 원숭이 Vero 세포인 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 버나바이러스 게놈 세그먼트 A 및 B가 버나바이러스의 서로다른 균주로부터 별도로 제조된 것인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 세그먼트 A가 플라스미드 pUC19FLAD78 또는 pUC18FLA23에 존재하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 세그먼트 B가 플라스미드 pUC18FLBP2에 존재하는 방법.
- 버나바이러스 (Birnavirus) 게놈 세그먼트 A 및 B의 하나 이상의 cDNA를 제조하고, 이 때 상기 cDNA는 버나바이러스의 여러 균주로부터 유도된 것이며,상기 하나 이상의 cDNA를 전사하여 합성 RNA 전사체를 제조하고, 이 때, 상기 RNA 전사체는 상기 세그먼트 A 및 B의 플러스 센스 RNA 전사체이며,숙주 세포를 상기 합성 RNA 전사체로 형질도입하고,상기 숙주 세포를 배양 배지에서 인큐베이션시킨 다음,상기 배양 배지로부터 살아있는, 키메릭 버나바이러스를 분리하는 단계로 이루어져 생산되는 것을 특징으로 하는 살아있는 키메릭 버나바이러스.
- 제 7항에 있어서, 상기 버나바이러스가 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)인 살아있는 키메릭 버나바이러스.
- pUC19FLAD78, pUC18FLA23, 및 pUC19FLBP2로 구성된 군으로부터 선택된 플라스미드.
- 제 7항에 따른 살아있는 키메릭 버나바이러스를 함유하는 백신으로서, 상기 살아있는 키메릭 버나바이러스는 투여 전에 불활성화된 것이 특징인 백신.
- 제 10항에 있어서, 상기 버나바이러스가 감염성 점액낭 질환 바이러스 (IBDV)인 백신.
- 제 1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 가금류 세포인 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 가금류 세포가 닭 또는 칠면조 세포인 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 가금류 세포가 닭의 배의 섬유아세포 (chicken embryo fibroblast cells) 또는 닭의 배의 신장 세포인 방법.
- 세그먼트 A, 세그먼트 B 및 세그먼트 A와 B로 구성된 군으로부터 선택된 버나바이러스 게놈의 적어도 일부를 함유하며, 이들 세그먼트의 5' 및 3' 말단을 포함하는 cDNA.
- 제 15항에 있어서, 상기 cDNA가 버나바이러스의 두개 이상의 다른 균주로부터 항원 결정자 (determinants)를 함유하는 cDNA.
- 제 15항에 따른 cDNA의 하나 이상의 복제물로 구성된 재조합 벡터.
- 제 15항에 따른 cDNA로 부터 전사된 합성 RNA.
- 제 17항에 따른 재조합 벡터 또는 제 18항에 따른 합성 RNA로 형질 변환된 숙주 세포.
- 버나바이러스의 두개 이상의 다른 균주로부터 항원 결정소를 함유하는 살아있는, 키메릭 버나바이스.
- 제 20항에 따른 살아있는, 키메릭 버나바이러스를 함유하는 벡신.
- 버나바이러스 게놈 세그먼트 A 및 B의 하나 이상의 cDNA를 제조하고,상기 cDNA로부터 유도된 RNA를 사용하는 숙주세포에서 ds RNA의 복제를 개시하고,상기 숙주 세포를 배양 배지에서 인큐베이션시킨 다음,상기 배양 배지로부터 살아있는, 감염성 버나바이러스를 분리하는 단계로 이루어지는 살아있는, 감염성 버나바이러스의 생산 방법.
- 제 22항에 있어서, 상기 cDNA가 버나바이러스의 두개 이상의 다른 균주로부터 항원 결정소를 함유하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 상기 cDNA가 돌연변이 되는 방법.
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