CN1419564A - 包含脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守区域的蛋白质 - Google Patents

包含脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守区域的蛋白质 Download PDF

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Abstract

本发明提供了含有修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原的新蛋白质和编码核酸。所述修饰的表面蛋白质的非保守氨基酸缺失，因而可以引起抗脑膜炎奈瑟氏球菌的交叉保护免疫反应。本发明还涵盖了所述修饰的表面蛋白在诊断、治疗和预防性疫苗以及设计和/或筛选药物中的应用。所述修饰的表面抗原特别用于疫苗中，其比相应的野生型表面抗原可以更有效地免疫接种而对抗更广谱的脑膜炎奈瑟氏球菌。

Description

包含脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守区域的蛋白质
发明领域
本发明涉及组成修饰形式的脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原的新蛋白质，涉及编码这种新肽和多肽的核酸，及涉及这些物质在诊断性，治疗性和预防性疫苗中的应用，及设计和/或筛选药物中的应用。更特别地，通过缺失非保守的氨基酸，本发明的修饰的表面抗原在疫苗中比相应的野生型表面抗原在对抗更广谱脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中更加有效。
发明背景
脑膜炎奈瑟氏球菌是一种革兰氏阴性菌，是导致脑膜炎奈瑟氏球菌性脑膜炎和败血病的主要因素。其唯一已知的宿主是人，而且大约10％的人可以是无症状携带者(Caugant等，1994，临床微生物学杂志32：323)。
脑膜炎奈瑟氏球菌可以表达一种多糖荚膜，使得可以根据表达的荚膜的性质对此菌进行分类。有至少12种脑膜炎奈瑟氏球菌血清型：A，B，C，29-E，H，I，K，L，W135，X，Y和Z，其中血清型A，B，和C导致90％的脑膜炎奈瑟氏球菌性疾病(Poolman等，1995，感染性因素和疾病4:13)。可以获得直接抗血清型A和C的疫苗，但血清型B荚膜多糖在人体内免疫原性很低，不能诱导保护作用。
因此对其它膜和胞外成分是否适于包含于疫苗中进行测试。例如测试1，2和3型(膜孔蛋白；由por基因编码)，和4型(Rmp)和5型(不透明性蛋白；由opa和opc基因编码)的外膜蛋白。
然而，目前这些候选物中无一能诱导完全的防护作用，尤其在儿童中(Romero等，1994，临床微生物学回顾，7559；Poolman等，1995，如前)。
为产生一种有效的疫苗，必需鉴别出在多数菌株中存在的而且能诱导防护性免疫应答的脑膜炎奈瑟氏球菌的成分(例如细菌抗体)。
在这方面，参考国际出版物WO99/24578，WO99/36544和WO99/57280，所述文献均在此并入参考，并阐述了一些可用于疫苗中以抗脑膜炎奈瑟氏球菌免疫的候选蛋白。
在这方面，特别参考国际出版物WO99/31132和Peak等，2000，FEMS免疫学医学微生物学28 329，所述文献在此均并入参考，并阐述了一种分离自一些不同脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的新表面抗原，这些表面抗原及其等位基因变体在本说明书中称为NhhA。
发明概述
本发明人揭示了NhhA表面抗原具有在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株之间可以变化的多肽区域，和其它在菌株之间是保守的区域。可变区域可以是免疫原性的，并趋于激发菌株特异性免疫应答，这样包含衍生自特定脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA抗原的疫苗趋于优先对特定菌株有免疫作用。因此，本发明人探求产生一种修饰的NhhA多肽，其激发一种与由野生型NhhA激发的菌株特异性免疫应答不同的免疫应答。这种修饰的NhhA抗原用于产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌的治疗性和/或预防性疫苗，如下文所述。通过主要指导抗保守表位的免疫应答，这种疫苗对广谱脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫作用应比野生型NhhA的免疫作用更有效。
本发明因此主要涉及分离具有NhhA多肽保守氨基酸的蛋白质。
因此本发明的蛋白质与相应野生型NhhA多肽相比，可以缺失一或多个非保守的氨基酸。
本发明的第一方面提供了一种分离的蛋白质，其包含NhhA多肽的12个或更多个连续的保守氨基酸的序列，所述分离的蛋白质不包括野生型NhhA多肽。
适当地，本发明的蛋白质能激发一种免疫应答。
优选地，这种免疫应答比所述相应野生型NhhA多肽激发的免疫应答的菌株特异性低。
更优选地，所述免疫应答提供了抗一或多个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的防护作用，或者甚至更优选地抗大多数脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的防护作用。
野生型NhhA多肽序列示于图1(SEQ ID NO：1-10)。
共有氨基酸序列也示于图1(SEQ ID NO：11)。
本发明分离的蛋白质优选包含NhhA多肽的一或多个保守区，在图1中称为C1，C2，C3，C4和C5区。
应意识到根据本发明的这方面，与野生型NhhA多肽相比，NhhA多肽的一个可变区可缺失一或多个非保守氨基酸，所述可变区在图1中称为V1，V2，V3或V4区。
优选地，V1区或至少其大部分是缺失的。
在特定的实施方案中，分离的蛋白质具有图5-9(SEQ ID NO：23-27)所示任一种氨基酸序列，所述图5-9(SEQ ID NO：23-27)所示序列是“本发明修饰的NhhA多肽”的实例。在图14(SEQ IDNO：33-39)中，还提供了除去N末端信号序列所得的“成熟”多肽的实例。
本发明的第二方面提供了一种编码本发明第一方面的多肽的分离的核酸。
野生型NhhA核酸序列示于图2(SEQ ID NO：12-21)。
共有核酸序列也示于图2(SEQ ID NO：22)。
优选地，C1，C2，C3，C4和C5区由图2所示各个核苷酸序列编码。
优选地，V1，V2，V3和V4区由图2所示各个核苷酸序列编码。
在一个特殊的实施方案中，本发明分离的核酸序列具有图5-9(SEQ ID NO：28-32)所示任一种核苷酸序列，图5-9(SEQ IDNO：28-32)所示序列是“本发明修饰的nhhA核酸”的特别实例。
根据本发明的第一和第二方面，本发明还涵盖了本发明分离的蛋白质和核酸的同源物，片段，变体和衍生物。
本发明不包括野生型NhhA多肽和nhhA核酸。
本发明的第三方面提供了一种表达构建体，其包含一种表达载体和本发明第二方面的核酸，其中所述序列与所述表达载体中的一或多个调节性核酸可操纵连接。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面的表达构建体。
本发明的第五方面提供了一种产生本发明第一方面的重组的分离的蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)培养含有本发明第三方面的表达载体的宿主细胞，
   以使所述多肽在所述宿主细胞中表达；
(ii)分离所述重组的多肽。
本发明的第六方面提供了一种抗体或抗体片段，其结合本发明的蛋白质或其片段，变体或衍生物。
本发明的第七方面提供了一种检测怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌的生物学样品中脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)从个体中分离生物学样品；
(ii)将所述抗体或抗体片段与生物学样品组合；
(iii)检测特异性结合的抗体或抗体片段，表示脑膜炎奈
瑟氏球菌的存在情况。
本发明的第八方面提供了一种检测怀疑含有脑膜炎奈瑟氏球菌的生物学样品中所述细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从患者中分离生物学样品；
(ii)检测所述样品中本发明第二方面所述核酸序列，其
    表示所述细菌的存在情况。
本发明的第九方面提供了一种诊断个体中脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将取自个体的生物学样品与本发明的多肽，其片
   段，变体或衍生物接触；
(ii)测定在所述样品中所述多肽，片段，变体或衍生物
   与脑膜炎奈瑟氏球菌特异性抗体之间的复合物存在
   与否，其中存在所述复合物表示存在所述感染。
优选地，个体是哺乳动物。
更优选地，个体是人。
在本发明的第十方面，还涵盖了上述本发明第一方面所述分离的蛋白质，本发明第二方面所述的分离的核酸，或上述抗体或抗体片段在一试剂盒中用以检测生物学样品中的脑膜炎奈瑟氏球菌的用途。
在本发明的第十一方面中，提供了一种药物组合物，其含有本发明第一方面所述的分离的蛋白质。
优选地，所述药物组合物是疫苗。
在本发明的第十二方面中，提供了一种预防脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括施用药物学有效量的上述疫苗。
在本发明的第十三方面中，提供了一种鉴别本发明第一方面所述的分离的蛋白质，其变体或衍生物的免疫原性片段的方法，包括以下步骤：
(i)产生所述多肽，变体或衍生物的片段；
(ii)将所述片段施用于个体；
(iii)在所述个体中检测免疫应答，应答包括产生特异性
   结合脑膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽，变体或衍
   生物的因子，和/或抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保
   护性作用。
优选地，个体是哺乳动物。
更优选地，个体是人。
附图及表简述
表1：鉴别来自10个指定脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA多肽的保守区(C1，C2，C3，C4和C5)和可变区(V1，V2，V3和V4)。还指明了相关的SEQ ID NOS。1列是菌株名称。SEQ ID NO：1-9是先前在WO99/31132中所述的；菌株Z2491的NhhA和nhhA序列得自 http://www.sanger.ac.uk/Projects/Nmeningitidis/；2列是C1区氨基酸编号；3列是V1区氨基酸编号；4列是C2区氨基酸编号；5列是V2区氨基酸编号；6列是C3区氨基酸编号；7列是V2区氨基酸编号8列是C4区氨基酸编号；9列是V4区氨基酸编号；10列是C5区氨基酸编号。注意还示出了共有序列(SEQ ID NO：11)的氨基酸编号。
表2：氨基酸取代表。
图1：10个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA氨基酸序列(SEQ IDNO：1-10)及共有序列(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列对比。在此序列对比中使用的菌株名称和多肽序列相当于表1中1列所示菌株名称和SEQ ID NOS。氨基酸以标准单字母缩写表示。共有氨基酸只是在残基是完全保守的位置示出。在共有序列之下标明了保守区(双下划线的，以C1，C2，C3，C4，C5标示)和可变区(单下划线的，以V1，V2，V3，V4标示)。
图2：来自10个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的nhhA核酸的核苷酸序列对比，所述序列编码图1所示氨基酸序列。C1，C2，C3，C4，C5区和V1，V2，V3，V4区如图1和表1所述。
图3：相当于pCO14K的质粒图谱，该质粒具有可操纵地连于porA启动子的编码野生型PMC21 NhhA的PCR扩增产物(数据未示出)。(未绘出刻度)3A：实心箭头表示pCO14K中porA和kanR基因的序列对比。示出了用于扩增PMC21菌株的nhhA基因的寡核苷酸引物HOMP5’和HOMP3’AN。NhhA基因是用带点的箭头表示的，porA启动子用黑方框表示，示出了如实施例2所述用于用nhhA置换porA的EagI和NcoI限制位点。3B：pIP52(PMC21)中基因的序列排列，如实施例2所述。BglII位点用于构建实施例4中所述的突变体。
图4：缺失NhhA多肽的特异区域的剪接重叠延伸PCR策略图式。野生型nhhA基因的图式示于图4A-C的上部，重组nhhA的图式在这些图的下部，可变区用黑色表示，保守区用未填充的方框表示。箭头表示寡核苷酸引物的大致位置。垂直阴影线表示扩增产物。来自nhhA核酸的非连续区域的寡核苷酸序列在此非连续区域之间用点线表示。表示的是大致的数值范围。双垂直线只是表示C5区的一部分。A：示出实施例6所述的策略。B：示出实施例7所述的策略。C：示出实施例8所示策略。
图5：(A)实施例4中产生的PMC21 NhhA缺失突变体多肽(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列；(B)编码核苷酸序列(SEQ IDNO：28)。
图6：(A)实施例5中产生的H41 NhhA缺失突变体多肽(SEQID NO：24)的氨基酸序列；(B)编码核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。
图7：(A)实施例6中通过剪接重叠PCR产生的PMC21 NhhA缺失突变体多肽(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列；(B)编码核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。
图8：(A)实施例7中通过剪接重叠PCR产生的PMC21 NhhA缺失突变体多肽(SEQ ID NO：26)的氨基酸序列；(B)编码核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。
图9：(A)实施例8中通过剪接重叠PCR产生的PMC21 NhhA缺失突变体多肽(SEQ ID NO：27)的氨基酸序列；(B)编码核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。
图10：野生型和NhhA缺失突变体多肽序列的氨基酸序列对比。这些多肽是如实施例2，3，4和5所述产生的。氨基酸用单字母缩写表示。相当于表1和图1所示区域的标示为C1，C2，C3，C4和C5的保守区，在H41和PMC21的全长序列中用双下划线表示，相当于表1和图1所示区域的标示为V1，V2，V3，V4的可变区在H41和PMC21的全长序列中用单下划线表示。
图11：示出NhhA过表达的Western免疫印迹。将45ug总细胞蛋白在4-20％梯度的SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)上分离，之后移至硝基纤维素滤膜上，进行Western免疫印迹，如实施例9所述。泳道1：示出野生型NhhA表达水平的亲代菌株。泳道2：菌株P6(如实施例2所述过表达PMC21 NhhA)。泳道3：菌株PΔ6(如实施例4所述过表达截短的PMC21 NhhA)。泳道4：菌株H14(如实施例3所述过表达H41 NhhA)。泳道5：菌株HΔ8(如实施例5所述过表达截短的H41 NhhA)。泳道6：菌株2A(如国际出版物WO99/31132所述通过突变nhhA基因废止NhhA表达)。分子量标准迁移示为185kDa，119kDa，85kDa，62kDa，51.2kDa，38.2kDa，22.4kDa。野生型NhhA多肽在泳道1中以高分子量免疫反应条带呈现，但在泳道6中不存在。
图12：分离的NhhA缺失突变体多肽。NhhA多肽是如实施例9所述分离的，之后在4-20％SDS-PAGE上分离。此聚丙烯酰胺凝胶是用考马斯蓝染色的。泳道1：如实施例6所述过表达截短的PMC21NhhA多肽的菌株的OMC制品。泳道2：纯化的截短的PMC21 NhhA多肽。泳道3：如实施例4所述过表达截短的PMC21 NhhA多肽的菌株的OMC制品。泳道4：纯化的截短的PMC21 NhhA多肽。泳道5：如实施例2所述过表达PMC21 NhhA多肽的菌株的OMC制品。泳道6：纯化的PMC21 NhhA多肽。泳道7：分子量标准，173kDa，111kDa，80kDa，61kDa，49kDa，36kDa。注意在除了6泳道之外的所有泳道中的反应性高分子量种类可能代表NhhA多肽的多聚体。其它条带可能是稳定性略差形式的NhhA或破坏产物。注意这些物质在泳道6中不存在。
图13：使用抗NhhA蛋白小鼠血清进行Western免疫印迹。在所有的实验组中，泳道1，3，5，7含有过表达PMC21 NhhA多肽的菌株的OMC，泳道2，4，6，8含有不表达NhhA的菌株2A的OMC。A组：泳道1和2：用野生型PMC21 NhhA以1∶1000稀释度接种小鼠A。泳道3和4：用野生型PMC21 NhhA以1∶10000稀释度接种小鼠A。泳道5和6：用野生型PMC21 NhhA以1∶1000接种小鼠B。泳道7和8：用野生型PMC21 NhhA以1∶10000接种小鼠B。B组：泳道1和2：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例4)以1∶1000稀释度接种小鼠C。泳道3和4：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例4)以1∶10000稀释度接种小鼠C。泳道5和6：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例4)以1∶1000稀释度接种小鼠D。泳道7和8：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例4)以1∶1000稀释度接种小鼠D。C组：泳道1和2：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例6)以1∶1000稀释度接种小鼠E。泳道3和4：用截短的PMC21NhhA多肽(实施例6)以1∶10000稀释度接种小鼠E。泳道5和6：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例6)以1∶1000稀释度接种小鼠F。泳道7和8：用截短的PMC21 NhhA多肽(实施例6)以1∶1000稀释度接种小鼠F。
图14：推定的成熟NhhA多肽缺失突变体。A：实施例2中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：33)；B：实施例3中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：34)；C：实施例4中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：35)；D：实施例5中所述推定的成熟蛋白质(SEQ IDNO：36)；E.实施例6中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：37)；F：实施例7中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：38)；和G：实施例8中所述推定的成熟蛋白质(SEQ ID NO：39)。
发明详述
在本说明书中，除非特别说明，术语“包含”意味着含有一定的整体或整体组，但不除外任何其它整体或整体组。
就术语而言，NhhA在此是指本发明的蛋白质，nhhA是指本发明的核酸。还应意识到NhhA/nhhA蛋白质和核酸例如但非限制性包括WO99/31132中所述的HiaNm/hianm蛋白质和核酸。
本发明通过阐明10个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中NhhA多肽中保守的和低保守的区域加以论述，至少部分论述。相应区域推断为在例证的NhhA多肽的其它等位基因变体中是保守的。
应意识到本发明的关键是通过缺失野生型NhhA多肽中非保守的氨基酸，形成本发明的一种修饰的NhhA多肽，基于免疫接种所述本发明多肽可以激发一种免疫应答，通过指导抗保守表位的免疫应答提供对一或多种异源脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的保护作用。
本文所用术语“非保守的”氨基酸是指在来自第一个脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的野生型NhhA多肽中存在的，但在一或多个其它菌株的野生型NhhA多肽不存在的氨基酸残基。
适当地，本发明第一方面的多肽与相应的野生型序列相比，缺失V1，V2，V3，或V4区之一的至少一部分，并因此可以统称为“缺失突变体”。
应意识到本发明人已经鉴别了V1，V2，V3，或V4区是野生型NhhA多肽中具有与相对保守的C1-5区域相比相对高频率的非保守的氨基酸的区域。
在V区域中，V1(高变的)和V2区具有最高频率的非保守氨基酸，而V3和V4具有相对较低的频率。然而，V1区与V2区相比组成了野生型NhhA多肽更重要的部分(就总氨基酸而言)。因此，优选本发明第一方面的分离的蛋白质至少缺失V1区的基本部分。
技术人员还应意识到在构建所述缺失突变体时，在不同的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA多肽之间的区域“改组”是可能的。例如，本发明的一个NhhA多肽可以含有一个H41 C1区域和一个PMC21 C5区域。
这种“改组”特别适于重组DNA方法。
在本发明中，术语“分离的”是指从其天然状态中分离的物质，或进行人工操作的其它物质。分离的物质可以是基本或根本没有天然状态时通常伴随它的成分，或可以是人工操作成为具有在其天然状态中通常伴随其的成分的人工状态。分离的物质可以是天然或重组形式。
术语“蛋白质”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是本领域熟知的天然的或非天然的氨基酸。
术语“肽”是指具有不超过50个氨基酸的蛋白质。
多肽是指具有50个或更多个氨基酸的蛋白质。
本文所用短语“激发免疫应答”是指本发明分离的多肽在施用其的哺乳动物体内产生免疫应答的的能力，其中应答是针对脑膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽的。优选地，免疫应答包括产生细菌抗体。更优选地，免疫应答是抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的保护性应答。
文中关于免疫应答所用术语“菌株特异性”是指或至少主要是指自体的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。
本文所用术语“交叉反应”是指本发明的多肽激发针对一或多个异源脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的免疫应答的能力。
本文所用术语“交叉防护性”是指本发明的多肽激发免疫应答，并从而提供对抗一或多个异源脑膜炎奈瑟氏球菌菌株感染的防护能力。
因此，前述本发明多肽在此可以称为“免疫原”或“免疫原性的”。
尽管为本发明之目的，所述修饰的NhhA蛋白质已经通过图5-9(SEQ ID NO：23-27)和图14所示氨基酸序列例证，但本发明还涵盖了例证的蛋白质的片段，衍生物和变体(如等位基因变体)。
例如，图1所示任何C1-5序列均可以缺失氨基酸，而V1-4区中不是所有的非保守氨基酸均需要缺失以降低菌株特异性免疫原性。
因此，本发明分离的蛋白质可以包括C1-5和V1-4区的片段。
事实上，如后文实施例中所述，利用常规限制性内切酶位点，和达到高水平表达稳定的免疫原性蛋白质，缺失C1，C2，C3，C4和/或C5区，或V1，V2，V3和/或V4区中的一或几个氨基酸，对基于重组DNA产生本发明的多肽是有利的。
在一个实施方案中，“片段”包括一种氨基酸序列，其组成少于100％，但至少20％，优选至少50％，更优选至少80％，或者甚至至少90％的所述C1，C2，C3，C4或C5区域。
片段例如可以是这样的肽，其包含少至12个氨基酸如C2区(SEQ ID NO：11)，或包含至少20个连续氨基酸的序列，或包含相当于一些或所有所述C1，C2，C3，C4和/或C5区的100个以上连续氨基酸的序列。
本文例证的其它片段是修饰的本发明的NhhA多肽，其经过翻译后加工形成成熟多肽，如图14所示。
在另一个实施方案中，“片段”是一种小肽，例如其长度为至少6个，优选至少10个，更优选至少20个氨基酸，其包含一或多个抗原性决定簇或衍生自修饰的本发明的NhhA蛋白的表位。也涵盖包含一个以上肽的较大片段，并可以通过应用标准重组核酸方法获得或使用常规液相或固相合成方法合成。例如，可以参考例如由Atherton和Shephard所著“肽合成”第9章中所述的液相或固相合成方法，所述文献包含于由Blackwell科学出版社出版的Nicholson编辑的“合成疫苗”中。或者，可以通过用蛋白酶如endoLys-C，endoArg-C，endoGlu-C和葡萄球菌毒素V8-蛋白酶消化本发明的多肽而产生所述肽。消化的片段可以通过例如高压液相色谱(HPLC)技术纯化。
本文使用术语“变体”多肽是本发明的多肽，其中一或多个氨基酸已经用不同的氨基酸置换。本领域熟知可以将一些氨基酸改变为具有相似性质的其它氨基酸，而不改变多肽的活性性质(保守取代)。可以在多肽中进行表2所示保守取代。
通过选择比表2所示保守性低的取代而实质上改变功能。其它置换可以是非保守性取代，这些置换相对较少的可以耐受。通常地，使多肽性质可能产生最大变化的取代是其中(a)亲水性残基(例如Ser或Thr)取代或被疏水性残基(例如Ala，Leu，Ile，Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代或被任何其它氨基酸取代；(c)具有正电侧链的残基(例如Arg，His或Lys)取代或被负电残基(例如Glu或Asp)取代；(d)具有大侧链的残基(例如Phe或Trp)取代或被具有较短侧链的残基(例如Ala，Ser)或无侧链的残基(如Gly)取代。
术语“变体”还包括产生自本说明书中例证的序列的等位基因变体的NhhA多肽。
NhhA多肽变体可包含在术语“多肽同源物”的范围内。
多肽同源物与所述本发明修饰的NhhA多肽的氨基酸序列呈现至少70％，优选至少80％，更优选至少90％的序列相同性。
本文经常使用的术语“同源物”与本发明的核酸或多肽具有一确定的核苷酸或氨基酸序列关系。
例如，预期这种同源物具有不同于那些例证的氨基酸的序列，但其是免疫原性的并提供交叉保护性免疫。
术语“同源物”特别不包括的是野生型NhhA多肽和nhhA核酸。
包含在同源物范围内的是“直向同源物”，其是分离自除了脑膜炎奈瑟氏球菌之外其它细菌菌种的功能相关多肽及其编码核酸。
用于阐述各个核酸和多肽之间序列关系的术语包括“对比窗”，“序列相同性”，“序列相同性百分率”和“基本相同性”。因为各个核酸/多肽均可包含(1)只是核酸/多肽共有的完整核酸/多肽序列的一或多个部分，和(2)在核酸/多肽之间不同的一或多个部分，序列对比典型地通过在“对比窗”上对比序列，以鉴别和对比序列局部区域的相似性。“对比窗”是指与参比序列相比典型的12个连续残基的理论片段。对比窗与参比序列(其没有添加或缺失)相比可以包含大约20％或更少的添加或缺失(即缺口)，以最佳对比各个序列。对比窗的序列的最佳序列对比可以通过计算机执行程序(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA，在此并入参考)或通过任选的方法产生的检测方法和最佳序列对比方法(即在对比窗上获得最高同源百分率)进行。也可以参考例如由Altschul等，1997，核酸研究25 3389所述的BLAST程序，在此并入参考。
关于序列分析的详细论述可见于分子生物学最新方法，第19.3章，Ausubel编辑(John Wiley&Sons Inc NY，1995-1999)。
术语“序列相同性”的最广泛的含义包括就使用标准程序进行适当序列对比而言精确的核苷酸或氨基酸匹配数目，就程度而言序列在对比窗上是相同的。因此，计算“序列相同性百分率”是通过在对比窗上对比两个最佳排列的序列，测定在两个序列中出现相同核酸碱基(例如A，T，C，G，I)的位置数，产生匹配位置的数，将匹配位置数与对比窗中总位置数(即窗口大小)相除，将结果乘100，产生序列相同性百分率。例如，“序列相同性“可以理解为是指通过DNASIS计算机程序(Windows Version 2.5；得自日立软件工程公司，South San Francisco，California，美国)计算的“匹配百分率”。
因此，本领域技术人员能通过重组DNA技术制备本发明多肽的同源物，如前述变体。例如，本发明的核酸可以使用随机诱变例如使用转座子诱变，或位点直接诱变加以突变。然后将所得DNA片段使用常规方法克隆入适当的表达宿主中，如大肠杆菌中，并检测保留所需活性的克隆。在已经用随机诱变方法产生克隆后，对阳性克隆进行测序以检测突变情况。
本文所用术语“衍生的”多肽是已经改变的本发明多肽，例如通过本领域已知的缀合或复合其它化学组分，或通过翻译后修饰方法改变。这种衍生物包括在本发明的NhhA多肽或其变体中缺失和/或添加氨基酸，或它的变体，其中所述衍生物激发一种免疫应答。
“添加”氨基酸可以包括将多肽或其变体融合其它多肽或蛋白质。在这方面应意识到本发明的多肽或变体可以掺入较大的多肽中，而且这种较大的多肽也可以期望是免疫原性的。上述多肽可以融合于另外的蛋白质中，例如不是衍生于脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白质中。另外的蛋白质例如可有助于蛋白质的纯化。例如可以使用一种聚组氨酸标签，或一种麦芽糖结合蛋白。或者，其可以产生一种有效抗脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫应答，或产生一种抗其它病原体的免疫应答。其它可能的融合蛋白是那些产生免疫调制应答的蛋白质。这种蛋白质例如包括A蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。另外，多肽可以融合于一种基于寡糖的疫苗成分，其中其作为载体蛋白。
本发明涵盖的其它衍生物包括但非限于在肽，多肽或蛋白质合成期间修饰侧链，掺入非天然的氨基酸和/或其衍生物，及使用交联剂及对本发明的多肽，片段和变体施加构象约束影响的其它方法产生的衍生物。本发明涵盖的侧链修饰例如包括修饰氨基基团如用乙酸酐进行酰化，用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基基团进行酰化；用甲基亚氨逐乙酸酯进行酰胺化；用氰酸盐对氨基进行甲氨酰化；用吡哆醛5磷酸对赖氨酸进行吡哆酸化(pyridoxylation)，随后用NaBH4还原；与醛反应进行还原烷化，随后用NaBH4还原；及用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯化。
羧基团可以通过活化碳二亚胺而修饰，通过形成O-酰基异脲随后衍生化为例如相应的酰胺。
精氨酸残基的鸟嘌呤基团可以通过与如2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物而修饰。
巯基团可以通过以下方法修饰，如过甲酸氧化为半胱磺酸；使用4-氯汞苯磺酸，4-氯汞安息香酸，2-氯汞-4-硝基苯酚，苯汞氯和其它汞剂形成汞衍生物；与其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺，马来酸酐或其它代替的马来酰亚胺反应；用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；及用氰酸盐在碱性pH下甲氨酰化。
色氨酸残基可以例如通过用2-羟-5-硝基苯溴化物或磺酰基卤化物烷化吲哚环，或通过用N-溴代琥珀酸二酰亚胺氧化而修饰。
酪氨酸残基可以通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而修饰。
组氨酸残基的咪唑环可以通过用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化或用吲哚乙酸衍生物烷化而修饰。
在肽合成期间掺入的非天然氨基酸及其衍生物包括但非限于使用4-氨基丁酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸，4-氨基-3-羟基-6甲基庚酸，t-丁基甘氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
本发明还涵盖了用二硝基苯酚共价修饰本发明的多肽，片段或变体，以使其在人体内是免疫原性的。
本发明分离的蛋白质(包括其片段，变体，衍生物和同源物)可以通过本领域技术人员已知的任何适当的方法制备。
例如，蛋白质可以通过包括以下步骤的方法作为重组多肽制备。
(i)制备一种表达构建体，其包含一种本发明的修饰的
   nhhA核酸，所述核酸可操纵地连于一或多个调节
   性核苷酸序列；
(ii)用此表达构建体转染或转化一种适当的宿主细胞；
(iii)在所述宿主细胞中表达此重组的多肽。
在后文提供了一些实施例，具体阐述了通过PCR产生本发明的修饰的nhhA核酸。
在一个特殊的实施方案中，PCR是一种剪接重叠PCR，对此在后文加以阐述，这种方法是基于Ho等，1989，基因7751所述的方法，和Horton等，1989，基因77 61所述方法，这两种方法均并入参考。
针对宿主细胞表达，重组的核酸是可操纵地连于表达载体中的一或多个调节序列。
“表达载体”可以是自身复制的染色体外载体如质粒，或者是整合入宿主基因组的载体。
“可操纵地连接”是指所述调节核苷酸序列是根据本发明的重组核酸而定位以起始，调节或另外控制转录。
调节性核苷酸序列一般是适于用于表达的宿主细胞的。本领域已知多种适于多种宿主细胞的适当的表达载体和适当的调节序列。
典型地，所述一或多个调节核苷酸序列可以包括但非限于启动子序列，前导或信号序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，及增强子或激活子序列。
本发明还涵盖了本领域已知的组成型或可诱导型启动子。启动子可以是天然发生的启动子，或是组合一个以上启动子的杂合启动子。
在一个优选的实施方案中，表达载体含有一个可选择标记基因，以选择转化的宿主细胞。可选择标记基因是本领域熟知的，并根据所用的宿主细胞而变化。
在一个实施方案中，表达载体是pCO14K，其具有一个porA启动子和卡那霉素选择基因，在后文对其加以阐述。根据这个实施方案，宿主细胞是选自大肠杆菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的细菌。
表达载体还可以包括一个融合配偶体(典型地是由表达载体提供的)，以便本发明的重组多肽表达为具有所述融合配偶体的融合多肽。融合配偶体的主要优点是其有助于鉴别和/或纯化所述融合多肽。
为表达所述融合多肽，必需将本发明的核苷酸序列连接入表达载体中，以使融合配偶体的翻译读码框与本发明的核苷酸序列一致。
熟知的融合配偶体例如包括但非限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，人IgG的Fc部分，麦芽糖结合蛋白(MBP)和6组氨酸(HIS6)，它们特别用于通过亲和层析分离融合多肽。针对通过亲和层析纯化融合蛋白，亲和层析的有关基质分别是谷胱甘肽-，直链淀粉-，镍-或钴-缀合的树脂。许多这种基质可以“试剂盒”形式获得，如用于(HIS6)融合配偶体使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)及Pharmacia GST纯化系统。
一种优选的配偶体是MBP，对此在实施例11中加以阐述。
本领域熟知的另一种融合配偶体是绿色荧光蛋白(GFP)。这种融合配偶体作为荧光“标记”，这样可以通过荧光显微镜或流式细胞计量术鉴别本发明的融合多肽。当评估本发明融合多肽的细胞定位时，或分离表达本发明融合多肽的细胞时，GFP标记是有用的。流式细胞计量术如荧光激活细胞分选(FACS)特别用于后一情况中。
优选地，融合配偶体还具有蛋白酶裂解位点，如Xa因子或凝血酶，这使相关的蛋白酶部分消化本发明的融合多肽，并从而从中释放本发明的重组多肽。然后可以将释放的多肽通过随后的层析分离从融合配偶体中分离。
本发明的融合配偶体的范围内还包括“附加表位”，其通常是短肽序列，可以获得其特异性抗体。熟知的可以用于获得特异性单克隆抗体的附加表位例如包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG标记。
如上所述，本发明的多肽可以通过培养一种宿主细胞而产生，所述宿主细胞是用包含编码本发明多肽或多肽同源物的核酸的所述表达构建体转化的。适于蛋白质表达的条件根据所选择的表达载体和宿主细胞而变化。这可易于由本领域技术人员通过常规实验确定。
进行表达的适当宿主细胞可以是原核或真核细胞。表达本发明多肽的一种优选的宿主细胞是细菌。所用的细菌可以是大肠杆菌或脑膜炎奈瑟氏球菌。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是脑膜炎奈瑟氏球菌，对其已经加以修饰以不表达PorA，Opa，Opc或荚膜多糖，但表达一种所需的脂多糖表型。
或者，宿主细胞可以是昆虫细胞如SF9细胞，其可以与杆状病毒表达系统一起使用。
重组的蛋白质可以常规地由本领域技术人员通过标准方法制备，例如Sambrook等，分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)，尤其是第16和17章；分子生物学通用方法，Ausubel等编辑(John Wiley&Sons，1995-1999)，尤其是第10和16章；及蛋白质科学通用方法，Colign等编辑(John Wiley&Sons，1995-1999)，尤其是第1，5和6章。在此均并入参考。
表达本发明的重组修饰的NhhA蛋白的优选方法，检测表达的蛋白质的方法在后文的实施例中加以阐述。核酸序列
本发明提供了一种分离的核酸，其编码一种本发明中的修饰的NhhA蛋白。
优选地，所述分离的核酸具有这样的核苷酸序列，其编码如图1和2中所示的一或多个NhhA多肽的恒定区(C区)。此分离的核酸还可编码如在图1和2中鉴别的一或多个非保守氨基酸(V区)，。
这种分离核酸的特殊实施方案示于SEQ ID NO：28-32及图5-9。
本文所用术语“核酸”是指单链或双链的mRNA，RNA，cRNA和DNA，所述DNA包含cDNA和基因组DNA。
“多核苷酸”是一种具有80个或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”是具有少于80个连续核苷酸的核酸。
“探针”可以是单链或双链的寡核苷酸或多核苷酸，经适当标记以在例如Northern或Southern印迹中检测互补序列。
“引物”通常是单链的寡核苷酸，优选15-50个连续的核苷酸，其能退火为一个互补核酸“模板”，并可以通过DNA聚合酶如Taq聚合酶，RNA依赖的DNA聚合酶或测序酶的作用，以模板依赖性方式被延伸。
本发明还涵盖了如上述本发明的核酸的同源物。
这种核酸同源物不包括编码全长野生型NhhA多肽的核酸。
例如，核酸同源物编码与本发明的NhhA V和C区结构相关的肽和多肽，通过免疫接种可提供对脑膜炎奈瑟氏球菌的交叉保护免疫性。
在一个实施方案中，核酸同源物编码本发明的多肽同源物，包括其变体，片段和衍生物。
在另一个实施方案中，核酸同源物与本发明的核酸具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至优选至少90％的序列相同性。
在另一个实施方案中，核酸同源物在至少低严格杂交条件下，优选在至少中等严格杂交条件下，更优选在高度严格杂交条件下，与本发明的核酸杂交。
“杂交”是指至少部分互补的核苷酸序列配对，以产生DNA-DNA，RNA-RNA，或DNA-RNA杂合体。本领域熟知在互补的嘌呤和嘧啶之间通过碱基配对，可以产生包含互补核苷酸序列的杂合体序列。
在这点上，应意识到修饰的嘌呤(例如肌苷，甲基肌苷和甲基腺苷)和修饰的嘧啶(硫尿嘧啶和甲基胞嘧啶)也可以参与碱基配对。
“严格性”是指在杂交期间的温度和离子浓度条件，及存在或不存在某些有机溶剂和/或去污剂.严格性越高，杂交的核苷酸序列之间所要求的互补水平越高。
“严格条件”是指在这样的条件下，只有具有高频率互补碱基的核酸杂交。
低严格条件包括并涵盖了以下内容：
(i)至少大约1％v/v至至少大约15％v/v甲酰胺，和至少大约1M至至少大约2M盐，在42℃杂交，及至少大约1M至至少大约2M盐在42℃冲洗；及
(ii)1％牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M NaHPO4(pH7.2)，7％SDS，在65℃杂交，及用(i)2×SSC，0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM NaHPO4(pH7.2)，5％SDS，在室温冲洗。
中等严格杂交条件包括并涵盖了以下内容：
(i)至少大约16％v/v至至少大约30％v/v甲酰胺，和至
   少大约0.5M至至少大约0.9M盐，在42℃杂交，及
   用至少大约0.5M至至少大约0.9M盐在42℃冲洗；
   及
(ii)1％牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M NaHPO4
   (pH7.2)，7％SDS，在65℃杂交，及用(a)2×SSC，
   0.1％SDS；或(b)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM
   NaHPO4(pH7.2)，5％SDS，在42℃冲洗。
高度严格杂交条件包括并涵盖了以下内容：
(i)至少大约31％v/v至至少大约50％v/v甲酰胺，和至少
   大约0.01M至至少大约0.15M盐，在42℃杂交，及
   用至少大约0.01M至至少大约0.15M盐在42℃冲洗；
   及
(ii)1％牛血清白蛋白(BSA)，1mM EDTA，0.5M NaHPO4
   (pH7.2)，7％SDS，在65℃杂交，及用(a)0.1×
   SSC，0.1％SDS；或(b)0.5％BSA，1mM EDTA，40mM
   NaHPO4(pH7.2)，1％SDS，在65℃以上的温度下
   冲洗大约1小时；及
(iii)用0.2×SSC，0.1％SDS在68℃或之上温度冲洗大
   约20分钟。
通常地，冲洗是在以下温度进行Tm＝69.3+0.41(G+C)％-12℃。通常地，随着错配的碱基数每增加1％，双螺旋DNA的Tm降低大约1℃。
尽管如上所述，但本领域已经熟知严格条件，如Ausubel等，如前述，在第2.9和2.10章中所述，在此将其并入参考。技术人员也意识到可以对各种因素加以修改，以最适应特异性杂交。对最后冲洗的严格性进行最佳化，以保证高度杂交。
特别的，通过把核苷酸固定在基质上(优选一种合成膜如硝基纤维素)的步骤，一个杂交步骤和一个检测步骤的印迹技术可以鉴别互补核苷酸序列。Southern印迹用于鉴别一个互补DNA序列；Northern印迹用于鉴别一个互补RNA序列。斑点印迹和狭线印迹可用于鉴别互补DNA/DNA，DNA/RNA，或RNA/RNA多核苷酸序列。本领域技术人员熟知这种方法，并见于Ausubel等(前述)在2.9.1至2.9.20页所述。根据这种方法，Southern印迹包括通过用凝胶电泳根据大小分离DNA分子，将根据大小分离的DNA移至一个合成膜上，并将这种结合DNA的膜与互补核苷酸序列杂交。
在斑点印迹和狭线印迹中，直接将DNA样品用于合成膜，之后如上述进行杂交。
当在cDNA或基因组DNA文库中鉴别互补核酸时，使用另一种斑点印迹步骤，如通过噬斑或集落杂交方法。这种方法的其它典型例子见于Sambrook等(前述)在第8-12章中所述，在此并入参考。
典型地，以下一般步骤可用于确定杂交条件。如上述将核酸印迹/移至一个合成膜上。将本发明的野生型核苷酸序列如上述标记，并分析此标记的核酸与一个固定的核苷酸序列杂交的能力。
技术人员可以意识到有许多因素可以影响杂交。放射性标记的多核苷酸序列的特异活性应典型地高于或等于大约108dpm/ug，以提供可检测到的信号。特异性活性为108-109dpm/ug的放射标记的核苷酸序列可检测大约0.5pg的DNA。本领域熟知在膜上必须固定足够的DNA以便检测。最好可以具有超量的DNA，通常为1-10ug。在杂交期间加入一个惰性聚合物如10％(w/v)葡聚糖硫酸酯(MW500,000)或聚乙二醇6000，也可以提高杂交的灵敏度(见Ausubel等，如前，在2.10.10所述)。
为从固定在膜上的核酸与标记的核酸之间的杂交中获得有意义的结果，在冲洗后必须有足够量的标记的核酸与固定的核酸杂交。冲洗是保证标记的核酸只与与其有所希望互补程度的固定核酸杂交。
本领域技术人员熟知检测标记的核酸与固定的核酸杂交的方法。这种方法包括放射自显影术，化学发光分析法，荧光和比色检测。
在另一个实施方案中，本发明的核酸同源物可以根据以下方法制备：
(i)从适当宿主中获得一种核酸提取物；
(ii)产生是随意简并的引物，其中包含本发明核苷酸序列
   的一部分；及
(iii)使用所述引物通过核酸扩增方法，扩增来自所述核酸
   提取物的一或多个扩增产物。
适当地，宿主是细菌。
优选地，宿主是奈瑟氏菌属。
更优选地，宿主是脑膜炎奈瑟氏球菌或乳酰胺奈瑟氏球菌。
用于核酸序列扩增方法中的引物包括以下详述的SEQ IDNO：40-51。
技术人员熟知适当的核酸扩增方法，并包括聚合酶链式反应(PCR)，如在此并入参考的Ausubel等(如前)在第15章中所述；链置换扩增(SDA)，如在此并入参考的美国专利No.5,422,252所述；滚环复制(RCR)，如在此并入参考的Liu等，1996，在J.Am.Chem.Soc.118 1587中所述，及国际出版物WO 92/01813和Lizardi等(国际出版物WO 97/19193)所述；基于核酸序列的扩增(NASBA)，例如在此并入参考的Sooknanan等，1994，生物技术171077所述；Q-β复制酶扩增，例如在此并入参考的Tyagi等，美国科学院院报93 5395所述。
本文所用术语“扩增产物”是指通过核酸扩增方法产生的核酸产物。抗体
本发明还涵盖了对抗本发明分离的蛋白质片段，变体和衍生物的抗体。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆的。熟知的适用于抗体产生，纯化和使用的方法见例如Coligan等，免疫学通用方法(JohnWiley&Sons NY，1991-1994)的第2章，和Harlow，E.&Lane，D.抗体实验手册，冷泉港，冷泉港实验室，1988，在此并入参考。
通常地，本发明的抗体结合或缀合于本发明的多肽，片段，变体或衍生物。例如，抗体可以包含多克隆抗体。这种抗体可以例如通过将本发明的多肽，片段，变体或衍生物注射入生产物种中，以获得多克隆抗血清，所述生产物种包括小鼠或兔。本领域技术人员熟知生产多克隆抗体的方法。可以使用的方法例如见于Coligan等，免疫学通用方法，如前，和Harlow&Lane，1988，如前所述。
代替在生产物种中获得的多克隆抗血清，单克隆抗体可以使用标准方法生产，例如Kohler&Milstein，1975，自然256，495所述方法，或通过最近对其加以修改的方法，例如Coligan等，免疫学通用方法，如前所述，通过将衍生自生产物种的脾细胞或其它生产抗体细胞永生增殖化并接种本发明的多肽，片段，变体或衍生物而产生单克隆抗体。
本发明的抗体范围内还包括上述单克隆或多克隆抗体的Fc或Fab片段。或者，抗体可以包含抗本发明肽的单链Fv抗体(scFvs)。这种scFvs可以例如根据美国专利No.5,091,513和欧洲专利No.239,400所述方法，或Winter&Milstein，1991，自然349 293所述方法制备，所述文献在此并入参考。
本发明的抗体可以用于亲和层析以分离天然或重组的脑膜炎奈瑟氏球菌多肽。例如，可以参考Coligan等，免疫学通用方法，如前，第9.5章中阐述的免疫亲和层析方法。
抗体可以用于：
(i)筛选表达文库以鉴别本发明的变体多肽；
(ii)鉴别免疫反应性片段或免疫反应性表位；和/或
(iii)检测脑膜炎奈瑟氏球菌感染。
这些用途在后文加以阐述，但非限于这些特殊用途。检测脑膜炎奈瑟氏球菌
确定个体中是否存在脑膜炎奈瑟氏球菌可以通过从所述个体中分离一种生物学样品，将上述抗体或抗体片段与此生物学样品混合，检测特异性结合的抗体或抗体片段，表示样品中是否存在脑膜炎奈瑟氏球菌。
术语“生物学样品”是指一种样品，其可以是从个体如患者中提取的，未处理的，处理的，稀释的或浓缩的样品。适当地，生物学样品选自全血，血清，血浆，唾液，尿液，汗液，腹水，腹膜液，滑液，羊水，脑脊液，皮肤活检组织等。
可以使用确定复合物形成的任何适当方法。例如，在免疫分析中可以使用具有伴随标记的本发明抗体或抗体片段。这种免疫分析可以包括但非限于放射性免疫分析(RIAs)，酶联免疫吸附测定(ELISAs)和免疫层析方法(ICTs)，这些是本领域技术人员熟知的。
例如，可以参考Coligan等，免疫学通用方法，第7章如前所述的根据本发明可以使用的各种免疫分析方法。免疫分析可以包括本领域已知的竞争性分析。
与抗体或抗体片段伴随的标记可以包括以下标记：
(A)与抗体或抗体片段直接附着的标记；
(B)与抗体或抗体片段间接附着的标记，即标记与另一种
   分析试剂附着，所述分析试剂随后结合抗体或抗体片
   段；和
(C)附着于抗体或抗体片段的随后反应产物的标记。
标记可以选自生色剂，催化剂，酶，荧光团，化学发光分子，镧离子如铕(Eu34)，放射性同位素和直接观测标记。在直接观测标记中，使用的可以是由胶体金属或非金属颗粒，染料颗粒，酶或底物，有机聚合物，乳胶颗粒，脂质体，或含有产生信号物的囊炮等。
大量用作标记的酶见于美国专利说明书U.S.4,366,241，U.S.4,843,000，和U.S.4,849,338所揭示，在此将其并入参考。用于本发明的酶标记包括碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，葡糖氧化酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶等。酶标记可以单独使用或在溶液中与另一种酶组合使用。
适当地，荧光团是选自异硫氰酸荧光素(FITC)，四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITL)或R-藻红蛋白(RPE)。
本发明还涵盖了一种检测脑膜炎奈瑟氏球菌感染的患者的方法，所述方法包括如下步骤，将取自患者的生物学样品与本发明的多肽，片段，变体或衍生物接触，并检测所述血清中是否存在所述多肽，片段，变体或衍生物与脑膜炎奈瑟氏球菌特异性抗体之间的复合物，其中存在所述复合物表示存在所述感染。
在一个优选的实施方案中，检测上述复合物可通过用本领域熟知的适当标记可检测地修饰所述多肽，片段，变体或衍生物，并将这种修饰的化合物用于例如上述免疫分析中。
另一方面，本发明提供了一种在怀疑含有所述细菌的生物学样品中检测脑膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括如下步骤，从患者体内分离生物学样品，在所述样品中检测到本发明的核酸序列，表示存在所述细菌。可以使用任何适当的方法确定所述核酸序列的检测情况。例如，本发明标记的核酸在对得自患者的核酸提取物进行的Southern印迹分析中用作探针，这已经为本领域所熟知。
或者，本发明标记的核酸可以在对得自患者的RNA提取物进行的Northern印迹分析中用作探针。
优选地，得自患者的核酸提取物与相当于本发明核酸序列的有义和反义序列或其侧翼序列的寡核苷酸引物，一起用于核酸扩增反应中，如PCR，或连接酶链反应(LCR)，如在此并入参考的国际申请WO89/09385所述。
许多自动固相检测方法也是适用的。例如，用超大规模固定引物列阵(VLSIPSTM)检测核酸，如Fodor等，1991；科学251 767和Kazal等，1996，自然医学2 573所述。上述一般方法是本领域技术人员所熟知的。药物组合物
本发明的另一个特点是使用本发明的多肽，片段，变体或衍生物(“免疫原性剂”)，在药物配方中作为活性配料，以防护脑膜炎奈瑟氏球菌感染。
适当地，此药物组合物包含一种药物适当的载体，稀释剂或赋形剂。
“药物适当的载体，稀释剂或赋形剂”是指一种可以安全地系统施用的固体或液体充填剂，稀释剂或胶囊化物质。根据特殊的施用途径，可以施用本领域熟知的各种载体。这些载体可以选自蔗糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽，明胶，滑石，硫酸钙，植物油，合成油，多醇，藻酸，磷酸盐缓冲液，乳化剂，等渗盐水和盐如无机酸盐包括盐酸盐，溴化盐和硫酸盐，有机酸盐如乙酸盐，丙酸盐和丙二酸及无热原水。
关于药物适当载体，稀释剂和赋形剂的论述参见Remington’s药物科学(Mack出版公司，N.J.美国，1991)，在此并入参考。
可以使用任何安全的施用途径，为患者提供本发明的组合物。例如可以通过口服，直肠，非肠道，舌下，口腔，静脉内，动脉内，肌内，皮内，皮下，吸入，眼内，腹膜内，脑室内，经皮等方式施用。肌内和皮下注射适于例如施用免疫原性组合物，疫苗和DNA疫苗。
剂型包括片剂，分散系，悬浮液，注射液，溶液，糖浆，含片，药片，胶囊，栓剂，气雾剂，皮肤贴片等。这些剂型还可以包括为此特别设计的注射或植入控制释放设备，或以这种方式发挥作用的其它形式的修改的植入体。治疗剂的控制释放可以通过例如用疏水性聚合物包被而实现，所述疏水性聚合物包括丙烯酸树脂，蜡，高级脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇酸及一些纤维素衍生物如羟丙甲基纤维素。另外，控制释放可以通过使用其它聚合物基质，脂质体和/或微粒而实现。
适于口服或非肠道施用的本发明药物组合物，可以是例如均含有预定数量的一或多种本发明治疗剂的分散单位如胶囊，小药囊或片剂，及例如是粉末或颗粒，或是水相、非水相溶液或悬浮液，水包油乳状液或油包水液相乳状液。这种组合物可以通过任何制药学方法制备，但所有方法均包括将上述的一或多种免疫原性剂与载体缔合，组成一或多种必需成分。通常地，制备组合物是通过将本发明的免疫原性剂与液体载体或充分分开的固体载体或二者均衡及密切混合，然后如果需要，将产物制成所需形状。
上述组合物可以以一种与剂型相容的方式施用，并且以防护脑膜炎奈瑟氏球菌感染的有效免疫原性的数量施用。在本发明中，施用于患者的剂量应足以在过一段时间后，在患者体内产生一种有益的应答，如降低脑膜炎奈瑟氏球菌的水平，或抑制脑膜炎奈瑟氏球菌感染。施用的免疫原性剂的数量可以根据治疗对象的年龄，性别，体重和一般健康状态而定。在这点上，需要施用的免疫原性剂的精确数量根据医生的判断而定。
在确定用于治疗或预防脑膜炎奈瑟氏球菌感染的免疫原性剂的有效量中，医生可以结合循环血浆水平，疾病进展和抗洪脑膜炎奈瑟氏球菌抗体的产生的情况加以确定。在任何情况中，本领域技术人员易于确定本发明免疫原性剂的适当数量。这种剂量可以是纳克至毫克范围的本发明免疫原性剂。
上述组合物可以用作治疗或预防疫苗。因此，本发明涉及生产含有本发明一或多种免疫原性剂作为活性成分的疫苗。可以使用各种适当的方法生产这种疫苗。所述方法例如包括“新生疫苗”(1997，Levine等，Marcel Dekker公司，纽约，Basel Hong Kong)所述，在此并入参考。
本发明的免疫原性剂可以与其它抗原混合，缀合或融合，包括其它抗原的B或T细胞表位。另外，其可以缀合于下述载体。
当使用本发明的一种半抗原肽时(即与关联抗体反应反应，但不能自身激发免疫应答的肽)，其可以与免疫原性载体缀合。本领域熟知有效的载体，包括例如：甲状腺球蛋白；白蛋白如人血清白蛋白；来自破伤风杆菌，白喉杆菌，百日咳杆菌，假单胞菌，大肠杆菌，葡萄球菌和链球菌的毒素，类毒素或任何毒素突变交叉反应物(CRM)；聚氨基酸如聚(赖氨酸：谷氨酸)；流感病毒；轮状病毒VP6，细小病毒VP1和VP2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重组疫苗等。或者，可以使用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，本发明的半抗原肽可以偶联于细菌毒素，类毒素或CRM的T细胞表位。在这点上，可以参考美国专利No.5,785,973所述，在此将其并入参考。
另外，本发明的多肽，片段，变体或衍生物在直接抗奈瑟氏菌属菌，或抗其它细菌或病毒的疫苗组合物中，可以作为载体蛋白。
本发明的免疫原性剂可以与脑膜炎奈瑟氏球菌抗原，或其它有机体抗原组合作为多价亚单位疫苗而施用，所述其它抗原包括病原性细菌流感杆菌，黏膜炎微球菌，淋球菌，大肠杆菌，肺炎链球菌等。或者或另外，它们可以与脑膜炎奈瑟氏球菌的寡糖或多糖组分一起施用。
疫苗还可以含有如前述的一种药物适当的载体，稀释剂或赋形剂。
疫苗或免疫原性组合物免疫包括本领域熟知的一种佐剂。本发明涵盖的佐剂包括但非限于：表面活性物质如十六胺，十八烷胺，十八烷氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基双(十八烷基)溴化铵，N，N-双(十八烷基)-N’，N’双(2-羟乙基-丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油和普流罗尼类多元醇；多胺如吡喃，葡聚糖硫酸酯，聚肌胞聚羰乙烯；肽如胞壁酰二肽和衍生物，二甲基甘氨酸，促吞噬肽；油乳状液和无机物凝胶如磷酸铝，氢氧化铝或铝；淋巴因子，QuilA和免疫刺激复合物(ISCOMS)。
关于佐剂的例子，参见于国际出版物WO99/36544所述，在此将其并入参考。通过DNA输送进行接种
本发明包含修饰的NhhA蛋白的表达构建体，可以施用于人，以预防和/或治疗宿主。在这点上，表达构建体可以编码一或多个修饰的NhhA肽，多肽，其片段或衍生物，在此统称为“免疫原性剂”。
表达构建体还包括基因治疗构建体，其特别使用基因治疗载体如牛痘，和用于基因治疗的病毒载体。后者包括腺病毒和腺病毒伴随病毒(AAV)，如Franceschi等，2000，细胞生物化学杂志，78 476，Braun-Falco等，1999，基因治疗6 432所述，逆转录病毒和慢病毒属载体如Buchshacher等，2000，血液95 2499所述，和衍生自单纯疱疹病毒和细胞巨化病毒的载体。关于基因治疗载体和输送方法参见于Robbins等，1998，生物技术趋势16 35所述。例如国际出版物WO99/36544阐述了潜在适用于使用奈瑟氏菌属菌蛋白进行基因治疗的许多载体及输送方法。
本发明的免疫原性剂可以由减毒病毒的宿主表达。“减毒病毒的宿主”是指天然的或已经使其基本无毒的病毒载体。病毒可以通过任何适当的物理(例如热处理)或化学方法(例如通过甲醛处理)使其基本无毒。“基本无毒”是指一种病毒，其感染性已经被破坏。理想的是病毒的感染性被破坏但不影响携带病毒免疫原性的蛋白质。如上所述，应意识到减毒病毒的宿主包含活病毒或灭活的病毒。
用于本发明疫苗中的减毒病毒的宿主可以包含病毒载体，包括腺病毒，细胞巨化病毒及优选痘病毒如牛痘(见例如Paoletti和Panicali，美国专利No.4,603,112所述)和减毒的沙门氏菌株(见例如Stocker，美国专利No.4,550,081所述)。活疫苗是特别有利的，因为它们产生延长的刺激，可以具有充分的长期持续的免疫性。阐述潜在适用于使用奈瑟氏菌属菌蛋白进行免疫接种的多种病毒载体及输送方法的参考文献例如是国际出版物WO99/36544。
多价疫苗可以从一或多种微生物中制备，所述微生物表达脑膜炎奈瑟氏球菌的不同表位(例如脑膜炎奈瑟氏球菌的其它表面蛋白或表位)。另外，其它病原性微生物的表位可以掺入疫苗中。
在一个优选的实施方案中，包括构建一种重组牛痘病毒，以表达本发明的核酸序列。在导入宿主的基础上，此重组的牛痘病毒表达免疫原性剂，从而激发宿主CTL应答。例如可参考美国专利No.4722848，其阐述了用于免疫接种的牛痘载体和方法。
本领域技术人员通过本文揭示，将知晓各种用于治疗性施用或接种免疫原性剂的其它载体。
在另一个实施方案中，核苷酸序列可以用作疫苗，以本领域已知的“裸DNA”疫苗形式。例如，本发明的表达载体可以导入哺乳动物中，导致一种多肽在体内产生，与这种多肽相对抗，宿主产生一种免疫应答，例如Barry，M.等(1995，自然，377：632-635)，在此并入参考。检测试剂盒
本发明还提供了检测生物学样品中脑膜炎奈瑟氏球菌的试剂盒。根据应用的测试方法的性质，这些试剂盒含有上述一或多种特殊制剂。在这点上，此试剂盒可以包括一或多个本发明的多肽，片段，变体，衍生物，抗体，抗体片段或核酸。此试剂盒还任选地包括适当的试剂以检测标记，阳性和阴性对照，冲洗溶液，稀释液等。例如基于核酸的检测试剂盒可以包括(i)本发明的核酸(其可用作阳性对照)，(ii)本发明的寡核苷酸引物，及根据应用的核酸扩增方法，任选一种DNA聚合酶，DNA连接酶等。制备免疫反应性片段
本发明还涉及一种鉴别本发明多肽，变体或衍生物的一种免疫反应性片段的方法。这种方法包含产生一种多肽，其变体或衍生物的片段，将此片段施用于哺乳动物；并检测此哺乳动物体内的免疫应答。这种应答包括产生特异性结合脑膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽，变体或衍生物的成分，和/或产生一种抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的防护作用。
在上述方法中测试特殊片段的免疫反应性之前，可以使用各种预测方法以推导一种特殊的片段是否可以用于获得与天然抗原交叉反应的抗体。这些预测的方法可以是基于氨基端或羧基端序列的，例如Ausubel等，如前，第11.14章中所述。或者，这些预测的方法可以是基于亲水性的预测，例如Kyte&Doolittle，1982，分子生物学杂志157 105和Hopp&Woods，1983，分子免疫学20 483)所述，或者基于二级结构的预测，例如Choo&Fasman，1978，Ann.Rev.Biochem.47 251)所述，所述文献均并入参考。
另外，“表位作图”使用本发明的单克隆抗体以鉴别交叉反应性表位，通过首先测试其提供交叉保护性的能力，随后鉴别由所述抗体识别的表位。这种方法例如由Coligan等，免疫学通用方法所揭示，如前。
通常地，由10-15个残基组成的肽片段提供最佳结果。少如6个或大如20个残基的肽也可以成功应用。这种肽片段然后可以化学偶联于一个载体分子如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，如Ausubel等，如前，第11.14和11.15所述。
也应意识到，肽可以是合成环化的，例如Hoogerhout等，1995，感染免疫学63 3473所述，在此并入参考。
可以将肽如上述用于免疫动物。然后可以通过放射性免疫分析或ELISA确定抗体的滴度，所述抗体是对抗从中选择所述肽的天然或亲代多肽的抗体，所述分析例如Ausubel等，如前，在第11.16和114章节中所述。
然后可以将抗体从动物的相关生物学体液中纯化，通过本领域熟知的硫酸铵分级分离或通过层析纯化。抗体纯化方法例如Ausubel等，如前，第10.11和11.13章节所述，在此并入参考。
对抗天然或亲代多肽的抗体的免疫反应性，可以通过任何相关方法确定，如Western印迹。功能阻断剂
确信WO99/31132中揭示的野生型NhhA/HiaNm多肽具有粘着性。它们事实上与流感杆菌的粘着素有一些相似，这些粘着素是表面抗原。特别的，它们与流感杆菌的Hia蛋白有大约67％的同源性(Barenkamp&St.Geme III，1996，分子微生物学19 1215)，与流感杆菌的Hsf蛋白有大约74％的同源性(St.Geme III，J.等，1996，细菌学杂志178 6281；和美国专利No.5646259)。针对这些对比，使用GAP程序，使用缺口重为3，长度重为0.01(Deveraux，1984，如前)。因此，阻断这些多肽的功能具有显著的治疗益处，因为这样可以阻止脑膜炎奈瑟氏球菌粘着及侵入细胞。功能的阻断可以通过许多方式进行。
例如，可以施用这样的组分，如阻断与本发明多肽相互作用的细胞表面受体的化学试剂或多肽。这些组分与感染性有机体竞争受体位点。这种组分可以包含例如本发明的多肽，尤其其片段或功能等价物以及模拟物。
术语“模拟物”是指一种化合物，将其设计为具有相似于蛋白质或肽的特殊功能区。也可以使用抗上述抗体产生的抗独特型抗体，所述抗体阻断细菌结合在细胞表面。或者，与本发明多肽的受体结合位点相互作用的组分，可以有效地预防细胞感染脑膜炎奈瑟氏球菌。这种组分可包含阻断抗体，肽或其它化学试剂。
本发明的另一方面是涉及所有这些组分，药物组合物，其中已经组合了药物合适的载体，以及通过施用这种组分或组合物治疗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的患者的方法。
本发明的多肽可以用于筛选用于上述方法中的化合物。例如，本发明的多肽可以组合一个标记，并暴露于存在测试试剂的细胞培养物中。然后观测试剂抑制标记的多肽结合细胞表面的能力。在这种筛选中，标记的多肽可以直接在有机体如大肠杆菌上使用。或者，可对脑膜炎奈瑟氏球菌自身进行工程化，以表达一种修饰的和可检测形式的多肽。在这种方法中使用工程化的脑膜炎奈瑟氏球菌是优选的，因为蛋白质的三级结构更可能与在野生型细菌中表达的相似。
通过以下非限制性实施例阐述的优选的实施方案，可使本发明易于理解并投入应用。实施例1：鉴别NhhA多肽的恒定区和可变区
本发明人阐明了NhhA氨基酸序列，其在脑膜炎奈瑟氏球菌的10个菌株之间是保守和/或非保守的。非保守的区域分成4个可变区(V1，V2，V3和V4)，保守区分为C1，C2，C3，C4和C5(如图1和表1所示；SEQ ID NO：1-11)。相应的核苷酸序列示于图2(SEQID NO：12-22)。实施例2：PMC 21 NhhA多肽过表达
由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株PMC21的nhhA基因编码的NhhA蛋白，通过产生一种表达构建体而过表达，所述构建体中nhhA基因可操纵地连于一个启动子。
以下核苷酸引物用于通过PCR扩增脑膜炎奈瑟氏球菌PMC21菌株nhhA核酸开放读框：
HOMP5′：5′-CAA TTA A CG  GCC  GAA TAA AAG GAA GCC GAT3′(SEQ ID NO：40)；其含有一个EagI限制位点(下划线处)，和编码NhhA的前7个氨基酸的序列(黑体)
HOMP3′AN 5′-TGG AAT  CCA TGG
Figure A0180718300413
3′(SEQ ID NO：41)；其含有一个NcoI限制位点(下划线处)，和越过菌株φ3的nhhA开放读框末端的48-61位核苷酸序列的反向互补序列(黑体)
扩增的产物含有限制位点，其随后用EagI和NcoI限制性内切酶消化。
用于亚克隆的质粒是pCO14K，这个质粒含有编码强表达脑膜炎奈瑟氏球菌1型外膜蛋白的基因的一个porA启动子上游，和脑膜炎奈瑟氏球菌菌株2996的侧翼序列，及一个可选择的卡那霉素抗性基因，如Rouppe van der Voort等，感染免疫学1996 64 2745所述。
然后将消化的扩增产物连接于EagI和NcoI限制性内切酶消化的pCO14K中。这种连接导致porA开放读框的大部分由nhhA扩增产物置换(图3)。这产生一种重组的核酸表达构建体(开放读框示于SEQ ID NO：12)，其编码SEQ ID NO：1所示的591个氨基酸的多肽。
在强porA启动子控制下表达本发明的nhhA核酸。在HOMP5’的第31位起始的ATG密码子处开始翻译。为防止porA和nhhA之间形成融合体，HOMP5’序列在所述起始ATG之前含有一个TAA终止密码子。
将所得质粒pIP52(PMC21)通过限制性消化线性化，并用于转化脑膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2，使用如Janik等，1976，临床微生物学杂志4 71所述方法。通过在37℃在5％CO2下，在含有100ug/ml卡那霉素的固体培养基上温育过夜，选择转化体。选择卡那霉素抗性集落，传代培养过夜，并针对NhhA多肽的过表达进行筛选，所述筛选是在10％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳上分离总细胞蛋白，随后使用Semi-Dry印迹仪(BioRad)移至硝基纤维素膜上。然后将此膜相继用兔抗NhhA血清(如国际出版物WO99/31132所述)和碱性磷酸酶缀合的抗兔IgG(Sigma)温育，之后用NBT/BCIP(Sigma)比色检测。分离一个与亲代菌株相比高水平表达NhhA多肽的一个克隆(图11)。使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸将裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：33)。
质粒构建体pIP52(PMC21)可以转化入任何转化感受态脑膜炎奈瑟氏球菌中。实施例3：H41 NhhA多肽过表达
使用与实施例2所述相同方法过表达由脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H41的nhhA基因编码的NhhA蛋白。这产生一种重组的核酸表达构建体(开放读框示于SEQ ID NO：13)，其编码SEQ ID NO：2所示591个氨基酸的一种多肽。在这个实施例中，将所得质粒pIP52(H41)线性化，并转化入脑膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。分析卡那霉素抗性克隆并选择一个克隆，所述克隆当通过Western免疫印迹检测证明NhhA过表达(图11)。使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸将裂解产生成熟多肽(图14；SEQID NO：34)。
这种策略可以用于产生含有其它脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的野生型nhhA序列的表达构建体。实施例4：使用常规限制位点构建NhhA缺失突变体
为了方便，由菌株PMC21的nhhA核酸编码的NhhA多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。本发明人产生了野生型PMC21 nhhA的一种缺失突变体，其中缺失了菌株最可能变化的区域。使用以下引物从nhhA核酸模板中通过PCR扩增，产生一种编码野生型PMC21NhhA多肽的1-54位氨基酸的扩增产物。
HOMP5′：5′-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3′(SEQ ID NO：40)；其是与用于产生过表达构建体pIP52的寡核苷酸相同的寡核苷酸。
NH3’BG：5’-GGT C AG  ATC
Figure A0180718300431
Figure A0180718300432
3’(SEQ ID NO：42)；其含有一个BglII限制位点(下划线处)，和编码野生型PMC21 NhhA的134位(双划线处)和49-54位氨基酸的反向互补序列(黑体)。
所得扩增产物包括一个EagI和BglII限制性内切酶位点。pIP52(PMC21)包括一个在nhhA开放读框(ORF)起始处上游的20bp处的单一的EagI位点和一个位于ORF内的单一BglII位点(见图3B)。因此，将pIP52(PMC21)和扩增产物用EagI和BglII进行限制性内切酶消化，连接并用于转化感受态大肠杆菌DH5α菌株；用PCR产物置换pIP52(PMC21)的EagI/BglII片段。这样产生了一种重组的核酸表达构建体(开放读框示于图5；SEQ ID NO：28)，其编码图5(SEQ ID NO：23)所示的512个氨基酸的一种多肽。这个氨基酸序列包括野生型序列的1-54和134-592位氨基酸，因此缺失野生型PMC21 NhhA多肽的V1区的大部分，所有V2和C2区，及部分C3区。
将这个质粒通过限制性消化而线性化，并转化入脑膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。使用实施例1所述方法，分离一个过表达截短的PMC21 NhhA的克隆(图11)。
使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸将裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：35)。为证实存在可裂解的信号序列，及证实过表达的蛋白质的相同性，将外膜蛋白通过分离在去污剂肌氨酰中不溶的组分而半纯化。
将分离的膜蛋白经电泳分离，之后移至尼龙膜上。过表达的蛋白质的位置通过考马斯蓝染色显示。切除此膜的这个区域，并对蛋白质进行N末端测序。这个蛋白质的前11个氨基酸是XXETDLTSVGT，其相当于推测由此实施例中所述过表达构建体表达的氨基酸序列的第52-62位氨基酸残基。
这是一个使用切除多核苷酸序列内限制位点进行缺失的实施例。这个构建体可以转化入任何转化感受态脑膜炎奈瑟氏球菌中。实施例5：使用常规限制位点构建NhhA缺失突变体
如实施例2所述产生一种含有H41的野生型nhhA序列的表达构建体。此所得构建体称为pIP52(H41)。使用这个实施例中描述的策略产生一种缺失突变体。在这种情况下使用的寡核苷酸引物是：
HOMP5′：5′-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3′(SEQ ID NO：40)；其是与用于产生过表达构建体pIP52的寡核苷酸相同的寡核苷酸。
NH3′STU：5′-GAT C AG  GCC
Figure A0180718300451
3′(SEQ ID NO：43)；其含有一个StuI限制位点(下划线处)，和编码野生型H41 NhhA的134位(双划线处)和49-54位氨基酸的反向互补序列(黑体)。
所得扩增产物包括一个EagI和StuI限制性内切酶位点。表达构建体pIP52(H41)含有这些限制位点。因此，将pIP52(H41)和扩增产物用EagI和StuI进行限制性内切酶消化，连接并用于转化感受态大肠杆菌DH5α菌株；这种连接是用PCR产物置换pIP52(H41)的EagI/StuI片段。这样产生了一种重组的核酸表达构建体(开放读框示于图6；SEQ ID NO：29)，其编码图6和SEQ ID NO：24所示的513个氨基酸的一种多肽。这个氨基酸序列包括野生型序列的1-54和134-593位氨基酸，因此缺失野生型H41 NhhA多肽的V1区的大部分，所有V2和C2区，及部分C3区。
将这个质粒通过限制性消化而线性化，并转化入脑膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。使用实施例1所述方法，分离一个过表达截短的H41 NhhA的克隆(图11)。
使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对推测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸将裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：36)。
这个构建体可以转化入任何感受态脑膜炎奈瑟氏球菌中。实施例6：使用剪接重叠PCR构建NhhA缺失突变体
除了使用常规的限制位点从编码NhhA的核苷酸中缺失可变区之外，还可以通过使用“剪接重叠延伸”PCR构建突变体，如Ho等，1989，如前，和Horton，R.M.，等，1989，如前所述。在这种方式中，可以产生这样的多核苷酸，其编码恒定区，但可变区缺失(见图5A，5B，5C)。
在这个实施例中，产生一种含有C1和C5区，但所有其它区域均缺失的构建体(见图5A)。
以下寡核苷酸引物用于PCR反应，以从PMC21菌株的染色体DNA中扩增相当于的C1区(见图1)的DNA。
HOMP5’：5’-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3’(SEQ ID NO：40)；其是与用于产生过表达构建体pIP52(PMC21)的寡核苷酸相同的寡核苷酸。
SO-C：5’- GAC GAA ATC AAC GTT
Figure A0180718300461
3’(SEQ ID NO：44)；这个序列是编码野生型PMC21菌株NhhA的C5区(下划线处)起始的237-241位氨基酸和C1区末端(黑体)的45-52位氨基酸序列的反向互补序列。
这个反应的扩增产物是HOMP5’/SO-C。
以下寡核苷酸引物用于PCR反应中，以从PMC21菌株的染色体DNA中扩增C5区：
SO-D：5’- AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT TAC-3’(SEQID NO：45)；其编码在C5区起始处的237-244位氨基酸(下划线处表示引物SO-C的反向互补序列)，
HO3’AN：5’-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C-3’(SEQ ID NO：41)；其与构建pIP52使用的引物相同。
这个反应的扩增产物是SO-D/HO3’AN。
将扩增产物HOMP5’/SO-C和SO-D/HO3’AN从琼脂糖凝胶中纯化，随后通过电泳分离，混合并使用引物HOMP5’和HO3，AN进行进一步扩增。所得扩增产物编码PMC21的野生型NhhA的1-52位和337-591位氨基酸。将此扩增产物用EagI和NcoI限制性消化，并克隆入pCO14K中，如实施例1所述。这个重组的分子含有C1和C5区，这样缺失V1-V4区和C2-C4区。开放读框的核苷酸序列示于图7和SEQ ID NO：30，衍生自此核苷酸序列的推测的多肽序列示于图7和SEQ ID NO：25。
将这个质粒通过限制性消化而线性化，并转化入脑膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。使用实施例2所述方法，分离一个过表达截短的PMC21 NhhA的克隆。
使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸可被裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：37)。
这个质粒可以转化入任何感受态脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中。实施例7：使用剪接重叠PCR构建NhhA缺失突变体
应意识到可以使用相似的策略产生编码NhhA的各种区域的重组多核苷酸。可以使用以下方法产生一种包含C1，C4，V4和V5区的构建体(见图5B)：
使用以下寡核苷酸引物扩增C1区：
HOMP5’：5’-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3’(SEQ ID NO：40)；
SO-E：5’ -AAC GCT TGC CGC ACG
Figure A0180718300471
Figure A0180718300472
3’(SEQ ID NO：46)；这个序列是编码PMC21菌株的C4区(下划线处)起始的211-215位氨基酸和C1区末端(黑体)的氨基酸序列的反向互补序列。
这个反应的扩增产物是HOMP5’/SO-E。
以下寡核苷酸引物用于PCR反应中，以从PMC21菌株的染色体DNA中扩增C4-V4-C5区：
SO-F：5’- CGT GCG GCA AGC GTT AAA GAC GTA-3’(SEQID NO：47)；其编码在C4区起始处的211-218位氨基酸(下划线处表示引物SO-E的反向互补序列)，
HO3’AN：5’-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C-3’(SEO ID NO：41)。
这个反应的扩增产物是SO-F/HOMP3’。
将扩增产物HOMP5’/SO-E和SO-F/HOMP3’从琼脂糖凝胶中纯化，随后通过电泳分离，混合并使用引物HOMP5’和HO3’AN进行进一步扩增。所得扩增产物编码PMC21的野生型NhhA的1-52位氨基酸和211-591位氨基酸。将此扩增产物用EagI和NcoI限制性消化，并克隆入pCO14K中。这个重组的分子含有C1，C4，V4和C5区，这样缺失V1-V3区和C2-C3区。开放读框的核苷酸序列示于图8和SEQ ID NO：31，衍生自此核苷酸序列的推测的多肽序列示于图8和SEQ ID NO：26。
使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前51个氨基酸可裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：38)。
这个质粒可以转化入任何感受态脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中。实施例8：使用剪接重叠PCR构建NhhA缺失突变体
应意识到可以使用相似的策略产生编码NhhA的各种区域的重组多核苷酸。可以使用以下方法产生一种包含C1，C2，C3，C4，和C5区的构建体(见图5C)：
使用以下寡核苷酸引物扩增C1和C2区：
HOMP5’：5’-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3’(SEQ ID NO：40)；
SO-G：5’- CAG CGA GTA GGT GAA
Figure A0180718300491
Figure A0180718300492
3’(SEQ ID NO：48)；这个序列是编码PMC21菌株C3区起始的125-129位氨基酸(下划线处)，所有C2区域(109-120位氨基酸，黑体和双划线处)和C1区末端(46-52位氨基酸，黑体)氨基酸序列的反向互补序列。
这个反应的扩增产物是HOMP5’/SO-G。
使用以下寡核苷酸引物扩增C3和部分C4区：
SO-H：5’- TTC ACC TAC TCG CTGAAA AAA GAC-3’(SEQID NO：49)；其编码在C3区起始处的125-132位氨基酸(下划线处表示引物SO-G的反向互补序列)，
SO-I：5’
Figure A0180718300495
ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT-3’(SEQ IDNO：50)；其编码在C3区末端的182-188位氨基酸(下划线处)和C4区211-222位氨基酸(黑体)的反向互补序列。
这个反应的扩增产物是SO-H/SO-I。
扩增产物HOMP5’/SO-G和SO-H/SO-I从琼脂糖凝胶中纯化，随后通过电泳分离，混合并使用引物HOMP5’和SO-I进行进一步扩增，所得扩增产物编码1-52，103-114，125-188和211-222为氨基酸，也就是C1，C2，C3和部分C4区。这个反应的扩增产物是HOMP5’/SO-I。
使用以下寡核苷酸引物扩增C5和部分C4区：
SO-J：5’ TGG AAC ATT AAA GGC GTT AAA
Figure A0180718300497
3’(SEQ IDNO：51)；其编码菌株PMC21的野生型NhhA的C4区218-229位氨基酸(下划线处)和C5区的237-243位氨基酸(黑体)。(黑体下划线处表示SO-I的反向互补序列)
HO3’AN：5’-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C-3’(SEQ ID NO：41)。
这个反应的扩增产物是SO-J/HO3’AN。
将扩增产物HOMP5’/SO-I和SO-J/HO3’AN从琼脂糖凝胶中纯化，随后通过电泳分离，混合并使用引物HOMP5’和HO3’AN进行进一步扩增所得产物编码PMC21菌株的野生型NhhA的1-52，103-114，125-188，211-229和237-591位氨基酸。将所得扩增产物用EagI和NcoI限制性消化，并克隆入pCO14K中。这个重组的分子含有C1，C2，C3，C4和C5区，这样缺失V1，V2，V3和V4区。开放读框的核苷酸序列示于图9和SEQ ID NO：32，衍生自此核苷酸序列的推测的多肽序列示于图9和SEQ ID NO：27。使用计算机程序SIGCLEAVE(www.angis.org.au.所示程序的eGCG组的一部分)对预测的氨基酸序列进行分析，表明前49个氨基酸可裂解产生成熟多肽(图14；SEQ ID NO：39)。
这个构建体可以转化入任何感受态脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中。实施例9：纯化过表达的NhhA多肽
前述实施例中阐述的重组的NhhA多肽可以通过以下步骤分离。将细菌在37℃在5％CO2环境中生长过夜(12-14小时)。(在这个实施例中，培养基是补加Levevthal碱的BHI琼脂。其它生长培养基是本领域技术人员熟知的)。收集10个25ml琼脂平板中的细菌，并悬浮于25ml用HCl将pH调节为8.0的10mM Tris中。加入等体积的含有2％肌氨酰的10mM Tris(pH8.0)，并将此混合物在4℃轻轻混合1小时。在20℃以100000×g离心70分钟，并弃去上清。将沉淀通过25号针管重悬浮于25ml含有1％肌氨酰的10mMTris(pH8.0)中。在20℃以100000×g离心70分钟，并弃去上清。将沉淀通过25号针管重悬浮于10ml的10mM Tris(pH8.0)中。此部分含有不溶解于肌氨酰的细胞成分，而且多是外膜蛋白。(可以加上另外一个步骤以除去残余的肌氨酰去污剂，这是将蛋白质溶液经过100-1000体积的例如10mM Tris.Cl或PBS(磷酸盐缓冲盐水)，在4℃透析4-8小时，循环4次。)
在已经通过280nm波长的吸光度，或通过使用一个BCA试剂盒(Pierce)确定了悬浮液中蛋白质的浓度后，将大约1ml含有1％SDS(十二烷基硫酸钠)，2％β-巯基乙醇及10mg蛋白质的溶液在BioRad袖珍多变II型仪器中的1.5mm厚的6％SDS-PAGE上分离。使用BioRad的“袖珍整体凝胶仪”从凝胶中洗脱高分子量的NhhA。将大约10％的每种洗脱级分通过SDS-PAGE分离，随后通过考马斯蓝染色进行检测。集合基本没有其它蛋白质的含有NhhA的级分，进行这种步骤以分离如实施例2所述的过表达的成熟NhhA(SEQ IDNO：1)，如实施例4所述的过表达的BglI缺失成熟的NhhA(SEQ IDNO：23)和如实施例6所述的过表达的NhhA缺失突变体(SEQ IDNO：25)。分离的蛋白质示于图12。实施例10：纯化的NhhA缺失突变多肽的免疫原性
将小鼠用前述实施例所述的纯化的野生型NhhA多肽和缺失突变体接种。第一组，将每个Balb/C小鼠在第0天用130ug和在第14天用115ug具有MPL+TDMTM佐剂(得自Sigma-Aldrich)的PMC21NhhA皮下接种。第二组，将每个小鼠用具有MPL+TDMTM佐剂(得自Sigma-Aldrich)的大约120ug蛋白在第0天接种，在第14天用190ug接种。在第三组，将每个小鼠用具有MPL+TDMTM佐剂(得自Sigma-Aldrich)的大约260ug蛋白在第0天接种，在第14天用1240ug接种。在第21天取血液样品并提取血清。通过Western免疫印迹测试这些血清中全长PMC21 NhhA的抗体的存在情况(图13)。将P6(过表达PMC21 NhhA)和菌株2A(废除NhhA表达)的OMC制品(5mg)，使用BioRad袖珍多变II型电泳设备，通过6％SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离。将蛋白质电泳移至硝基纤维素膜上，并将滤膜切成3mm的条带，然后在5％脱脂奶的PBS中封闭。将小鼠血清在5％脱脂奶粉中稀释为1∶1000和1∶10000，并和硝基纤维素膜孵育。使用碱性磷酸酶缀合的抗小鼠IgG(Sigma)检测抗体结合，之后用NBT/BCIP(Sigma)进行比色检测。从图13中可以看出，通过用NhhA缺失突变体或用全长成熟的NhhA多肽接种，可以激发抗全长成熟PMC21 NhhA多肽的免疫应答。实施例11：在大肠杆菌中表达缺失突变体多肽
除了在脑膜炎奈瑟氏球菌中表达本发明的突变体多肽之外，也可将其在大肠杆菌中表达。实施例4-8所述的任何重组nhhA缺失突变体均可以用作PCR扩增的模板。使用的寡核苷酸引物可以是如国际出版物WO99/31132所述引物(如该文献中所述的SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25)。扩增产物可以用BamHI/HindIII酶限制性消化，并和BamHI/HindIII酶限制性消化的质粒pMALC2连接(New EnglandBioLabs)，将所得质粒转化入感受态的大肠杆菌DH5α菌株中。使用pMALC2生产者推荐的条件，可以诱导所得菌株以高水平表达重组的蛋白质。所得重组的蛋白质是一种麦芽糖结合蛋白和本发明缺失突变体NhhA多肽的融合体。其可以是通过在SDS-PAGE上分离，随后使用袖珍凝胶电洗脱仪(BioRad)根据生产者的指导进行电洗脱而半纯化。然后将半纯化的融合蛋白用PBS透析，之后用蛋白酶因子Xa消化，以从重组的NhhA蛋白中裂解麦芽糖结合蛋白组分。重组的NhhA蛋白可以通过标准方法纯化，例如R.K.Scopes，蛋白质纯化(Springer-Verlag，纽约，NY USA，1993)。
通过本说明书，阐述了本发明优选的实施方案，但无限制本发明之意。本领域技术人员应意识到，在不偏离本发明精神的范围内可以对本发明举例说明的实施方案加以各种修改和变化。
本文所引用的所有的计算机程序，公式，专利和科学文献在此均并入参考。表1
    C1     V1     C2     V2     C3     V3     C4     V4     C5
 共有SEQ ID NO：11     1-50     51-108     109-120     121-134     135-198     199-220     221-239     240-248     249-604
 PMC21SEQ ID NO：1     1-50     51-108     109-120     121-124     125-188     189-210     211-229     230-236     237-591
 H41SEQ ID NO：2     1-50     51-102     103-114     115-124     125-188     189-210     211-229     230-236     237-591
 P20SEQ ID NO：3     1-50     51-105     106-117     118-121     122-185     186-205     206-224     225-234     235-589
 EG327SEQ ID NO：4     1-50     51-104     105-116     117-126     127-190     191-212     213-231     232-238     239-594
 EG329SEQ ID NO：5     1-50     51-108     109-120     121-124     125-188     189-210     211-229     230-236     237-591
 H38SEQ ID NO：6     1-50     51-105     106-117     118-131     132-195     196-217     218-236     237-243     244-599
 H15SEQ ID NO：7     1-50     51-104     105-116     117-130     131-194     195-216     217-235     236-242     243-598
 BZ10SEQ ID NO：8     1-50     51-104     105-116     117-130     131-194     195-216     217-235     236-242     243-598
 BZ198SEQ ID NO：9     1-50     51-104     105-116     117-126     127-190     191-212     213-231     232-238     239-594
 Z2491SEQ ID NO：10     1-50     51-102     103-114     115-124     125-188     189-208     209-227     228-236     237-592
表2
    原有残基     示范取代
    Ala     Ser
    Arg     Lys
    Asn     Gln，His
    Asp     Glu
    Cys     Ser
    Gln     Asn
    Glu     Asp
    Gly     Pro
    His     Asn，Gln
    Ile     Leu，Val
    Leu     Ile，Val
    Lys     Arg，Gln，Glu
    Met     Leu，Ile，
    Phe     Met，Leu，Tyr
    Ser     Thr
    Thr     Ser
    Trp     Tyr
    Tyr     Trp，Phe
    Val     Ile，Leu

Claims (25)

1.一种分离的蛋白质，其包含NhhA多肽的12个或更多个连续的保守氨基酸，其中所述分离的蛋白质不是野生型NhhA多肽。
2.权利要求1的分离的蛋白质，其能激发一种免疫应答。
3.权利要求2的分离的蛋白质，其中所述免疫应答的菌株特异性比相应所述NhhA多肽激发的免疫应答的菌株特异性低。
4.权利要求3的分离的蛋白质，其中所述免疫应答提供抗一或多种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的防护作用。
5.权利要求3的分离的蛋白质，其中所述免疫应答提供了抗多数脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的防护作用。
6.权利要求1的分离的蛋白质，其包含20或更多个连续的保守氨基酸。
7.权利要求6的分离的蛋白质，其包含50或更多个连续的保守氨基酸。
8.权利要求7的分离的蛋白质，其包含100或更多个连续的保守氨基酸。
9.权利要求1的分离的蛋白质，其中NhhA多肽具有选自以下一组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ IDNO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10。
10.一种分离的蛋白质，其包含选自以下一组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：11的第1-50位残基；
(ii)SEQ ID NO：11的第109-120位残基；
(iii)SEQ ID NO：11的第135-198位残基；
(iv)SEQ ID NO：11的第221-239位残基；和
(v)SEQ ID NO：11的第249-604位残基；
其中所述分离的蛋白质不是野生型NhhA多肽。
11.权利要求10的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质具有选自以下一组的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO：1的第1-50位氨基酸残基；
(ii)SEQ ID NO：2的第1-50位氨基酸残基；
(iii)SEQ ID NO：3的第1-50位氨基酸残基；
(vii)SEQ ID NO：4的第1-50位氨基酸残基；
(viii)SEQ ID NO：5的第1-50位氨基酸残基；
(ix)SEQ ID NO：6的第1-50位氨基酸残基；
(x)SEQ ID NO：7的第1-50位氨基酸残基；
(xi)SEQ ID NO：8的第1-50位氨基酸残基；
(xii)SEQ ID NO：9的第1-50位氨基酸残基；
(xiii)SEQ ID NO：10的第1-50位氨基酸残基；
(xiv)SEQ ID NO：1的第125-188位氨基酸残基；
(xv)SEQ ID NO：2的第125-188位氨基酸残基；
(xvi)SEQ ID NO：3的第122-185位氨基酸残基；
(xvii)SEQ ID NO：4的第127-190位氨基酸残基；
(xviii)SEQ ID NO：5的第125-188位氨基酸残基；
(xix)SEQ ID NO：6的第132-195位氨基酸残基；
(xx)SEQ ID NO：7的第131-194位氨基酸残基；
(xxi)SEQ ID NO：8的第131-194位氨基酸残基；
(xxii)SEQ ID NO：9的第127-190位氨基酸残基；
(xxiii)SEQ ID NO：10的第125-188位氨基酸残基；
(xxiv)SEQ ID NO：1的第211-229位氨基酸残基；
(xxv)SEQ ID NO：3的第206-224位氨基酸残基；
(xxvi)SEQ ID NO：1的第237-591位氨基酸残基；
(xxvii)SEQ ID NO：2的第237-592位氨基酸残基；
(xxviii)SEQ ID NO：3的第235-589位氨基酸残基；
(xxix)SEQ ID NO：4的第239-594位氨基酸残基；
(xxx)SEQ ID NO：5的第237-591位氨基酸残基；
(xxxi)SEQ ID NO：6的第244-599位氨基酸残基；
(xxxii)SEQ ID NO：7的第243-598位氨基酸残基；
(xxxiii)SEQ ID NO：8的第243-598位氨基酸残基；
(xxxiv)SEQ ID NO：9的第239-594位氨基酸残基；和
(xxxv)SEQ ID NO：10的第237-592位氨基酸残基；
11.权利要求10的分离的蛋白质，还包含NhhA多肽的一或多个可变区氨基酸。
12.权利要求11的分离的蛋白质，其具有选自以下一组的氨基酸序列：SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ IDNO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ IDNO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ IDNO：39。
13.一种权利要求10的分离的蛋白质的等位基因变体。
14.一种权利要求10的分离的蛋白质的片段或衍生物。
15.权利要求13的片段，其是免疫原性的。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-15任一项的一或多种分离的蛋白质。
17.权利要求16的药物组合物，其是一种疫苗。
18.一种编码权利要求1-15任一项的分离的蛋白质的分离的核酸。
19.权利要求18的分离的核酸，其具有选自以下一组的核苷酸序列：
(i)SEQ ID NO：22的第1-150位残基；
(ii)SEQ ID NO：22的第325-361位残基；
(iii)SEQ ID NO：22的第403-595位残基；
(iv)SEQ ID NO：22的第661-717位残基；和
(v)SEQ ID NO：22的第745-1815位残基。
20.权利要求19的分离的核酸，其具有选自以下一组的核苷酸序列：SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32。
21.一种表达载体，其包括权利要求19或权利要求20的分离的核酸。
22.一种用权利要求21的表达载体转化的宿主细胞。
23.权利要求22的宿主细胞，其是一种细菌。
24.权利要求23的宿主细胞，其是脑膜炎奈瑟氏球菌。
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