DE60120840T2

DE60120840T2 - Impfstoffe basierend auf Mutanten des Virus der infektiösen Bursitis

Info

Publication number: DE60120840T2
Application number: DE60120840T
Authority: DE
Inventors: Adriaan Antonius Wilhelmus Maria Loon; Egbert Mundt
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2021-07-03
Also published as: MXPA01006919A; HUP0102823A3; HUP0102823A2; AU780878B2; BR0102776A; AU5419601A; JP2002095485A; CN1257973C; KR100759769B1; CA2351010C; DE60120840D1; US20020064532A1; PL199159B1; US6485940B2; CA2351010A1; CN1366041A; HU225488B1; KR20020013387A; HU0102823D0; ATE330969T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff umfassend eine IBDV Mutante mit Nukleotidsequenzen die eine Variante E VP2 Protein im Segment A des viralen Genoms kodieren und die fähig ist, Hühnerembryofibroblastgewebskulturen (CEF-Gewebskulturen) zu infizieren und in diesen zu replizieren.
Die infektiöse Bursitis-Virusinfektion (IBDV) ist ein Element der Bimaviridae Familie. Viren in dieser Familie haben eine sehr ähnliche genomische Organisation und einen sehr ähnlichen Replizierungszyklus. Die Genome dieser Viren bestehen aus 2 Segmenten (A und B) aus doppelsträngiger (ds) RNS. Das grössere Segment A kodiert ein Polyprotein, welches durch Autoproteolysis abgespalten ist, um reife virale Proteine VP2, VP3 und VP4 zu bilden. VP2 und VP3 sind die hauptsächlichen Strukturproteine des Virions. VP2 ist das hauptsächliche Host-schützende Immunogen der Birnaviren, und enthält die antigenen Bereiche, die für die Induktion von neutralisierenden Antikörpern verantwortlich sind. Das VP4 Protein ist die Virus-kodierte Protease, die in der Verarbeitung eines Precursor-Polyproteins der VP2, VP3 und VP4 Proteine involviert ist. Das grössere Segment A besitzt auch einen zweiten offenen Leserahmen (ORF), dem Polyproteingen vorausgehend und es teilweise überlappend. Dieser zweite offene Leserahmen kodiert ein Protein VP5 von unbekannter Funktion, welches in IBDV infizierten Zellen vorliegt. Das kleinere Segment B kodiert VP1, ein 90 kDa multifunktionales Protein mit Polymerase und Capping-Enzym-Aktivitäten.
Für IBDV existieren zwei Serotypen, Serotype 1 und 2. Die zwei Serotypen können durch Virusneutralisations-(VN)-Tests unter schieden werden. Weiterhin sind Untertypen von Serotype 1 isoliert worden. Diese sogenannten "Varianten"-Viren von Serotype 1 können durch Kreuzneutralisationstests, einem Panel von monoklonalen Antikörpern oder RT-PCR nachgewiesen werden. Diese Untertypen von Serotype 1 von IBDV sind auch in der Literatur beschrieben worden, beispielsweise: klassische, Variante-E, GLS, RS593 und DS326 Stämme (Van Loon, et al. Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauschholzhausen, Deutschland, 179-187, 1994).
Infektiöse Bursitis (IBD), auch Gumboro-Krankheit genannt, ist eine akute, hoch ansteckende virale Infektion in Hühnern, wobei es das lymphoide Gewebe als Hauptziel mit einem selektiven Tropismus für Zellen der Bursa Fabricius aufweist. Die Krankheitsrate in empfänglichen Herden ist hoch, mit rapidem Gewichtsverlust und moderaten Mortalitätsraten. Hühner, die die Krankheit überleben, können Immundefizite haben, weil die Bursa Fabricius zerstört ist, die für die Verteidigungsmechanismen der Hühner wesentlich ist. Der IBD-Virus bewirkt schwere Immununterdrückung in Hühnern, die jünger als 3 Wochen sind, und bursale Läsionen in Hühnern von bis zu 3 Monaten Alter.
Über viele Jahre konnte die Krankheit durch Induktion von hohen Level von Antikörpern in Zuchtherden durch Anwendung von einem inaktivierten Impfstoff unterdrückt werden, für Hühner, die mit gedämpft lebenden IBDV Impfstoff geprimt worden sind. Dies hat ökonomische Verluste, die durch IBD verursacht worden sind, auf einem Minimum gehalten. Mütterliche Antikörper in Hühnern, die von geimpften Zuchthühnern abgeleitet worden sind, verhindern frühe Infektionen mit IBDV und vermindern Probleme, die mit der Immununterdrückung verbunden sind. Zusätzlich sind gedämpft lebende Impfstoffe schon bei kommerziellen Hühnerherden erfolg reich angewandt worden, nachdem die mütterlichen Antikörper abgenommen haben.
Kürzlich haben sehr virulente Stämme von IBDV zu einem Ausbrechen der Krankheit mit hoher Mortalität in Europa geführt. Die laufenden Impfprogramme haben versagt, Hühner in ausreichender Weise zu schützen. Impfversagen sind hauptsächlich der Unfähigkeit von lebenden Impfstoffen zuzuschreiben, Vögel vor einer Challenge-Infektion mit virulenten Feldviren zu infizieren.
Ein weiterer Grund für das Auftreten von einer akuter Krankheit in geimpften Herden ist das Ausbrechen von antigenen Varianten in der Mitte der 1980er Jahre, insbesondere in den USA. Die wichtigsten neuen antigenen Untertypen von Serotype 1 IBDVs waren die Delaware Variante E und GLS Stämme. Bis dann sind eingesetzte Impfstoffe auf lebend gedämpften oder getöteten IBDV Stämmen ausschliesslich des klassischen Typs basiert gewesen. Trotz der Tatsache, dass klassische IBDV Impfstoffstämme einen gewissen Grad an Kreuzschutz gegen die Infektion von Hühnern durch andere Untertypestämme (und vice-versa) induzieren, sind wesentliche ökonomische Verluste als ein Ergebnis der Impfung mit Impfstoffen, basierend auf nur einem der Untertypviren aufgetreten.
Als ein Ergebnis dieser Entwicklungen im Feld ist es notwendig geworden, sowohl klassische als auch Varianten IBDV Untertypen Impfstoff Stämme in den IBDV Impfstoff aufzunehmen, um einen Breitbandschutz zu erreichen.
Wie oben beschrieben werden sowohl lebende als auch abgetötete Impfstoffe, die auf klassischen Stämmen basieren, allgemein im Feld verwendet. Die getöteten klassischen Impfstoffs werden allgemein durch Injektion verabreicht, wohingegen die lebenden klassischen Impfstoffe durch Injektion oder durch eine der kostengünstigen Anwendungstechniken verabreicht werden, wie Spray-, Aerosol und Trinkwasser-Impfung.
Die Delaware Variante E Viren, die bis jetzt identifiziert worden sind, sind hoch virulent und können nur als ein inaktivierter Impfstoff verabreicht werden. Bis jetzt hat es nur einen erfolgreichen Versuch gegeben, einen Variante E Stamm in Zellkulturen zu adaptieren und zu dämpfen. Dieser Impfstoff-Stamm, der als 89/03 bezeichnet wird, ist fähig, einen Schutz gegen eine Variante E Infektion zu induzieren, aber hat den Nachteil, dass es nicht wirkt, falls es durch eine der Massenanwendungswege verabreicht wird. Dieser Impfstoff-Virus benötigt eine Verabreichung durch Injektion, subkutan oder intramuskulär (Hein et al., Proceedings of the 43th Western poultry disease conference, Seiten 102-103, 1994, Sacramento, USA).
Um Vögel gegen eine Infektion durch IBDV des GLS Untertyps zu schützen, sind nur inaktivierte Impfstoffe verfügbar.
Mundt (J. Gen. Virology 80, 2067-2076, 1999) hat die strukturellen Anforderungen auf molekularem Niveau identifiziert, was es den IBDV Stämmen erlaubt, die nur fähig waren, in vivo die Bursa Fabricius zu infizieren und in dieser zu replizieren, nun auch Hühnerembryofibroblast (CEF) Gewebekulturen zu infizieren und in diesen zu replizieren. Zwei Aminosäureaustausche in dem VP2 Protein an den Positionen 253 (Gln zu His) und 284 (Ala zu Thr) wären notwendig und ausreichend für die Fähigkeit von IBDV Bursitisstämmen (BU), um CEF und andere Gewebekulturen zu infizieren. Insbesondere sind zwei chimerische D78/Variante E IBDV Mutanten mit einer Gewebekultur (TC) Phenotype in diesem Dokument beschrieben.
Im Hinblick auf diesen Stand der Technik besteht ein Bedürfnis für einen lebend gedämpften Delaware Variante E IBDV Impfstoff, der effektiv ist, falls er über eine Massenanwendungsroute verabreicht worden ist. Weiterhin besteht ein Bedürfnis nach einem ein breites Spektrum aufweisenden IBDV Impfstoff Stamm, der einen adäquaten Schutz gegen IBDV Stämme von zwei oder mehreren Untertypen bildet. Solch ein breitbandiger Impfstoff verhindert, dass getrennte Impfstoffviren für jede der IBDV Untertypen herzustellen und in einen Kombinationsimpfstoff zu formulieren sind.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff umfassend eine IBDV Mutante anzugeben, der fähig ist, eine Schutzimmunität in Hühnern gegen virulente Stämme von mindestens zwei IBDV Untertypen zu induzieren. Es ist ein weiteres Ziel, einen Impfstoff umfassend eine IBDV Mutante anzugeben, der Schutz gegen die virulente IBDV Variante E Stämme liefert und der zur selben Zeit über eine Massenanwendungstechnik verabreicht werden kann, die üblicherweise für eine lebende IBDV Impfung eingesetzt wird.
Es ist herausgefunden worden, dass diese Ziele erfüllt werden durch einen Impfstoff umfassend eine IBDV Mutante mit Nukleotidsequenzen, die eine Variante E VP2 Protein im Segment A des viralen Genoms kodieren und der fähig ist, CEF Gewebekulturen zu infizieren und in diesen zu replizieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante eine oder mehrere Mutationen in dem Variante E VP2 Kodierbereich umfassen, so dass

(i) das Codon für die Aminosäure an der Position 254 Glycin kodiert, und/oder
(ii) das Codon für die Aminosäure an der Position 270 Threonin kodiert.

Es ist durch die hiesigen Erfinder gezeigt worden, dass die chimerische IBDV D78/Variante E Bursitis (BU) Mutante, die in Mundt et al. (1999, supra) offenbart ist, die Kultur (BU) und Immunogenizitäts-Charakteristika von einem Variante E Stamm zeigt, virulent ist und vollständige Lymphozyten-Depletion nach Verabreichung an Hühner induziert. Weiterhin ist in Beispiel 2 gezeigt worden, dass die entsprechende Gewebekultur (TC) Mutante von diesem Stamm weniger virulent ist und fähig ist, eine partielle Schutzimmunantwort zu induzieren, falls sie durch Injektion verabreicht worden ist. Dennoch induziert zur selben Zeit die TC Mutante nur einen geringen Schutz gegen einen Challenge, falls diese Mutante über den Okularen Weg verabreicht worden ist (ein Weg, der ein Modell für die Trinkwasser Verabreichung ist). Erstaunlicherweise haben die Erfinder identifiziert, dass weitere Mutationen in den natürlich auftretenden Codonen für Aminosäuren 254(Ser) und/oder 270(Ala) in dem VP2 Gen der Variante E Viren, die in Codonen resultieren, die die Aminosäure 254(Gly) und/oder 270(Thr) kodieren, eine lebend gedämpfte IBDV Mutante liefern:

(i) die fähig ist, Virus neutralisierende (VN) Antikörper Titer gegen klassische und Variante E Untertyp IBDV Stämme von ungefähr dem gleichen Niveau zu induzieren,
(ii) die fähig ist, Schutz in geimpften Tieren gegen einen Challenge mit virulenten klassischen und Variante E Untertyp IBDV Stämmen zu induzieren,
(iii) die fähig ist, Schutz zu induzieren, falls es über einen Massenanwendungsweg verabreicht worden ist.

Die IBDV Untertypen sind im Stand der Technik gut definiert, beispielsweise durch das Mittel von ihrem Reaktionsmuster mit monoklonalen Antikörpern. Ein IBDV des Variante E Untertyps reagiert spezifisch mit dem Virus neutralisierenden Moab (monoklonalen Antikörper) 67, der bei der ATCC durch Dave Snyder am 14. September 1992 unter der Eingangsnummer Nr. HB 11122 (siehe auch, Vakharia et al., Virus Research 31, 265-273, 1994) hinterlegt worden ist.
Die Mutationen, die in einer IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung resultieren, werden in den Kodierbereich für das Variante E VP2 Protein an den Codonen für Aminosäure 254(Ser) und/oder 270 (Ala) eingeführt.
Eine vorteilhafte IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung umfasst die gewünschten Mutationen in beiden Codonen oder in dem Codon für die Aminosäure 254.
Der Austausch von Nukleotid 890 (A zu G) und 938 (G zu A) führt zu den Ersetzungen der Aminosäure 254 (Ser zu Gly) beziehungsweise 270 (Ala zu Thr). Wie oben beschrieben ist die genomische Organisation von IBD Viren gut etabliert: das IBDV Genom umfasst ein grosses Segment A und ein kleineres Segment B. Das Segment A von IBDV umfasst einen grossen offenen Leserahmen (ORF), der ein Polyprotein von ungefähr 110 kDa (VP2-VP4-VP3; 1) kodiert. Die vollständigen Nukleotidsequenzen von Segment A und Segment B von vielen IBDV Stämmen sind bestimmt worden. Weiterhin sind der Ort innerhalb des ORF, die Nukleotidsequenz, die die Variante E VP2 Protein kodiert, und die Aminosäurensequenz von dem Variante E VP2 Protein von Vakharia et al., Avian Diseases 36, 736-743, 1992; Vakharia et al., Virus Res. 31, 265-273, 1994; Heine et al., J. Gen. Virol. 22, 1835-1843, 1991 bestimmt worden. Zusätzlich sind die Nukleotidsequenz von dem DNS Fragment, welches die Variante E VP2 kodierende Sequenzen (Nukleotide 647-1725) umfasst, und den Aminosäurensequenzen 172-532 des Polyproteins entspricht, das zum Erzeugen einer IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung, wie in den Beispielen beschrieben, eingesetzt worden ist, in SEQ ID. Nr. 1 und 2 gezeigt.
Die hier eingesetzten Nummern, um auf die Aminosäurepositionen hinzuweisen, beziehen sich auf die Nummerierung der Aminosäuren in dem IBDV Polyprotein, wie es üblicherweise beim Stand der Technik eingesetzt wird. Die Nummern, die auf die Nukleotidpositionen hinweisen, basieren auf der vollständigen Nukleotidsequenz vom Segment A des IBDV Genoms, wie es durch Mundt und Müller (J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; NCBI Eingangsnummer Nr. X 84034) beschrieben worden ist.
Es ist in Mundt (1999, supra) gezeigt worden, dass die Vorbedingung für einen IBDV Stamm mit einem klassischen oder Variante E Phenotype, CEF Gewebekultur zu infizieren und in dieser zu replizieren, die Anwesenheit von Codonen ist, die Aminosäure 253 (His) und 284 (Thr) in dem VP2 Gen von den jeweiligen Stämmen kodieren. Daher umfasst insbesondere ein IBDV Stamm zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung, der die Eigenschaft hat, CEF Gewebekultur zu infizieren und in diesen replizieren, Aminosäure 253 (His) und 284 (Thr). Solch ein IBDV Stamm kann durch Verfahren erhalten werden, die in Mundt (1999, supra) beschrieben worden sind. Weiterhin ist ein solches Verfahren auch in Beispiel 1 beschrieben.
Als ein Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes bestehen verschiedene Möglichkeiten für die Codonen, die die Aminosäuren 254(Gly) und 270(Thr) von dem Polyprotein einer IBDV Mutante gemäss der Erfindung kodieren. Das Codon in dem VP2 Kodierbereich für Aminosäure 254(Gly) kann GGA, GGC, GGG oder GGT sein, wobei GGC bevorzugt ist, wohingegen das Codon für Aminosäure 270(Thr) ACT, ACC, ACA oder ACG sein kann, wobei ACG besonders bevorzugt ist.
Die Variante E IBDV Stämme mit der Eigenschaft (i) CEF Gewebekultur zu infizieren und in diesen zu replizieren und (ii) eine ein breites Spektrum umfassende Immunantwort bei Verabreichung über einen Massenanwendungsweg zu induzieren, können durch Einfügen der spezifischen relevanten Codonen, die oben erwähnt worden sind, in einem natürlich auftretenden Variante E Stamm hergestellt werden.
Alternativ kann dieses Ergebnis auch erhalten werden durch Austausch von Teilen des Variante E VP2 Kodierbereichs durch einen entsprechenden Teil der genomischen Sequenz eines bekannten (klassischen) IBDV Stamms, der bereits die gewünschten Codonen an den relevanten Positionen enthält. Volle Längen an genomischen Sequenzen von klassischen Stämmen sind in den US Patenten US 5,871,744 (Vakharia und Mundt) und der EP-Patentanmeldung Nr. 98201704.8 (Akzo Nobel NV) beschrieben worden.
Insbesondere ist eine IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung geliefert worden, die einen Teil der VP2 kodierenden Sequenz des klassischen Stammes D78, der ein VP2 Protein Fragment kodiert, umfasst, die Aminosäurepositionen 253-284 umfasst und die gewünschten Codonen aufweist wie oben beschrieben.
Eine bevorzugte IBDV Mutante zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung umfasst einen Teil des D78 VP2 Kodierbereichs umfassend die Nukleotidposition 884-985 mit einer Nukleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist. Dieses Nukleotidfragment ersetzt das entsprechende Fragment des Variante E VP2 Kodierbereichs und kodiert unter anderem die folgenden Aminosäuren: 253 (His), 254 (Gly), 270 (Thr) und 284 (Thr) (SEQ ID Nr. 4).
Eine IBDV Mutante zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung kann das genetische Rückgrat des Segments A eines Variante E IBDV Stammes umfassen, umfassend einen mutierten VP2 Kodierbereich wie oben beschrieben. Dennoch kann eine IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung auch auf dem genetischen Rückgrat eines anderen IBDV Stammes beruhen, wie einem klassischen oder GLS Stamm, einem klassischen Stamm, insbesondere auf dem Stamm D78, der bevorzugt ist.
Bei solch einer "chimerischen" IBDV Mutante sind VP2 kodierende Sequenzen auf dem genetischen Rückgrat des Segmentes A eines ersten Typs des IBDV Stammes durch die entsprechenden relevanten Variante E VP2 kodierenden Sequenzen ersetzt, die zusätzlich die gewünschten Mutationen umfassen, die für die vorteilhaften Eigenschaften der neuen IBDV Mutante verantwortlich sind.
Die VP2 kodierenden Sequenzen, die eine Variante E VP2 Protein kodieren, können die (mutierte) genetische Information kodierend das vollständige Variante E VP2 Protein (Nukleotidpositionen 131-1666) umfassen oder können ein Fragment davon umfassen, das ein VP2 Protein kodiert, das fähig ist, Variante E Virus neutralisierende Antikörper zu induzieren. Im letzteren Fall können die Variante E VP2 kodierenden Sequenzen mit VP2 kodierenden Sequenzen von einem anderen IBDV Untertyp komplementiert werden, so dass solch eine IBDV Mutante ein vollständiges VP2 Protein exprimiert.
Insbesondere kann solch eine IBDV Mutante mindestens ein (mutiertes) Variante E VP2 kodierendes Fragment umfassen, das den so genannten veränderlichen Bereich des VP2 Gens abdeckt. Bayliss et al. (J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1990) haben bestimmt, dass dieser Bereich innerhalb der Nukleotidpositionen 745-1182 lokalisiert ist.
Vorzugsweise umfasst die IBDV Mutante die Variante E VP2 kodierenden Sequenzen, umfassend die Nukleotide 647-1666, umfassend die gewünschten oben beschriebenen Mutationen.
Die Erzeugung der (chimerischen) IBDV Mutanten kann erreicht werden durch Mittel des kürzlich hergestellten infektiösen cRNS Systems für IBDV (Mundt und Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996). Dieses reverse Genetiksystem eröffnet die Möglichkeit, Mutationen in das RNS Genom der IBDV einzuführen. Der wichtigste Schritt in diesem reversen Genetiksystem ist es, cDNS Klone mit voller Länge von den Segmenten A und B des IBD Virus zu erzeugen, umfassend die Nukleotide der 5'- und 3'-Enden von beiden diesen Segmenten. Nach den Klonierungsverfahren sind die Sequenzen voller Länge von Segment A und B in operativer Weise mit einem Promoter verbunden, der fähig ist, eine DNS abhängige RNS Polymerase zu binden, wie die T7, SP6 oder T3 Polymerase, wobei der T7 Promoter bevorzugt ist. Die DNS abhängige Polymerase ist fähig, virale cRNS von cDNS Klonen voller Länge von Segment A beziehungsweise B zu beschreiben. Diese cRNS ist fähig, die Replikation des Virus und die Isolierung von viablen Viren zu induzieren. Dieses Verfahren kann mit jeder natürlich auftretenden IBDV durchgeführt werden.
Reverse Genetiksystems sind für verschiedene IBDV Stämme beschrieben, wie D78 (Yao et al., J. Virol. 72, 2647-2657, 1998), Stamm HK46 (Lim et al., J. Virol. 73, 2854-2862, 1999) und CEF 94 (Boot et al., Virology 265, 330-341, 1999).
Das Segment B einer IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung kann von jedem anderen IBDV Stamm abgeleitet werden, bevorzugterweise von einem klassischen IBDV Stamm, insbesondere von einem Stamm D78 oder P2 (US Patent US 5,871,744 und EP-Patentanmeldung Nr. 98201704.8).
Die IBDV Mutanten, wie oben beschrieben, umfassen Segment B von Stamm P2 und zeigen insbesondere vorteilhafte gedämpfte und Schutzeigenschaften, speziell eine Mutante mit Amino 254(Gly) oder 254 (Gly)/270 (Thr).
Die gewünschten Mutationen können in das IBDV Genom eingeführt werden durch das Mittel von verfahren, die allgemein im Stand der Technik zu diesem Zweck beschrieben sind. Insbesondere werden die Mutation(en) durch Mittel von Ort-gesteuerten Mutagenesis-Effekten eingeführt. Verfahren für das Einführen einer Mutation in dem IBDV Genom sind hier beschrieben, aber sie werden auch allgemein im Stand der Technik eingesetzt (Mundt und Vakharia, 1996, supra; Yao et al., J. Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt et al., 1999, supra; EP Patentanmeldung Nr. 98201704.8; "Current Protocols in Molecular Biology", eds.: F. M. Ausubel et al., Wiley N.Y., 1995 Edition, Seiten 8.5.1.-8.5.9. und Kunkel et al. in Methods in Enzymology vol. 154, 376-382, 1987).
Wie in den Beispielen gezeigt, zeigt eine IBDV Mutante zum Einsatz in der Erfindung sehr vorteilhafte Eigenschaften, die zu einem neuen Typ von IBDV Impfstoff führen können. Daher ist diese Erfindung ein Impfstoff zum Einsatz beim Schutz von Geflügel gegen Krankheiten, die von einer IBDV Infektion herrühren. Der Impfstoff umfasst eine IBDV Mutante, wie oben beschrieben, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner.
Die IBDV Mutante kann in einem Impfstoff als lebend gedämpfter oder inaktivierter Virus eingebracht werden, jedoch ist die lebende Form bevorzugt, weil dies den Einsatz von allen vorteilhaften Eigenschaften der IBDV Mutanten der vorliegenden Erfindung gestattet.
Ein Impfstoff gemäss der Erfindung kann hergestellt werden durch konventionelle Verfahren wie die, die beispielsweise üblicher weise genutzt werden für die kommerziell verfügbaren lebenden und inaktivierten IBDV Impfstoffe. Kurz gesagt ist ein empfängliches Substrat mit einer IBDV Mutante gemäss der Erfindung inokuliert und propagiert werden, bis der Virus zu einem gewünschten infektiösen Titer repliziert hat, wonach das IBDV enthaltende Material geerntet wird.
Jedes Substrat, welches fähig ist, die Replikation von IBDV Mutanten zu unterstützen, kann eingesetzt werden, um den Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung herzustellen, umfassend die primären (aviären) Zellkulturen, wie Hühnerembryofibroblast-Zellen (CEF) oder Hühnerembryoleber-Zellen (CEL), Säugetierzelllinien wie die VERO Zelllinie oder die BGM-70 Zelllinie, oder aviäre Zelllinien wie QT-35, QM-7 oder LMH. Üblicherweise nach der Inokulation von den Zellen, wird der Virus für 3-10 Tage propagiert, wonach das Zellkultur Supernatant geerntet wird, und falls gewünscht gefiltert oder zentrifugiert, um Zellenreste zu entfernen.
Alternativ wird die IBDV Mutante in embryonierten Hühnereiern propagiert. Insbesondere ist das Substrat, auf dem diese IBDVs propagiert werden, SPF embryonierte Eier. Embryonierte Eier können beispielsweise mit 0.2 ml IBDV Mutante inokuliert werden, welche Suspension oder Homogenat enthält, das mindestens 10² TCID₅₀ je Ei umfasst, und nachfolgend bei 37° Celsius inkubiert worden ist. Nach ungefähr 2-5 Tagen kann das IBD Virusprodukt geerntet werden durch Einsammeln des Embryos und/oder der Membranen und/oder der Allantoisflüssigkeit, die von geeignetem Homogenisieren von diesem Material gefolgt wird. Das Homogenat kann danach für 10 Minuten bei 2500 × g zentrifugiert werden, gefolgt von einer Filterung des Supernatants durch einen Filter (100 Mikrometer).
Der Impfstoff gemäss der Erfindung, der den lebenden Virus enthält, kann in der Form einer Suspension oder in einer lyophilisierten Form hergestellt und vermarktet werden, und enthält zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner, welche für solche Kompositionen üblich sind. Träger umfassen Stabilisierer, Konservierungsmittel und Puffer. Geeignete Stabilisierer sind beispielsweise SPGA, Kohlenhydrate (wie Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sucrose, Dextran, Glutamat oder Glukose), Proteine (solche wie getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Zersetzungsprodukte davon. Geeignete Puffer sind beispielsweise Alkalimetallphosphate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamicin. Verdünner umfassen Wasser, wässrige Puffer (wie gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole (wie Glyzerol).
Falls erwünscht können die lebenden Impfstoffe gemäss der Erfindung ein Adjuvans enthalten. Beispiele von geeigneten Verbindungen und Kompositionen mit Adjuvans-Aktivität sind dieselben wie unten beschrieben.
Obwohl die Verabreichung durch Injektion, beispielsweise intramuskulär, subkutan oder in ovo des lebenden Impfstoffs gemäss der vorliegenden Erfindung möglich ist, wird der Impfstoff vorzugsweise durch eine kostengünstige Massenanwendungsweg verabreicht, der für eine IBDV Impfung üblicherweise eingesetzt wird. Für die IBDV Impfung umfasst dieser Weg die Trinkwasser, Spray- und Aerosol-Impfung.
Zur Verabreichung über den Trinkwasserweg ist es üblich, die Tiere für ungefähr 2 bis 4 Stunden vom Zugang zu Wasser abzuschneiden, bevor ihnen den Impfstoff enthaltendes Wasser vorgesetzt wird, und es ist wesentlich, dass genug Trinkraum für alle Vögel vorhanden ist, dass sie alle gleichviel trinken können.
Der Impfstoff wird in frischem Trinkwasser mit einer Konzentration angewandt, die so berechnet ist, dass jeder Vogel eine ausreichende Dosis erhält.
Um zu verhindern, dass eine wesentliche Verminderung des viablen Impfstoffvirus durch das Vorliegen von geringen Mengen von Chlor-, Eisen-, Zink- oder Kupfer-Ionen im Trinkwasser auftritt, wird vorzugsweise ein Schutzstoff wie entrahmte Milchpulver) zu dem den Impfstoff enthaltenden Wasser hinzugefügt.
Das Sprayverfahren, umfassend die gewöhnliche Spray- und Aerosol-Verabreichung, umfasst die Verabreichung von dem lebenden IBDV Impfstoff, der in kleinen Flüssigkeitspartikeln eingebunden ist. In dem gewöhnlichen Sprayverfahren haben Partikel üblicherweise eine ursprüngliche Tropfengrösse von 10 bis 100 Mikron und bei dem Aerosol-Verabreichungs-Verfahren liegt die Tröpfchengrösse üblicherweise zwischen < 1 und 50 Mikron.
Um die Inaktivierung des lebenden Impfstoff-Virus zu verhindern, weil erhöhte Konzentrationen von aufgelösten Salzen als ein Ergebnis der Austrocknung der (Trink)Wasserteilchen auftreten, können kleine Mengen eines Proteinschutzes, so wie entrahmte Milch, entrahmtes Milchpulver oder Gelatine der wässrigen Phase hinzugefügt werden.
Für die Erzeugung von kleinen Partikeln können konventionelle Spray-Apparate und Aerosol-Erzeuger eingesetzt werden, wie die kommerziell erhältlichen Sprayerzeuger für Tornister-Spray, Brutplatzspray und Sprühnebelspray. Die Trinkwasserimpfung kann auch durch konventionelle Apparate ausgeführt werden. Details, die konventionelle Spray/Aerosol- und Trinkwasser-Impfungen betreffen, können in dem "Compendium, Verabreichung von Geflügel-Impfstoffen" nachgelesen werden, welches von dem Gezond heidsdienst voor Pluimvee, Doorn, Die Niederlande, van Eck et al., VI-VII, 1988 herausgegeben worden ist.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann die IBDV Mutante in einer inaktivierten Form aufweisen. Der Hauptvorteil von einem inaktivierten Impfstoff ist das hohe Niveau von Schutzantikörpern von langer Dauer, was erreicht werden kann gegen sowohl die klassische als auch die Variante E der IBDV Stämme.
Das Ziel der Inaktivierung der Viren, die nach dem Propagationsschritt geerntet worden sind, ist es, die Reproduktion der Viren zu eliminieren. Allgemein kann dies erreicht werden durch chemische oder physikalische Mittel, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Ein Impfstoff, der die inaktivierte IBDV Mutante umfasst, kann beispielsweise einen oder mehrere der oben erwähnten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner aufweisen, die zu diesem Zweck geeignet sind.
Vorzugsweise umfasst ein inaktivierter Impfstoff gemäss der Erfindung eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvans-Aktivität. Geeignete Verbindungen oder Kompositionen zu diesem Zweck umfassen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl Emulsion basierend auf, beispielsweise einem Mineralöl, so wie Bayol F^® oder Marcol 52^® oder einem Pflanzeöl so wie ein Vitamin E Azetat, und Saponin.
Der Impfstoff gemäss der Erfindung umfasst eine effektive Dosis der IBDV Mutante als aktive Komponente, das heisst eine Menge von immunisierendem IBDV Material, so dass Immunität in den geimpften Vögeln gegen einen Challenge durch einen virulenten Virus induziert wird. Immunität ist hier so definiert, dass die Induktion von einem signifikant höheren Niveau an Schutz in einer Population von Vögeln nach der Impfung vorliegt, verglichen mit einer ungeimpften Gruppe.
Typischerweise kann der lebende Impfstoff gemäss der Erfindung in einer Dosis von 10²-10⁴ TCID₅₀ infektiöser Dosis₅₀ (TCID₅₀) je Tier verabreicht werden, vorzugsweise in einer Dosis, die zwischen 10^4.0-10^7.0 TCID₅₀ liegt. Inaktivierte Impfstoffe können die antigenen Äquivalente von 10⁵-10⁹ TCID₅₀ je Tier aufweisen.
Inaktivierte Impfstoffe werden üblicherweise parenteral, beispielsweise intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Obwohl der IBDV Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung in effektiver Weise bei Hühnern eingesetzt werden kann, können auch anderes Geflügel wie Truthähne, Perlhühner und Rebhühner in erfolgreicher Weise mit dem Impfstoff geimpft werden. Hühner umfassen Masthühner, Vermehrungsbestand und Legebestand.
Das Alter der Tiere, die einen lebenden oder inaktivierten Impfstoff gemäss der Erfindung erhält, ist dasselbe, wie das der Tiere, die die üblichen lebenden oder inaktivierten IBDV Impfstoffe erhalten. Beispielsweise können Hühner (frei von mütterlich abgeleiteten Antikörpern-MDA) im Alter von einem Tag oder in ovo geimpft werden, wohingegen Hühner mit hohen Niveaus an MDA vorzugsweise bei 2 bis 3 Wochen Alter geimpft werden. Legebestand oder Vermehrungsbestand mit geringem Niveau an MDA können im Alter von 1 bis 10 Tagen geimpft werden, gefolgt von einer Booster-Impfung mit inaktiviertem Impfstoff im Alter von 6 bis 12 und 16 bis 20 Wochen.
Kombinationsimpfstoffe mit, zusätzlich zu der oben beschriebenen IBDV Mutante, einem oder mehreren Immunogenen, die von anderen Pathogenen abgeleitet werden, die für Geflügel infektiös sind, werden auch betrachtet.
Vorzugsweise umfasst der Kombinationsimpfstoff zusätzlich einen oder mehrere Impfstoffstämme des „Mareks Disease Virus" (MDV), des infektiösen Bronchitisvirus (IBV), dem Virus der Newcastle Krankheit (NDV), dem sogenannten „Egg drop"-Syndrom (EDS) Virus, Puten Rhinotracheitis Virus (TRTV) oder Reovirus.
BEISPIELE
Beispiel 1 Erzeugung von einer breitbandigen klassische/Variante E IBDV Mutante
Material und Verfahren
Virus und Zellen.
Der Serotype I Stamm D78 (Intervet International BV, Boxmeer, Die Niederlande) wurde in Hühnerembryozellen (CEC) propagiert. CEC, das von embryonierten SPF Eiern abgeleitet worden ist, sind in Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM) versetzt mit 10 Prozent fötalem Kalbsserum (FCS) gewaschen und sind eingesetzt worden für die Propagierung von wiedergewonnenem Virus und Übergabe von Transfektionssupernatanten. Transfektionsexperimente und Immunofluoreszenzassays sind durchgeführt worden unter Einsatz von Wachtel-Muskelzellen (QM-7, ATCC) gewachsen in Medium 199 versetzt mit 10 % FCS.
Herstellung von einem cDNS Klon voller Länge von Segment B IBDV Stämmen.
Zum Klonen von cDNS voller Länge von Segment B vom Serotype I Stamm D78, ist das Virus in CEC propagiert worden und durch Ultrazentrifugierung gereinigt worden. Genomische virale RNS vom Stamm D78 ist gereinigt worden, revers in cDNS transkribiert worden, und durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) verstärkt worden, unter Einsatz von Standardverfahren mit Oligonukleotiden, wie dies in Mundt und Vakharia (1996, supra) beschrieben worden ist. Das Amplifikationsprodukt ist stumpf endend geklont worden und Plasmide mit geeigneten PCR Fragmenten sind sequenziert worden. Das Klonierungsverfahren, um ein Plasmid mit cDNS voller Länge von Segment B (pUC18BD78) unter Steuerung von dem T7- RNS Polymerase Promotor zu erhalten, entsprach dem Verfahren, das durch Mundt und Vakharia (1996, supra) für Segment B von Stamm P2 beschrieben worden ist.
Konstruktion von intergenerischen IBDV Plasmiden.
Zum Ersatz von IBDV spezifischen Sequenzen ist ein Plasmid eingesetzt worden, das den vollständigen Kodierbereich des Variante E Stammes E/Del umfasst (Vakharia, Biotechnology Annual Review 3, 151-168, 1997). pEDEL22BacII ist mit Restriktionsenzymen Nde I und Sal I, Nukleotide 647 beziehungsweise 1725 (SEQ ID Nr. 1) in Übereinstimmung mit der Sequenz voller Länge von Stamm P2 (NCBI Eingangsnummer Nr. X 84034) gespalten worden, um ein 1078 bp Fragment zu erhalten, welches die kodierenden Sequenzen von dem variablen Bereich von VP2 (Bayliss et al., 1990, supra) und Sequenzen von VP4 vom Stamm E/Del umfasst. Nach Ligation in Nde I- Sal I gespaltene pD78A/ΔNB (Mundt, 1999, supra) ist ein chimerisches Plasmid pD78A-E/Del voller Länge mit Sequenzen sowohl von Segment A vom Stamm D78 als auch E/Del etabliert worden (Mundt, 1999, supra). Plasmid pD78A-E/Del ist als Basis für die ortsgerichtete Mutagenesis eingesetzt worden.
Zu diesem Zweck ist pD78A-E/Del mit den Restriktionsenzymen Sac I und Sal I, Nukleotide 868 und 1725 gespalten worden, in Übereinstimmung mit der Sequenz voller Länge von Stamm P2, und geklont in einen entsprechend gespalteten Plasmidvektor pBS^– (Stratagene), um pBSD78-E/Del zu erhalten. Die ortsgerichtete Mutagenese-Experimente sind durchgeführt worden wie oben beschrieben (Kunkel et al., 1992, supra). Ortsgerichtete Mutagenese der Nukleotidsequenz (nt 941-985) ist erhalten worden unter Einsatz des Oligonukleotids D78-E/Delmut12-1 (Tabelle 1, SEQ ID Nr. 5) und Plasmid pBSD78-E/Del. Die interessierende Sequenz wurde gesteuert durch Sequenzieren und ein Plasmid, das die geänderte Sequenz umfasste, ist für ein zweites Mutagenese-Experiment eingesetzt worden. Zu diesem Zweck war die Sequenz des sich ergebenden Plasmids (pBSD78-E/Delmut1) durch Einsatz des Oligonukleotids D78-E/Delmut12-2 (Tabelle 1, SEQ ID Nr. 6) mutagenisiert worden. Die sich ergebenden Plasmide sind sequenziert worden und ein geeignetes Plasmid (pBSD78-E/Delmut12) wurde abgespalten mit Sac I und Spe I, Nukleotide 868 und 1181, in Übereinstimmung mit der Sequenz voller Länge von Stamm P2. Das erhaltene Fragment, das die mutagenisierte Sequenz enthält, wurde in das geeignete gespaltene pD78A-E/Del ligiert. Das sich ergebende Plasmid pD78A-E/Delmut12 wurde durch Sequenzieren gesteuert. Das Plasmid enthält ein ausgetauschtes Codon für die Aminosäuren 253, 254, 270, und 284. Hier ist das Codon für die Aminosäuren von der E/Del- Sequenz ersetzt worden mit solch einer D78-Sequenz (Q 253 H, S 254 G, A 270 T, A 284 T). Plasmide pD78A, pD78A -E/Del und pD78A -E/DelMut12 sind in der 1 dargestellt. Verfügbare Plasmide sind eingesetzt worden für die Konstruktion von weiteren intergenerischen Plasmiden. Zu diesem Zweck sind Plasmide pD78A -E/DelMut12 wie oben beschrieben und pD78A-E/Del-QH-AT (Mundt, 1999, supra) Nde I/Nar I abgespalten worden und DNS-Fragmente von jedem Plasmid sind eluiert worden. Das Nde I/Nar I Fragment von pD78A -E/DelMut12 wurde in das abgespaltene Nde I/Nar I Rückgrat von pD78A-E/Del-QH-AT fixiert, um pD78A – E/DelMut1 zu erhalten. Unter Einsatz dieser Strategie sind das folgende Codon für die Aminosäuren von der E/Del- Sequenz ersetzt worden mit solch einer D78-Sequenz (Q 253 H, S 254 G, A 284 T). Um ein Plasmid (pD78A -E/DelMut2) zu erhalten, wo das folgende Codon für die Aminosäuren von der E/Del- Sequenz mit der D78-Sequenz (Q 253 H, A 270 T, A 284 T) ersetzt worden sind, ist das Nde I/Nar I Fragment von pD78A-E/Del-QH-AT in das Nde I/Nar I Rückgrat von pD78A -E/DelMut12 ligiert. Karten der Plasmide pD78A -E/DelMut12, pD78A -E/DelMut1, pD78A -E/DelMut2, und pD78A -E/DelQH-AT sind in 2 dargestellt. Tabelle 1 Oligonukleotide zum Einsatz für die Herstellung von cDNS Klonen voller Länge des IBDV Segmentes A mit Aminosäuresubstitutionen*

* Komposition und Ort des Oligonukleotidprimers, eingesetzt für die ortsgerichtete Mutagenesis. Geänderte Nukleotide für die Mutagenesis sind klein gedruckt und die geänderten kodierenden Nukleotidtripletts sind fett gedruckt. Die Positionen, an denen die Primer (die Nukleotid-Nummer) binden und die Numerierung der Aminosäuren sind in Übereinstimmung mit der publizierten Sequenz des Stammes P2 (Mundt und Müller, 1995, supra).

Viruswiedergewinnung von cRNS in Gewebekultur.
Für eine in vitro Transkription von RNS von Plasmiden, die Segment A (pD78A -E/DelMut1, pD78A -E/DelMut2, pD78A -E/DelMut12) und pD78B enthalten, wurden durch Abspaltung mit entweder BsrGI oder Pst I linearisiert. Weitere Behandlung von linearisierter DNS und Transkription sind ausgeführt worden wie von Mundt & Vakharia (1996, supra) beschrieben, mit zwei Ausnahmen: i) die Transkriptionsmischungen sind nicht durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt worden, und ii) CEC wurden für Transfektions-Experimente, wie durch Mundt und Vakharia (1996, supra) beschrieben, eingesetzt. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Zellen gefroren/aufgetaut, zentrifugiert bei 700 × g, um zelluläre Reste zu eliminieren, und die sich ergebenden Supernatants sind weiter geklärt worden durch Filtration durch 0.45 Mikrometerfilter und gelagert bei –70° Celsius. Für Immunofluoreszenzstudien sind Zellen auf sterilen Küvettenhalter für Objektträger gewachsen worden. Mutanten, die Segment B von P2 enthalten, sind wie oben beschrieben hergestellt worden.
Feststellung von IBDV Antigen.
Das IBDV Antigen wurde durch indirektes Immunofluoreszenz-Assay (IFA) festgestellt. Supernatante von transfektierten CEC sind auf CEC passagiert worden. Für IFA sind CEC, die auf Küvettenhalter für Objektträger gewachsen wurden, mit Supernatanten inkubiert, die sich aus den passagierten Experimenten ergeben hatten. Nach 16 Stunden wurden die Zellen mit Azeton fixiert und für die IFA verarbeitet.
Ergebnisse
Transfektionsexperimente mit chimerischer cRNS.
Für die Transfektionsexperimente sind cDNS Klone voller Länge von chimerischen Segmenten A (pD78A – E/DelMut1, pD78A – E/DelMut2, pD78A -E/DelMut12) in synthetische cRNS transkribiert und mit Segment B (pD78B oder pP2B) cRNS voller Länge in CEC cotransfektiert worden. Zwei Tage nach der Transfektion sind Zellen gefroren/aufgetaut worden und die sich ergebenden Supernatants sind einmal auf CEC passagiert worden. Nach dem Frieren/Auftauen wurde die Transfektion und die passagierte Supernatanten auf IBDV Antigen durch IFA unter Einsatz von CEC getestet. Das Virus wurde nach Transfektion von cRNS von dem Plasmid pD78B oder pP2B in Kombination mit pD78A-E/DelMut1, was zu der Mutante Virus D78A-E/DelMut1 (klassische/Variante E (TC)-254(Gly)//D78B) führt, mit pD78A-E/DelMut2, was zu der Mutante Virus D78A-E/DelMut2 (klassische/Variante E (TC)-270(Thr)//D78B) führt, und mit pD78A-E/DelMut12, was zu der Mutante Virus D78A-E/DelMut12 (klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B) führt, und mit entsprechenden Mutanten, die genomische Segment B von Stamm P2 (Mut1//P2B, Mut2//P2B und Mut12//P2B) umfassen, erzeugt.
Beispiel 2
A Eigenschaften von IBDV D78/Variante E (BU) und (TC) Mutante
Die biologischen Eigenschaften von zwei Stand der Technik IBDV Mutanten D78/Variante E (BU) (bezeichnet als D78A-E/Del) und D78/Variante E (TC) (bezeichnet als D78A-E/Del-QH-AT-SR) beschrieben in Mundt (1999, supra), sind bestimmt worden.
Material und Verfahren
Die Wirkung von den verschiedenen Impfstoffen wurde durch die Messung des Widerstandes gegen einen Challenge festgestellt, der mit der Verabreichung eines Challenge Virus (virulente IBDV Stamm Variante E), 14 Tage nach der Impfung erhalten worden ist. Die untersuchten Impfstoffe waren die Impfstoffe D78/Variante E (BU) und (TC), und der kommerziell erhältliche klassische Impfstoff Nobilis Stamm D78 (Intervet International BV, Die Niederlande). Der (BU) Impfstoff, 10^2.0 EID₅₀/Tier, wurde angewandt über den Augentropfenweg im Alter von 2 Wochen. Der (TC) Impfstoff, 10^5.5 oder 10^3.5 TCID₅₀/Tier, wurde über den Augentropfenweg beziehungsweise über die intramuskuläre Injektion im Alter von 2 Wochen verabreicht. Der kommerzielle verfügbare klassische Impfstoff Nobilis Stamm D78, 10^3.3 TCID₅₀/Tier ist über den Augentropfenweg im Alter von 2 Wochen verabreicht worden. Die Anwesenheit von IBDV in der Bursa Fabricius und mikroskopische Läsionen in der Bursa von 5 Tieren je Gruppe sind untersucht worden, 3, 7, 10 und 13 Tage nach der Impfung und 3 Tage nach dem Challenge.
Schutz gegen einen Challenge in diesem Experiment und in den Experimenten wie unten beschrieben wurde festgestellt durch Bestimmung (i) akuter Läsionen 3 Tage nach dem Challenge, (ii) viralem Antigen in der Bursa 3 Tage nach dem Challenge und (iii) einem Läsionswert von 5 (100% Lymphozyten-Depletion).
Ergebnisse
(i) Durchschnittlicher mikroskopischer Läsionswert in der Bursa 3, 7, 10 und 13 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge.
Wie es aus Tabelle 2 ersehen werden kann, induzierte der IBDV (BU) Stamm die vollständige lymphozytische Depletion bereits 7 Tage nach der Impfung. Der TC adaptierte IBDV Stamm hat keine Läsionen nach der Impfung induziert. Der kommerzielle Impfstoff induzierte milde bis moderate Läsionen nach der Impfung. Weitere Daten zeigten, dass Tiere, die mit der D78/Variante E (BU) Mutante oder D78 geimpft worden waren, gegen den Challenge geschützt gewesen sind. Jedoch entwickelten Tiere, die mit der D78/Variante E (TC) Mutante über den okularen oder intramuskulären Weg geimpft worden sind, (verschiedene Niveaus von) akuten Läsionen nach dem Challenge, was darauf hinweist, dass nur ein geringer beziehungsweise teilweiser Schutz erhalten worden war. Die Kontrolltiere waren nicht geschützt, da alle Tiere akute Läsionen und 100% Lymphozyten Depletion zeigten, 3 Tage nach dem Challenge. Tabelle 2 Durchschnittlicher bursaler Läsionswert

(oc) = okularer Weg; (im) = intramuskulärer Weg; C = chronische Läsionen; A = akute Läsionen

(ii) Erfassung von IBDV mit einem ELISA System in der Bursa 3, 7, 10 und 13 Tage nach der Impfung und 3 Tage nach dem Challenge.
Wie aus der Tabelle 3 gesehen werden kann, könnte die D78/Variante E (BU) Virus 3 und 7 Tage nach der Impfung isoliert werden. Kein Virus konnte 3 Tage nach dem Challenge nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die Tiere gegen einen Challenge geschützt waren. Im Gegensatz zu den Tieren, die mit der Gewebekultur geimpft worden waren, die Stamm D78/Variante E (TC) adaptiert waren, konnten wir den Impfstoff Virus nicht isolieren. Drei Tage nach dem Challenge, enthielten 4 von 5 über den okularen Weg geimpfte Tiere den Challenge-Virus. Drei Tage nach dem Challenge bei Tieren, die über den intramuskulären Weg geimpft worden waren, enthielten 2 von 5 den Challenge-Virus. Dies weist darauf hin, dass Tiere, die über den okularen oder intramuskulären Weg mit D78/Variante E (TC) geimpft worden waren, für 20 beziehungsweise 60 % geschützt gewesen sind. Der kommerzielle Impfstoff Virus konnte 3, 7 und 10 Tage nach der Impfung isoliert werden. Kein Virus konnte 3 Tage nach dem Challenge nachgewiesen werden, darauf hinweisend, dass die Tiere gegen den Challenge geschützt gewesen sind.
Alle Kontrolltiere haben das virale Antigen in der Bursa. Tabelle 3 Gegenwart von IBDV in der Bursa Fabricius.

(oc) = okularer Weg; (im) = intramuskulärer Weg; * Anzahl der positiven Tiere mit vorhandenem viralen Antigen je untersuchter Gesamtanzahl.

B Eigenschaften von der breitbandigen klassischen/Variante E (TC) IBDV Mutante
Materialien und Verfahren
Herstellung von IBDV Impfstoffen.
Primäre Hühnerembryofibroblast (CEF) Zellen sind mit einer finalen Konzentration von 2 × 10/ml hergestellt worden. Die Zellen sind in Eagles minimal essentiellen Medium (MEM) kultiviert worden, enthaltend 5 % fötales Kälberserum. Zu 15 ml von dieser Zellsuspension sind 0.1 ml IBDV-Stamm klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (= Mut12) (passagiertes Niveau 2) hinzugefügt worden. Nach der Inkubation für 3-6 Tage in einem Hochfeuchtigkeitsinkubator bei 37° Celsius, wurde das Supernatant (passagiertes Niveau 3) genommen, um das Tierexperiment 1 auszuführen. Das Supernatant ist verdünnt worden, um in einem Impfstoff einer Dosis von 10^3.0, 10^4.0 oder 10^5.0 TCID₅₀/Tier zu resultieren.
Für das zweite Tierexperiment wurde der IBDV Stamm klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) weiter gereinigt. Drei Plaque Reinigungsrunden sind ausgeführt worden. Danach ist der Virus in der selben Weise wie oben beschrieben kultiviert worden. Das neunte passagierte Niveau (P9) wurde in dem zweiten Tierexperiment eingesetzt. Der kommerziell verfügbare klassische IBDV Impfstoff Nobilis Stamm D78 (Intervet International BV, die Niederlande) wurde in dem zweiten Experiment eingesetzt.
Experiment 1.
Ein Tierexperiment wurde ausgeführt, um die Sicherheits- und die Wirksamkeits-Charakteristika des Breitspektrum Impfstoff Virus Stamm klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) in 14 Tage alten SPF Vögeln zu untersuchen. Das Impfstoff Virus wurde über den Augentropfenweg oder den intramuskulären Weg zugeführt. Das Virus wurde re-isoliert auf CEF von der Bursa, die das IBDV-Antigen nach der Impfung enthielt. Die Wirksamkeit des Breitspektrum Impfstoff klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) wurde durch Messung der serologischen Antwort und Widerstand auf einen Challenge festgestellt, erhalten von der Verabreichung eines Challenge Virus (virulenter IBDV Stamm Variante-E), 14 Tage nach der Impfung. Die Anwesenheit von IBDV in der Bursa Fabricius und mikroskopische Läsionen in der Bursa von 5-15 Tieren je Gruppe sind untersucht worden, 3 und 14 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge. Schutz gegen den Challenge ist festgestellt worden. Weiterhin wurde die serologische Antwort gegen klassische und Variante E Viren mit dem VN-Test fest gestellt worden, 14 Tage nach der Impfung.
Experiment 2.
In einem zweiten Potenztest wurde die Wirkung des Impfstoffes durch Messung der serologischen Antwort und dem Widerstand gegen den Challenge festgestellt, erhalten durch Verabreichung eines Challenge Virus 14 Tage nach Verabreichung von dem Gumboro Impfstoff Stamm klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) über den Augentropfenweg.
Vierzehn Tage alte Hühnern sind in 3 Gruppen unterteilt worden. Eine Gruppe ist mit klassischer/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (P9) geimpft worden, eine Gruppe mit original klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (P3) und die letzte Gruppe mit kommerziellem Impfstoff Nobilis Gumboro D78.
Am 3, 7 und 14 Tage nach der Impfung sind Bursa von 3 bis 15 Hühnern je Gruppe genommen worden. Die Bursa's sind auf Läsionen und die Gegenwart von viralem Antigen untersucht worden. Vierzehn Tage nach der Impfung sind vier nicht-geimpfte SPF Hühner von demselben Alter und Quelle zu jeder Gruppe hinzugefügt worden. Blut wurde von allen Tieren genommen und alle Tiere sind einem Challenge mit virulentem IBDV Stamm F52/70 über den Augentropfenweg unterworfen worden. Für eine Zeitdauer von 10 Tagen sind klinische Zeichen und Mortalität aufgezeichnet worden. Am dritten Tag nach dem Challenge sind Bursa's von 5 Hühnern je Gruppe isoliert worden. Die Bursa's sind auf Läsionen und die Gegenwart von viralem Antigen untersucht worden. Am zehnten Tag nach dem Challenge sind die Bursa's von den überlebenden Tieren auf die Gegenwart von mikroskopischen Läsionen untersucht worden.
Ergebnisse
Experiment 1.
(i) Durchschnittlicher mikroskopischer Läsionswert in der Bursa 3 und 14 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt. Die nicht-geimpften Kontroll-Tiere sind nicht geschützt gewesen, das Challenge Virus induzierte akute Läsionen und vollständige lymphozytische Depletion, 3 und 10 Tage nach dem Challenge. Im Gegensatz dazu induzierte der breitbandige Impfstoff klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) nur milde bis moderate Läsionen nach der Impfung. Weiterhin sind 3 Tage nach dem Challenge nur milde bis moderate chronische Läsionen beobachtet worden, die darauf hinwiesen, dass die Tiere gegen den Challenge mit virulenter Variante E IBDV geschützt gewesen sind. Zehn Tage nach dem Challenge verminderten sich die Läsionen in der geimpften Gruppe weiter. Tabelle 4 Durchschnittlicher bursaler Läsionswert von klassischer/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (P3).

ED = Augentropfenweg; (IM) = intramuskulärer Weg; C = chronische Läsionen; A = akute Läsionen

(ii) Serologische Antwort gegen IBDV
Als VN-IBDV-Viren sind eine klassische und ein Variante-E Stamm eingesetzt worden. Es kann in Tabelle 5 gesehen werden, dass klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (P3) eine gute serologische Antwort gegen sowohl klassische als auch Variante E Stämme von IBDV induziert hat, was auf die Breitbandnatur des Virus hinweist.
Tabelle 5 Serologische Antwort 14 Tage nach der Impfung (VN-Titer wird als log2 der Verdünnung exprimiert).

ED = Augentropfenweg; (IM) = intramuskulärer Weg.

(iii) Feststellung von IBDV mit einem ELISA-System in der Bursa 3 und 14 Tage nach der Impfung und 3 Tage nach dem Challenge.
Wie aus der Tabelle 6 zu ersehen ist, konnte der Virus 3 Tage nach der Impfung in Tieren isoliert werden, die mit der höheren Dosis geimpft worden waren. In keinem der geimpften Tiere konnte 3 Tage nach dem Challenge ein Virus festgestellt worden, was darauf hinweist, dass alle Tiere gegen den Challenge geschützt waren. Im Gegensatz dazu enthielten alle Kontrolltiere das virale Antigen in der Bursa nach dem Challenge. Tabelle 6 Gegenwart von IBDV in der Bursa Fabricius.

ED = Augentropfenweg; (IM) = intramuskulärer Weg; * Anzahl der positiven Tiere mit vorhandenem viralem Antigen je untersuchter Gesamtanzahl

Experiment 2.
(i) Durchschnittlicher mikroskopischer Läsionswert in der Bursa 3 und 14 Tage nach der Impfung und 3 und 10 Tage nach dem Challenge.
Wie aus der Tabelle 7 zu ersehen ist, sind die nicht-geimpften Kontroll-Tiere nicht geschützt gewesen und das Challenge-Virus hat die vollständige lymphozytische Depletion induziert, 3 und 10 Tage nach dem Challenge, was zu akuten Läsionen nach dem Challenge geführt hat. Im Gegensatz induzierte der Breitband-Impfstoff klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) milde bis moderate Läsionen nach der Impfung. Weiterhin waren 3 Tage nach dem Challenge milde bis moderate chronische Läsionen beobachtet worden, darauf hinweisend, dass die Tiere gegen einen Challenge mit klassischem virulenten IBDV Stamm F52/70 geschützt sind. In der Gruppe geimpft mit klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) P9, zeigte ein Tier schwere akute Läsionen, 3 Tage nach dem Challenge, darauf hinweisend, dass es nicht geschützt gewesen ist. Zehn Tage nach dem Challenge verminderten sich die Läsionen in der Bursa von Tieren, die mit klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) geimpft gewesen sind, weiter und alle waren von einer milden bis moderaten Natur, darauf hinweisend, dass alle untersuchten Tiere geschützt gewesen sind.
Tabelle 7 Durchschnittlicher bursaler Läsionswert von Nobilis Gumboro D78 und dem klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270 (Thr) Stamm am passagierten Niveau 3 oder 9.
(ii) Serologische Nachricht gegen IBDV
Als VN-IBDV-Viren sind ein klassischer und ein Variante-E Stamm eingesetzt worden. Es kann aus der Tabelle 8 ersehen werden, dass klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr) (P3 und P9) eine gute serologische Antwort gegen sowohl klassische als auch die Variante-E Stämme von IBDV induziert, auf die Breitband-Natur von dem Virus hinweisend. Im Gegensatz dazu induzierte die Gruppe, die mit D78 (Dosis 5.1 log10) geimpft gewesen ist, eine durchschnittliche serologische Antwort gegen den klassischen beziehungsweise Variante E Virus von 8.8 log2 und 5.9 log2, klar die klassische Art dieses Impfstoff anzeigend.
Tabelle 8 Serologische Antwort 14 Tage nach Impfung

(VN-Titer wird als log2 von der Verdünnung ausgeführt).

(iii) Feststellung von IBDV eines ELISA-Systems in der Bursa 3, 7 und 14 Tage nach Impfung und 3 Tage nach dem Challenge.
Wie aus Tabelle 9 gesehen werden kann, konnte der Virus 3 bis 14 Tage nach Impfung isoliert werden. Das Virus konnte nur in einem Tier festgestellt worden, dass mit der klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr), Passagierniveau 9, geimpft worden war, 3 Tage nach dem Challenge, darauf hinweisend, dass dieses Tier nicht gegen den Challenge geschützt gewesen ist. Alle anderen Tiere waren gegen den Challenge geschützt. Tabelle 9 Vorhandensein von IBDV in der Bursa Fabricius.

* Anzahl von positiven Tiere mit viralem Antigen auf die Gesamtzahl der untersuchten Tiere bezogen

Beispiel 3 Sicherheit und Wirksamkeit von Breitband IBDV Mutanten
Material und Verfahren
Ein weiteres Tierexperiment ist ausgeführt worden, um Sicherheits- und Wirksamkeits-Charakteristika von verschiedenen Breitband Impfstoff Virus Stämmen zu untersuchen. Die Breitband Virus Stämme variierten in Segment B, die von dem Gumboro Virus Stamm D78 oder P2 abgeleitet worden sind. Weiterhin sind Gumboro Stämme untersucht worden, bei denen nur einer der 2 Wechsel (an Positionen 254 und 270) in Segment A eingeführt worden sind. Bei diesem Experiment wurden die Wirkungen des Impfstoffs durch Messungen der serologischen Antwort und dem Widerstand auf einen Challenge festgestellt, erhalten durch Verabreichung eines Challenge Virus (F52/70), 14 Tage nach Verabreichung der Gumboro Impfstoff Stämme. Die untersuchten Impfstoffe waren die Breitband Impfstoff Virus Stämme:
klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B
klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B
klassische/Variante E (TC)-254(Gly)//D78B
klassische/Variante E (TC)-254(Gly)//P2B
klassische/Variante E (TC)-270(Thr)//D78B
klassische/Variante E (TC)-270(Thr)//P2B.
Die verschiedenen Breitband Impfstoffe bei einer Dosis zwischen 10^3.4 und 10^4.8 TCID₅₀/Tier sind über den Augentropfenweg im Alter von 3 Wochen angewandt worden. Das Vorhandensein von IBDV sind in der Bursa Fabricius und mikroskopische Läsionen in der Bursa von 5 Tieren je Gruppe untersucht worden, 3 und 14 Tage nach Impfung und 3 und/oder 10 Tage nach Challenge. Schutz gegen Challenge wurde festgestellt. Weiterhin wurde die serologische Antwort gegen klassische und Variante-E Viren mit dem VN-Test, 14 Tage nach der Impfung, festgestellt.
Ergebnisse
(i) Durchschnittlicher mikroskopischer Läsionswert und Erfassung von IBDV-Antigen in der Bursa.
Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 dargestellt. Alle IBDV Mutanten zeigen eine verminderte Virulenz. Die Mutanten mit einem Segment B vom Stamm D78 induzieren moderate Läsionen, wohingegen die gedämpften Eigenschaften der Mutanten mit einem Segment B vom Stamm P2 nochmals mildere Eigenschaften zeigen. Klassische/Variante E (TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B resultierte in 40 Schutz. Die anderen Stämme induzierten vollständigen Schutz, 3 Tage nach dem Challenge (nur chronische Läsionen vorhanden), ausgenommen für klassische/Variante E (TC)-270(Thr)//P2B, die nach einer Augentropfen-Verabreichung nicht effektiv war. Alle anderen Gruppen zeigten milde bis moderate Läsionen, 10 Tage nach dem Challenge. Tabelle 10 Durchschnittlicher bursaler Läsionswert

C = chronische Läsionen; A = akute Läsionen

* Nummer von positiven Tieren mit vorhandenem viralen Antigen je untersuchter Gesamtzahl.

(ii) Serologische Antwort gegen IBDV
Ein klassischer und ein Variante-E Stamm sind als VN-IBDV Viren eingesetzt worden. Es kann in Tabelle 12 gesehen werden, dass die IBDV Impfstoff Stämme eine gute serologische Antwort gegen sowohl klassische als auch gegen Variante-E Stämme von IBDV induzierten. Die klassische/Variante E (TC)-270(Thr)//P2B Mutante griff nicht nach der Augentropfen-Verabreichung des Virus.
Tabelle 12 Serologische Antwort, 14 Tage nach der Impfung (VN-Titer sind als log2 der Verdünnung ausgedrückt worden). x = 4 von 25 antworteten nicht, y = 1 von 25 antwortete nicht, z = 2 von 25 antworteten nicht.
Legende der Figuren
1.
Konstruktion von chimerischen cDNS Klonen von Segment A von IBDV. Eine Karte von der genomischen Organisation des IBDV Segmentes A ist an der Spitze der Figur gezeigt. Kodierende Sequenzen von Segment A vom Stamm D78 sind durch einen offenen Kasten dargestellt. E/Del Sequenzen sind durch schattierte Kästen dargestellt. Der Ort von mutierten Aminosäuren sind angezeigt und mit einem einzelnen Buchstabencode angezeigt. Die Nummerierung von Nukleotiden und Aminosäuren entsprechen derjenigen der veröffentlichten Sequenz von Stamm P2 (Mundt und Müller, 1995, supra). nt, Nukleotide
2.
Konstruktion von chimerischen cDNS Klonen von Segment A von IBDV. Eine Karte von der genomischen Organisation des IBDV Segmentes A ist an der Spitze der Figur gezeigt. Kodierende Sequenzen von Segment A von dem chimerischen cDNS Klon pD78A-E/DelMut12 sind durch einen offenen Kasten dargestellt. Sequenzen von dem chimerischen cDNS Klon pD78A-E/Del-QH-AT (Mundt, 1999, supra) sind mit schwarzen Kästen dargestellt. Restriktionsenzyme und ihre für das Klonen eingesetzten Abspaltungsorte sind angezeigt. Orte von mutierten Aminosäuren sind angezeigt und mit einem einzelnen Buchstabencode bezeichnet. Die Nummerierung von Nukleotiden und Aminosäuren entsprechen derjenigen der veröffentlichten Sequenz von Stamm P2 (Mundt und Müller, 1995, supra). nt, Nukleotide.
SEQUENZLISTING

Claims

Impfstoff zum Einsatz zum Schutz von Geflügel gegen Krankheiten, die durch die infektiöse Bursitis-Virusinfektion (IBDV) hervorgerufen werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfstoffe eine IBDV-Mutante mit den Nukleotid-Sequenzen umfassen, die eine Variante E VP2 Protein im Segment A des viralen Genoms kodieren und die fähig ist, Hühnerembryofibroblastgewebskulturen (CEF-Gewebskulturen) zu infizieren und in diesen zu replizieren, und wobei die Mutante eine oder mehrere Mutationen in dem Variante E VP2 Kodierbereich umfassen, so dass (i) das Codon für die Aminosäure an der Position 254 Glycin kodiert, und/oder (ii) das Codon für die Aminosäure an der Position 270 Threonin kodiert, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner.
Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Codon für die Aminosäure 254 in dem Variante E VP2 Kodierbereich der Mutante GGC ist und/oder dass das Codon für die Aminosäure 270 ACG ist.
Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Kodierbereich für das 253-284 Fragment des Variante E VP2 Proteins durch den entsprechenden Kodierbereich des D78 Stammes des IBDV ersetzt ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Backbone des Segments A der Mutante ein IBDV des klassischen Untertypus ist, vorzugsweise des IBDV Stammes D78.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Segment B des viralen Genoms der Mutante ein klassischer IBDV Stamm ist, vorzugsweise des Stammes D78 oder P2.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die IBDV-Mutante in einer lebendigen Form ist.
Verwendung einer IBDV-Mutante wie in den Ansprüchen 1 bis 6 definiert, zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verabreichung über einen Massenanwendungsweg.