WO2006027532A1 - Dispositif de transfert d'elements contenus dans un liquide - Google Patents

Dispositif de transfert d'elements contenus dans un liquide Download PDF

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WO2006027532A1
WO2006027532A1 PCT/FR2005/050707 FR2005050707W WO2006027532A1 WO 2006027532 A1 WO2006027532 A1 WO 2006027532A1 FR 2005050707 W FR2005050707 W FR 2005050707W WO 2006027532 A1 WO2006027532 A1 WO 2006027532A1
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liquid
micro
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residues
transfer
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Frédéric Revol-Cavalier
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Commissariat A L'energie Atomique
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    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids

Definitions

  • the invention relates to a device for the collective and simultaneous transfer of micro-quantities of liquid.
  • the invention relates to a device for transferring elements, for example biological elements, contained in a liquid.
  • the researchers decided to use the techniques developed by the micro-electronics for the fabrication of silicon integrated circuits for producing silicon or glass substrates of very small dimensions.
  • the supports thus produced form microarrays or micro systems with multi-point analysis and micrometric dimensions.
  • silicon it is possible to integrate multiplexing, addressing or reading circuits within these micro-systems.
  • microelectronic techniques it is possible, for example, to produce structured silicon chips comprising several thousand wells of some ten micrometers in which biological probes will be fixed (see document [1]). It is also possible to produce small biological microsystems, for example microchannels in which the biological fluids will be able to move, or microchambers of reactions or microcuvettes in which we will be able to perform biological or chemical reactions with controlled volumes. of liquid.
  • micro-systems with micro ⁇ tanks or pits are widely used because they can immobilize a large number of different probes on a very small area.
  • the disadvantage of these micro-systems is that the filling of micro ⁇ cups is difficult.
  • the filling of micro-reservoirs of a biochip can be carried out by robots equipped with piezoelectric heads which deliver micro drops of liquid inside the microcuvettes of the micro system. These robots can also take the
  • liquid present in the microcuvettes of a biochip is particularly useful when one wants to study biological or biochemical processes by taking part of the liquid contained in microcuvettes, for example when one wants to carry out a quality control of a biological or biochemical process at a precise stage of said process. , when one wants to keep liquid samples at a stage of the process, or when one wants to duplicate the filling of a micro system in a large number of micro systems filled identically.
  • each microcuvette contains a tiny amount of solution (a few pL to a few nL), sampling is possible if a pipette with a tip specially designed to adapt to the shape of the microcuvette is used. But when you want to make this levy on hundreds of micro-cuvettes, no dispensing robot currently on the market can perform the levy collectively. Moreover, for certain applications, in particular applications of biological type or chemical kinetics, it is important to be able to quickly take the liquid contained in the microcuvettes before it evaporates. However, at the scale of nano-liter, evaporation is fast. This excludes the use of currently available robots on the market.
  • the walls of the capillaries can be chemically coated with a silane, or physically with materials such as teflon or parylene.
  • a silane or physically with materials such as teflon or parylene.
  • the disadvantage of these treatments is that they are heavy and depend on the hydrophobic / hydrophilic nature of the solvent, the biological element to be transferred and the wall considered.
  • ultrasound To facilitate the desorption of the adsorbed elements on the walls of the capillaries, it is also possible to use ultrasound. The risk is to disrupt the liquid contained in the cuvettes or to break the biological elements contained in the capillary microphones.
  • the object of the invention is to provide a device which makes it possible to transfer simultaneously and simultaneously micro-amounts of liquid, without being disturbed during the discharge of the collected liquids.
  • a device for transferring micro-quantities of liquid comprising at least one micro-liquid quantity transfer and sampling element, means being provided for removing, after the transfer of the liquid, residues. left by the liquid on a surface of said element, characterized in that said means consist of a sacrificial layer formed on said surface and intended to be at least partially removed by the action of at least one means for restoring or recovering at least a portion of said residues left by the liquid.
  • the at least partial elimination of the sacrificial layer may be by decomposition or by dissolution.
  • Micro-quantities of liquids are understood to mean amounts of the order of pico-liter (pL) to a few nano-liters (nL).
  • the element for sampling and transferring a micro-quantity of liquid is a micropipette.
  • Micropipettes columns pierced with an axial hole and micrometer-sized section.
  • the element for sampling and transferring a micro-quantity of liquid is a solid micro-rod covered with a metal layer.
  • the solid micro-rod is a column having a section (or diameter) of micrometric size.
  • the sacrificial layer is made of a soluble material.
  • said soluble material is chosen from sugar, agarose gel, a polymer, a resin or PVA.
  • any similar material that can be dissolved in a suitable solvent can be used.
  • the sugar layer may for example be made from sucrose, glucose or trehalose. These materials are cited as examples; they are interesting because they are commonly used in the manufacture of biochips.
  • the sacrificial layer is in a material that can be decomposed by electrolysis.
  • the sacrificial layer is made of a metallic material.
  • the choice of materials constituting the sacrificial layer is made according to their capacity to facilitate the desorption of the residues (by example biological elements) adsorbed on the sacrificial layer, their independence vis-à-vis the hydrophobic / hydrophilic nature of the liquid to be taken (in which the residues, here biological elements, are in solution), the biological element to be taken and from the relevant wall of the sampling and transfer element.
  • the means for restoring or recovering at least a portion of the residues left by the liquid is a solvent selected from water, hot water or a solution containing alcohol. These solvents are chosen because they are little or not aggressive for the biological elements.
  • the means for recovering or recovering at least a portion of the residues left by the liquid is electrolysis. Electrolysis is particularly suitable in the case where the sacrificial layer is a metal layer.
  • the invention also relates to the following methods.
  • the invention relates to a method for sampling micro-quantities of liquid using the transfer device comprising micropipettes, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention also relates to a method for taking micro ⁇ amounts of liquid using the transfer device comprising micro-rods, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention relates to a method of discharging the adsorbed residues on the sacrificial layer of the device according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • the solvent and the means for recovering or recovering at least a portion of the residues left by the liquid may be identical.
  • the means for restoring or recovering at least a portion of the residues left by the liquid may be electrolysis.
  • FIGS. 1A to 1D show the steps of a method of sampling a liquid using a transfer device comprising micropipettes;
  • FIGS. 2A to 2D represent the steps of a sampling method; a liquid using a transfer device comprising micro-rods.
  • a transfer device comprising micropipettes of silicon oxide and a sacrificial layer deposited on the inner wall of these micropipettes.
  • holes in the thickness of a silicon substrate in a regular arrangement. For example, it is possible to make between several tens and thousands of holes, or to have a hole density of between 1000 and 30000 per cm 2 of silicon wafer. These through holes can be made using a laser, a deep plasma etching of the substrate or any other similar technique.
  • the oxidation of the silicon substrate is carried out in order to obtain a silicon oxide layer on the walls of the holes and on the faces of the silicon substrate. This oxidation step of the substrate may for example be carried out in an oxidation furnace.
  • the chemical etching or plasma of one of the faces of the substrate in order to remove the layer of silicon oxide formed in the preceding step on said face.
  • the chemical etching of the silicon revealed in the preceding step is carried out so as to disengage the tubes which will constitute the micropipettes.
  • the etching of the silicon continues until a satisfactory micropipette height is reached.
  • the inner wall of the capillaries of the device is covered with a sacrificial layer.
  • the sacrificial layer covers at least the parts of the inner wall of the micropipette intended to receive the liquid to be sampled.
  • the outer walls of the micropipettes can also be covered with a sacrificial layer.
  • the sacrificial layer may be a porous layer or a metal layer. It can be obtained by soaking the micropipettes in a solution containing the constituent elements of the layer dissolved in a solvent. For example, to obtain a porous sacrificial layer, a sugar solution containing sucrose, glucose or trehalose can be aspirated from the micropipettes.
  • the sacrificial layer can also be obtained by performing a physical, chemical or electrochemical deposition of a metal (for example by spraying or evaporation of gold, copper, nickel, chromium, aluminum, etc.), a polymer, or mineral compounds (silica, silicon nitride ).
  • the walls of the micropipettes may for example be covered with an agarose gel or a polymer such as a photoresist or PVA. It should be noted that a physical or chemical treatment may be necessary for the complete formation of the layer, for example heat treatment or ultraviolet irradiation.
  • the sacrificial layer is obtained by dipping the capillaries in a 10% by weight solution of sucrose.
  • the filling of the micropipettes may for example be carried out by capillarity.
  • the device is placed in an oven at 50 ° C. so that the solution is evaporated.
  • Sucrose is preferentially on the inner walls, but it can also be on the outer walls of the capillaries.
  • the device thus produced is then used to transfer 5 .mu.l of a solution containing oligonucleotides at a concentration of 40 .mu.M.
  • the 5 ⁇ L of liquid to be taken can for example be located in the microcuvettes of a microsystem (for example a biochip).
  • the micropipettes of the transfer device according to the invention are placed in the microcuvettes or micro-reservoirs of the microsystem containing the liquids to be sampled and the micropipettes are filled by capillarity, by pumping, by shock or by any other means. similar known to those skilled in the art.
  • the transfer device will preferably be designed so that each micropipette can be received simultaneously only by a single microcuvette of the biochip: each micropipette thus sucks the liquid contained in a single microcuvette.
  • the 5 ⁇ L of liquid can be sucked into each capillary by means of a pump or by capillarity. If a pump is used, care should be taken not to suck a larger volume than the internal volume of the capillary; indeed, the aspirated liquid must remain in the capillary.
  • a micropipette 1 comprising silicon oxide walls 2 whose internal surface is covered with a sacrificial layer 3, which is immersed in a microcuvette 4 comprising a liquid 6 comprising biological elements. 5. Then, the filled device is placed in an oven at 50 ° C.
  • the biological elements are adsorbed on the inner walls of the micropipette, i.e. on the sacrificial layer 3 (FIG. 1B).
  • the sacrificial layer 3 can be dissolved in order to bring back in solution the biological elements present on the walls of the micropipettes.
  • the transfer device is then placed above a device having micro ⁇ reservoirs in order to recover the liquid contained in each micropipette.
  • the sacrificial layer can be dissolved by various techniques, for example the dissolution of the layer in a specific solvent. If the layer is sugar, water can be used; if the layer is PVA or agarose gel, we can use hot water; if the layer is of resin, a solution containing alcohol will preferably be used; if the sacrificial layer is metallic, it can be dissolved by electrolysis, for example.
  • the sacrificial layer 3 is obtained from a sucrose solution at 10% by weight. To dissolve it, it is therefore possible to use water 16.
  • the micropipettes 1 of the device are therefore immersed in an ependorf 14 (having a diameter of 5 mm and a maximum capacity of 150 ⁇ L) filled with 50 ⁇ L of water (FIG. IC).
  • the micropipettes 1 will suck up the water 16 contained in ependorf 14.
  • the sacrificial layer 3 on which the biological elements 5 are fixed will dissolve in contact with the water.
  • the liquid 17 thus produced containing the solvent 16
  • the layer sacrificial 3 can be dissolved completely (as in Figure ID) or partially. Indeed, as the biological elements are adsorbed on the surface of the sacrificial layer, it does not need to be completely destroyed (here, dissolved) to restore the elements fixed on its surface.
  • the quantities of chemical elements obtained are measured when they are taken with a transfer device having micropipettes with and without sacrificial layer.
  • a UV spectrophotometer To dose the elements contained in the collected liquid, it is possible to use a UV spectrophotometer.
  • the operating wavelength of the spectrophotometer is chosen according to the nature of the biological elements that it is desired to assay.
  • the spectrophotometer is set at 260 nm because it is desired to assay oligonucleotides which adsorb at this wavelength.
  • the measurements were made in duplicate in order to detect any measurement error. The results of these measurements are presented in Table 1 below:
  • the invention consists in using an intermediate layer between the wall of the micropipette and the solution to be sampled. After partial or total evaporation of the liquid taken, the biological or biochemical elements contained in the liquid taken will adsorb to this intermediate layer. This layer is then dissolved in a receiving pan. The dissolution of the layer will allow to release in solution the biological or biochemical elements which have adsorbed on the sacrificial layer.
  • the transfer device comprises columns, called micro-rods, of micrometric size, made of silicon and covered with a metal layer whose thickness is between 100 nm and a few microns.
  • a metal layer whose thickness is between 100 nm and a few microns.
  • the sacrificial layer whose thickness is between 100 nm and a few micrometers, is deposited on the outer surface of the micro-rods.
  • This particular configuration of the transfer device does not make it possible to recover an identical quantity of liquid between the different micro-rods, but it makes it possible to concentrate the biological species that will be fixed on the sacrificial layer. Indeed, using an electric field, we will be able to attract electrically charged biological or biochemical elements included in the liquid. For example, DNAs, RNAs and bacteria, which have non-zero electrical charges, will be attracted to the micro-rods of the device by application of an electric field.
  • the transfer device comprises for example micro-rods made from a silicon substrate and covered with a platinum layer.
  • the device can be obtained by etching micro-rods in a silicon wafer, for example by plasma etching. Then, the micro-rods are metallized by spraying or evaporation of a metal target.
  • a 1% agarose gel layer is deposited on the metal micro-rods to produce the sacrificial layer. This layer can be obtained by soaking in a solution containing 1% agarose. The thickness of the layer varies between 0.1 micrometre and a few micrometers.
  • the micro-rods 21 are immersed in a solution 26 containing oligonucleotides 25 at the concentration of 40 ⁇ M.
  • An electric field is applied between an electrode (not shown) immersed in the solution 26 containing the oligonucleotides 25 and each micro-rod 21 covered with the agarose gel 23 (FIG. 2A).
  • Oligonucleotides are attracted to micro-rods 21 and adsorb to sacrificial layer 23 ( Figure 2B).
  • the micro-rods 21 of the transfer device are immersed in an ependorf 14 filled with 50 ⁇ L of hot water 36 (FIG. 2C).
  • the microcuvettes have been replaced by ependorfs in order to facilitate the experiments.
  • micro ⁇ bowls instead of ependorfs order to retrieve items contained in separate pits.
  • the ependorf contains the solution 37 which notably comprises hot water 36 and oligonucleotides 25.
  • This solution 37 can then be assayed with the UV spectrophotometer.
  • the spectrophotometer is set to emit a wavelength at 260 nm because the elements you want assay (oligonucleotides) adsorb at this wavelength.
  • Patent FR 2 823 999 "Miniature device for separating and isolating biological objects and uses”.
  • Patent GB 2 353 093 "Liquid sample handling or transfering device”.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif de transfert de micro-quantités de liquide, comprenant au moins un élément de prélèvement et de transfert (1) d'une micro-quantité de liquide (6), des moyens étant prévus pour éliminer, après le transfert du liquide, des résidus (5) laissés par le liquide sur une surface (2) dudit élément, caractérisé en ce que lesdits moyens sont constitués d'une couche sacrificielle (3) formée sur ladite surface et destinée à être au moins partiellement éliminée sous l'action d'au moins un moyen (16) permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie desdits résidus laissés par le liquide. L'invention concerne également des procédés de prélèvement de micro-quantités de liquide et un procédé de décharge.

Description

l'
DISPOSITIF DE TRANSFERT D'ELEMENTS CONTENUS DANS UN LIQUIDE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne un dispositif permettant le transfert collectif et simultané de micro-quantités de liquide. En particulier, l'invention concerne un dispositif permettant de transférer des éléments, par exemple des éléments biologiques, contenus dans un liquide.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
Avant l'apparition des puces à ADN, la fixation de sondes sur un support était largement utilisée, notamment dans le domaine du diagnostic. Les deux principaux types de supports utilisés dans ce domaine étaient le plastique et la nitrocellulose. L'inconvénient de ces supports est qu'ils ne permettent pas l'immobilisation d'un grand nombre de sondes à leur surface.
L'émergence de nouvelles applications telles que le séquençage génomique, les tests ADN en biologie, le bio terrorisme ou agroalimentaire a nécessité le développement de supports de grande capacité, l'objectif étant d'obtenir le nombre le plus élevé possible de sondes différentes sur une surface la plus petite possible.
Pour atteindre cet objectif, les chercheurs ont décidé d'utiliser les techniques développées par la micro électronique pour la fabrication de circuits intégrés en silicium afin de réaliser des supports en silicium, ou en verre, de très petites dimensions. Les supports ainsi réalisés forment des biopuces ou micro systèmes à multi points d'analyses et de dimensions micrométriques. De plus, en utilisant du silicium, on peut intégrer des circuits de multiplexage, d'adressage ou de lecture à l'intérieur de ces micro-systèmes.
En utilisant les techniques de la micro électronique, on peut par exemple réaliser des puces structurées en silicium comprenant plusieurs milliers de cuvettes de quelque dizaine de micromètres, dans lesquelles on va fixer des sondes biologiques (voir le document [1] ) . On peut aussi réaliser des microsystèmes biologiques de petites dimensions, comme par exemple des microcanaux dans lesquels les fluides biologiques vont pouvoir se déplacer, ou des microchambres de réactions ou micro-cuvettes dans lesquelles on va pouvoir réaliser des réactions biologiques ou chimiques avec des volumes contrôlés de liquide.
Ces micro-systèmes présentant des micro¬ réservoirs ou micro-cuvettes sont très utilisés car ils permettent d' immobiliser un grand nombre de sondes différentes sur une très petite surface. L'inconvénient de ces micro-systèmes est que le remplissage des micro¬ cuvettes est difficile.
Le remplissage des micro-réservoirs d'une biopuce peut être réalisé par des robots équipés de têtes piézoélectriques qui délivrent des micro gouttes de liquide à l'intérieur des micro-cuvettes du micro système. Ces robots peuvent également prélever du l'
liquide présent dans les micro-cuvettes d'une biopuce. Cela est particulièrement utile lorsqu' on veut étudier des procédés biologiques ou biochimiques en prélevant une partie du liquide contenu dans des micro-cuvettes, par exemple lorsqu'on veut réaliser un contrôle qualité d'un procédé biologique ou biochimique à une étape précise dudit procédé, lorsqu'on veut conserver des échantillons de liquide à une étape du procédé, ou encore lorsqu'on veut dupliquer le remplissage d'un micro système en un grand nombre de micro systèmes remplis de manière identique.
Comme chaque micro-cuvette contient une infime quantité de solution (quelques pL à quelques nL) , le prélèvement est possible si on utilise une pipette ayant un embout spécialement conçu pour s'adapter à la forme de la micro-cuvette. Mais lorsqu'on désire réaliser ce prélèvement sur des centaines de micro-cuvettes, aucun robot de dispense actuellement sur le marché ne peut effectuer le prélèvement de manière collective. Par ailleurs, pour certaines applications, notamment des applications de type biologiques ou de cinétiques chimiques, il est important de pouvoir prélever rapidement le liquide contenu dans les micro-cuvettes avant que celui-ci ne s'évapore. Or, à l'échelle du nano-litre, évaporation est rapide. Cela exclut donc l'utilisation des robots actuellement disponibles sur le marché.
Il existe des systèmes de transfert qui permettent le transfert collectif de liquide. Ces systèmes sont équipés de faisceaux de capillaires qui viennent chacun déposer du liquide dans une micro- l'
cuvette (voir les documents [2] et [3] ) . Ces dispositifs à faisceaux de capillaires sont adaptés pour prélever ou distribuer collectivement du liquide dans des biopuces comprenant quelques dizaines de micro-cuvettes. Mais lorsque le nombre de cuvettes augmente et dépasse plusieurs centaines et que les dimensions des cuvettes diminuent, il devient également impossible d'utiliser ces dispositifs munis de faisceaux de capillaires pour effectuer le transfert collectif de liquide. Pour réaliser le transfert collectif de liquide dans les micro-cuvettes d'une biopuce, on pourrait penser utiliser un système équipé de faisceaux de capillaires de tailles micrométriques. Le problème est que, du fait de la dimension des capillaires, la quantité de liquide qu'ils prélèvent devient tellement faible que évaporation à l'intérieur des capillaires est très rapide. L'éjection du liquide contenue dans chaque capillaire devient alors difficile à réaliser. En effet, le liquide prélevé étant évaporé, les éléments biologiques contenu dans le liquide vont s'adsorber sur la paroi du capillaire.
Pour limiter l'adsorption de ces éléments sur les parois ou pour faciliter leur désorption, on peut préalablement recouvrir chimiquement les parois des capillaires avec un silane, ou physiquement avec des matériaux tels que le téflon ou le parylène. L'inconvénient de ces traitements est qu'ils sont lourds et dépendent de la nature hydrophobe/hydrophile du solvant, de l'élément biologique à transférer et de la paroi considérée. Pour faciliter la désorption des éléments adsorbés sur les parois des capillaires, on peut également utiliser des ultrasons. Le risque est de perturber le liquide contenu dans les cuvettes ou de casser les éléments biologiques contenus dans les micros capillaires.
EXPOSÉ DE I/ INVENTION
Le but de l'invention est de fournir un dispositif qui permette de transférer collectivement et de manière simultanée des micro-quantités de liquide, sans être gêné lors de la décharge des liquides prélevés .
Ce but est atteint par un dispositif de transfert de micro-quantités de liquide, comprenant au moins un élément de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide, des moyens étant prévus pour éliminer, après le transfert du liquide, des résidus laissés par le liquide sur une surface dudit élément, caractérisé en ce que lesdits moyens sont constitués d'une couche sacrificielle formée sur ladite surface et destinée à être au moins partiellement éliminée sous l'action d'au moins un moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie desdits résidus laissés par le liquide.
L'élimination au moins partielle de la couche sacrificielle peut se faire par décomposition ou par mise en solution.
On entend par micro-quantités de liquides des quantités de l'ordre du pico-litre (pL) à quelques nano-litres (nL) . Selon une première variante, l'élément de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide est une micropipette. On entend par
« micropipettes » des colonnes percées d'un trou axial et de section de dimension micrométrique.
Selon une deuxième variante, l'élément de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide est une micro-tige pleine recouverte d'une couche métallique. La micro-tige pleine est une colonne ayant une section (ou diamètre) de dimension micrométrique.
Avantageusement, la couche sacrificielle est en un matériau soluble. Avantageusement, ledit matériau soluble est choisi parmi le sucre, le gel d'agarose, un polymère, une résine ou le PVA. En fait, on peut utiliser tout matériau similaire pouvant être dissous dans un solvant adéquat. La couche en sucre peut par exemple être réalisée à partir de saccharose, de glucose ou de tréhalose. Ces matériaux sont cités à titre d'exemple ; ils sont intéressants car ils sont couramment utilisés dans la fabrication des biopuces.
De plus, leur dissolution se fait dans des solvants
(eau, éthanol...) non agressifs pour les éléments biologiques . Avantageusement, la couche sacrificielle est en un matériau décomposable par électrolyse. Avantageusement, la couche sacrificielle est en un matériau métallique.
Le choix des matériaux constituant la couche sacrificielle est fait en fonction de leur capacité à faciliter la désorption des résidus (par exemple des éléments biologiques) adsorbés sur la couche sacrificielle, de leur indépendance vis-à-vis de la nature hydrophobe/hydrophile du liquide à prélever (dans lequel les résidus, ici des éléments biologiques, sont en solution), de l'élément biologique à prélever et de la paroi considérée de l'élément de prélèvement et de transfert.
Avantageusement, le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide est un solvant choisi parmi de l'eau, de l'eau chaude ou une solution contenant de l'alcool. Ces solvants sont choisis car ils sont peu ou pas agressifs pour les éléments biologiques . Avantageusement, le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide est une électrolyse. L' électrolyse est particulièrement adaptée dans le cas où la couche sacrificielle est une couche métallique.
L'invention concerne également les procédés suivants .
Selon une première variante, l'invention concerne un procédé de prélèvement de micro-quantités de liquide à l'aide du dispositif de transfert comportant des micropipettes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- aspiration des micro-quantités de liquide dans la au moins une micropipette, l'
- séchage du dispositif pour provoquer évaporation desdites micro-quantités de liquide prélevées sous forme de résidus.
Selon une deuxième variante, l'invention concerne aussi un procédé de prélèvement de micro¬ quantités de liquide à l'aide du dispositif de transfert comportant des micro-tiges, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- plonger les micro-tiges du dispositif dans le liquide à transférer,
- appliquer un champ électrique entre une électrode plongée dans le liquide à transférer et chaque micro¬ tige pour attirer des résidus chargés présents dans le liquide. Enfin, l'invention concerne un procédé de décharge des résidus adsorbés sur la couche sacrificielle du dispositif selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- plonger les éléments de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide dans un solvant et éliminer au moins une partie de la couche sacrificielle à l'aide d'un moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide, - récupérer la solution comprenant le solvant et les résidus désabsorbés.
Avantageusement, le solvant et le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide peuvent être identiques. Avantageusement, le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide peut être une électrolyse.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, et accompagnée des dessins annexés parmi lesquels :
- les figures IA à ID représentent les étapes d'un procédé de prélèvement d'un liquide à l'aide d'un dispositif de transfert comportant des micropipettes, - les figures 2A à 2D représentent les étapes d'un procédé de prélèvement d'un liquide à l'aide d'un dispositif de transfert comportant des micro-tiges.
On précise que, pour des soucis de clarté, ces figures ne représentent qu'une partie du dispositif selon l'invention, à savoir une seule micropipette ou micro-tige plongée dans une seule micro-cavité ou cavité.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Pour illustrer l'invention, nous allons décrire le mode de réalisation d'un dispositif de transfert selon l'invention comportant des micropipettes en oxyde de silicium et une couche sacrificielle déposée sur la paroi interne de ces micropipettes. On commence par réaliser des trous dans l'épaisseur d'un substrat de silicium selon un agencement régulier. On peut par exemple réaliser entre plusieurs dizaines et plusieurs milliers de trous, ou bien avoir une densité de trous comprise entre 1000 et 30000 par cm2 de plaque de silicium. Ces trous traversants peuvent être réalisé à l'aide d'un laser, d'une gravure plasma profonde du substrat ou de toute autre technique similaire. Puis, on réalise l'oxydation du substrat de silicium afin d' obtenir une couche d'oxyde de silicium sur les parois des trous et sur les faces du substrat de silicium. Cette étape d'oxydation du substrat peut par exemple être réalisée dans un four d'oxydation. Puis on effectue la gravure chimique ou plasma d'une des faces du substrat afin d' ôter la couche d'oxyde de silicium formée à l'étape précédente sur ladite face. Puis, on réalise la gravure chimique du silicium révélé à l'étape précédente de façon à dégager des tubes qui vont constituer les micropipettes. La gravure du silicium se prolonge jusqu'à ce qu'on atteigne une hauteur de micropipette satisfaisante. Enfin, la paroi interne des capillaires du dispositif est recouverte d'une couche sacrificielle. La couche sacrificielle recouvre au moins les parties de la paroi interne de la micropipette destinées à recevoir le liquide à prélever. Les parois extérieures des micropipettes peuvent également être recouvertes d'une couche sacrificielle.
La couche sacrificielle peut être une couche poreuse ou une couche métallique. Elle peut être obtenue par trempage des micropipettes dans une solution contenant les éléments constitutifs de la couche dissous dans un solvant. Par exemple, pour obtenir une couche sacrificielle poreuse, on peut faire aspirer aux micropipettes une solution sucrée contenant du saccharose, du glucose ou du tréhalose. La couche sacrificielle peut également être obtenue en réalisant un dépôt physique, chimique ou électrochimique d'un métal (par exemple par pulvérisation ou évaporation d'or, de cuivre, de nickel, de chrome, d'aluminium...), d'un polymère, ou de composés minéraux (silice, nitrure de silicium...) . Les parois des micropipettes pourront par exemple être recouvertes d'un gel d' agarose ou d'un polymère tel qu'une résine photosensible ou du PVA. Il est à noter qu'un traitement physique ou chimique peut être nécessaire à la formation complète de la couche, par exemple un traitement thermique ou une insolation aux ultraviolets.
Dans cet exemple, la couche sacrificielle est obtenue en trempant les capillaires dans une solution de saccharose à 10% en poids. Le remplissage des micropipettes peut par exemple être réalisé par capillarité. Puis, on place le dispositif dans une étuve à 5O0C afin que la solution soit évaporée. Le saccharose est préférentiellement sur les parois internes, mais il peut être également sur les parois externes des capillaires.
Le dispositif ainsi réalisé est ensuite utilisé pour transférer 5 μL d'une solution contenant des oligonucléotides à la concentration de 40 μM. Les 5 μL de liquide à prélever peuvent par exemple se situer dans les micro-cuvettes d'un microsystème (par exemple une biopuce) . On place dans ce cas les micropipettes du dispositif de transfert selon l'invention dans les micro-cuvettes ou micro-réservoirs du microsystème contenant les liquides à prélever et on réalise le remplissage des micropipettes par capillarité, par pompage, par chocage ou tout autre moyen similaire connu de l'homme du métier. Le dispositif de transfert sera de préférence réalisé de manière à ce que chaque micropipette ne puisse être reçues simultanément que par une seule micro-cuvette de la biopuce : chaque micropipette aspire ainsi le liquide contenu dans une seule micro-cuvette.
Les 5 μL de liquide peuvent être aspirés dans chaque capillaire à l'aide d'une pompe ou par capillarité. Si on utilise une pompe, on fera attention à ne pas aspirer un volume plus important que le volume interne du capillaire ; en effet, le liquide aspiré doit rester dans le capillaire. Dans la figure IA, on peut voir une micropipette 1, comportant des parois 2 en oxyde de silicium dont la surface interne est recouverte d'une couche sacrificielle 3, qui est plongée dans une micro-cuvette 4 comprenant un liquide 6 comportant des éléments biologiques 5. Puis, on place le dispositif rempli dans une étuve à 5O0C afin que la solution aspirée s'évapore et les éléments biologiques se déposent sur la couche sacrificielle : les éléments biologiques 5 sont adsorbés sur les parois internes de la micropipette, c'est-à-dire sur la couche sacrificielle 3 (figure IB) . Pour récupérer le liquide 6 prélevé (ou plus particulièrement, les éléments biologiques 5 l'l'
présents dans le liquide prélevé) , on peut dissoudre la couche sacrificielle 3 afin de remettre en solution les éléments biologiques présents sur les parois des micropipettes. Le dispositif de transfert est alors disposé au dessus d'un dispositif présentant des micro¬ réservoirs afin de récupérer le liquide contenu dans chaque micropipette.
Pour dissoudre la couche sacrificielle, différentes techniques peuvent être utilisée comme par exemple la dissolution de la couche dans un solvant déterminé. Si la couche est en sucre, on peut utiliser de l'eau ; si la couche est en PVA ou en gel d'agarose, on pourra utiliser de l'eau chaude ; si la couche est en résine, on utilisera de préférence une solution contenant de l'alcool ; si la couche sacrificielle est métallique, elle peut être dissoute par électrolyse par exemple.
Dans cet exemple, la couche sacrificielle 3 est obtenue à partir d'une solution de saccharose à 10% en poids. Pour la dissoudre, on peut donc utiliser de l'eau 16. Les micropipettes 1 du dispositif sont donc plongés dans un ependorf 14 (ayant un diamètre de 5 mm et une contenance maximale de 150 μL) rempli de 50 μL d'eau (figure IC) . Les micropipettes 1 vont aspirer l'eau 16 contenue dans ependorf 14. La couche sacrificielle 3 sur laquelle sont fixées les éléments biologiques 5 va se dissoudre au contact de l'eau. Le liquide 17 ainsi produit contenant le solvant 16
(l'eau), les éléments biologiques prélevés 5 et les éléments constituant la couche sacrificielle 3 sont libérés dans ependorf 14. On notera que la couche sacrificielle 3 peut être dissoute de manière totale (comme dans la figure ID) ou partielle. En effet, comme les éléments biologiques sont adsorbés à la surface de la couche sacrificielle, celle-ci n'a pas besoin d'être entièrement détruite (ici, dissoute) pour remettre en solution les éléments fixés sur sa surface.
Pour mettre en évidence les avantages de la présence de cette couche sacrificielle, on dose les quantités d'éléments chimiques obtenus lorsqu'ils sont prélevés avec un dispositif de transfert ayant des micropipettes avec et sans couche sacrificielle. Pour doser les éléments contenus dans le liquide recueilli, on peut utiliser un spectrophotomètre UV. La longueur d'onde de fonctionnement du spectrophotomètre est choisie selon la nature des éléments biologiques que l'on souhaite doser.
Dans le cas présent, on règle le spectrophotomètre à 260 nm car l'on veut doser des oligonucléotides qui adsorbent à cette longueur d'onde. Les mesures ont été effectuées en double exemplaires afin de déceler une éventuelle erreur de mesure. Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau 1 suivant :
Tableau 1
Figure imgf000016_0001
On constate grâce à ces résultats qu'environ 40% d' oligonucléotides supplémentaires sont remis en solution lorsqu'on utilise un dispositif dont les capillaires comportent une couche sacrificielle. L'invention consiste à utiliser une couche intermédiaire entre la paroi de la micropipette et la solution à prélever. Après évaporation partielle ou totale du liquide prélevé, les éléments biologiques ou biochimiques contenus dans le liquide prélevé vont s'adsorber sur cette couche intermédiaire. Cette couche est ensuite dissoute dans une cuvette réceptrice. La dissolution de la couche va permettre de libérer en solution les éléments biologiques ou biochimiques qui se sont adsorbés sur la couche sacrificielle. D'après les résultats comparatifs obtenus, on peut conclure que la présence de la couche sacrificielle permet de limiter, voir d'annuler les interactions qui auraient lieu entre les éléments biologiques compris dans le liquide prélevé et les parois des capillaires s'il n'y avait pas de couche sacrificielle et de remettre en solution ces éléments biologiques.
Un autre exemple de réalisation et d'utilisation du dispositif de transfert est présenté ci-dessous. Dans cet exemple, le dispositif de transfert comporte des colonnes, appelées micro-tiges, de taille micrométrique, fabriqués en silicium et recouvertes d'une couche métallique dont l'épaisseur est comprises entre 100 nm et quelques micromètres. On peut, comme dans l'exemple précédent, réaliser entre plusieurs dizaines et plusieurs milliers de micro- tiges, ou bien avoir une densité de micro-tiges comprise entre 1000 et 30000 par cm2 de la plaque de silicium. Ici, la couche sacrificielle, dont l'épaisseur est comprises entre 100 nm et quelques micromètres, est déposée sur la surface externe des micro-tiges. Cette configuration particulière du dispositif de transfert ne permet pas de récupérer une quantité identique de liquide entre les différentes micro-tiges, mais elle permet de concentrer les espèces biologiques que l'on va fixer sur la couche sacrificielle. En effet, en utilisant un champ électrique, on va pouvoir attirer les éléments biologiques ou biochimiques chargés électriquement compris dans le liquide. Par exemple, les ADN, les ARN et les bactéries, qui possèdent des charges électriques non nulles, vont être attirés sur les micro-tiges du dispositif par application d'un champs électrique.
On va à présent réaliser des mesures sur un dispositif de transfert comportant des micro-tiges métallisées recouvertes d'un gel d'agarose.
Le dispositif de transfert comprend par exemple des micro-tiges fabriquées à partir d'un substrat de silicium et recouvertes d'une couche de platine. Le dispositif peut être obtenu par gravure des micro-tiges dans une plaque de silicium, par exemple par gravure plasma. Puis, les micro-tiges sont métallisées par pulvérisation ou évaporation d'une cible métallique.
On dépose sur les micro-tiges métalliques une couche de gel d'agarose à 1% pour réaliser la couche sacrificielle. Cette couche peut être obtenue par trempage dans une solution contenant 1% d'agarose. L'épaisseur de la couche varie entre 0,1 micromètre et quelques micromètres.
Une fois recouvertes d'une couche sacrificielle 23 (film d'agarose), les micro-tiges 21 (constituées d'un cœur 22 en silicium recouvert d'une couche métallique 24) sont plongées dans une solution 26 contenant des oligonucléotides 25 à la concentration de 40 μM. On applique un champ électrique entre une électrode (non représentée) plongée dans la solution 26 contenant les oligonucléotides 25 et chaque micro-tige 21 recouverte du gel d'agarose 23 (figure 2A) . Les oligonucléotides 25 sont attirés vers les micro-tiges 21 et s'adsorbent sur la couche sacrificielle 23 (figure 2B) . Enfin, les micro-tiges 21 du dispositif de transfert sont plongées dans un ependorf 14 rempli de 50 μL d'eau chaude 36 (figure 2C) .
On précise que dans les deux exemples cités, les micro-cuvettes ont été remplacées par des ependorfs afin de faciliter les expériences. Dans le cadre général du brevet, on pourra utiliser des micro¬ cuvettes à la place des ependorfs pour pouvoir récupérer des éléments contenus dans des micro-cuvettes distinctes . Dans la figure 2D, l' ependorf contient la solution 37 qui comprend notamment l'eau chaude 36 et les oligonucléotides 25. Cette solution 37 peut ensuite être dosée au spectrophotomètre UV. Le spectrophotomètre est réglé pour émettre une longueur d'onde à 260 nm car les éléments que l'on souhaite doser (les oligonucléotides) adsorbent à cette longueur d' onde.
Les résultats de ces mesures, réalisées en double exemplaires, sont présentés dans le tableau 2 suivant :
Tableau 2
Figure imgf000020_0001
On constate grâce à ces résultats que l'absorbance mesurée est plus élevée quand les micro- tiges sont munies d'une couche sacrificielle. Le fait de mettre un gel d' agarose sur la surface des micro¬ tiges permet donc de remettre plus d' oligonucléotides en solution.
BIBLIOGRAPHIE
[1] Brevet FR 2 823 999, « Dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques et utilisations ».
[2] Demande US 2002/0006359 Al, « Microplate sample and reagent loading System ».
[3] Brevet GB 2 353 093, « Liquid sample handling or transfering device ».

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de transfert de micro¬ quantités de liquide, comprenant au moins un élément de prélèvement et de transfert (1, 21) d'une micro¬ quantité de liquide (6, 26), des moyens étant prévus pour éliminer, après le transfert du liquide, des résidus (5, 25) laissés par le liquide sur une surface (2, 24) dudit élément, caractérisé en ce que lesdits moyens sont constitués d'une couche sacrificielle (3, 23) formée sur ladite surface (2, 24) et destinée à être au moins partiellement éliminée sous l'action d'au moins un moyen (16, 36) permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie desdits résidus (5, 25) laissés par le liquide.
2. Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élément de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide est une micropipette (1) .
3. Dispositif de transfert selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élément de prélèvement et de transfert d'une micro-quantité de liquide est une micro-tige (21) pleine (22) recouverte d'une couche métallique (24) .
4. Dispositif de transfert selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche sacrificielle (3, 23) est en un matériau soluble.
5. Dispositif de transfert selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le matériau soluble est choisi parmi le sucre, le gel d'agarose, un polymère, une résine ou le PVA.
6. Dispositif de transfert selon la revendication 2, caractérisé en ce que la couche sacrificielle (3) est en un matériau décomposable par électrolyse.
7. Dispositif de transfert selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la couche sacrificielle (3) est en un matériau métallique.
8. Dispositif de transfert selon l'une quelconque des revendications 1, 4 ou 5, caractérisé en ce que le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide est un solvant choisi parmi de l'eau, de l'eau chaude ou une solution contenant de l'alcool.
9. Dispositif de transfert selon l'une quelconque des revendications 1, 6 ou 7, caractérisé en ce que le moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide est une électrolyse.
10. Procédé de prélèvement de micro- quantités de liquide à l'aide du dispositif de l'
transfert selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- aspiration des micro-quantités de liquide dans la au moins une micropipette (1) , - séchage du dispositif pour provoquer évaporation desdites micro-quantités de liquide prélevées sous forme de résidus.
11. Procédé de prélèvement de micro- quantités de liquide (26) à l'aide du dispositif de transfert selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- plonger les micro-tiges (21) du dispositif dans le liquide à transférer, - appliquer un champ électrique entre une électrode plongée dans le liquide (26) à transférer et chaque micro-tige (21) pour attirer des résidus chargés présents dans le liquide (26) .
12. Procédé de décharge des résidus adsorbés sur la couche sacrificielle (3, 23) du dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - plonger les éléments de prélèvement et de transfert
(1, 21) d'une micro-quantité de liquide (6, 26) dans un solvant (16, 36) et éliminer au moins une partie de la couche sacrificielle (3, 23) à l'aide d'au moins un moyen permettant de restituer ou de récupérer au moins une partie des résidus laissés par le liquide, - récupérer la solution (17, 37) comprenant le solvant (16, 36) et les résidus (5, 25) désabsorbés.
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