CN1084218A - 多颗粒抗原传输系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种颗粒形抗原，其中有外来的抗 原决定基的嵌合体抗原存在于类病毒颗粒(VLPS) 或类病毒核颗粒(CLPS)之上或之内。此VLPS或 CLPS是致免疫的且宜于制备疫苗制剂。

Description

本发明涉及颗粒形抗原。特别涉及类病毒颗粒形或类病毒核颗粒形抗原。具体讲，本发明涉及其中的外源抗原决定基存在于类病毒颗粒或类病毒核颗粒上或其内的嵌合体抗原。
病毒一般是由许多不同的，连同DNA或RNA有规律排在一起组装的蛋白质组成的。对于无脂质包膜的病毒而言，此蛋白质同一定的蛋白质一起常成层状或同心状排列，共形成外表皮或衣壳以及形成所谓的核或内衣壳等其它形式。
许多病毒品种，病毒蛋白质能在无核酸的情况下组装形成所谓的类病毒颗粒或VLPs。同样，一般同核酸一起共形成病毒核的蛋白质能在无核酸的情况下组装形成所谓的类核颗粒（CLPs）。正如本文中所用，术语“类病毒颗粒”和“类核颗粒”，用于上述概念中意指在无病毒基因组核酸情况下的病毒蛋白质（或修饰的、或嵌合体病毒蛋白质）的装配物。
颗粒形状实体中的致免疫抗原决定基的一般原则是极希望构成可具体使用的形式，如研制口服或其他粘膜给药途径的疫苗。然而，很少有有用的致免疫抗原决定基能容易地制成仍保持其抗原决定基致免疫性的颗粒形式。保存致免疫抗原决定基的颗粒载体的研制工作为传输抗原提供了有力的手段。各种类型颗粒业已用于携载外来抗原决定基，这些颗粒有如由乙型肝炎病毒（HBV）表面或核抗原形成的颗粒、脊髓灰质炎病毒和酵母Ty颗粒（1-5）。
VLPs和CLPs就是有致免疫抗原决定基的颗粒抗原的例子。虽然抗原决定基也位于内部，但它们常常位于颗粒表面或附近。而且，当经口、呼吸道或其他粘膜途径给药时，VLPs和CLPs足够稳定和耐降解使之能用作疫苗。后者（粘膜途径）的特征无疑与天然形态的许多病毒是经口感染的这一事实有关。呼肠孤病毒族的成员即为这类病毒的例子。
然而，下述几个因素，使得为并入外来抗原决定基而对天然VLPs和CLPs进行修饰的种种企图充满着困难。首先，经常出现的情况是VLPs或CLPs中蛋白质片断的外源蛋白质的并入对颗粒的形成有抑制作用。而且，即使有可能形成颗粒，而所需的外源抗原决定基不一定是致免疫的。例如，它可能位于外源抗原决定基不可能呈现其天然形态的位点。
据最近报导，当兰舌病病毒（bluetongue）（BTV，Orbivirus属，呼肠孤病毒科）的两种主要内衣壳蛋白（VP3和VP7）在昆虫细胞中通过二元重组杆状病毒合成时，形成了类病毒核颗粒（CLPs）（6），且能用一步蔗糖梯度离心法或盐沉淀法来分离这些颗粒。
还发现用适宜的重组杆状病毒表达同VP3和VP7在一起的两种主要的外衣壳蛋白（VP2和VP5）导致了VPLs的合成。而且，次要的内蛋白VP1、VP4和VP6同CLPs（VP3和VP7）的成分或同VLPs（VP2、VP5、VP3、VP7）的成分的不同结合的表达，分别得到了VP1、VP4和/或VP6进入CLPs或VLPs中的内含物。
而且，通过代表不同的BTV血清型的VP3和VP7种，或其他诸如动物流行型出血性病毒（EHDV）VP3和BTV  VP7等环状病毒属的共表达可获得CLP的合成。而用代表不同BTV血清型的基因可实现VLPs的合成。
本发明提供了致免疫的VLPs和CLPs及特别适用于疫苗制剂的VLPs和CLPs。具体讲，本发明提供作为多免疫原的疫苗传送体系用的遗传工程的、多成份的类病毒颗粒（VLPs）和类病毒核颗粒（CLPs），所说多免疫原代表能使人致病的病毒，细菌和细菌毒素（如乙型肝炎B.HIV.人呼吸道合胞病毒、顽固梭状芽胞杆菌（Clostridium  difficile）、牛白血病病毒、Helicobacter  Pylori等）的致免疫原。
一方面，本发明提供颗粒形抗原，该抗原包括能相互合作组装成类病毒颗粒（VLPs）或类病毒核颗粒（CLPs）的多种蛋白质，其中，所说颗粒包括第一和第二两种不同蛋白质，而每种蛋白质又分别来自一种挑选的病毒种的第一和第二天然蛋白质的氨基酸顺序，其中第一和第二种蛋白质中至少有一种是嵌合体，且包括来自外源蛋白质的氨基酸顺序（而并非第一或第二种天然蛋白质）。
本发明的另一方面是提供了一种生产嵌合体VLPs或CLPs的方法，该VLPs或CLPs至少包括一种天然蛋白质。该方法中VLPs或CLPs使用了包括天然病毒蛋白质和非天然蛋白质的许多的不同蛋白质装配成。该非天然蛋白质包含来自外源蛋白质的氨基顺序和来自天然病毒蛋白质的氨基酸顺序。
本发明还提供了一种包括本发明的有效量的抗原，结合治疗上可以接受的载体或稀释剂的疫苗组合物。
本发明也提供了一种给需要治疗的宿主诱导保护性致免疫应答的方法，其中包括给寄主施用根据本发明的免疫学上有效量的抗原。根据本发明，一方面可将抗原投用给所说寄主的粘膜表面，适宜的情况是口服该抗原。
本发明是基于下述令人惊奇的发现，即可采用上述技术来形成存在外源抗原决定基的CLPs和VLPs。这是根据本发明人所发现的下述事实，VP7蛋白质位于CLPs的外表面（带形成内部二十面体亚核的VP3）。当与VP7共表达时，把代表狂犬病G蛋白质的致免疫区的14氨基顺序引入VP3的氨基末端会导致嵌合体蛋白质的表达和形成CLPs。
进一步的研究证明，VLPs和CLPs可作为一种构建适用的抗原和致免疫颗粒的手段。这样，至少包括48个外源氨基酸的嵌合体BTV VP7蛋白质可以并入CLPs和VLPs。具体讲，已经确定，当狂犬病的14氨基酸残基或乙型肝炎病毒preS2区的1-48氨基酸残基并入VP7的氨基末端时，不仅在感染细胞中可表达该嵌合体蛋白质，而且它们也可并入CLPs同VP3共表达。
同样还确定，当代表人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜蛋白质V3环的30氨基酸并入BTV  VP7氨基末端时，合成嵌合VP7且并入CLPs与BTV  VP3共表达。
顽固梭状芽孢杆菌（Clostridium  difficile）是人结肠炎的诱发剂。毒素A在致发此种病毒中起着重要的作用。在毒素A中，十肽TIDGKKYYFN重复了几次。用编码VP3和VP7（VP3基因是在多面体启动子的控制下表达的，而带SmaⅠ和SpeⅠ（和XbaⅠ相容的）克隆位点的VP7基因置于多面体启动子控制下）的二元载体在VP7基因氨基末端上克隆编码顽固梭状芽孢杆菌十肽毒素A的寡聚核苷酸双链体。用重组杆状病毒感染的S.frugiperda细胞表达VP3和嵌合十肽VP7  CLPs。
置于BTV  VP7氨基末端上游和用BTV  VP3采用重组杆状病毒共合成的牛白血病病毒（BLV）抗原决定基并不产生CLPs。然而，当未修饰的BTV  VP7和融合蛋白质与BTV  VP3共合成时，却产生含融合蛋白质的嵌合CLPs。
编码螺旋杆菌幽脲酶亚基A和B的基因用PCR生产，并在PACUW3载体中克隆。用该质粒产生重组杆状病毒，用该重组杆状病毒感染的秋粘虫（S.frugiperda）细胞既产生脲酶亚基A也产生脲酶亚基B。
根据本发明的CLPs形的抗原一般含两种基本蛋白质和一种或多种其他任选蛋白质，其中所说基本蛋白质是病毒主要内衣壳蛋白质，所说任选蛋白质则选自次要内衣壳蛋白质。本发明的CLPs优选包含0、1、2或3种其他任选的病毒次要内衣壳蛋白质。
VLPs形的根据本发明的抗原，一般含3种基本蛋白质和一种或多种其他任选（即可有可无）蛋白质，其中所说的基本蛋白质中的两种是病毒主要内衣壳蛋白质，所说基本蛋白质中的一种蛋白质是病毒主要外衣壳蛋白质，所说的任选蛋白质选自次要内衣壳蛋白质和主要外衣壳蛋白质。本发明的VLPs优选包含0或1种其他任选的病毒主要外衣壳蛋白质和/或0、1、2或3种其他任选的病毒次要内衣壳蛋白质。
根据本发明的颗粒性抗原，可包含多种能相互合作共组装成类病毒核颗粒（CLPs）的蛋白质，此抗原包括第一和第二种不同主要结构的蛋白质，其中每一种蛋白质包括，在三种次要蛋白质的任意一种或其结合物的存在或不存在下，分别由选择的病毒种或相关病毒种的第一种和第二种天然蛋白质衍生的氨基酸序列，所说次要蛋白质中的每一种包括由选择的病毒种或相关的病毒种的三种次要蛋白质衍生的氨基酸序列。上述5种蛋白质中的至少一种蛋白质是嵌合体，并且包含由外源蛋白质而非天然蛋白质衍生的氨基酸序列。
同样，根据本发明的颗粒性抗原，可含多种能相互合作共同组装成类病毒颗粒（VLPs）的蛋白质，其特征在于，此抗原包括第1、第2、第3种和任选的（即可有可无）第4种不同主要结构的蛋白质，这些蛋白质中的每一种包括，在3种次要蛋白质中的任一种或其结合物的存在或不存在下，分别从选择的病毒种或相关的病毒种的第1、第2、第3和第4种天然蛋白质衍生来的氨基酸序列，所说的每一种次要的蛋白质包括从选择的病毒种或相关的病毒种的3种次要蛋白质衍生的氨基酸序列。上述8种蛋白质中的至少任一种蛋白质是嵌合体且包含由外源蛋白质而非天然蛋白质衍生的氨基酸序列。
对于呼肠孤病毒种的情形，例如BTV等环状病毒属而言，由CLP组成的颗粒性抗原可包括两种基本的蛋白质及一种或多种其他任选的（即可有可无）蛋白质，其中所说的基本蛋白质是病毒主要内衣壳蛋白质VP3和VP7，所说的任选蛋白质为从次要内衣壳蛋白质VP1、VP4和VP6中选出的。
蛋白质的这些结合物示于如下：
VP3+VP7
VP3+VP7+VP1
VP3+VP7+VP4
VP3+VP7+VP6
VP3+VP7+VP1+VP4
VP3+VP7+VP4+VP6
VP3+VP7+VP1+VP6
VP3+VP7+VP1+VP4+VP6
同样，VLPs可包括三种基本蛋白质和一种或多种其他任选的（可有可无）蛋白质。其中三种基本蛋白有两种是病毒主要内衣壳蛋白质VP3和VP7，一种是从VP2和VP5选出的病毒主要外衣壳蛋白质，而所说的任选蛋白质是从次要内衣壳蛋白质VP1、VP4和VP6及主要外衣壳蛋白质VP2和VP5中选出的。
这些蛋白质的结合物如下所示：
VP2+VP3+VP7
VP2+VP3+VP7+VP1
VP2+VP3+VP7+VP4
VP2+VP3+VP7+VP6
VP2+VP3+VP7+VP1+VP4
VP2+VP3+VP7+VP1+VP6
VP2+VP3+VP7+VP4+VP6
VP2+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
VP5+VP3+VP7
VP5+VP3+VP7+VP1
VP5+VP3+VP7+VP4
VP5+VP3+VP7+VP6
VP5+VP3+VP7+VP1+VP4
VP5+VP3+VP7+VP1+VP6
VP5+VP3+VP7+VP4+VP6
VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1
VP2+VP5+VP3+VP7+VP4
VP2+VP5+VP3+VP7+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP4
VP2+VP5+VP3+VP7+VP4+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
本发明的抗原可用至少一种天然形式的蛋白质和同样的蛋白质或其它于嵌合体形式中的蛋白质（即并入外源蛋白质的氨基酸序列）制备的。可根据本发明的方法来生产颗粒性嵌合体抗原，其中从所说外源蛋白质衍生的氨基酸序列包括由外源蛋白质抗体识别的抗原决定基。例如，外源蛋白质是一种致病有机体的蛋白质而该颗粒性抗原能在易感受该疾病的生物体中产生保护性（例如中和作用）抗体或细胞免疫应答。根据本发明的抗原特别适用于配制疫苗。
嵌合体VLPs或CLPs可包括以嵌合形式掺入的一种或多种主要结构蛋白质。在此形式中，CLPs可包括：（ⅰ）天然形式的第1种病毒蛋白质、（ⅱ）天然形式的第2种病毒蛋白质，和（ⅲ）嵌合形式的、包含由天然病毒蛋白质衍生的氨基酸序列和由外源蛋白质衍生的氨基酸序列的第1种和第2种病毒蛋白质中的一种蛋白质。
同样，根据本发明的VLPs可包括：（ⅰ）天然形式的第1种病毒蛋白质;（ⅱ）天然形式的第2种病毒蛋白质;（ⅲ）天然形式的第3种病毒蛋白质，和（ⅳ）包括由天然病毒蛋白质衍生的氨基酸序列和由外源蛋白质衍生的氨基酸序列的嵌合体形式的第1种和第2种病毒蛋白质中的一种蛋白质。
至少包括一种非天然形式的蛋白质的嵌合体VLPs或CLPs，可根据本发明的方法通过组装来自包括有天然形式的病毒蛋白质和非天然形式蛋白质的多种不同的蛋白质的VLPs或CLPs来制备。此非天然形式的蛋白质包括外源蛋白质衍生的氨基酸序列，和天然病毒蛋白质衍生的氨基酸序列。外源蛋白质衍生的氨基酸序列可以位于嵌合体蛋白质的N-末端，但可以根据本发明来设想其它排列法，如将外源蛋白质衍生的氨基酸序列插入天然蛋白质序列中，或位于其C-末端。业已发现，外源蛋白质衍生的氨基酸序列位于嵌合体蛋白质N末端，可以使最终的VLPs或CLPs中外源抗原决定基是致免疫的。
为了构造能被表达为包括作为本发明抗原颗粒成分的嵌合体蛋白质的DNA序列，可以使用常规的定位诱变和基因拼接技术。同样，可以各种方式由其组成成分来组装所说的抗原颗粒。例如，可单独制备各成分，然后再于适宜的介质中通过混合各构成蛋白质的溶液进行简单结合即可。然而，优选的方案是，共表达天然和嵌合蛋白质，由此能完成抗原颗粒的组装而不出现表达降解、修饰或产生其它与它们组装形成VLPs或CLPs所不相容的多肽这类弊病。更优选的方案是共表达这些构成蛋白质。
虽然任何适宜的表达体系均可以使用，但使用包括杆状病毒表达载体的表达体系已获得了特别满意的结果。所以优选在昆虫或昆虫的细胞中表达其组成蛋白质。
下面将参照附图对本发明作更详细的说明：
附图1为含HBV preS2序列上游和与BTV VP7共线性的重组体转移载体;
图2A-2C为由AcBTV7-preS2产生的蛋白质的SDSPAGE分析结果;
图3A-B为由VP3和VP7（泳道1）或VP3，VP7和preS2VP7（泳道2和3）组成的CLPs的SDS-PAGE和Western免疫印迹分析结果;
图4A-B为纯化的CLPs经immunogold-电子显微镜所摄照片;
图5A-C为对嵌合CLPs的免疫原性所作的SDS-PAEG和Western免疫印迹分析结果;
图6是用抗天然的BTV/BTV  VP7、嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3、由天然的BTV  VP3/BTV  VP7衍生的CLPs和由BTV  VP3/嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3衍生的嵌合体CLPs的抗BTV和抗V3（HIV-1）血清所作的Western印迹分析;
图7表示，顽固梭状芽孢杆菌毒素A和BTV-10  VP7氨基末端间的连接;
图8为携带顽固梭状芽孢杆菌毒素A十肽的CLPs和嵌合体CLPs的PAGE图;
图9为带抗十肽抗血清的CLPs和嵌合体CLPs的Western印迹;
图10为BLV抗原决定基和BTV  VP7重组蛋白质的构建;
图11A和11B系重组杆状病毒的表达Western印迹。把重组感染病毒的sf细胞溶胞物于膜上进行印迹反应，分别同（A）抗VP7兔血清和（B）抗pp（142-161）兔血清反应。泳道1：AcVP3.7，泳道2;AcVP3.B3-7;AcVP3.B1-7;
图12为用抗VP7兔血清（a）和抗pp（142-161）兔血清（b）对嵌合体CLPs所作的SDS-PAGE图（A）和Western印迹分析（B）。泳道1;正常CLPs，泳道2;嵌合体CLPs（B3-7）。
图13为插入P8/P9和P6/P7寡聚核苷酸双键分子后VP7的DNA和氨基酸的序列，为了以后将其用于外源抗原决定基的克隆，两种插入体均含有独特的PpUMI位点（划线的）;
图14为原始的VP7基因和带插入物的该基因的BsXZ图;
图15为原始pUC4K-BTVI-VP7的和带插入物克隆的Bam-HI/BstXI消化物的琼脂糖凝胶电泳图。小于350b.p的碎片从凝胶中流走;
图16为伴随产生克隆位点的VP7突变;
图17为伴随产生BgIII和ScaI位点的突变VP7基因的限制性核酸内切酶分析;
图18系表达Helicobacter  pylori脲酶A和B亚基的重组杆状病毒感染的S.frugiperda细胞的溶胞物的PAGE图;
图19系表达Helicobacter  pylori脲酶A和B亚基的重组杆状病毒感染的S.frugiperda细胞的溶胞物Western印迹图;
图20系表明昆虫细胞中的SIV  VP6的表达的10%SDS-PAGE图;
图21为带SIV  VP6的CLPs的SDS-PAGE图，泳道1仅有CLPs;泳道2、3和4为带SIV  VP6及不同量的CLPs，泳道5仅为SIV  VP6。
实施例1
在此实施例中，将介绍含兰舌病病毒VP7蛋白质（preS2-VP7）氨基末端上游的，及与之共线性的乙型肝炎病毒preS2区的大部份的嵌合体蛋白质的构建。
A.质粒的构建
于pAcYM1为基础的转移载体（PAcBTV10.7）中，通过把ayw亚型乙型肝炎病毒（HBV）（8，9）衍生的EcoRI-Xhol）片断转入BTV-10 VP7 DNA氨基末端的办法来制备含嵌合体preS2-VP7基因（图1）的质粒，这样此质粒便处于多面体启动子（10，11）的控制下。用顺序分析（12）来证明转移载体中的嵌合体基因的取向。在lipofectin（13，14）存在下，用重组转移载体和AcRP23-1acZDNA使单层S.frugiperda细胞共转染，来制备重组病毒，lacZ-阴性表现型的子代病毒是纯化的噬斑，回收重组AcBTV-preS2病毒并配制高滴定度的病毒原液。为了引入上游BamHI、SbaI和SmaI位点，借助聚合酶链式反应，用寡核苷酸（5′GCGGGATCCCCTCAGACCCGGGGACACTATCGCCGCA）使BTV VP7转移载体（15）的5′编码区突变。由于此BTV  VP7转移载体也含有下游BamHI位点，所以用BamHI来消化此修饰的载体并插入pAcYM1（11）。然后用Xbal和SmaⅠ对产物进行消化，并连接到在两端用结合子（划线的）修饰的HBV（8）的ayw菌株衍生的EcoRⅠ-Xhol片断上，以提供同经切割的Xbal序列互补的5′悬突端和3′平头末端。衍生的嵌合体基因的氨基末端的序列示于图1。
B.preS2-VP7的表达
用每个细胞AcBTV7-preS2的5个噬斑形成单位（PFU）感染单层S.frugiperda细胞来研究用重组AcBTV7-preS2病毒合成蛋白质。感染后48小时收获细胞，并按以前所述的方法溶胞（6），萃取液用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。通过同仅仅表达38kDa VP7蛋白质（15）的野生型AcNPV或AcBTV 10.7比较，HBV-VP7嵌合体（preS2-VP7）所预期的蛋白质大小得到证实（图2A）。代表HBV preS2区的表达蛋白质，同已产生抗HBV preS2肽（氨基酸残基14-32）的兔抗血清对其进行Western印迹系统分析（图2B）来予以证实。修饰的和未修饰的VP7蛋白质同抗血清反应产生抗BTV-10病毒颗粒（图2C）抗性。
以每个细胞5PFU的m.o.i，用AcBTVVP-preS2（泳道1）或AcBTV 10.7（泳道2），或AcNPV（泳道3）或伪感染（泳道4）感染S.frugiperda细胞。按上述方法制备细胞溶胞产物。用10%SDS-DAGE分离蛋白质和（A）用考马斯兰染色，或（B）在Immobilon膜上进行电印迹并同兔抗preS2反应，或（C）用兔BTV-10抗血清作印迹和反应。用碱性磷酸酶结合物检测结合抗体。左手边的泳道（A）处示出了蛋白质分子量标记（KD），指出了AnNPV多面体（P）、preS2-VP7和VP7蛋白质的位置。
C.组装抗原颗粒
为了研究所说重组蛋白质是否因BTV-VP3组装形成CLPs（6），用AcBTV-preS2重组病毒和AcBTV 17.3（仅表达VP3蛋白质（16）的重组杆状病毒）将悬浮S.Frugiperda细胞培养物共感染，收获感染的细胞，溶胞及按以前（6）所述方法进行梯度离心分析。尽管两种蛋白质均以高水平表达，但未回收到形态学上的结构（无数据显示）。用AcBTV 10-7和AcBTV17.3共感染的细胞产生CLPs（6，无数据显示）作对照。
为了测定嵌合体VP7并入颗粒是否有任何条件，用表达VP3和VP7（6）的二元重组杆状病毒（AcBTV17.3-10.7）以每细胞为2PFU的感染复制率（m.o.i）和AcBTV7-preS2病毒，以每细胞为2PFU或8PFU的感染复制率（m.o.i）对S.frugiperda细胞进行感染，三天后（p.i）收获感染的细胞，溶胞并按以前所述（6）用离心法纯化CLPs。
图3所示的CLPs蛋白质剖面指出了两种VP7形式存在于两种CLP制剂中。而且，CLPs中嵌合体VP7的量取决于用于共感染的AcBTV7-preS2重组病毒的m.o.i。在m.o.i为2时，相对于VP7，preS2-VP7蛋白质含量比m.o.i为8时，用AcBTV7-preS2的情况下要低得多（图3，A）。在感染复制率高时，由染色凝胶所作的估计，嵌合体VP7的量约为真实的VP7量的20%。可以借助10%Western印迹分析法、用HBVpreS2肽抗血清来对所说颗粒中存在嵌合体蛋白质进行确认（图3B）。在图3中，VP3和VP7组成的CLPs（泳道1），或VP3、VP7和preS2-VP7（泳道2，3）组成的CLPs是在昆虫细胞中合成的。纯化的CLPs用间歇式蔗糖梯度离心法进行纯化。用10%SDS-PAGE分离蛋白质，用考马斯兰染色（A）或在Immobilon膜上进行电印迹并与兔抗preS2血清反应（B）。泳道2和3中，CLPs来自AcBTV17-3，10-7（m.o.i为2）和AcBTV7-preS2（m.o.i＝δ，泳道2）的共感染，或AcBTV 17-3，10-7（m.o.i＝2）和AcBTV7-preS2（m.o.i＝2，泳道3）的共感染。
用免疫电子显微镜、金标记的抗HBV preS2血清分析所说颗粒上的preS2-VP7蛋白质的位置。如图4A所示，金颗粒在CLPs的外表面（由用AcVP7-preS2共感染昆虫细胞所得到的经纯化的CLPs），这表明preS2序列曝露于此颗粒的表面。在由AcBTV 17.3-10.7衍生的CLPs的对照实验中，未检出有金颗粒（图4B：由仅以AcBTV 17.3-10.7所感染的细胞得到的纯化的CLPs，bar＝100nm）。若用AcBTV17.3-10.7二元重组病毒感染的细胞溶胞产物与从AcBTVVP7-preS2感染回收的细胞溶胞产物相混合，则回收到CLPs，并用免疫电子显微镜，金标记的preS2抗血清进行类似分析。在CLPs表面未检测出有金颗粒。
D.嵌合体CLPs的致免疫性
通过对这些颗粒进行致免疫性评价，来证明此嵌合体CLPs的生物活性。用以前所述的方法（17）从小鼠得到抗纯化的嵌合体CLPs的抗血清，检验对含preS2区的表达的E.coli融合蛋白质（18），该所生成抗血清的反应活性（未公开GST-preS2数据）。图5示出了感染的昆虫细胞的考马斯兰染色凝胶图，其中：泳道1为用表达嵌合体preS2-VP7蛋白质的重组杆状病毒感染的昆虫细胞的情况，泳道2和3分别为诱导（泳道2）或非诱导（泳道3）时用表达GST-preS2大肠杆菌细胞感染的情况，该图还表示对照组大肠杆菌培养物的GST。
在Western印迹分析中，两种表达的蛋白质与所得的抗嵌合体颗粒的抗体的反应都很激烈。明显不能染色的非诱导的GST-preS2的融合蛋白质带与抗体（1-4000滴度）的反应活性进一步证明了致免疫原性极高。
为了证明抗体的确能识别HBV抗原，用表面抗原阳性HBV患者的血清作了类似的Western印迹分析（图5C）。抗HBV大的（preS1-preS2-S）和中等（preS2-S）的表面抗原的阳性信号证明了本发明的嵌合体颗粒具有很高的致免疫能力。
图5表示下述情况的颗粒型的SDS10%PAGE图（A）和Western免疫印迹（B）：
1.表达preS2-VP7的重组杆状病毒感染的秋粘虫细胞（Spodoptera frugiperda）;
2.在用IPTG诱发的PGEX-Ⅰ载体中，同谷胱甘肽S-转移酶（GST-pre-S2）C末端融合的表达preS2抗原决定基的E.Coli细胞（18）;
3.与泳道2同，无IPTG诱发作用;
4.表达谷胱甘肽S-转移酶（GST）的E.Coli细胞：和（C）：
1.用1HBVsAg阳性患者血清作Western免疫印迹，L为大的（preS1-preS2-S）HBV表面抗原，M为中等（preS2-S）HBV表面抗原;和
2.HBVsAg阴性人血清，抗体按1∶4000的比例稀释。
另外，由BTV  VP3和包含在由HIV-IV3环衍生的N-末端有30氨基酸序列的BTV  VP7的嵌合体蛋白质制备嵌合体CLPs。
用抗天然BTV/BTV  VP7，嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3、由天然BTV  VP3/BTV  VP7衍生的CLPs和BTV  VP3/嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3衍生的嵌合体CLPs的抗BTV和抗V3（HIV-1）血清进行Western印迹分析。其结果示于图6，其中图片A说明抗BTV血清同下述泳道中物质相互作用的情况：VP7（天然BTV  VP3/BTV  VP7）、V3-VP7（嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3）、CLP（天然BTV  VP3/BTV  VP7衍生的CLPs）、V3  IN  CLP（由BTV  VP3和嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3衍生的嵌合体CLPs）：图片B说明下述泳道中物质与抗-HIV-1  V3血清相互作用的情况：CLP（天然BTV  VP3/BTV  VP7衍生的CLPs）、V3  IN  CLP（BTV  VP3和嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3衍生的嵌合体CLPs）。
可以看到嵌合体CLPs同抗BTV和抗HIV-1  V3血清均能相互作用，而天然BTV  CLPs不同抗HIV-1  V3血清相互作用。
VLPs也可用下述物质来构建：
（ⅰ）BTV  VP3，
（ⅱ）包含在其N-末端（从HIV-1  V3环衍生的）有30氨基酸序列的BTV  VP7的嵌合体蛋白质，
（ⅲ）VP2，和
（ⅳ）VP5。
参见图6，图片C说明下述泳道中物质与抗HIV-1  V3血清相互作用的情况：
V3  IN  VLP（从BTV  VP2，BTV  VP3衍生的嵌合体VLPs，
嵌合体BTV  VP7/HIV-1  V3
和BTV  VP5）
VLP（从BTV  VP2，BTV  VP3和BTV  VP5衍生的VLPs）。
可以看到嵌合体VLPs能与抗HIV-1  V3血清相互作用，而天然BTV  VLPs也表现出与抗HIV-1  V3血清相互作用。然而，嵌合体VP7的迁移率却比天然VLPs的低。
实施例2
用嵌合体CLPs顽固梭状芽孢杆菌毒素A十肽的表达研究如下：
按以前叙述的方法（25，26）繁殖秋粘虫（sf）细胞（ILPB-SE21）和重组杆状病毒，质粒DNA的操作采用标准程序（27）。对于构建重组杆状病毒而言，用Bsu36.1切BacPAK6  DNA对含外源基因的转移质粒载体进行脂感染（lipofected）。选取白斑，用两次连续噬斑试验对其进行纯化，按以前介绍的方法（28）纯化嵌合体CLPs，进行SDS-PAGE，Western印迹和电子显微镜测试。
参见图7，在VP7基因的氨基末端上克隆编码顽固梭状芽孢杆菌毒素A的寡聚核苷酸双链体。近来研制的编码VP3和VP7的二元载体用于此载体中克隆抗原决定基。在多面体启动子控制下表达VP3基因。而带Smal和Spel（同XbaⅠ相容的）克隆位点的VP7基因置于多面体启动子控制之下。
用表达VP3和嵌合体十肽VP7的重组杆状病毒感染秋粘虫细胞。制备CLPs并用PAGE，Western印迹和电子显微镜对其进行纯化和研究。在嵌合体CLPs和CLPs的PAGE图上，可以看出嵌合体十肽VP7比未修饰的VP7大（见图8）。
嵌合体VP7（但并非未修饰的VP7）与抗十肽兔抗体进行反应（见图9）。利用电子显微镜（uranile  acetate染料）可以看到嵌合体CLPs似乎不稳定，许多VP7突刺消失，一些颗粒看起来像亚核颗粒。
实施例3
对用CLPs的BLV（牛白血病病毒）抗原决定基的表达研究如下：
把BLV抗原决定基置于VP7氨基末端的上游。用重组杆状病毒进行融合蛋白质与BTV  VP3的共合成不产生类核颗粒（CLPs）。然而，当用未修饰的BTV  VP7和所说融合蛋白质同BTV  VP3共合成时，则产生含融合蛋白质的嵌合体CLPs。
用于此研究的三种BLV  gp51抗原决定基的序列列于下表1中。把表2中的BLV  gp51抗原决定基序列的退火寡聚核苷酸置于PAcBTV10.7（28）或PAcVC3.BTV  10.7BTV17.3（29）质粒中的BTV  10  VP7  cDNA的氨基末端来制备重组杆状病毒的转移载体。
表1.用于本研究的BLV  gp51中的抗原决定基
抗原决定基  BLV gp51氨基酸序列评估
B1  98-117(20个残基)合孢体抑制作用
B2  169-192(24个残基)T辅助抗原决定基
和结合于细胞受体上的结合位
B3  142-161(20个残基)铰链区和在三聚体
中两个gp51分子间的接触。
表2.为置于BTV10  VP7  cDNA中的编码BLV抗原决定基的寡聚核苷酸的序列
抗原决定基  序列
B1  5'-CTAGAAAATGAGCCAAGCCGATCAAGGGTCCTTTTATGTC
AATCATCAAATTTTATTCCTGCATCTCAAG-3'
5'-CTTGAGATGCTGGAATAAAATTTGATGATTGACATAAAA
GGACCCTTGATCGGCTTGGCTCATTTT-3'
B2  5'-CTAGAAAATGAGTTTAAATCAAACGGCACGGGCCTTCCC
AGACTGTGCTATATGTTGGGAACCTTCCCCTCCCTGGGC
TCCCGAA-3'
5'-TTCGGGAGCCCAGGGAGGGGAGGGTTCCCAACATATAGCAC
AGTCTGGGAAGGCCCGTGCCGTTTGATTTAAACTCA
TTTT-3'
B3  5'-CTAGAAAATGAGTAAAATTCCTGATCCCCCTCAACCCGAC
TTCCCTCAGCTGAACAGTGACTGGGTTCCCTCT-3'
5'-AGAGGGAACCCAGTCACTGTTCAGCTGAGGGAAGTCGGG
TTGAGGGGGATCAGGAATTTTACTCATTTT-3'
同上述三种转移载体的每一种以及前面所述使用Lipofectin的AcRP23-Lac  Z  DNA一起共转染单层s.f（秋粘虫）细胞以产生重组杆状病毒。带Lac  Z阴性表现型的子代病毒是纯化的斑，并用SDS-PAGE分析及用抗BTV10兔血清和抗BTV10  VP7单克隆抗体（抗VP7  MAb）进行IIP实验（间接免疫过氧化酶实验）进行挑选。用IIP实验和使用抗BTV10  VP7（抗VP7）及抗BLV  gp51合成肽（抗pp）兔血清的Western印迹分析方法，检验原种重组病毒。
IIP实验
所用IIP实验类似于已知技术介绍的方法（Sugiyama等人（1989）Res.Vet.Sci.46∶283-285）。简单地讲，用甲醇把用重组杆状病毒感染的sf（秋粘虫）细胞固定于微滴板上，然后用封闭液（5%脱脂乳的磷酸盐缓冲盐水）复盖之，再用抗体探测，接着由过氧化酶蛋白质A（Bio  Rad）检测。用邻苯二胺使结合的过氧化酶蛋白质A显现出。
经SDS-巯基乙醇处理后，用SDS-PAGE对感染的sf细胞和CLPs进行分析。把蛋白质印迹于（Millipore公司产）Immunobilon膜后，浸渍于封闭溶液中过夜，然后用抗VP7或抗pp血清检测，接着用过氧化酶蛋白质A检测，以及ECL体系（Amersham）检测。
用序列分析来确定在转移载体中的嵌合体基因的取向（图10）。构建表达BLV  B1-BTV  10  VP7嵌合体（AcB1-7）和BLV  B3-BTV  VP7嵌合体及VP3（AcVP3.B3-7）的重组杆状病毒业已完成。进一步对另一重组病毒AcVP3.B2-7的噬斑进行纯化。如表3所示，所有3种重组病毒蛋白质均同抗BTV10兔血清和抗VP7  MAb反应。
表3以重组杆状病毒感染的sf细胞的抗体
的免疫活性（用IIP实验测定）
重组杆状病毒
抗体  AcNPV  AcB1-7  AcVP3.B2-7  AcVP3.B3-7
抗BTV10  -  +  +  +
抗-VP7 MAb  -  +  +  +
抗-pp(98-117)  -  +  NT*  -
抗-pp(142-161)  -  -  NT  +
＊NT：未实验
AcVP3.B3-7感染的sf细胞也同抗pp（氨基酸残基142-161）兔血清反应，但ACB1-7蛋白质不同抗pp（98-117）兔血清反应。然而，由于此抗pp（98-117）血清也不同BLVgp51抗原反应（表4），所以由此可以检验用抗BLV  gp51或抗BLV兔血清的BLV  B1表达。
表4.用重组杆状病毒感染的sf细胞溶胞物和BLV  gp51
抗原的抗体的免疫活性（用Western印迹测定的）
重组杆状病毒
抗体  AcVP3-7  AcB1-7  AcVP3.B3-7  BLVgp51
抗-VP7 serum  +  +  +  NT
抗-pp(98-117)  -  -  -  -
抗-pp(142-161)  -  -  +  +
表5  嵌合体CPs的形成
重组杆状病毒  CLP-的形成
嵌合体  AcB1-7+AcBTV17.3  未
嵌合体  AcB1-7+AcBTV10.7-17.3  形成
嵌合体  AcVP3.B3-7  未
嵌合体  AcVP3.B3-7+AcBTV10.7  形成
嵌合体  AcVP3.B3-7+AcBTV10.7-17.3  形成
正如所预计的那样，用Western印迹分析分子量表明，嵌合体蛋白质B1-VP7和B3-VP7及BTV  VP7为40kd、42kd和38kd（图11A）。
嵌合体CLPs的形成
用AcB1-7和AcBTV17.3共感染或用AcVP3.B3-7感染的sf细胞中都不形成CLPs，即使两种情况下蛋白质合成水平都很高（表5）。只有当用这些重组病毒和表达真实VP7的重组病毒共感染的细胞才能形成嵌合体CLPs。用抗VP7和抗pp（142-161）兔血清的Western印迹分析法即可证实由AcVP3-7感染的sf细胞所得到的CLPs中存在嵌合体蛋白质（B3-7）（图12）。
实施例4
按如下方法用修饰和变异的VP7基因表达肝炎B preS2抗原决定基。
按以前所述的方法（25，28）繁殖sf细胞（ILPB-sf21）和重组杆状病毒。将标准程序用于质粒DNA操作（27）。
按所述方法（30）进行PCR（聚合酶链反应）随后进行蛋白酶K消化。用BSU36Ⅰ切BacPAK6  DNA脂感染（Lipofected）含外源基因的转移质粒载体构建重组杆状病毒，挑选白噬斑并用两次连续噬斑分析进行纯化（31）。按前面所述进行嵌合体CLPs纯化、SDS-PAGE分析、Western印迹和电子显微镜分析（28）。
氨基末端缺失
用于本发明前述研究中的VP7载体用VP7的氨基末端作外源抗原决于基的连接物，虽然50aa这样大的抗原决定基能在嵌合体CLPs的表面表达，但此载体体系一般需要用某些未修饰的VD7共感染，否则在大多数情况下将不形成颗粒或不稳定。
因此，为了提高作为载体的VP7的容量，拟构建氨基末端缺失的VP7。如果VP7的氨基末端序列不一定为形成CLPs所需，那么它们可以由其他的氨基酸序列（外源抗原决定基）来代替，并可以插入较大的顺序（大于50aa）。
利用PCR技术，使用反向引物构建二种氨基末端缺的VP7：
GGCGAGATCTTA.AGA.GAC.GTT.TAATG.GG
BglⅡ
直接引物  M  E  I  L  G  I
MEI  GGCAGATCTACCATG.GAA.ATT.TTG.GGG.ATA.G
（29aa  BglⅡ
缺失）  M  A  Q  R  N  E  M
MAQ  GGCAGATCTACCATG.GCA.CAA.AGA.AAT.GAG.ATG.T
55aa  BglⅡ
缺失）
用这些引物经PCR反应所得的片断用蛋白酶K处理，苯酚和乙醇沉淀，用BgIII限制性核酸内切酶消化后，使PCR片断克隆于pAcYM1杆状病毒表达载体的BamHI位点上（32）。用BacPAK6线性化的杆状病毒DNA得到重组病毒（31）。用考马斯兰染色聚丙烯酰胺凝胶来证实平截VP7蛋白质氨基末端的表达。正如预计的那样，平截VP7蛋白质具有的分子量为24KD（29aa缺失）和30KD（55aa缺失）。
用表达VP3的重组杆状病毒和表达VP7（29aa缺失）、VP7（55aa缺失）或作为阳性对照的VP7的重组杆状病毒共感染sf细胞制备CLPs。感染后溶胞48小时，按以前所述方法对CLPs进行纯化（28）。仅在用未缺失的VP7（而不是其平截变种）的对照实验中制备出CLPs，由此得出结论，VP7的氨基末端部分是形成CLPs所必要的，因此用外源序列来置换是不可能的。
VP7亲水区的插入物
本实验的目的是测定VP7分子中的能携代额外序列的区域，由于该区域有利于表达不同构象抗原决定基。研究这样载体是重要的，因为大部分的致免疫决定基是有不同构象的。
业已选定VP7亲水区作为该研究对象，因为一般情况下疏水区为分子间和分子内的相互作用所需。
把二个BstⅪ位点（105位和937bp）用于将氨基酸序列插入VP7。这两个位点均位于为VP7亲水区编码的VP7基因部分。对于第1位点（105位）来说，此VP7三级结构是已知的。其内的氨基酸插入物应位于A和Bβ层间的环内，因此需要进行Ⅹ-射线结晶学研究。所以，可以预计此位点的插入不会对VP7的三级结构有干扰。
为了实验将这些位点用于表达外源抗原决定基的可能性，分别合成编码四种氨基酸的寡聚核苷酸双链链体（图13）。
用BstⅪ限制性核酸内切酶消化含于PUC4K载体BamHI位点上克隆的S7基因的PUC4K-BTV-10  S7质粒，并将p6/p7和p8/p9寡聚核苷酸双链体分别与之连接。
用BamHI和BsⅪ限制性核酸内切酶进行消化检验所得克隆（图14和15）。带插入物的VP7基因从PUC4K载体上切除后，再克隆于BamHI切割和脱磷酸的pAcYMI载体中（32），并用BsⅪ消化验证。
按上述方法制备带插入物的表达VP7变种的重组杆状病毒。用表达VP3的重组杆状病毒和带插入物的表达VP7的重组杆状病毒对sf细胞进行共感染。用未修饰的VP7（但不是带4aa插入物的VP7变种）制备出CLPs。因此可以得出结论，用于插入物的位点不适合于载体目的。
内点突变
同时引入独特克隆位点来制备VP7基因的两个不同的点突变，以将其用于克隆外源致免疫的抗原决定基。克隆BTV10  VP7基因于pAcCL29质粒BamHI位点上（具有单链能力的杆状病毒表达载体）（8）。该突变示于图16。突变基因的限制性核酸内切酶分析示于图17。
一次突变把Lys255变为Ser产生ScaⅠ位点，另一次突变把Gly169变为Ser产生BgIII克隆位点。第二次突变是特别感兴趣的，因为这使VP7的RGE主体发生突变，它涉及细胞受体的结合。因此RGE主体可能在CLPs的表面，且可用于体现外源抗原决定基。
业已构建了表达突变VP7基因的重组杆状病毒。几次用表达VP3和突变VP7S（各突变体单独用）的重组杆状病毒共感染sf昆虫细胞的实验中，均证实两种突变均使CLPs形成。然而，在Lys变至Ser的突变中，CLPs似乎不完全且缺乏某些VP7。而在Gly变至Ser的突变中，形成的CLPs是完全的，看不出同用未突变的VP7生产的CLPs有差别。此位点将开发用于克隆外源致免疫抗原决定基。
实施例5
螺杆菌属（Helicobacter）幽门脲酶亚基A和B抗原决定基作为CLPs的表达研究如下。幽门螺杆菌是胃溃疡的诱发剂。生产螺杆菌属幽门脲酶有利于研制抗此病的疫苗（33）。
将二元杆状病毒载体pAcUW3用于使用单杆状病毒的螺杆菌属幽门的A和B两种亚基的表达（34）。按所述方法进行聚合酶链反应（PCR）（30）。用Bsu36.1切BacPAK6DNA对含脲酶A和B亚基的质粒转移载体进行脂感染（lipofected）以构建重组杆状病毒。收集噬斑，以两次连续噬斑试验进行纯化（31）。按以前所述方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（28）。
用PCR方法，以2.7kb  TagⅠ克隆（W.Thomas）作为模板，生产编码螺杆菌属幽门脲酶亚基A和B的基因。在多面体启动子控制下，在pAcUW3载体中，脲酶A亚基于BgHI位点将所说含编码脲酶亚基的结构基因的PCR片断克隆。用Hind  Ⅲ限制性核酸内切酶确定pAcUW3A，B.质粒中的PCR片断的取向。
用此质粒生产重组杆状病毒。若用此重组杆状病毒感染sf细胞，产生脲酶A和B亚基（图18）。在Western印迹上可见A和Bv亚基同抗脲酶抗体反应（图19）。亚基A的表达很好，而亚基B未表达到这样高的水平。亚基B似乎十分不稳定，在Western印迹上可见脲酶特异性谱带梯，这可能是有节制地表达的原因之一。
实施例6
前面业已证明，如用杆状病毒载体表达，BTV的三种次要蛋白质，VP1、VP4和VP6能并入CLPs。本实施例则介绍是否这些蛋白质能促进CLPs中的外源抗原决定基的传送。为此目的，本实施例介绍通过缺失突变和其后插入外源抗原决定基体来开发VP6蛋白质所作的种种努力。业已证明VP6羧基末端的缺失体可包入CLPs衣壳内。
构建带7-辅助抗原决定基的嵌合体蛋白质，此决定基来自BTV的VP6蛋白质的羧基末端（HindⅢ位，通过去除23氨基酸）上的SIV（41-62氨基酸）的gag基因。所得蛋白质包于类核颗粒（CLPs）衣壳内。
借助PCR，使用标准方法合成SIVgag抗原决定基。克隆的SIVgag基因用作模板，下面的核苷酸作引物：
1.正向引物
HindⅢ
5′CGCGAAGCTTCGCAAGCACTGTCAG
AAGG
2.反向引物
5′GCGCAAGCTTGGATCCTATTGATGG
TCTCC
保持正向引物上的HindⅢ位点和反向引物上的HindⅢ和BamHI位点。
构建嵌合体质粒
用HindⅢ消化含VP6  cDNA的质粒pUC19大片段以凝胶提纯。把PCR合成的HindⅢ消化片断克隆于该凝胶纯化的大片断上，通过定顺分析来检查取向和序列。
构建转移载体
用BamHI消化从pUC19切割下嵌合体VP6  SIV基因，并用杆状病毒转移载体pAcYM1于BamHI位点克隆。用定序分析来确定其取向。
用BTV  VP6制备表达SIV抗原决定基的重组杆状病毒
单层sf21细胞是共转移载体和消化的杆状病毒bakpac6  DNA的Bsu  361。感染后60小时收集含子代病毒的上清液。此重组病毒对野生型（兰斑）来说是纯化的噬斑（白斑）。
SIV  VP6于CLPs中包壳
用表达VP3和VP7的二元重组杆状病毒和SIV  VP6重组杆状病毒共感染所说细胞。感染后48小时纯化此CLPs。
构建表达SIV  VP6嵌合体蛋白质的重组杆状病毒
构建的此重组体是完全的。此嵌合体蛋白质的表达用35s甲硫氨酸体外标记和SDS-PAGE（同天然的VP6蛋白质比较）进行分析。当天然VP6缺失23氨基酸而嵌合体蛋白质（gag抗原决定基）加上23个氨基酸则两者有同样的分子量。
SIV  VP6于CLPs中包壳
在用二元重组病毒进行共感染下，把SIV  VP6包壳于由VP3和VP7形成的CLPs中。
把已制备的含SIV-VP6的大量的CLPs接种小鼠进行嵌合体SIV免疫性（主要是T细胞应答）评估。进一步的计划是开发体现外源免疫的T细胞抗原决定基的VP6蛋白质。
用本领域内公知方法，如简单地混合来配制本发明的疫苗。该疫苗的用量是普通技术人员容易确定的。成人的适宜剂量为10μg-100mg，如50μg-50mg。儿童可以使用类似剂量。人用的载体体系有如肠释放胶囊等，使本发明的抗原在胃的酸性环境下得到保护。
也可使用佐剂。适宜的粘膜佐剂有霍乱毒素。可以使用的其他佐剂有霍乱毒素的非毒性衍生物。佐剂的用量取决于所用的类型，一般而言，如用霍乱毒素，用量为5μg-50μg左右，如10μg-35μg。适宜的载体有肠溶胶囊和聚丙交酯-乙交酯微粒。0.2NNaHCO3和/或含盐水是适宜的稀释剂。
优选的给药方式有口服、鼻、直肠或眼给药。口服给药可传输到其他G.I粘膜，如肠粘膜。根据本发明的疫苗可以烟雾剂，悬浮剂，胶囊剂和/或栓剂的形式用于粘膜表面。给药方法对本领域的普通技术人员是显而易见的。
简言之，已根据含广泛研究的各种外源病毒抗原致免疫区的VP7构建了BTV结构蛋白嵌合体（如狂犬病毒糖蛋白G、乙型肝炎病毒preS2区、HIV和SIV gag及env蛋白质）。将代表狂犬病G蛋白质致免疫区的10氨基酸残基序列引入VP7的氨基末端，用重组杆状病毒表达嵌合体蛋白质，并经与其他BTV蛋白质共表达并入CLPs和VLPs。此两种颗粒均已用于小鼠引发免疫应答。并用Western印迹分析证明产生了识别为真正狂犬病G蛋白质的血清。同样，表达了含大部分乙型肝炎病毒preS2区（氨基酸残基1-48）的上游，和同VP7蛋白质氨基末端（preS2-VP7）共线性的嵌合体VP7蛋白质，并在真实的VP7和VP3存在下并入所说CLPs。两种VP7蛋白质均并入了CLPs。并入CLPs的preS2-VP7的比例受真实的VP7的表达水平的影响。对此嵌合体颗粒所作的免疫电子显微镜观察指出preS2抗原决定基曝露于CLPs的表面。
对于HIV和SIV  gag及env蛋白质而言，已实验了于三个不同的区插入嵌合体VP7（如，HIV-1  env的VP3环、SIV  gag的氨基酸残基41-60、SIV  gag蛋白质的氨基酸残基161-180）。这些抗原决定基的每一个均与BTV  VP7蛋白质的氨基末端融合，并用重组杆状病毒表达。然后将每一重组病毒同表达BTV  VP3蛋白质的第二种重组病毒一起用于感染昆虫细胞以形成CLPs。生物化学和电子显微镜分析均表明形成的嵌合体CLPs同BTV  CLPs类似。免疫金-阴性染色电子显微镜分析证实这些抗原决定基曝露于CLPs的表面。也构建了这样的嵌合体VLPs，其中的HIV  env蛋白质的V3环插入BTV  VP7的氨基末端，且同表达VP3的重组杆状病毒及（1）BTV  VP2和（2）BTV  VP5共表达。
所得数据指出，当大的抗原决定基，如HBV preS2的48氨基酸并入BTV  VP7的氨基末端时，在同BTV  VP3共表达时阻止了CLPs的形成。然而，当与制备VP7和VP3的二元基因载体共表达时，则并入了嵌合体蛋白质。
相反的，如将小的抗原决定基（如代表狂犬病G序列的10氨基酸序列）并入VP7氨基末端，仅用VP3共表达，则形成CLPs。同样，业已发现使用如由HIV  V3环（30氨基酸残基）高度可变区衍生的N-末端序列嵌合体VP7，即可在无真实的VP7蛋白质存在下形成CLPs。
BTV的VP7以三聚体形式存在于CLPs表面。近来分析表明，如用合成大量VP3的载体共感染制备不足的VP7，则产生不完全的CLPs，即缺失某些表面VP7排列的CLPs。也可依次把VP7加到VP3亚核中，首先加到稳定此结构的位置，然后加到使CLPs表面结构完整的位置。如使用此种办法不能仅用VP3使嵌合体VP7制备成CLP时，则补充入未修饰的VP7蛋白质，以允许并入嵌合体蛋白质中。
本发明涉及含乙型肝炎病毒（HBV）preSe区的48个氨基酸残基、HIV-1  V3环30氨基酸残基和狂犬病毒G蛋白质10氨基酸残基的嵌合体VP7蛋白质的表达。为制备嵌合体CLPs和VLPs，将嵌合体VP7蛋白质与天然BTV结构蛋白质一起在杆状病毒中来表达。
在最大的嵌合体蛋白质，VP7/HDV pre-S2情况下，虽然在同VP3表达时，此蛋白质不能包容于CLPs内，但当用VP3和VP7共表达时，此蛋白质能包容入CLPs内，这一事实表明此颗粒可适应各种形式的VP7。已对这些颗粒的生物和免疫特性进行了分析。正如免疫电子显微镜所证实的那样，HBV抗原决定基位于CLPs表面。
只有当sf细胞被该重组病毒和表达BTV的未修饰的VP7和VP3的重组杆状病毒共感染时，嵌合体蛋白质才在sf细胞中形成BTV类核颗粒（CLPs）。并入CLPs中的preS2-VP7的比例受该两种病毒相对感染复制率影响。对此嵌合体颗粒所作的免疫电子显微镜分析指出preS2抗原决定基曝露于此CLPs的表面。如果用preS2-VP7重组病毒和仅合成VP3蛋白质的杆状病毒载体对昆虫细胞进行共感染，则未鉴别出有CLPs。
高水平BTV嵌合体CLPs的合成为生产大抗原决定基提供了新的手段，由这种CLPs产生的外源抗原决定基的免疫原性在小鼠中得到了证实。
除了存在作为本发明的VLPs或CLPs嵌合体蛋白质一部分的抗原决定基外，一般的VLPs和CLPs结构又能使其他抗原并入，例如在空中心区。
利用本说明书中公开的方法，可生产多效价疫苗。
利用本发明方法制备的CLPs和VLPs有着超过其他方法的一些特殊的优点。首先，能大量地进行生产，特别是该方法用于提高杆状病毒载体的表达能力时更是如此（例如能以每升培养物20-30mg的量进行生产，能在无血清的培养液中生产，能稳定地进行冷冻干燥）。第2，鉴于本发明颗粒的物理性质，能使用一般的一步法来纯化（细胞溶胞物梯度离心法）LCPs和VLPs。第3，可以基本上在无任何可检测出量的外源物如昆虫或杆状病毒蛋白质和RNAs或DNAs的形式下来生产CLPs和VLPs。第4，使用的纯化步骤无损害足以维持所说颗粒的天然构象的形态结构。第5，虽然所说颗粒能有效地附于细胞上并为细胞所吸收，但能使这些颗粒以不复制的形式制备。第6，CLPs和VLPs（尤其基于BTV的）能耐受很宽范围的其他的蛋白质序列而不破裂，并能包容多种抗原决定基。最后一点，也是最重要一点，生产的VLPs具有固有的性质，在脊椎动物宿主中既诱导B细胞应答，也诱导T细胞应答。
简言之，所研制的CLPs和VLPs能传输代表病毒抗原决定基的多肽成分以产生保护性免疫作用。此CLPs和VLPs，尤其是BTV的CLPs和VLPs，是大型多蛋白质结构。
它们能并入结构蛋白质的其他蛋白质形式（如嵌合体VP7），其中包括这些蛋白质的其他形式（如VP7a和VP7b）。此外，有可能使用多种蛋白质类型来传输抗原（如VP2和/或VP5和/或VP7）。此特征具有重要的意义，例如，减少不应答的机会：设计产生免疫性的疫苗应优选不只基于单病毒序列或抗原，而应该包括尽可能多的适用的致免疫序列。为了避免初次接种产生抗BTV应答，基于其他BTV血清型的VLPs也能用于连续免疫接种，这是BTV系统特别有用的特点，这是其他抗原传输体系目前尚不能采用的（例如牛痘、脊髓灰质炎、T型颗粒或沙门氏杆菌媒介）。
由杆状病毒载体高水平生产CLPs和VLPs，表明此体系适合作为能使多种外来抗原传输给免疫体系以诱发细胞和体液免疫性的载体体系。
根据本发明，外来抗原按能使抗原决定基位于CLPs和VLPs中的内位点上的方式，表达为CLPs和VLPs蛋白质成分上的抗原决定基。这能使外来的抗原在抵达所希望的位置前都受到保护不至于发生蛋白水解和/或不受到抗体的攻击。用其中的VP7是嵌合体形式的嵌合体VLP即可实现此目的。
同样，由于VP3同BTV蛋白质的已知的相互作用，形成的这种次要蛋白质的嵌合体类似物，也提供了在所得的嵌合体VLPs中于保护位置上的位点处引入外来基因的机会。
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Claims (36)

1、一种颗粒形的包括能相互合作组装成类病毒颗粒(VLPs)或类病毒核颗粒(CLPs)的多种蛋白质的抗原，其特征在于所说颗粒包括两种或多种不同的蛋白质，该蛋白质中的每一种蛋白质包括：由选择的病毒种的天然蛋白质衍生的氨基酸序列，以及所说蛋白质中的至少一种蛋白质是嵌合体并包括由外来的而非天然蛋白质衍生的氨基酸序列。
2、一种根据权利要求1的颗粒形抗原，所说抗原由包括两种基本的蛋白质和一种或多种任选的（即可有可无）其他蛋白质的CLPs所组成的，其中所说的基本蛋白质选自病毒主要内衣壳蛋白质，所说任选的蛋白质选自次要内衣壳蛋白质。
3、一种根据权利要求2的颗粒形抗原，所说抗原包括0.1.2或3种其他任选的病毒次要内衣壳蛋白质。
4、一种根据权利要求1的颗粒形抗原，由包括3种基本的和1种或多种任选的（即可有可无）蛋白质的VLP组成，其中：所说基本蛋白质中的两种蛋白质是病毒主要内衣壳蛋白质，所说基本蛋白质中的一种蛋白质是病毒主要外衣壳蛋白质，所说任选的蛋白质选自次要内衣壳蛋白质和主要外衣壳蛋白质。
5、一种根据权利要求4的颗粒形抗原，包括0或1种任选的病毒主要外衣壳蛋白质。
6、一种根据权利要求4或5的颗粒形抗原，包括0.1.2或3种其他任选的病毒次要内衣壳蛋白质。
7、一种根据上述任一项权利要求的颗粒形抗原，其中所说由外来蛋白衍生的氨基酸序列包括由抗所说外来蛋白的抗体识别的抗原决定基。
8、一种根据以上任一权利要求的颗粒形抗原，其中所说外来蛋白质是患病生物体的蛋白质，所说颗粒形抗原能在易感受所说疾病的生物体中产生保护性抗体或细胞免疫应答。
9、一种根据上述任一权利要求的颗粒形抗原，包括天然形的所说的不同蛋白质中的一种。
10、一种根据上述任一权利要求的颗粒形抗原，其中所说不同的蛋白质只有一种是嵌合体。
11、一种根据上述任一权利要求的颗粒形抗原，其中所说不同的蛋白质包括天然形的所说第1和第2蛋白质，还包括嵌合形的所说第1和第2蛋白质中的一种。
12、一种根据上述任一权利要求的颗粒形抗原，其中所说第1和第2蛋白质包括由呼肠孤病毒（Reoviridae）科家族的病毒蛋白质衍生的氨基酸序列。
13、一种根据权利要求12的颗粒形抗原，其中所说第1和第2蛋白质包括由环状病毒属、轮状病毒或呼肠孤病毒属蛋白质衍生的氨基酸序列。
14、一种根据权利要求12至13的颗粒形抗原，其中所说蛋白质包括由兰舌（bluetongue）病毒蛋白质衍生的氨基酸序列。
15、一种根据上述任一项权利要求的颗粒形抗原，该抗原由包括两种基本蛋白质和一种或多种其他任选（即可有可无）蛋白质的CLP所组成，其中所说基本蛋白质是病毒主要内衣壳蛋白质VP3和VP7，所说任选的蛋白质选自次要衣壳蛋白质VP1、VP4和VP6。
16、一种根据权利要求15的颗粒形抗原，由下述蛋白组合之一种所组成：
VP3+VP7
VP3+VP7+VP1
VP3+VP7+VP4
VP3+VP7+VP6
VP3+VP7+VP1+VP4
VP3+VP7+VP4+VP6
VP3+VP7+VP1+VP6
VP3+VP7+VP1+VP4+VP6
17、一种根据上述任一项权利要求的颗粒形抗原，其中所说抗原由包括三种基本蛋白质和一种或多种其他任选蛋白质的VLP所组成，所说基本蛋白质中的两种蛋白质是病毒主要内衣壳蛋白质VP3和VP7，所说基本蛋白质中的一种蛋白质是选自VP2和VP5的病毒主要外衣壳蛋白质，所说任选的蛋白质选自次要内衣壳蛋白质VP1、VP4和VP6及主要外衣壳蛋白质VP2和VP5。
18、一种根据权利要求17的颗粒形抗原，该抗原由下述蛋白质组合中的一种所组成：
VP2+VP3+VP7
VP2+VP3+VP7+VP1
VP2+VP3+VP7+VP4
VP2+VP3+VP7+VP6
VP2+VP3+VP7+VP1+VP4
VP2+VP3+VP7+VP1+VP6
VP2+VP3+VP7+VP4+VP6
VP2+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
VP5+VP3+VP7
VP5+VP3+VP7+VP1
VP5+VP3+VP7+VP4
VP5+VP3+VP7+VP6
VP5+VP3+VP7+VP1+VP4
VP5+VP3+VP7+VP1+VP6
VP5+VP3+VP7+VP4+VP6
VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1
VP2+VP5+VP3+VP7+VP4
VP2+VP5+VP3+VP7+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP4
VP2+VP5+VP3+VP7+VP4+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP1+VP6
VP2+VP5+VP3+VP7+VP6+VP4+VP6
19、一种根据权利要求16-19中任一项的颗粒形抗原，其中所说蛋白质是兰舌病毒蛋白质BTV-VP3和BTV-VP7。
20、一种根据权利要求10的颗粒形抗原，其中所说蛋白质包括嵌合体BTV-VP7，此嵌合体BTV-VP7包括由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外来蛋白质（非BTV-VP7）衍生的氨基酸序列。
21、一种根据权利要求20的颗粒形抗原，其中所说的VLPs或CLPs包括：（ⅰ）天然BTV-VP3，（ⅱ）天然BTV-VP7和（ⅲ）嵌合体BTV-VP7及由外来蛋白质（非BTV-VP7）衍生的氨基酸序列。
22、一种根据上述任一权利要求的颗粒形抗原，其中所说外来蛋白质是人免疫缺陷病毒（HIV）蛋白质或人乙型肝炎病毒（HBV）蛋白质。
23、一种生产包含至少一种非天然蛋白质的VLP或CLP的方法，此方法包括由包含第1和第2天然病毒蛋白质和所说非天然蛋白质的多种不同蛋白质组装成所说的VLPs和CLPs，其特征在于所说非天然蛋白质是嵌合体且包括由外来蛋白质衍生的氨基酸序列和由所说的第1和第2天然病毒蛋白质衍生的氨基酸序列。
24、一种根据权利要求23的方法，其中所说的第1和第2不同蛋白质包括环状病毒属、轮状病毒或呼肠孤病毒属的蛋白质衍生的氨基酸序列。
25、一种根据权利要求24的方法，其中所说的第1和第2不同蛋白质包括由兰舌病毒蛋白质衍生的氨基酸序列。
26、一种根据权利要求25的方法，其中所说兰舌病毒蛋白质是BTV-VP3和BTV-VP7。
27、一种根据权利要求26的方法，其中所说VLPs或CLPs包括嵌合体BTV-VP7，此嵌合体BTV-VP7包括由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外来蛋白（非BTV-VP7）衍生的氨基酸序列。
28、一种根据权利要求26的方法，其中所说VLPs或CLPs包括（ⅰ）天然BTV-VP3，（ⅱ）天然BTV-VP7和（ⅲ）包含由天然BTV-VP7衍生的氨基酸序列和由外来蛋白质（非BTV-VP7）衍生的氨基酸序列的嵌合体BTV-VP7。
29、一种根据权利要求23-28的任一项的方法，其中所说的由外来蛋白质衍生的氨基酸序列位于所说嵌合体蛋白质的N末端。
30、一种根据权利要求23-29的任一项的方法，其中构成蛋白质被共表达。
31、一种根据权利要求23-30任一项的方法，其中所说的表达系统包括杆状病毒表达载体。
32、一种根据权利要求24-31任一项的方法，其中所说构成蛋白质在昆虫或昆虫细胞中表达。
33、一种包括根据权利要求1有效量的抗原和治疗上可接受的载体或稀释剂的疫苗组合物。
34、一种在需治疗的宿主中诱导保护性致免疫应答的方法，该方法包括给宿主使用有效量的根据权利要求1的抗原的给药步骤。
35、一种根据权利要求34的方法，其中将所说抗原施用于所说宿主的粘膜表面。
36、一种根据权利要求35的方法，其中所说方法为经口服给药。
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