ES2203098T3 - Aparato microfabricado para dosificados a base de celulas. - Google Patents
Aparato microfabricado para dosificados a base de celulas.Info
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Abstract
Aparato incluyendo: a) una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella; b) una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales; c) una suspensión de células a cultivar; y d) medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular; caracterizado porque uno o varios componentes del aparato se construyen de una película o membrana de tal manera que dicho uno o varios componentes sean permeables a los gases en la medida en que se puede usar medios tamponados con CO2 en la cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que puede permear oxígeno, a su través a las células para sus metabolismo durante el crecimiento.
Description
Aparato microfabricado para dosificados a base de
células.
La presente invención se refiere a ensayos de
crecimiento celular y a base de células. En particular, la
invención se refiere a un aparato microfabricado para llevar a cabo
ensayos de crecimiento celular y a base de células y a métodos para
llevar a cabo tales ensayos.
El enfoque corriente en aplicaciones de selección
de alta producción tendentes a la selección de cantidades
crecientes de compuestos es movido por las tecnologías dobles de la
química combinatoria y la genómica, para producir nuevos
medicamentos blancos potenciales y nuevos medicamentos candidatos
como compuestos terapéuticos potenciales. El proceso de selección
primaria ha sido afrontado por el desarrollo de procesos de ensayo
de selección de alta producción y miniaturización de ensayos
utilizando el formato de placa de cavidades de microtítulo con 384,
864, 1536 o más cavidades miniaturizadas. Los ensayos
miniaturizados son capaces de permitir niveles de producción de más
de 100.000 pruebas/día en selección primaria. A este nivel de
producción, cabría esperar que una selección primaria produzca
100-1000 "aciertos" por día. Cada uno de estos
medicamentos putativos tiene que experimentar selección más
refinada y comprobación en varios ensayos para investigar la
compatibilidad biológica del compuesto. Tales ensayos incluyen
biodisponibilidad, metabolismo y toxicología, y se realizan
predominantemente usando líneas de células cultivadas. En
comparación con los ensayos utilizados en el proceso de selección
primaria, los ensayos de selección secundaria tiene un nivel mucho
más alto de complejidad y requisitos más estrictos, tanto en la
mecánica del ensayo como en la información generada. Se requiere en
la técnica metodologías de ensayo de selección secundaria que sean
capaces de manejar tanto una tasa creciente de generación avanzada
de medicamentos putativos como la generación de datos biológicos
referentes al medicamento candidato. Además, el desarrollo de
ensayos que producen un mayor contenido de información tiene el
potencial de incrementar el nivel de caracterización de un
medicamento avanzado durante la fase de selección del desarrollo de
medicamentos.
Se han descrito previamente dispositivos
microfabricados que son adecuados para ser utilizados en análisis
biológicos miniaturizados. Por ejemplo, WO 96/15450 describe un
dispositivo que incluye una estructura de vidrio atacada con una
colección de cámaras conectadas por un microcanal y encerradas por
una placa de cobertura de vidrio. Wilding y otros han descrito
dispositivos, por ejemplo, en WO 93/22058, que describen un
dispositivo de mesoescala para amplificar ADN por PCR, constando el
dispositivo de varias cámaras conectadas por un canal. WO 93/22055
y WO 93 22053 se refieren a dispositivos para analizar una muestra
fluida conteniendo células incluyendo un sistema de flujo de
mesoescala con orificio de entrada para captura y/o lisis de
células en fluidos biológicos, o conteniendo un radical de unión
para unir específicamente un analito, donde el analito puede ser un
componente intracelular en una célula en una muestra, o una
población de células en una muestra.
Los dispositivos anteriores se refieren a la
medición o detección de células o analitos celulares en células
introducidas en el dispositivo inmediatamente antes del análisis.
no se describen para uso en cultivo o crecimiento celular, ni para
uso en el estudio de respuestas celulares a agentes bajo prueba.
Además, no describen ni permiten el uso de células cultivadas
adherentes. También se puede ver ideas similares en US 5.637.469,
US 5.593.838 y WO 97/21090. US 5.637.469 sugiere en términos
generales supervisar el crecimiento celular en sistemas de
mesoescala y supervisar la inhibición de flujo como una indicación
de crecimiento de un organismo no especificado en una estructura de
mesoescala que se ha llenado con medio de crecimiento y muestra
(ejemplo 7) y sellado.
WO 9614933 describe dispositivos de mesoescala
para (a) caracterizar la motilidad de células, primariamente
células de esperma, es decir, células que se mueven sin necesidad
de medios de unión, (b) separar y recoger células con motilidad de
interés, y (c) fertilización in vitro.
FR 2657879 describe un dispositivo de macroescala
para cultivo de células.
US 4.018.652 describe un dispositivo de
macroescala para la determinación de la concentración de
microorganismos.
Se requiere un dispositivo capaz de proporcionar
un entorno que soporte la supervivencia a largo plazo de células
cultivadas, acoplado con medios para utilizar células cultivadas
dentro del dispositivo para análisis secundario de medicamentos u
otros estudios.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un aparato incluyendo:
- a)
- una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella;
- b)
- una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales;
- c)
- una suspensión de células a cultivar; y
- d)
- medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular;
caracterizado porque uno o varios componentes del
aparato se construye de una película o membrana de tal manera que
dicho uno o varios componentes sea permeable a los gases en la
medida en que se puede usar medios tamponados con CO_{2} en la
cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que puede permear
oxígeno a su través a las células para su metabolismo durante el
crecimiento.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para determinar el efecto de una sustancia de prueba en
una actividad celular o parámetro físico utilizando el aparato
antes definido, incluyendo dicho método:
- a)
- suministrar una o varias muestras de sustancias de prueba cuyos efectos en las células se ha de medir en condiciones para hacer que dichas células sean expuestas a dichas sustancias;
- b)
- determinar el efecto de las sustancias de prueba en dichas células por medio de detección óptica.
El método para determinar el efecto de una
sustancia de prueba incluye preferiblemente el paso de cultivar
células que se adhieren a una superficie dentro del aparato antes
de la introducción de las sustancias de prueba. Después del paso c)
se facilitan preferiblemente uno o varios reactivos de ensayo y
dispersar los reactivos a una o varias cámaras de reacción en el
aparato.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para medir un analito celular mediante el uso del aparato
antes definido, método que incluye:
- a)
- dejar que las células crezcan;
- b)
- proporcionar uno o varios reactivos de ensayo y dispersar dichos reactivos a una o varias cámaras en dicho aparato;
- c)
- medir el analito celular por medios ópticos.
Con el fin de que la invención se pueda entender
mejor, ahora se describirán varias realizaciones a modo de ejemplo
solamente y con referencia a los dibujos acompañantes, en los
que:
La figura 1a es una representación diagramática
en planta de un elemento de microcanal individual del aparato
microfabricado para realizar ensayos de crecimiento celular y a
base de células.
La figura 1b es una vista en sección de un disco
microfabricado incluyendo una pluralidad de elementos de ensayo para
realizar ensayos de crecimiento celular y a base de células según
la presente invención.
La figura 2 representa una configuración
alternativa de un elemento de ensayo individual del aparato
microfabricado para uso con células que se cultivan en la
superficie de perlas microportadoras.
Y la figura 3 es otra configuración de un
elemento de ensayo individual del aparato microfabricado en el que
se han dispuesto medios para evitar o impedir el paso de células en
la cámara de crecimiento celular.
Con referencia a la figura 1b, el aparato de la
presente invención incluye un disco rotativo (18) microfabricado
para proporcionar un orificio de introducción de muestra (no
representado) situado hacia el centro del disco y conectado a un
depósito anular de muestra (9) que, a su vez, está conectado a una
pluralidad de elementos de ensayo de microcanal radialmente
dispersados (6), incluyendo cada uno de dichos elementos de
microcanal una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada
de muestra y un canal de salida para extracción de líquido de ella
y una placa de cubierta situada sobre dicho disco para definir
cámaras cerradas y canales de conexión. Cada elemento de microcanal
está conectado en un extremo al depósito central de muestra (9) y
en el extremo opuesto a un canal común de residuos (10).
Cada uno de los elementos microcanal radialmente
dispersados (6) del aparato microfabricado (representado en la
figura 1a) incluye un canal de entrada de muestra (1) conectado en
su extremo izquierdo al depósito (9), una cámara de crecimiento
celular (2) para llevar a cabo crecimiento celular y conectada
mediante un canal (4) a una cámara de ensayo (3) y un canal de
salida (6) conectado en su extremo derecho al canal de residuos
(10).
En un formato alternativo de la presente
invención representado en la figura 2, los elementos microcanal (6)
se modifican para permitir el uso del aparato con células que se
cultivan en la superficie de perlas microportadoras (17). Así, cada
elemento microcanal (6) incluye un canal de entrada de muestra (8)
conectado en su extremo izquierdo al depósito de muestra (9), una
cámara de crecimiento celular (7) que conecta mediante un canal
(16) con una cámara de ensayo (11), y un canal de salida (12) que
conduce al canal común de residuos (10).
Con referencia a la figura 3, en otra realización
del aparato, la cámara de crecimiento celular (2) puede estar
provista de estructuras moldeadas elevadas dispuestas en la porción
de base de la cámara de crecimiento celular para formar pilares
(15), de tal manera que formen una barrera al flujo o paso de
células que llegan a la cámara de crecimiento celular (2) mediante
el canal de entrada (1), permitiendo al mismo tiempo el paso de
líquido. Estas estructuras son de dimensiones elegidas para
proporcionar entre las estructuras intervalos que son demasiado
estrechos para permitir el paso de células transportadas como una
suspensión en el líquido que se desplaza en el dispositivo, pero que
son suficientemente grandes para permitir que células que se
cultivan en la superficie de la cámara de crecimiento celular (14)
migren mediante la barrera por extensión de procesos de célula
entre la barrera y citoquinesis siguiente. Las dimensiones
adecuadas para los intervalos entre los pilares elevados (15)
formados en las cámaras de crecimiento celular son entre 5 y 50
\mum, dependiendo del tipo de célula y tamaño de célula
seleccionados para la captura.
Cada elemento microcanal (6) representado en la
figura 3 incluye además preferiblemente una o varias cámaras de
ensayo para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes
celulares y que están conectadas en línea entre dicha cámara de
crecimiento celular (2) y dicho canal de salida (5).
El disco (18) es adecuadamente de una
construcción moldeada de una o dos piezas y se hace de un plástico
opcionalmente transparente o material polimérico por medio de
piezas moldeadas separadas que se montan para proporcionar una
estructura cerrada con agujeros en posiciones definidas para
permitir la carga del dispositivo con líquidos y la extracción de
líquidos residuales. En la forma más simple, el dispositivo se
produce como dos partes complementarias, soportando una o cada
estructura moldeada que, cuando se unen fijamente, forman una serie
de elementos microcanal interconectados dentro del cuerpo de un
disco sólido. Alternativamente los elementos microcanal se pueden
formar por métodos de micromaquinado en los que los microcanales y
las cámaras que forman los elementos microcanal se micromaquinan a
la superficie de un disco, y una placa de cobertura; por ejemplo
una película plástica, se adhiere a la superficie para encerar los
canales y las cámaras.
Para dotar a las células cultivadas de medios
para obtener oxígeno para el metabolismo y poder usar medios
tamponados con CO_{2}, uno o varios componentes del dispositivo
se construyen a partir de una película o membrana permeable a los
gases. Adecuadamente, la película o membrana permeable a los gases
se forma a partir de polímeros de silicona, tal como
polidimetilsiloxano, o de poliuretano, politetrafluoroetileno u
otros materiales plásticos permeables a los gases. Además se
facilitan preferiblemente medios (no representados) para cerrar
herméticamente los agujeros en la estructura cerrada para evitar la
evaporación de líquido durante el uso, por lo que tales medios
sellan los agujeros sin interferir con el intercambio de gases a
los medios de crecimiento celular. El sellado se puede realizar
mediante el uso de otra capa de material permeable a los gases a
través de todo el dispositivo, o mediante el uso de un material no
permeable aplicado localmente a los agujeros solamente, dejando
expuesto a la atmósfera local el resto del material permeable a los
gases.
Los materiales plásticos o poliméricos adecuados
para formar la cámara de crecimiento celular y microcanales se
seleccionan preferiblemente de manera que tengan propiedades
hidrófobas, donde la superficie del plástico o polímero también se
puede modificar selectivamente por medios químicos o físicos para
alterar las propiedades superficiales para conferir una propiedad
deseada, por ejemplo, compatibilidad con el crecimiento celular,
unión de células y la unión de biomoléculas por medios covalentes o
no covalentes. Los plásticos preferidos se seleccionan a partir de
poliestireno y policarbonato.
Alternativamente, la cámara de crecimiento
celular y los microcanales se pueden construir de materiales
plásticos o poliméricos que se seleccionan de manera que tengan
propiedades hidrófilas. La superficie del plástico o polímero
también se puede modificar selectivamente por medios químicos o
físicos para alterar las propiedades superficiales para producir
regiones localizadas de hidrofobicidad dentro de las cámaras y/o
microcanales para conferir una propiedad deseada. Por estos medios,
por ejemplo, se puede disponer barreras o válvulas hidrófobas para
controlar el flujo de líquido dentro del aparato. Los plásticos
preferidos se seleccionan a partir de polímeros con una superficie
cargada, adecuadamente poliestireno tratado químicamente o con
plasma iónico, policarbonato u otros polímeros transparentes
rígidos.
Los elementos microcanal (6) están dispersados
radialmente alrededor del disco (18) y conectados a un orificio
central común. Los canales 1, 4, 5, 8, 12, y 16 son de una
dimensión compatible con el movimiento de células a lo largo de los
canales. Adecuadamente, los canales y las cámaras pueden ser de
cualquier forma en sección transversal, tal como cuadrada,
rectangular, circular, trapezoidal y triangular. Adecuadamente, la
cámara de crecimiento celular (2) está dimensionada para
proporcionar un área de suelo entre 100 \mum^{2} y 1.000.000
\mum^{2}, preferiblemente entre 1000 \mum^{2} y 1.000.000
\mum^{2} y muy preferiblemente entre 10.000 \mum^{2} y
1.000.000 \mum^{2}. La superficie del plástico o polímero de la
cámara de crecimiento celular se puede tratar o modificar
selectivamente para permitir la unión y/o el crecimiento de células.
El tratamiento implica preferiblemente exposición a luz UV intensa
para modificar la superficie del polímero o alternativamente el uso
de alto voltaje descarga de plasma usando técnicas conocidas (véase
Amstein, C. F. y Hartmann, P. A., J. Clin. Microbiol., 2. 1,
46-54 (1975)) para crear una superficie con carga
negativa adecuada para crecimiento celular y unión y (si es
preciso) a efectos de ensayo. La unión de células se puede mejorar
más mediante la aplicación de recubrimientos adicionales a la
superficie de la cámara de crecimiento celular, por ejemplo,
polilisina, colágeno, fibronectina.
Como ya se ha mencionado, en el aspecto preferido
de la invención, cada uno de los elementos microcanal (6) está
provisto además de una cámara de ensayo (3) que está situada en
línea entre la cámara de crecimiento celular (2) y el canal de
salida (5), para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes
celulares. La cámara de ensayo está dimensionada proporcionalmente
al volumen de la cámara de crecimiento celular (2) para permitir la
recogida y/o captura de analitos solubles que se pueden derivar de
las células cultivadas bajo estudio.
Adecuadamente, el volumen de la cámara de ensayo
(3) está entre dos veces y una décima parte del volumen de la
cámara de crecimiento celular (2). Ventajosamente, el canal (4) que
conecta la cámara de crecimiento celular y la cámara de ensayo se
caracteriza por tener paredes hidrófobas y un área en sección
transversal que es menor que el canal (1) hacia arriba de la cámara
de crecimiento celular. Adecuadamente, el canal (4) tiene un área
en sección transversal de entre 0,99 y 0,01 veces la del canal de
entrada (1). Adecuadamente, el canal de salida (5) se caracteriza
por tener paredes hidrófobas y un área en sección transversal de
entre 0,99 y 0,01 veces la del canal (4). De esta forma, se puede
controlar el flujo de líquido en los elementos microcanal mediante
la aplicación de una fuerza centrífuga definida para hacer que el
líquido fluya en un canal de un área en sección transversal
definida, donde la misma fuerza es insuficiente para hacer que el
líquido fluya en más canales enlazados de menor área en sección
transversal, teniendo esto el efecto de parar el flujo de líquido
en una posición deseada en el elemento microcanal.
En unos medios alternativos de controlar el flujo
de líquido, el canal (1) y el canal (4) se construyen con la misma
área en sección transversal, pero la superficie de cada uno de los
canales se puede modificar selectivamente por medios químicos o
físicos para conferir un grado diferente de hidrofobicidad en dicho
canal. Por ejemplo, el canal (4) hacia abajo de la cámara de
crecimiento celular (2) se puede tratar de manera que tenga una
hidrofobicidad más alta que el canal (1) hacia arriba de la cámara
de crecimiento celular. Por estos medios, la aplicación de una
fuerza definida al líquido en el canal (1), suficiente para hacer
que baje líquido por este canal, será insuficiente para hacer que
entre líquido en el segundo canal (4) de hidrofobicidad más alta,
teniendo esto el efecto de parar el flujo de líquido en una
posición deseada en el elemento microcanal. Los medios adecuados
para modificar selectivamente la hidrofobicidad de la superficie de
los canales incluyen exposición de zonas definidas a radiación
ionizante o electromagnética o plasma iónico mediante una máscara, o
mediante la aplicación de un material hidrófobo o tinta por
serigrafía u otros medios de aplicación localizada.
Los medios de controlar flujo de líquido dentro
del aparato descrito anteriormente se pueden usar solos o en
combinación según sea preciso, para conferir el control deseado de
flujo de líquido en cámaras y canales conectados dentro del
elemento microcanal. Si se utilizan en combinación, los métodos se
pueden usar secuencialmente, por ejemplo donde un cambio del área en
sección transversal va seguido de un cambio de la hidrofobicidad,
formando dos puntos secuenciales de control de flujo de líquido.
Alternativamente, los métodos se pueden usar de forma coincidente,
en los que un cambio del área en sección transversal de un canal va
acompañado de un cambio de la hidrofobicidad de dicho canal,
usándose la combinación para conferir un grado de control sobre
flujo de líquido no alcanzable usando unos medios únicos.
La superficie interior de la cámara de ensayo se
puede recubrir con uno o varios ligandos capaces de unir
específicamente un analito de interés enlazando de forma covalente
o no covalente el ligando a la superficie. Ejemplos de ligandos
adecuados para tal fin incluyen: biotina, estreptavidina, proteína
A, anticuerpos, lectinas, receptores hormonales, sondas de ácido
nucleico, proteínas de unión de ADN y análogos.
El aparato y método se pueden usar para la
detección del crecimiento celular y la medición de actividad
celular, parámetros celulares y procesos bioquímicos, por ejemplo
metabolismo celular, viabilidad de células, expresión de gen
indicador, usando técnicas no invasivas, es decir, técnicas que no
ponen en peligro la integridad o viabilidad de las células.
Alternativamente, el aparato se puede usar en la detección y
medición de productos derivados de células, que se han liberado o
excretado de otro modo de células, tal como hormonas peptídicas,
segundos mensajeros, etc. Mediante el uso del aparato mostrado en la
figura 3, el aparato permite estudios de migración celular en
respuesta a estímulos químicos o físicos, por ejemplo quimiotaxia,
donde una sustancia quimioatrayente se coloca en un lado de una
barrera y se observan las células colocadas en el lado opuesto de
la barrera para penetrar la barrera al moverse hacia el
quimioatrayente.
La invención se puede usar con cualquier tipo de
célula que pueda ser cultivada en artículos de plástico estándar de
cultivo de células. Tales tipos de células incluyen todas las
células normales y transformadas derivadas de cualquier fuente
reconocida con respecto a la especie (por ejemplo, humanos,
roedores, simios), fuente de tejido (por ejemplo, cerebro, hígado,
pulmón, corazón, corteza de riñón, músculo) y tipo de célula (por
ejemplo, epitelial, endotelial). Además, células que han sido
transfectadas con genes recombinantes también pueden ser cultivadas
usando la invención. hay protocolos establecidos disponibles para
el cultivo de diversos tipos de células. (Véase, por ejemplo,
Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic
Technique, 2ª edición, Alan R. Liss Inc. 1987). Tales protocolos
pueden requerir el uso de recubrimientos especiales y medios
selectivos para permitir el crecimiento celular y la expresión de
funciones celulares especializadas. Ninguno de tales protocolos
está excluido del uso con el aparato de esta invención.
La escala del dispositivo vendrá dictada en
cierta medida por su uso, es decir, el dispositivo será de un
tamaño que sea compatible con el uso con células eucarióticas. Esto
impondrá un límite inferior a cualquier canal diseñado para
permitir el movimiento de células y determinará el tamaño de las
zonas de contención o crecimiento de células según el número de
células presentes en cada ensayo. Una célula media de mamífero que
se cultiva como un cultivo adherente tiene un área de \sim300
\mum^{2}; las células no adherentes y las células adherentes no
unidas tienen un diámetro esférico de \sim10 \mum. En
consecuencia, es probable que los canales para movimiento de células
dentro del dispositivo tengan dimensiones del orden de
20-30 \mum o más. Los tamaños de las zonas de
contención de células dependerán del número de células necesario
para llevar a cabo un ensayo (determinándose el número tanto por la
sensibilidad como los requisitos estadísticos). Se contempla que un
ensayo y típico requeriría un mínimo de 500-1000
células que para células adherentes requerirán estructuras de
150.000-300.000 \mum^{2}, es decir,
"cavidades" circulares de \sim400-600 \mum
de diámetro.
La configuración de los microcanales en la
presente invención se elige preferiblemente para permitir la siembra
simultánea de la cámara de crecimiento celular mediante la
aplicación de una suspensión de células en un medio fluido al
depósito de muestra por medio del orificio de entrada de muestra,
seguido de la rotación del disco (18) por medios adecuados a una
velocidad suficiente para producir el movimiento de la suspensión
de células hacia fuera hacia la periferia del disco por fuerza
centrífuga. El movimiento del líquido distribuye la suspensión de
células a lo largo de cada uno de los microcanales de entrada (1,
8) hacia las cámaras de crecimiento celular (2, 7). La velocidad de
rotación del disco se elige para proporcionar suficiente fuerza
centrífuga para permitir que fluya líquido para llenar la cámara de
crecimiento celular (2, 7); pero con fuerza insuficiente para que
entre líquido en el canal restringido (4, 16) de menor diámetro en
el lado opuesto de la cámara de crecimiento celular.
Una vez que ha parado la rotación, las células en
la suspensión pueden sedimentar bajo gravedad sobre la parte
inferior de la cámara de crecimiento celular (2, 7) y unirse a la
superficie tratada si está presente. Las células que permanecen en
el canal son incapaces de unirse a la superficie hidrófoba no
tratada y permanecerán en suspensión. Por lo tanto, después de un
período de tiempo apropiado, elegido para permitir que tenga lugar
la unión de células, el dispositivo se puede girar a mayor
velocidad que antes, de tal manera que se haga que todo el líquido
y las células no unidas se desplacen hacia la periferia del disco
al canal de residuos (10) dispuesto alrededor del borde del disco.
Después de salida del espacio libre de canales de células no unidas,
la rotación se ralentiza a la misma velocidad usada inicialmente
para llenar los elementos microcanal y se aplica medio nuevo de
cultivo de células al depósito de muestra. Por la rotación una vez
más del disco, el medio de cultivo celular fluye bajo fuerza
centrífuga para llenar los microcanales y las cámaras de crecimiento
celular como se ha descrito previamente. Esta acción deja las
células unidas sembradas en la superficie de las cámaras de
crecimiento celular cubiertas con medio de cultivo fresco adecuado
para ensayos de crecimiento celular y a base de células.
En el aparato de la figura 2, las perlas (17)
proporcionan un área superficial grande para unión de células y
crecimiento en un volumen de líquido relativamente pequeño. En el
dispositivo aquí descrito, las perlas (17) realizan dos funciones:
en primer lugar, proporcionan una superficie para la unión y
crecimiento de células, eliminando así la necesidad de proporcionar
una superficie compatible con el crecimiento celular dentro del
disco que permite usar una banda más amplia de materiales para
construcción, y, en segundo lugar, proporcionan una portadora
física más grande para células que permite diseñar fácilmente
canales dentro del dispositivo para evitar el acceso de células. En
la realización preferida, cada elemento incluye una cámara de
crecimiento celular (2, 7), una cámara de análisis (3, 11), y una
cámara residual (10) que están dispuestas radialmente alrededor del
centro del disco y conectadas a un orificio común en el centro del
disco.
Después de la adición de muestras de células al
aparato, su unión y siguiente crecimiento celular, se puede
introducir reactivos y muestras para ensayo en el depósito de
muestra (9) mediante el orificio de entrada de muestra. Los
reactivos a suministrar a todos los elementos microcanal se pueden
introducir, como se ha descrito anteriormente, para sembrar con
células, es decir, aplicando una solución conteniendo reactivos al
orificio central y girando el disco para producir la distribución
del reactivo a todos los microcanales, cámaras de crecimiento
celular y cámaras de ensayo. La aplicación de muestras específicas a
cavidades específicas se puede lograr pipetando pequeños volúmenes
de líquido como gotas discretas a la cavidad central directamente
junto al agujero del canal de entrada que conduce a la cámara de
crecimiento celular que ha de recibir la muestra. Esto se puede
lograr, por ejemplo, utilizando un dispositivo dispensador
piezoeléctrico (no representado), por lo que la dispensación de
gotitas de líquido del dispositivo se sincroniza con la velocidad de
rotación del disco (18) de tal manera que, a una combinación
apropiada de frecuencia de dispensación de gotas y la velocidad de
rotación del disco, se pueda hacer que gotitas individuales de
líquido choquen en la superficie del disco y se pueda hacer que
sean transportadas por fuerza centrífuga a un canal de entrada
adyacente (1, 8) y se mezclen con líquido presente en la cámara de
crecimiento celular (2, 7).
Se puede pipetar alternativamente líquidos como
gotas discretas sobre la superficie hidrófoba de un disco
estacionario (18), usándose la rotación del disco para mover estas
gotas de líquido al canal de entrada apropiado y así a la cámara de
crecimiento celular. Por dichos medios, todos los reactivos y
muestras se pueden suministrar a la cámara de células en el orden y
proporciones deseados para efectuar el ensayo.
Una vez que se han realizado las manipulaciones
de líquido del ensayo es necesario efectuar un procedimiento de
detección para medir el resultado del ensayo, midiendo típicamente
la señal emitida por un radical marcador fluorescente,
quimiluminiscente u otro. El dispositivo representado en la figura
1b está configurado para permitir dos medios de detección de la
señal de ensayo. En primer lugar, la señal de ensayo se puede medir
in situ en la cámara de crecimiento celular. Tal señal
estaría tipificada por la medición del producto de un gen indicador
dentro de las células, por ejemplo fluorescencia de GFP.
Alternativamente, puede ser deseable medir
productos o analitos derivados de células, por ejemplo por métodos
de ensayo de unión inmunoquímica u otra específica, en ausencia de
células cultivadas en el aparato, para evitar la interferencia en
la medición. En este caso, el aparato está provisto de una segunda
cámara, es decir, la cámara de ensayo (3, 11) dispuesta más cerca de
la periferia del disco y conectada a la cámara de crecimiento
celular (2, 7). La cámara de ensayo está conectada al canal
periférico de residuos (10) por un canal estrecho (5, 12), teniendo
este canal un menor diámetro que el canal (4, 16) que conecta la
cámara de ensayo con la cámara de crecimiento celular. La
diferencia de diámetros entre cámaras permite, en condiciones
controladas de rotación y fuerza centrífuga, como se ha explicado
anteriormente, que se desplace líquido de la cámara de crecimiento
celular a la cámara de ensayo. Por ejemplo, por este proceso, se
desplaza un analito de la cámara de crecimiento celular a la cámara
de ensayo donde el analito se somete a captura de afinidad por un
ligando unido a la pared de la cámara de ensayo. Por lo tanto, este
proceso proporciona unos medios de alejar un analito derivado de
células, que ha sido liberado o excretado de otro modo de células,
del entorno celular, inmovilizando el analito dentro de la cámara
de ensayo por medio de un compañero de unión específica a unir al
analito, y permitiendo adiciones siguientes de reactivos y
procesado para permitir la detección del analito.
Opcionalmente, al menos uno de los reactivos para
uso en un método de ensayo utilizando el aparato puede ser marcado
con un marcador detectable por unión covalente o no covalente. Se
puede seleccionar marcadores detectables adecuados de marcadores
fluorescentes, marcadores quimiluminicentes, marcadores
bioluminiscentes, marcadores de enzimas y marcadores radioactivos.
Se puede seleccionar marcadores fluorescentes adecuados para marcar
reactivos según el método de la invención a partir de las
categorías generales de colorantes fluorescentes, incluyendo,
aunque sin limitación, fluoresceínas, rodaminas, colorantes de
cianina, cumarinas, y los grupos de colorantes fluorescentes BODIPY.
Se hallarán ejemplos de marcadores bioluminiscentes detectables en
las proteínas indicadoras fluorescentes, tal Proteína Fluorescente
Verde (GFP) y aecuorina. Los marcadores alternativos para obtener
una señal detectable pueden ser marcadores de transferencia de
energía de fluorescencia.
Una vez que el ensayo ha terminado, la medición
de la señal se puede lograr por medios apropiados para la molécula o
radical marcador utilizado en el ensayo y se logra típicamente por
medios ópticos. Por ejemplo, la luminescencia emitida de células o
de un reactivo de ensayo marcado fluorescente se puede detectar en
el aparato microfabricado utilizando un aparato de formación de
imágenes que incorpora una cámara CCD, o utilizando un fluorímetro.
La detección de fluorescencia emitida se puede lograr mediante el
cuerpo del disco (18) donde el disco está hecho totalmente de un
material transparente o alternativamente mediante ventanas de
material transparente que han sido fabricadas en el cuerpo del
disco.
Como alternativa a la detección no radiactiva, el
aparato de la presente invenció se puede usar en unión con
detección radiactiva utilizando la técnica de proximidad de
escintilación. Por ejemplo, se puede introducir en el aparato
perlas conteniendo escintilante. Alternativamente el aparato
microfabricado de la invención puede llevar incorporada una capa
conteniendo escintilante en o sobre una superficie interior de la
cámara de crecimiento celular (2, 7) y/o la cámara de ensayo (3,
11). La región del aparato conteniendo las perlas escintilantes o
superficie escintilante es preferiblemente ópticamente transparente
para permitir que el material transmita luz a una longitud de onda
dada con eficiencia óptima. La región conteniendo escintilante puede
estar compuesta de cualquier material transparente conteniendo
escintilante, por ejemplo. Un vidrio escintilante a base de
compuestos conteniendo metal lantánido, o un material plástico tal
como poliestireno o poliviniltolueno, al que se incorpora la
sustancia escintilante.
Las sustancias escintilantes adecuadas pueden
incluir hidrocarburos aromáticos tal como
p-terfenil, p-cuaterfenil y sus
derivados, y derivados de oxazoles y
1,3,4-oxadiazoles, por ejemplo,
2-(4-t-butilfenil)-5-(4-bifenilil)-1,3,4-oxadiazol
y 2,5-difeniloxazol. También se puede incluir un
desplazador de longitud de onda tal como
1,4-bis(5-fenil-2-oxazolil)
benceno, o 9,10-difenilantraceno.
Un radical de unión tal como un miembro de un par
de unión específico puede ser inmovilizado sobre la superficie de la
perla o capa escintilante para unir específicamente con un analito
que se puede derivar de células usadas en el proceso de ensayo.
Elementos de par de unión específicos adecuados con los que es útil
la invención, incluyen biotina, estreptavidina, proteína A,
anticuerpos, lectinas, receptores hormonales, sondas de ácido
nucleico, proteínas de unión de ADN y análogos. Se ha de entender
que cualquier elemento del par de unión específico se puede unir e
inmovilizar para unir a un elemento complementario del par de unión
específico.
Los radioisótopos típicos que se puede usar para
marcar el reactivo de ensayo incluyen los usados de ordinario en
bioquímica tal como [^{3}H], [^{126}I], [^{36}S] y
[^{33}P], pero no excluyen el uso de otros isótopos. Las
metodologías de detección basadas en proximidad de escintilación son
conocidas (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número
4568649, Bertoglio-Matte, J.). La detección puede
utilizar varias modalidades a combinar para poder medir todos los
ensayos simultáneamente o en sucesión rápida. Un formato apropiado
de formación de imágenes puede proporcionar alternativamente medios
de detección adecuados para ensayos radioactivos y no radiactivos
utilizando el aparato.
En algunos usos, algunas zonas de ensayo serán
redundantes; es decir, no todos los elementos del aparato se usarán
cada vez. Se contempla que el usuario decida qué tipo de ensayos
hay que efectuar y seleccionar después medios de control apropiados
para dirigir el flujo de líquido dentro del aparato. En
consecuencia, tales estructuras serán compatibles con un rango de
procedimientos y protocolos de ensayo que requieren diferentes
complejidades de movimiento de fluido. Por ejemplo, la detección de
un gen indicador enlazado con GFP requerirá una estructura de
cavidades simples para permitir la medición de fluorescencia. En
contraposición, la medición de un analito secretado de células, por
ejemplo, la medición de una citoquina por inmunoensayo, o la
medición de mRNA celular después de lisis, requerirá una estructura
más complicada para separar las células del analito secretado antes
del análisis de dicho analito.
La invención se ilustra mejor por referencia a
los ejemplos siguientes.
Se cultivó un cultivo de células HeLa en
Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% suero
de ternera y L-glutamina en un matraz de plástico
usando condiciones estándar de cultivo de tejidos. Se recogieron
células por tripsinización y la suspensión resultante se concentró
por centrifugación dando una concentración de células de 10^{7}
células/ml. Se aplicaron alícuotas de la suspensión de células (1
\mul) a agujeros en la superficie de una estructura microfabricada
del tipo representado en la figura 1, producida por moldeo por
inyección, con canales internos de 50 \mum de profundidad y 100
\mum de anchura.
La suspensión de células se movió a lo largo de
los canales de entrada dentro del disco a cámaras circulares de
crecimiento celular de 50 \mum de profundidad y 500 \mum de
diámetro y se dejó que las células se uniesen y creciesen. Después
de incubación durante 48 horas en una incubadora de cultivo de
tejidos (37ºC/95% HR), se examinó la densidad, morfología y
viabilidad de las células. Exámenes visibles por microscopía de
contraste de fase mostraron que las poblaciones de células que
crecían en microstructuras tenían la misma densidad y morfología
que los cultivos de control crecidos del mismo material padre y
mantenidos en artículos de plástico estándar de cultivo de células.
Después se comprobó la viabilidad de las células usando un kit
comercial de prueba (LIVE/DEAD Viability Kit, Molecular Probes,
Oregon, L-3224) lavando el medio de crecimiento de
las células dentro del dispositivo, lavando las células con una
solución salina fosfato tamponada (PBS) e introduciendo una solución
de los reactivos de ensayo fluorescentes en las cámaras de
crecimiento celular. El examen posterior por microscopía
fluorescente demostró que las células que crecían en
microstructuras habían mantenido una viabilidad de células de
>95%, comparable con las células de control cultivadas bajo
condiciones estándar de cultivo de tejidos.
Un disco de plástico microfabricado del tipo
representado en la figura 1, producido por moldeo por inyección,
que contenía varios canales internos radial de 50 \mum de
profundidad y 100 \mum de anchura, se modificó selectivamente en
superficie por exposición a una lámpara UV de 500 W a una distancia
de 20 cm durante 30 minutos mediante una máscara metálica de tal
manera que la luz UV chocase en la superficie solamente en regiones
definidas por la máscara.
Se cultivó un cultivo de células HeLa en
Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) complementado con 10% suero
de ternera y L-glutamina en un matraz de plástico
usando condiciones estándar de cultivo de tejidos. Se recogieron
células por tripsinización y la suspensión resultante se concentró
por centrifugación dando una concentración de células de 10^{7}
células/ml. Se aplicaron alícuotas de la suspensión de células (1
\mul) a agujeros en la superficie del dispositivo y las células se
movieron a lo largo de los canales por rotación alrededor del eje
de disco (1000 rpm durante 30 segundos). Después de la incubación
durante 18 horas en una incubadora de cultivo de tejidos (37ºC/95%
HR), se examinaron las células por microscopía de contraste de
fase. Se halló que las células se cultivaban preferentemente en
regiones del disco previamente expuestas a luz UV, se observó que
las células en otras regiones eran menos densas y estaban menos
unidas. El disco se giró después a 1000 rpm durante 30 segundos y
se reexaminaron las células. Después del giro se halló que las
células en zonas expuestas a UV habían permanecido unidas a la
superficie de plástico y seguía siendo morfológicamente idénticas a
las células de control; en contraposición, las células en
superficies no expuestas se quitaron por la fuerza centrífuga
generada por el disco giratorio.
Células HeLa cultivadas y recogidas como se ha
descrito anteriormente se introdujeron en el dispositivo del Ejemplo
2 en microcanales que contenían pilares moldeados de varias
dimensiones dispersados en los canales para hacer de barreras al
movimiento celular en los canales. Se introdujo en los canales una
suspensión de células y se incubó la estructura durante 18 horas
para dejar que las células se sedimentasen y creciesen. El examen
posterior reveló que en canales donde los intervalos entre los
pilares eran de 10 x 60 \mum o más, se observó que células habían
pasado libremente por las barreras. En contraposición, donde los
intervalos entre los pilares eran de 10 x 20 \mum o menos, se
impidió que las células pasasen por la barrera al ser transportadas
por el flujo de líquido en suspensión. Sin embargo, a la incubación
y crecimiento siguientes, se observó que las células migraban por
tales barreras por deformación lenta. Tales estructuras de barrera
pueden ser útiles para el estudio de movimiento o migración celular
en respuesta a estímulos químicos o físicos.
Se introdujo células HeLa transfectadas para
producir una expresión estable de una proteína de fusión de
Calreticulina-GFP en un aparato moldeado del tipo
representado en la figura 1, que soporta canales de 100 \mum de
anchura y 100 \mum de profundidad conectados a cámaras circulares
de 600 \mum y 1000 \mum de diámetro y 100 \mum de
profundidad. Las células se incubaron durante 18 horas en una
incubadora de cultivo de tejidos y examinaron por microscopía de
fluorescencia confocal. Las células cultivadas en estructuras
microfabricadas mostraron el mismo nivel de expresión GFP que las
células de control cultivadas bajo condiciones convencionales de
cultivo de tejidos.
Se cultivaron células HeLa e introdujeron en un
disco microfabricado como se describe en el Ejemplo 1. Después de
incubación durante 18 horas se extrajo de las células el medio de
crecimiento y sustituyó por medio conteniendo diferentes
concentraciones del agente de permeabilización de membranas,
digitonina, en el rango 0-0,2 mg/ml (p/v) y se
incubaron células en presencia de digitonina durante 10 minutos. La
viabilidad de las células se midió después como se describe en el
Ejemplo 1. Se halló que los resultados eran equivalentes a las
células expuestas al mismo rango de dosis de digitonina en un ensayo
a base de placa de microtítulo.
Claims (26)
1. Aparato incluyendo:
- a)
- una placa base que soporta una pluralidad de elementos microcanal, incluyendo cada uno una cámara de crecimiento celular, un canal de entrada para suministrarle muestra líquida y un canal de salida para la extracción de muestra líquida de ella;
- b)
- una placa de cobertura colocada encima de dicha placa base, extendiéndose dicha placa de cobertura sobre dichos elementos para definir dichas cámaras y canales de conexión; estando provista dicha placa de cobertura de agujeros para proporcionar acceso a dichos canales;
- c)
- una suspensión de células a cultivar; y
- d)
- medios, incorporados en dichas cámaras de crecimiento celular, para unión de células y crecimiento celular;
caracterizado porque uno o varios
componentes del aparato se construyen de una película o membrana de
tal manera que dicho uno o varios componentes sean permeables a los
gases en la medida en que se puede usar medios tamponados con
CO_{2} en la cámara de crecimiento celular y/o en la medida en que
puede permear oxígeno, a su través a las células para sus
metabolismo durante el crecimiento.
2. Aparato según la reivindicación 1, donde dicha
placa base incluye un disco rotativo que se microfabrica para
proporcionar un orificio de introducción de muestra situado hacia
el centro del disco y conectado a un depósito anular de muestra, y
donde dichos elementos microcanal están dispersados radialmente en
dicho disco con sus respectivos canales de entrada conectados para
recibir muestra de dicho depósito.
3. Aparato según la reivindicación 1 ó 2, donde
dicha placa de cobertura se fabrica de material plástico permeable
a los gases.
4. Aparato según la reivindicación 3, donde dicho
material plástico es un polímero de silicona, poliuretano, o
politetrafluoroetileno.
5. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, donde dichos medios para
unión de células y crecimiento celular se han introducido
modificando química o físicamente al menos una porción de una
superficie de dicha cámara de crecimiento celular para permitir la
unión de células y el crecimiento celular.
6. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde dichos medios para
unión de células y crecimiento celular incluyen una superficie con
carga negativa.
7. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, donde dichos medios para
unión de células y crecimiento celular incluyen un recubrimiento
superficial de polilisina, colágeno y/o fibronectina.
8. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, donde los medios para unión
de células y crecimiento celular incluyen una o más perlas
microportadoras situadas en dicha cámara de crecimiento celular,
donde cada una de dichas perlas microportadoras realiza unión de
células y crecimiento celular.
9. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, donde la cámara de
crecimiento celular incluye además elementos moldeados elevados
dispuestos en la porción de base de la cámara de crecimiento
celular para formar pilares.
10. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde el área en sección
transversal de dicho canal de entrada es mayor que la de dicho canal
de salida.
11. Aparato según la reivindicación 10, donde el
área en sección transversal de dicho canal de salida es entre 0,99
y 0,01 veces la de dicho canal de entrada.
12. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, donde al menos algunos de
dichos elementos microcanal incluyen además una o varias cámaras de
ensayo para llevar a cabo ensayos que implican constituyentes
celulares y conectados en línea entre dicha cámara de crecimiento
celular y dicho canal de salida.
13. Aparato según la reivindicación 14, donde la
cámara o cámaras de ensayo están conectadas entre sí y a dicha
cámara de crecimiento celular por un canal o canales intermedios en
el orden de: canal de entrada, cámara de crecimiento celular, canal
intermedio 1, cámara de ensayo 1, canal intermedio 2 (si está
presente), cámara de ensayo 2 (si está presente), ..., canal de
salida, y donde las zonas en sección transversal de los canales
respectivos se reducen progresivamente del canal de entrada al
canal de salida.
14. Aparato según la reivindicación 13, donde el
área en sección transversal del o cada canal intermedio y el canal
de salida es entre 0,99 y 0,01 veces la del canal inmediatamente
precedente (hacia arriba).
15. Aparato según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, donde se ha previsto en o
sobre una superficie interior de una o varias de dichas cámaras de
ensayo una capa incluyendo una sustancia escintillante.
16. Aparato según la reivindicación 15, donde la
capa incluyendo una sustancia escintilante incluye un radical de
unión unido a ella, siendo dicho radical de unión un elemento de un
par de unión específico seleccionado a partir de biotina;
estreptavidina, proteína A, anticuerpos, lectinas, receptores
hormonales, sondas de ácido nucleico, y proteínas de unión de
ADN.
17. Un método para determinar el efecto de una
sustancia de prueba en una actividad celular o parámetro físico
utilizando un aparato como el definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, incluyendo dicho método:
- a)
- proporcionar una o varias muestras de sustancias de prueba cuyo efecto en las células se ha de medir en condiciones para hacer que dichas células se expongan a dichas sustancias; y
- b)
- determinar el efecto de las sustancias de prueba en dichas células por medio de detección óptica.
18. Un método según la reivindicación 17, donde
las células son adherentes.
19. Un método según la reivindicación 18, donde
se cultivan células que se adhieren a una superficie dentro del
aparato antes de la introducción de las sustancias de prueba.
20. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 17-19, donde se facilita después
del paso siguiente c) uno o varios reactivos de ensayo y dispersar
dichos reactivos a una o varias cámaras de reacción en dicho
aparato.
21. Un método según la reivindicación 20, donde
al menos uno de dichos reactivos de ensayo se marca con un marcador
detectable seleccionado a partir de marcadores fluorescentes,
marcadores quimiluminiscentes, marcadores bioluminescentes,
marcadores de enzima y marcadores radioactivos.
22. Un método para medir un analito celular
utilizando el aparato como el definido en cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, incluyendo dicho método
- a)
- dejar que las células crezcan;
- b)
- proporcionar uno o varios reactivos de ensayo y dispersar dichos reactivos a una o varias cámaras en dicho aparato;
- c)
- medir el analito celular por medios ópticos.
23. Un método según la reivindicación 22, donde
al menos uno de dichos reactivos de ensayo se marca con un marcador
detectable seleccionado a partir de marcadores fluorescentes,
marcadores quimiluminiscentes, marcadores bioluminescentes,
marcadores de enzimas y marcadores radioactivos.
24. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 22-23, donde las células son
adherentes.
25. El uso del aparato definido en cualquiera de
las reivindicaciones 1-16, para cultivar células en
asociación con un ensayo a base de células.
26. El uso según la reivindicación 25, donde las
células son células adherentes.
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