CN1257973C - 一种广谱的传染性鸡囊病病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供广谱IBDV疫苗，其能够诱导抗经典及变种E IBDV病毒株的保护性免疫应答，而且。该疫苗能够通过大量应用途径给予禽类。

Description

一种广谱的传染性鸡囊病病毒疫苗
本发明涉及一种在IBDV病毒基因组A节段中含有编码变种E VP2蛋白的核苷酸序列且能够在CEF组织培养物中进行感染和复制的IBDV突变株，本发明还涉及含有该突变株的疫苗和该突变株在生产疫苗中的用途。
传染性鸡囊病病毒(IBDV)是双RNA病毒科(Birnaviridae)的一个成员。该科的病毒具有极为相似的基因组结构及类似的复制周期。这些病毒的基因组由两个双链(ds)RNA节段(A及B)组成。较大一点的节段A编码一个多蛋白，其被自我蛋白酶解切割形成成熟的病毒蛋白VP2、VP3及VP4。VP2及VP3均为病毒体的主要结构蛋白。VP2是双RNA病毒的主要的寄主保护性免疫原，其含有负责诱导中和抗体的抗原区域。VP4蛋白是病毒编码的蛋白酶，参与VP2、VP3及VP4蛋白的前体多蛋白的加工过程。较大一点的节段A还含有另一个开放阅读框(ORF)，其位于该多蛋白基因的前面并与之部分重叠。该开放阅读框编码一未知功能的蛋白VP5，其存在于IBDV感染的细胞中。小一点的节段B编码VP1，VP1为90kDa的多功能蛋白，具有聚合酶和加帽酶的活性。
对于IBDV，存在两种血清型，血清型1及血清型2。这两种血清型可通过病毒中和实验(VN)而区分。而且，血清型1的亚型已被分离。这些血清型1的所谓“变种”病毒可通过交叉中和实验、一组单克隆抗体或RT-PCR进行鉴别。这些IBDV血清型1的亚型已在文献中进行了描述，例如：经典株，变种-E、GLS、RS593及DS326株(Van Loon，等.有关传染性鸡囊病及鸡感染性贫血症的国际研讨会论文集(Proceedings of the International symposium on infections bursaldisease and chicken infections anaemia)，Rauischholzhausen，德国，179-187，1994)。
传染性鸡囊病(IBD)，也称为Gumboro疾病，是一种鸡的急性、高接触传染性病毒传染病，以淋巴组织为主要靶器官，选择性靶向法布里丘斯囊细胞。易感鸡群中的发病率是非常高的，并伴有体重骤减及中度的死亡率。从该种疾病中康复的鸡因为其法布里丘斯囊的损坏可能是免疫缺陷的，这是因为法布里丘斯囊对于鸡的防御功能是必需的。IBD-病毒在低于三周龄的鸡群中可导致严重的免疫抑制并在达到三个月龄的鸡群中导致法布里丘斯囊的病变。
多年来，该疾病都是采用如下方法来预防：向经IBDV减毒活疫苗初免过的种鸡施用灭活疫苗，以诱发生成高水平抗体。这样可以使IBD导致的经济损失降低至最低。小鸡中来自接种过的种鸡的母源抗体防止了早期IBDV感染，且减少与免疫抑制有关的问题。此外，减毒的活疫苗也已成功用于母源抗体减少的商品鸡群。
最近，IBDV的强毒株导致该疾病在欧洲的爆发，死亡率很高。现有的免疫方案无法成功地保护禽类，其主要是因为活疫苗无法在野强毒株侵入之前感染禽类。
在免疫过的禽类中出现急性疾病的另一个原因是八十年代中期抗原变种的出现，此情形尤其出现在美国。IBDVs血清型1的最重要的新抗原亚型为Delaware变种E及GLS毒株。截止这个时间之前，所使用的疫苗仅仅是基于传统类型的活的减毒或灭活IBDV株。然而，尽管传统的IBDV疫苗株对鸡诱导一定程度的抗其它亚型株的交叉感染(反过来也是这样)，但用基于仅仅一种病毒亚型的疫苗进行免疫的结果导致相当大经济损失的持续发生。
由于本领域的这些发展，很有必要将传统的及变异的IBDV亚型疫苗株结合至IBDV疫苗中以获取广谱的保护。
如上所述，本领域通常使用基于传统毒株的活的和灭活的疫苗。灭活的传统疫苗普遍以注射形式给予，而活的传统疫苗或以注射形式或者以更为廉价的、大量应用(mass application)技术如喷雾、气雾及饮用水进行接种。
所鉴别的Delaware变种E病毒具有极高毒力，仅能以灭活疫苗的形式给予。截至现在，仅有一例成功的实验在细胞培养物中改变及减弱了E株变种的病毒。该疫苗株命名为89/03，能够诱导抗E变种感染的保护，但其具有通过大量应用途径无法为机体摄取的缺陷。该病毒疫苗需要以皮下注射或肌内注射的形式给药(Hein等，第43届西方家禽疾病会议论文集(Proceedings of the 43th WesternPoultry disease Conference)，第102-103页，1994，Sacramento，USA)。
对于保护禽类不受IBDV的GLS亚型的感染，仅仅可以使用灭活的疫苗。
Mundt(J.Gen.Virology 80，2067-2076，1999)在分子水平鉴别出允许IBDV病毒株(其仅能在法布里丘斯囊中进行体内感染和增殖)在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)组织培养物中也可感染和复制的结构要求。在VP2蛋白中位置253(Gln变为His)及284处(Ala变为Thr)两个氨基酸残基的替换，对于IBDV粘液囊株(BU)感染CEF及其它组织培养物为必要和充分的。具体而言，该文献公开了两个具有组织培养物(TC)表型的嵌合D78/变种E IBDV突变株。
因此，有必要发展一种通过大量应用途径接种也能有效的Delaware变种E的IBDV减毒活疫苗。更进一步讲，需要获取广谱IBDV疫苗株以提供抗IBDV两个或更多亚型的充分的保护。这样一种广谱的疫苗可以避免制备每一IBDV亚型的单个疫苗病毒并将其配制成联合疫苗的麻烦。
本发明的目的就是提供一种IBDV突变株，其能够在鸡禽中诱导抗至少两种IBDV亚型病毒株的保护性免疫，本发明的另一目的是提供一种IBDV突变株，其可以抗IBDV变种E株而产生保护反应，且同时其可以采用接种IBDV活疫苗时普遍使用的大量应用技术来给予。
现在已经发现，这些目的通过提供一种IBDV突变株得以实现，该突变株在病毒基因组A节段中含有编码变种E VP2蛋白的核苷酸序列，并能够在CEF组织培养物中进行感染和复制，其特征在于该突变株在VP2编码区域中包含一个或多个突变，使得：
(i)编码第254位氨基酸的密码子编码甘氨酸，且/或
(ii)编码第270位氨基酸的密码子编码苏氨酸。
本发明人发现，Mundt等(1999，同上)发现的有着变种E株的培养(BU)及免疫原性特征的IBDV D78/变种E嵌合粘液囊(BU)突变株，具有强毒力，且接种后可导致鸡完全的淋巴细胞衰竭(lymphocyte depletion)。更进一步，在实施例2中已经显示该株相应的组织培养物(TC)突变株却是低毒力的，且如果是以注射的形式给予的话能够诱导部分的保护性免疫反应。然而同时，如果突变株是以眼睛途径(饮用水给药的一种模型)给予的话，TC突变株仅诱导水平极低的保护反应。令人吃惊的是，发明人发现将病毒变种E VP2基因中编码254(Ser)和/或270(Ala)位氨基酸的天然密码子进一步突变产生编码氨基酸254(Gly)和/或270(Thr)的密码子，提供了一个活的减毒的IBDV突变株，该突变株：
(i)能够诱导大约同样水平的抗传统和变种E亚型IBDV株的病毒中和(VN)抗体滴度，
(ii)能够在接种动物中诱导产生抗高毒力的传统和变种E亚型IBDV株的保护反应，
(iii)如果以大量应用途径给予的话能够诱导产生保护反应。
IBDV亚型在本领域已经很好地进行了定义，例如通过其与单克隆抗体的反应模式来进行定义。IBDV的变体E亚型与病毒中和抗体Moab67发生特异性反应，该抗体由Dave Snyder于1992年9月14日提交保藏于ATCC，保藏号为HB 11122(同样可以参见，Vakharia等，病毒研究(Virus Research)31，265-273，1994)。
将能产生本发明IBDV突变株的突变导入变种E VP2蛋白的编码区域内编码氨基酸254(Ser)和/或270(Ala)的密码子处。
按照本发明的具有优点的IBDV突变种在这两个密码子上或仅在编码氨基酸254的密码子上包含预期的突变。
在核苷酸位点890(A变为G)及938(G变为A)所发生的替换分别导致了氨基酸位点254(Ser变为Gly)及270(Ala变为Thr)的取代。如上所述，IBD病毒的基因组结构已被很好地阐明。IBDV基因组含有一个较大的A节段及一个较小的B节段。IBDV的A节段含有一个编码大约110kDa(VP2-VP4-VP3；图1)多蛋白的大开放阅读框(ORF)。许多IBDV株的A节段及B节段完整的核苷酸序列已经被确定。此外，ORF中的定位、编码变种E的VP2蛋白的核苷酸序列及变种E的VP2蛋白的氨基酸序列已经为Vakharia等，鸟类疾病(Avian Diseases) 36，736-743，1992；Vakharia等，病毒研究， 31，265-273，1994；Heine等，J.Gen.Virol.，22，1835-1843，1991所确定。此外，包含变种E VP2编码序列(核苷酸647-1725)的DNA片段的核苷酸序列及所述多蛋白的相应氨基酸序列显示于SEQ ID.No.1及2中，它们在实施例中用于产生本发明的IBDV突变株。
本发明中用来标示氨基酸位置的数字采用本领域通用的IBDV多蛋白的氨基酸编号。用于标示核苷酸位置的编号以Mundt及Muller(J.Gen.Virol.77，437-443，1995；NCBI序列号X84034)所述的IBDV基因组A节段的完整核苷酸序列为基础。
Mundt(1999，同上)等已经证实具有经典表型或变体E表型的IBDV株在CEF组织培养物中感染及复制的首先必备的条件是在各自病毒株的VP2基因中编码氨基酸253(His)及284(Thr)的密码子的存在。因此，在CEF组织中显示感染和复制特性的本发明IBDV株尤其包含氨基酸253(His)和284(Thr)。该IBDV病毒株可以通过Mundt(1999，同上)所公开的方法获得，而且，该方法在实施例1中已经描述。
由于遗传密码的简并性，所以编码本发明IBDV突变株多蛋白的氨基酸254(Gly)及270(Thr)的密码子有多种可能。对于VP2编码区的氨基酸254(Gly)，密码子可以为GGA，GGC，GGG或者GGT，优选GGC，而编码氨基酸70(Thr)的密码子可以为ACT，ACC，ACA或者ACG，优选ACG。
具有如下特性的变种E IBDV病毒株可以通过在自然发生的变种E株中引入上述的特定的相关密码子制备而成：(i)在CEF组织培养物中进行感染及复制，及(ii)通过大量应用途经接种可诱导广谱免疫应答。
作为选择，该结果同样可以通过用已知(经典的)IBDV病毒株基因组序列的相应部分置换部分的变种E的VP2编码区而获得，该已知的IBDV病毒株已经在相应位点上具有期望密码子。经典病毒株的全长基因组序列已在美国专利5,871,744(Vakharia及Mundt)及欧洲专利申请98201704.8(Akzo Nobel NV)中公开。
具体讲，按照本发明所提供的一个IBDV突变株含有经典株D78的部分的VP2编码区，该编码区编码含有253-284位氨基酸的VP2蛋白片断且具有如上所述的期望密码子。
按照本发明优选的IBDV突变株包含具有SEQ ID No.3所示核苷酸序列的884-985核苷酸位点的部分D78 VP2编码区。该核苷酸片段取代了变种E VP2编码区相应的片段且编码其内部的如下氨基酸253(His)，254(Gly)，270(Thr)及284(Thr)(SEQ ID No.4)。
按照本发明的IBDV突变株可以包含变种E IBDV株A片段的遗传骨架，其包括如上所述的突变的VP2编码区。然而，按照本发明的IBDV突变株同样可以基于其它IBDV株的遗传骨架，例如，经典株或者GLS株，优选经典株，更具体的是D78株，
在这样一个“嵌合”IBDV突变株中，原初类型IBDV株的A节段遗传骨架上的VP2编码序列为相关变种E相应VP2编码序列所取代，此相应VP2编码序列还包括负责新型IBDV突变株所述有利特征的期望突变。
编码变种E VP2蛋白的VP2编码序列可以包含编码完整的变种E VP2蛋白的(突变)遗传信息(核苷酸位点131-1666)，或者可以包含其编码能够诱导变种E病毒中和抗体的VP2蛋白的片段。在后一种情况中变种E VP2编码序列可以用另一个IBDV亚型的VP2编码序列来补充，使得IBDV突变株能够表达完整的VP2蛋白。
更具体一点讲，这样一个IBDV突变株可以至少包含跨越所谓的VP2基因可变区的(突变的)变种E VP2编码片段。Bayliss等(j.Gen.Virol.71，1303-1312，1990)确定了这一区域位于核苷酸位点745-1182中。
优选地，IBDV突变株包含跨越核苷酸位点647-1666的变种E VP2编码序列，其包括上述期望突变。
该(嵌合)IBDV突变株的获得可以通过利用最近新开发的用于IBDV的感染性cRNA系统来实现(Mundt及Vakharia，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11131-11136，1996)。这一反向遗传学系统创造了在IBDV RNA基因组中引入突变的可能性。在这个反向遗传学系统中最为重要的步骤是提供IBD病毒的A及B节段的全长cDNA克隆，包括这两个节段的5’-及3’-末端核苷酸。克隆后，将A及B节段的全长序列可操作性连接至能与DNA依赖性RNA聚合酶例如T7、SP6或者T3聚合酶结合的启动子上，优选T7-启动子。DNA依赖性RNA聚合酶能够表达分别来自A及B节段全长序列cDNA克隆的病毒cRNA。该cRNA能够诱导病毒的复制及活病毒的分离。该程序可以使用所有天然存在的IBDV进行。
对于不同种IBDV病毒株的反向遗传学系统都已有描述，例如D78(Yao等，病毒学杂志(J.Virol.)， 72，2647-2657，1998)，HK46株(Lim等，病毒学杂志， 73，2854-2862，1999)及CEF 94株(Boot等.，病毒学(Virology)  265，330-341，1999)。
按照本发明的IBDV突变株的B节段可以获自任一IBDV株，优选来自经典的IBDV病毒株，最优选来自病毒株D78或者P2(美国专利5,871,744及欧洲专利98201704.8)。
如上所述包含P2株B节段的IBDV突变株显示尤其有利的减毒及保护性特性，特别是含有氨基酸254(Gly)或者254(Gly)/270(Thr)的突变株。
上述期望突变可以通过本领域用于此目的的已知技术引入IBDV基因组中。尤其是通过定点诱变引入该突变。在IBDV基因组中引入突变的方法在本文也有描述，但同样为本领域所常用(Mundt及Vakharia，1996，同上；Yao等，病毒学杂志72，2647-2654，1998；Mundt等，1999，同上；欧洲专利申请98201704.8；当代分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)，编者：F.M.Ausubel等，Wiley N.Y.，1995版，第8.5.1.-8.5.9页及Kunkel等在酶学方法(Methods in Enzymology)第154卷，376-382，1987。
如实施例中所证明的那样，本发明所述的IBDV突变株表现出极有利的特性，这能够导致新型IBDV疫苗的产生。因此，本发明的另一方面就是用于保护禽类抵抗IBDV感染所致疾病的疫苗。该疫苗包含如上所述的IBDV突变株及可药用载体或稀释剂。
此IBDV突变株可以以活的减毒病毒或灭活病毒的形式掺入至疫苗中，但优选活的形式，因为其允许本发明IBDV突变株的所有优势特性都能够得到使用。
按照本发明的疫苗可以通过传统的方法例如普遍使用的商业上已有活性或灭活疫苗的生产方法来制备。简单地说，用本发明所述IBDV突变株接种易感底物，增殖至期望的感染滴度，然后收获含有IBDV的材料。
任一可以支持IBDV突变株复制的底物都可以用于制备本发明的疫苗。包括原代(鸟类)细胞培养物，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)或鸡胚胎肝细胞(CEL)，哺乳动物细胞系例如VERO细胞系或者BGM-70细胞系，或者鸟类细胞系例如QT-35、QM-7或者LMH。通常来讲，细胞经过接种以后，经过3-10天病毒复制，之后收获细胞培养物上清液。如果希望，经过过滤或离心去除细胞碎片。
作为一种选择，IBDV突变株也可以在具胚鸡蛋中进行增殖。具体而言，用于增殖IBDV的底物是SPF具胚鸡蛋。具胚鸡蛋可以通过例如0.2ml含IBDV突变株悬浮液或者匀浆液进行接种，每个鸡蛋含有至少102TCID50，然后在37℃进行培养。经过大约2-5天后通过收集胚胎和/或膜和/或尿囊液然后匀浆该物质来收获IBD病毒产品。匀浆物在2500xg下经过10分钟离心，上清液经过滤膜(100μm)过滤。
本发明所述含有活病毒的疫苗可以以悬浮液或者冷冻干燥的形式制备和销售，另外还可包括药学可接受的通常用于这种组合物的载体或稀释剂。载体包括稳定剂，防腐剂及缓冲剂。合适的稳定剂例如有SPGA，碳水化合物(例如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，右旋糖酐，谷氨酸或者葡萄糖)，蛋白(例如干牛奶血清，白蛋白或者酪素)或者其降解产物。适宜的缓冲液是，例如磷酸碱金属盐。适宜的防腐剂是例如硫汞撒，硫柳汞及庆大霉素等。稀释剂包括水，水性缓冲液(例如缓冲盐水)，醇类及多羟基化合物(例如甘油)。
如果希望的话，按照本发明的活疫苗可以包含佐剂。具有佐剂活性的适宜的化合物或组合物的例子在下面将提到。
尽管按照本发明所述的活疫苗以注射方式给予，例如以肌内或皮下注射或卵内(in ovo)的形式给予是可能的，但是该疫苗优选通过一般用于IBDV接种的廉价大量应用途径给予。对于IBDV接种，该途径包括饮用水、喷雾及气雾接种。
对于通过饮用水途径给予的形式，一般先使动物缺水2-4小时，然后给它们提供含该疫苗的水。对于所有鸟类，饮水空间充足是非常重要的。该疫苗以能确保每一个体都能得到足够的剂量的浓度溶于新鲜饮用水。
为了预防在饮用水中因小量氯、铁、锌或铜离子的存在引起活疫苗病毒显著减少，优选在该含疫苗水中加入保护剂如脱脂乳(粉剂)。
喷雾方法包括粗喷(coarse spray)及气雾剂接种，涉及施用载有活IBDV疫苗的小液态颗粒。在粗喷方式方法中颗粒一般具有最初粒径大小10至100微米，在气雾剂给予方法中一般具有最初粒径大小＜1至50微米。
为了避免因水颗粒干燥所致溶解盐类浓度的增加而使活疫苗病毒灭活，小量的蛋白保护剂例如脱脂乳、脱脂乳粉剂或明胶可被加入至该水相中去。
对于小颗粒的产生，可使用传统的喷雾设备及气雾制发生器，例如商业上可购得的用于背负式喷雾(knapsack spray)、孵卵器喷雾(hatchery spray)及原子喷雾(atomist spray)的喷雾设备。同样也可以使用传统的设备进行饮用水免疫。涉及到喷雾/气雾剂及饮用水免疫的具体细节可以查找″禽类免疫给予纲要″(Compendium，administration of poultry vaccines)，为Gezondheidsdienstvoor Pluiruvee出版，Doom，荷兰，van Eck等，VI-VII，1988。
本发明的另一方面是提供含有IBDV突变株的灭活疫苗。灭活形式的疫苗的最大优点是可以获得抗经典和变种E IBDV病毒株的长久持续时间的高水平保护性抗体。
对增殖后收获的病毒进行灭活的目的是消除病毒的复制。一般来讲，其可以通过本领域已知的物理或化学方式来获得。
含有灭活IBDV突变株的疫苗能够例如含有一种或多种上述药学上可接受的适用于该目的的载体或稀释剂。
优选地，按照本发明的灭活疫苗含有一种或多种具有佐剂活性的化合物。用于该目的的适宜化合物或组合物包括铝的氢氧化物、磷酸盐或者氧化物，基于例如矿物油例如Bayol F或者Marcol 52或者植物油例如维生素E醋酸盐的油包水或水包油乳剂，及皂苷。
按照本发明的疫苗含有有效剂量的IBDV突变株作为活性成分，也就是说，免疫IBDV物质的量可以在接种鸟类中诱导抗强毒力毒株的免疫。这里免疫是指与未免疫群体相比免疫后的鸟类产生高水平的保护。
典型地，按照本发明的活疫苗可以以每一动物102-109TCID50感染剂量50(TCID50)，优选104.0-107.0TCID50的剂量给予。灭活疫苗可以包含相当于每只动物105-109TCID50的抗原量。
灭活疫苗一般是以肠胃外的形式给予，例如肌内或皮下注射。
虽然本发明的IBDV疫苗可以有效用于鸡，但是用该疫苗也可成功地免疫其它禽类例如火鸡，珍珠鸡及鹧鸪。所述鸡包括童子鸡(broilers)，繁殖鸡(reproduction stock)和产蛋鸡(laying stock)。
接受按照本发明活性或灭活疫苗的动物的年龄与接种传统的活性或灭活IBDV疫苗的动物年龄相同。例如，童子鸡(没有母源抗体-MDA)可以在一日龄或者卵内接种，而具有高水平MDA的童子鸡优选在2-3周龄时接种。低水平MDA的繁殖鸡和产蛋鸡可以在1-10日龄接种而后在6-12及16-20周龄时用灭活疫苗加强免疫。
本发明还包括联合疫苗，除了上述IBDV突变株外该联合疫苗含有一种或多种来自其它的禽类易感病原体的免疫原。
优选地，联合疫苗还包含马立克氏病病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征(egg drop syndrove，EDS)病毒、火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)或呼吸道肠道病毒的一种或多种疫苗株。
                             实施例
实施例1 广谱经典/变种E IBDV突变株的制备
材料及方法
病毒及细胞
D78株血清I型(Intervet International BY，Boxmeer，荷兰)在鸡胚胎细胞(CEC)中增殖。将来自具胚SPF卵的CEC在补充10％胎牛血清(FCS)的Dulbeccos极限必需培养基(DMEM)中生长并用于增殖病毒，并对转染上清液传代。转染实验及免疫荧光实验使用鹌鹑肌细胞(QM-7，ATCC)来进行，其在培养基199且补充10％FCS时进行培养
IBDV病毒株B节段全长cDNA克隆的构建
为了D78株血清I型B节段全长cDNA的克隆，将病毒在CEC中进行增殖且经过超速离心进行纯化。将D78株的基因组病毒RNA纯化，反转录为cDNA，且按照标准方法，使用如Mundt及Vakharia(1996，同上)所述的寡核苷酸进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。扩增产物经过末端平端化克隆，含有合适PCR片段的质粒被测序。获取含有处于T7-RNA聚合酶启动子控制下的B片段全长cDNA的质粒(pUC18BD78)的克隆程序对应于Mundt及Vakharia(1996，同上)所描述的用于P2株B节段的程序。
属间IBDV质粒的构建
对于IBDV特定序列的取代，使用含有变种E E/Del株完整编码区的质粒(Vakharia，生物工艺学年评(Biotechnology Annual Review) 3，151-168，1997)。按照P2株(NCBI登记号：X 84034)的全序列，分别在核苷酸647及1725位用限制性酶Nde I及Sal I对pEDEL2BacII进行切割(SEQ ID No.1)，获得一个含有E/Del株的VP2可变区编码序列(Bayliss等，1990，同上)及VP4序列的1078bp片段。连接入已为Nde I及Sal I切割的pD78A/ANB(Mundt，1999，同上)后，构建了嵌合性全长质粒pD78A-E/Del，其含有D78株A节段及E/Del的序列(Mundt，1999，同上)。质粒pD78A-E/Del用于作为定点诱变的基础。
为此，pD78A-E/Del用限制性酶Sac I及Sal I于相应于P2株全长序列核苷酸位点868及1725处切割，并将其克隆进入已合适切割的质粒载体pBS(Stratagene)，获得pBSD78-E/Del。定点诱变实验如前人所述进行(Kunkel等，1992，同上)。使用寡核苷酸D78-E/Delmut12-1(表1，SEQ ID No.5)及质粒pBSD78-E/Del获得核苷酸序列(nt 941-985)的定点诱变。相关序列通过测序进行控制，并用于含有改变序列的质粒来进行第2次诱变实验。为此，所获质粒(pBSD78-E/Delmut1)序列经过使用寡核苷酸D78-E/Delmut12-2(表1，SEQ IDNo.6)来进行诱变。产生的质粒被测序，将一适当的质粒(pBSD78-E/Delmut12)用限制性酶SacI及SpeI于相应于P2株全长序列核苷酸位点868及1181处切割。所获含有突变序列的片段被连接至适当切割后的pD78A-E/Del中。通过测序来控制所产生的质粒pD78A-E/Delmut12。该质粒含有编码氨基酸253，254，270，及284的交换密码子。这里E/Del-序列编码这些氨基酸的密码子为相应D78-序列所取代(Q 253 H，S 254 G，A 270 T，A 284 T)。质粒pD78A，pD78A-E/Del及pD78A-E/DelMut12在图1中已有描述。已有的质粒被用于构建其它属间质粒，为此，将如上描述的质粒pD78A-E/DelMut12及pD78A-E/Del-QH-AT(Mundt，1999，同上)用Nde I/Nar I切割，且每一质粒DNA片段均被洗脱。pD78A-E/DelMut12的NdeI/NarI片段被连接至pD78A-E/Del-QH-AT的NdeI/NarI切割骨架中以获取pD78A-E/DelMut1。按照这个策略，E/Del-序列的下述编码氨基酸的密码子为相应的D78-序列(Q 253 H，S 254 G，A 284 T)所取代。为了获取质粒(pD78A-E/DelMut2)，其中E/Del-序列下述的编码氨基酸的密码子为相应D78-序列(Q 253H，A 270T，A 284 T)所取代，将pD78A-E/Del-QH-AT的NdeI/NarI片段连接至pD78A-E/DelMut12的NdeI/NarI骨架中。质粒pD78A-E/DelMut12，pD78A-E/DelMut1，pD78A-E/DelMut2，及pD78A-E/DelQH-AT的图谱描述于图2。
表1用于构建包含氨基酸取代的IBDV株A节段全长cDNA克隆的寡核苷酸*
  名称   核苷酸序列   方向   氨基酸取代 核苷酸顺序号
  D78-E/Delmut12-1D78-E/Delmut12-2   GCCGGtCGTCAGCCCATTGTTTGCGGCCACAGCcCTGGTGATTACTACCGttGTCCCATCAAAGCCTATgAGGTAGATGGTGGCGCCCAGTACAAGGCcgTGGAC   反义反义   A284TQ253HS254GA270T 941-985884-943
*用于定点诱变的寡核苷酸引物的组成及定位。突变的变化核苷酸为小写字母且改变的编码核苷酸三联体以粗字体突出显示。引物结合位点(核苷酸顺序号)及氨基酸编号均按照公开的P2株序列(Mundt Muller，1995，同上)。
在组织培养物中从cRNA获取病毒
为了进行RNA的体外转录，通过BsrGI或者Pst I切割对含有A节段(pD78A-E/DelMut1，pD78A-E/DelMut2，pD78A-E/DelMut12)及pD78B质粒线性化。线性化的DNA的进一步处理及转录如Mundt和Vakharia(1996，同上)所描述的那样，有两点不同：i)转录混合物不用苯酚/氯仿抽提纯化，及ii)CEC用于如Mundt及Vakharia(1996，同上)所述的转染实验。转染两天后冻融细胞，在700xg离心以除去细胞碎片，所获上清液被进一步通过0.45微米滤膜过滤澄清并储存于零下70摄氏度。对于免疫荧光学研究，在消毒过的盖玻片上培养细胞。含有P2 B节段的突变株按如上制备。
IBDV抗原的检测
IBDV抗原通过间接免疫荧光实验(IFA)进行检测。转染CEC的上清被传代至CEC上。对于IFA，在盖玻片上生长的CEC与上述传代实验获得的上清液一起进行培养，经过16小时后，细胞使用丙酮固定和处理以进行IFA。
结果
使用嵌合cRNA的转染实验.
对于转染实验，将嵌合节段A的全长cDNA克隆(pD78A-E/DelMut1，pD7SA-E/DelMut2，pD78A-E/DelMut12)转录为合成cRNA且与B节段(pD78B或者pP2B)全长cRNA共转染至CEC中。转染后两天细胞被冷冻/解冻，结果产生的上清液在CEC上传代一次。冷冻/解冻后，将转染和传代上清液用于通过IFA使用CEC检测IBDV抗原。从质粒pD78B或者pP2B联合pD78A-E/DelMut1的cRNA转染产生突变病毒D78A-E/DelMut1(经典/变种E(TC)-254(Gly)//D78B)，联合pD78A-E/DelMut2产生突变病毒D78A-E/DelMut2(经典/变种E(TC)-270(Thr)//D78B)，联合pD78A-E/DelMut12产生突变病毒D78A-E/DelMut12(经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)I/D78B)，且相应的突变株包含P2株的基因组B节段(Mut1//P2B，Mut2//P2B和Mut12//P2B)。
实施例2
A IBDV D78/变种E(BU)及(TC)突变株的特性
对Mundt(1999，同上)中公开的两个现有IBDV突变株D78/变种E(BU)(命名为D7SA-E/Del)及D78/变种E(TC)(命名为D78A-E/Del-QH-AT-SR)的生物学特性进行测定。
材料和方法
不同疫苗的效果通过测量对接种14天后给予攻击病毒(强毒IBDV变种E)所致攻击的抗性来确定。所检测的疫苗为D78/变种E(BU)及(TC)，及商业上可获得的经典疫苗Nobilis株D78(Intervet International BV，荷兰)。(BU)疫苗，102.0EID50/只动物，通过滴眼液途径在两周龄施用。(TC)疫苗，105.5或103.5TCID50/只动物，分别通过滴眼液途径或者肌内注射在两周龄施用。商业上可获得的经典疫苗Nobilis株D78，103.3TCID50/只动物，通过滴眼液途径在两周龄施用。每组5只动物的法布里丘斯囊中IBDV的存在及该囊中的显微损伤在接种后3、7、10及13天及攻击后3天进行测量。
本实验及下述的实验的保护性反应通过确定下列方面进行估量：(i)攻击3天后的急性损伤，(ii)攻击3天后法布里丘斯囊中的病毒抗原，及(iii)分值为5的损伤(100％淋巴细胞衰竭)。
结果
(i)接种3、7、10及13天后和攻击3天及10天后的平均显微损伤值
正如表2所列的那样，在接种后7天IBDV(BU)株诱导完全的淋巴细胞衰竭。接种后TC适应的IBDV株未导致损伤。接种商品疫苗后导致轻微至中度损伤。进一步的数据显示动物使用D78/变种E(BU)突变株或者D78进行免疫可以获得保护而免受攻击。然而，使用D78/变种E(TC)突变株经过眼睛或者肌内途径免疫的动物在攻击后却有(不同水平的)急性损伤，表明仅分别获得轻微的或部分的保护。接种后3天所有动物都显示急性伤害及100％淋巴细胞衰竭，所以对照组动物没有得到保护。
表2.法布里丘斯囊损伤平均值
            接种后的天数     攻击后的天数
  病毒   3   7   10   13   3   10
  D78/变种E(BU)   3.2   5.0   5.0   5.0   4.4C   4.7
  D78/变种E(TC)(oc)   0   0   0   0   3.0A   4.1
  D78/变种E(TC)(im)   0   0   0   0   1.0A   2.8
  Nobilis株D78   0.2   2.2   2.0   1.8   2.8C   1.9
  无接种对照   5.0A
(oc)滴眼途径；(im)＝肌内途径；C＝慢性损伤；A＝急性损伤
(ii)在接种后3、7、10及13天和攻击后3天使用ELISA系统检测法布里丘斯囊中的IBDV。
正如表3所看到的那样，在接种后3天及7天可分离到D78/变种E(BU)病毒。攻击后3天没有检测到病毒，显示动物已产生保护。相反，在用组织培养物适应株D78/变种E(TC)接种的动物中，我们没能分离出接种病毒。攻击后3天经过滴眼途径免疫的动物5个中有4个含有攻击病毒。攻击后3天经过肌内途径免疫的动物5个中有2个含有攻击病毒。显示使用D78/变种E(TC)经过滴眼或肌内途径免疫的动物分别有20％或60％的保护。商用疫苗病毒在接种后3、7及10天可以分离到。攻击后3天没有检测到病毒，显示动物已产生保护。
所有的对照动物在法布里丘斯囊中都有病毒抗原。
表3.法布里丘斯囊中IBDV的存在
          接种后的天数      攻击后的天数
 病毒   3   7   10   13   3   ％保护
 D78/变种E(BU)   4/5*   5/5   0/5   0/5   0/5   100
 D78/变种E(TC)(oc)   0/5   0/5   0/5   0/5   4/5   20
 D78/变种E(TC)(im)   0/5   0/5   0/5   0/5   2/5   60
 Nobilis株D78   1/5   2/5   1/5   0/5   0/5   100
 无接种对照   8/8   0
(oc)滴眼途径；(im)＝肌内途径；*所检测总量中病毒抗原呈阳性的动物数量
B广谱经典/变种E(TC)IBDV突变株的特性
材料及方法
IBDV疫苗的准备
原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)以最终浓度2×106/ml进行制备。细胞在含有5％胎牛血清的Eagles极限必需培养基中进行培养。15ml该细胞悬浮液中加入0.1mlIBDV-株经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Tllr)(＝Mut12)(传代2次)。在高湿度孵育箱内37℃下孵育3-6天，上清(传3代)用于进行动物实验1。上清被稀释至疫苗剂量103.0，104.0或者105.0 TCID50/动物。
对于第二个动物实验，进一步纯化IBDV株经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)。进行三轮噬斑纯化。接下来以上述同样的方式培养病毒。传9代后的收获产物(P9)用于第二个动物实验。商业上可获得的经典IBDV疫苗Nobilis株D78(Intervet International BV，荷兰)被用于第二个实验。
实验1.
用动物实验研究广谱疫苗病毒株经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)在14日龄的SPF鸟类中的安全及有效特性。疫苗病毒通过滴眼或肌内途径使用。接种后从来自含有IBDV抗原的法布里丘斯囊的CEF中再分离病毒。该广谱疫苗病毒株经典/变种E(TC)-254((Gly)/270(Thr)的有效特性通过测量血清学反应及对接种后14天给予强毒病毒IBDV株变种E所致攻击的抗性来评估。在接种后3及14天和攻击后3及10天检测每组中5-15个动物法布里丘斯囊中的显微损伤及在法布里丘斯囊中IBDV的存在。确定抗攻击的保护反应。更进一步，接种后14天，使用VN-实验确定抗经典及变种E病毒的血清学反应。
实验2.
在另一效力测试中，疫苗的效果通过测量经滴眼途径接种Gumboro疫苗株经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)14天后的血清学反应及对给予攻击病毒所致攻击的抗性进行测定。
将14日龄的鸡分为3组，一组使用经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P9)免疫，一组使用起始经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3)进行免疫，最后一组使用商业疫苗Nobilis Gumboro D78免疫。接种后3、7及14天，从每组的3-15只小鸡中摘取法布里丘斯囊。该法布里丘斯囊被用于进行损伤及病毒抗原存在的检测。接种后14天向每组中加入4个日龄及来源均相同的未经免疫的SPF鸡。从所有动物中抽取血样，所有动物均使用强毒株IBDV F52/70经过滴眼途径进行攻击。在10天中记录临床症状和死亡率。攻击后三天，从每组5只鸡中分离出法布里丘斯事囊，该法布里丘斯囊被用于进行损伤及病毒抗原存在的检测。攻击后10天，来自存活动物的法布里丘斯囊被用于检测显微损伤的存在。
结果
实验1.
(i)接种后3及14天和攻击后3及10天法布里丘斯囊中的平均显微损伤值结果如表4所示。未免疫对照组动物未受到保护，攻击后3及10天攻击病毒诱导急性损伤及完全的淋巴细胞衰竭。相反，广谱疫苗经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)接种后仅诱导轻微至中度的损伤。另外，攻击后3天仅检测到轻微至中度慢性损伤，这表明动物已经获得了对使用的强毒力变种E IBDV攻击的保护。攻击后10天接种组中的损伤进一步降低。
表4.经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr))(P3)的平均法布里丘斯囊损伤值
  接种后天数   攻击后天数
途径   剂量   3   14   3   10
ED   2.7   0   3.6   3.0C   2.3
ED   3.7   2.8   3.4   4.0C   1.5
ED   4.7   2.6   2.8   3.0C   1.9
IM   2.5   0   2.2   1.6C   1.4
IM   3.5   0   3.2   1.0C   1.0
IM   4.5   0.8   1.8   2.0C   1.3
没接种对照组   5.0A   5.0
ED滴眼途径；(IM)＝肌内途径；C＝慢性损伤；A＝急性损伤
(ii)抗IBDV的血清学反应
VN-IBDV病毒采用经典及变种E。从表5中可以看出，经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3)诱导了良好的抗经典及变种E IBDV株的血清学反应，这表明该毒株的广谱特性。
表5.接种后14天的血清学反应(VN-滴度以稀释的log2来表达)
  典型VN病毒  变种-E VN病毒
  途径   剂量
  ED   2.7   8.2±1.3  8.3±1.1
  ED   3.7   8.0±1.4  7.7±1.5
  ED   4.7   7.6±1.4  8.0±1.7
  IM   2.5   7.6±1.1  7.4±1.8
  IM   3.5   7.5±1.7  7.2±2.0
  IM   4.5   8.1±0.9  7.1±1.4
  无接种对照组   ＜4.0±0.0  ＜4.0±0.0
ED＝滴眼途径；(IM)＝肌内途径.
(iii)使用ELISA系统检测接种后3及14天和攻击后3天在法布里丘斯囊中的IBDV如表6所示，在使用高剂量免疫过的动物中接种后3天可分离到病毒。攻击后3天在任一接种过的动物中均未检测到病毒，显示所有动物均已得到保护。相反，所有对照组动物在攻击后于法布里丘斯囊中都含有病毒抗原。
表6.法布里丘斯囊中IBDV的存在.
  接种后天数     攻击后天数
  途径   剂量   3   14   3   保护百分数
  ED   2.7   0/5*   15   0/5   100
  ED   3.7   4/5   0/5   0/5   100
  ED   4.7   3/5   0/5   0/5   100
  IM   2.5   0/5   0/5   0/5   100
  IM   3.5   0/5   0/5   0/5   100
  IM   4.5   2/5   0/5   0/5   100
  非接种对照组   12/12   0
ED＝滴眼途径；(IM)＝肌内注射途径；*在调查的动物总数中病毒抗原呈阳性的动物数量
实验2.
(i)接种后3及14天和攻击后3及10天法布里丘斯囊的平均显微损伤值
如表7所看到的那样，非免疫对照组动物未受到保护，攻击后3及10天攻击病毒诱导急性损伤及完全的淋巴细胞衰竭。相反，广谱疫苗经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)接种后仅诱导轻度至中度的损伤。而且，观察到攻击后3天仅诱导轻度至中度慢性损伤，显示该动物已被保护抵抗恶性经典株F52/70 IBDV。在使用典型/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)P9接种的组中，攻击后3天一只动物显示出严重的急性损伤，表明其并未得到保护。攻击后10天使用典型/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)免疫的动物法布里丘斯囊中的损伤进一步减少，且都为轻度至中度性质，表明所研究动物均已得到保护。
表7.Nobilis Gumboro D78及在传代水平为3及9时典型/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)的平均法布里丘斯囊损伤值
  保护   接种后天数   攻击后天数
  疫苗   剂量   (％)   3   14   3   10
  第9代   3.6   95   2.8   4.3   3.3   1.9
  第3代   4.1   100   2.6   4.0   3.5   2.3
  Nobilis D78   5.1   74   0   3.3   2.5   2.5
  非免疫对照组   0   5.0   5.0
(ii)抗IBDV血清学反应
VN-IBDV-病毒采用经典及变异株E。可以从表8看出，株E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P3及P9)诱导良好的抗典型及变种E IBDV株的血清学反应，显示出该病毒的广谱特性。相反，使用D78免疫的组(剂量5.1log10)诱导分别为8.8log2及5.9log2的抗经典及变种E病毒的血清学反应，这清楚地证明了该疫苗的经典特性。
表8.接种后14天的血清学反应
  经典VN病毒  变株-E VN病毒
  疫苗   剂量
  第9代   3.6   7.3±1.8  7.3±1.5
  第3代   4.1   8.4±1.7  7.8±1.8
  D78   5.1   8.8±3.4  5.9±1.8
  非免疫对照组   ＜4.0±0.0  ＜4.0±0.0
(VN-滴度以log2稀释倍数表示).
(iii)在接种后3、7及14天及攻击后3天于法布里丘斯囊中使用ELISA系统来检测IBDV
如表9所示那样，接种后3-14天可分离出病毒。攻击后3天仅在一只使用经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)(P9)接种过的动物中检测到病毒，这显示该动物并未受到保护而所有其它的动物得到保护。
表9.法布里丘斯囊中IBDV的存在
  接种后天数   攻击后天数
  疫苗   剂量   3   7   14   3 ％保护
  P9   3.6   0/5*   2/3   0/3   1/4 75
  P3   4.1   0/5   2/3   0/3   0/4 100
  D78   5.1   1/5   2/3   1/3   0/4 100
  非接种对照组   9/9 0
*在调查的动物总数中病毒抗原呈阳性的动物数量
实施例3 广谱IBDV突变株的安全性及有效性
材料及方法
进一步的动物实验研究不同广谱疫苗病毒株的安全性及有效特性。获自Gumboro病毒株D78或者P2的广谱病毒株B节段不同。更进一步，研究了A片段2个变化(在位置254及270)中仅有一个被引入的Gumboro株。在该实验中疫苗的有效性通过测量接种Gumboro疫苗株14天后的血清学反应及对病毒(F52/70)攻击的抗性而测定。所检测的疫苗是广谱疫苗病毒株：
经典/变体E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B
经典/变体E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B
经典/变体E(TC)-254(Gly)//D78B
经典/变体E(TC)-254(Gly)//P2B
经典/变体E(TC)-270(Thr)//D78B
经典/变体E(TC)-270(Thr)//P2B.
以103.4～104.8TCID50/动物的剂量范围在3周年龄时经过滴眼途径接种不同的广谱疫苗。接种后3及14天和攻击后3和/或10天研究每组中5只动物的法布里丘斯囊的显微损伤及IBDV的存在。确定抗攻击的保护反应。更进一步，抗经典及变种E病毒的血清学反应在接种后14天通过VN测试进行确定。
结果
(i)法布里丘斯囊中IBDV抗原的检测及平均显微损伤值
结果如表10及11所示，所有的IBDV突变株都显示降低的毒。具有D78株B节段的突变株诱导中度损伤，然而具有P2株B节段的突变株的弱毒性显示了更为温和的特性。经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B结果产生40％的保护。攻击后3天其它株诱导完全保护(仅慢性损伤存在)，只是经典/变种E(TC)-270(Thr)//P2B经过滴眼途径给予后无效。在攻击后10天所有其它的组显示出轻微至中度损伤。
表10.平均法布里丘斯囊损伤值
    接种后天数     攻击后天数
  病毒   3   14   3   10
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B   0.0   3.4   3.6A/C   1.5
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//D78B   0.0   3.0   3.8C   2.7
  经典/变种E(TC)-270(Thr)//D78B   0.4   4.2   4.6C   3.0
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B   0.8   2.0   1.4C   1.5
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//P2B   0.8   2.0   2.6C   1.6
  经典/变种E(TC)-270(Thr)//P2B   0.0   0.0   5.0A   5.0
  非免疫对照组   ND   0.0   5.0A   5.0
C＝慢性损伤；A＝急性损伤
表11.法布里丘斯囊中IBDV的存在
    接种后天数     攻击后天数
  病毒   3   14   3   ％保护
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//D78B   0/5*   0/5   3/5   40
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//D78B   0/5   0/5   0/5   100
  经典/变种E(TC)-270(Thr)//D78B   0/5   0/5   0/5   100
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B   2/5   0/5   0/5   100
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//P2B   1/5   0/5   0/5   100
  经典/变种(TC)-270(Thr)//P2B   0/5   0/5   8/8   0
非免疫对照组 ND ND 13/13 0
*在调查的动物总数中病毒抗原呈阳性的动物数量
(ii)抗IBDV血清学反应
一个经典株及一个变种E株被用做VN-IBDV病毒，从表12中可以看到，IBDV疫苗株诱导了抗经典及变种E株IBDV的良好的血清学反应。经过滴眼途径给予的经典/变种E(TC)-270(Thr)1/P2B突变株未发生反应。
表12.血清学反应，接种后14天(VN-滴度以稀释的log2来表示)。x＝25个中有4个未反应，y＝25个中有1个未反应，z＝25个中有2个未反应
  病毒   典型VN病毒  变种-E VN病毒
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)/D78B   7.9±2.2x  6.5±1.9x
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//D78B   8.0±1.5y  8.2±1.4
  经典/变种E(TC)-270(Thr)//D78B   9.0±1.6y  8.8±1.4
  经典/变种E(TC)-254(Gly)/270(Thr)//P2B   7.7±1.6y  6.7±1.5z
  经典/变种E(TC)-254(Gly)//P2B   7.5±1.8z  6.8±1.7y
  经典/变种E(TC)-270(Thr)//P2B   ＜4.0±0.0  ＜4.0±0.0
  非免疫对照组   ＜4.0±0.0  ＜4.0±0.0
                         附图说明
图1：
具有IBDV节段A的嵌合cDNA克隆的构建。该图顶部显示了IBDV节段A的基因组结构图。空白框符指示D78株的节段A编码序列。E/Del序列由带阴影的框符标示。突变氨基酸的位置由单字母密码指示和命名。根据P2株的公开序列(Mundt和Muller，1995，同上)，给核苷酸和氨基酸编号。nt，核苷酸。
图2：
具有IBDV节段A的嵌合cDNA克隆的构建。该图顶部显示了IBDV节段A的基因组结构图。空白框符指示嵌合cDNA克隆pD78A-E/DelMut12中节段A的编码序列。黑色框符标示嵌合cDNA克隆pD78A-E/Del-QH-AT的序列(Mundt，1999，同上)。图上标出了用于进行克隆的限制酶和它们的切割位点。突变氨基酸的位置由单字母密码指示和命名。根据P2株的公开序列(Mundt和Muller，1995，同上)，给核苷酸和氨基酸编号。nt，核苷酸。
序列表
<110>Akzo Nobel NV
<120>一种广谱传染性鸡囊病病毒疫苗
<130>2000563
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1078
<212>DNA
<213>传染性鸡囊病病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1077)
<223>与E/Del片段核苷酸第647-1725位相同
<400>1
tat gat ctt ggg tat gtg agg ctt ggt gac ccc ata ccc gct ata ggg    48
Tyr Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly
  1               5                  10                  15
ctt gac cca aaa atg gta gca aca tgt gac agc agt gac agg ccc aga    96
Leu Asp Pro Lys Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg
             20                   25                   30
gtc tac acc ata act gca gcc gat aat tac caa ttc tca tca cag tac    144
Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Asn Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr
         35                   40                   45
caa aca ggt ggg gta aca atc aca ctg ttc tca gcc aac att gat gcc    192
Gln Thr Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala
     50                   55                   60
atc aca agt ctc agc gtt ggg gga gag ctc gtg ttc aaa aca agc gtc    240
Ile Thr Ser Leu Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Lys Thr Ser Val
 65                  70                  75                  80
caa agc ctt gta ctg ggc gcc acc atc tac ctt ata ggc ttt gat ggg    288
Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly
                 85                  90                  95
act gcg gta atc acc aga gct gtg 9cc gca aac aat ggg ctg acg gcc    336
Thr Ala Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala
            100                 105                 110
ggc atc gac aat ctt atg cca ttc aat ctt gtg att cca acc aat gag    384
Gly Ile Asp Asn Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu
        115                 120                 125
ata acc cag cca atc aca tcc atc aaa ctg gag ata gtg acc tcc aaa    432
Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys
    130                 135                 140
agt gat ggt cag gca ggg gaa cag atg tca tgg tcg gca agt ggg agc    480
Ser Asp Gly Gln Ala Gly Glu Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
cta gca gtg acg atc cat ggt ggc aac tat cca gga gcc ctc cgt ccc    528
Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro
                165                 170                 175
gtc aca cta gta gcc tac gaa aga gtg gca aca gga tct gtc gtt acg    576
Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
gtc gct ggg gtg agc aac ttc gag ctg atc cca aat cct gaa cta gca    624
Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala
        195                 200                 205
aag aac ctg gtt aca gaa tac ggc cga ttt gac cca gga gcc atg aac    672
Lys Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn
    210                 215                 220
tac acg aaa ttg ata ctg agt gag agg gac cac ctt ggc atc aag acc    720
Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg Asp His Leu Gly Ile Lys Thr
225                 230                 235                 240
gtc tgg cca aca agg gag tac act gac ttt cgt gag tac ttc atg gag    768
Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu
                245                 250                 255
gtg gcc gac ctc aac tct ccc ctg aag att gca gga gca ttt ggc ttc    816
Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe
            260                 265                 270
aaa gac ata atc cgg gcc ata agg agg ata gct gta ccg gtg gtc tct    864
Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser
        275                 280                 285
aca ttg ttc cca cct gcc gct cct cta gcc cat gca att ggg gaa ggt    912
Thr Leu Phe Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly
    290                 295                 300
gta gac tac cta ctg ggc gat gag gca cag gct gct tca gga acc gct    960
Val Asp Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala
305                 310                 315                 320
cga gcc gcg tca gga aaa gca agg gct gcc tca ggc cgc ata agg cag    1008
Arg Ala Ala Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln
                325                 330                 335
ctg act ctc gcc gcc gac aag ggg tac gag gta gtc gcg aat cta ttc    1056
Leu Thr Leu Ala Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe
            340                 345                 350
cag gtg ccc cag aat ccc gta g                                    1078
Gln Val Pro Gln Asn Pro Val
        355
<210>2
<211>359
<212>PRT
<213>传染性鸡囊病病毒
<400>2
Tyr Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly
  1               5                  10                  15
Leu Asp Pro Lys Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg
             20                  25                  30
Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asp Asn Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr
         35                  40                  45
Gln Thr Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala
     50                  55                  60
Ile Thr Ser Leu Ser Val Gly Gly Glu Leu Val Phe Lys Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
Gln Ser Leu Val Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly
                 85                  90                  95
Thr Ala Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Ala
            100                 105                 110
Gly Ile Asp Asn Leu Met Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu
        115                 120                 125
Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys
    130                 135                 140
Ser Asp Gly Gln Ala Gly Glu Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro
                165                 170                 175
Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala
        195                 200                 205
Lys Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn
    210                 215                 220
Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg Asp His Leu Gly Ile Lys Thr
225                 230                 235                 24
Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu
                245                 250                 255
Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe
            260                 265                 270
Lys Asp Ile Ile Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser
        275                 280                 285
Thr Leu Phe Pro Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly
    290                 295                 300
Val Asp Tyr Leu Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala
305                 310                 315                 320
Arg Ala Ala Ser Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln
                325                 330                 335
Leu Thr Leu Ala Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe
            340                 345                 350
Gln Val Pro Gln Asn Pro Val
        355
<210>3
<211>101
<212>DNA
<213>传染性鸡囊病病毒
<220>
<221>CDS
<222>(3)..(101)
<223>D78 VP2编码区第884-985位核苷酸
<400>3
tc cac ggc ctt gta ctg ggc gcc acc atc tac ctc ata ggc ttt gat     47
   His Gly Leu Val Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp
     1               5                  10                  15
ggg aca acg gta atc acc agg gct gtg gcc gca aac aat ggg ctg acg    95
Gly Thr Thr Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr
                 20                  25                  30
acc ggc                                                            101
Thr Gly
<210>4
<211>33
<212>PRT
<213>传染性鸡囊病病毒
<400>4
His Gly Leu Val Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly
  1               5                  10                  15
Thr Thr Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr
             20                  25                  30
Gly
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
     寡核苷酸引物
<400>5
gccggtcgtc agcccattgt ttgcggccac agccctggtg attac                  45
<210>6
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
     寡核苷酸引物
<400>6
taccgttgtc ccatcaaagc ctatgaggta gatggtggcg cccagtacaa ggccgtggac 60

Claims (10)

1.一种IBDV突变株，其在变种E株、经典株或GLS株病毒基因组A节段中含有编码变种E的VP2蛋白的核苷酸序列，且能够在CEF组织培养物中进行感染和复制，其特征在于该突变株在变种E的VP2编码区域含有一个或多个突变，使得：
(i)编码第254位氨基酸的密码子编码甘氨酸，且/或
(ii)编码第270位氨基酸的密码子编码苏氨酸。
2.根据权利要求1的突变株，其特征在于编码第254位氨基酸的密码子为GGC和/或编码第270位氨基酸的密码子是ACG。
3.根据权利要求1或2的突变株，其特征在于变种E VP2蛋白253-284片段的编码区被IBDV的D78株相应编码区所取代。
4.根据权利要求1或2的突变株，其特征在于其A节段的骨架是经典亚型IBDV的A节段骨架。
5.根据权利要求4的突变株，其特征在于所述经典亚型IBDV是IBDV D78株。
6.根据权利要求1或2的突变株，其特征在于该病毒基因组的B节段是经典IBDV株的B节段。
7.根据权利要求6的突变株，其特征在于所述经典IBDV株是D78株或P2株。
8.一种用于保护禽类免受IBDV感染所致疾病的疫苗，其特征在于该疫苗含有权利要求1-7任何一项的IBDV突变株以及药学上可接受的载体或稀释剂。
9.根据权利要求8的疫苗，其特征在于IBDV突变株采用活的形式。
10.权利要求1-7任何一项的IBDV突变株在制备经大量应用途径接种的疫苗中的应用。
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