ES2352344T3

ES2352344T3 - Dispositivo de microfluido para estudio de células.

Info

Publication number: ES2352344T3
Application number: ES05763452T
Authority: ES
Inventors: Mordechai Deutsch
Original assignee: Seng Enterprises Ltd
Current assignee: Seng Enterprises Ltd
Priority date: 2005-01-25
Filing date: 2005-07-26
Publication date: 2011-02-17
Anticipated expiration: 2025-07-26
Also published as: EP1866075B1; WO2006080000A1; US8481325B2; ATE480324T1; US8038964B2; EP1866075A1; US20090105095A1; DE602005023534D1; US20110275543A1

Abstract

Un dispositivo (46) para el estudio de células, que lleva hoyuelos, depresiones, tubos, o inclusiones de un tamaño que se acomodan a una o más células como picopozos, por medio de los cuales los picopozos tienen una dimensión de 1 a 200μm, Que comprende a) un portador (50) que tiene una superficie superior (48). b) Un arreglo de picopozo (18) sobre la superficie superior (48), c) Un reservorio de fluido (52) en comunicación fluida con el arreglo de picopozo (18) a través de al menos un cal capilar (54) y d) Una tapa (60) es movible con relación dicho portador (50) y Configurada para descansar por encima de dicho arreglo de picopozo (18), donde Dicho portador (50) es un componente unitario que tiene un arreglo en el picopozo (18), un reservorio de fluido (52), un canal capilar (54) como un reservorio de desperdicio (56), y un canal capilar de desperdicio (58), y una depresión (78) integralmente conformadas sobre este, por un arreglo de picopozo (18), parte de un componente que lleva un picopozo separado (93), donde dicho canal de desperdicio capilar (58) está en comunicación fluida con dicho arreglo de picopozo (18) y que comprende una meseta (47) sobre dicha superficie superior (48), en donde dicho arreglo ético (18) se localiza sobre dicha meseta (47) o en un depresión (78), en dicha meseta (47) donde una primera región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar (54) y una segunda región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar de desperdicio (58).

Description

Campo y Antecedentes de la Invención

La presente invención se relaciona con el campo de la biología celular y más particularmente, con un dispositivo y método mejorado para estudio de células. Específicamente la presente invención es de un dispositivo que incluye un arreglo de picopozo y conductos de fluido capilares.

Los métodos combinatorios en química, biología celular y bioquímica son esenciales para la preparación simultánea cercana de multitudes de entidades activas tales como moléculas. Una vez se prepara tal multitud de moléculas, es necesario estudiar el efecto de cada una de las entidades activas sobre un organismo vivo.

El estudio de los efectos de estímulos tal como la exposición a entidades activas sobre organismos vivos es preferiblemente de manera inicial efectuada en células vivas. En razón a que las funciones de la célula incluyen muchas células interrelacionadas, los ciclos y las reacciones químicas, el estudio de un agregado de células, sea un agregado homogéneo o heterogéneo no suministra unos resultados suficientemente detallados o interpretables: en su lugar un estudio comprensivo de la actividad biológica de una entidad activa puede ser efectuado de manera ventajosa al examinar el efecto de la entidad activa sobre las células vivas aisladas simples. Así, el uso de ensayos de células simples es una de las herramientas más importantes para entender los sistemas biológicos y la influencia sobre estas de varios estímulos tales como la exposición a entidades activas.

La preparación combinatoria de multitudes de entidades activas acopladas con la necesidad de estudiar el efecto de cada una de las entidades activas sobre los organismos vivos que utilizan ensayos de célula simple, requieren el desarrollo de ensayos de célula viva simple de alto rendimiento. Existe necesidad de estudio de respuestas en tiempo real a los estímulos en poblaciones de células grandes y heterogéneas a un nivel de célula individual. En tales estudios es esencial tener la capacidad de definir características múltiples de cada célula individual, así como también la respuesta de la célula individual a los estímulos experimentales de interés.

En la técnica, se conocen varios diferentes métodos para estudiar las células vivas.

Las placas multipozos que tienen 6, 12, 48, 96, 384 o aún 1536 pozos sobre una huella de ca. 8,5 cm por ca. 12,5 cm son bien conocidos en la técnica. Tales placas multipozo se suministran con un arreglo 2n por 3n de pozos empacados rectangulares, siendo un entero. El diámetro de los pozos de una placa depende del número de pozos y es generalmente mayor de aproximadamente 250 micrómetros (para una placa de 1536 pozos). El volumen de los pozos depende del número de los pozos y la profundidad del mismo pero generalmente es mayor de 5 x 10-6 litros (para una placa de 1536 pozos). La estandarización del formato de placa multipozo es una gran ventaja para los investigadores, que permiten el uso de productos estandarizados que incluyen dispositivos de manejo robótico, manejadores de muestras automatizadas, dispensadores de muestra, lectores de placa, componentes de observación, lavadores de placa, software y accesorios tales como multifiltros.

Las placas multipozo están comercialmente disponibles en muchos diferentes abastecedores. Las placas multipozo hechas de muchos diferentes materiales están disponibles, incluyendo pero no estando limitado a vidrio, plásticos, cuarzo y silicio. Las placas multipozo que tienen pozos donde la superficie interna está recubierta con varios materiales, tales como entidades activas son conocidas.

Aunque excepcionalmente útiles para el estudio de grandes grupos de células, las placas multipozo no son adecuadas para el estudio de células individuales a unos pequeños grupos de células debido al tamaño grande relativo a la escala celular, de los pozos. Las células mantenidas en tales pozos flotan alrededor de una solución o se adhieren a la superficie del pozo. Cuando las células flotan en un pozo, las células individuales específicas no son fácilmente encontradas para observación. Cuando las células se adhieren a la superficie del pozo, las células se adhieren a cualquier localización en el pozo, incluyendo cualquier parte sobre el fondo y las paredes del pozo. Tal variabilidad en la localización hace imágenes de alto rendimiento (por ejemplo para estudios morfológicos) que se inoculan como adquiriendo una célula individual y enfocarse sobre esta es extremadamente difícil. Ta variabilidad en la localización también hace un procesamiento de señal de alto rendimiento (por ejemplo, detección de luz emitida por una célula única o simple a través de procesos fluorescentes) que se inoculan a medida en que luz se debe recoger del área entera del pozo, disminuyendo la señal a un índice de ruido. Además, una célula mantenida en un pozo de placa multipozo puede ser física o químicamente manipulada (por ejemplo aislamiento o movimiento de una célula seleccionada única o un tipo único de célula, que cambia el medio o que introduce entidades activas) solo con dificultad. Además, la carga de las placas multipozo cuando se localizan sobre una célula por pozo, expresada en términos de células mantenidas de manera única en los pozos por unidad de área es muy baja (aproximadamente 1536 células en 65 cm2, o 24 células cm-2). Así, las placas multipozos son en general solo adecuadas para el estudio de agregados homogéneos o heterogéneos de células como un grupo.

Las placas multipozo son inadecuadas para el estudio de la apoptosis que sufren las células. Es conocido estudiar procesos biológicos al exponer una monocapa de células que se adhieren al fondo del pozo de una placa multipozo a un estimulo que origina la apoptosis. Sin embargo, una vez que la célula inicia con el proceso de apoptosis, la adhesión de la célula al fondo del pozo ya no es suficiente: la célula se separa del fondo y es llevada por corrientes de fluido incidental en el pozo. La célula ya no es observable y su identidad se pierde.

Las placas multipozo también son inadecuadas para el estudio de células no adherentes. Solo justo como células que sufren apoptosis, en placas multipozo las células que no se adhieren se pueden estudiar como individuos solo con dificultad. Esta es la principal desventaja en razón a que las células que no se adhieren son cruciales para investigar el descubrimiento de fármacos, terapias de célula madres, cáncer y detección de enfermedades inmunológicas, diagnostico y terapia. Por ejemplo, la sangre contiene 7 tipos heterogéneos de células no adherentes, todas las cuales efectúan funciones esenciales, desde llevar oxigeno a suministrar inmunidad contra una enfermedad.

En la técnica, un número de métodos y dispositivos se han desarrollado para el estudio de células individuales o un pequeño número de células, un grupo. Muchos de tales métodos son o están basados en utilizar un dispositivo que lleva picopozo. El dispositivo que lleva picopozo es un dispositivo para el estudio de células que tiene al menos un componente que lleva picopozo para el estudio9 de células. Un componente que lleva picopozo es un componente que tiene al menos una pero generalmente una pluralidad de picopozos, cada picopozo configurado para mantener al menos una célula. El término “picopozo” es general e incluye características tales como encrespaduras, depresiones, tubos e inclusiones. En razón a que el rango de células en tamaño desde aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 (o aún más) micrómetros de diámetro no existe un tamaño de picopozo único que sea apropiado para mantener una célula única de cualquier tipo. Dicho eso, las dimensiones del picopozo individual típico en los componentes que llevan picopozo conocidos en la técnica tienen invenciones de entre aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 200 micrómetros, dependiendo de la implementación exacta. Por ejemplo, un dispositivo diseñado para el estudio de células de 20 micrones aislados únicas típicamente tienen picopozos de dimensiones de aproximadamente 20 micrómetros. En otros casos, se utilizan picopozos mayores para estudiar la interacción de unas pocas células mantenidas juntas en un picopozo. Por ejemplo, un picopozo de 200 micrómetros se reconoce al ser utilizado para el estudio de interacciones de 2 o 3 células, ver Solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 Publicada como WO03/035824.

Una característica que incrementa la utilidad del dispositivo que lleva picopozo es que cada picopozo individual es individualmente dirigible. Por direccionamiento individual se quiere decir que cada picopozo se puede registrar, encontrar, observar, estudiar sin observación continua. Por ejemplo, aunque las células se mantengan en picopozos de un componente que lleva picopozo, cada célula se caracteriza y el respectivo picopozo en donde estas células se mantienen se nota. Cuando se desea, el componente de observación del dispositivo que lleva picopozo es dirigido al sitio del picopozo donde se mantiene una célula específica. Un método de implementar la direccionamiento individual es mediante el uso de puntos fiduciales con otras características (tales como signos o etiquetas), generalmente en el componente que lleva picopozo. Otro método de implementar la direccionamiento individual al disponer los picopozos en un arreglo de picopozo y encontrar un picopozo deseado específico al contar. Otro método de implementar la direccionamiento individual es el suministrar un componente de observación dedicado para cada picopozo.

En la técnica, el componente que lleva picopozo de un dispositivo que lleva picopozo es a menudo un chip, una placa u otro componente sustancialmente plano. Aquí, tal componente es denominado un “portador”. En la técnica, también existen componentes que llevan picopozo no portadores de dispositivos que llevan picopozo, por ejemplo, manojos de fibras o manojos de tubos.

Mrksich y Whitesides, Ann, Rev, Biophis. Biomol. Struct. 1996 25, 55-78; Craighead et al.,

J. Vac. Sci. Technol. 1982, 20, 316; Singhvi et al., Science 199, 264, 696,-698; Aplin and Hughes, Analyt. Biochem. 1981, 113, 114-148 y la Patente U.S. No. 5, 324, 591 todas enseñan dispositivos que incluyen arreglos de manchas de entidades que atraen células o que se unen a células sobre una placa. En tales dispositivos, las manchas sirven como picopozos, que unen células a través de una variedad de uniones químicas. En tales dispositivos, la placa es el componente que lleva picopozo del dispositivo. Debido al tamaño de las manchas, cada uno de tales picopozos generalmente mantiene más de una célula. Para reducir la interacción entre las células mantenidas en diferentes picopozos, las manchas se deben espaciar relativamente alejadas, reduciendo la carga como se expresa en términos de picopozos por unidad de área. Aún con espaciamiento generoso, en tales componentes que llevan picopozo se mantienen células que no están completamente aisladas de la interacción mutua no pueden las células estar sometidas a manipulación individual. El hecho de que las células no floten libremente pero estén unidas a la placa a través de una interacción necesariamente compromete los resultados de los experimentos efectuados.

En la Patente No. US 6, 103, 479 el componente que lleva picopozo es un portador transparente suministrado con un arreglo no uniforme de picopozos, cada pozo funcionalizado con entidades químicas que se unen a las células específicamente o no específicamente. Cada picopozo es de aproximadamente 200 a 1000 micrómetros de diámetro y se configura para mantener una pluralidad de células. Las áreas interpicopozo son hidrófobas con el fin de no atraer las células. Además del portador, un dispositivo de la Patente US No. 6, 103, 479 se suministra con una placa que lleva una cámara de vidrio, plástico o silicio en la cual los canales microfluídicos individualmente dirigibles son gravados por agua fuete, la placa que lleva la cámara configurada para casar con el portador. Cuando casa, el portador y la placa que lleva la cámara constituye un casete en el cual cada célula se une al potador y se aísla en una cámara suministrada con un sistema de suministro de fluido individual. Los reactivos se suministran a través del sistema de suministro de fluido y se observan mediante la detección de fluorescencia. Con el fin de suministra espacio para las paredes de las cámaras, las áreas de interpicopozo del portador son relativamente grandes, reduciendo la carga como se expresa en términos de picopozo por unidad de área. Posteriormente al estudio, el casete se separa en dos partes y el arreglo micropratonado de células procesadas adicionalmente. En algunas realizaciones, la placa que lleva la cámara se hace de politetrafluoroetileno, polidimetilsiloxano o un elastómero. En razón a que las células mantenidas no hacen contacto con la placa que lleva la cámara no es claro que ventajas se produzca cuando se suministra una placa que lleva la cámara de tales materiales esotéricos.

En la Solicitud de Patente U.S. No.10/199, 341 se ensaña un dispositivo para tratar una pluralidad de objetos dieléctricos (tales como células, cada objeto individual es un haz de luz individual producido mediante un arreglo óptico.

En la Patente US No. 4,729, 949, se enseña un dispositivo que atrapa células individuales en un portador que lleva picopozo, el portador es sustancialmente una placa que tiene una pluralidad de picopozos que son aberturas abusadas individualmente dirigibles de un tamaño para mantener las células individuales. La succión aplicada desde la superficie de fondo de la placa donde los picopozos son estrechos crea una fuerza que arrastra las células suspendidas en un fluido por encima del portador en el extremo ancho de los picozos sobre la superficie del portador para ser mantenidas allí. Utilizando las enseñanzas de la Patente U.S. No. 4,729, 949 un grupo específico de células (que tienen dimensiones similares a aquellas del extremo amplio de los picopozos) se seleccionan dentro de un grupo de células y se mantienen en el portador. Aunque las células son sometidas a un estímulo común, el hecho de que los picopozos son individualmente dirigibles permute el efecto de un estímulo sobre una célula individual para ser observada. Un portador de la Patente U.S. No. 4, 729, 949 se hace generalmente de metal tal como níquel se prepara utilizando técnicas de foto resistencia y electroplateo estándar en un portador de la Patente U.S. No. 4, 729, 949, las áreas interpicopozo del portador son relativamente grandes, que conducen a una carga baja, expresada en términos de picopozos por unidad de área. Además, la succión requerida para mantener las células en picopozos de un portador de la Patente U.S. No. 4, 729, 949, deforma las células mantenidas y hace una porción significativa de las membranas celulares no disponibles para contacto, ambos factores comprometen potencialmente los resultados experimentales. El estudio de células mantenido en un portador de la Patente U.S. No. 4, 729, 949, con los métodos no basados en detectar fluorescencia generalmente dan pobres resultados debido a las reflexiones de la luz sobre el portador.

De la solicitud de Patente U.S. No. 99/04473Publocada como WO99/45357 se enseña un componente que lleva picopozo producido al someter a agua fuerte los extremos de manojo de fibras ópticas (aparentemente de vidrio) aunque dejando el revestido intacto para formar un componente que lleva picopozo que es un manojo de tubos. El tamaño de los picopozos hexagonales se demuestra que es tan pequeño como de 7 micrómetros de ancho, 5 micrómetros de profundidad y tiene un volumen total de aproximadamente 1,45 x 10-13 litros. El área de interpicopozo es muy larga debido al grosor de la cubierta de las fibras ópticas. La luz emitida por las celdas mantenidas en cada picopozo es independientemente observable a través de una fibra óptica respectiva. En algunas realizaciones, la superficie interna de los picopozos es recubierta con una película de materiales tales como colágeno, fibronectina, polilisina, polietilenglicol, poliestireno, fluoróforos, cromóforos, tintes o un metal. Cargar el componente que lleva el picopozo de la solicitud de Patente PCT No. US 99/04473 incluye sumergir el manojo de fibra óptica en una suspensión de célula de tal manera que las células se adherían a los picopozos. Existe un número de desventajas a las enseñanzas de la Solicitud de Patente PCT No. US 99/04473. El hecho de que las células sean estudiadas solo posteriormente a la adhesión de los picopozos necesariamente influencia los resultados de los experimentos efectuados. En razón a que la proliferación de células generalmente inicia poco después de la adhesión, no se sabe si una señal detectada es producida por una célula única o una pluralidad de células. No es claro donde exactamente en un picopozo se mantiene una célula y por lo tanto que porcentaje de la luz emitida de la célula viaja a un detector. El hecho de que la luz emitida viaje a través de una fibra óptica produce una pérdida de información dependiente de tiempo y de fase.

En la Solicitud de Patente PCT Publicada No. IL04/00192 de la solicitante presentada el 26 de febrero del 2004 se enseña un componente que lleva picopozo producido al poner el manojo junto a los capilares de vidrio, cada capilar de vidrio fluyó a un generador de flujo de fluido independiente tal como una bomba. Una célula mantenida en un primer picopozo se transfiere a un segundo picopozo mediante la aplicación simultánea de un flujo externo desde el primer picopozo y un flujo interno hacia el segundo picopozo.

Un dispositivo preferido ara el estudio de las células se describe en la Solicitud de Patente presente No. IL01/00992 Publicada como WO 03/035824 del solicitante. El dispositivo 10 descrito en la Figura 1, se suministra con un portador transparente 12 como un componente que lleva picopozo. El portador 12 es sustancialmente una lámina de material transparente (tal como vidrio o poliestireno) sobre la superficie cuyas características tales como conectores internos 14 canales de fluido 16, picopozos (en la Figura 1), un arreglo de picopozo 18, un reservorio de fluido 20 y un conector externo 22. El portador 12 es mantenido de manera inmóvil en un soporte 22 que tiene una ventana de corte de un tamaño y forma para aceptar el potador 12. Otros componentes del dispositivo 10 no descritos incluyen generadores de reflujo, componentes de observación, tubería externa y similar. Cuando una cubierta (no descrita)

Se forma integralmente con el portador 12, los canales de fluido 16, el arreglo de picopozo 18 y el reservorio 20 se sellan formando canales que permiten el transporte de fluidos y los reactivos a las células mantenidos en el arreglo de picopozo 18. Los picopozos se configuran para mantener un número predeterminado de células (una o más) de un cierto tamaño y son preferiblemente manejables de manera individual tanto para examen como para manipulación.

La Figura 2 es una reproducción de una fotografía de un portador diferente a 26 mantenido en un soporte 24. Una primera jeringa 28 como generador de flujo interno está en comunicación con un conector interno 14, mediante un tubo capilar 30. El conector interno 14 está en comunicación fluida con el arreglo de picopozo 18 a través de un pasaje de fluido. El arreglo de picopozo 18 está en comunicación fluida con el conector externo 22 a través de un pasaje de fluido. una segunda jeringa 22 como un generador de flujo externo está en comunicación con el conector externo 22 a través del tubo capilar 34.

La Solicitud de Patente PCT No. Il01/00992 también enseña métodos de manipular físicamente las células mantenidas en un dispositivo que lleva un picopozo utilizando, por ejemplo, micro electrodos individualmente manejables (encontrados en los picopozos o en la grada de cubierta)

o las pulsas ópticas. Las manipulaciones físicas típicas incluyen mover las células seleccionadas hacia adentro y fuera de los picopozos específicos. Un método útil que se implementó utilizando un dispositivo de la solicitud de Patente PCT No. ILO1/00992 es que las células, mantenida cada una sola en un picopozo respectivo, se examinan (en la presencia o ausencia reactivos) y con base en los resultados del examen, las células con una cierta característica se selecciona para permanecer en un picopozo respectivo mientras que las células sin ciertas características se remueven de un picopozo respectivo y se inyecta mediante la aplicación de un flujo en paralelo a la superficie del portador, generado mediante un generador de flujo.

En una característica adicional de la enseñanza de la solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 es que, en algunas realizaciones, los picopozos se yuxtaponen, esto es, el área ocupada por un arreglo de picopozo es hecha sustancialmente de manera completa de picopozos con poca o ninguna área de picopozo, ver Figura 3. La Figura 3 es una reproducción de una fotografía o parte de un arreglo de picopozo 18 desde la parte superior de un portador 12 de la solicitud de Patente PCT No. IL01/00992. En la Figura 3 se ve una pluralidad de picopozos hexagonales 36, algunos poblados con células vivas 38 Se ve que en las áreas de interpicopozo 40 figura solamente un porcentaje en el orden total del arreglo del picopozo 18. Esta característica permite el empaque de las células con densidad de tejido cercano, especialmente en unas configuraciones de picopozo de células únicas. Por ejemplo, un dispositivo típico de la solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 que tiene un arreglo de picopozo de 2 mm por 2 mm de picopozos yuxtapuestos hexagonalmente empacados de un diámetro de 10 micrómetros y sin área de interpicopozo incluye aproximadamente 62000 picopozos mientras que un dispositivo que tiene un arreglo de picopozo de 2 mm por 2 mm de picopozos yuxtapuestos hexagonalmente empacados de un diámetro de 20 micrómetros y sin un área de interpicopozo incluye aproximadamente 10000 picopozos.

Esta característica también permite la carga de picopozo única: en un fluido que contiene las células suspendidas se introduce en el volumen por encima del arreglo del picopozo. En razón a que hay poca área de interpicopozo, las células se asientan en los picopozos.

A pesar de la utilidad sin paralelo de un dispositivo 10 de la Solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 como se describió en la Figura 1 y en la Figura 2, un dispositivo tal como el 10 tiene numerosas desventajas. Una primera desventaja es aquella de la complejidad. La necesidad de generadores de flujo (por ejemplo jeringas 28 y 32) y las interfaces concomitantes de materiales no similares incrementa la complejidad del dispositivo 10, incrementa el esfuerzo y el gasto requerido en el dispositivo de forjado 10 e incrementa la dificultad del uso del dispositivo 10. Una segunda desventaja es que las dificultades en el uso del dispositivo que incluye cargar, unir los generadores de flujo y similares producen la integración de un dispositivo 10 con un sistema robótico para el uso completamente automatizado impráctico.

Adicionalmente la WO-A-03/052375, la US-A-2002/182627 y la US-A-2003/082632 describe cada una un dispositivo microfluídico y un proceso para estudiar células vivas en este. Las células se pueden colocar en lugares discretos en el dispositivo tal como en los pozos. Los dispositivos comprenden canales microfluídicos, reservorios de suministro de fluido, medios de recolección de desperdicio y una tapa. La acción capilar se enseña para las mecánicas del fluido.

Sería altamente ventajoso tener un dispositivo para el estudio de las células que no tenga al menos alguna de las desventajas de la técnica anterior.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención maneja exitosamente al menos algunos de los inconvenientes de la técnica anterior al suministrar un dispositivo que lleva picopozo para el estudio de las células. Una de las ventajas primarias de un dispositivo de la presente invención es la simplicidad de la elaboración y la facilidad de uso.

La simplicidad le permite al dispositivo ser desechable, una ventaja cuando se estudian sustancias biológicas peligrosas tales como agentes patógenos.

La invención se define mediante las reivindicaciones finales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La invención se describe aquí, por vía de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos que la acompañan. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se enfatiza que los detalles particulares mostrados son por vía de ejemplo y los propósitos de la discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención solamente, y están presentes en el caso de suministrar lo que se cree que es más útil y facilitar el entendimiento de la descripción de los principios y los aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se ha hecho intento de mostrar detalles estructurales de la invención con más detalle de lo que es necesario para un entendimiento fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos haciendo evidente a aquellos expertos en la técnica como varias formas de la invención pueden tener realizaciones en la práctica.

En los dibujos:

Figura 1 (técnica anterior) describe un dispositivo que lleva picopozo para el estudio de las células de solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 que incluye un portador transparente;

Figura 2 (técnica anterior) es una reproducción de una fotografía de un dispositivo que lleva picopozo de la solicitud de Patente PCT No. IL01/00992;

Figura 3 (técnica anterior) es una reproducción de una fotografía de un arreglo de pozo poblado de células de un portador de un dispositivo que lleva picopozo de la solicitud de patente PCT No. IL01/00992;

Figura 4A, 4B y 4C describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo para el estudio de células de la presente invención;

Figura 5 describe la carga de un arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva picopozo a la presente invención con células;

Figura 6 describe el asentamiento de las células cargadas sobre un arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención; La Figura 7 describe una pluralidad de células mantenidas en los picopozos de el arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención;

Figura 8 describe un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención donde el arreglo de picopozo se abre al ambiente;

Figura 9 describe la tapa del dispositivo que lleva picopozo de la presente invención se traslada deslizantemente a una posición de descanso predeterminada sobre el portador;

La Figura 10 describe la adición de una solución de lavado al reservorio de fluido de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención con el fin de lavar las células mantenidas en el arreglo de picopozo respectivo;

La Figura 11 describe la adición de la solución de teñido al reservorio de fluido de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención con el fin de teñir las células mantenidas en el arreglo de picopozo respectivo;

La Figura 12 describe un arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva picopozo a la presente invención desde una vista superior que muestra una solución de teñido que desplaza una solución de lavado en el respectivo arreglo de picopozo.

La Figura 13 describe la tapa de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que se traslada deslizantemente a una posición de descanso predeterminada sobre el portador;

La Figura 14 describe la tapa del dispositivo que lleva un picopozo de la presente invención que se traslada deslizantemente a una posición de descanso predeterminado sobre el portador para sellar sustancialmente el reservorio del fluido, el canal capilar y el arreglo de picopozo desde el ambiente para reducir la evaporación de los fluidos;

La Figura 15 describe un dispositivo de observación en uso para estudiar las células mantenidas en una regla de picopozo de la presente invención;

La Figura 16 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que tiene tres arreglos de picopozo;

La Figura 17 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que tiene ranuras para acoplamiento de la tapa en el respectivo portador;

La Figura 18 describe un dispositivo o para el estudio automatizado de las células de la presente invención que incluye un dispositivo que lleva picopozo, una tapa movible, un componente que mueve la tapa, tres componentes que dispersan fluido y un sistema de control.

La Figura 19 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que consiste esencialmente de cuatro componentes;

La Figura 20 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que consiste esencialmente de tres componentes;

La Figura 21 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que consiste esencialmente de tres componentes;

La Figura 22 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que consiste esencialmente de dos componentes;

La Figura 23 describe una realización de un dispositivo que lleva picopozo de la presente invención que tiene un portador adelgazado en la vecindad del arreglo de picopozo en la sección transversal desde el lado.

REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención es un dispositivo que lleva un picopozo para el estudio de las células que incluye un arreglo de picopozo y un reservorio de fluido en comunicación fluida con los picopozos a través de canales capilares. La presente invención también es un dispositivo que lleva picopozo para el estudio de células que incluye un arreglo de picopozo y una tapa móvil. La presente invención es también un método automatizado para estudiar células. La presente invención es también un dispositivo para el estudio automatizado de células que incluye un dispositivo que lleva un picopozo que tiene un arreglo de picopozo, una tapa móvil asociada con el dispositivo que lleva picopozo, un componente móvil de tapa, al menos un componente de suministro de fluido y un sistema de control configurado para operar sustancialmente de manera automática.

Los principios y usos de las enseñanzas de la presente invención pueden ser mejor entendidos con referencia a la descripción que la acompaña, las figuras y los ejemplos. En las Figuras, los numerales de referencias similares se refiere a partes similares en todo sitio.

Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio en la presente invención incluyen técnicas de los campos de biología, química, ingeniería y física. Tales técnicas son completamente explicadas en la literatura.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la invención. Además, las descripciones, materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Los métodos y los materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención.

Como se utilizan aquí, los términos “que comprende ”y “que incluye” o las variantes gramaticales de los mismos deben ser tomadas como especificaciones de las características establecidas, enteros, etapas o componentes pero no precluyen la adición de una o más características, enteros, etapas, componentes o grupos adicionales de los mismos. Este término comprende el término que “consiste de” y “que consiste esencialmente de”.

La frase “que consiste esencialmente de” olas variantes gramaticales de las mismas cuando se utilizan aquí se deben tomar como especificando las características establecidas, los enteros, las etapas

: o los componentes pero no precluyen la adición de una o más características adicionales, enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos sino solamente sin las características, enteros, etapas, componentes o grupos adicionales de los mismos no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, dispositivo o método reivindicado.

El término “método” se refiere a las maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada que incluye, pero no está limitada, a aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, o fácilmente desarrollados de maneras conocidas, técnicas medios y procedimientos por los practicantes de las técnicas químicas, fármaco biológicas, biológicas, bioquímicas y médicas. La implementación de los métodos de la presente invención involucra efectuar

: o completar tareas o etapas seleccionadas manualmente, automáticamente, o una combinación de las mismas.

Aquí, el término “entidad activa” se entiende por incluir entidades químicas, biológicas o farmacéuticas que incluyen cualquier sustancia química sintética o biológica que influencie una célula y con la cual la entidad está en contacto. Las entidades activas típicas incluyen pero no están limitadas a ingredientes farmacéuticos activos, anticuerpos, antígenos, materiales biológicos, materiales químicos, compuestos cromatogénicos, fármacos, enzimas, zonas fluorescentes, inmunógenos, indicadores, ligandos, ácidos nucleicos, nutrientes, péptidos, medios fisiológicos, proteínas, receptores, toxinas selectivas y toxinas.

Aquí, por “indicador” significa cualquier entidad activa que luego de la interacción con algún estímulo produce un efecto observable. En el contexto de la presente invención por estímulo significa, por ejemplo, una segunda entidad activa (tal como una molécula liberada) mediante una célula y por un efecto observable se significa, por ejemplo, un efecto visible, por ejemplo un cambio el color o emisión de luz.

Aquí, por “arreglo de picopozo” se significa un grupo de uno o más picopozos, preferiblemente una pluralidad de picopozos, preferiblemente una pluralidad de picopozos dispuestos en una forma ordenada.

Algunas realizaciones de la presente invención incluyen componentes que son transparentes

o se hacen de un material transparente. Por “transparente” se significa que el componente o material y sustancialmente transparente a al menos una longitud de onda de luz (preferiblemente un rango de longitudes de onda) en al menos parte del espectro de luz visible, el espectro de luz ultravioleta y/o de radiación infrarroja, preferiblemente el espectro de luz visible.

Es importante notar que algunas realizaciones de la presente invención se relacionan con realizaciones de la Solicitud de Patente PCT publicada No. IL04/00571 de la solicitante Presentada el 27 de junio 2004. En la Solicitud de Patente PCT No. IL04/00571 se enseñan portadores que llevan picopozos que tienen una variedad de características innovadoras. Respecto a las enseñanzas de la Solicitud de Patente PCT No. IL04/00571 es de picopozos configurados para influenciar la proliferación de células de las células mantenidas allí. En una realización, los portadores que tienen picopozos de un tamaño cambiable se enseñan. En otra realización, los portadores configurados para retrasar la proliferación de células mantenidas allí, por ejemplo al retrasar o evitar la adhesión de célula, se enseña. En otras realizaciones, se enseña a los portadores configurados con el fin de permitir en las células crecer en y a través del portador. Las realizaciones anteriormente descritas son preferiblemente implementadas al elaborar los picopozos de o recubrir los picopozos de un material con las propiedades deseadas. En algunas realizaciones, la superficie interna de un picopozo con la cual la célula mantenida hace contacto se configura para tener la propiedad deseada. La propiedad, influencia o efecto deseado. Los materiales preferidos de los cuales se hacen los portadores listados en la Solicitud de Patente PCT No. IL04/00571 incluyen polidimetilsiloxano, elastómeros (tales como caucho de silicio), moléculas de para-xilileno polimerizadas, derivados polimerizados de moléculas de para-xilileno y geles (especialmente hidrogeles). En algunas realizaciones, la superficie interna de un picopozo con la cual una célula mantenida hace contacto se configura para tener la propiedad, influencia o efecto deseado.

Un aspecto adicional de la solicitud de Patente PCT No. Iil04/00571 es la enseñanza de una cubierta de gel para los componentes que llevan picopozo. La cubierta de gel se configura para evitar que las células mantenidas en un picopozo salgan del picopozo debido al empujón, los flujos de fluido incidentales o durante el movimiento del portador.

Las ventajas de un portador que lleva picopozo hecho de un gel, de una cubierta de gel de picopozo o de un portador de gel cubierto con una cubierta de gel influye, dependiendo de la realización, que las entidades activas se puedan integrar en el gel, que las entidades activas se puedan poner en contacto con la célula mediante difusión a través del gel, que la difusión de los compuestos liberados se haga lenta permitiendo la identificación de la cual la célula liberó un compuesto dado, que la proliferación de las células mantenidas allí se retrase pero que una vez las células inician la proliferación, y que permita la proliferación en y a través del matiz de gel.

Dispositivo que lleva picopozo de la presente invención

Un dispositivo que lleva picopozo 46 de la presente invención, consiste esencialmente en tres componentes: el portador 50, la tapa 60 y el portador de tapa 61 se describen, entre otros, en las figuras 4A (sin la tapa 60 y con el soporte de tapa 61), 4B (soporte de tapa 61 no descrito) y 4C. Un arreglo de picopozo 18 se encuentra en una depresión encontrada en una meseta 47 o una superficie superior 48 del portador 50, las Figuras 4A y 4C. La meseta de flaqueo 47 son espacios 66. En cada uno de los dos lados del portador 50 se encuentra rieles 64, cada riel incluye una repisa de riel 65 y una pared de riel 67.

Como se describió en la Figura 4B, 4C, la tapa 60 se configura para ajustar el portador 50 sustancialmente en paralelo con la superficie superior 48, descansando sustancialmente sobre la meseta 47 y la repisa de riel 65. El soporte de tapa 61 se configura para ajustar sobre la tapa 60 y para acoplar el portador 50 (por ejemplo al “ajustar a presión en el sitio” ) con el fin de asegurar la tapa 60 al potador 50 y permitir al dispositivo 46 ser mantenido son tocas o contactar ninguna de las partes sensibles o delicadas. Cuando está en su lugar, la tapa 60 es confinada lateralmente por paredes de riel 67 confinadas verticalmente por un soporte de tapa 61 pero es axialmente deslizable en paralelo con la superficie superior 48. Además, la interface entre la parte superior de la mezcla 47 y la tapa 60 definen un espacio de grosor capilar blanqueado por espacio 66, el espacio de grosor capilar que constituye el reservorio de fluido 52 y el capilar 54 corriente arriba del arreglo de picopozo 18 y el canal de capilar de desperdicio 58 y el reservorio de desperdicio 56 corriente abajo del arreglo de picopozo 18. Cuando la tapa 60 se coloca sustancialmente en paralelo con la superficie superior 48, una gota de fluido colocada en contacto con el extremo 74 de la tapa 60 sobre la meseta 47 (que constituye una parte de reservorio de fluido 52) es arrastrada por acción capilar hacia y pasando el reservorio de fluido 52, a través del canal capilar 54 sobre y pasando el arreglo de picopozo 18, a través de los canales capilares de desperdicio 58 y hacia afuera del reservorio de desperdicio 56, ver Figura 4C.

En el portador 50, el límite entre el canal capilar de desperdicio y el reservorio de desperdicio 56 no se delimita claramente: el canal capilar de desperdicio 58 es la región corriente debajo de la meseta 47 próximo al arreglo de picopozo 18 mientras que el reservorio de desperdicio 56 es sustancialmente una sección de meseta más amplia y larga 47 corriente abajo del canal capilar de desperdicio 58.

En el portador 50, el límite entre el reservorio de fluido 52 y el canal capilar 54 no se define claramente: el canal capilar 54 es la región de la meseta 47 próxima al arreglo de picopozo 18 y corriente arriba de la misma mientras que el reservorio de fluido 52 es sustancialmente una región de la meseta 47 corriente arriba del canal capilar 54. Se puede decir aún que el reservorio de fluido 52 es sustancialmente la región de la meseta 47 que está en proximidad al extremo 74 de la etapa 60 cuando la etapa 60 está en el lugar sustancialmente en paralelo con la superficie superior 48 como se describió en la Figura 4C.

En el dispositivo 46, la regla de picopozo 18 está en comunicación fluida con el reservorio de fluido 52 a través del canal capilar 54. La regla de picopozo 18 está en comunicación fluida con el reservorio de desperdicio 56 a través del canal capilar de desperdicio 58.

En un dispositivo que lleva picopozo 46 que incluye un portador 50, el área de la meseta 47 que constituye una parte del reservorio de fluido 56 y un canal capilar de desperdicio 58 es relativamente grande comparado con el área de la meseta 47 que constituye una parte del reservorio de fluido 52 y del canal capilar 54. Así cuando la tapa 60 se coloca el volumen de desperdicio del reservorio de desperdicio 56 y el canal capilar de desperdicio 58 es significativamente mayor que el volumen de reservorio definido 52 y el canal capilar 54. El fluido colocado en el reservorio de fluido 52 es por lo tanto eficientemente arrastrado desde el reservorio de fluido 52 a través del canal capilar 54 pasando el arreglo de picopozo 18 al reservorio de desperdicio 56. Cuando un reservorio de desperdicio 56 se llena su capacidad, el flujo capilar que pasa el arreglo de picopozo 18 cesa efectivamente. Así, en las Figuras 4A y 4C, el dispositivo que lleva el picopozo 46 se describió teniendo un elemento absorbente 68 en comunicación fluida con el reservorio de desperdicio 56. El fluido que pasa al canal capilar de desperdicio 58 es arrastrado hacia el elemento absorbente 68, una pieza de papel de filtro absorbente. El elemento absorbente 68 incrementa efectivamente el volumen del reservorio de desperdicio 56.

En un dispositivo que lleva un picopozo 46, el canal capilar de desperdicio 58 es un canal capilar único que esta sustancialmente definido por la interfaz de la tapa 60 y la meseta 47. Por lo tanto, la tapa 60 es un componente de canal capilar de desperdicio 58. En las realizaciones de la presente invención, existe más de un canal capilar de desperdicio 58. En la realización de la presente invención (no descritas) una o más canales capilares de desperdicio 58 son canales del transportador 50 y no están definidos por una tapa 60.

En un dispositivo que lleva un picopozo 46, el canal capilar 54 es un canal capilar único que está sustancialmente definido por la interface de la tapa 60 y la meseta 47. Por lo tanto. La tapa 60 es un componente del canal capilar 54. En las realizaciones de la presente invención, existe más de un canal capilar 54. En las realizaciones de la presente invención (no descritas) uno o más canales capilares 54 son canales dentro de un portador 50 y no están definidos por una tapa 60.

Una ventaja del hecho de que la tapa 60 sea un componente del canal capilar 54 en un dispositivo que lleva un picopozo 46 es que la posición de la tapa 60 relativa al portador 50 varía las características de la comunicación fluida entre el reservorio del fluido 52 y un arreglo de picopozo 18. Específicamente, la posición de la tapa 60 determina la longitud (consecuentemente el volumen) del canal capilar 54 y así influencia la taza de flujo del reservorio de fluido 52 y un arreglo de picopozo

18.

Es importante notar que el dispositivo que lleva picopozo 46 de la presente invención a la región de meseta 47 que constituye la parte del reservorio del fluido 52 es simplemente un continuo más amplio de la región de meseta 47. Esta constituye una parte del canal capilar 54. En las realizaciones de la presente invención (no descritas) el reservorio de fluido 52 es sustancialmente una parte del canal capilar 54. También es importante notar que el dispositivo que lleva picopozo 46 de la presente invención la región de meseta 47 que constituye la parte del reservorio de desperdicio 56 es simplemente un continuo más amplio de la región de meseta 47 que constituye una parte del canal capilar de desperdicio 58. En las realizaciones de la presente invención el reservorio de desperdicio 56 es sustancialmente una parte del canal capilar de desperdicio 58.

Es una ventaja tener acceso al arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva el picopozo respectivo de la presente invención para permitir cargar las células mediante sedimentación (discutidas en lo sucesivo y en la solicitud de Patente PCT No. IL01/00992 de la invención) aún al mismo tiempo una característica de realizaciones de un dispositivo de la presente invención es que el fluido es transportado hacia y desde el arreglo de picopozo por acción capilar. Es por lo tanto ventajoso que la tapa sea movible o removible para permitir el acceso al arreglo de picopozo de un dispositivo que lleva el picopozo respectivo de la presente invención. Además, como se anotó anteriormente, en las realizaciones de la presente invención es útil cambiar la posición de una tapa con relación a un portador respectivo, por ejemplo con el fin de modificar la tasa de flujo desde un reservorio de fluido del portador al respectivo arreglo de picopozo.

Es generalmente preferible que la tapa 60 tenga al menos dos posiciones de descanso sustancialmente diferentes con relación al picopozo 18. Por “posición de descanso sustancialmente diferente” quiere decir, por ejemplo, que hay una diferencia sustancial en la configuración o desempeño del dispositivo que depende de una posición de descanso seleccionada. Las posiciones de descanso de ejemplo de la tapa 60 incluye: una posición de descanso que permite acceso al arreglo de picopozo 18 para cargar las células en el arreglo de picopozo 18; una posición de descanso que permite la adición de fluidos al reservorio de fluidos 52, una posición de descanso donde el reservorio de fluido 52, el canal capilar 54 y el arreglo de picopozo 18 se sellan sustancial mente del ambiente para reducir la evaporación de los fluidos; y una o más posiciones de descanso que permiten el flujo de los fluidos entre el reservorio de fluidos 52 al arreglo de picopozo a diferentes tazas. En una realización preferida de la presente invención se predeterminan tales posiciones de descanso.

En una realización de un dispositivo 47 la presente invención tal como la realización descrita en las figuras 4A, AB, AC, 60 es movible con relación al contador 50, que permite el acceso a las características del portador 50 tal como el arreglo de picopozo 18 y también permiten cambiar el dispositivo 46, por ejemplo al variar la taza de flujo de fluido desde el reservorio del fluido 52 al arreglo de picopozo 18. Preferiblemente, la tapa 60 es sustancialmente movible en paralelo, por ejemplo, deslizablemente hacia la superficie de arriba 48. Una ventaja adicional de tal asociación deslizante de la tapa 60 con el portador 50 es la simplicidad de elaboración.

Preferiblemente, un dispositivo que lleva un picopozo de la presente invención se suministra con un indicador o indicadores para indicar cuando una respectiva tapa se encuentra en una posición de descanso predeterminada dada. Tal indicador incluye, por ejemplo, marcas en un portador 50 y/o sobre un tapa 60. En las figuras 4A y 4C, las marcaciones 72a, 72b o 76c con el portador 50 indican tres posiciones de descanso sustancialmente diferentes de la tapa 60. Para uso la tapa 60 se desliza a lo largo de los rieles 64 de tal manera que el final 74 de la tapa 60 está en flujo con una cualquiera de las marcaciones 72a y 72b o 72c. Las tres posiciones de descanso indicadas por las marcaciones 72a, 72b y 72c son pociones de descanso donde el reservorio de fluido 52 es accesible para permitir la adición de fluidos al mismo, la diferencia entre las tres posiciones de descanso es toda la longitud del canal capilar 54: el final 74 está en flujo con la marcación 72a es más corto que cuando el extremo 74 está en flujo con la marcación 72b es más corto que cuando el extremo 74 está en flujo con la marcación 72c. El dispositivo que lleva el picopozo 46 descrito en las figuras 4a y 4c no se suministra con marcaciones que indican una posición de descanso de la tapa donde el arreglo de picopozo se expone.

En una realización preferida de un dispositivo 46 de la presente invención, la tapa 60 se suministra con una característica 70 (por ejemplo una muesca, una depresión, una protuberancia, una ranura, un aro, un receso, una manija, una indentación) configurada para acoplar un dispositivo que aplica fuerza que se utiliza para mover la tapa 60 con relación al portador 50. Se ve en la figura 4C que la característica 60 es una depresión similar a una ranura sobre la superficie superior de la tapa 60.

En una realización de la presente invención, la tapa 60 es transparente. En una realización de la presente invención, el portador 50 es transparente. En una realización preferida de la presente invención, tanto la tapa 60 como el portador 50 son trasparentes.

En una realización preferida, la tapa 60 se hace de policarbonato o de vidrio. En una realización preferida, el portador 50 es una estructura unitaria de policarbonato o vidrio. En una realización preferida, la tapa 60 es de vidrio y el portador 50 es una estructura unitaria de policarbonato.

Uso del dispositivo que lleva picopozo en la presente invención

Para uso, se suministra un dispositivo que lleva un picopozo 46 donde la tapa 60 está en posición donde el arreglo de picopozo 18 se expone. Una solución de células vivas (por ejemplo, Humanas Eritroides K562, Limfoblastos T Humanos MOLT-4, Linfocitos de Sangre Periférica (PBL, células primarias), Líneas de Células T Jurkat, Promonocito U937) se carga en un arreglo de picopozo 18, por ejemplo utilizando una pipeta 76, como se describió en la Figura 5.

La depresión 78 sobre la superficie superior 48 del portador 50 se ve en detalle en la sección transversal en la figura 6. El arreglo de picopozo 18 se encuentra en la parte inferior de la depresión 78, el arreglo de picopozo 18 se hace de un arreglo hexagonal de picopozos con borde de cuchillo herméticamente empacados 36. Las células 38 provenientes de la solución aplicada de la pipeta 76 se asienta bajo gravedad, cada célula en un picopozo hexagonal individual 76, en sección transversal en la figura 7.

Posteriormente a la carga de las células desde una posición donde el arreglo del picopozo 18 se expone al ambiente como se describió en la figura 8, un dispositivo que aplica fuerza 80 (un estilo) acopla la característica similar ranura 70 sobre la superficie superior de la tapa 60, Figura 9. La fuerza que aplica el dispositivo 80 se utiliza para deslizar la tapa 60 pasando la posición de descanso indicada por la marcación 72a a la posición de descanso donde el extremo 74 de la tapa 60 está en flujo con la marcación 72b, Figura 10.

Posteriormente, como se describió en la Figura 10 una pipeta 76 se utiliza para agregar una solución de lavado de célula 82 (por ejemplo, PBS, DMEM o RPMI) al reservorio de fluido 52. En el reservorio de fluido 52, el fluido de lavado de célula 82 es transportado por acción capilar a través del canal capilar 54, pasando el arreglo de picopozo 18 dentro de la depresión 78 y hacia afuera a través del canal capilar de desperdicio 58 al reservorio de desperdicio 56, lavando así las células vivas 38 mantenidas en los picopozos 36.

Posteriormente, como se describió en las figuras 11 y 12 se utiliza una pipeta 76 para agregar una solución de tejido de célula 84 (por ejemplo, de acetato de fluorescina (1 micromolar), naranja acridina (5 micromolar), rodamina 123 (1 micromolar), FDA, PI, Annexina V, y anticuerpo de anti-Glicoforina A marcado con alloficocanina para el estudio de expresión de GFP) al reservorio de fluido

52. Desde el reservorio de fluido 52, el fluido que tiene la célula 84 es transportado por acción capilar a través del canal capilar 54, pasando el arreglo del picopozo 18 dentro de la depresión 78 y hacía afuera a través del canal capilar de desperdicio 85 al reservorio de desperdicio 56, tiñendo así las células vivas 38 mantenidas en picopozo 36. Durante el transporte de los fluidos, la solución que tiñe la célula 84 desplaza la solución que lava la célula 82, como se describió en la célula 11 y en la figura

12.

Posteriormente a la adición del fluido que tiñe la célula 84, un dispositivo que aplica fuerza 80 (un estilo) acopla la característica similar a ranura 70 sobre la superficie superior de la tapa 60 y se utiliza para deslizar la tapa 60 desde la posición de descanso donde termina 74 de la tapa 60 y está en flujo desde la marcación 72b, como se describió en la figura 13, a la posición de descanso donde el extremo 74 de la tapa 60 está en flujo con la marcación 72c como se describió en la figura 14. En la posición de descanso donde el extremo 74 de la tapa 60 está en flujo con la marcación 72c (por ejemplo, Figura 14), el reservorio de fluido 52, el canal capilar 54, el arreglo de picopozo 18 y el canal capilar de desperdicio 58 están sustancialmente sellados de tal manera que las células vivas 38 mantenidas en los picopozos 36 del arreglo de picopozo 18 se mantienen en un ambiente estable.

Cuando ha pasado tiempo suficiente para el teñido de las células, las células vivas 36 mantenidas en los picopozos 36 del arreglo de picopozo 18 del dispositivo que lleva el picopozo 46 se examina utilizando el dispositivo de observación 86, en la Figura 15 un microscopio de investigación motorizado Olimpus BX61 (Olimpos America Inc., Melville, NY, USA).

Como se describió en la figura 15, en realizaciones de la presente invención las células vivas 36 mantenidas en los picopozos 36 del arreglo de picopozo 18 se examinan del anterior. En las realizaciones de la presente invención (no descrita), las células 38 se observan desde abajo mediante un dispositivo de observación ubicado por debajo del dispositivo que lleva el picopozo 36. En tales realizaciones, el portador 50 es preferiblemente adelgazado desde abajo en la vecindad del arreglo de picopozo 18. En general, el portador más delgado 50 está en la vecindad del arreglo de picopozo 18, la menor influencia del portador 50 tiene sobre la luz que pasa a través de este. En la realización desde la presente invención en adelgazamiento es tal que la parte inferior del portador 50 en la vecindad del arreglo de picopozo 18 es sustancialmente paralelo a la superficie inferior del arreglo de picopozo 18. En tal realización se describió en la Figura 23, para el portador 112.

Si se desea, el dispositivo que lleva el picopozo 46 de la presente invención se transfiere a una incubadora durante un periodo de tiempo, antes, durante o después de las células vivas se examinen utilizando el dispositivo de observación 86.

Se describió anteriormente un experimento donde las células 38 mantenidas en un arreglo de picopozo 18 de un dispositivo 46 de la presente invención sufre de solamente dos etapas de tratamiento: una primera etapa de lavado con una solución de lavado de célula 82 y una segunda etapa de teñido con la solución de teñido de célula 84. Utilizando un dispositivo de la presente invención tal como 46, un mayor número de etapas se efectúa si se desea. La realización de la presente invención descrita anteriormente, el volumen del reservorio de desperdicio 56 (y, si está presente, el volumen, del elemento absorbente 68 funcionalmente asociado con este) finalmente determina el número máximo de tales etapas que se pueden efectuar.

Como se describió anteriormente en u experimento en donde las células 38 mantenidas en un arreglo de picopozo 18 de un dispositivo 46 en la presente invención sufren solamente dos tipos de tratamiento: lavado y teñido. En las realizaciones de la presente invención, las células mantenidas en los picopozos de un arreglo de picopozo de un dispositivo de la presente invención sufren otros tipos de tratamientos que incluyen etapas de lavado y/o etapas de teñido y/o exposición a las funciones que contienen entidades activas tales como cantidades de fármaco, toxinas selectivas, ingredientes farmacéuticos activos, y similares.

En las realizaciones de la presente invención, un portador de la presente invención, incluye más de un arreglo de t picopozo. Por ejemplo, el descrito en la Figura 16 es un portador 87 de la presente invención con tres arreglos del picopozo, 18a, 18b y 18c en depresiones a lo largo de la celda del flujo de fluido definido por el canal capilar 54 y el canal capilar de desperdicio 58. Para uso, las células son cargadas en cada uno de los arreglos del picopozo 18a, 18b y 18c. Preferiblemente, diferentes tipos de células son cargadas en cada uno de los arreglos de picopozo 18a, 18b y 18c, que permite el desempeño de experimentos en uno o más de un tipo de célula que utiliza un portador 87. En una organización de la presente invención, es cualquiera o ambos arreglos de picopozo corriente abajo 18b y 18c cargan células indicadoras que son células que reaccionan a entidades de desperdicio, efluentes o activas liberadas de las células mantenidas en el arreglo de picopozo corriente arriba 18a.

como se describió en las Figuras 4B y 4C, la tapa 60 se configuro para ajustar sustancialmente en paralelo con la superficie superior 48 del contador 50, descansado sustancialmente sobre las meseta 47 y las repisas de riel 65. Cuando están en su lugar la tapa 60 es lateralmente confinada por las paredes del riel 67, verticalmente confinadas por el soporte de tapa 61 pero es axialmente deslizable en paralelo a la superficie superior 48. En las realizaciones de la presente invención tal como el soporte 51 descrito en la figura 17, la tapa 60 se configuró para acoplar deslizablemente la ranura 62 en los rines 64 de tal manera que cuando están en su lugar, la tapa 60 es lateral y verticalmente confinada por la ranura 62 pero axialmente deslizable en paralelo a la superficie superior 48. En tales realizaciones, un componente tal como un soporte de tapa 61 no es necesario en la medida en la que ranura 62 se asegura a la tapa 60 al portador 51.

Estudio automatizado de las células

Luego de la lectura cuidadosa de la descripción en las figuras presentes, un experto en la técnica reconoce que un dispositivo de la presente invención acoplado con las robóticas y lo sistemas de control de la técnica anterior permiten la implementación de un estudio completamente automatizado de grandes grupos de células como individuos. Específicamente, el uso de transporte de fluido capilar en comunicación con un reservorio de fluido definido por el pozo obvio la necesidad de uso de generadores de flujo externo tales como bombas y conexiones con concomitantes y adaptadores. El uso de una tapa móvil que cubre y descubre el arreglo de picopozo para el uso permite el uso de un sistema robótico relativamente simple hecho de componentes comercialmente disponibles. Hasta ahora, la automatización eficiente no ha sido posible en la práctica utilizando los dispositivos que llevan picopozo de la técnica anterior.

Para el uso automatizado un dispositivo 46 de la presente invención se coloca en un dispositivo robótico apropiadamente configurado, tal como un dispositivo robótico 88 descrito en el figura 18, cuya caracterización, diseño y construcción corresponde a una persona con la capacidad de un experto en la técnica. El dispositivo robótico 88, el dispositivo 46 (no a escala en la Figura 18) se coloca sobre un carrito móvil 90 (como un componente de trasporte) equipado con un dispositivo móvil de tapa 92. El dispositivo robótico 88 se suministra con una estación de distribución de solución de célula 94, una estación de distribución de lavado de célula 96, una estación de distribución de solución de teñido de célula 98 y un dispositivo de observación 86. Todos los componentes del dispositivo robótico, que incluyen movimiento del carrito 90 y activación del dispositivo que mueve la tapa 92 se controlan mediante el sistema de control 100.

La etapas de tal uso automatizado del dispositivo 46 son sustancialmente similares a aquellas descritas anteriormente para el uso manual del dispositivo 46. En razón a que las especificaciones, dimensiones y características de un dispositivo 46 son un dispositivo robótico fácilmente estandarizado 88 es fácilmente programado para abrir y cerrar una tapa 60 (utilizando, por ejemplo, un dispositivo de movimiento de tapa 92), para depositar una cantidad deseada de solución de las células vivas en el arreglo de picopozo 18 (que utiliza, por ejemplo, la estación que distribuye la solución de la célula 94), para depositar una cantidad deseada de soluciones (por ejemplo, una solución de lavado que distribuye la solución de lavado de célula 96 o una solución de teñido que utiliza la estación que distribuye la solución que tiene la célula 98) en un reservorio de fluido 52 y para transferir el dispositivo 46 a observación mediante un dispositivo de observación 86.

Características de los picopozos de un dispositivo de la presente invención

Preferiblemente, los picopozo individuales de un arreglo de picopozo son individualmente dirigibles. Para facilidad de estudio óptico y observación, se prefiere que los fondos de todos los picopozos sean sustancialmente coplanos o coplanares: la coplanaridad permite la observación óptica de muchas células (sean mediante exploración o simultáneamente utilizando un componente de observación de ángulo amplio) sin la necesidad de consumir tiempo y la dificultada técnica de implementar el reenfoque.

Preferiblemente, los picopozos de un arreglo de picopozo se yuxtapone. Por yuxtapuesto se entiende que en el área donde se encuentran los picopozos, la mayor parte del área es un área del picopozo y un poco del área es un área de interpicopozo. De acuerdo a una característica de la presente invención, por yuxtapuesto se entiende que el área de interpicopozo entre dos picopozos es menor o igual a 0.32, .025, 0.15, 0.10 o a 0.06 de la suma de las áreas de los dos picopozos. En ciertas realizaciones de la presente invención se prefiere que el área de interpicopozo sea sustancialmente cero, eso es que el canto de los picopozos tenga sustancialmente un borde de cuchillo.

Como las enseñanzas de la presente invención están dirigidas a las biología celular, se prefiere generalmente que los picopozos sean pequeños con el fin de evitar tener un gran número de células mantenidas en uno cualquiera de los picopozos. Así, en general, las dimensiones de los picopozo son generalmente hasta aproximadamente 200, 100, 50, 25, y aun 10 micrómetros. Por las dimensiones que tiene el significado usual de la palabra y es dependiente de la forma del picopozo. Por ejemplo, para los picopozos hexagonales o circulares, el termino dimensión se refiere al diámetro. Para los picopozos cuadrados o triangulares se significa la dimensión más larga del cuadrado o el triangulo, respectivamente. Las dimensiones exactas de los picopozos individuales dependen del tipo (y consecuentemente el tamaño) de las células a ser estudiadas y los tipos de experimentos y estudios que se deben efectuar. En razón a que diferentes tipos de células tienen diferentes tamaños, generalmente el arreglo de picopozo de la presente invención tiene picopozos de un tamaño para acomodar una o más células del tipo a ser estudiado. En algunas realizaciones se prefiere que un picopozo individual sea de un tamaño con el fin de mantener no más de una célula vivía de un cierto tamaño. En otras realizaciones se prefiere que el picopozo sean de un tamaño con el de mantener no más de un número predeterminado de células de un cierto tamaño (por ejemplo, dos o tres células simultáneamente).

En algunas realizaciones de la presente invención, los picopozos son hoyuelos o depresiones en la superficie inferior del arreglo de picopozo. En otras realizaciones los picopozos son sustancialmente cerramientos de dimisiones de tal manera que al menos una célula de un cierto tamaño es contenible, preferiblemente pero no necesariamente de manera sustancialmente completa, dentro de la inclusión, cada inclusión tiene una abertura en la superficie, la abertura define un primera sección transversal de un tamaño que permite el paso de la célula de un cierto tamaño. Las dimensiones exactas de las inclusiones individuales depende del tipo (y consecuentemente el tamaño) de las células a ser estudiadas y los tipos de experimentos y los estudios que se van a efectuar. El volumen de tales picopozo de inclusión es típicamente menos de 1 x 10-11 litros (que corresponde al volumen de 200 micrómetros cúbicos), menos de 1 x 10-12 litros (que corresponde al volumen de 100 micrómetros cúbicos) , menos de 1 x 10-13 litros (que corresponde al volumen de 50 micrómetros cúbicos) , menos de 1 x 10-14 litros (que corresponde al volumen de 25 micrómetros cúbicos) , y aun menos de 1 x 10-15 litros (que corresponde al volumen de cubo de 10 micrómetros cúbicos) , el área de la primera sección transversal, que corresponde al tamaño de la abertura de una respectiva inclusión es típicamente de menos de aproximadamente 40000 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cubo de 200 micrómetros 2), 10000 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cubo de 200 micrómetros 2), 2500 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cubo de 50 micrómetros 2), 625 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cubo de 25 micrómetros 2), y aun menos de aproximadamente de un cubo 100 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cuadrado de 200 micrómetros 2), menos de aproximadamente 100 micrómetros 2 (que corresponde al área de un cuadrado de 10 micrómetros 2).

Una realización de un portador de la presente invención tiene direcciones cercanas a aquellas de una lámina de microscopio estándar Elio, es decir, 28.4 milímetros de ancho por 76.2 milímetros de longitud. El centro del arreglo del picopozo es de 18.1 mm desde el borde del reservorio de fluido del portador. El ancho de entre las dos paredes de riel es de 24.5 mm, entre los bordes distantes de los espacios 19.5 mm, la meseta en la región del reservorio de fluido 5 mm y la meseta al final de la región de reservorio de desperdicio 15.2 mm. El grosor del portador desde la parte inferior del portador a la parte superior de la meseta de 2.3 mm. El radio de la depresión en la cual el arreglo del picopozo se encuentra en 1 mm y el volumen es de 5 x 10-6 litros. Cuando una tapa respectiva está en su lugar, el volumen atrapado bajo la meseta corriente arriba del arreglo del picopozo que constituye parte del reservorio de fluido y el canal capilar es de aproximadamente 15 microlitos mientras que el volumen atrapado bajo la meseta que esta corriente abajo del arreglo del picopozo y que constituía parte del reservorio de desperdicio y el canal capilar de desperdicio es de aproximadamente 150 microlitos.

Métodos de elaboración de un dispositivo de la presente invención

En general, la elaboración y el montaje de un dispositivo de la presente invención corresponde a la capacidad a un experto en la técnica luego de la lectura cuidadosa en la descripción en las figuras presentes que utiliza cualquier método adecuado con el cual un experto en la técnica está bien al tanto. Los métodos adecuados incluyen métodos que emplean una o más técnicas que incluyen pero no están limitadas a moldeo, repujado, agua fuerte elaboración de forma libre, moldeo por inyección, micro agua fuerte, micro maquinado, micro plateo, moldeo, recubrimiento de giro, litografía o foto-litografía.

Generalmente se prefiere que un dispositivo de la presente invención sea tan simple de elaborar cómo es posible al ensamblar un dispositivo de la presente invención tan pocos componentes como sea posible.

En una realización, de la presente invención un dispositivo 102, ver Figura 19 consiste esencialmente de cuatro componentes: a) un portador 50 con una superficie superior que tiene una depresión 78 en la superficie superior, b) un componente que lleva un picopozo 93 que lleva un arreglo de picopozo configurado para ajustar a la depresión 58 c) una tapa 60 configurada para descansar por encima del arreglo del picopozo cuando el componente que lleva el picopozo 93 se ajusta a la depresión 78, y d) un uso de porte de tapa 61 configurado para descansar por encima de la tapa 60 y acoplar el portador 50 con el fin de asegurar la tapa 60 al portador 50.

En una realización de la presente invención un dispositivo 104, ver figura 20, consiste esencialmente de tres componentes: a) un portador 50 con una superficie superior que lleva un arreglo de picopozo sobre la superficie superior, c) una tapa 60, configurada para descansar por encima del arreglo del picopozo, y d) uso porte de tapa 61 configurado para descansar por encima de la tapa 60 y acoplar el portador 50 con el fin de asegurar la tapa 60 al portador 50.

En una realización de la presente invención un dispositivo 106, ver figura 21, consiste esencialmente en tres componentes: a) un portador 51 con una superficie superior que tiene una depresión 78 en la superficie superior, b) un componente que lleva un picopozo 93 que lleva un arreglo de picopozo configurado para ajustar a la depresión 78 y c) una tapa 60 configurada para descansar por encima del arreglo del picopozo cuando el componente que lleva el picopozo 93 se ajusta a la depresión 78.

En una realización de la presente invención un dispositivo 108, ver figura 22, consiste esencialmente de dos componentes: a) un portador 51 con una superficie superior que lleva un arreglo de picopozo sobre la superficie superior y c) una tapa 60 configurada para descansar por encima del arreglo picopozo.

En los dispositivos 104 y 108, el arreglo de picopozo respectivo es integralmente conformado dentro de una depresión 78 sobre la superficie superior de portador 50, como se describió anteriormente.

En general, en los dispositivos 102 y 106 el componente que lleva el picopozo 93 esta funcionalmente asociado con el portador 50 o 51, por ejemplo, al colocar el componente que lleva el picopozo 93 en una depresión 78 sobre la superficie superior del portador 50 o 51 y al unirse al portador 50 o 51, como se describió anteriormente.

En todos los cuatro dispositivos 102, 104, 406 y 108, las tapas respectivas 60 son movibles deslizablemente. En los dispositivos 102 y 104, la tapa 60 está confinada lateralmente por las paredes de riel 67, verticalmente confinada por el soporte de tapa 61 y es axialmente deslizable y el paralelo con superficie superior 48. En los dispositivos 106 y 108, la tapa 60 se confina lateral y verticalmente por las ranuras 62 y axialmente deslizable en paralelo a la superficie superior 48.

En las realizaciones de la presente invención, un dispositivo completo de la presente invención y todos los componentes del mismo son hechos de un material. En otras realizaciones, un dispositivo de la presente invención se hace de hasta un número de diferentes materiales. En las realizaciones de la presente invención, los componentes individuales, como por ejemplo un portador se hace de un número de diferentes materiales como una pluralidad de capaz o como una estructura recubierta.

En una realización de la presente invención, las paredes de picopozos se forman integralmente con la superficie de fondo del portador (por ejemplo, 104 y 108). En las realizaciones que incluyen un componente que lleva un picopozo separado (por ejemplo 102 y 106) el componente que lleva el picopozo se hace de cualquier material adecuado, el mismo o diferente que el material del cual se hace el portador. Los materiales adecuados de los cuales se hace la tapa, un portador o un componente que lleva picopozo incluyen peor no están limitados a cerámicas, elastómeros, epoxis, vidrios, vidrios-cerámicas, metales, plásticos, policarbonatos, polidimetilsiloxano, polietilentereftalato glicol, polímeros, poliuretano, polimetilmetacrilota, polietileno, polivinil cloruro, caucho, silicio, óxido de silicio y caucho de cilicio.

La elaboración de un portador con picopozos integralmente conformados, de un portador sin los picopozo integralmente conformados o un componente que lleva un picopozo es claro para un experto en la técnica a partir de la lectura detalla de la presente descripción. Un método preferido es análogo a los métodos descritos por el inventor en la solicitud de patente PCT No. IL01/00992, en la solicitud de patente PCT No IL04/00571 y en la solicitud de patente PCT No. IL04/00661, tal método incluye a) poder en contacto un material precursor con una plantilla que incluye unas características negativas del portador o del componente que lleva el picopozo con el fin de crear las características deseadas en el material precursor, las características incluyen el arreglo del picopozo; b) fijar las características en el material precursor con el fin de formar un portador excipiente o un componente que lleva un picopozo; c) procesar el portador incipiente o componente que lleva el picopozo con el fin de fin de formar el portador o componente que lleva el picopozo de la presente invención.

Generalmente pero no necesariamente, una tapa (por ejemplo, 60) y un soporte de tapa (por ejemplo, 61) es un componente separado de un dispositivo de la presente invención. La elaboración de una tapa y un soporte de tapa es claro para un experto en la técnica luego de la lectura detalla de la presente descripción.

En una realización preferida, un borrador de un dispositivo de la presente invención es un componente unitario que tiene un arreglo de picopozo, un reservorio de fluido, un canal capilar, un reservorio de desperdicio y un canal capilar de desperdicio integralmente conformado sobre este como se describió en las figuras 20 y 22.

En una realización preferida de la presente invención, un portador tiene un reservorio de fluido, un canal capilar, un reservorio de desperdicio, un canal capilar de desperdicio y una depresión integralmente formada sobre este pero un arreglo de un picopozo es parte de un componente que lleva un picopozo separado como se describe en las figuras 19 y 21. La ventaja de tal realización es que muchos portadores son masa producida mientras que una pluralidad de diferentes tipos de componente que lleva el picopozo se produce y se disparan según sea necesario. Las diferencias típicas de entre los diferentes tipos de componentes que llevan picopozo incluyen, numero, tamaño, forma y disposiciones de los picopozo componentes.

En una realización de la presente invención, un componente que lleva un picopozo y un portador se forman separadamente y luego del componente que lleva el picopozo se une fijamente el portador en el sitio apropiado sobre el portador. La unión fija incluye el uso de métodos que emplean adhesivos, soldadura, o tratamiento de superficie tales como tratamiento de plasma.

Un componente que lleva picopozo preferido es un componente plano sobre el cual se encuentran los picopozos, preferiblemente en la forma de un tapón (por ejemplo 93) que ajusta cómodamente en una depresión (por ejemplo 78). Un componente que lleva un picopozo preferido adicional es un componente similar a parilla que continúa sustancialmente solo las paredes de los picopozos, preferiblemente en la forma de un tapón que ajusta cómodamente en una depresión.

En las realizaciones del método de elaboración un portador de la presente invención se coloca (y opcionalmente se une) a un componente que lleva un picopozo preformado o un componente similar a parrilla en una placa precursora, es ventajoso a menudo que el componente que lleva el picopozo dado tenga dimensiones similares o sustancialmente éticas a aquella de la depresión en la cual el componente que lleva el picopozo se coloca. Tales dimensiones permiten la colocación exacta del componente que lleva el picopozo en la depresión.

En una realización preferida de la presente invención descrita en la figura 23 en la sección transversal un hueco 110 que corresponde a una depresión que soporta un picopozo 78 como se discutió anteriormente, se localiza en un portador respectivo 112 y un componente que lleva un picopozo 93 incluye un arreglo de picopozo 18 sobre una superficie superior 114 del mismo, donde las dimensiones del componente que lleva el picopozo 93 son un poco mayores que las dimensiones del hueco 110. Por ejemplo, un hueco 110 es circular y tiene un diámetro de 2 mm mientras que el respectivo componente que lleva el picopozo 93 es un cuadrado que tiene 2.2 mm de longitud. El componente que lleva el picopozo se une (como se describió anteriormente) al portador 112 desde la parte de abajo con el fin de sellar un hueco 110 de tal manera que los bordes de la superficie superior 114 del componente que lleva el picopozo 93 entre en contacto con el área del portador 112 inmediatamente adyacente al hueco 110 y pidiendo así una depresión que soporta el arreglo del picopozo 78 como se describió anteriormente. Una ventaja de tal realización (como se discutió anteriormente) es que el portador 112 es muy delgado bajo la regla del picopozo 18 de tal manera que la observación de la célula 38 mantenida en los picopozos esta mínimamente influenciada.

En una realización de la presente invención, el componente que lleva el picopozo es formado dentro de un portador al poner en contacto un molde apropiado con un material precursor moldeable cuando el material precursor está adentro de una depresión. Tal realización se discute en detalle adelante.

Los componentes de un dispositivo de la presente invención tal como un portador con picopozo integrados conformados como un portador sin picopozo integralmente conformados o un componente que lleva un picopozo de la presente invención se hace preferiblemente de acuerdo a los métodos de la presente invención.

Un primer método de la presente invención para elaborar un componente de la presente invención es sustancialmente al poner en contacto un material precursor con una plantilla, la plantilla tiene unas características negativas o algunas del componente (especialmente los picopozos) que dando así las características del material precursor. Las características son posteriormente fijadas en el material precursor elaborando un componente incipiente. Después de cualquier procesamiento requerido adicional del componente incipiente (que se puede limitar a simplemente separar la plantilla del componente incipiente), el dispositivitos se ensambla de los componentes separados.

Dependiendo del material precursor, la fijación incluye, pero no está limitada a, métodos tales como calentar el material precursor, enfriar el material precursor, curar el material precursor, polimerizar el material precursor, irradiar el material precursor, irradiar el material precursor, erradicar el matinal precursor, iluminar el material precursor, edificar el material precursor, exponer el material precursor, a un fijativo y esperar un periodo de tiempo. Por fijativo se quiere significar un agente que vigila que el material precursor cambie al estado fijo y se utiliza aquí como un término general para tales materiales como fijativos, endurecedores, polimerizaciones/reticulación/iniciadores de curado, catalizadores y agentes. Es importante notar que en algunos casos el material precursor se produce al mezclar dos o más componentes que posteriormente cambian a un estado fijo, por ejemplo, al esperar simplemente un periodo de tiempo.

En una realización preferida de presente invención, el material precursor es un material precursor irreversiblemente deformable. Aquí por material precursor irreversible deformable se significa un material que no recupera la forma después de la deformación y así no existe necesidad de una acción separada para fijar las características en el material precursor más allá de separa el componente producido del molde en tales casos, el material precursor no cambia químicamente de manera sustancial posterior al contacto con el molde. Ejemplos de materiales precursores irreversiblemente deformables adecuados incluyen ceras, parafinas, plásticos, polímeros y similares; en tal realización, una plantilla preferida es una estampilla, y el contacto de las plantillas con el material precursor es sustancialmente estampa las características del componente en el material precursor, preferiblemente condiciones térmicas controladas.

En otra realización preferida de la presente invención el material precursor es un material precursor irreversiblemente deformable. Aquí por material precursor irreversiblemente deformable se significa un material que es capaz de recuperar la forma después de la deformación e incluye fluidos significables, materiales polimerizables, polvos, fluidos y materiales termos plásticos.

En una realización preferida, el material precursor reversiblemente deformable es un material termo plástico a una temperatura plegable. Posterior al contacto del molde pero antes de que el contacto se termine, el material termo plástico es enfriado, fijado así las características deseadas en el componente incipiente.

En otra realización preferida, el material irreversiblemente deformable es un material polimerizable (por ejemplo en una solución de monómero, un polímero reticulable, o polímeros vulcanizables, fluidos polimerizables o una resina termo consolidante). Posterior a la fuerza en contacto el molde pero antes de que el contacto se termine, el material polimerizable se polimeriza, fijando así las características deseadas del componente incipiente. En tales casos, el material precursor y el material del cual se hace el componente son químicamente no similares (por ejemplo, tienen la relación del monómero al polímero).

Uno material precursor polimerizable preferido es una mezcla precursora de polidimetilsiloxano no curado. Una mezcla de dos componentes de dos componentes de polidimetilsiloxano (el prepolímero y el agente de cura) se mezclan juntos en la proporción deseada.

(Preferiblemente a aproximadamente 10:1, pero proporciones entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 20:1 son generalmente adecuadas) para dar una mezcla precursora de polidimetilsiloxano, la mezcla es clasificada y puesta en contacto con la plantilla. Las características se fijan por la cura de la mezcla. El precursor de polidimetilsiloxano generalmente tiene lugar a un temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas y, cuando se desea, se acelera por calentamiento. Por ejemplo se ha encontrado que los componentes del dispositivo de la presente invención hechos de polidimetilsiloxano están listos para procesamiento adicional dentro de las 2 horas cuando se cura a 60ºC o dentro de los 15 minutos cuando se cura a 150ºC. Una revisión detalla de los métodos de producción de las características micrónicas tal como los picopozos de polidimetilsiloxano adecuados para implementar las enseñanzas de la presente invención son conocidos en la técnica y discuten, por ejemplo, en Ng et al., Electroforesis 2202, 23, 3461-3473 y Duffy et al., Anal, Chem. 1998, 70, 4974-4984.

Otro material precursor polimerizable preferido es el uretano que es polimerizado para producir poliuretano.

Otro material precursor irreversiblemente deformable preferido es un fluido geliflicable. Después de que el fluido gelificante es puesto en contacto con el molde, las características se fijan al gelificar el fluido gelificante para producir un gel. Los más preferidos son los fluidos gelificante que producen un hidrogel.

Los fluido gelificables conocidos en la técnica incluyen fluidos que se melifican luego del calentamiento, los fluidos que se gelifican luego de enfriamiento, los fluidos que se gelifican luego de irradiación o iluminación, los fluidos que se gelifican como resultado en la puesta en contacto con un reactivo calificante y los fluidos que se gelifican después de un periodo de tiempo. Los fluidos gelificables preferidos para implementar las enseñanzas de la presente invención incluyen soluciones agares, agarosa, gelatinas, agarosa con temperatura de fusión baja, alginatos, proteínas, polisacáridos de proteína, alginatos indecibles con Ca2+-(especialmente aquellos que gelifiquen la temperatura ambiente) y polisacáridos.

Un fluido gelificante preferido es una solución de agaroza con temperatura de fusión baja. Tal solución es un fluido a temperaturas que no afectan las células vivas (por ejemplo 20ºC) y el gel a temperatura baja que no afecta a las células vivas (por ejemplo 4ºC). Una agaroza excepcionalmente adecuada para implementar las enseñanzas de la presente invención que se puede comparar, por ejemplo, de Cambrex Bio Science Rockland Inc (Rockland, ME, USA) es HGS-LMP agaroza 0.5% en PBS (Catalogo Nr. 50221).

Otro fluido gelificante preferido es una solución de alginato cuyos geles luego de contacto con el reactivo gelificante, el reactivo gelificante preferido es una solución que tiene una concentración de iones Ca2+ mayor de aproximadamente 1 x 10-6 M. Un agente gelificante excepcionalmente útil es una solución de gluconato de calcio 20 x 10-3 M. La solución de alginato adecuadas se pueden comprar de Pronota Biopolímeros (Drammen, Norway) e incluyen, por ejemplo, Protanal LF 120 1% en agua y Protanal LF200 1% en agua.

La plantilla que tienen un negativo de las características es, por ejemplo, una estampilla o un molde, y se hace generalmente de cualquier material adecuado que sea más rígido que el respectivo material precursor. Los materiales adecuados incluyen pero no están limitados a materiales reversiblemente reformables, materiales irreversiblemente reformables, cerámicas, ipoxis, vidrios, vidrios-cerámicas, metales, plásticos, policarbonatos, polidimetilsiloxano, polietilenterftalato glicol, polímeros, polimetil metacrilato, parafinas, poliestireno, poliuretanos, polivinil cloruro, silicio, óxido de silicio, cauchos de silicio y cera.

La plantilla se hace, por ejemplo, utilizando métodos con los cuales un experto en la técnica está enterado tal como moldeo, realzado, agua fuerte, elaboración de forma libre, moldeo por inyección, micro agua fuerte, micro maquinado, micro plateo, moldeo, litografía o fotolitografía.

En una realización el dispositivo de la presente invención de hace al elaborar picopozos como se describió anteriormente dentro de un depresión (tal como 78) de un portador (tal como 50). Los portadores adecuados incluyen pero no están limitados a portadores de hechos de materiales reversiblemente deformables, materiales irreversiblemente deformables, cerámicas, ipoxis, vidrios, vidrios-cerámicas, metales, plásticos, policarbonatos, polidimetilsiloxano, polietilenterftalato glicol, polímeros, polimetil metacrilato, parafinas, poliestireno, poliuretanos, polivinil cloruro, silicio, óxido de silicio, cauchos de silicio. En tal caso, un material precursor para elaborar los picopozos se coloca en la depresión de portador. Una plantilla nueva se coloca dentro de la depresión con el fin de poner en contacto el material precursor y el material precursor se siga como se describió anteriormente. Tal realización tiene la ventaja de que el portador despojado de picopozos es virtualmente cualquier material producido en masa. Posteriormente, el molde se hace y se utiliza para fijar picopozos de virtualmente cualquier tamaño deseado, número y disposición en el portador.

En otra realización preferida anotada anteriormente, una plantilla que incluye el negativo de las características deseadas efectuando las picopozo se pone en contacto con el material precursor con el fin de formar un portador con una depresión despojada de picopozos. Posteriormente, un componente similar a parrilla, que constituye sustancialmente las paredes de los picopozo del arreglo de picopozos, se une utilizando un método apropiado, por ejemplo, adhesivos (por ejemplo, adhesivos curables con luz, tales como adhesivos que curan con luz 3051 o 3341 elaborado de Henkel Loctite Deutschlnad GmbH, Munich, Alemania) o tratamientos de superficies tales como unión anódica, unión de fusión o tratamiento de plasma tal como descarga de plasma tal como descarga de plasma (excepcionalmente adecuada para unir polidimetilsiloxano, ver Duffy et al., Anal. Chem. 1998, 70, 4974-4984).

Otro método preferido para elaborar un picopozo es un portador que incluye fotolitografía o un material foto resistente colocado sobre un sustrato, o un proceso comercialmente disponible (por ejemplo Micro Resist Technology GmbH, Berlín, Alemania) con el cual un experto en la técnica está bien enterado. En resumen, la plantilla que incluye el negativo de las características deseadas exceptuando los picopozos se ponen en contacto en el material precursor con el fin de formar un precursor con una depresión desprovista de los picopozos. Posteriormente, un material foto resistente con índice de alto aspecto (por ejemplo un fluido foto resistente es SU-8 Micro Chem Corporation, Newton MA, USA) se coloca en la depresión como una película uniformemente gruesa. Un método preferido para lograr una película uniformemente delgada de un fluido foto resistente es mediante recubrimiento de giro, esto es, el fluido foto resistente se coloca en la depresión del portador y el portador rota alrededor de un eje perpendicular. Como resultado de la rotación el fluido foto resistente forma una película uniformemente gruesa, típicamente entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 20 micrómetros de grueso. Una vez que la película de grosor uniforme de material foto resistente se logre el material foto resistente se ilumina a través de una máscara, la máscara es sustancialmente una plantilla o maestro de los picopozos deseados. Desarrollar el precursor con la película selectivamente fija remueve las áreas no fijas de la película. De tal manera que el arreglo del picopozo se hace de hasta una capa foto resistente fija que descansa sobre un portador donde los picopozos son esculpidos es una capa foto resistente y el fondo de los picopozos es la superficie de la capa precursora. Utilizando un método de fotolitografía, los picopozos que tiene una superficie de fondo plana son fácilmente producidos.

Los componentes de un dispositivo de la presente invención se hacen de cualquier material adecuado. Los materiales adecuados incluyen pero no está limitados a cerámicas, ipoxis, vidrios, vidrios-cerámicas, metales, plásticos, policarbonatos, polidimetilsiloxano, polietilenterftalato glicol, polímeros, polimetil metacrilato, parafinas, poliestireno, poliuretanos, polivinil cloruro, silicio, óxido de silicio.

Otro medo preferido de elaborar un dispositivo de la presente invención comprende unir uno

o más componentes que llevan picopozos a una placa precursora que utiliza un método apropiado, por ejemplo, utilizar un adhesivo o un tratamiento de superficie tal como un tratamiento de plasma, por ejemplo como se escribió anteriormente. Un componente que lleva un picopozo preferido y es un portador que comprende una pluralidad de picopozos dispuestos sobre una superficie. Los portadores preferidos incluyen aquellos descritos en la solicitud de patente PCT No. IL01/00992 o la Solicitud de Patente PCT No. IL01/00571.

Algunas realizaciones del dispositivo de la presente invención comprende picopozo donde la superficie de los picopozos (con la cual las células soportadas potencialmente hacen contacto físico) se recubren con una capa de algún material de recubrimiento deseado, por ejemplo un material de recubrimiento que influencia la proliferación de células vivas como se describió en la solicitud de patente PCT No IL04/00571.

Un experto en la técnica está enterado de muchas maneras y muchos materiales de recubrimiento con los cuales recubrir la superficie interna de los picopozos de un dispositivo de la presente invención.

Un método preferido de recurrir las superficies internas de los picopozos de n dispositivo de la presente invención, aplicable habitualmente en cualquier dispositivo producido mediante virtualmente cualquier método, comprende poner en contacto un fluido precursor con la superficie interna de los picopozos y posteriormente solidificar el fluido precursor, formando la capa de material de recubrimiento. Dependiendo de la naturaleza de fluido precursor, solidificarse efectúa mediante cualquier número de método que incluye pero no está limitado a calentar el fluido precursor, y enfriar el fluido precursor, polimerizar el fluido precursor, reticular el fluido precursor, curar el fluido precursor, irradiar el fluido precursor, iluminar el fluido precursor, gelificar el fluido precursor, irradiar el fluido precursor a una fijación o esperar un periodo de tiempo.

Un método preferido de recubrir la superficies internas de los picopozos de un dispositivo de la presente invención, aplicar eventualmente cualquier dispositivo producido mediante virtualmente cualquier método, es mediante deposición de vapor. La deposición de vapor involucra la deposición de materiales tales como moléculas o átomos sobre la superficie a bajas presiones y se caracteriza por la producción de homogéneamente recubrimientos delgados sobre una superficie, tal como la superficie interna de un picopozo de un dispositivo de la presente invención.

En una realización de la deposición de vapor a la superficies internas de los picopozos de un dispositivo de la presente invención, los átomos o moléculas que conforman el material de recubrimiento de depositan. En otras realización de la deposición de vapor, lo átomos o moléculas que comprenden un precursor del material de recubrimiento se depositan sobre la superficie interna de los picopozos, seguido al solidificar el material precursor de recubrimiento formado de esta manera la capa de material de recubrimiento. Solidificar el material precursor de recubrimiento para formar la capa de material de recubrimiento se efectúa mediante cualquier número de métodos que incluyen pero no están limitados a calentar el material precursor de recubrimiento, como enfriar el material de precursor de recubrimiento, polimerizar el material precursor de recubrimiento, reticular el material precursor de recubrimiento, curar el material precursor de recubrimiento, y radiar el material precursor de recubrimiento, iluminar el material precursor de recubrimiento, melificar el material precursor de recubrimiento, exponer material precursor de recubrimiento a un fijativo y esperar un periodo de tiempo.

Un material de recubrimiento preferido para recubrir las superficies internas de los picopozos de un dispositivo de la presente invención se hace de moléculas de paraxilileno polimerizadas (o derivadas de las mismas, específicamente donde uno o más hidrógenos, especialmente hidrógenos aromáticos de cualquiera o ambos anillos aromáticos son sustituidos) depositados por deposición de vapor, un recubrimiento comercialmente conocido como Parileno® (disponible por ejemplo, V&P Scientif, Inc., San Diego, CA, USA). El Parileno® se prefiere no solamente para las propiedades que influencia la proliferación de célula sino también por el hecho de que los recubrimientos de Parileno® son resistentes a las bacterias, resistente a los hongos, transparentes, tienen baja permeabilidad, son resistentes a los ácidos y bases, uniformes, delgados, (típicamente 0.1-1 micrómetro) y sin vacios aun cuando una superficie recubierta incluye configuraciones con bordes agudos, superficies puntas, superficies planas, grietas o superficies internas expuestas.

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10.

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Un dispositivo (46) para el estudio de células, que lleva hoyuelos, depresiones, tubos, o inclusiones de un tamaño que se acomodan a una o más células como picopozos, por medio de los cuales los picopozos tienen una dimensión de 1 a 200µm, Que comprende a) un portador (50) que tiene una superficie superior (48). b) Un arreglo de picopozo (18) sobre la superficie superior (48), c) Un reservorio de fluido (52) en comunicación fluida con el arreglo de picopozo (18) a través de al menos un cal capilar (54) y d) Una tapa (60) es movible con relación dicho portador (50) y Configurada para descansar por encima de dicho arreglo de picopozo (18), donde Dicho portador (50) es un componente unitario que tiene un arreglo en el picopozo (18), un reservorio de fluido (52), un canal capilar (54) como un reservorio de desperdicio (56), y un canal capilar de desperdicio (58), y una depresión (78) integralmente conformadas sobre este, por un arreglo de picopozo (18), parte de un componente que lleva un picopozo separado (93), donde dicho canal de desperdicio capilar (58) está en comunicación fluida con dicho arreglo de picopozo (18) y que comprende una meseta (47) sobre dicha superficie superior (48), en donde dicho arreglo ético (18) se localiza sobre dicha meseta (47) o en un depresión (78), en dicha meseta (47) donde una primera región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar (54) y una segunda región de dicha meseta (47) constituye una parte de dicho canal capilar de desperdicio (58).

El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) es movible sustancialmente y en paralelo con dicha superficie superior (48).

Los dispositivos de la reivindicación 1, en donde dicho reservorio de fluido (52) se localiza sobre dichas superficies superior (48). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) es un componente de dicho reservorio de fluido (52). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) se asocia deslizantemente con dicho portador (50) El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) se suministra con una característica configurada para acoplar un dispositivo que se aplicaba a la fuerza utilizado para mover dicha tapa (60) con relación a dicho portador (50). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha tapa (60) tiene al menos dos posiciones de descanso sustancialmente diferentes con relación a dicho arreglo de picopozo (18). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicho portador (50) comprende además dos rieles, en donde dicho arreglo de picopozo (18) se localiza entre dichos do rieles (64) y en donde dicha tapa (60) se asocia deslizantemente con dichos dos rieles (64). El dispositivo de la reivindicación 8, en donde dicho arreglo de picopozo (18) se localiza en una depresión (78) entre dichos dos rieles (64). El dispositivo de la reivindicación 9, en donde dicha tapa (60) y un área entre dicho dos rieles (64) definen sustancialmente un canal capilar (54,58). El dispositivo de la reivindicación 1, en donde una meseta (47) sobre la superficie superior

(48) constituye una parte del canal de desperdicio capilar (58) y donde el canal de desperdicio de capilar (58) se define por el espacio entre la tapa (60) y la meseta (47).