FR2890975A1 - Plaque de tests a puits. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une plaque (1) de tests comprenant une pluralité de puits (2) de réception de cultures de cellules et de produits à tester.Cette plaque est remarquable en ce que chaque puits (2) est subdivisé en deux parties, d'une part un tronçon creux (21), dit "tronçon commun", qui débouche sur l'une des faces (11) dite "supérieure" de ladite plaque (1) et qui s'étend depuis cette face supérieure (11) jusqu'à une certaine profondeur de ladite plaque (1) et d'autre part, une pluralité de microcavités discrètes (22), regroupées de façon à ce que chacune débouche à sa partie supérieure dans la partie inférieure dudit tronçon commun (21).Application aux tests biochimiques, biologiques ou pharmacologiques faisant intervenir des cultures de cellules.

Description

La présente invention concerne le domaine des microsystèmes appliqués à la

biologie et aux biotechnologies.

L'invention se rapporte à la miniaturisation des supports de cultures de cellules, utilisés pour la réalisation de tests chimiques, biochimiques et/ou pharmacologiques. Dans la suite de la description et des revendications, de tels supports sont dénommés "plaques de tests à puits".

L'invention a plus précisément pour objet une plaque de tests à puits et son procédé de fabrication.

La technique de criblage haut débit, connue sous la dénomination anglaise de "high-throughput screening" consiste à tester un grand nombre de produits chimiques ou biochimiques sur des cellules vivantes. Après mise en contact, les réactions des cellules vis-à-vis de ces produits sont analysées, afin de caractériser ces derniers.

A titre d'exemple illustratif, on peut considérer l'analyse d'un produit 15 cosmétique, tel que le mascara.

Un mascara classique est fabriqué à partir d'environ deux cents produits chimiques élémentaires. Chacun d'entre eux doit être testé, afin d'en vérifier la biocompatibilité avec les yeux de l'utilisatrice.

De façon classique, on utilise pour ce faire des cellules de cornées de lapin qui permettent de caractériser notamment la toxicité des produits.

Les tests sont généralement effectués sur plusieurs dilutions du produit chimique, typiquement trois dilutions. De plus, chaque test doit être répliqué plusieurs fois afin de pouvoir établir des résultats statistiques. Le nombre de réplications de tels tests varie généralement de quatre à seize, neuf étant une valeur courante suffisante.

Ainsi, pour caractériser le mascara précité, il faudra entreprendre en général deux cent fois trois fois neuf tests, soit cinq mille quatre cent tests sur des cellules de cornée de lapin.

Les plaques de tests actuellement disponibles sur le marché consistent en des macrosupports en matière plastique, d'environ 10 cm sur 10 cm, qui comprennent quelques dizaines de puits, voire même jusqu'à mille cinq cent puits.

Les cellules biologiques sont placées dans ces puits avec un milieu de culture qui les maintient en vie.

Ensuite, les produits à tester sont distribués dans les puits, soit manuellement à l'aide d'une micropipette, soit automatiquement à l'aide de distributeurs à injection automatisée, munis de têtes dont les dimensions sont inférieures ou égales au millimètre. De tels distributeurs sont connus sous la dénomination anglaise de "spotter".

La tendance actuelle est à la miniaturisation de ces supports. De tels microsupports sont connus de l'homme du métier sous la dénomination de "puce à 10 cellules".

Un des enjeux de la miniaturisation est de caractériser complètement un produit à l'aide d'un unique support, en réduisant ainsi les manipulations.

De plus, la réduction des dimensions du support a pour effet de réduire les volumes des produits utilisés. Il en résulte une diminution du coût des produits chimiques consommables et un gain de la vitesse des réactions biochimiques.

Par ailleurs, un autre avantage de la miniaturisation est l'automatisation des manipulations, qui permet de gagner du temps non seulement lors du dépôt des produits à tester, grâce à des distributeurs automatisés, mais également lors de l'analyse des résultats, grâce à des appareils de lecture également automatisés. Ces appareils sont notamment des microscopes et des logiciels d'analyse et de traitement de données.

Les puces à cellules actuellement disponibles sur le marché sont très peu nombreuses.

On connaît ainsi une puce pour l'analyse de l'ADN (acide désoxyribonucléique), distribuée par le Commissariat à l'Energie Atomique (CEAILETI), sous la marque "MICAM 8100". Cette puce comprend 8.100 puits de section transversale octogonale, à bords droits, de 100 à 200 m (micromètres) de profondeur.

On connaît également des produits développés en séries très limitées dans des laboratoires, pour des travaux de recherche, par exemple le support pour cellules biologiques développé par le JAIST pour le criblage haut débit de médicaments anticancéreux. On se reportera à ce sujet à l'article de Sathuluri Ramachandra Rao et al, "High-throughput screening of anticancer drugs microarray based cell chip", Japan Advanced Institute of Science and Technology, Japan, Micro Total Analysis Systems 2002, Vol 2., 862-864, Kluwer Academic Publishers.

Les dispositifs miniaturisés actuellement présents sur le marché comportent tous des puits dont les dimensions sont extrêmement faibles, typiquement de l'ordre de 100 tm x 100 tm x 100 m, ce qui correspond à un volume de l'ordre de 1 nanolitre.

La réduction du volume des puits présente toutefois de nombreux inconvénients.

L'utilisateur se trouve tout d'abord confronté à des problèmes d'évaporation. En effet, à température ambiante, une goutte de liquide de 1 nanolitre s'évapore instantanément. De plus, la survie des cellules biologiques disposées dans les puits est fortement compromise dans un si faible volume de liquide.

Par ailleurs, avec des puits de très faible volume, la distribution et la dilution des produits à tester ne sont pas aisées.

En effet, les concentrations typiquement utilisées lors des tests sont de l'ordre de 1/1000, de sorte que pour un puits d'un volume de 1 nanolitre, il faut être capable de distribuer 1 picolitre de produit à tester. Les machines de distribution de liquide les plus performantes - et donc les plus chères - qui existent à l'heure actuelle sur le marché peuvent distribuer au minimum quelques dizaines de picolitres. Il est donc impossible à l'heure actuelle de diluer les produits à tester au 1/1000.

Il s'avère en conséquence long et difficile de distribuer le produit à tester dans les quelques milliers de puits d'une microplaque. Ceci a pour effet d'augmenter les problèmes d'évaporation des liquides et les réactions chimiques au niveau des premiers puits remplis peuvent être achevées avant que la totalité de la puce à cellules n'ait été entièrement remplie.

Le volume nanométrique des puits des puces à cellules actuellement existantes est donc source de nombreuses difficultés techniques et conduit à une manipulation complexe et coûteuse.

L'invention a pour but de résoudre les problèmes précités de l'état de la technique et notamment de fournir une plaque de tests à puits miniaturisés qui évite les problèmes d'évaporation des produits testés et qui garantisse la survie des cellules biologiques utilisées.

Cette plaque de tests doit également permettre de distribuer 35 facilement des dilutions appropriées des produits à tester.

A cet effet, l'invention concerne une plaque de tests biochimiques, biologiques ou pharmacologiques comprenant une pluralité de puits de réception de cultures de cellules et des produits à tester.

Conformément à l'invention, chaque puits est subdivisé en deux parties, d'une part un tronçon creux, dit "tronçon commun", qui débouche sur l'une des faces dite "supérieure" de ladite plaque et qui s'étend depuis cette face supérieure jusqu'à une certaine profondeur de ladite plaque et d'autre part, une pluralité de microcavités discrètes, regroupées de façon à ce que chacune débouche à sa partie supérieure dans la partie inférieure dudit tronçon commun.

Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de l'invention, prises seules ou en combinaison: É les parois latérales de chaque microcavité sont inclinées vers le centre et vers le fond de ladite microcavité, É lesdites microcavités ont une profondeur comprise entre 50 et 200 micromètres environ et une section transversale de forme carrée ou rectangulaire, dont la longueur et la largeur sont comprises entre 100 et 400 micromètres environ, É lesdits tronçons communs ont une profondeur comprise entre 100 et 500 micromètres environ et une section transversale de forme carrée ou rectangulaire, dont la longueur et la largeur sont comprises entre 500 et 2000 micromètres environ, É chaque puits comprend C rangées de D microcavités qui débouchent dans son tronçon commun, C et D étant des nombres entiers dont au moins l'un est supérieur ou égal à deux, les microcavités voisines étant contiguës; É ladite plaque est réalisée dans un matériau polymère biocompatible et transparent à la lumière, par exemple une résine de polyuréthane.

É la surface de sa face supérieure est traitée de façon à être hydrophobe et en ce que la surface des parois latérales du tronçon commun et des parois latérales et du fond des microcavités est traitée de façon à être hydrophile; É ladite plaque inclut dans son épaisseur ou elle comprend sous sa face inférieure au moins un composant électrique, électronique et/ou optique, qui participe à la lecture des résultats des tests effectués.

L'invention concerne également un procédé de fabrication de la plaque de tests précitée, réalisée en matériau polymère qui comprend les étapes consistant à : - réaliser un maître modèle mâle de ladite plaque de tests, - réaliser autour dudit maître modèle mâle, un moule femelle, en plusieurs parties, dont au moins l'une, dite "partie avant", destinée à former les micro- ou les nano- structures correspondant aux puits de la future plaque, est réalisée en un silicone présentant de très bonnes qualités de réplication dudit maître modèle, par exemple en polydiméthylsiloxane (PDMS), - couler sous vide ledit matériau polymère, à l'intérieur du moule femelle précédemment obtenu, et le faire durcir, - éjecter la plaque de tests ainsi obtenue, hors du moule, à l'aide d'éjecteurs.

Selon d'autres variantes préférentielles: É une couche de matériau antiadhésif est déposée sur la surface extérieure dudit maître modèle mâle, avant la fabrication du moule femelle et/ou sur la surface intérieure dudit moule, avant le coulage sous vide du matériau polymère, É au moins une partie du maître modèle est réalisée par des techniques de photolithographie et gravure de silicium, É le matériau polymère est du polyuréthane.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui va maintenant en être faite, en référence aux dessins annexés, qui en représentent, à titre indicatif mais non limitatif, un mode de réalisation possible.

Sur ces dessins: - la figure 1 est une vue en perspective d'une plaque de tests conforme à l'invention, - la figure 2 est une vue agrandie et de dessus d'une partie des puits de la plaque de la figure 1, - les figures 3 et 4 sont des vues en coupe d'une partie de la plaque, respectivement selon les plans de coupe représentés par les lignes III-III et IV-IV de la figure 2, - les figures 5 et 6 sont des schémas représentant en coupe deux modes de réalisation du revêtement de surface d'une portion de plaque de tests 30 conforme à l'invention, et les figures 7A à 7F sont des schémas illustrant les étapes successives du procédé de fabrication de la plaque de tests conforme à l'invention.

Dans la suite de la description et des revendications, le terme "tests" dans l'expression "plaque de tests" désigne tout type de test effectué avec des produits de nature chimique, biochimique, biologique ou pharmacologique, ces produits étant dénommés "produits à tester". Ces produits se présentent naturellement à l'état liquide ou sont dilués dans un solvant afin de le devenir.

L'expression "culture de cellules" désigne les cellules biologiques testées et leur milieu de culture et/ou de croissance.

En se reportant à la figure 1, on peut voir une plaque de tests à puits conforme à l'invention, référencée 1.

Elle se présente sous la forme d'un parallélépipède, de préférence rectangulaire, de faible épaisseur. Ses deux faces opposées de plus grandes dimensions portent respectivement les références 11 et 12 et sont dénommées ci- après, face supérieure 11 et face inférieure 12, en référence à la position qu'elles occupent sur la figure 1.

La face supérieure 11 s'étend dans un plan P. A titre de l'exemple purement illustratif et non limitatif, les dimensions de cette plaque de tests 1 sont les suivantes: - longueur: 8 à 9 cm environ, - largeur: 2 à 2,5 cm, et - épaisseur e: 1 à 4 mm environ.

La plaque 1 comprend une pluralité de puits 2 de réception des produits à tester.

De préférence, ces puits 2 sont ménagés dans la zone centrale 13 de la plaque 1 et sont disposés sous forme de A rangées de B puits, A et B étant des nombres entiers supérieurs ou égaux à un, et qui ne sont pas forcément égaux l'un à l'autre.

Chaque puits 2 est légèrement espacé du voisin.

A titre d'exemple, sur la figure 1, la plaque 1 comporte quinze rangées de quinze puits, soient deux cent vingt cinq puits.

Chaque puits 2 s'étend selon un axe longitudinal X-X' perpendiculaire au plan P. Comme cela apparaît mieux sur la figure 4, chaque puits 2 est subdivisé en deux parties en fonction de la profondeur, et comporte ainsi dans sa partie supérieure, un tronçon creux 21 qui s'étend depuis la face supérieure 11 de la plaque 1 et qui est dénommé ci-après "tronçon commun" et dans sa partie inférieure, une pluralité de microcavités discrètes 22, regroupées de façon à déboucher à leur partie supérieure dans ledit tronçon commun 21.

Chaque tronçon commun 21 présente un axe longitudinal qui se confond avec l'axe longitudinal X-X' du puits 2 et chaque microcavités 22 s'étend selon un axe longitudinal parallèle à cet axe X-X'.

De préférence, les microcavités 22 sont disposées sous forme de C rangées de D puits, C et D étant des nombres entiers dont au moins l'un est supérieur ou égale à deux, et qui ne sont pas forcément égaux l'un à l'autre. Les microcavités voisines sont contiguës.

Dans le mode de réalisation illustré sur la figure 2, chaque puits 2 comprend dans son fond, trois rangées de trois microcavités 22, soit un total de neuf 10 microcavités par puits.

Dans le mode de réalisation représenté sur la figure 1, la plaque de tests 1 comprend donc quinze fois quinze fois neuf microcavités, soit deux mille vingt cinq microcavités.

Bien que l'on puisse faire varier les valeurs de C et D à l'infini, les 15 microcavités 22 sont avantageusement au nombre de quatre, neuf, douze, seize ou vingt cinq par puits 2.

Chaque tronçon commun 21 présente une section transversale (perpendiculaire à l'axe X-X'), de forme rectangulaire, de préférence carrée. Ses parois latérales, référencées 210 s'étendent dans un plan perpendiculaire au plan P. Chaque microcavité 22 présente également une section transversale, de forme rectangulaire, de préférence carrée.

Chaque microcavité 22 comporte un fond 221 et des parois latérales 220.

De préférence, le fond 221 est rigoureusement plat et s'étend 25 parallèlement à la face supérieure 11 de la plaque 1.

De façon avantageuse, les parois latérales 220 sont inclinées vers le centre et vers le fond de chaque microcavité 22.

Elles forment un angle a d'environ 110 à 150 avec le fond 221.

Les cultures de cellules sont distribuées dans chaque puits 2 et se répartissent dans les microcavités 22. Un volume donné de produit à tester est ensuite ajouté dans le milieu de culture pour obtenir la dilution souhaitée.

Dans l'exemple de réalisation illustré sur la figure 1, chaque test est ainsi répliqué neuf fois puisqu'il y a neuf microcavités 22 par puits 2. Des cultures de cellules ou des produits à tester de natures différentes ou qui présentent des dilutions différentes peuvent ainsi être distribués dans d'autres puits 2 voisins.

En se reportant aux figures 2 et 4, on peut voir que chaque tronçon commun 21 de puits 2 présente typiquement une section transversale de longueur L1 et de largeur L2 comprises entre 500 et 2000 tm de préférence, voisines de 1 mm et une profondeur et comprise entre 100 et 500 m (micromètres) environ.

Par ailleurs, chaque microcavité 22 présente typiquement une section transversale de longueur L3 et de largeur L4 de l'ordre de quelques centaines de micromètres, typiquement de 100 à 400 m environ et une profondeur e2 variant de 50 à 200 m environ.

De préférence, la plaque de tests 1 est réalisée dans une matière 10 plastique biocompatible, transparente à la lumière, et stable aux UV.

De préférence encore, cette matière est un matériau polymère, par exemple une résine de polyuréthane ou un matériau thermoplastique, tel que du polycarbonate.

Ce matériau doit être biocompatible pour ne pas présenter 15 d'interférences avec les cultures de cellules et/ou les produits à tester.

L'intérêt d'un matériau transparent est de permettre la lecture des résultats par des dispositifs à lecture optique, celle-ci étant effectuée au travers de la plaque 1.

La stabilité aux UV permet d'éviter un jaunissement éventuel de la 20 plaque dans le temps. De plus, la plaque doit pouvoir être stérilisée sous emballage pour éviter tout risque de contamination.

Enfin, l'emploi d'un tel matériau polymère présente des avantages sur le plan du coût, de la liberté de réalisation de formes géométriques complexes et de très faibles dimensions, et de la possibilité d'effectuer un traitement de surface de cette plaque, comme cela sera décrit ultérieurement.

Le traitement de surface susceptible d'être réalisé sur la plaque 1, a pour but d'améliorer le confinement des liquides (cultures de cellules et produits à tester) à l'intérieur des puits 2.

L'amélioration du confinement des gouttes de liquides simplifie le remplissage des puits 2. On peut ainsi, par exemple, ensemencer globalement la plaque 1 avec la culture de cellules, puis racler la surface supérieure 11, de façon à ne conserver qu'une quantité donnée de liquide dans chaque puits 2. Il n'est ainsi plus nécessaire d'utiliser un distributeur de milieu cellulaire de grande précision et coûteux.

Ensuite, chaque quantité de liquide (produit à tester) distribuée à l'intérieur d'un puits se trouve bien séparée de celle distribué dans le puits voisin.

L'isolement des liquides entre les différents puits 2 garantit l'absence de contamination entre les puits et la fiabilité des résultats obtenus.

Enfin, la tension superficielle des gouttes de liquide est plus élevée, ce qui a pour effet de limiter leur évaporation à l'intérieur des microcavités et de garantir également un mélange plus rapide des produits à tester et des cultures de cellules.

Une première technique de traitement de surface, illustrée sur la figure 5, consiste à déposer une couche de matériau hydrophobe 3 sur la face supérieure 11 du support 1 et une couche de matériau hydrophile 4 sur la surface des parois internes des puits 2, à savoir les parois 210, 220 et 221.

A titre d'exemples de produits chimiques hydrophobes 3 susceptibles d'être utilisés, on pourra citer la BSA (sérum albumine bovine), ce produit étant distribué par exemple par Aldrich ou Bioblock, ou un produit commercialisé sous la marque "sigmacote", par la société Sigma.

Ils peuvent être appliqués, par exemple, par une technique de "tamponnage", connue sous l'appellation anglaise de "stamping", qui consiste à mettre les produits de revêtement en contact physique, sélectivement avec la surface à traiter, ici la face supérieure 11 de la plaque 1. Cette mise en contact s'effectue à l'aide d'un tampon recouvert du produit hydrophobe qui est plaqué contre ladite face supérieure 11.

Un exemple de produit chimique hydrophile 4 utilisable est la polylysine, qui permet de traiter l'intérieur des puits 2, avant ou après l'application du produit hydrophobe 3.

Une seconde technique de traitement de surface est illustrée sur la 25 figure 6. Elle a pour objet de rendre hydrophobe la face supérieure 11 de la plaque 1.

Dans ce cas, la face 11 est traitée de façon à subir une "micro-" ou une "nano-structuration" de sa surface. La surface ainsi structurée porte la référence numérique 110.

La surface 110 est modifiée de façon à présenter une série de creux ou de déformations qui vont augmenter l'aire de la surface en contact avec le liquide, ce qui favorise la formation d'une goutte 5 à grande tension superficielle, comme cela est représenté sur la partie droite de la figure 6.

Cette structuration de la surface peut soit être prévue à l'origine sur le 35 maître modèle utilisé lors de la fabrication de la plaque par plasturgie, soit être réalisée par tamponnage.

Enfin, selon une variante de réalisation non représentée sur les figures, il est possible d'inclure dans l'épaisseur de la plaque, au moins un composant électrique, électronique et/ou optique, par exemple un capteur ou une caméra à affichage à cristaux liquides (LCD). Un tel composant, disposé de façon appropriée par rapport aux puits, permet, seul, ou couplé à un appareil extérieur, de lire les résultats des tests réalisés dans les puits.

Selon une autre variante, il est possible de fixer contre la face inférieure 12 de la plaque 1, une plaque de verre pour améliorer la lecture des résultats.

La plaque de tests 1 conforme à l'invention présente donc de nombreux avantages.

Le volume de milieu de culture distribué simultanément dans les neuf microcavités étant augmenté, c'est-à-dire voisin du microlitre, les problèmes d'évaporation quasi instantanée que l'on rencontrait dans l'état de la technique, avec des volumes d'une dizaine de nanolitres, sont surmontés.

L'architecture spécifique de la plaque de test, dans laquelle plusieurs microcavités 22 sont regroupées au fond d'un même puits 2 permet de diviser le nombre de dépôts de produits à tester, par le nombre de microcavités ainsi regroupées.

A titre d'exemple, pour un regroupement de neuf microcavités par puits, tel que représenté sur la figure 2, le temps de dépôt du produit à tester est théoriquement divisé par neuf. Celui-ci devrait même être encore plus faible puisque le positionnement d'un distributeur de milieu cellulaire ou de produit à tester, au-dessus d'un puits présentant une aire de 1 mm2, est plus aisé et plus rapide, que celui réalisé au-dessus d'un puits présentant une aire de 0,01 mm2.

Par ailleurs, le volume de liquide, déposé dans chaque puits, est suffisant pour permettre une dilution standard des produits à tester. En effet, les machines permettant la distribution d'un volume de l'ordre du nanolitre sont courantes et bon marché.

L'aire de la section transversale du tronçon commun 21 de chaque puits, qui doit être ciblée par la machine de distribution, fait environ 1 mm2 et non plus 1/100 mm2 comme cela est le cas avec les supports du type "puces à cellules" de l'état de la technique. En conséquence, il devient possible de travailler avec des machines de distribution moins précises et donc moins coûteuses.

En outre, le fait de travailler avec des volumes de produit plus importants facilite l'observation, du fait qu'il n'y a pas de ménisque en haut des puits, comme cela est le cas pour les puits connus de l'état de la technique et dont les dimensions sont plus petites.

Enfin, l'architecture spécifique des parois inclinées des microcavités présente des avantages par rapport aux parois rectilignes verticales des supports à 5 micro puits existants.

En effet, les parois latérales 220 inclinées permettent une meilleure répartition statique des cellules biologiques vivantes lors de l'ensemencement global de la plaque par une solution contenant ces cellules.

Les microcavités 22 présentent moins de réflexions parasites que si leur paroi latérale était verticale, ce qui est important lors de l'observation des résultats, notamment lorsqu'on utilise la technique de l'observation par fluorescence.

Les parois inclinées (surfaces en dépouille) facilitent le démoulage de la plaque de tests 1, lors de son procédé de fabrication par plasturgie.

Ce procédé de fabrication va maintenant être décrit plus en détails.

En se reportant à la figure 7A, on peut voir que la première étape du procédé consiste à réaliser une réplique 6, dénommée ci-après "maître modèle mâle", de la plaque de tests 1 que l'on souhaite obtenir.

Ce maître modèle mâle 6 comprend une partie centrale 61 qui correspond à la réplique exacte de la plaque de tests 1 à obtenir, cette partie centrale étant reliée à au moins deux languettes 62 et 63, destinées à délimiter les futurs orifices d'amenée de matière et évents du moule à fabriquer.

La partie centrale 61 est obtenue, par exemple, par assemblage, d'une plaque de silicium 611 portant les micro- ou les nano- structures qui correspondent aux puits 2 et d'une plaque parallélépipédique 612, en matériau polymère dont la face supérieure présente un évidement destiné à recevoir ladite plaque de silicium.

Les microstructures de la plaque de silicium sont obtenues par les techniques classiques de photolithographie d'une résine épaisse et de gravure du silicium.

La seconde étape, illustrée sur la figure 7B, consiste à réaliser, autour du maître modèle 6, un moule femelle 7 qui en constitue la contre-forme.

Ce moule femelle 7 comprend avantageusement au moins deux parties, à savoir une partie supérieure 71 et une partie inférieure ou fond 72.

La partie supérieure 71 comprend elle-même au moins deux parties, une partie 711, dite "avant", destinée à former les micro- ou les nanostructures correspondant aux puits 2 de la plaque de tests 1 et une partie 712, dite "arrière".

La partie avant 711 est réalisée dans un matériau du groupe des silicones, qui présente de très bonnes qualités de réplication (reproduction) du maître modèle 6 et qui facilite ultérieurement le démoulage.

De façon avantageuse, la partie avant 711 est réalisée en 5 polydiméthylsiloxane (connu sous l'abréviation "PDMS") et les autres parties du moule 712 et 72, en silicone.

De façon avantageuse, le moule 7 peut également comprendre un carter extérieur rigide en acier, en alliage léger ou en matière plastique, non représenté sur les figures.

De façon avantageuse, le moule 7 est obtenu en coulant successivement le PDMS, puis le silicone, chaque étape de coulage étant suivie d'une mise sous vide du moule et d'une étape de durcissement thermique.

Chacun des matériaux du moule hybride assure une fonction. Le PDMS permet une réplication parfaite des microstructures à partir du maître modèle 6, le silicone englobe le PDMS et solidifie la partie élastomère du moule et le carter extérieur rigidifie l'ensemble et facilite la fonction d'éjection.

Enfin, on notera que des répliques 73 des futurs éjecteurs sont également utilisées pour ménager des orifices appropriés dans le moule 7. Ces éjecteurs permettront ultérieurement un démoulage aisé de la pièce.

La figure 7C illustre le moule femelle 7 finalement obtenu après retrait du maître modèle mâle 6. On notera que le moule femelle 7 comprend au moins un orifice d'amenée de matière 75 et un évent 74.

Les micro-structures en PDMS sont assez fragiles. Pour augmenter la durée de vie du moule, il est possible de revêtir celui-ci et/ou le maître modèle 6, d'une couche de produit anti-adhérent, tel que du polytétrafluoroéthylène (PTFE). Celui-ci est appliqué, par exemple, par pulvérisation.

La figure 7D représente la coulée sous vide du matériau constituant la plaque 1, par exemple une résine de polyuréthane 100, à l'intérieur du moule 7. Cette étape est suivie d'un traitement thermique à environ 70 Cet du durcissement de la résine.

Comme représenté sur la figure 7E, on procède ensuite au démoulage à l'aide des éjecteurs métalliques 8 qui permettent d'éviter la déformation de la pièce.

On obtient la plaque de tests 1 représentée sur la figure 7F, après 35 ébavurage des portions de matériau 100 correspondant aux conduits d'amenée et évents.

Le point fort de ce procédé de fabrication est la possibilité de produire des microsystèmes transparents, bon marché. Il constitue ainsi, non seulement, une alternative hautement concurrentielle aux technologies verre et silicium, grâce à des coûts réduits et à de meilleures possibilités d'obtention de formes géométriques spécifiques, mais également une avancée qualitative majeure, par rapport aux technologies polymères existantes (injection plastique, emboutissage), ces dernières n'étant pas adaptées à la fabrication de microsystèmes.

Le moule femelle 7 fabriqué conformément à l'invention permet d'obtenir des plaques de tests avec des micro- ou nano-structures polymères de qualité, avec des précisions dimensionnelles submicroniques, ce qui est nécessaire pour des applications en biologie ou chimie.

Claims (14)

REVENDICATIONS

1. Plaque (1) de tests biochimiques, biologiques ou pharmacologiques, comprenant une pluralité de puits (2) de réception de cultures de cellules et de produits à tester, caractérisée en ce que chaque puits (2) est subdivisé en deux parties, d'une part un tronçon creux (21), dit "tronçon commun", qui débouche sur l'une des faces (11) dite "supérieure" de ladite plaque (1) et qui s'étend depuis cette face supérieure (11) jusqu'à une certaine profondeur de ladite plaque (1) et d'autre part, une pluralité de microcavités discrètes (22), regroupées de façon à ce que chacune débouche à sa partie supérieure dans la partie inférieure dudit tronçon commun (21).

2. Plaque de tests selon la revendication 1, caractérisée en ce que les parois latérales (220) de chaque microcavité (22) sont inclinées vers le centre et vers le fond (221) de ladite microcavité.

3. Plaque de tests selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdites microcavités (22) ont une profondeur (e2) comprise entre 50 et 200 micromètres environ et une section transversale de forme carrée ou rectangulaire, dont la longueur (L3) et la largeur (L4) sont comprises entre 100 et 400 micromètres environ.

4. Plaque de tests selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits tronçons communs (21) ont une profondeur (el) comprise entre 100 et 500 micromètres environ et une section transversale de forme carrée ou rectangulaire, dont la longueur (L1) et la largeur (L2) sont comprises entre 500 et 2000 micromètres environ.

5. Plaque de tests selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que chaque puits (2) comprend C rangées de D microcavités (22) qui débouchent dans son tronçon commun (21), C et D étant des nombres entiers dont au moins l'un est supérieur ou égal à deux, les microcavités voisines étant contiguës.

6. Plaque de tests selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes, caractérisée en ce qu'elle est réalisée dans un matériau polymère biocompatible et transparent à la lumière.

7. Plaque de tests selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit matériau est une résine de polyuréthane.

8. Plaque de tests selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la surface de sa face supérieure (11) est traitée de façon à être hydrophobe et en ce que la surface des parois latérales (210) du tronçon commun (21) et des parois latérales (220) et du fond (221) des microcavités (22) est traitée de façon à être hydrophile.

9. Plaque de tests selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle inclut dans son épaisseur (e) ou en ce qu'elle comprend sous sa face inférieure (12), au moins un composant électrique, électronique et/ou optique, qui participe à la lecture des résultats des tests effectués.

10. Procédé de fabrication d'une plaque de tests (1) selon l'une quelconque des revendications précédentes, réalisée en matériau polymère (100), caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : réaliser un maître modèle mâle (6) de ladite plaque de tests (1), réaliser autour dudit maître modèle mâle (6), un moule (7) femelle, en plusieurs parties, dont au moins l'une (711), dite "partie avant", destinée à former les micro- ou les nano- structures correspondant aux puits (2) de la future plaque (1), est réalisée en un silicone qui présente de très bonnes qualités de réplication dudit maître modèle (6), couler sous vide ledit matériau polymère (100), à l'intérieur du 20 moule femelle (7) précédemment obtenu, et le faire durcir, - éjecter la plaque de tests (1) ainsi obtenue, hors du moule (7), à l'aide d'éjecteurs (8).

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la partie avant (711) du moule (7) est réalisée en polydiméthylsiloxane (PDMS).

12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce qu'une couche de matériau antiadhésif est déposée sur la surface extérieure dudit maître modèle mâle (6), avant la fabrication du moule femelle (7) et/ou sur la surface intérieure dudit moule (7), avant le coulage sous vide du matériau polymère (100).

13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce qu'au moins une partie du maître modèle (6) est réalisée par des techniques de photolithographie et gravure de silicium.

14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que le matériau polymère (100) est du polyuréthane.