ES2203098T3 - Aparato microfabricado para dosificados a base de celulas. - Google Patents

Aparato microfabricado para dosificados a base de celulas.

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Abstract

Aparato incluyendo: a) una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella; b) una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales; c) una suspensión de células a cultivar; y d) medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular; caracterizado porque uno o varios componentes del aparato se construyen de una película o membrana de tal manera que dicho uno o varios componentes sean permeables a los gases en la medida en que se puede usar medios tamponados con CO2 en la cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que puede permear oxígeno, a su través a las células para sus metabolismo durante el crecimiento.

Description

Aparato microfabricado para dosificados a base de células.
La presente invención se refiere a ensayos de crecimiento celular y a base de células. En particular, la invención se refiere a un aparato microfabricado para llevar a cabo ensayos de crecimiento celular y a base de células y a métodos para llevar a cabo tales ensayos.
El enfoque corriente en aplicaciones de selección de alta producción tendentes a la selección de cantidades crecientes de compuestos es movido por las tecnologías dobles de la química combinatoria y la genómica, para producir nuevos medicamentos blancos potenciales y nuevos medicamentos candidatos como compuestos terapéuticos potenciales. El proceso de selección primaria ha sido afrontado por el desarrollo de procesos de ensayo de selección de alta producción y miniaturización de ensayos utilizando el formato de placa de cavidades de microtítulo con 384, 864, 1536 o más cavidades miniaturizadas. Los ensayos miniaturizados son capaces de permitir niveles de producción de más de 100.000 pruebas/día en selección primaria. A este nivel de producción, cabría esperar que una selección primaria produzca 100-1000 "aciertos" por día. Cada uno de estos medicamentos putativos tiene que experimentar selección más refinada y comprobación en varios ensayos para investigar la compatibilidad biológica del compuesto. Tales ensayos incluyen biodisponibilidad, metabolismo y toxicología, y se realizan predominantemente usando líneas de células cultivadas. En comparación con los ensayos utilizados en el proceso de selección primaria, los ensayos de selección secundaria tiene un nivel mucho más alto de complejidad y requisitos más estrictos, tanto en la mecánica del ensayo como en la información generada. Se requiere en la técnica metodologías de ensayo de selección secundaria que sean capaces de manejar tanto una tasa creciente de generación avanzada de medicamentos putativos como la generación de datos biológicos referentes al medicamento candidato. Además, el desarrollo de ensayos que producen un mayor contenido de información tiene el potencial de incrementar el nivel de caracterización de un medicamento avanzado durante la fase de selección del desarrollo de medicamentos.
Se han descrito previamente dispositivos microfabricados que son adecuados para ser utilizados en análisis biológicos miniaturizados. Por ejemplo, WO 96/15450 describe un dispositivo que incluye una estructura de vidrio atacada con una colección de cámaras conectadas por un microcanal y encerradas por una placa de cobertura de vidrio. Wilding y otros han descrito dispositivos, por ejemplo, en WO 93/22058, que describen un dispositivo de mesoescala para amplificar ADN por PCR, constando el dispositivo de varias cámaras conectadas por un canal. WO 93/22055 y WO 93 22053 se refieren a dispositivos para analizar una muestra fluida conteniendo células incluyendo un sistema de flujo de mesoescala con orificio de entrada para captura y/o lisis de células en fluidos biológicos, o conteniendo un radical de unión para unir específicamente un analito, donde el analito puede ser un componente intracelular en una célula en una muestra, o una población de células en una muestra.
Los dispositivos anteriores se refieren a la medición o detección de células o analitos celulares en células introducidas en el dispositivo inmediatamente antes del análisis. no se describen para uso en cultivo o crecimiento celular, ni para uso en el estudio de respuestas celulares a agentes bajo prueba. Además, no describen ni permiten el uso de células cultivadas adherentes. También se puede ver ideas similares en US 5.637.469, US 5.593.838 y WO 97/21090. US 5.637.469 sugiere en términos generales supervisar el crecimiento celular en sistemas de mesoescala y supervisar la inhibición de flujo como una indicación de crecimiento de un organismo no especificado en una estructura de mesoescala que se ha llenado con medio de crecimiento y muestra (ejemplo 7) y sellado.
WO 9614933 describe dispositivos de mesoescala para (a) caracterizar la motilidad de células, primariamente células de esperma, es decir, células que se mueven sin necesidad de medios de unión, (b) separar y recoger células con motilidad de interés, y (c) fertilización in vitro.
FR 2657879 describe un dispositivo de macroescala para cultivo de células.
US 4.018.652 describe un dispositivo de macroescala para la determinación de la concentración de microorganismos.
Se requiere un dispositivo capaz de proporcionar un entorno que soporte la supervivencia a largo plazo de células cultivadas, acoplado con medios para utilizar células cultivadas dentro del dispositivo para análisis secundario de medicamentos u otros estudios.
En un aspecto, la presente invención proporciona un aparato incluyendo:
a)
una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella;
b)
una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales;
c)
una suspensión de células a cultivar; y
d)
medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular;
caracterizado porque uno o varios componentes del aparato se construye de una película o membrana de tal manera que dicho uno o varios componentes sea permeable a los gases en la medida en que se puede usar medios tamponados con CO_{2} en la cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que puede permear oxígeno a su través a las células para su metabolismo durante el crecimiento.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para determinar el efecto de una sustancia de prueba en una actividad celular o parámetro físico utilizando el aparato antes definido, incluyendo dicho método:
a)
suministrar una o varias muestras de sustancias de prueba cuyos efectos en las células se ha de medir en condiciones para hacer que dichas células sean expuestas a dichas sustancias;
b)
determinar el efecto de las sustancias de prueba en dichas células por medio de detección óptica.
El método para determinar el efecto de una sustancia de prueba incluye preferiblemente el paso de cultivar células que se adhieren a una superficie dentro del aparato antes de la introducción de las sustancias de prueba. Después del paso c) se facilitan preferiblemente uno o varios reactivos de ensayo y dispersar los reactivos a una o varias cámaras de reacción en el aparato.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para medir un analito celular mediante el uso del aparato antes definido, método que incluye:
a)
dejar que las células crezcan;
b)
proporcionar uno o varios reactivos de ensayo y dispersar dichos reactivos a una o varias cámaras en dicho aparato;
c)
medir el analito celular por medios ópticos.
Con el fin de que la invención se pueda entender mejor, ahora se describirán varias realizaciones a modo de ejemplo solamente y con referencia a los dibujos acompañantes, en los que:
La figura 1a es una representación diagramática en planta de un elemento de microcanal individual del aparato microfabricado para realizar ensayos de crecimiento celular y a base de células.
La figura 1b es una vista en sección de un disco microfabricado incluyendo una pluralidad de elementos de ensayo para realizar ensayos de crecimiento celular y a base de células según la presente invención.
La figura 2 representa una configuración alternativa de un elemento de ensayo individual del aparato microfabricado para uso con células que se cultivan en la superficie de perlas microportadoras.
Y la figura 3 es otra configuración de un elemento de ensayo individual del aparato microfabricado en el que se han dispuesto medios para evitar o impedir el paso de células en la cámara de crecimiento celular.
Con referencia a la figura 1b, el aparato de la presente invención incluye un disco rotativo (18) microfabricado para proporcionar un orificio de introducción de muestra (no representado) situado hacia el centro del disco y conectado a un depósito anular de muestra (9) que, a su vez, está conectado a una pluralidad de elementos de ensayo de microcanal radialmente dispersados (6), incluyendo cada uno de dichos elementos de microcanal una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada de muestra y un canal de salida para extracción de líquido de ella y una placa de cubierta situada sobre dicho disco para definir cámaras cerradas y canales de conexión. Cada elemento de microcanal está conectado en un extremo al depósito central de muestra (9) y en el extremo opuesto a un canal común de residuos (10).
Cada uno de los elementos microcanal radialmente dispersados (6) del aparato microfabricado (representado en la figura 1a) incluye un canal de entrada de muestra (1) conectado en su extremo izquierdo al depósito (9), una cámara de crecimiento celular (2) para llevar a cabo crecimiento celular y conectada mediante un canal (4) a una cámara de ensayo (3) y un canal de salida (6) conectado en su extremo derecho al canal de residuos (10).
En un formato alternativo de la presente invención representado en la figura 2, los elementos microcanal (6) se modifican para permitir el uso del aparato con células que se cultivan en la superficie de perlas microportadoras (17). Así, cada elemento microcanal (6) incluye un canal de entrada de muestra (8) conectado en su extremo izquierdo al depósito de muestra (9), una cámara de crecimiento celular (7) que conecta mediante un canal (16) con una cámara de ensayo (11), y un canal de salida (12) que conduce al canal común de residuos (10).
Con referencia a la figura 3, en otra realización del aparato, la cámara de crecimiento celular (2) puede estar provista de estructuras moldeadas elevadas dispuestas en la porción de base de la cámara de crecimiento celular para formar pilares (15), de tal manera que formen una barrera al flujo o paso de células que llegan a la cámara de crecimiento celular (2) mediante el canal de entrada (1), permitiendo al mismo tiempo el paso de líquido. Estas estructuras son de dimensiones elegidas para proporcionar entre las estructuras intervalos que son demasiado estrechos para permitir el paso de células transportadas como una suspensión en el líquido que se desplaza en el dispositivo, pero que son suficientemente grandes para permitir que células que se cultivan en la superficie de la cámara de crecimiento celular (14) migren mediante la barrera por extensión de procesos de célula entre la barrera y citoquinesis siguiente. Las dimensiones adecuadas para los intervalos entre los pilares elevados (15) formados en las cámaras de crecimiento celular son entre 5 y 50 \mum, dependiendo del tipo de célula y tamaño de célula seleccionados para la captura.
Cada elemento microcanal (6) representado en la figura 3 incluye además preferiblemente una o varias cámaras de ensayo para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes celulares y que están conectadas en línea entre dicha cámara de crecimiento celular (2) y dicho canal de salida (5).
El disco (18) es adecuadamente de una construcción moldeada de una o dos piezas y se hace de un plástico opcionalmente transparente o material polimérico por medio de piezas moldeadas separadas que se montan para proporcionar una estructura cerrada con agujeros en posiciones definidas para permitir la carga del dispositivo con líquidos y la extracción de líquidos residuales. En la forma más simple, el dispositivo se produce como dos partes complementarias, soportando una o cada estructura moldeada que, cuando se unen fijamente, forman una serie de elementos microcanal interconectados dentro del cuerpo de un disco sólido. Alternativamente los elementos microcanal se pueden formar por métodos de micromaquinado en los que los microcanales y las cámaras que forman los elementos microcanal se micromaquinan a la superficie de un disco, y una placa de cobertura; por ejemplo una película plástica, se adhiere a la superficie para encerar los canales y las cámaras.
Para dotar a las células cultivadas de medios para obtener oxígeno para el metabolismo y poder usar medios tamponados con CO_{2}, uno o varios componentes del dispositivo se construyen a partir de una película o membrana permeable a los gases. Adecuadamente, la película o membrana permeable a los gases se forma a partir de polímeros de silicona, tal como polidimetilsiloxano, o de poliuretano, politetrafluoroetileno u otros materiales plásticos permeables a los gases. Además se facilitan preferiblemente medios (no representados) para cerrar herméticamente los agujeros en la estructura cerrada para evitar la evaporación de líquido durante el uso, por lo que tales medios sellan los agujeros sin interferir con el intercambio de gases a los medios de crecimiento celular. El sellado se puede realizar mediante el uso de otra capa de material permeable a los gases a través de todo el dispositivo, o mediante el uso de un material no permeable aplicado localmente a los agujeros solamente, dejando expuesto a la atmósfera local el resto del material permeable a los gases.
Los materiales plásticos o poliméricos adecuados para formar la cámara de crecimiento celular y microcanales se seleccionan preferiblemente de manera que tengan propiedades hidrófobas, donde la superficie del plástico o polímero también se puede modificar selectivamente por medios químicos o físicos para alterar las propiedades superficiales para conferir una propiedad deseada, por ejemplo, compatibilidad con el crecimiento celular, unión de células y la unión de biomoléculas por medios covalentes o no covalentes. Los plásticos preferidos se seleccionan a partir de poliestireno y policarbonato.
Alternativamente, la cámara de crecimiento celular y los microcanales se pueden construir de materiales plásticos o poliméricos que se seleccionan de manera que tengan propiedades hidrófilas. La superficie del plástico o polímero también se puede modificar selectivamente por medios químicos o físicos para alterar las propiedades superficiales para producir regiones localizadas de hidrofobicidad dentro de las cámaras y/o microcanales para conferir una propiedad deseada. Por estos medios, por ejemplo, se puede disponer barreras o válvulas hidrófobas para controlar el flujo de líquido dentro del aparato. Los plásticos preferidos se seleccionan a partir de polímeros con una superficie cargada, adecuadamente poliestireno tratado químicamente o con plasma iónico, policarbonato u otros polímeros transparentes rígidos.
Los elementos microcanal (6) están dispersados radialmente alrededor del disco (18) y conectados a un orificio central común. Los canales 1, 4, 5, 8, 12, y 16 son de una dimensión compatible con el movimiento de células a lo largo de los canales. Adecuadamente, los canales y las cámaras pueden ser de cualquier forma en sección transversal, tal como cuadrada, rectangular, circular, trapezoidal y triangular. Adecuadamente, la cámara de crecimiento celular (2) está dimensionada para proporcionar un área de suelo entre 100 \mum^{2} y 1.000.000 \mum^{2}, preferiblemente entre 1000 \mum^{2} y 1.000.000 \mum^{2} y muy preferiblemente entre 10.000 \mum^{2} y 1.000.000 \mum^{2}. La superficie del plástico o polímero de la cámara de crecimiento celular se puede tratar o modificar selectivamente para permitir la unión y/o el crecimiento de células. El tratamiento implica preferiblemente exposición a luz UV intensa para modificar la superficie del polímero o alternativamente el uso de alto voltaje descarga de plasma usando técnicas conocidas (véase Amstein, C. F. y Hartmann, P. A., J. Clin. Microbiol., 2. 1, 46-54 (1975)) para crear una superficie con carga negativa adecuada para crecimiento celular y unión y (si es preciso) a efectos de ensayo. La unión de células se puede mejorar más mediante la aplicación de recubrimientos adicionales a la superficie de la cámara de crecimiento celular, por ejemplo, polilisina, colágeno, fibronectina.
Como ya se ha mencionado, en el aspecto preferido de la invención, cada uno de los elementos microcanal (6) está provisto además de una cámara de ensayo (3) que está situada en línea entre la cámara de crecimiento celular (2) y el canal de salida (5), para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes celulares. La cámara de ensayo está dimensionada proporcionalmente al volumen de la cámara de crecimiento celular (2) para permitir la recogida y/o captura de analitos solubles que se pueden derivar de las células cultivadas bajo estudio.
Adecuadamente, el volumen de la cámara de ensayo (3) está entre dos veces y una décima parte del volumen de la cámara de crecimiento celular (2). Ventajosamente, el canal (4) que conecta la cámara de crecimiento celular y la cámara de ensayo se caracteriza por tener paredes hidrófobas y un área en sección transversal que es menor que el canal (1) hacia arriba de la cámara de crecimiento celular. Adecuadamente, el canal (4) tiene un área en sección transversal de entre 0,99 y 0,01 veces la del canal de entrada (1). Adecuadamente, el canal de salida (5) se caracteriza por tener paredes hidrófobas y un área en sección transversal de entre 0,99 y 0,01 veces la del canal (4). De esta forma, se puede controlar el flujo de líquido en los elementos microcanal mediante la aplicación de una fuerza centrífuga definida para hacer que el líquido fluya en un canal de un área en sección transversal definida, donde la misma fuerza es insuficiente para hacer que el líquido fluya en más canales enlazados de menor área en sección transversal, teniendo esto el efecto de parar el flujo de líquido en una posición deseada en el elemento microcanal.
En unos medios alternativos de controlar el flujo de líquido, el canal (1) y el canal (4) se construyen con la misma área en sección transversal, pero la superficie de cada uno de los canales se puede modificar selectivamente por medios químicos o físicos para conferir un grado diferente de hidrofobicidad en dicho canal. Por ejemplo, el canal (4) hacia abajo de la cámara de crecimiento celular (2) se puede tratar de manera que tenga una hidrofobicidad más alta que el canal (1) hacia arriba de la cámara de crecimiento celular. Por estos medios, la aplicación de una fuerza definida al líquido en el canal (1), suficiente para hacer que baje líquido por este canal, será insuficiente para hacer que entre líquido en el segundo canal (4) de hidrofobicidad más alta, teniendo esto el efecto de parar el flujo de líquido en una posición deseada en el elemento microcanal. Los medios adecuados para modificar selectivamente la hidrofobicidad de la superficie de los canales incluyen exposición de zonas definidas a radiación ionizante o electromagnética o plasma iónico mediante una máscara, o mediante la aplicación de un material hidrófobo o tinta por serigrafía u otros medios de aplicación localizada.
Los medios de controlar flujo de líquido dentro del aparato descrito anteriormente se pueden usar solos o en combinación según sea preciso, para conferir el control deseado de flujo de líquido en cámaras y canales conectados dentro del elemento microcanal. Si se utilizan en combinación, los métodos se pueden usar secuencialmente, por ejemplo donde un cambio del área en sección transversal va seguido de un cambio de la hidrofobicidad, formando dos puntos secuenciales de control de flujo de líquido. Alternativamente, los métodos se pueden usar de forma coincidente, en los que un cambio del área en sección transversal de un canal va acompañado de un cambio de la hidrofobicidad de dicho canal, usándose la combinación para conferir un grado de control sobre flujo de líquido no alcanzable usando unos medios únicos.
La superficie interior de la cámara de ensayo se puede recubrir con uno o varios ligandos capaces de unir específicamente un analito de interés enlazando de forma covalente o no covalente el ligando a la superficie. Ejemplos de ligandos adecuados para tal fin incluyen: biotina, estreptavidina, proteína A, anticuerpos, lectinas, receptores hormonales, sondas de ácido nucleico, proteínas de unión de ADN y análogos.
El aparato y método se pueden usar para la detección del crecimiento celular y la medición de actividad celular, parámetros celulares y procesos bioquímicos, por ejemplo metabolismo celular, viabilidad de células, expresión de gen indicador, usando técnicas no invasivas, es decir, técnicas que no ponen en peligro la integridad o viabilidad de las células. Alternativamente, el aparato se puede usar en la detección y medición de productos derivados de células, que se han liberado o excretado de otro modo de células, tal como hormonas peptídicas, segundos mensajeros, etc. Mediante el uso del aparato mostrado en la figura 3, el aparato permite estudios de migración celular en respuesta a estímulos químicos o físicos, por ejemplo quimiotaxia, donde una sustancia quimioatrayente se coloca en un lado de una barrera y se observan las células colocadas en el lado opuesto de la barrera para penetrar la barrera al moverse hacia el quimioatrayente.
La invención se puede usar con cualquier tipo de célula que pueda ser cultivada en artículos de plástico estándar de cultivo de células. Tales tipos de células incluyen todas las células normales y transformadas derivadas de cualquier fuente reconocida con respecto a la especie (por ejemplo, humanos, roedores, simios), fuente de tejido (por ejemplo, cerebro, hígado, pulmón, corazón, corteza de riñón, músculo) y tipo de célula (por ejemplo, epitelial, endotelial). Además, células que han sido transfectadas con genes recombinantes también pueden ser cultivadas usando la invención. hay protocolos establecidos disponibles para el cultivo de diversos tipos de células. (Véase, por ejemplo, Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2ª edición, Alan R. Liss Inc. 1987). Tales protocolos pueden requerir el uso de recubrimientos especiales y medios selectivos para permitir el crecimiento celular y la expresión de funciones celulares especializadas. Ninguno de tales protocolos está excluido del uso con el aparato de esta invención.
La escala del dispositivo vendrá dictada en cierta medida por su uso, es decir, el dispositivo será de un tamaño que sea compatible con el uso con células eucarióticas. Esto impondrá un límite inferior a cualquier canal diseñado para permitir el movimiento de células y determinará el tamaño de las zonas de contención o crecimiento de células según el número de células presentes en cada ensayo. Una célula media de mamífero que se cultiva como un cultivo adherente tiene un área de \sim300 \mum^{2}; las células no adherentes y las células adherentes no unidas tienen un diámetro esférico de \sim10 \mum. En consecuencia, es probable que los canales para movimiento de células dentro del dispositivo tengan dimensiones del orden de 20-30 \mum o más. Los tamaños de las zonas de contención de células dependerán del número de células necesario para llevar a cabo un ensayo (determinándose el número tanto por la sensibilidad como los requisitos estadísticos). Se contempla que un ensayo y típico requeriría un mínimo de 500-1000 células que para células adherentes requerirán estructuras de 150.000-300.000 \mum^{2}, es decir, "cavidades" circulares de \sim400-600 \mum de diámetro.
La configuración de los microcanales en la presente invención se elige preferiblemente para permitir la siembra simultánea de la cámara de crecimiento celular mediante la aplicación de una suspensión de células en un medio fluido al depósito de muestra por medio del orificio de entrada de muestra, seguido de la rotación del disco (18) por medios adecuados a una velocidad suficiente para producir el movimiento de la suspensión de células hacia fuera hacia la periferia del disco por fuerza centrífuga. El movimiento del líquido distribuye la suspensión de células a lo largo de cada uno de los microcanales de entrada (1, 8) hacia las cámaras de crecimiento celular (2, 7). La velocidad de rotación del disco se elige para proporcionar suficiente fuerza centrífuga para permitir que fluya líquido para llenar la cámara de crecimiento celular (2, 7); pero con fuerza insuficiente para que entre líquido en el canal restringido (4, 16) de menor diámetro en el lado opuesto de la cámara de crecimiento celular.
Una vez que ha parado la rotación, las células en la suspensión pueden sedimentar bajo gravedad sobre la parte inferior de la cámara de crecimiento celular (2, 7) y unirse a la superficie tratada si está presente. Las células que permanecen en el canal son incapaces de unirse a la superficie hidrófoba no tratada y permanecerán en suspensión. Por lo tanto, después de un período de tiempo apropiado, elegido para permitir que tenga lugar la unión de células, el dispositivo se puede girar a mayor velocidad que antes, de tal manera que se haga que todo el líquido y las células no unidas se desplacen hacia la periferia del disco al canal de residuos (10) dispuesto alrededor del borde del disco. Después de salida del espacio libre de canales de células no unidas, la rotación se ralentiza a la misma velocidad usada inicialmente para llenar los elementos microcanal y se aplica medio nuevo de cultivo de células al depósito de muestra. Por la rotación una vez más del disco, el medio de cultivo celular fluye bajo fuerza centrífuga para llenar los microcanales y las cámaras de crecimiento celular como se ha descrito previamente. Esta acción deja las células unidas sembradas en la superficie de las cámaras de crecimiento celular cubiertas con medio de cultivo fresco adecuado para ensayos de crecimiento celular y a base de células.
En el aparato de la figura 2, las perlas (17) proporcionan un área superficial grande para unión de células y crecimiento en un volumen de líquido relativamente pequeño. En el dispositivo aquí descrito, las perlas (17) realizan dos funciones: en primer lugar, proporcionan una superficie para la unión y crecimiento de células, eliminando así la necesidad de proporcionar una superficie compatible con el crecimiento celular dentro del disco que permite usar una banda más amplia de materiales para construcción, y, en segundo lugar, proporcionan una portadora física más grande para células que permite diseñar fácilmente canales dentro del dispositivo para evitar el acceso de células. En la realización preferida, cada elemento incluye una cámara de crecimiento celular (2, 7), una cámara de análisis (3, 11), y una cámara residual (10) que están dispuestas radialmente alrededor del centro del disco y conectadas a un orificio común en el centro del disco.
Después de la adición de muestras de células al aparato, su unión y siguiente crecimiento celular, se puede introducir reactivos y muestras para ensayo en el depósito de muestra (9) mediante el orificio de entrada de muestra. Los reactivos a suministrar a todos los elementos microcanal se pueden introducir, como se ha descrito anteriormente, para sembrar con células, es decir, aplicando una solución conteniendo reactivos al orificio central y girando el disco para producir la distribución del reactivo a todos los microcanales, cámaras de crecimiento celular y cámaras de ensayo. La aplicación de muestras específicas a cavidades específicas se puede lograr pipetando pequeños volúmenes de líquido como gotas discretas a la cavidad central directamente junto al agujero del canal de entrada que conduce a la cámara de crecimiento celular que ha de recibir la muestra. Esto se puede lograr, por ejemplo, utilizando un dispositivo dispensador piezoeléctrico (no representado), por lo que la dispensación de gotitas de líquido del dispositivo se sincroniza con la velocidad de rotación del disco (18) de tal manera que, a una combinación apropiada de frecuencia de dispensación de gotas y la velocidad de rotación del disco, se pueda hacer que gotitas individuales de líquido choquen en la superficie del disco y se pueda hacer que sean transportadas por fuerza centrífuga a un canal de entrada adyacente (1, 8) y se mezclen con líquido presente en la cámara de crecimiento celular (2, 7).
Se puede pipetar alternativamente líquidos como gotas discretas sobre la superficie hidrófoba de un disco estacionario (18), usándose la rotación del disco para mover estas gotas de líquido al canal de entrada apropiado y así a la cámara de crecimiento celular. Por dichos medios, todos los reactivos y muestras se pueden suministrar a la cámara de células en el orden y proporciones deseados para efectuar el ensayo.
Una vez que se han realizado las manipulaciones de líquido del ensayo es necesario efectuar un procedimiento de detección para medir el resultado del ensayo, midiendo típicamente la señal emitida por un radical marcador fluorescente, quimiluminiscente u otro. El dispositivo representado en la figura 1b está configurado para permitir dos medios de detección de la señal de ensayo. En primer lugar, la señal de ensayo se puede medir in situ en la cámara de crecimiento celular. Tal señal estaría tipificada por la medición del producto de un gen indicador dentro de las células, por ejemplo fluorescencia de GFP.
Alternativamente, puede ser deseable medir productos o analitos derivados de células, por ejemplo por métodos de ensayo de unión inmunoquímica u otra específica, en ausencia de células cultivadas en el aparato, para evitar la interferencia en la medición. En este caso, el aparato está provisto de una segunda cámara, es decir, la cámara de ensayo (3, 11) dispuesta más cerca de la periferia del disco y conectada a la cámara de crecimiento celular (2, 7). La cámara de ensayo está conectada al canal periférico de residuos (10) por un canal estrecho (5, 12), teniendo este canal un menor diámetro que el canal (4, 16) que conecta la cámara de ensayo con la cámara de crecimiento celular. La diferencia de diámetros entre cámaras permite, en condiciones controladas de rotación y fuerza centrífuga, como se ha explicado anteriormente, que se desplace líquido de la cámara de crecimiento celular a la cámara de ensayo. Por ejemplo, por este proceso, se desplaza un analito de la cámara de crecimiento celular a la cámara de ensayo donde el analito se somete a captura de afinidad por un ligando unido a la pared de la cámara de ensayo. Por lo tanto, este proceso proporciona unos medios de alejar un analito derivado de células, que ha sido liberado o excretado de otro modo de células, del entorno celular, inmovilizando el analito dentro de la cámara de ensayo por medio de un compañero de unión específica a unir al analito, y permitiendo adiciones siguientes de reactivos y procesado para permitir la detección del analito.
Opcionalmente, al menos uno de los reactivos para uso en un método de ensayo utilizando el aparato puede ser marcado con un marcador detectable por unión covalente o no covalente. Se puede seleccionar marcadores detectables adecuados de marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminicentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores de enzimas y marcadores radioactivos. Se puede seleccionar marcadores fluorescentes adecuados para marcar reactivos según el método de la invención a partir de las categorías generales de colorantes fluorescentes, incluyendo, aunque sin limitación, fluoresceínas, rodaminas, colorantes de cianina, cumarinas, y los grupos de colorantes fluorescentes BODIPY. Se hallarán ejemplos de marcadores bioluminiscentes detectables en las proteínas indicadoras fluorescentes, tal Proteína Fluorescente Verde (GFP) y aecuorina. Los marcadores alternativos para obtener una señal detectable pueden ser marcadores de transferencia de energía de fluorescencia.
Una vez que el ensayo ha terminado, la medición de la señal se puede lograr por medios apropiados para la molécula o radical marcador utilizado en el ensayo y se logra típicamente por medios ópticos. Por ejemplo, la luminescencia emitida de células o de un reactivo de ensayo marcado fluorescente se puede detectar en el aparato microfabricado utilizando un aparato de formación de imágenes que incorpora una cámara CCD, o utilizando un fluorímetro. La detección de fluorescencia emitida se puede lograr mediante el cuerpo del disco (18) donde el disco está hecho totalmente de un material transparente o alternativamente mediante ventanas de material transparente que han sido fabricadas en el cuerpo del disco.
Como alternativa a la detección no radiactiva, el aparato de la presente invenció se puede usar en unión con detección radiactiva utilizando la técnica de proximidad de escintilación. Por ejemplo, se puede introducir en el aparato perlas conteniendo escintilante. Alternativamente el aparato microfabricado de la invención puede llevar incorporada una capa conteniendo escintilante en o sobre una superficie interior de la cámara de crecimiento celular (2, 7) y/o la cámara de ensayo (3, 11). La región del aparato conteniendo las perlas escintilantes o superficie escintilante es preferiblemente ópticamente transparente para permitir que el material transmita luz a una longitud de onda dada con eficiencia óptima. La región conteniendo escintilante puede estar compuesta de cualquier material transparente conteniendo escintilante, por ejemplo. Un vidrio escintilante a base de compuestos conteniendo metal lantánido, o un material plástico tal como poliestireno o poliviniltolueno, al que se incorpora la sustancia escintilante.
Las sustancias escintilantes adecuadas pueden incluir hidrocarburos aromáticos tal como p-terfenil, p-cuaterfenil y sus derivados, y derivados de oxazoles y 1,3,4-oxadiazoles, por ejemplo, 2-(4-t-butilfenil)-5-(4-bifenilil)-1,3,4-oxadiazol y 2,5-difeniloxazol. También se puede incluir un desplazador de longitud de onda tal como 1,4-bis(5-fenil-2-oxazolil) benceno, o 9,10-difenilantraceno.
Un radical de unión tal como un miembro de un par de unión específico puede ser inmovilizado sobre la superficie de la perla o capa escintilante para unir específicamente con un analito que se puede derivar de células usadas en el proceso de ensayo. Elementos de par de unión específicos adecuados con los que es útil la invención, incluyen biotina, estreptavidina, proteína A, anticuerpos, lectinas, receptores hormonales, sondas de ácido nucleico, proteínas de unión de ADN y análogos. Se ha de entender que cualquier elemento del par de unión específico se puede unir e inmovilizar para unir a un elemento complementario del par de unión específico.
Los radioisótopos típicos que se puede usar para marcar el reactivo de ensayo incluyen los usados de ordinario en bioquímica tal como [^{3}H], [^{126}I], [^{36}S] y [^{33}P], pero no excluyen el uso de otros isótopos. Las metodologías de detección basadas en proximidad de escintilación son conocidas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 4568649, Bertoglio-Matte, J.). La detección puede utilizar varias modalidades a combinar para poder medir todos los ensayos simultáneamente o en sucesión rápida. Un formato apropiado de formación de imágenes puede proporcionar alternativamente medios de detección adecuados para ensayos radioactivos y no radiactivos utilizando el aparato.
En algunos usos, algunas zonas de ensayo serán redundantes; es decir, no todos los elementos del aparato se usarán cada vez. Se contempla que el usuario decida qué tipo de ensayos hay que efectuar y seleccionar después medios de control apropiados para dirigir el flujo de líquido dentro del aparato. En consecuencia, tales estructuras serán compatibles con un rango de procedimientos y protocolos de ensayo que requieren diferentes complejidades de movimiento de fluido. Por ejemplo, la detección de un gen indicador enlazado con GFP requerirá una estructura de cavidades simples para permitir la medición de fluorescencia. En contraposición, la medición de un analito secretado de células, por ejemplo, la medición de una citoquina por inmunoensayo, o la medición de mRNA celular después de lisis, requerirá una estructura más complicada para separar las células del analito secretado antes del análisis de dicho analito.
La invención se ilustra mejor por referencia a los ejemplos siguientes.
Ejemplo 1
Se cultivó un cultivo de células HeLa en Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% suero de ternera y L-glutamina en un matraz de plástico usando condiciones estándar de cultivo de tejidos. Se recogieron células por tripsinización y la suspensión resultante se concentró por centrifugación dando una concentración de células de 10^{7} células/ml. Se aplicaron alícuotas de la suspensión de células (1 \mul) a agujeros en la superficie de una estructura microfabricada del tipo representado en la figura 1, producida por moldeo por inyección, con canales internos de 50 \mum de profundidad y 100 \mum de anchura.
La suspensión de células se movió a lo largo de los canales de entrada dentro del disco a cámaras circulares de crecimiento celular de 50 \mum de profundidad y 500 \mum de diámetro y se dejó que las células se uniesen y creciesen. Después de incubación durante 48 horas en una incubadora de cultivo de tejidos (37ºC/95% HR), se examinó la densidad, morfología y viabilidad de las células. Exámenes visibles por microscopía de contraste de fase mostraron que las poblaciones de células que crecían en microstructuras tenían la misma densidad y morfología que los cultivos de control crecidos del mismo material padre y mantenidos en artículos de plástico estándar de cultivo de células. Después se comprobó la viabilidad de las células usando un kit comercial de prueba (LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes, Oregon, L-3224) lavando el medio de crecimiento de las células dentro del dispositivo, lavando las células con una solución salina fosfato tamponada (PBS) e introduciendo una solución de los reactivos de ensayo fluorescentes en las cámaras de crecimiento celular. El examen posterior por microscopía fluorescente demostró que las células que crecían en microstructuras habían mantenido una viabilidad de células de >95%, comparable con las células de control cultivadas bajo condiciones estándar de cultivo de tejidos.
Ejemplo 2
Un disco de plástico microfabricado del tipo representado en la figura 1, producido por moldeo por inyección, que contenía varios canales internos radial de 50 \mum de profundidad y 100 \mum de anchura, se modificó selectivamente en superficie por exposición a una lámpara UV de 500 W a una distancia de 20 cm durante 30 minutos mediante una máscara metálica de tal manera que la luz UV chocase en la superficie solamente en regiones definidas por la máscara.
Se cultivó un cultivo de células HeLa en Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% suero de ternera y L-glutamina en un matraz de plástico usando condiciones estándar de cultivo de tejidos. Se recogieron células por tripsinización y la suspensión resultante se concentró por centrifugación dando una concentración de células de 10^{7} células/ml. Se aplicaron alícuotas de la suspensión de células (1 \mul) a agujeros en la superficie del dispositivo y las células se movieron a lo largo de los canales por rotación alrededor del eje de disco (1000 rpm durante 30 segundos). Después de la incubación durante 18 horas en una incubadora de cultivo de tejidos (37ºC/95% HR), se examinaron las células por microscopía de contraste de fase. Se halló que las células se cultivaban preferentemente en regiones del disco previamente expuestas a luz UV, se observó que las células en otras regiones eran menos densas y estaban menos unidas. El disco se giró después a 1000 rpm durante 30 segundos y se reexaminaron las células. Después del giro se halló que las células en zonas expuestas a UV habían permanecido unidas a la superficie de plástico y seguía siendo morfológicamente idénticas a las células de control; en contraposición, las células en superficies no expuestas se quitaron por la fuerza centrífuga generada por el disco giratorio.
Ejemplo 3
Células HeLa cultivadas y recogidas como se ha descrito anteriormente se introdujeron en el dispositivo del Ejemplo 2 en microcanales que contenían pilares moldeados de varias dimensiones dispersados en los canales para hacer de barreras al movimiento celular en los canales. Se introdujo en los canales una suspensión de células y se incubó la estructura durante 18 horas para dejar que las células se sedimentasen y creciesen. El examen posterior reveló que en canales donde los intervalos entre los pilares eran de 10 x 60 \mum o más, se observó que células habían pasado libremente por las barreras. En contraposición, donde los intervalos entre los pilares eran de 10 x 20 \mum o menos, se impidió que las células pasasen por la barrera al ser transportadas por el flujo de líquido en suspensión. Sin embargo, a la incubación y crecimiento siguientes, se observó que las células migraban por tales barreras por deformación lenta. Tales estructuras de barrera pueden ser útiles para el estudio de movimiento o migración celular en respuesta a estímulos químicos o físicos.
Ejemplo 4
Se introdujo células HeLa transfectadas para producir una expresión estable de una proteína de fusión de Calreticulina-GFP en un aparato moldeado del tipo representado en la figura 1, que soporta canales de 100 \mum de anchura y 100 \mum de profundidad conectados a cámaras circulares de 600 \mum y 1000 \mum de diámetro y 100 \mum de profundidad. Las células se incubaron durante 18 horas en una incubadora de cultivo de tejidos y examinaron por microscopía de fluorescencia confocal. Las células cultivadas en estructuras microfabricadas mostraron el mismo nivel de expresión GFP que las células de control cultivadas bajo condiciones convencionales de cultivo de tejidos.
Ejemplo 5
Se cultivaron células HeLa e introdujeron en un disco microfabricado como se describe en el Ejemplo 1. Después de incubación durante 18 horas se extrajo de las células el medio de crecimiento y sustituyó por medio conteniendo diferentes concentraciones del agente de permeabilización de membranas, digitonina, en el rango 0-0,2 mg/ml (p/v) y se incubaron células en presencia de digitonina durante 10 minutos. La viabilidad de las células se midió después como se describe en el Ejemplo 1. Se halló que los resultados eran equivalentes a las células expuestas al mismo rango de dosis de digitonina en un ensayo a base de placa de microtítulo.

Claims (26)

1. Aparato incluyendo:
a)
una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella;
b)
una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales;
c)
una suspensión de células a cultivar; y
d)
medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular;
caracterizado porque uno o varios componentes del aparato se construyen de una película o membrana de tal manera que dicho uno o varios componentes sean permeables a los gases en la medida en que se puede usar medios tamponados con CO_{2} en la cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que puede permear oxígeno, a su través a las células para sus metabolismo durante el crecimiento.
2. Aparato según la reivindicación 1, donde dicha placa base incluye un disco rotativo que se microfabrica para proporcionar un orificio de introducción de muestra situado hacia el centro del disco y conectado a un depósito anular de muestra, y donde dichos elementos microcanal están dispersados radialmente en dicho disco con sus respectivos canales de entrada conectados para recibir muestra de dicho depósito.
3. Aparato según la reivindicación 1 ó 2, donde dicha placa de cobertura se fabrica de material plástico permeable a los gases.
4. Aparato según la reivindicación 3, donde dicho material plástico es un polímero de silicona, poliuretano, o politetrafluoroetileno.
5. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dichos medios para unión de células y crecimiento celular se han introducido modificando química o físicamente al menos una porción de una superficie de dicha cámara de crecimiento celular para permitir la unión de células y el crecimiento celular.
6. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dichos medios para unión de células y crecimiento celular incluyen una superficie con carga negativa.
7. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dichos medios para unión de células y crecimiento celular incluyen un recubrimiento superficial de polilisina, colágeno y/o fibronectina.
8. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde los medios para unión de células y crecimiento celular incluyen una o más perlas microportadoras situadas en dicha cámara de crecimiento celular, donde cada una de dichas perlas microportadoras realiza unión de células y crecimiento celular.
9. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la cámara de crecimiento celular incluye además elementos moldeados elevados dispuestos en la porción de base de la cámara de crecimiento celular para formar pilares.
10. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde el área en sección transversal de dicho canal de entrada es mayor que la de dicho canal de salida.
11. Aparato según la reivindicación 10, donde el área en sección transversal de dicho canal de salida es entre 0,99 y 0,01 veces la de dicho canal de entrada.
12. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde al menos algunos de dichos elementos microcanal incluyen además una o varias cámaras de ensayo para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes celulares y conectados en línea entre dicha cámara de crecimiento celular y dicho canal de salida.
13. Aparato según la reivindicación 14, donde la cámara o cámaras de ensayo están conectadas entre sí y a dicha cámara de crecimiento celular por un canal o canales intermedios en el orden de: canal de entrada, cámara de crecimiento celular, canal intermedio 1, cámara de ensayo 1, canal intermedio 2 (si está presente), cámara de ensayo 2 (si está presente), ..., canal de salida, y donde las zonas en sección transversal de los canales respectivos se reducen progresivamente del canal de entrada al canal de salida.
14. Aparato según la reivindicación 13, donde el área en sección transversal del o cada canal intermedio y el canal de salida es entre 0,99 y 0,01 veces la del canal inmediatamente precedente (hacia arriba).
15. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde se ha previsto en o sobre una superficie interior de una o varias de dichas cámaras de ensayo una capa incluyendo una sustancia escintillante.
16. Aparato según la reivindicación 15, donde la capa incluyendo una sustancia escintilante incluye un radical de unión unido a ella, siendo dicho radical de unión un elemento de un par de unión específico seleccionado a partir de biotina; estreptavidina, proteína A, anticuerpos, lectinas, receptores hormonales, sondas de ácido nucleico, y proteínas de unión de ADN.
17. Un método para determinar el efecto de una sustancia de prueba en una actividad celular o parámetro físico utilizando un aparato como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, incluyendo dicho método:
a)
proporcionar una o varias muestras de sustancias de prueba cuyo efecto en las células se ha de medir en condiciones para hacer que dichas células se expongan a dichas sustancias; y
b)
determinar el efecto de las sustancias de prueba en dichas células por medio de detección óptica.
18. Un método según la reivindicación 17, donde las células son adherentes.
19. Un método según la reivindicación 18, donde se cultivan células que se adhieren a una superficie dentro del aparato antes de la introducción de las sustancias de prueba.
20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, donde se facilita después del paso siguiente c) uno o varios reactivos de ensayo y dispersar dichos reactivos a una o varias cámaras de reacción en dicho aparato.
21. Un método según la reivindicación 20, donde al menos uno de dichos reactivos de ensayo se marca con un marcador detectable seleccionado a partir de marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, marcadores bioluminescentes, marcadores de enzima y marcadores radioactivos.
22. Un método para medir un analito celular utilizando el aparato como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, incluyendo dicho método
a)
dejar que las células crezcan;
b)
proporcionar uno o varios reactivos de ensayo y dispersar dichos reactivos a una o varias cámaras en dicho aparato;
c)
medir el analito celular por medios ópticos.
23. Un método según la reivindicación 22, donde al menos uno de dichos reactivos de ensayo se marca con un marcador detectable seleccionado a partir de marcadores fluorescentes, marcadores quimiluminiscentes, marcadores bioluminescentes, marcadores de enzimas y marcadores radioactivos.
24. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 22-23, donde las células son adherentes.
25. El uso del aparato definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para cultivar células en asociación con un ensayo a base de células.
26. El uso según la reivindicación 25, donde las células son células adherentes.
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