KR20020013387A - 광범위한 감염성 활액낭 질병 바이러스 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표준 IBDV 균주 및 변종 E IBDV 균주에 대한 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 광범위한 IBDV 백신을 제공한다. 나아가, 이 백신은 대량 사용 경로로 가금류에 투여할 수 있다.
Description
본 발명은 바이러스 지놈 중 세그먼트 A에 변종 E VP2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 CEF 조직 배양물에서 감염 및 복제할 수 있는 IBDV 돌연변이체, 이 돌연변이체를 포함하는 백신 및 백신의 제조에 있어서 이 돌연변이체의 용도에 관한 것이다.
감염성 활액낭 질병 바이러스(IBDV)는 비르나비리대(Birnaviridae) 부류의 일원이다. 이 부류의 바이러스는 매우 유사한 지놈 구조 및 유사한 복제 사이클을 갖는다. 이들 바이러스의 지놈은 이중가닥(ds) RNA로 된 2개의 세그먼트(A 및 B)로 구성되어 있다. 큰 세그먼트 A는 폴리단백질을 암호화하며, 이 단백질은 자가단백분해기작에 의해 절단되어 성숙한 바이러스 단백질 VP2, VP3 및 VP4을 형성한다. VP2와 VP3은 비리온의 주요 구조 단백질이다. VP2는 비르나바이러스의 주요 숙주-보호성 면역원이고, 중화 항체의 유도에 관여하는 항원성 영역들을 함유하고 있다. VP4 단백질은 바이러스가 암호화하는 단백분해효소로서 VP2, VP3 및 VP4 단백질의 폴리단백질 전구체를 처리하는데 관여한다. 큰 세그먼트 A는 또한 제2의 개방 번역틀(ORF)을 갖고 있으며 폴리단백질 유전자에 선행하고 이와 부분적으로 중첩되어 있다. 제2의 개방 번역틀은 IBDV 감염 세포에 존재하는 미지 기능의 단백질 VP5를 암호화한다. 작은 세그먼트 B는 VP1, 즉 폴리머라제 및 캡핑 효소 활성을 갖는 90 kDa의 다기능 단백질을 암호화한다.
IBDV 경우, 두개의 혈청형, 즉 혈청형 1 및 2가 존재한다. 두개의 혈청형은 바이러스 중화(VN) 시험에 의해 구별될 수 있다. 나아가, 혈청형 1의 아류형(subtype)들이 분리되었다. 혈청형 1의 소위 "변종" 바이러스는 교차-중화 시험, 즉 단클론성 항체 또는 RT-PCR의 패널에 의해 동정될 수 있다. 혈청형 1의 IBDV의 이들 아류형은 문헌[Van Loon, 등. Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, 독일, 179-187, 1994]에 기재되어 있으며, 이들의 예로는 표준, 변종-E, GLS, RS593 및 DS326 균주가 있다.
소위 굼보로(Gumboro) 병이라고 지칭되는 감염성 활액낭 병(IBD)은 파브리시우스(Fabricius)의 활액낭 세포에 선택적인 향성(tropism)을 갖으면서 림프 조직을 주요 표적으로 하는 닭들의 급성, 고도의-접촉전염성 바이러스 감염이다. 감염되기 쉬운 무리의 이환율은 높고 급속하게 몸무게가 감소되고 사망율은 중간정도이다. 이 질병으로부터 회복된 닭은 닭의 방어 기작에 중요한 파브리시우스의 활액낭이 파괴되어 면역이 결여될 수 있다. IBD-바이러스는 3주령이하의 닭들에서 심각한 면역억제를 야기하고 3개월 이하된 병아리에서 활액낭 상해를 유도한다.
수년동안 이 질병은 약독화된 생 IBDV 백신으로 초회 항원 자극된 닭들에게 불활성화된 백신을 사용하여 종축(種畜) 내에 고 수준의 항체를 유도함으로써 예방될 수 있었다. 이것은 IBD에 의해 야기된 경제적 손실을 최소한으로 유지시켜 주었다. 백신접종된 종축으로부터 유래된 닭들 내에 있는 모계 항체들은 IBDV의 초기 감염을 예방하고 면역억제와 관련된 문제점들을 줄인다. 게다가, 약독화된 생 백신도 모계 항체가 감소된 후 상업용 닭 무리에서 성공적으로 사용되어 왔다.
최근, IBDV 중 지독한 독성 균주가 유럽에서 높은 사망율로 질병의 발병을 야기하였다. 최근 백신접종 프로그램은 병아리들을 충분히 보호하지 못하였다. 백신접종 실패의 주요 원인은 생 백신이 독성 야외 바이러스(virulent field virus)의 감염 전에 새를 감염시킬 수 없었기 때문이다.
백신접종된 무리에서의 급성 질병의 또다른 원인은 1980년대 중반, 특히 미국에서 항원성 변종의 발생이다. 혈청형 1 IBDV들 중 가장 중요한 신규의 항원성 아류형은 델라웨어(Delaware) 변종 E 및 GLS 균주이었다. 그때까지 사용된 백신은 오직 표준 유형의 약독화된 생(生) IBDV균주 또는 사(死) IBDV 균주를 주성분으로 하였다. 그러나, 표준 IBDV 백신 균주가 다른 아류형 균주에 의한 닭의 감염에 대해 어느정도 교차-보호를 유도한다(그 반대도 마찬가지임)는 사실에도 불구하고, 실질적인 경제적 손실이 오직 하나의 아류형 바이러스에 기초한 백신으로 백신접종한 결과로 확인되었다.
이 분야에서의 이러한 개발들의 결과로서, 표준 IBDV 아류형 백신 균주 및 변종 IBDV 아류형 백신 균주 모두를 IBDV 백신에 통합하여 광범위한 보호를 얻을 필요가 있다.
상기 기술된 바와 같이, 표준 균주에 기초한 생 및 사 백신들 모두는 이분야에 통상 사용된다. 표준 사 백신은 통상 주사로 투여되나, 표준 생 백신은 주사로 투여되거나 저가의 대량 사용 기법, 예컨대 스프레이-, 에어로졸 및 음용수 백신접종으로 투여된다.
지금까지 확인된 델라웨어 변종 E 바이러스는 독성이 지독하며 오직 불활성화된 백신으로써만 투여될 수 있다. 지금까지, 세포 배양물 내에서 변종 E 균주를 적응시키고 약독화하려는 시도 중 오직 한 가지만 성공하였다. 89/03으로 지칭된 이 백신은 변종 E 감염에 대한 보호를 유도할 수 있으나, 임의의 대량 사용 경로에 의해서 투여할 경우 효과가 없는 단점을 갖는다. 이 백신 바이러스는 주사, 특히 피하주사 또는 근육내 주사에 의해 투여되어야 할 필요가 있다(Hein 등, Proceedings of the 43th Western poultry disease conference, pages 102-103, 1994, Sacramento, USA).
GLS 아류형의 IBDV에 의한 감염으로부터 조류를 보호하기 위해서는 오직 불활성화된 백신만이 유용하다.
Mundt(J. Gen. Virology 80, 2067-2076, 1999)는 오직 파브리시우스의 활액낭에서 생체내 감염 및 복제할 수 있는 IBDV 균주가 또 닭 배 섬유아세포(CEF) 조직 배양물에서 감염 및 복제할 수 있는데 필요한 구조적 필수요건을 분자 수준에서 확인하였다. IBDV 활액낭 균주(BU)가 CEF 및 기타 조직 배양물을 충분히 감염하기 위해서는 VP2 단백질 내 위치 253(Gln에서 His로의 치환) 및 위치 284(Ala에서 Thr로의 치환)에서 두개의 아미노산이 교환되어야 한다. 특히, 조직 배양(TC) 표현형을 갖는 두개의 키메라 D78/변종 E IBDV 돌연변이체는 이 문헌에 개시되어 있다.
상기의 관점에서, 대량 사용 경로를 통해 투여되는 경우 효과가 있는 약독화된 생 델라웨어 변종 E IBDV 백신이 필요하다. 나아가, 2이상의 아류형의 IBDV 균주에 대한 적절한 보호를 제공할 광범위한 IBDV 백신 균주를 수득할 필요가 있다.이러한 광범위한 백신은, 각 IBDV 아류형에 대해 분리된 백신 바이러스들을 하나의 조합 백신으로 제조 및 제형화하지 않아도 된다.
본 발명의 목적은 2이상의 IBDV 아류형의 독성 균주에 대하여 닭에게 보호 면역을 유도할 수 있는 IBDV 돌연변이체를 제공하는 것이다. 다른 목적은 독성 IBDV 변종 E 균주에 대한 보호를 제공하고 동시에 생 IBDV 백신접종에 통상 사용되는 대량 사용 기술로 투여될 수 있는 IBDV 돌연변이체를 제공하는 것이다.
도 1: IBDV 중 세그먼트 A의 키메라 cDNA 클론의 작제. IBDV 세그먼트 A의 지놈 구조에 대한 지도는 도면 상부에 나타나 있다. 균주 D78 중 세그먼트 A의 암호화 서열은 빈 박스로 표시되어 있다. E/Del 서열은 그림자진 박스로 표시되어 있다. 돌연변이된 아미노산의 위치가 지적되어 있고 1문자 코드로 명명되어 있다. 뉴클레오티드 및 아미노산의 번호매기기는 균주 P2의 공개된 서열(Mundt 및 Muller, 1995, 상기 참조)에 따른 것이다. nt는 뉴클레오티드이다.
도 2: IBDV 중 세그먼트 A의 키메라 cDNA 클론의 작제. IBDV 세그먼트 A의 지놈 구조에 대한 지도는 도면 상부에 나타나 있다. 키메라 cDNA 클론 pD78A-E/DelMut12 중 세그먼트 A의 암호화 서열은 빈 박스로 표시되어 있다. 키메라 cDNA 클론 pD78A-E/Del-QH-AT(Mundt, 1999, 상기 참조) 서열은 검은색 박스로 표시되어 있다. 클로닝에 사용된 제한 효소 및 이의 절단 부위가 지적되어 있다. 돌연변이된 아미노산의 위치가 지적되어 있고 1문자 코드로 명명되어 있다. 뉴클레오티드 및 아미노산의 번호매기기는 균주 P2(Mundt 및 Muller, 1995, 상기 참조)의 공개된 서열에 따른 것이다. nt는 뉴클레오티드이다.
이들 목적은 바이러스 지놈 중 세그먼트 A에 있는 변종 E VP2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 CEF 조직 배양물에서 감염 및 복제할 수 있는 IBDV 돌연변이체를 제공함으로써 달성되었으며, 이 돌연변이체는
(ⅰ) 위치 254의 아미노산 코돈이 글리신을 암호화하고/하거나
(ⅱ) 위치 270의 아미노산 코돈이 트레오닌을 암호화하도록 변종 E VP2 암호화 영역에서의 하나이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Mundt 등(1999, 상기 참조)에 개시되어 있으며 변종 E 균주의 배양(BU) 및 면역원성 특징을 나열하는 키메라 IBDV D78/변종 E 활액낭(BU) 돌연변이체는 독성이 있으며 닭에 투여된 후 림프구가 완전히 고갈되도록 유도한다. 나아가, 실시예 2에서는 상기 균주의 해당 조직 배양(TC) 돌연변이체가 독성이 덜하며 주사로 투입될 경우 부분적인 보호 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 그러나, 동시에 TC 돌연변이체는 눈 경로(음용수 투여의 모델인 경로)로 투여되는 경우 감염에 대해서 오직 불충분한 보호를 유도한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 변종 E바이러스의 VP2 유전자 내 아미노산 254(Ser) 및/또는 270(Ala)에 자연적으로 발생하는 코돈 내에 또다른 돌연변이가 아미노산 254(Gly) 및/또는 270(Thr)을 암호화하는 코돈을 초래하면,
(ⅰ) 거의 동일한 수준의 표준 IBDV 균주 및 변종 E 아류형 IBDV 균주에 대하여 바이러스 중화(VN) 항체 역가를 유도할 수 있으며,
(ⅱ) 독성의 표준 IBDV 균주 및 변종의 E 아류형 IBDV 균주의 감염에 대하여 백신접종된 동물의 보호를 유도할 수 있고,
(ⅲ) 대량 사용 경로로 투여될 경우 보호를 유도할 수 있는
약독화된 생 IBDV 돌연변이체를 제공한다.
IBDV 아류형은 또한 당업계에 잘 정의되어 있으며, 예를들면, 단클론성 항체를 사용한 이들의 반응 패턴에 의해 정의되어 있다. 변종 E 아류형의 IBDV는 Dave Snyder에 의해 1992. 9. 14. 수탁번호 제HB 11122호로 ATCC에 기탁된 바이러스 중화 Moab 67과 특이적으로 반응한다(또, Vakharia 등, Virus Research 31, 265-273, 1994 참조).
본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체를 그 결과로 나타내는 돌연변이는 변종 E VP2 단백질에 대한 암호화 영역에 아미노산 254(Ser) 및/또는 270(Ala) 코돈에서 도입된다.
본 발명에 따른 유익한 IBDV 돌연변이체는 아미노산 254에 대한 코돈 내 또는 양쪽 코돈 내에서 원하는 돌연변이를 포함한다.
뉴클레오티드 890(A에서 G로) 및 938(G에서 A로)을 교환하면 아미노산254(Ser에서 Gly로) 및 270(Ala에서 Thr로)로 각각 치환된다. 상기 기술한 바와 같이, IBD 바이러스의 지놈성 구조는 잘 확립되어 있다: IBDV 지놈은 큰 세그먼트 A와 작은 세그먼트 B로 구성되어 있다. IBDV 중 세그먼트 A는 약 110 kDa의 폴리단백질(VP2-VP4-VP3; 도 1)을 암호화하는 큰 개방형 해독틀(ORF)을 포함한다. 다수의 IBDV 균주들 중 세그먼트 A 및 세그먼트 B의 완전한 뉴크레어티드 서열은 결정되었다. 나아가, ORF 내의 위치, 변종 E VP2 단백질을 암호화하는 뉴클레어티드 서열 및 변종 E VP2 단백질의 아미노산 서열은 [Vakharia 등, Avian Diseases 36, 736-743, 1992; Vakharia 등, Virus Res. 31, 265-273, 1994; Heine 등, J. Gen. Virol. 22, 1835-1843, 1991]에 의해 결정되었다. 추가적으로, 변종 E VP2 암호화 서열(뉴클레오티드 647-1725)을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열 및 실시예들에서 기술한 바와 같이 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체를 생성시키는데 사용된 폴리단백질 중 해당 아미노산 서열 172-532은 서열번호 1 및 2에 나타나 있다.
본 명세서에서 아미노산 위치를 지적하는데 사용된 숫자는 당업계에서 통상 사용되는 바와 같이 IBDV 폴리단백질 내 아미노산의 번호매기기에 따른 것이다. 뉴클레오티드 위치를 지적하는 숫자는 Mundt 및 Muller(J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; NCBI 수탁번호 X 84034)에 기재된 바와 같이 IBDV 지놈 중 세그먼트 A의 완전한 뉴클레오티드 서열에 기초한 것이다.
CEF 조직 배양물에서 감염 및 복제하는 표준 또는 변종 E 표현형을 갖는 IBDV의 선행조건은 각 균주들의 VP2 유전자 내 아미노산 253(His) 및 284(Thr)을 암호화하는 코돈이 존재하여야 한다는 것이 Mundt(1999, 상기 참조)에 의해 입증되어 있다. 따라서, 특히 CEF 조직 배양물에서 감염 및 복제하는 특성을 나타내는 본 발명에 따른 IBDV 균주는 아미노산 253(His) 및 284(Thr)을 포함한다. 이러한 IBDV 균주는 Mundt(1999, 상기 참조)에서 개시된 방법에 의해 얻을 수 있다. 나아가, 이러한 방법은 실시예 1에도 기재되어 있다.
유전자 코드의 축퇴의 결과로, 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체의 폴리단백질 중 아미노산 254(Gly) 및 270(Thr)을 암호화하는 코돈에 대하여 다양한 가능성이 존재한다. 아미노산 254(Gly)에 대한 VP2 암호화 영역내 코돈은 GGA, GGC, GGG 또는 GGT일 수 있으며 GGC가 바람직하고, 아미노산 270(Thr)에 대한 코돈은 ACT, ACC, ACA 또는 ACG가 가능하고 ACG가 바람직하다.
(ⅰ) CEF 조직 배양물 내에서 감염 및 복제할 수 있고 (ⅱ) 대량 사용 경로로 투여할 경우 광범위한 면역 반응을 유도하는 특성을 갖는 변종 E IBDV 균주는 자연적으로 발생한 변종 E 균주 내 상기 언급한 특정 관련 코돈을 도입시킴으로써 준비할 수 있다.
대안으로, 또한 이러한 결과는 변종 E VP2 암호화 영역의 일부를, 이미 관련 위치에서 바람직한 코돈을 포함하는 공지된(표준) IBDV 균주의 지놈 서열 중 해당 부위로 교환함으로써 얻을 수 있다. 표준 균주의 전길이의 지놈 서열은 미국 특허 제5,871,744호(Vakharia 및 Mundt) 및 유럽 특허출원 제98201704.8(Akzo Nobel NV)호에 개시되어 있다.
특히, 본 발명에 따라, 아미노산 위치 253-284를 포함하는 VP2 단백질 단편을 암호화하는 표준 균주 D78의 VP2 암호화 서열 중 일부를 포함하고 상기 언급한바람직한 코돈을 갖는 IBDV 돌연변이체가 제공된다.
본 발명에 따른 바람직한 IBDV 돌연변이체는 서열번호 3에 나타난 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드 위치 884-985에 걸쳐 있는 D78 VP2 암호화 영역의 일부를 포함한다. 이 뉴클레오티드 단편은 변종 E VP2 암호화 영역 중 해당 단편을 대신하고, 특히 아미노산 253(His), 254(Gly), 270(Thr) 및 284(Thr)을 암호화한다(서열번호 4)
본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체는 상기 기술한 바와 같은 돌연변이된 VP2 암호화 영역을 포함하고 변종 E IBDV 균주의 세그먼트 A의 유전자 골격을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체도 표준 또는 GLS 균주와 같은 또다른 IBDV 균주의 유전자 골격에 기초할 수 있으며, 특히 표준 균주인 D78이 바람직하다.
"키메라" IBDV 돌연변이체의 경우, 제1 유형의 IBDV 균주 중 세그먼트 A의 유전자 골격 상의 VP2 암호화 서열을, 신규의 IBDV 돌연변이체에 유익한 특성을 부여할 수 있는 바람직한 돌연변이를 추가적으로 포함하는 해당 관련 변종 E VP2 암호화 서열로 치환한다.
변종 E VP2 단백질을 암호화하는 VP2 암호화 서열은 완전한 변종 E VP2 단백질을 암호화하는 (돌연변이된) 유전자 정보(뉴클레오티드 위치 131-1666)를 포함할 수 있거나, 변종 E 바이러스 중화 항체를 유도할 수 있는 VP2 단백질을 암호화하는 그 단편을 포함할 수 있다. 후자의 경우 변종 E VP2 암호화 서열은 IBDV 돌연변이체가 완전한 VP2 단백질을 발현하도록 또다른 IBDV 아류형의 VP2 암호화 서열로 보충할 수 있다.
특히, 이러한 IBDV 돌연변이체는 VP2 유전자의 소위 가변 영역에 걸쳐있는 (돌연변이된) 변종 E VP2 암호화 단편을 적어도 포함할 수 있다. Bayliss등(J. Gen. Virol. 71, 1303-1312, 1990)은 이 영역이 뉴클레오티드 위치 745-1182 사이에 위치해 있다는 것을 확인하였다.
바람직하게는, IBDV 돌연변이체는 상기 언급한 바람직한 돌연변이를 포함하고 뉴클레오티드 647-1666에 걸쳐 있는 변종 E VP2 암호화 서열을 포함한다.
(키메라) IBDV 돌연변이체는 최근 확립된 IBDV의 감염성 cRNA 시스템에 의해 형성시킬 수 있다(Mundt and Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996). 이러한 역 유전자 시스템은 IBDV의 RNA 지놈에 돌연변이를 도입할 수 있는 가능성을 열어준다. 이러한 역 유전자 시스템에서 가장 중요한 단계는 IBD 바이러스 중 세그먼트 A 및 B의 전길이 cDNA 클론을 제공하는 것으로, 이들 세그먼트 모두의 5'- 및 3'- 말단의 뉴클레오티드를 포함한다. 클로닝 공정 이후, 세그먼트 A 및 B의 전길이 서열은 T7, SP6 또는 T3 폴리머라제와 같은 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있는 프로모터에 작동가능 하게 연결되며, T7 프로모터가 바람직하다. DNA 의존성 폴리머라제는 세그먼트 A 및 B 각각의 전길이 cDNA로부터 바이러스 cRNA를 형성할 수 있다. 이러한 cRNA는 바이러스의 복제 및 생존성 있는 바이러스의 분리를 유도할 수 있다. 이러한 공정은 자연적으로 발생하는 IBDV 모두에 대해 수행할 수 있다.
역 유전자 시스템은 다양한 IBDV 균주에 대해 기술되어 왔으며, 그 예로D78(Yao 등, J. Virol. 72, 2647-2657, 1998), 균주 HK46(Lim 등, J. Virol. 73, 2854-2862, 1999) 및 CEF 94(Boot 등, Virology 265, 330-341, 1999)가 있다.
본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체의 세그먼트 B는 임의의 IBDV 균주로부터 유래될 수 있으며, 표준 IBDV 균주가 바람직하고, 균주 D78 또는 P2가 특히 바람직하다(미국특허 제5,871,744호 및 유럽특허출원 제98201704.8호).
균주 P2의 세그먼트 B를 포함하는 전술된 IBDV 돌연변이체, 특히 아미노산 254(Gly) 또는 254(Gly)/270(Thr)를 갖는 돌연변이체는 특정의 유익한 약독화 및 보호성 특성을 나타낸다.
이러한 목적으로 당업계에 통상 알려진 방법을 통해 소정의 돌연변이가 IBDV 지놈에 도입될 수 있다. 특히, 돌연변이(들)는 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 도입된다. IBDV 지놈에 돌연변이를 도입하는 방법은 본 명세서에 기재되어 있으나, 또한 당업게에서 통상 사용되고 있다(Mundt 및 Vakharia, 1996, 상기 참조; Yao 등, J. Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt 등, 1999, 상기 참조; 유럽특허출원 제98201704.8호; Current Protocols in Molecular Biology, eds.; F. M. Ausubel 등, Wiley N.Y., 1995 판, 8.5.1-8.5.9 쪽 및 Kunkel 등 in Methods in Enzymology vol. 154, 376-382, 1987).
실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체는 신규 유형의 IBDV 백신을 유도할 수 있는 매우 바람직한 특성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 또다른 일면은 IBDV 감염에 의한 질병에 대해 가금류를 보호하는데 사용하기 위한 백신이다. 백신은 전술한 IBDV 돌연변이체를 약학적 허용 담체 또는 희석제와함께 포함한다.
IBDV 돌연변이체는 약독화된 또는 불활성화된 생 바이러스로서 백신으로 통합될수 있으나 생 바이러스는 본 발명의 IBDV 돌연변이체의 유익한 특성 모두를 이용하도록 하기 때문에 바람직하다.
본 발명에 따른 백신은 종래 방법, 예를들면 시판되고 있는 생- 및 불활성화된 IBDV 백신에 대해 통상 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 간단히 말하자면, 감수성자 기체(基體)를 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체로 접종하고 소정의 감염성 역가로 바이러스가 복제될 때까지 증식시킨 후 IBDV 함유 물질을 수집한다.
IBDV 돌연변이체의 복제를 견딜 수 있는 모든 기체는 본 발명에 따른 백신을 제조하는데 사용될 수 있으며, 닭 배 섬유아세포(CEF) 또는 닭 배 간 세포(CEL)와 같은 초기 (조류) 세포 배양물, VERO 세포주 또는 BGM-70 세포주와 같은 포유류 세포주, 또는 QT-35, QM-7 또는 LMH와 같은 조류 세포주를 포함하다. 통상, 세포를 접종하고 난 후 바이러스를 3-10일 동안 증식시키고, 이후 세포 배양물 상청액을 수집하고 바람직한 경우 여과 또는 원심분리하여 세포 잔해를 제거한다.
대안으로, IBDV 돌연변이체는 배발생된 닭 난자(egg) 내에서 증식시킨다. 특히, 이들 IBDV가 증식되는 기체는 SPF 배발생된 난자이다. 배발생된 난자는 예를들면, 난자 당 적어도 102TCID50을 포함하는 IBDV 돌연변이체 함유 현탁액 또는 균질액 0.2㎖로 접종할 수 있으며, 계속해서 37℃에서 항온배양한다. 약 2-5일 후, 배 및/또는 세포막 및/또는 요막액(allantoic fluid)을 수집하고 이 물질을 적당히 균질화함으로써 IBD 바이러스 생성물을 수집한다. 그리고나서, 균질액을 10분간 2500×에서 원심분리하고 필터(100㎛)를 통해 상청액을 여과할 수 있다.
생 바이러스를 함유하는 본 발명의 백신은 현탁액의 형태로 또는 동결건조된 형태로 제조 및 시판될 수 있으며, 추가적으로 이러한 조성물에 통상 사용되는 약학적 허용 담체 또는 희석제를 함유할 수 있다. 담체는 안정화제, 보존제 및 완충제를 포함한다. 바람직한 안정화제는 예컨대, SPGA, 탄수화물(예, 소비톨, 만니톨, 전분, 수크로즈, 덱스트란, 글루타메이트 또는 글루코즈), 단백질(예, 건조된 우유의 유장, 알부민 또는 카제인) 또는 이들의 분해 생성물이 있다. 적절한 완충제로는 예컨대 알칼리 금속 포스페이트가 있다. 적절한 보존제로는 티메로살, 메르티올레이트 및 젠타미신이 있다. 희석제는 물, 수성 완충액(예, 완충된 함염물), 알콜 및 폴리올(예, 글리세롤)이 있다.
바람직한 경우, 본 발명에 따른 생 백신은 면역보강제를 함유할 수 있다. 면역보강제 활성을 갖는 적절한 화합물 및 조성물의 예로는 하기 언급되는 것과 동일하다.
본 발명에 따른 생 백신은 예컨대 근육내, 피하내 또는 난으로(in ovo)의 주사에 의해 투여될 수 있지만, IBDV 백신접종에 통상 사용되는 저가의 대량 사용 경로에 의해 백신을 투여하는 것이 바람직하다. IBDV 백신접종의 경우, 이 방법은 음용수, 스프레이 및 에어로졸 백신접종을 포함한다.
음용수 경로에 의한 투여의 경우 2 내지 4 시간동안 동물에게 물을 주지않고나서 이들 앞에 백신을 함유한 물을 두는 것이 일상적인 것이고, 모든 새들이 균등하게 마실 수 있는 공간을 충분이 주는 것이 중요한다. 백신은 각 새에 충분한 용량으로 주기 위해 계산된 농도로 신선한 음용수에 넣는다.
음용수 내 소량의 염소, 철, 아연 또는 구리 이온의 존재로 인한 생존가능한 백신 바이러스의 극적인 감소를 억제하기 위해, 탈지유(분말)와 같은 보호제를 백신 함유 물에 첨가하는 것이 바람직하다.
스프레이 방법은 조대(coarse) 스프레이 및 에러로졸 투여를 포함하며, 작은 액체 입체내에 통합된 생 IBDV 백신을 투여하는 것을 포함한다. 조대 스프레이 방법에서, 입자는 통상 초기 소적 크기가 10 내지 100 마이크론이고 에어로졸 투여 방법에서 소적 크기는 통상 <1 내지 50 마이크론이다.
(수도) 물 입자의 건조의 결과 용해된 염의 농도가 증가되는 것으로 인한 생 백신 바이러스의 불활성를 억제하기 위해 소량의 단백질 보호제, 예를들면, 탈지유, 탈지유 분말 또는 젤라틴을 수상에 첨가할 수 있다.
작은 입자를 생성하기 위해, 종래의 스프레이-기구 및 에어로졸 발생기를 사용할 수 있으며, 그 예로, 시판되고 있는 배낭 스프레이, 부화장 스프레이 및 분무(atomist) 스프레이용 스프레이 발생기가 있다. 또한 음용수 백신접종은 종래 기구를 사용하여 수행할 수 있다. 종래 스프레이/에어로졸- 및 음용수 백신접종에 대한 상세한 내용은 Gezondheidsdienst voor Pluimvee, Doorn, The Netherlands, van Eck 등, Ⅵ-Ⅶ, 1988에 의해 발행된 "Compendium, administration of poultry vaccines"에서 찾을 수 있다.
본 발명의 다른 일면에서, 불활성화된 형태로 IBDV 돌연변이체를 함유하는백신을 제공한다. 불활성화된 백신의 주요 장점은 표준 IBDV 균주 및 변종 E IBDV 균주 모두에 대한 보호 항체를 고 수준으로 오랜 기간동안 얻을 수 있다는 것이다.
증식 단계 이후 수집된 바이러스를 불활성화시키고자 하는 목적은 바이러스 재생산을 제거하기 위해서이다. 일반적으로, 이것은 당업계에 잘 알려진 화학적 또는 물리적 방법에 의해 달성될 수 있다.
불활성화된 IBDV 돌연변이체를 함유하는 백신은, 예를들면 이러한 목적에 적합한 하나이상의 전술한 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 불활성화된 백신은 면역보강제 활성이 있는 하나이상의 화합물을 포함한다. 이 목적을 위한 적절한 화합물 또는 조성물은 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 산화알루미늄, 예를들면 광유(예, Bayol FR또는 Marcol 52R, 또는 비타민 E 아세테이트와 같은 식물유를 주성분으로 하는 수중유 또는 유중 수 에멀젼 및 사포닌을 포함한다.
본 발명에 따른 백신은 유효한 용량(즉, 독성 바이러스의 감염에 대하여 백신접종된 새의 면역을 유도할 면역성부여 IBDV 물질의 양)의 IBDV 돌연변이체를 활성성분으로 포함한다. 면역은 본 명세서에서 백신접종되지 않은 군과 비교하여 백신접종 후 새 집단에서 상당히 더 높은 수준의 보호를 유도하는 것으로 정의한다.
통상, 본 발명에 따른 생 백신은 각 동물 당 102-109TCID50감염 용량50(TCID50)의 용량으로 투여될 수 있으며, 바람직한 용량의 범위는 104.0-107.0TCID50이다. 불활성화된 백신은 각 동물당 105-109TCID50의 항원 당량을 함유할 수 있다.
불활성화된 백신은 통상 비경구적으로, 예를들면, 근육내 또는 피하로 투여된다.
본 발명에 따른 IBDV 백신이 닭에서 효과적으로 사용될 수 있지만, 칠면조, 뿔닭 및 엽조(partidge)와 같은 다른 가금류도 성공적으로 백신으로 접종될 수 있다. 닭은 영계(broiler), 번식 무리(reproduction stock) 및 산란 무리(laying stock)을 포함한다.
본 발명에 따른 생 백신 또는 불활성화된 백신을 받은 동물의 연령은 종래 생- 또는 불활성화된 IBDV 백신을 받은 동물과 동일하다. 예를들면, 영계(모계로부터 유래된 항체-MDA가 없음)는 생후 1일째에 또는 난으로 백신접종할 수 있으며, 고수준의 MDA를 갖는 영계는 2-3 주령에 백신접종하는 것이 바람직하다. 저수준의 MDA를 갖는 산란 무리 또는 번식 무리는 생후 1-10일에 백신접종하고 이어서, 6-12 주령 및 16-20주령일 때 불활성화된 백신으로 보조(booster) 백신접종할 수 있다.
또한, 본 발명은, 전술한 IBDV 돌연변이체 외에, 가금류에 감염성인 기타 병원균 유래의 하나이상의 면역원을 더 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는 조합 백신은 추가적으로 마렉스병(Mareks Disease) 바이러스(MDV), 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 뉴캣슬병(Newcastle disease) 바이러스(NDV), 난 적하 징후(egg drop syndrom, EDS) 바이러스, 터키(turkey) 비기관염 바이러스(TRTV) 또는 레오바이러스 중 하나이상의 백신 균주를 포함한다.
실시예
[실시예 1] 광범위한 표준/변종 E IBDV 돌연변이체의 제조
재료 및 방법
바이러스 및 세포
혈청형 Ⅰ 균주 D78(Intervet International BV, Boxmeer, 네덜란드)을 닭 배 세포(CEC)에서 증식시켰다. 배형성된 SPF 난에서 유래된 CEC를 10% 태아 소 혈청(FCS)으로 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM)에서 성장시켰으며, 회수된 바이러스의 증식 및 형질감염 상청액의 계대배양에 사용하였다. 10% FCS로 보충된 배지 199에서 성장시킨 메추라기 근육 세포(QM-7, ATCC)를 사용하여 형질감염 실험 및 면역형광 분석을 수행하였다.
세그먼트 B IBDV 균주의 전길이 cDNA 클론의 작제
혈청형 Ⅰ 균주 D78 중 세그먼트 B의 전길이 cDNA을 클로닝하기 위해, CEC에서 바이러스를 증식시키고 초(ultra)원심분리법으로 정제하였다. 균주 D78의 지놈성 바이러스 RNA를 정제하고 cDNA로 역전사시킨 후 Mundt 및 Vakharia(1996, 상기 참조)에 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드를 사용한 표준공정에 따라 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 증폭 생성물을 블런트 말단으로 클로닝하고, 적절한 PCR 단편을 함유한 플라스미드에 대해 서열결정하였다. T7-RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하의 세그먼트 B의 전길이 cDNA를 함유하는 플라스미드(pUC18BD78)를 얻기 위한 클로닝 공정은 균주 P2의 세그먼트 B에 대해 Mundt 및 Vakharia(1996, 상기 참조)에서 기술한 공정에 해당하였다.
속(屬)간(intergeneric) IBDV 플라스미드의 작제
IBDV 특정 서열을 치환하기 위해, 변종 E 균주 E/Del의 완전한 암호화 영역을 함유하는 플라스미드를 사용하였다(Vakharia, Biotechnology Annual Review 3, 151-168, 1997). pEDEL22BacⅡ을 제한 효소NdeⅠ 및SalⅠ로 각각 균주 P2의 전길이 서열(NCBI 수탁번호 X 84034)에 따른 뉴클레오티드 647 및 1725(서열번호 1)에서 절단하여, VP2 중 가변 영역의 암호화 서열(Bayliss 등, 1990, 상기 참조) 및 균주 E/Del의 VP4 서열을 포함하는 1078bp 단편을 얻었다.NdeⅠ 및SalⅠ 절단된 pD78A/△NB(Mundt, 1999, 상기 참조) 안으로 연결시킨 후 균주 D78 중 세그먼트 A의 서열 및 E/Del을 함유하는 키메라 전길이 플라스미드 pD78A-E/Del를 작제하였다(Mundt, 1999, 상기 참조). 플라스미드 pD78A-E/Del를 부위 지정 돌연변이유발법의 토대로 사용하였다.
이로 인해, pD78A-E/Del을 제한효소 SacⅠ 및 SalⅠ로 균주 P2의 전길이 서열에 따른 뉴클레오티드 868 및 1725에서 절단하고 적절하게 절단된 플라스미드 벡터 pBS-(스트라젠) 안으로 클로닝하여 pBSD78-E/Del를 얻었다. 부위 지정 돌연변이유발 실험을 전술한 바와 같이 수행하였다(Kunkel 등, 1992, 상기 참조). 뉴클레오티드 서열(nt 941-985)의 부위 지정 돌연변이유발은 올리고뉴클레오티드 D78-E/Delmut12-1(표 1, 서열번호 5) 및 플라스미드 pBSD78-E/Del을 사용하여 얻었다. 관심있는 서열을 서열결정하여 조절하고 변화된 서열을 함유하는 플라스미드를 제2 돌연변이유발 실험에 사용하였다. 이로 인해 생성된 플라스미드(pBSD78-E/Delmut1) 서열을 올리고뉴클레오티드 D78-E/Delmut12-2(표 1, 서열번호 6)을 사용하여 돌연변이시켰다. 생성된 플라스미드를 서열결정하였고, 적절한 플라스미드(pBSD78-E/Delmut12)를 SacⅠ 및 SpeⅠ로, 균주 P2 의 전길이 서열에 따른 뉴클레오티드 868 및 1181에서 절단하였다. 돌연변이된 서열을 함유하는 수득된 단편을 적절하게 절단된 pD78A-E/Del안으로 연결하였다. 생성된 플라스미드 pD78A-E/Delmut12를 서열결정으로 조절하였다. 플라스미드는 아미노산 253, 254, 270 및 284에 대해 교환된 코돈을 함유한다. 여기서, E/Del-서열의 아미노산에 대한 코돈을 D78-서열의 것으로 치환하였다(Q 253 H, S 254 G, A 270 T, A 284 T). 플라스미드 pD78A, pD78A-E/Del 및 pD78A-E/DelMut12는 도 1에 도시되어 있다. 또다른 속(屬)간 플라스미드의 작제를 위해 유용한 플라스미드들을 사용하였다. 이로 인해 전술한 플라스미드 pD78A-E/DelMut12 및 pD78A-E/Del-QH-AT(Mundt, 1999, 상기 참조)를NdeⅠ/NarⅠ로 절단하고 각 플라스미드의 DNA 단편 둘다를 추출해내었다. pD78A-E/DelMut12의NdeⅠ/NarⅠ단편을 pD78A-E/Del-QH-AT의 절단된NdeⅠ/NarⅠ 골격 안으로 연결하여 pD78A-E/DelMut1을 얻었다. 이러한 전략을 사용하여 E/Del- 서열의 아미노산에 대한 하기 코돈을 D78-서열의 것으로 치환시켰다(Q 253 H, S 254 G, A 284 T). E/Del-서열의 아미노산에 대한 하기 코돈을 D78-서열의 것으로 치환된(Q 253 H, 270 T, A 284 T) 플라스미드(pD78A-E/DelMut2)를 얻기 위해서, pD78A-E/Del-QH-AT의NdeⅠ/NarⅠ단편을 pD78A-E/DelMut12 중NdeⅠ/NarⅠ 골격내로 연결시켰다. 플라스미드 pD78A-E/DelMut12, pD78A-E/DelMut1, pD78A-E/DelMut2 및 pD78A-E/DelQH-AT의 지도는 도 2에 도시되어 있다. 표 1은 아미노산 치환을 함유하는 IBDV 세그먼트 A의 전길이 cDNA 클론을 작제하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다*.
(*부위 지정 돌연변이유발법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조성 및 위치. 돌연변이유발을 위한 변화된 뉴클레오티드는 소문자 코드로 표시되어 있고, 변화된 암호화 뉴클레오티드 3문자는 두꺼운 글씨로 표시되어 있다. 프라이머가 결합하는 위치(뉴클레오티드 번호) 및 아미노산의 번호매기기는 균주 P2의 공개된 서열(Mundt 및 Muller, 1995, 상기 참조)에 따른 것이다.)
조직 배양물 내 cRNA으로부터 바이러스 회수
시험관내 전사를 위해 세그먼트 A를 함유하는 플라스미드(pD78A-E/DelMut1, pD78A-E/DelMut2, pD78A-E/DelMut12) 및 pD78B의 RNA를BsrGⅠ 또는PstⅠ로 절단하여 선형으로 만들었다. 하기 두가지 점만 제외하고 Mundt & Vakharia(1996, 상기 참조)에 기술한 바와 같이 선형 DNA의 부가적인 처리 및 전사를 수행하였다: ⅰ) 전사 혼합물을 페놀/클로로포름 추출로 정제하지 않았다; 그리고 ⅱ) Mundt 및 Vakharia(1999, 상기 참조)에 기술된 형질감염 실험을 위해 CEC를 사용하였다. 2일 후 형질감염 세포를 동결/융해시키고, 700×g에서 원심분리하여, 세포 잔해를 제거하고, 형성된 상청액을 0.45㎛ 필터로 여과하여 더욱 정화시키고 -70℃에서 저장하였다. 면역형광 연구를 위해, 멸균 덮개 슬립(slip) 상에서 세포를 성장시켰다. P2의 세그먼트 B를 함유하는 돌연변이체를 전술한 바와 같이 제조하였다.
IBDV 항원의 검출
IBDV 항원을 간접 면역형광 분석법(IFA)으로 검출하였다. 형질감염된 CEC의 상청액을 CEC 상에서 계대배양하였다. IFA를 위해 덮개 슬립상에서 성장한 CEC를 계대배양 실험으로부터 나온 상청액과 항온배양하였다. 16시간 후 세포를 아세톤으로 고정하고 IFA를 위해 처리하였다.
결과
키메라 cRNA로 한 형질감염 실험
형질감염 실험을 위해, 키메라 세그먼트 A의 전길이 cDNA 클론(pD78A-E/DelMut1, pD78A-E/DelMut2, pD78A-E/DelMut12)을 합성 cRNA로 전사시키고, 세그먼트 B(pD78B 또는 pP2B) 전길이 cRNA와 함께 CEC에 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 동결/융해시키고, 형성된 상청액을 CEC상에서 한번 계대배양하였다. 동결/융해 형질감염 및 계대배양 후, CEC를 사용하여 IFA에 의해 IBDV 항원 시험을 상청액에 대하여 수행하였다. 플라스미드 pD78B 또는 pP2B 유래의 cRNA를, pD78A-E/DelMut1와 함께 형질감염시켜서 돌연변이 바이러스 pD78A-E/DelMut1(표준/변종 E (TC)-254(Gly)//D78B)를 생성시키고, pD78A-E/DelMut2와 함께 형질감염시켜서 돌연변이 바이러스 pD78A-E/DelMut2(표준/변종 E (TC)-270(Thr)//D78B)를 생성시키고, pD78A-E/DelMut12와 함께 형질감염시켜서 돌연변이 바이러스 pD78A-E/DelMut12(표준/변종 E (TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B)를 생성시켰으며, 이들은 균주 P2의 지놈성 세그먼트 B를 포함하는 돌연변이체(Mut1//P2B, Mut2//P2B 및 Mut12//P2B)에 해당한다.
실시예 2
A. IBDV V78/변종 E (BU) 및 (TC) 돌연변이체의 특성
Mundt(1999, 상기 참조)에 의해 개시된 두개의 선행 IBDV 돌연변이체 D78/변종 E(BU)(D78A-E/Del로 지칭됨) 및 D78/변종 E(TC)(D78A-E/Del-QH-AT-SR로 지칭됨)의 생물학적 특성이 확인되었다.
재료 및 방법
백신접종 14일 후 감염 바이러스(독성 IBDV 균주 변종 E)를 투여하여 얻은 감염에 대한 내성을 측정함으로써 다른 백신의 효과를 평가하였다. 조사되는 백신은 백신 D78/변종 E(BU) 및 (TC), 및 시판되는 표준 백신 노빌리스(Nobilis) 균주 D78(Intervet International BV, 네덜란드)이었다. (BU) 백신, 102.0EID50/동물 을 2주령 때 점안제 경로(eye-drop route)로 적용시켰다. (TC) 백신, 105.5또는 103.5TCID50/동물 을 2주령 때 각각 소적으로 눈 경로(eye-drop route)를 통해 또는 근육내 주사를 통해 적용시켰다. 시판되는 표준 백신 노빌리스 균주 D78, 103.3TCID50/동물 을 2주령 때 각각 소적으로 눈 경로(eye-drop route)를 통해 적용시켰다. 파브리시우스의 활액낭 중 IBDV의 존재 및 각 그룹당 5마리 동물의 활액낭 중 미세한 상해를 백신접종 3일, 7일, 10일 및 13일 후에 그리고 감염 3일 후에 조사하였다.
이 실험 및 하기 실험들에서 감염에 대한 보호는 (ⅰ) 감염 3일 후 급성 상해, (ⅱ) 감염 3일 후 활액낭 중 바이러스성 항원 및 (ⅲ) 5의 상해 점수(100% 림프구 고갈)를 측정함으로써 평가하였다.
결 과
(ⅰ) 백신접종 3일, 7일, 10일 및 13일 후 및 감염 10일 후 활액낭 중 미세한 상해 평균 점수
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, IBDV(BU) 균주는 백신접종 7일 후 이미 완전한 림프구 고갈을 유도하였다. TC 적응된 IBDV 균주는 백신접종후 상해를 유도하지 않았다. 시판되는 백신은 백신접종 후 가볍거나 온화한(mild to moderate) 상해를 유도하였다. 또다른 데이터는 D78/변종 E(BU) 돌연변이체 또는 D78로 백신접종된 동물이 감염으로부터 보호되었다는 것을 보여주었다. 그러나, 눈 또는 근육내 경로를 통해 D78/변종 E(TC) 돌연변이체로 백신접종된 동물은 감염 후 (서로 다른 수준의) 급성 상해로 진전되었고, 이는 각각 불충분하고 부분적인 보호만이 가능하다는 것을 의미한다.
감염 3일 후 대조 동물들 모두는 급성 상해를 나타내고 100% 림프구가 고갈된 바와 같이 보호되지 않았다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | |||||
| 바이러스 | 3 | 7 | 10 | 13 | 3 | 10 |
| D78/변종 E(BU) | 3.2 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 4.4C | 4.7 |
| D78/변종 E(TC)(oc) | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.0A | 4.1 |
| D78/변종 E(TC)(im) | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.0A | 2.8 |
| 노빌리스 균주 D78 | 0.2 | 2.2 | 2.0 | 1.8 | 2.8C | 1.9 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 5.4A |
(oc) = 눈 경로; (im) = 근육내 경로; C = 만성 상해; A = 급성 상해
(ⅱ) 백신접종 3일, 7일, 10일 및 13일 후 그리고 감염 3일후 활액낭 중 IBDV의 ELISA 시스템에 의한 검출
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, D78/변종 E(BU) 바이러스는 백신접종 후 3일 및 7일 후에 분리할 수 있었다. 감염 3일 후에는 바이러스를 전혀 검출할 수 없었으며, 이는 동물이 감염으로부터 보호었다는 것을 의미한다. 반면, 조직 배양에적응된 균주 D78/변종 E(TC)로 백신접종된 동물들에서는 백신 바이러스를 전혀 분리할 수 없었다. 감염 3일 후 눈 경로를 통해 백신접종된 동물 5마리 중 4마리는 감염 바이러스를 함유하였다. 감염 3일 후, 근육내 경로를 통해 백신접종된 동물 5마리 중 2마리는 감염 바이러스를 함유하였다. 눈 또는 근육내 경로를 통해 D78/변종 E(TC)로 백신접종된 동물들은 각각 20% 또는 60%가 보호되었다는 것을 의미한다. 시판되는 백신 바이러스는 백신접종 3일, 7일 및 10일 후에 분리될 수 있었다. 감염 3일 후 바이러스를 전혀 검출할 수 없었으며, 이는 동물이 감염에 대해 보호되었다는 것을 의미한다.
모든 대조군 동물은 활액낭 중 바이러스 항원을 보유한다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | |||||
| 바이러스 | 3 | 7 | 10 | 13 | 3 | % 보호 |
| D78/변종 E(BU) | 4/5* | 5/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| D78/변종 E(TC)(oc) | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 4/5 | 20 |
| D78/변종 E(TC)(im) | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 2/5 | 60 |
| 노빌리스 균주 D78 | 1/5 | 2/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 8/8 | 0 |
(oc) = 눈 경로; (im) = 근육내 경로; * 조사된 총 수에 대해 바이러스 항원를 갖는 동물의 숫자
B. 광범위한 표준/변종 E(TC)IBDV 돌연변이체의 특성
재료 및 방법
IBDV 백신의 제조
초기 닭 배 섬유아세포(CEF)를 최종 농도 2×106/㎖로 제조하였다. 이 세포를 5% 태아 소 혈청을 함유하는 이글 최소 필수 배지에서 배양하였다. 이 세포 현탁액 15㎖에 IBDV-균주 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(=Mut12)(계대 수준 2에서) 0.1㎖를 첨가하였다. 37℃의 고습도 항온배양기에서 3-6일간 항온배양한 후 상청액(계대 수준 3)을 취하여 동물 실험 1을 수행하였다. 상청액을 희석하여 백신 용량 103.0, 104.0또는 105.0TCID50/동물로 만들었다.
제2 동물 실험을 위해, IBDV 균주 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)을 더 정제하였다. 3회 플라크 정제를 수행하였다. 이어서 전술한 방법과 동일하게 바이러스를 배양하였다. 9번째 계대 수준(P9)을 제2 동물 실험에 사용하였다. 시판되는 표준 IBDV 백신 노빌리스 균주 D78(Intervet International BV, 네덜란드)를 제2 실험에 사용하였다.
실험 1.
생후 14일된 SPF 새에서 광범위한 백신 바이러스 균주 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)의 안정성 및 유효성 특성을 연구하기 위해 동물실험을 수행하였다. 백신 바이러스는 소적으로 눈 경로로 또는 근육내 경로로 적용되었다. 백신접종 후 IBDV-항원을 함유한 활액낭으로부터 바이러스를 CEF 상에 재분리하였다. 백신접종 14일 후, 감염 바이러스(독성 IBDV 균주 변종-E)를 투여하여 얻은 혈청 반응 및 감염에 대한 내성을 측정함으로써 광범위한 백신 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)의 유효성을 평가하였다. 백신접종 3일 및 14일 후 그리고 감염3일 및 10일 후 파브리시우스의 활액낭 중 IBDV의 존재 및 각 그룹 당 5-15마리의 동물의 활액낭 중 미세한 상해를 조사하였다. 감염에 대한 보호를 측정하였다. 나아가, 표준 및 변종 E 바이러스에 대한 혈청 반응을 VN-시험으로 백신접종 14일 후에 측정하였다.
실험 2.
제2 유효성 시험에서, 소적으로 눈 경로를 통해 굼보로 백신 균주 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)을 투여하고 14일 후 감염 바이러스를 투여하여 얻은 혈청 반응 및 감염에 대한 내성을 측정함으로써 백신의 효과를 측정하였다.
생후 14일된 닭을 3그룹으로 나누었다. 한 그룹은 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P9)으로 백신접종하고, 또 한 그룹은 원래 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3)으로 백신접종하고, 나머지 한 그룹은 시판되는 백신 노빌리스 굼보로 D78로 백신접종하였다.
백신접종 3일, 7일 및 14일 후, 각 그룹 당 3-15마리 닭들로부터 활액낭을 취하였다. 상해 및 바이러스성 항원의 존재에 대해 활액낭을 검사하였다. 백신접종 14일 후, 동일 연령 및 공급원의 백신접종되지 않은 SPF 닭 4마리를 각 그룹에 첨가하였다. 모든 동물로부터 혈액을 채취하고 소적으로 눈 경로를 통해 독성 IBDV 균주 F52/70로 동물들을 감염시켰다. 10일동안, 임상 징후 및 사망율을 기록하였다. 감염 3일 후에, 각 그룹당 5마리 닭으로부터 활액낭을 분리하였다. 상해 및 바이러스성 항원에 대해 활액낭을 검사하였다. 감염 10일 후, 생존한 동물 유래의 활액낭에 대하여 미세 상해의 존재를 검사하였다.
결과
실험 1.
(ⅰ) 백신접종 3일 및 14일 후 그리고 감염 10일 후 활액낭 중 미세 상해의 평균 점수
표 4에 그 결과가 표시되어 있다. 백신접종되지 않은 대조 동물은 보호되지 않았으며, 감염 3일 및 10일 후 감염 바이러스는 급성 상해 및 완전한 림프구 고갈을 유도하였다. 반면, 광범위한 백신 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)는 백신접종 후 오직 가볍거나 온화한 상해만을 유도하였다. 나아가, 감염 3일 후 가볍거나 온화한 만성 상해만이 관찰되였는데 이는 동물이 독성 변종 E IBDV에 의한 감염으로부터 보호되었다는 것을 의미한다. 감염 후 10일 후 백신접종된 그룹에 있는 상해는 더 감소되었다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | ||||
| 경로 | 용량 | 3 | 14 | 3 | 10 |
| ED | 2.7 | 0 | 3.6 | 3.0C | 2.3 |
| ED | 3.7 | 2.8 | 3.4 | 4.0C | 1.5 |
| ED | 4.7 | 2.6 | 2.8 | 3.0C | 1.9 |
| IM | 2.5 | 0 | 2.2 | 1.6C | 1.4 |
| IM | 3.5 | 0 | 3.2 | 1.0C | 1.0 |
| IM | 4.5 | 0.8 | 1.8 | 2.0C | 1.3 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 5.0A | 5.0 |
ED = 소적으로의 눈 경로; (IM) = 근육내 경로; C = 만성상해; A = 급성상해
(ⅱ) IBDV에 대한 혈청 반응
VN-IBDV-바이러스로서 표준 그리고 변종-E 균주를 사용하였다. 표 5로부터표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3)가 IBDV의 표준 균주 뿐만 아니라 IBDV의 변종 E 균주에 대해서도 유익한 혈청 반응을 유도하였다는 것을 알 수 있으며, 이는 광범위한 바이러스 특성을 의미하는 것이다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | ||
| 경로 | 용량 | ||
| ED | 2.7 | 8.2 ±1.3 | 8.3 ±1.1 |
| ED | 3.7 | 8.0 ±1.4 | 7.7 ±1.5 |
| ED | 4.7 | 7.6 ±1.4 | 8.0 ±1.7 |
| IM | 2.5 | 7.6 ±1.1 | 7.4 ±1.8 |
| IM | 3.5 | 7.5 ±1.7 | 7.2 ±2.0 |
| IM | 4.5 | 8.1 ±0.9 | 7.1 ±1.4 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | <4.0 ±0.0 | <4.0 ±0.0 |
ED = 소적으로의 눈 경로; (IM) = 근육내 경로
(ⅲ) 백신접종 3일 및 14일 후 그리고 감염 3일 후 활액낭 중 IBDV의 ELISA 시스템에 의한 검출
표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 더 높은 용량으로 백신접종된 동물에서 백신접종 3일 후 바이러스를 분리할 수 있었다. 감염 3일 후 백신접종된 동물에서는 전혀 바이러스를 검출할 수 없었으며, 이는 모든 동물이 감염으로부터 보호되었다는 것을 의미한다. 반면, 대조 동물 모두는 감염 후 활액낭 내에 바이러스성 항원을 함유하였다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | ||||
| 경로 | 용량 | 3 | 14 | 3 | % 보호 |
| ED | 2.7 | 0/5* | 15 | 0/5 | 100 |
| ED | 3.7 | 4/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| ED | 4.7 | 3/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| IM | 2.5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| IM | 3.5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| IM | 4.5 | 2/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 12/12 | 0 |
(ED) = 소적으로의 눈 경로; (IM) = 근육내 경로; * 조사된 총 수에 대해 바이러스성 항원를 갖는 동물의 숫자
실험 2.
(ⅰ) 백신접종 3일 및 14일 후 그리고 감염 3일 및 10일 후 활액낭 중 미세 상해 평균 점수.
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 백신접종되지 않은 대조 동물은 보호되지 않았으며, 감염 3일 및 10일 후 감염 바이러스는 완전한 림프구 고갈을 유도하여 감염 후 급성 상해를 산출하였다. 반면 광범위한 백신 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)은 백신접종 후 가볍거나 온화한 상해를 유도하였다. 나아가, 감염 3일 후 가볍거나 온화한 만성 상해가 관찰되었는데, 이는 동물이 표준 독성 IBDV 균주 F52/70에 의한 감염으로부터 보호되었다는 것을 의미한다. 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)P9로 백신접종된 그룹에서, 한 마리가 감염 3일 후 심각한 급성 상해를 나타내었는데, 이는 보호되지 않았다는 것을 의미한다. 감염 10일 후 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)로 백신접종된 동물의 활액낭 중 상해는 더 감소되었고 모두 가볍거나 온화하였는데, 이는 모든 조사 동물들이 보호되었다는 것을 의미한다. 표 7은 계대 수준 3 또는 9에서 노빌리스 굼보로 D78 및 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr) 균주의 활액낭 상해 평균 점수에 관한 것이다.
| 보호 | 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | ||||
| 백신 | 용량 | (%) | 3 | 14 | 3 | 10 |
| 계대 9 | 3.6 | 95 | 2.8 | 4.3 | 3.3 | 1.9 |
| 계대 3 | 4.1 | 100 | 2.6 | 4.0 | 3.5 | 2.3 |
| 노빌리스 D78 | 5.1 | 74 | 0 | 3.3 | 2.5 | 2.5 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 0 | 5.0 | 5.0 |
(ⅱ) IBDV에 대한 혈청 반응
VN-IBDV로서 표준 균주 및 변종-E 균주를 사용하였다. 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3 및 P9)는 IBDV의 표준 균주 뿐만 아니라 IBDV의 변종-E 균주에 대하여 유익한 혈청 반응을 나타냈는데, 이는 바이러스의 광범위한 특성을 의미한다. 반면, D78로 백신접종된 그룹(용량 5.1 log10)은 표준 바이러스 및 변종 E 바이러스 각각 8.8 log2 및 5.9log2에 대해 평균적인 혈청 반응을 유도하였으며, 이로부터 명확하게 이 백신의 표준 특성을 확인하였다.
| 표준 VN 바이러스 | 변종-E VN 바이러스 | ||
| 백신 | 용량 | ||
| 계대 9 | 3.6 | 7.3 ±1.8 | 7.3 ±1.5 |
| 계대 3 | 4.1 | 8.4 ±1.7 | 7.8 ±1.8 |
| D78 | 5.1 | 8.8 ±3.4 | 5.9 ±1.8 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | <4.0 ±0.0 | <4.0 ±0.0 |
(VN-역가는 희석의 log2로 표현함)
(ⅲ) 백신접종 3일, 7일 및 14일 후 그리고 감염 3일 후 활액낭 중 IBDV의 ELISA 시스템에 의한 검출.
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 바이러스를 백신접종 3-14일 후에 분리할 수 있었다. 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr) 계대 9로 백신접종한 한 마리의 동물에서만 감염 3일 후 바이러스를 검출할 수 있었으며, 이는 이 동물이 감염으로부터 보호되지 않았다는 것을 의미한다. 기타 다른 동물들은 감염으로부터 보호되었다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | |||||
| 백신 | 용량 | 3 | 7 | 14 | 3 | % 보호 |
| 계대 9 | 3.6 | 0/5* | 2/3 | 0/3 | 1/4 | 75 |
| 계대 3 | 4.1 | 0/5 | 2/3 | 0/3 | 0/4 | 100 |
| D78 | 5.1 | 1/5 | 2/3 | 1/3 | 0/4 | 100 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | 9/9 | 0 |
* 조사된 총 동물 수에 대하여 바이러스성 항원이 존재하는 양성 동물의 숫자
[실시예 3] 광범위한 IBDV 돌연변이체의 안정성 및 유효성
재료 및 방법
다른 광범위한 백신 바이러스 균주의 안정성 및 유효성 특성을 조사하기 위해 또다른 동물 실험을 수행하였다. 광범위한 바이러스 균주는 굼보로 바이러스 균주 D78 또는 P2 유래의 세그먼트 B에 변화가 있는 것이었다. 나아가, 굼보로 균주는 세그먼트 A에서 2개의 변화(위치 254 및 270) 중 오직 하나만이 도입된 것으로이 균주를 조사하였다. 이 실험에서, 백신의 효과는 굼보로 백신 균주를 투여하고 14일 후, 감염 바이러스(F52/70)를 투여하여 얻은 혈청 반응 및 감염에 대한 내성을 측정함으로써 백신의 효과를 평가하였다. 조사된 백신은 하기와 같은 광범위한 백신 바이러스 균주이었다:
표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B
표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B
표준/변종 E(TC)-254(Gly)//D78B
표준/변종 E(TC)-254(Gly)//P2B
표준/변종 E(TC)-270(Thr)//D78B
표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B.
103.4및 104.8TCID50/동물 사이의 용량에서 상이한 광범위한 백신을 3주령될 때 소적으로 눈 경로로 적용시켰다. 파브리시우스의 활액낭 중 IBDV의 존재 및 각 그룹당 5 마리의 활액낭 중 미세 상해를 백신접종 3일 및 14일 후 그리고 감염 3일 및/또는 10일 후에 조사하였다. 감염으로부터 보호를 측정하였다. 나아가, 표준 바이러스 및 변종-E 바이러스에 대한 혈청 반응을 백신접종 14일 후 VN-시험으로 측정하였다.
결과
(ⅰ) 활액낭 중 미세 상해 평균 점수 및 IBDV-항원의 검출
결과는 표 10 및 11에 나타나 있다. 모든 IBDV 돌연변이체는 감소된 독성을나타낸다. 균주 D78 중 세그먼트 B를 갖는 돌연변이체는 온화한 상해를 유도하는 반면, 균주 P2 중 세그먼트 B를 갖는 돌연변이체의 약독화된 특성은 더욱 온화한 특성을 나타낸다. 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B는 40%의 보호를 나타내었다. 소적으로 눈 투여된 후 효과적이지 않은 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B를 제외한 다른 균주들은 감염 3일 후 완전한 보호를 유도하였다(오직 만성 상해만 존재함). 기타 모든 그룹들은 감염 10일 후 가볍거나 온화한 상해를 나타냈다.
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | |||
| 바이러스 | 3 | 14 | 3 | 10 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B | 0.0 | 3.4 | 3.6A/C | 1.5 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//D78B | 0.0 | 3.0 | 3.8C | 2.7 |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//D78B | 0.4 | 4.2 | 4.6C | 3.0 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B | 0.8 | 2.0 | 1.4C | 1.5 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//P2B | 0.8 | 2.0 | 2.6C | 1.6 |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B | 0.0 | 0.0 | 5.0A | 5.0 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | ND | 0.0 | 5.0A | 5.0 |
C = 만성 상해; A = 급성 상해
| 백신접종 후 일수 | 감염 후 일수 | |||
| 바이러스 | 3 | 14 | 3 | % 보호 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B | 0/5* | 0/5 | 3/5 | 40 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//D78B | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//D78B | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B | 2/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//P2B | 1/5 | 0/5 | 0/5 | 100 |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B | 0/5 | 0/5 | 8/8 | 0 |
| 백신접종되지 않은 대조군 | ND | ND | 13/13 | 0 |
* 조사된 총 수에 대해 바이러스성 항원이 존재하는 양성 동물의 수.
(ⅱ) IBDV에 대한 혈청 반응
VN-IBDV 바이러스로서 표준 균주 및 변종-E 균주를 사용하였다. 표 12에 나타난 바와 같이, IBDV 백신 균주는 IBDV의 표준 균주 뿐만 아니라 IBDV의 변종 E 균주에 대하여 유익한 혈청 반응을 유도하였다. 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B 돌연변이체는 바이러스를 소적으로 눈으로 투여한 수 채취되지 않았다. 표 12는 백신접종 14일 후 혈청 반응(VN-역가는 희석의 log2로 표현함)에 관한 것이다. x=는 25중 4가 반응하지 않았다. y=25중 1이 반응하지 않았다. z=25중 2가 반응하지 않았다.
| 표준 VN 바이러스 | 변종-E VN 바이러스 | |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B | 7.9 ±2.2x | 6.7 ±1.9x |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//D78B | 8.0 ±1.5y | 8.2 ±1.4 |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//D78B | 9.0 ±1.6y | 8.8 ±1.4 |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B | 7.7 ±1.6y | 6.7 ±1.5z |
| 표준/변종 E(TC)-254(Gly)//P2B | 7.5 ±1.8z | 6.8 ±1.7y |
| 표준/변종 E(TC)-270(Thr)//P2B | <4.0 ±0.0 | <4.0 ±0.0 |
| 백신접종되지 않은 대조군` | <4.0 ±0.0 | <4.0 ±0.0 |
본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체는 2이상의 IBDV 아류형의 독성 균주에 대하여 닭에게 보호 면역을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 IBDV 돌연변이체는 독성 IBDV 변종 E 균주에 대한 보호를 제공하고 동시에 생 IBDV 백신접종에 통상 사용되는 대량 사용 기술로 투여될 수 있다.
Claims (10)
- 바이러스 지놈 중 세그먼트 A에 있는 변종 E VP2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고 CEF 조직 배양에서 감염 및 복제될 수 있는 IBDV 돌연변이체로서, 변종 E VP2 암호화 영역 내에서 (ⅰ) 위치 254의 아미노산에 대한 코돈이 글리신을 암호화하고/하거나 (ⅱ) 위치 270의 아미노산에 대한 코돈이 트레오닌을 암호화하도록 하나이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 IBDV 돌연변이체.
- 제1항에 있어서, 아미노산 254의 코돈은 GGC이고/이거나 아미노산 270의 코돈은 ACG인 것이 특징이 IBDV 돌연변이체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 변종 E VP2 단백질 중 253-284 단편에 대한 암호화 영역이 IBDV의 D78 균주 중 해당 암호화 영역으로 치환된 것이 특징인 IBDV 돌연변이체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세그먼트 A의 골격은 표준 아류형의 IBDV, 바람직하게는 IBDV 균주 D78인 것이 특징인 IBDV 돌연변이체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 지놈 중 세그먼트 B는표준 IBDV 균주의 것, 바람직하게는 균주 D78 또는 P2의 것인 것이 특징인 IBDV 돌연변이체.
- IBDV 감염에 의해 야기되는 질병에 대하여 가금류를 보호하기 위해 사용되고, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IBDV 돌연변이체를 약학적 허용 담체 또는 희석제화 함께 포함하는 것이 특징인 백신.
- 제6항에 있어서, IBDV 돌연변이체는 생(生) 형태인 것이 특징인 백신.
- 대량 사용 경로를 통해 투여하기 위한 백신의 제조에 있어서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IBDV의 용도.
- IBDV 감염에 의해 야기되는 질병에 대해 가금류를 보호하는 방법에 있어서, 제6항 또는 제7항에 따른 백신을 동물에 투여하는 것이 특징인 방법.
- 제9항에 있어서, 백신은 대량 사용 경로를 통해 투여되는 것이 특징인 방법.
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