PL216780B1 - Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego - Google Patents

Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego

Info

Publication number
PL216780B1
PL216780B1 PL356819A PL35681901A PL216780B1 PL 216780 B1 PL216780 B1 PL 216780B1 PL 356819 A PL356819 A PL 356819A PL 35681901 A PL35681901 A PL 35681901A PL 216780 B1 PL216780 B1 PL 216780B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gly
thr
ala
asn
val
Prior art date
Application number
PL356819A
Other languages
English (en)
Other versions
PL356819A1 (pl
Inventor
Ian Richardn Anselm Peak
Michael Paul Jennings
Original Assignee
Univ Queensland Of Santa Lucia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Queensland Of Santa Lucia filed Critical Univ Queensland Of Santa Lucia
Publication of PL356819A1 publication Critical patent/PL356819A1/pl
Publication of PL216780B1 publication Critical patent/PL216780B1/pl

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55572Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku.
Wynalazek dotyczy wyizolowanego białka zawierającego konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjnego, kompozycji farmaceutycznej, przeciwciała monoklonalnego lub wiążącego antygen fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wyizolowanego kwasu nukleinowego, konstruktu ekspresyjnego, komórki gospodarza, sposobu wytwarzania rekombinowanego białka, sposobu wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej i sposobu diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposobu wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, jak również zastosowania wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego. Wynalazek umożliwia wywołanie krzyżowej, ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciw Neisseria meningitidis, dzięki czemu może być stosowany w diagnostyce, w terapeutycznych i profilaktycznych szczepionkach i w projektowaniu i/lub wyszukiwaniu leków. Wynalazek umożliwia ponadto, skutecznie immunizację przeciw szerszemu spektrum szczepów N. meningitidis niż oczekuje się w przypadku odpowiedniego antygenu powierzchniowego typu dzikiego.
Neisseria meningitidis jest bakterią Gram ujemną powodującą meningokokowe zapalenie opon i posocznicę. Jedynym znanym jej gospodarzem jest człowiek, u którego zarażenie może przebiegać bezobjawowo w przypadku około 10% populacji (Caugant i wsp., 1994, Journal of Clinical Microbiology 32 323).
N. meningitidis może tworzyć polisacharydową otoczkę i to umożliwia klasyfikowanie bakterii zgodnie z charakterem prezentowanego kapsydu. Istnieje przynajmniej dwanaście serotypów N. meningitidis. A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y i Z, spośród których serotypy A, B i C powodują 90% choroby meningokokowej (Poolman i wsp., 1995, Infectious Agents and Disease 4 13). Dostępne są szczepionki skierowane przeciw serotypom A i C, lecz w przypadku serotypu B polisacharydy kapsydu są słabo immunogenne i u człowieka nie wywołują odporności.
Co za tym idzie, sprawdzano inne składniki zewnątrzkomórkowe i błonowe pod względem użyteczności ich uwzględnienia w szczepionkach. Przykłady obejmują białka zewnątrzbłonowe klasy 1, 2 i 3 (poryny kodowane przez geny por) i klasy białek 4 (Rmp) i 5 (białka Opacity; kodowane przez geny opa i opc).
Jednakowoż, do chwili obecnej, żaden z tych kandydatów nie był w stanie wywołać pełnej ochrony, szczególnie u dzieci (Romera i wsp., 1994, Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman i wsp., 1995, powyżej).
Dla stworzenia skutecznej szczepionki konieczne jest zidentyfikowanie składników N. meningitidis występujących w większości szczepów i zdolnych do wywołania obronnej odpowiedzi immunologicznej (przykładowo bakteriobójcze przeciwciała).
Zgodnie z tym uczyniono odniesienie do publikacji międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/58683 i WO 99/57280, z których każda jest włączona tu przez odniesienie literaturowe i opisuje szereg białek będących kandydatami mogącymi być użytecznymi w szczepionkach dla szczepienia przeciw Neisseria meningitidis.
Zgodnie z tym szczególne odniesienie jest uczynione do publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/31132 i Peak i wsp., 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28:329 każda, włączona tu przez cytowanie, opisuje nowe antygeny powierzchniowe i ich alleliczne postaci, dla celów tego opisu oznaczone NhhA.
Podsumowanie wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane białko zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:35.
Korzystnie, wyizolowane białko ma sekwencję w 80% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych powyżej i jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
Korzystnie, wyizolowane białko ma sekwencję w 90% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych powyżej, i jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne zawierające partnera fuzyjnego oraz wyizolowane białko określone powyżej.
PL 216 780 B1
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej jedno wyizolowane białko albo białko fuzyjne określone powyżej, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna ma postać szczepionki.
Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego charakteryzujący się tym, że wiąże się z reagującym krzyżowo epitopem wyizolowanego białka określonego powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że koduje wyizolowane białko lub białko fuzyjne określone powyżej.
Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:28.
Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt ekspresyjny zawierający rolowany kwas nukleinowy określony powyżej, funkcjonalnie połączony z promotorem.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca konstrukt ekspresyjny określony powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna ma postać szczepionki.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca konstrukt ekspresyjny określony powyżej.
Korzystnie, komórka gospodarza jest bakterią.
Korzystnie, komórka gospodarza jest z gatunku Neisseria meningitidis.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinowanego białka charakteryzujący się tym, że obejmuje (i) hodowanie komórki gospodarza określonej powyżej, tak że w komórce gospodarza wyrażane jest rekombinowane białko, oraz (ii) izolowanie rekombinowanego białka.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowane białko określone powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne określone powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt ekspresyjny określony powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej w której podejrzewa się jej obecność, charakteryzujący się tym, że obejmuje (i) łączenie przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego określonego powyżej z próbką biologiczną uzyskaną od ssaka, oraz (ii) wykrywanie swoiście związanego przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wskazującego na obecność N. meningitidis.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis u ssaka, znamienny tym, że obejmuje (i) kontaktowanie próbki biologicznej uzyskanej od osobnika z wyizolowanym białkiem albo białkiem fuzyjnym określonych powyżej, oraz (ii) wykrywanie obecności lub nieobecności we wspomnianej próbce kompleksu utworzonego pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym oraz przeciwciałami specyficznymi dla N. meningitidis, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na występowanie zakażenia.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, znamienny tym, że obejmuje etap wykorzystania wyizolowanego kwasu nukleinowego określony powyżej dla wykrycia obecności N. meningitidis W próbce biologicznej.
Korzystnie, próbka pochodzi od człowieka.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie wyizolowanego białka albo białka fuzyjnego określonych powyżej, do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie konstruktu ekspresyjnego określonego powyżej do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.
PL 216 780 B1
Niniejszy wynalazek ujawnia, że powierzchniowy antygen NhhA posiada obszary polipeptydu różniące się pomiędzy szczepami N. meningitidis i inne obszary, konserwatywne pomiędzy szczepami. Obszary zmienne mogą być immunogeniczne i wykazywać skłonność do wywoływania odpowiedzi odpornościowych specyficznych dla szczepu tak, że szczepionki zawierające antygen pochodzący ze szczególnego szczepu N. meningitidis wykazują skłonność do preferencyjnego wywoływania odporności przeciw szczególnemu szczepowi N. meningitidis. W konsekwencji sugerowane jest wytwarzanie zmodyfikowanego polipeptydu NhhA, który wywołuje reakcję odpornościową, która nie jest specyficzna względem szczepu, jak ta wywołana NhhA typu dzikiego. Zmodyfikowany antygen NhhA będzie użyteczny, jak to opisano poniżej, dla wytworzenia leczniczych i/lub profilaktycznych szczepionek przeciw N. meningitidis. Przez ukierunkowanie odpowiedzi immunologicznej pierwotnie przeciw konserwatywnym epitopom, szczepionki takie powinny skutecznie wywoływać odporność przeciw szerszemu zakresowi szczepów N. meningitidis niż w przypadku immunizacji NhhA typu dzikiego.
Białka według wynalazku posiadają, w porównaniu z odpowiadającymi im polipeptydami NhhA typu dzikiego, jedną lub więcej delecji niekonserwatywnych aminokwasów.
Dogodnie, białko według wynalazku jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej.
Korzystnie, odpowiedź immunologiczna jest mniej specyficzna wobec szczepu niż wywołana przez wspomniany polipeptyd NhhA typu dzikiego.
Korzystniej, wspomniana odpowiedź immunologiczna dostarcza ochrony przeciw jednemu lub większej liczbie szczepów N. meningitidis lub jeszcze korzystniej wielu szczepom N. meningitidis.
Sekwencje polipeptydu NhhA typu dzikiego są przykładowo podane na Fig. 1 (SEQ ID NO:1 do 10).
Sekwencja najwyższej zgodności jest również podana na Fig. 1 (SEQ ID NO:1).
Wyizolowane białko według wynalazku korzystnie zawiera jeden lub więcej obszarów stałych polipeptydu NhhA, oznaczonych na Fig. 1 jako obszary C1, C2, C3, C4 i C5. Powinno być dostrzeżone, że zgodnie z tym aspektem, dogodnie jeden lub więcej niekonserwatywnych aminokwasów obszaru zmiennego polipeptydu NhhA oznaczonych jako obszar V1, V2, V3 lub V4 na Fig. 1 jest usuniętych w porównaniu z polipeptydem NhhA typu dzikiego.
Korzystnie usunięty jest obszar V1 lub przynajmniej istotna jego część.
W szczególnej postaci, wyizolowane białko może zawierać sekwencję aminokwasową przedstawioną na którejkolwiek z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:23 do 27), będących przykładem „zmodyfikowanych polipeptydów NhhA według wynalazku. Na Fig. 14 (SEQ ID NO:33 do 39) dostarczone są dalsze przykłady „dojrzałych polipeptydów przypuszczalnie z usuniętymi N-końcowymi sekwencjami sygnałowymi.
Zgodnie z drugim aspektem wynalazek dostarcza wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd zgodny z pierwszym aspektem.
Sekwencje kwasu nukleinowego nhhA typu dzikiego podano przykładowo na Fig. 2 (SEQ ID NO:12 do 21).
Sekwencja kwasu nukleinowego najwyższej zgodności jest podana również na Fig. 2 (SEQ ID NO:22).
Korzystnie, obszary C1, C2, C3, C4 i C5 są kodowane odpowiednio przez sekwencje nukleotydowe podane na Fig. 2.
Korzystnie, obszary V1, V2, V3 i V4 są kodowane przez odpowiednie sekwencje nukleotydowe podane na Fig. 2.
W szczególnej postaci wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku może posiadać sekwencję jaką podano na którejkolwiek z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:28 do 32), będących szczególnymi przykładami „zmodyfikowanych kwasów nukleinowych nhhA według wynalazku.
Szczególnie, z zakresu wynalazku wyłączone są dzikiego typu polipeptydy NhhA i kwasy nukleinowe nhhA.
W trzecim aspekcie wynalazek dotyczy konstruktu ekspresyjnego obejmującego wektor ekspresyjny i kwas nukleinowy według drugiego aspektu, gdzie wspomniana sekwencja jest połączona funkcjonalnie z jednym lub większą ilością regulatorowych i kwasów nukleinowych wspomnianego wektora ekspresyjnego.
W piątym aspekcie wynalazku dostarczony jest sposób wytwarzania rekombinowanego wyizolowanego białka zgodnego z pierwszym aspektem wynalazku, obejmujący etapy:
(i) hodowania komórki gospodarza zawierającej wektor według trzeciego aspektu tak, że wspomniany polipeptyd jest wyrażany we wspomnianej komórce gospodarza i
PL 216 780 B1 (ii) izolowania wspomnianego zrekombinowanego polipeptydu.
W szóstym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywania N. meningitidis w próbkach biologicznych podejrzanych o ich przenoszenie, obejmujący etapy:
(i) łączenia wyżej wspomnianego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną i (ii) wykrycia swoiście związanego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała co wykazującego obecność N. meningitidis.
W siódmym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu diagnozowania u osobnika infekcji spowodowanej przez N. meningitidis, obejmującego etapy:
(i) kontaktowania próbki biologicznej z osobnika z wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym według wynalazku i (ii) określenie obecności lub nieobecności kompleksu pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem, białkiem fuzyjnym, a specyficznymi dla N. meningitidis przeciwciałami we wspomnianej próbce, gdzie występowanie wspomnianego kompleksu jest wskaźnikiem infekcji.
Korzystnie osobnik jest ssakiem.
Korzystniej osobnik jest człowiekiem.
W ósmym aspekcie wynalazku dostarczona jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyizolowane białko zgodne z pierwszym wspomnianym aspektem.
Korzystnie wspomniana kompozycja farmaceutyczna jest szczepionką.
Szczepionka może być zastosowana do zapobiegania u pacjenta infekcji N. meningitidis.
Krótki opis Fig. i Tabel.
Tabela 1: Identyfikacja aminokwasów z konserwatywnych regionów (C1, C2, C3, C4 i C5) i regionów zmiennych (V1, V2, V3, V3 i V4) polipeptydu NhhA, z każdego z dziesięciu (10) identycznych szczepów N. meningitidis. Podano również odpowiednie SEQ ID NO. Kolumna 1 = oznaczenie szczepu. SEQ ID NO:1-9 były wcześniej opisane w zależnym zgłoszeniu WO 99/31132; sekwencje
NhhA i nhhA szczepu Z2491 uzyskano z http://www.sanger.ac.Uk/Proiects/N meningitidis/; kolumna 2 = numeracja aminokwasu z rejonu C1; kolumna 3 = numeracja aminokwasu z rejonu V1; kolumna 4 = numeracja aminokwasu z rejonu C2; kolumna 5 = numeracja aminokwasu z rejonu V2; kolumna 6 = numeracja aminokwasu z rejonu C3; kolumna 7 = numeracja aminokwasu z rejonu V2; kolumna 8 = numeracja aminokwasu z rejonu C4; kolumna 9 = numeracja aminokwasu z rejonu V4; kolumna 10 = numeracja aminokwasu z rejonu C5. Uwaga podano również numerację sekwencji najwyższej zgodności (SEQ ID NO:11).
Tabela 2: Tabela podstawień aminokwasowych.
Fig. 1: Przyrównanie sekwencji aminokwasowej NhhA z dziesięciu (10) szczepów N. meningitidis (SEQ ID NO:1-10) wraz z sekwencją konsensusową (SEQ ID NO:11). Nazwy szczepów i sekwencje polipeptydowe użyte w przyrównaniu odpowiadają nazwom szczepu i SEQ ID NO z kolumny 1 Tabeli 1. Aminokwasy są wskazane w postaci typowych jednoliterowych skrótów. Aminokwasy konsensusowe są podane jedynie, gdy są całkowicie konserwatywne. Obszary konserwatywne (podwójne podkreślenie oznaczone C1, C2, C3, C4, C5) i obszary zmienne (pojedyncze podkreślenie, oznaczone V1, V2, V3, V4) są podane pod sekwencją konsensusową. Sekwencje aminokwasowe na tej figurze są zgodne z tabelą 1, jak podano poniżej: PMC21 = SEQ ID NO:1; H41 = SEQ ID NO:2; P20 = SEQ ID NO:3; EG327 = SEQ ID NO:4; EG329 = SEQ ID NO:5; H38 = SEQ ID NO:6; H15 = SEQ ID NO:7; BZ10 = SEQ ID NO:8; BZ198 = SEQ ID NO:9; Z2491 = SEQ ID NO:10 oraz sekwencja konsensusowa = SEQ ID NO:11.
Fig. 2: Przyrównanie sekwencji nukleotydowej kwasów nukleinowych nhhA z dziesięciu (10) szczepów N. meningitidis, gdzie sekwencje kodują sekwencje aminokwasowe z fig. 1. Obszary C1, C2, C3, C4, C5 i V1, V2, V3, V4 opisano na fig. 1 i w tabeli 1. Sekwencje kwasów nukleinowych na tej figurze są przypisane następująco PMC21 = SEQ ID NO:12; H41 = SEQ ID NO:13; P20 = SEQ ID NO:14; EG327 = SEQ ID NO:15; EG329 = SEQ ID NO:16; H38 = SEQ ID NO:17; H15 = SEQ ID NO:18; BZ10 = SEQ ID NO:19; BZ198 = SEQ ID NO:20; Z2491 = SEQ ID NO:21 oraz sekwencja konsensusowa = SEQ ID NO:22.
Fig. 3: Mapa plazmidu odpowiadająca pCO14K z produktem amplifikacji PCR kodującym dzikiego typu PMC21 NhhA połączone funkcjonalnie z promotorem porA. (nie narysowane w skali) 3A: wypełnione strzałki pokazują organizację genów porA i kanR w pCO14K. Jak pokazano dla amplifikacji genu nhhA ze szczepu PMC21 użyto oligonukleotydowe startery HOMP5' i ΗΟΜΡ3ΆΝ. Gen nhhA przedstawiono jako wykropkowaną strzałkę, promotor porA jako czarny prostokąt i miejsca restrykcyjne EagI i NcoI użyto dla zastąpienia porA przez nhhA jak to opisano w Przykładzie 2. 3B ułożenie
PL 216 780 B1 genów w pIP52 (PMC21), jak opisano w Przykładzie 2. Przedstawiono miejsce BgIII użyte dla konstrukcji mutanta jak to opisano w Przykładzie 4.
Fig. 4: Schematyczne przedstawienie strategii wydłużania przez PCR nachodzących na siebie fragmentów dla delecji specyficznych obszarów polipeptydów NhhA. Schemat dzikiego typu genu nhhA przedstawiono w górnej części Fig. A-C i zrekombinowany nhhA przedstawiono na dole tych Fig., z obszarami zmiennymi przedstawionymi jako czarne i obszarami stałymi przez niewypełnione prostokąty. Strzałki pokazują przybliżoną lokalizację starterów oligonukleotydowych. Pionowe kreskowane linie wskazują produkty amplifikacji. Gdy sekwencja oligonukleotydowa jest z obszarów nieciągłych kwasu nukleinowego nhhA to jest przedstawiona przez wykropkowaną linię pomiędzy takimi, nieciągłymi obszarami. Podano przybliżoną skalę. Podwójne, pionowe linie wskazują, że przedstawiono jedynie część obszaru C5. A: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 6. B: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 7. C: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 8.
Fig. 5: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:23) wytworzonego w Przykładzie 4 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:28).
Fig. 6: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA H41 (SEQ ID NO:24) wytworzonego w Przykładzie 5 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:29).
Fig. 7: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:25) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 6 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:30).
Fig. 8: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:26) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 7 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:31).
Fig. 9: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:27) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 8 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:32).
Fig. 10: Przyrównanie sekwencji aminokwasowej typu dzikiego i sekwencji polipeptydów z delecjami. Polipeptydy te wytworzono jak to opisano w Przykładzie 2, Przykładzie 3, Przykładzie 4 i Przykładzie 5. Aminokwasy podano jako jednoliterowe skróty. Obszary konserwatywne oznaczone C1, C2, C3, C4 i C5 odpowiadają tym, które zdefiniowano w Tabeli 1, na Fig. 1 i które są podane przez podwójnie podkreślone pełnej długości sekwencje z H41 i PMC21 i obszary zmienne oznaczone V1, V2, V3 i V4 odpowiadające tym, zdefiniowanym w Tabeli 1 i Fig. 1 są podane przez podkreślone, pełnej długości sekwencje z H41 i PMC21.
Fig. 11: Przedstawia Western blot immunologiczny ujawniający nadekspresję NhhA. 45 μg całkowitego białka rozdzielono w 2-20% gradientowym SDS-PAGE przed przeniesieniem na filtr nitrocelulozowy jak to opisano w Przykładzie 9. Ścieżka 9: szczep P6 (nadekspresja PMC 21 NhhA jak opisano w Przykładzie 2). Ścieżka 3: szczep ΡΔ6 (nadekspresja skróconego PMC 21 NhhA opisanego w Przykładzie 4). Ścieżka 4: szczep H14 (nadekspresja H41 NhhA opisana w Przykładzie 3). Ścieżka 5: szczep ΗΔ8 (nadekspresja skróconego H41 NhhA opisanego w Przykładzie 5). Ścieżka 6: szczep 2A (NhhA ekspresja zniesiona przez mutację w genie NhhA jak opisano w Międzynarodowej Publikacji Patentowej WO 99/31132). Podano migrację standardów: 185 kDa, 119 kDa, 85 kDa, 62 kDa, 51,2 kDa, 38,2 kDa, 22,4 kDa. Niskiego typu polipeptyd NhhA występuje jako immunoreaktywne pasmo cząsteczki o wysokiej masie występujące w ścieżce 1, lecz którego brak w ścieżce 6.
Fig. 12: Wyizolowane polipeptydy NhhA z delecją. Polipeptydy NhhA wyizolowano jak to opisano w Przykładzie 9 przed rozdziałem w 4-20% SDS-PAGE. Żel poliakryloamidowy był barwiony barwnikiem Coomassie. Ścieżka 1: preparat OMC szczepu nadeksprymującego skrócony PMC21 polipeptydu NhhA opisany w Przykładzie 6. Ścieżka 2: oczyszczony, skrócony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 3: preparat OMC szczepu nadeksprymującego skrócony polipeptyd NhhA PMC21 opisany w Przykładzie 4. Ścieżka 4: oczyszczony, skrócony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 5: preparat OMC szczepu nadeksprymującego polipeptyd NhhA opisany w Przykładzie 2. Ścieżka 6: oczyszczony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 7: Standardy masy cząsteczkowej 173 kDa, 111 kDa, 80 kDa, 61 kDa, 49 kDa, 36 kDa. Uwaga reaktywne wysokocząsteczkowe rodzaje we wszystkich ścieżkach z wyjątkiem 6 przypuszczalnie przedstawiają multimerowe polipeptydy NhhA. Inne pasma są przypuszczalnie mniej stabilnymi postaciami NhhA lub produktami degradacji. Uwaga nie występują one w ścieżce 6.
Fig. 13: Western blot immunologiczny przeprowadzony przy pomocy mysiej surowicy przeciw białku NhhA. We wszystkich panelach ścieżki 1, 3, 5, 7 zawierają OMC szczepu nadeksprymującego
PL 216 780 B1 polipeptyd NhhA PMC21 i ścieżki 2, 4, 6 i 8 zawierają OMC szczepu 2A, który nie wyraża NhhA. Panel A: ścieżki 1 i 2: mysz A zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz A zaszczepiona NhhA PMC21 typu dzikiego w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6, mysz B zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz B zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:10 000. Panel B: ścieżki 1 i 2: mysz C zaszczepiona skróconym polipeptydem NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz C zaszczepiona skróconym polipeptydem NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6: mysz D zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz D zaszczepiona skróconym PMC21 NhhA (Przykład 4) rozcieńczenie 1:1000. Panel C: Ścieżki 1 i 2 mysz E zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz E zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6: mysz F zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz F zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000.
Fig. 14: Wydedukowany delecyjny mutant polipeptydu NhhA. A: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 2 (SEQ ID NO:33); B: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 3 (SEQ ID NO:34); C: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 4 (SEQ ID NO:35); D: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 5 (SEQ ID NO:36); E: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 6 (SEQ ID NO:37); F: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 7 (SEQ ID NO:38) i G: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 8 (SEQ ID NO:39).
Szczegółowy opis wynalazku
W tym opisie, chyba że kontekst wymaga inaczej, słowa „zawiera, „zawierają i „zawierając będą rozumiane jako dotyczące określonej całości lub grupy całości, lecz nie dla wyłączenia jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości.
Zgodnie z nomenklaturą, NhhA jest użyte tu dla określenia białek według wynalazku, podczas gdy nhhA jest użyty dla określenia kwasów nukleinowych według wynalazku. Powinno być również zrozumiane, że białka i kwasy nukleinowe NhhA/nhhA obejmują białka i kwasy nukleinowe HiaNm/hianm określone przykładowo w WO 99/31132, bez ograniczeń.
Obecny wynalazek w części jest wydedukowany przez wyjaśnienie konserwatywnych i mniej konserwatywnych obszarów polipeptydu NhhA w dziesięciu (10) szczepach N. meningitidis. Wydedukowano, że odpowiednie obszary są konserwatywne w allelicznych wariantach przykładowych polipeptydów NhhA.
Powinno być docenione, że kluczowe dla niniejszego wynalazku jest uświadomienie sobie, że przez usunięcie niekonserwatywnych aminokwasów z dzikiego typu polipeptydu NhhA w celu uzyskania zmodyfikowanej postaci polipeptydu NhhA, odpowiedź immunologiczna może być wywołana po immunizacji wspomnianym polipeptydem według wynalazku, który przez kierowanie odpowiedzi immunologicznej przeciw konserwatywnym epitopom będzie dostarczał ochrony przeciw jednemu lub większej ilości szczepów N. meningitidis.
W użytym tu znaczeniu „niekonserwatywne aminokwasy są aminokwasami występującymi w polipeptydzie dzikiego typu NhhA z pierwszego szczepu N. meningitidis, lecz które nie występują w dzikiego typu polipeptydzie NhhA z jednego lub większej liczby innych szczepów.
Korzystnie, polipeptydy z pierwszego aspektu wynalazku posiadają usuniętą przynajmniej część jednego z obszarów V1, V2, V3 lub V4 w porównaniu z odpowiednią sekwencją typu dzikiego i zgodnie z tym mogą być zbiorowo określone jako przykłady „mutantów delecyjnych.
Powinno być dostrzeżone, że zidentyfikowano obszary V1, V2, V3 i V4 jako obszary polipeptydu NhhA typu dzikiego posiadające ze względnie dużą częstością niekonserwatywne aminokwasy, w porównaniu ze względnie konserwatywnymi obszarami C1-5.
Obszary V, V1 (hiperzmienny) i V2 zawierają z dużą częstością niekonserwatywne aminokwasy, podczas gdy w obszarach V3 i V4 występują one ze względnie niższą częstością. Jednakowoż, obszar V1 stanowi bardziej znaczącą część polipeptydów NhhA typu dzikiego niż obszar V2 (w kategoriach całkowitej liczby aminokwasów). Co za tym idzie, jest korzystne aby wyizolowane białka według wspomnianego pierwszego aspektu posiadały przynajmniej istotną część usuniętego obszaru V1.
Powinno być również dostrzeżone przez znawcę, że konstruując wspomniane mutanty delecyjne możliwe jest „tasowanie obszarów pomiędzy peptydami NhhA różnych szczepów N. meningitidis. Przykładowo, polipeptyd NhhA według wynalazku może zawierać obszar H41 C1 wraz z obszarem PMC21 C5.
PL 216 780 B1
Takie „tasowanie jest szczególnie użyteczne dla sposobów rekombinowania DNA.
Dla celów wynalazku przez „wyizolowany rozumie się materiał, który został oddzielony od jego naturalnego stanu lub w inny sposób poddany manipulacji człowieka. Wyizolowany materiał może być zasadniczo lub w istotnym stopniu, wolny od naturalnych składników normalnie towarzyszących mu w jego stanie naturalnym, lub może być manipulowany tak, jakby był w stanie sztucznym wraz ze składnikami, które normalnie towarzyszą mu w stanie naturalnym. Wyizolowany materiał może być w postaci naturalnej lub zrekombinowanej.
„Białko oznacza polimer aminokwasowy. Aminokwas może być naturalnym lub nie występującymi w przyrodzie aminokwasami, co jest dobrze rozumiane w dziedzinie.
„Peptyd jest białkiem posiadającym nie więcej niż pięćdziesiąt (50) aminokwasów.
Polipeptyd jest białkiem posiadającym pięćdziesiąt (50) lub więcej aminokwasów.
W użytym tu znaczeniu zwrot „wywołuje odpowiedź immunologiczną określa zdolność wyizolowanego polipeptydu według wynalazku do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej u ssaka, któremu jest podany, gdzie odpowiedź jest skierowana przeciw N. meningitidis i/lub wspomnianemu peptydowi. Korzystnie, odpowiedź immunologiczna obejmuje wytworzenie bakteriobójczych przeciwciał. Korzystniej, odpowiedź immunologiczna chroni przed zarażeniem N. meningitidis.
„Swoista dla szczepu jest użyte tu w kontekście odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw lub przynajmniej głównie przeciw autologicznemu szczepowi N. meningitidis.
W użytym tu znaczeniu „reaktywność krzyżowa jest zdolnością polipeptydu według wynalazku do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw jednemu lub większej liczbie heterologicznych szczepów N. meningitidis.
W użytym tu znaczeniu „krzyżowa ochrona jest zdolnością polipeptydu według wynalazku do wywołania odpowiedzi immunologicznej i, co za tym idzie, dostarczania ochrony przeciw zarażeniu jednym, lub większą liczbą heterologicznych szczepów N. meningitidis.
Tak więc, w świetle poniższego, wspomniany polipeptyd według wynalazku może być określony tu jako „immunogen lub jako będący „immunogenicznym.
Choć dla celów obecnego wynalazku wspomniane zmodyfikowane białka NhhA zostały przykładowo podane jako sekwencje aminokwasowe z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:23-27) i Fig. 14, niniejszy wynalazek również rozważa fragmenty, pochodne i warianty (takie jak warianty alleliczne) przykładowych białek.
Przykładowo, aminokwasy mogą być usunięte z którejkolwiek sekwencji C1-5 podanej na Fig. 1, podczas gdy nie wszystkie niekonserwatywne aminokwasy w obszarach V1-4 wymagają usunięcia celem ograniczenia immunogeniczności specyficznej wobec szczepu.
Co za tym idzie, wyizolowane białka według wynalazku mogą zawierać fragmenty obszarów C1-5 i V1-4.
W rzeczywistości, jak będzie dyskutowane poniżej, w Przykładach, może być konieczne dla celów wytwarzania polipeptydów według wynalazku, opartego na rekombinowaniu DNA, usunięcie jednego lub kilku aminokwasów z obszaru C1, C2, C3, C4 i/lub C5 lub obszaru V1, V2, V3 i/lub V4, przez wykorzystanie dogodnych miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych i uzyskania wysokiego poziomu ekspresji stabilnego, immunogenicznego białka.
W jednej postaci „fragment obejmuje sekwencję aminokwasową zawierającą mniej niż 100%, lecz przynajmniej 20%, korzystnie przynajmniej 50%, korzystniej przynajmniej 80% i jeszcze korzystniej przynajmniej 90% wspomnianych obszarów C1, C2, C3, C4 lub C5.
Fragmenty przykładowo mogą być peptydami zawierającymi tak niewiele jak dwanaście aminokwasów obszaru C2 (SEQ ID NO:11) lub sekwencje przynajmniej dwudziestu aminokwasów, lub więcej niż sto kolejnych aminokwasów odpowiadających pewnym lub wszystkim opisanym obszarom C1, C2, C3, C4 i/lub C5.
Inne fragmenty przykładowo podane tu są zmodyfikowanymi polipeptydami NhhA według wynalazku, które podległy posttranslacyjnej obróbce do postaci dojrzałego polipeptydu, takiego jak przedstawiono na Fig. 14.
W kolejnej postaci „fragment jest małym peptydem przykładowo o długości 6, korzystnie przynajmniej 10 i korzystniej przynajmniej 20 aminokwasach, zawierającym jedną lub więcej determinant antygenowych lub epitopów pochodzących ze zmodyfikowanych białek NhhA według wynalazku. Rozważane są również większe fragmenty zawierające więcej niż jeden polipeptyd, które mogą być otrzymane przez zastosowanie typowych sposobów rekombinowania kwasu nukleinowego lub są zsyntetyzowane przy pomocy tradycyjnych sposobów syntezy w cieczy lub na fazie stałej. PrzykładoPL 216 780 B1 wo, odniesienie literaturowe może być uczynione do syntezy w cieczy lub na fazie stałej jaką przykładowo opisali w Rozdziale 9 zatytułowanym „Peptide Synthesis Atherton i Shephard zawartej w publikacji zatytułowanej „Synthetic Vaccines pod redakcją Nicholson i opublikowanej przez Blackwell Scientific Publications. Alternatywnie, peptydy mogą być wytworzone przez trawienie polipeptydu według wynalazku proteinazami, takimi jak endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C i gronkowcową proteazą V8. Będące produktami trawienia fragmenty mogą być oczyszczone przykładowo sposobami wysoko rozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC).
W użytym tu znaczeniu „wariant polipeptydów to polipeptydy według wynalazku, w których jeden lub więcej aminokwasów zastąpiono innymi aminokwasami. Jest dobrze zrozumiałe w dziedzinie, że pewne aminokwasy mogą być zmienione na inne o z grubsza podobnych właściwościach, bez zmiany charakteru aktywności polipeptydu (konserwatywne podstawienia). Przykładowe konserwatywne podstawienia mogą być dokonane zgodnie z Tabelą 2.
Zasadnicze zmiany w funkcji mogą być dokonane przez wybranie podstawień mniej konserwatywnych niż te, przedstawione w Tabeli 2. Inne zamiany aminokwasów będą podstawieniami niekonserwatywnymi i stosunkowo niewiele z nich może być tolerowane. Ogólnie podstawienia, które przypuszczalnie wytwarzają więcej zmian we właściwościach polipeptydów to te, w których (a) reszta hydrofilowa (np. Ser lub Thr) jest podstawiona przez resztę hydrofilową (np. Ala, Leu, Ile, Phe lub Val); (b) cysteina lub prolina jest podstawiona przez jakikolwiek inny aminokwas; (c) aminokwas o elektrododatnim łańcuchu bocznym (np. Arg, His lub Lys) jest podstawiony przez aminokwas elektroujemny (np. Glu lub Asp) lub (d) aminokwas o masywnym łańcuchu bocznym (np. Phe lub Trp) jest podstawiony przez aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym (Ala, Ser) lub bez łańcucha bocznego (np. Gly).
Termin „wariant obejmuje również polipeptydy NhhA według wynalazku wytworzone z Allelicznych wariantów sekwencji podanych przykładowo w tym opisie.
Warianty polipeptydu NhhA mogą być objęte zakresem terminu „homologi polipeptydu.
Homologi polipeptydu mają wspólnych przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80% i korzystniej przynajmniej 90% identycznej sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi polipeptydów NhhA według wynalazku, jak to wcześniej opisano. Ogólnie, użyty tu termin „homolog obejmuje możliwą do określenia zależność sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej z kwasem nukleinowym lub polipeptydem według wynalazku.
Przykładowo, takie homologi są rozważone jako posiadające sekwencje aminokwasowe różniące się od tych, przykładowo tu podanych, lecz które są immunogeniczne i dostarczają krzyżowej ochrony immunologicznej.
Specyficznie z zakresu terminu „homologi wyłączone są polipeptydy dzikiego typu NhhA i kwasy nukleinowe nhhA. W zakresie określenia homologi mieszczą się „ortologi, które są funkcjonalnie pokrewnymi polipeptydami i kodujące je kwasy nukleinowe izolowane z gatunków bakterii innych niż AZ. meningitidis.
Terminy użyte tu dla opisania zależności sekwencji pomiędzy odpowiednimi kwasami nukleinowymi i polipeptydami obejmują „okienko porównywania, „identyczność sekwencji, „procentową identyczność sekwencji i „istotną identyczność. Ponieważ odpowiednie kwasy nukleinowe/polipeptydy mogą zawierać (1) jedynie jedną lub więcej części pełnej sekwencji kwasu nukleinowego/polipeptydu, która jest wspólna z kwasami nukleinowymi/polipeptydami i (2) jedną lub więcej części różniących się pomiędzy kwasami nukleinowymi/peptydami, porównania sekwencji są typowo przeprowadzone w „okienku porównywania dla identyfikacji i porównania lokalnych obszarów podobieństwa sekwencji. „Okienko porównywania odnosi się do konceptualistycznego odcinka typowo 12 kolejnych reszt, które są porównane względem sekwencji referencyjnej. Optymalne przyrównanie sekwencji dla przyrównania okienka porównywania może być dokonane przez komputerową implementację algorytmów (program Geneworks z Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie programów Wisconsin Genetics Software Packge Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, włączonego tu przez cytowanie) lub przez sprawdzenie i najlepsze przyrównanie (np. dające najwyższą procentową homologię w okienku porównywania) wytworzone jakimkolwiek, wybranym spośród różnych sposobów. Odniesienie literaturowe może również być zrobione do rodziny programów BLAST jakie przykładowo ujawnili Altschul i wsp., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, który jest włączony tu przez cytowanie.
Szczegółową dyskusję analizy sekwencji można znaleźć w rozdziale 19.3 Current Protocols in Molecular Biology wyd. Ausubel i wsp. (John Willey & Sons Inc., NY, 1995-1999).
PL 216 780 B1
Termin „identyczność sekwencji jest użyty tu w szerokim tego słowa znaczeniu obejmując szereg dokładnie dopasowanych nukleotydów lub aminokwasów zgodnie z odpowiednim przyrównaniem przy pomocy standardowego algorytmu z uwagi na identyczność sekwencji w okienku porównywania. Co za tym idzie, „procentowa identyczność sekwencji jest obliczona przez porównanie dwóch optymalnie przyrównanych sekwencji w okienku porównywania, określając liczbę miejsc, w których występują identyczne zasady (np. A, T, C, G, I) w obu sekwencjach, co daje liczbę dopasowanych miejsc, dzieląc liczbę dopasowanych miejsc przez całkowitą liczbę miejsc w okienku porównywania (tj. wielkość okienka) i mnożąc wynik przez 100 co daje procentową identyczność sekwencji. Przykładowo, „identyczność sekwencji może być rozumiana jako „procentowe dopasowanie obliczone programem komputerowym DNASIS (wersja 2,5 dla Windows, dostępna z Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA).
Tak więc, dobrze mieści się w zakresie umiejętności znawcy przygotowanie homologów peptydowych według wynalazku, takich jak warianty wcześniej zdefiniowane przez technologię rekombinowania DNA. Przykładowo, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być zmutowane zarówno przez losową mutagenezę, przykładowo mutagenezę transpozonową lub mutagenezę ukierunkowaną. Uzyskane fragmenty DNA są następnie klonowane w dogodnych gospodarzach dla ekspresji, takich jak E. coli przy pomocy tradycyjnych technologii i wykrywane są klony utrzymujące pożądaną aktywność. Gdy klony są otrzymane przy pomocy sposobów losowej mutagenzy, to dla wykrycia mutacji przeprowadzone jest określanie sekwencji nukleotydowej pozytywnych klonów.
W użytym tu znaczeniu „pochodne polipeptydy są polipeptydami według wynalazku, które zmieniono przykładowo przez koniugowanie lub kompleksowanie z innymi cząsteczkami chemicznymi lub sposobami posttranslacyjnej modyfikacji, co jest zrozumiałe w dziedzinie. Takie pochodne obejmują delecje aminokwasu i/lub insercje do polipeptydów NhhA według wynalazku lub ich wariantów, gdzie wspomniane pochodne wywołują odpowiedź immunologiczną.
„Insercje aminokwasów mogą obejmować fuzje polipeptydów lub ich wariantów z innymi polipeptydami lub białkami. W związku z powyższym warto wskazać, że polipeptydy lub warianty według wynalazku mogą być wbudowane do większych polipeptydów i oczekuje się, że takie większe polipeptydy mogą również być immunogeniczne. Polipeptydy jakie opisano powyżej mogą być przyłączone do kolejnego białka, które nie pochodzi z N. meningitidis. Inne białko może, przykładowo, uczestniczyć w oczyszczaniu białka. Przykładowo, użyty może być znacznik histydynowy lub białko wiążące maltozę. Alternatywnie, może wytwarzać odpowiedź immunologiczną skuteczną względem N. meningitidis lub może wytwarzać odpowiedź immunologiczną przeciw innemu patogenowi. Inne możliwe fuzje białkowe to te, które wytwarzają odpowiedź immunomodulującą. Szczególne przykłady takich białek obejmują białko A lub S-transferazę glutationu (GST). Ponadto, polipeptyd może być przyłączony dla składnika szczepionki opartego na oligosacharydzie, działającego jako nośnik białka.
Inne, rozważane pochodne obejmują, lecz nie są ograniczone do modyfikacji łańcuchów bocznych, wbudowania nienaturalnych aminokwasów i/lub ich pochodnych podczas syntezy polipeptydu lub białka, użycia substancji sieciujących i innych sposobów, które narzucają konformację polipeptydów, fragmentów i wariantów według wynalazku. Przykłady modyfikacji łańcucha bocznego rozważane przez obecny wynalazek obejmują modyfikacje grup aminowych takie jak acylacja bezwodnikiem kwasu octowego; acylacja grup aminowych bezwodnikiem bursztynowym i tetrahydroftalowym; amidynacja metyloacetamidem; karbamoilacja grup aminowych cyjanianem; pirydoksylacja lizyny pirydoksylo-5-fosforanem, a następnie redukcja NaBH4; redukcyjna alkilacja przez reakcję z aldehydem, a następnie redukcję NaBH4 i trinitrobenzylacja grup aminowych kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).
Grupa karboksylowa może być modyfikowana przez aktywowanie karbodiimidem przez tworzenie O-acylomocznika, a następnie przez kolejną modyfikację przykładowo do odpowiedniego amidu.
Guaninowa grupa reszty argininy może być modyfikowana przez heterocykliczną kondensację przy pomocy odczynników takich jak 2,3-butanodion, fenylogIioksaI i glioksal.
Grupy sulfhydrylowe mogą być zmodyfikowane sposobami takimi jak przeprowadzenie utleniania kwasu nadmrówkowego do kwasu cystydylowego, tworzenie pochodnych rtęci przy pomocy kwasu 4-chlorortęciowofenylosulfonowego, 4-chlorortęciowobenzoesowego; 2-chlorortęciowo-4-nitrofenylowego, chlorku fenylortęciowego i innych związków rtęci; tworzenie mieszanych disiarczków z innymi związkami tiolowymi; reakcję z imidem maleinowym, bezwodnikiem maleinowym lub innymi podstawionymi imidami maleinowymi; karboksymetylacją kwasem jodooctowym lub amidem jodooctowym i karbamoilację cyjanianem w alkalicznym pH.
PL 216 780 B1
Reszty tryptofanu mogą być zmodyfikowane przez przykładowo, alkilowanie pierścienia indolowego bromkiem 2-hydroksy-5-nitrobenzylowym, halogenkami kwasu sulfonowego lub przez utlenianie imidem N-bromobursztynowym.
Reszty tyrozyny mogą być modyfikowane przez nitrowanie do postaci pochodnej 3-nitrotyrozyny.
Pierścień imidazolowy reszty histydyny może być modyfikowany przez N-karboetoksylację dietylopirowęglanem lub alkilowanie pochodnymi kwasu jodooctowego.
Przykłady wbudowania nienasyconych aminokwasów i pochodnych podczas syntezy polipeptydu obejmują, lecz nie są ograniczone do użycia kwasu 4-aminomasłowego, kwasu 6-aminoheksenowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-5-fenylopentanowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-6-metyloheptanowgo, t-butyloglicyny, norleucyny, norwaliny, fenyloglicyny, ornityny, sarkozyn, 2-tienyloalaniny i/lub
D-izomerów aminokwasów.
Wynalazek rozważa również kowalencyjne modyfikowanie wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku dinitrofenolem dla uczynienia go immunogenicznym u człowieka.
Wyizolowane białka oraz białka fuzyjne według wynalazku mogą być przygotowane przy pomocy jakiejkolwiek użytecznej procedury znanej znawcom.
Przykładowo, białko może być przygotowane jako rekombinowany polipeptyd przy pomocy procedury obejmującej etapy:
(i) przygotowanie konstruktu ekspresyjnego zawierającego zmodyfikowany kwas nukleinowy nhhA według wynalazku połączony funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą regulatorowych sekwencji nukleotydowych (ii) transfekcję lub transformację użytecznej komórki gospodarza konstruktem ekspresyjnym i (i) ekspresję zrekombinowanego polipeptydu we wspomnianej komórce gospodarza.
Poniżej przedstawiony jest szereg przykładów, opisujących wytworzenie zmodyfikowanych kwasów nukleinowych nhhA przez PCR.
W pewnej, szczególnej postaci PCR jest PCR zachodzących fragmentów jaki będzie opisany poniżej, który to sposób jest oparty na opisanym w Ho i wsp., 1989, Gene 77 51 i przez Horton i wsp., 1989, Gene 77 61, które oba są włączone tu przez cytowanie.
Dla ekspresji w komórce gospodarza rekombinowany kwas nukleinowy jest połączony funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą sekwencji regulatorowych w wektorze ekspresyjnym.
„Wektor ekspresyjny może być zarówno samoreplikującym się poza chromosomowym wektorem takim jak plazmid lub wektorem, który wbudowuje się do genomu gospodarza.
„Połączony funkcjonalnie oznacza, że wspomniana regulatorowa sekwencja(e) nukleotydowa jest/są umiejscowiona względem zrekombinowanego kwasu nukleinowego według wynalazku dla zapoczątkowania, regulacji lub kontrolowania transkrypcji w inny sposób.
Nukleotydowe sekwencje regulatorowe ogólnie będą odpowiednie dla użytej dla ekspresji komórki gospodarza. Wiele rodzajów odpowiednich wektorów ekspresyjnych jest użytecznymi sekwencjami regulatorowymi znanymi w dziedzinie dla różnych komórek gospodarzy.
Typowo, wspomniana jedna lub więcej regulatorowych sekwencji nukleotydowych może zawierać, lecz nie tylko, sekwencje promotorowe, sekwencje liderowe lub sygnałowe, miejsca wiązania rybosomu, sekwencje startu i terminacji transkrypcji, sekwencje startu i terminacji translacji i sekwencje enhanserową lub aktywatorową.
W dziedzinie znane są konstytutywne lub indukowalne promotory rozpatrywane przez wynalazek. Promotory mogą być zarówno promotorami występującymi naturalnie, lub promotorami hybrydowymi łączącymi elementy więcej niż jednego promotora.
W korzystnej postaci wektor ekspresyjny zawiera selekcyjny gen znacznikowy pozwalający na selekcję stransformowanych komórek gospodarza. Podlegające selekcji geny znacznikowe są dobrze znane w dziedzinie i będą różniły się zależnie od użytej komórki gospodarza.
W pewnej postaci wektorem ekspresyjnym jest pCO14K posiadający promotor porA i gen selekcyjny warunkujący odporność na kanamycynę, co będzie opisane szczegółowo poniżej. Zgodnie z tą postacią komórką gospodarza jest bakteria wybrana z grupy obejmującej E. coli N. meningitidis.
Wektor ekspresyjny może również zawierać partnera fuzyjnego (typowo dostarczony przez wektor ekspresyjny) tak, że zrekombinowany polipeptyd według wynalazku jest wyrażony jako polipeptyd fuzyjny ze wspomnianym partnerem fuzyjnym. Zasadniczą korzyścią partnerów fuzyjnych jest to, że wspomagają identyfikację i/lub oczyszczanie wspomnianego polipeptydu fuzyjnego.
PL 216 780 B1
Dla ekspresji wspomnianego polipeptydu fuzyjnego niezbędnym jest przyłączenie, przy pomocy Iigazy, sekwencji nukleotydowej zgodnej z wynalazkiem do wektora ekspresyjnego tak, że ramka odczytu fuzyjnego partnera i sekwencji nukleotydowej według wynalazku są zgodne.
Dobrze znane przykłady partnerów fuzyjnych obejmują, lecz nie są ograniczone do S-transferazy glutationu (GST), części Fc ludzkiego IgG, białka wiążącego maltozę (MBP) i heksahistydyny (HIS6), które są szczególnie użyteczne dla izolowania fuzji polipeptydowych przez chromatografię powinowactwa. Dla oczyszczania polipeptydów fuzyjnych przez chromatografię powinowactwa odpowiednimi złożami dla chromatografii są odpowiednio żywice glutationowa, amylozowa i niklowa lub skoniugowana z kobaltem. Wiele takich złóż jest dostępnych w „zestawach takich jak QUIAekspress™ system (Quiagen) użyteczny z (His6), partnerami fuzyjnymi i system oczyszczania Pharmacia GST.
Korzystnym partnerem fuzyjnym jest MBP opisany poniżej w Przykładzie 11.
Kolejnym partnerem fuzyjnym, dobrze znanym w dziedzinie jest zielone białko fluorescencyjne (GFP). Ten partner fuzyjny służy jako „znacznik fluorescencyjny pozwalający na identyfikację polipeptydu fuzyjnego według wynalazku poprzez mikroskopię flourescencyjną lub cytometrię przepływową. Znacznik GFP jest użyteczny dla określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji polipeptydu fuzyjnego według wynalazku lub izolowania komórek wyrażających polipeptyd fuzyjny według wynalazku. Metody cytometrii przepływowej takie jak sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) są szczególnie użyteczne w tym ostatnim zastosowaniu.
Korzystnie, partnerzy fuzyjni posiadają również miejsca cięcia dla proteaz takich jak czynnik X2 lub trombina pozwalających odpowiedniej proteazie częściowo strawić polipeptyd fuzyjny według wynalazku i co za tym idzie uwolnić zrekombinowany polipeptyd według wynalazku. Uwolniony polipeptyd może następnie być oddzielony od partnera fuzyjnego przez kolejny etap rozdziału chromatograficznego.
Fuzyjni partnerzy według wynalazku obejmują również „znaczniki epitopowe, które są zazwyczaj krótkimi sekwencjami peptydowymi, dla których dostępne jest specyficzne przeciwciało. Dobrze znanymi przykładami epitopów znacznikowych, dla których dostępne są gotowe, specyficzne przeciwciała są c-myc, hemaglutynina z wirusa grypy i znaczniki FLAG.
Jak wcześniej, polipeptydy według wynalazku mogą być wytworzone przez hodowanie komórki gospodarza transformowanej wspomnianym konstruktem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, lub homolog polipeptydu według wynalazku. Warunki odpowiednie dla ekspresji białka będą różniły się w zależności od wyboru wektora ekspresyjnego i komórki gospodarza. Jest to łatwe do stwierdzenia przez znawcę poprzez rutynowe eksperymentowanie.
Użyteczne dla ekspresji komórki gospodarza mogą być prokariotycznymi lub eukariotycznymi. Pewna, korzystna komórka gospodarza dla ekspresji polipeptydu według wynalazku jest bakterią. Użytą bakterią może być Escherichia coli lub N. meningitidis.
W korzystnej postaci komórką gospodarza jest N. meningitidis, która może być zmodyfikowana tak, aby nie ulegała ekspresji PorA, Opa, Opc lub polisacharyd kapsydu i wyrażany był pożądany fenotyp lipopolisacharydu.
Alternatywnie, komórka gospodarza może być komórką owada, taką jak przykładowo komórki SF9, które mogą być wykorzystane w bakulowirusowym systemie ekspresji.
Zrekombinowane białko może być dogodnie przygotowane przez osobę biegłą w sztuce przy pomocy typowych protokołów jakie przykładowo opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) włączonej tu przez cytowanie, szczególnie rozdziały 16 i 17; Current Protocols in Molecular Biology red. Ausubel i wsp., (John Willey & Sons, Inc. 1995-1999), włączonej tu przez cytowanie, szczególnie rozdziały 10 i 16 i Current Protocols in Protein Science, red. Coligan i wsp., (John Willey & Sons Inc. 1995-1999), która jest włączona tu przez cytowanie w szczególności rozdziały 1, 5 i 6.
Szczególnymi sposobami ekspresji zrekombinowanych zmodyfikowanych białek NhhA według wynalazku i sposobami wykrywania ekspresji białka są podane poniżej Przykłady.
Sekwencje nukleotydowe.
Dostarczony jest wyizolowany kwas nukleinowy kodujący zmodyfikowane białko NhhA według wynalazku.
Korzystnie, wspomniany wyizolowany kwas nukleinowy posiada sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub więcej rejonów stałych (C) polipeptydu NhhA jak opisano na Fig. 1 i 2. Wyizolowany
PL 216 780 B1 kwas nukleinowy może ponadto kodować jeden lub więcej niekonserwatywnych (obszar V) aminokwasów takich jak również zidentyfikowane na Fig. 1 i 2.
Szczególne postaci takich wyizolowanych kwasów nukleinowych są dostarczone w SEQ ID NO:28-32 i na Fig. 5-9.
Termin „kwas nukleinowy w użytym tu znaczeniu oznacza jedno- lub dwuniciowy mRNA, RNA, cRNA i DNA, wspomniany DNA obejmuje cDNA i genomowy DNA.
„Polinukleotyd jest kwasem nukleinowym zawierającym osiemdziesiąt (80) lub więcej kolejnych nukleotydów, podczas gdy „oligonukleotyd zawiera mniej niż osiemdziesiąt (80) kolejnych nukleotydów.
„Sonda może być jedno- lub dwuniciowym oligonukleotydem lub polinukleotydem dogodnie wyznakowanym celem wykrycia komplementarnych sekwencji przykładowo w doświadczeniach typu Northern lub Southern blot.
„Starter jest zazwyczaj jednoniciowym oligonukleotydem, korzystnie posiadającym 15-50 kolejnych nukleotydów, który jest zdolny do związania się z „matrycą komplementarnego kwasu nukleinowego i wydłużanym w sposób zależny od matrycy przez działanie polimerazy DNA, takiej jak Taq polimeraza, RNA zależna DNA polimeraza lub Sekwenaza™. Obecny wynalazek rozważa również homologi kwasów nukleinowych według wynalazku, jakie wcześniej zdefiniowano. Takie homologi kwasu nukleinowego nie obejmują kwasów nukleinowych kodujących pełnej długości polipeptydy dzikiego typu NhhA.
Przykładowo, homologi kwasu nukleinowego kodują peptydy i polipeptydy strukturalnie pokrewne NhhA obszarów V i C według wynalazku, które mogą być użyteczne dla celów dostarczenia krzyżowej ochrony immunologicznej przez immunizację N. meningitidis.
W pewnej postaci homologi kwasu nukleinowego kodują wyizolowane białko i białko fuzyjne według wynalazku. W innej postaci homologi kwasów nukleinowych dzielą przynajmniej 60%, korzystnie przynajmniej 70%, korzystniej przynajmniej 80% i jeszcze korzystniej przynajmniej 90% sekwencji identycznej z kwasami nukleinowymi według wynalazku.
W jeszcze kolejnej postaci, homologi kwasu nukleinowego hybrydyzują z kwasami nukleinowymi według wynalazku w przynajmniej warunkach o niskiej ostrości, korzystnie w przynajmniej średnio ostrych warunkach i korzystniej w bardzo ostrych warunkach.
„Hybrydyzować i hybrydyzacja w użytym tu znaczeniu oznaczają parowanie przynajmniej części komplementarnych sekwencji nukleotydowych dla wytworzenia hybryd DNA-DNA, RNA-RNA lub DNA-RNA. Sekwencje hybryd zawierają komplementarne sekwencje nukleotydowe występujące dzięki parowaniu zasad pomiędzy komplementarnymi purynami i pirymidynami, co dobrze znane jest w dziedzinie.
Zgodnie z tym powinno być dostrzeżone, że zmodyfikowane puryny (przykładowo inozyna, metyIoinożyna i metyloadenozyna) i zmodyfikowane pirymidyny (tiourydyna i metylocytozyna) mogą również uczestniczyć w parowaniu zasad.
„Ostrość w użytym tu znaczeniu określa temperaturę i siłę jonową, i występowanie, lub brak, określonych rozpuszczalników organicznych i/lub detergentów podczas hybrydyzacji. Wyższa ostrość oznacza, że wyższy będzie wymagany poziom komplementarności hybrydyzujących sekwencji nukleotydowych.
„Ostre warunki oznaczają takie warunki, w których hybrydyzować będzie jedynie kwas nukleinowy o większej częstości komplementarnych zasad.
Cytowane tu warunki niskiej ostrości uwzględniają i obejmują:
(i) od przynajmniej około 1% obj./obj. do przynajmniej około 15% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 1 M do przynajmniej około 2 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 1 M do przynajmniej około 2 M soli do płukania w 42°C; i (ii) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C (i) 2 x SSC, 0,1% SDS; lub (ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 5% SDS do płukania w temperaturze pokojowej.
Średnio ostre warunki uwzględniają i obejmują:
(iii) od przynajmniej około 16% obj./obj. do przynajmniej około 30% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 0,5 M do przynajmniej około 0,9 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 0,5 M do przynajmniej około 0,9 M soli do płukania w 42°C; i
PL 216 780 B1 (iv) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C i (a) 2 x SSC, 0,1% SDS; lub (b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 5% SDS do płukania w temperaturze pokojowej.
Ostre warunki uwzględniają i obejmują:
(i) od przynajmniej około 31% obj./obj. do przynajmniej około 50% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 0,01 M do przynajmniej około 0,15 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 001 M do przynajmniej około 0,15 M soli do płukania w 42°C; i (ii) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C i (a) 0,1 x SSC, 0,1% SDS; lub (b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 1% SDS do płukania w temperaturze przekraczającej 65°C przez około godzinę; i (v) 0,2 x SSC, 0,1% SDS dla płukania w lub powyżej 68°C przez około 20 minut.
Ogólnie, płukanie jest przeprowadzone w Tm=69,3 + 0,41 (G+C)% - 12°C. Ogólnie, Tm dwuniciowego DNA zmniejsza się o około 1°C dla każdego dodatkowego 1% niesparowanych zasad.
Wyżej wspomniane ostre warunki hybrydyzacji są dobrze znane w dziedzinie i opisano je w rozdziałach 2.9 i 2.10 Ausubel i wsp., co włączono tu przez cytowanie. Znawcy dostrzegą również, że można manipulować różnymi czynnikami dla optymalizowania specyficzności hybrydyzacji. Optymalizowanie ostrości końcowych płukań może służyć dla uzyskania pewności o wysokim stopniu hybrydyzacji.
Typowo, komplementarne sekwencje nukleotydowe są zidentyfikowane sposobami blotowania obejmującymi etap, w którym nukleotydy są unieruchomione na macierzy (korzystnie syntetycznej błonie takiej jak nitroceluloza), etap hybrydyzacji i etap wykrycia. Metoda Southern blot jest użyta dla identyfikacji komplementarnej sekwencji DNA; metoda Northern blot jest użyta dla identyfikacji komplementarnej sekwencji RNA. Metody Dot blot i slot blot mogą być użyte dla identyfikacji komplementarnych DNA/DNA, DNA/RNA lub RNA/RNA sekwencji polinukleotydowych. Takie techniki są dobrze znane znawcom i zostały opisane przez Ausubel i wsp., powyżej, na stronach 2.9.1 do 2.9.20. Zgodnie z takimi sposobami Southern blot wymaga rozdzielenia cząsteczek DNA zgodnie z ich wielkością przez elektroforezę w żelu, przenoszenie rozdzielonych pod względem wielkości DNA na syntetyczny filtr i hybrydyzację DNA związanego z filtrem z komplementarną sekwencją nukleotydową.
W metodach dot blot i slot blot próbki DNA są bezpośrednio naniesione na syntetyczny filtr przed przeprowadzoną jak wyżej hybrydyzacją.
Alternatywny etap przenoszenia jest użyty, gdy identyfikowane są komplemetarne kwasy nukleinowe w bibliotece cDNA lub DNA genomowego, tak jak w procesie hybrydyzacji kolonijnej lub łysinkowej. Innymi typowymi przykładami tej procedury jest opisany w rozdziałach 8-12 Sambrook i wsp., powyżej, które są włączone tutaj przez cytowanie.
Typowo, poniższe ogólne procedury mogą być użyte dla określenia warunków hybrydyzacji. Kwasy nukleinowe są wiązane/przenoszone na syntetyczne błony, jak to opisano powyżej. Sekwencja nukleotydowa typu dzikiego według wynalazku jest wyznakowana jak opisano powyżej i badana jest zdolność tego, wyznakowanego kwasu nukleinowego do hybrydyzacji z unieruchomioną sekwencją nukleotydową.
Znawcy dostrzegą, że szereg czynników wpływa na hybrydyzację. Aktywność specyficzna wyznakowanej radioaktywnie sekwencji polinukleotydowej powinna być typowo większa niż, lub równa około 108 dpm/ug dla dostarczenia wykrywalnego sygnału. Radioaktywnie wyznakowana sekwencja
O Q nukleotydowa o aktywności specyficznej 10 do 10 dpm^g może wykryć około 0,5 pg DNA. Jest dobrze znane w dziedzinie, że dostatecznie dużo DNA musi być unieruchomione na filtrze aby umożliwiło wykrycie. Jest pożądane posiadanie nadmiaru unieruchomionego DNA, zazwyczaj 1-10 μg. Dodanie obojętnego polimeru takiego jak 10% (wag./obj.) siarczan dekstranu (MW 500 000) lub glikolu polietylenowego 6000 podczas hybrydyzacji może również zwiększyć czułość hybrydyzacji (patrz Ausubel i wsp., powyżej, w 2.10.10). Dla uzyskania znaczących wyników hybrydyzacji pomiędzy kwasem nukleinowym unieruchomionym na filtrze i wyznakowanym kwasem nukleinowym, przed płukaniem hybrydyzowana musi być z unieruchomionym kwasem nukleinowym dostateczna ilość wyznakowanego kwasu nukleinowego. Płukanie daje pewność, że wyznakowany kwas nukleinowy hybrydyzuje jedynie z unieruchomionym kwasem nukleinowym o pożądanym stopniu komplementarności do wyznakowanego kwasu nukleinowego.
Sposoby wykrywania wyznakowanych kwasów nukleinowych hybrydyzujących z unieruchomionym kwasem nukleinowym są dobrze znane praktykującym znawcom. Sposoby takie obejmują autoradiografię, chemiluminescencję, fluorescencję i wykrywanie kolorymetryczne.
PL 216 780 B1
W pewnej postaci homologiczne kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być przygotowane zgodnie z poniższą procedurą:
(i) otrzymanie ekstraktu kwasu nukleinowego od dogodnego gospodarza;
(ii) stworzenie starterów, które są warunkowo zdegenerowane, gdzie każdy zawiera część sekwencji nukleotydowej według wynalazku; i (iii) użycie wspomnianych starterów dla amplifikacji sposobami amplifikacji kwasu nukleinowego jednego lub większej liczby produktów amplifikacji na matrycy wspomnianego ekstraktu kwasu nukleinowego.
Użyteczną komórką gospodarza jest bakteria.
Korzystnie gospodarzem jest rodzaj Neisseria.
Korzystniej gospodarzem jest N. meningitidis lub N. lactamica.
Startery użyte zgodnie ze sposobami amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego obejmują SEQ ID NO:40-41 jak szczegółowo opisano poniżej.
Użyteczne sposoby amplifikacji kwasu nukleinowego są dobrze znane znawcom i obejmują polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) jak przykładowo opisano w rozdziale 15 Ausubel i wsp., powyżej, która jest włączona tu przez cytowanie; amplifikację z zastąpieniem łańcucha (SDA) jak przykładowo opisano w patencie U.S. nr 5,422,252, który jest włączony tu przez cytowanie; replikację według modelu obracającego się koła (RCR) jak przykładowo opisano w Liu i wsp., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587 i Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 92/01813 i Lizardi i wsp., (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe WO 97/19193), które są włączone tu przez odniesienie literaturowe; amplifikację zależną od sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) jak przykładowo opisali Sooknan i wsp., 1994, Biotechniques 17 1077), które jest włączone tu przez odniesienie literaturowe i amplifikację Q-e, jak przykładowo opisano przez Tyagi i wsp., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395, który jest włączony tu przez cytowanie.
W użytym tu znaczeniu „produkt amplifikacji określa produkt będący kwasem nukleinowym wytworzonym sposobami amplifikacji kwasu nukleinowego.
Przeciwciała.
Wynalazek rozważa również przeciwciała przeciw wyizolowanym białkom i białkom fuzyjnym według wynalazku. Przeciwciała według wynalazku mogą być poliklonalne lub monoklonalne. Dobrze znane protokoły, które mogą być zastosowane dla wytworzenia przeciwciała, jego oczyszczenia i użycia można znaleźć przykładowo w rozdziale 2 Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology (John Willey & Sons NY, 1991-1994) i Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, które są oba włączone tu przez cytowanie.
Ogólnie, przeciwciała według wynalazku wiążą się z, lub koniugują z białkiem fuzyjnym lub białkiem fuzyjnym według wynalazku. Przykładowo, przeciwciała mogą obejmować przeciwciała poliklonalne, takie przeciwciała mogą być przygotowane przykładowo przez wstrzyknięcie wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzających je zwierząt, które mogą obejmować myszy lub króliki, dla otrzymania surowicy poliklonalnej. Przykładowe protokoły, które mogą być użyte są opisane przykładowo w CoIigan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej i w Harlow & Lane 1988, powyżej. W miejsce poliklonalnej surowicy odpornościowej uzyskanej w produkujących gatunkach, wyprodukowane mogą być przeciwciała monoklonalne przy pomocy typowego sposobu jaki przykładowo opisano w artykule Kohler i Milstein, 1975, Nature 256, 495, który jest włączony tu przez cytowanie lub przez bardziej współczesne ich modyfikacje jak przykładowo opisano w Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej, przez immunizowanie komórek śledziony lub innych komórek wytwarzających przeciwciało, pochodzących z gatunków wytwarzających przeciwciała, które zaszczepiono jednym lub większą liczbą wyizolowanych białek lub białek fuzyjnych według wynalazku.
Wynalazek może obejmować również swoim zakresem przeciwciała zawierające fragmenty Fc lub Fab poliklonalnego lub monoklonalnych przeciwciał, które określono powyżej. Alternatywnie, przeciwciała mogą zawierać pojedynczy łańcuch przeciwciał Fv (scFvs) przeciw peptydom według wynalazku. Takie scFvs mogą być przygotowane przykładowo zgodnie ze sposobami opisanymi odpowiednio w patencie US nr 5,091,513, patencie europejskim nr 239,400 lub w artykule Winter i Milstein, 1991, Nature 349 293, które są włączone tu przez cytowanie.
Przeciwciała według wynalazku mogą być użyte dla powinowactwa przy izolowaniu naturalnych lub zrekombinowanych polipeptydów N. meningitidis.
Przykładowo, odniesienie może być uczynione do procedur chromatografii immunopowinowactwa opisanych w rozdziale 9.5 Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej.
PL 216 780 B1
Przeciwciała mogą być użyte do:
(vi) przeszukiwania bibliotek ekspresyjnych dla identyfikacji wariantów polipeptydów według wynalazku;
(vii) identyfikacji reaktywnych immunologicznie fragmentów lub reaktywnych immunologicznie epitopów; i/lub (viii) wykrywania zarażenia N. meningitidis, jak będzie opisane poniżej, lecz bez ograniczenia do tych szczególnych zastosowań.
Wykrywanie N. meningitidis.
Obecność, lub brak N. meningitidis u osobnika może być określone przez izolowanie próbki biologicznej od wspomnianego osobnika, mieszanie przeciwciała lub opisanego powyżej fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną i wykrycia specyficznego wiązania przeciwciała, lub fragmentu przeciwciała, co wskazuje na obecność N. meningitidis w próbce.
Termin „próbka biologiczna w użytym tu znaczeniu określa próbki, które mogą być wyekstrahowane, nie poddane obróbce, poddane obróbce, rozcieńczone lub zatężone, pochodzące od osobnika takiego jak pacjent. Dogodnie, próbka biologiczna jest wybrana z grupy obejmującej pełną krew, surowicę, plazmę, ślinę, mocz, pot, płyn wysiękowy, płyn otrzewnowy, płyn maziówkowy, płyn omoczniowy, płyn rdzeniowo-mózgowy, bioptaty skóry i im podobne.
Użyty może być jakikolwiek dogodny sposób dla określenia tworzenia kompleksu. Przykładowo, przeciwciało lub fragment przeciwciała zgodnie z wynalazkiem posiadający związany z nim znacznik, może być użyty w oznaczeniach immunologicznych. Takie oznaczenia immunologiczne mogą obejmować, lecz nie są ograniczone do radioimmuno oznaczeń (RIA), enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) i technik immunochromatograficznych (ICT), które są dobrze znane znawcom.
Przykładowo, odniesienie może być uczynione do Rozdziału 7 z Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej, ujawniającego różnorodne oznaczenia immunologiczne, które mogą być użyte zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Oznaczenia immunologiczne mogą obejmować oznaczenia kompetycyjne jak jest pojmowane w dziedzinie.
Znacznik związany z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała może obejmować poniższe:
(A) bezpośrednie przyłączenie znacznika do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała;
(B) pośrednie przyłączenie znacznika do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała; tj. przyłączenie znacznika do innego odczynnika w oznaczeniu, który z kolei wiąże przeciwciało lub fragment przeciwciała; i (C) przyłączenie do kolejnego produktu reakcji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała.
Znacznik może być wybrany z grupy obejmującej chromogen, katalizator, enzym, fluorofor, cząsteczkę chemiluminescencyjną, jon Iantanowca takiego jak europ (Eu34), izotop promieniotwórczy i bezpośrednio widoczny znacznik. W przypadku bezpośrednio widocznego znacznika użyty może być metal koloidalny lub cząsteczka nie będąca metalem, cząsteczka barwnika, enzym lub substrat, polimer organiczny, cząsteczka lateksu, Iiposom lub inny nośnik zawierające substancję wytwarzającą sygnał i jemu podobne.
Znaczną ilość enzymów użytecznych jako znaczniki ujawniono w opisach patentowych US 4,366,241, US 4,843,000 i US 4,849,338, z których wszystkie są włączone tu przez cytowanie. Znaczniki enzymatyczne użyteczne w obecnym wynalazku obejmują alkaliczną fosfatazę, peroksydazę chrzanową, lucyferazę, β-galaktozydazę, oksydazę glukozy, lizozym, dehydrogenazę jabłczanową i im podobne. Znacznik enzymatyczny może być użyty sam lub w połączeniu z drugim enzymem w roztworze.
Dogodnie, fluorofor jest wybrany z grupy obejmującej rodanek fluoresceiny (FITC), rodanek tetrametylorodaminy (TRITL) lub R-fikoerytrynę (RPE).
Wynalazek obejmuje również sposób wykrywania infekcji N. meningitidis u pacjentów, wspomniany sposób obejmuje etapy kontaktowania próbki biologicznej z pacjenta z białkiem albo białkiem fuzyjnym według wynalazku i określenia występowania lub braku kompleksu pomiędzy wspomnianym białkiem albo białkami fuzyjnymi N. meningitidis specyficznymi przeciwciałami we wspomnianej surowicy, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na wspomnianą infekcję.
W korzystnej postaci wykrycie powyższego kompleksu jest osiągnięte przez wykrycie modyfikacji wspomnianego białka albo białka fuzyjnego dogodnym znacznikiem, który jest dobrze znany w dziedzinie i użycie takiego zmodyfikowanego związku w oznaczeniu immunologicznym jakie opisano powyżej.
PL 216 780 B1
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywania bakterii N. meningitidis w próbce biologicznej podejrzanej o zawieranie tej bakterii, wspomniany sposób obejmuje etapy wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem we wspomnianej próbce co wskazuje na obecność tej bakterii. Wykrycie wspomnianej sekwencji kwasu nukleinowego może być określone przy pomocy jakiegokolwiek dogodnego sposobu. Przykładowo, wyznakowany kwas nukleinowy zgodny z wynalazkiem może być użyty jako sonda w doświadczeniu Southern blot z kwasem nukleinowym otrzymanym od pacjenta, co jest dobrze znane w dziedzinie.
Alternatywnie, wyznakowany kwas nukleinowy według wynalazku może być wykorzystany jako sonda w doświadczeniu typu Northern blot z RNA otrzymanym od pacjenta. Korzystnie, otrzymany od pacjenta ekstrakt kwasu nukleinowego jest wykorzystany wraz ze starterami oligonukleotydowymi odpowiadającymi sensownej i antysensownej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku, lub sekwencji go otaczającej w reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego takiej jak PCR lub reakcji łańcuchowej Iigazy (LCR), co przykładowo opisano w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 89/09385, które jest włączone tu przez cytowanie.
Odpowiednie są również różnorodne zautomatyzowane techniki wykrywania na fazie stałej. Przykładowo, wielkoskalowe uporządkowania unieruchomionego startera (VLSIPS™) są użyte dla wykrywania kwasów nukleinowych jak to przykładowo opisali Fodor i wsp., 1991; Science 251 767 i Kazal i wsp., 1996, Nature Medicine 2 753. Powyższe ogólne sposoby są dobrze znane znawcom.
Kompozycje farmaceutyczne.
Dalszą cechą wynalazku jest użycie białka albo białka fuzyjnego, według wynalazku („czynniki immunogeniczne) jako czynników aktywnych w kompozycji farmaceutycznej dla ochrony pacjenta przed infekcją N. meningitidis.
Dogodnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbkę.
Przez „farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbka rozumiany jest stały lub płynny wypełniacz, rozpuszczalnik lub substancja zamykająca, która może być bezpiecznie użyta w podaniu ogólnoustrojowym. Zależnie od szczególnej drogi podania użyte mogą być różnorodne dobrze znane w dziedzinie nośniki. Nośniki te mogą być wybrane z grupy obejmującej cukry, skrobię, celulozę i jej pochodne, słód, żelatynę, talk, siarczan wapnia, oleje roślinne, oleje syntetyczne, poliole, kwas alginowy, roztwory buforowane fosforanami, emulgatory, izotoniczne roztwory soli fizjologicznej i sole takie jak sole kwasów nieorganicznych obejmujących chlorowodorki, bromki, siarczany, sole kwasów organicznych takich jak octany, propioniany i jabłczany i woda wolna od pirogenów.
Użytecznym odniesieniem literaturowym opisującym farmaceutycznie akceptowalne nośniki, rozpuszczalniki i wypełniacze jest Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. NJ. USA, 1991), która jest włączona tu przez cytowanie.
Jakakolwiek droga podania może być użyta dla dostarczenia pacjentowi kompozycji według wynalazku. Przykładowo, doustna, doodbytnicza, pozajelitowa, podjęzykowa, dopoliczkowa, donaczyniowa, dochrząstkowa, domięśniowa, doskórna, podskórna, przez inhalację, do gałki ocznej, dootrzewnowa, do płynu rdzeniowo-mózgowego, przezskórna i im podobne. Domięśniowy lub podskórny zastrzyk jest przykładowo odpowiedni dla podania immunogenicznych kompozycji, szczepionek i DNA szczepionek.
Postacie dawkowania obejmują tabletki, dyspersje, zawiesiny, zastrzyki, roztwory, syropy, pastylki, kapsułki, czopki, aerozole, plastry przezskórne i temu podobne. Te postaci dawki mogą również obejmować wstrzyki walne lub wszczepialne urządzenia kontrolujące uwalnianie za-projektowane specyficznie dla tego celu, lub inne postaci wszczepów zmienione, aby dodatkowo działały w ten sposób. Kontrolowane uwalnianie czynnika leczniczego może być spowodowane przez jego powlekanie, przykładowo hydrofobowymi polimerami obejmującymi żywice akrylowe, woski, wysoko alifatyczne alkohole, polimleczany i poli(kwasy glikolowe) i określone pochodne celulozy, takie jak hydroksypropylometyloceluloza. Ponadto, kontrolowane uwalnianie może być uzyskane przez zastosowanie innych matryc polimerowych, liposomów i/lub mikrokapsułek.
Kompozycje farmaceutyczne według obecnego wynalazku dla podania doustnego lub pozajelitowego mogą występować jako oddzielne jednostki takie jak kapsułki, saszetki lub tabletki, z których każda zawiera wcześniej określoną ilość jednego lub większej liczby czynników według wynalazku, w postaci proszku lub granulek, lub jako roztwór lub zawiesina w wodnym roztworze, niewodny roztwór, lub emulsja oleju w wodzie, lub emulsja wody w oleju. Takie kompozycje mogą być przygotowane każdym farmaceutycznym sposobem, lecz każdy ze sposobów obejmuje etap połączenia ze sobą
PL 216 780 B1 jednego lub więcej czynników jakie opisano powyżej z czynnikiem stanowiącym jeden lub więcej niezbędnych składników. Ogólnie, kompozycje są przygotowane przez jednorodne i dokładne mieszanie czynników immunogenicznych według wynalazku z płynnymi nośnikami, lub dokładnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub obydwoma i następnie, jeśli jest to niezbędne, kształtowanie produktu do pożądanej postaci.
Powyższe kompozycje mogą być podane w sposób zgodny z postacią dawkowania i w takiej ilości jaka jest immunogenicznie skuteczna dla ochrony pacjentów przed zarażeniem N. meningitidis. Dawka podana pacjentowi w kontekście niniejszego wynalazku powinna być wystarczająca dla spowodowania u pacjenta korzystnej odpowiedzi przez pewien czas, takiej jak zmniejszenie poziomu N. meningitidis lub zahamowanie infekcji spowodowanej przez N. meningitidis. Ilości czynnika(ów) immunogenicznych, które będą podane mogą zależeć od leczonego podmiotu w tym od wieku, płci, wagi i jego ogólnego stanu zdrowia. Zgodnie z tym dokładne ilości immunogenicznego czynnika(ów) wymaganych dla podania będą zależały od osądu lekarza.
W określaniu skutecznej ilości czynnika immunogenicznego podanego w leczeniu lub profilaktyce przeciw N. meningitidis lekarz może oceniać poziom w osoczu w układzie krążenia postęp choroby i wytwarzanie przeciwciał przeciw N. meningitidis. W każdym przypadku dogodne dawki czynników immunogenicznych według wynalazku mogą być łatwo określone przez znawcę. Takie dawki mogą być w zakresie nanogramów lub miligramów czynników immunogenicznych według wynalazku.
Powyższe kompozycje mogą być użyte jako szczepionki terapeutyczne lub profilaktyczne. Zgodnie z tym, wynalazek rozciąga się na wytwarzanie szczepionek zawierających jako czynnik aktywny jeden lub więcej czynników immunogenicznych według wynalazku. Różnorodne, możliwe do zastosowania procedury są rozważane dla wytworzenia takich szczepionek. Przykładowe procedury obejmują przykładowo opisane w New Generation Vaccines (1997, Levine i wsp., Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, Bazylea, Hong Kong), które jest włączone tu przez cytowanie.
Czynnik immunogeniczny według wynalazku może być zmieszany, skoniugowany lub połączony z innymi antygenami obejmującymi epitopy komórki B lub T lub inne antygeny. Ponadto, może być skoniugowany z nośnikiem jak opisano poniżej.
Gdy użyte jest będące haptenem białko według wynalazku (tj. peptyd reagujący z rozpoznanymi przeciwciałami, lecz same nie mogą wywołać odpowiedzi immunologicznej), może być skoniugowany z immunogenicznym nośnikiem. Użyteczne nośniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują przykładowo: tyroglobulinę; albuminy takie jak albumina ludzkiej surowicy; toksyny, toksoidy lub jakikolwiek zmutowany materiał reagujący krzyżowo (CRM), toksyny z tężca, błonicy, płonicy, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus i Streptococcus, kwasy poliaminowe takie jak kwas poli(lizyna:kwas glutaminowy); grypa; rotawirus VP6, parwowirus VP1 i VP2; białko rdzenia wirusa żółtaczki typu B; zrekombinowana szczepionka przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B i im podobne. Alternatywnie, fragmenty lub epitopy nośnikowego białka lub innego białka immunogenicznego mogą być użyte. Przykładowo, haptogenowe białko według wynalazku może być związane epitopem komórki T toksyny bakteryjnej, toksoidu, lub CRN. Zgodnie z tym, odniesienie może być uczynione do patentu USA nr 5,785,973, który jest włączony tu przez cytowanie.
Ponadto, białko lub białko fuzyjne według wynalazku może działać jako nośnik białkowy w kompozycji szczepionki skierowanej przeciw Neisseria lub przeciw innej bakterii lub wirusowi.
Czynniki immunogeniczne według wynalazku mogą być podane jako wielowartościowa podjednostka szczepionek w połączeniu z antygenem N. meningitidis, lub antygenami innych organizmów obejmujących patogeniczną bakterię H. influenzae, N. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae itp.. Alternatywnie, lub dodatkowo mogą być one podane wraz z oligosacharydami lub polisacharydowymi składnikami N. meningitidis.
Szczepionki mogą również zawierać farmakologicznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub wypełniacz jaki tu określono.
Szczepionki i kompozycje immunogeniczne mogą zawierać adjuwant jaki jest dobrze znany w dziedzinie. Adjuwanty rozważane przez obecne doświadczenie obejmują, lecz nie są ograniczone do substancji powierzchniowo czynnych, takich jak heksadecyloamina, oktadecyloamina, estry kwasu oktadecyloaminowego, lizolecytyna, bromek dimetylodioktadecyloamonowy, N,N-dikoktadecylo-N',N'bis(2-hydroksyetylopropanodiamina), metoksyheksadecyloglicerol i poliole pluronowe; poliaminy takie jak piran, siarczan dekstranu, poi i IC karbopol; peptydy takie jak dipeptyd muramylu i pochodne, dimetyloglicyna, tuftsyna; emulsje olejowe; żele mineralne takie jak fosforan glinu, wodorotlenek glinu lub alum; limfokiny, QuiIA i kompleks immunopobudzający (ISCOMS).
PL 216 780 B1
Wobec przykładowych adjuwantów uczynione jest również odniesienie literaturowe do publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonej tu poprzez cytowanie.
Szczepienie przez dostarczenie DNA.
Konstrukty ekspresyjne zawierające zmodyfikowane białko NhhA według wynalazku mogą być podane ludziom dla profilaktyki i/lub leczenia. Zgodnie z tym konstrukty ekspresyjne mogą kodować jeden lub więcej zmodyfikowanych polipeptydów NhhA, wyizolowanych białek i białek fuzyjnych, ogólnie określonych jako „czynniki immunogeniczne.
Konstrukty ekspresyjne obejmują również konstrukty do terapii genowej, wykorzystujące wyspecjalizowane wektory dla terapii genowej takie jak krowianka i wektory wirusowe użyteczne w terapii genowej. Te ostatnie obejmują adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusowi (AAV) takie jak opisano w Fraceshii i wsp., 2000, J. Cell Biochem. 76 476, Braun-Falco i wsp., 1999, Gene Ther. 6 432, wektory retrowirusowe i Iantiwirusowe jakie opisano w Buchshacher i wsp., 2000, Blood 95 2499 i wektory pochodzące od wirusa opryszczki i cytomegalowirusa. Ogólny przegląd wektorów dla terapii genowej i sposobu dostarczenia można znaleźć w Robbis i wsp., 1998, Trends in Biotech. 16 35. Przykładową pracą opisującą szereg wektorów potencjalnie użytecznych dla terapii genowej wykorzystują białka Neisseria i sposoby dostarczenia z publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonego tu przez cytowanie.
Immunogeniczne czynniki według wynalazku mogą być wyrażone przez attenuowane wirusy gospodarzy. Przez „atenuowane wirusy gospodarzy rozumie się wektory wirusowe, które są zarówno naturalne lub, które uczyniono zasadniczo awirulentnymi. Wirusy mogą być uczynione zasadniczo awirulentnymi w jakimkolwiek dogodnym, fizycznym (np. działanie temperaturą) lub chemicznym znaczeniu (np. działanie formaldehydem). Przez „zasadniczo awirulentny rozumie się wirus, którego infektywność zniszczono. Idealnie, infektywność wirusa jest zniszczona bez wpływania na białko warunkujące immunogeniczność wirusa. Z powyższego powinno być dostrzeżone, że attenuowani wirusowi gospodarze mogą zawierać żywe wirusy lub inaktywowane wirusy.
Atenuowani gospodarze wirusowi, którzy mogą być użyteczni w szczepionce zgodnej z wynalazkiem mogą zawierać wektory wirusowe obejmujące adenowirusy, cytomegaIowirusy i korzystnie poksywirusy jako szczepionkę (patrz przykładowo Paoletti i Panicali, patent US nr 4,603,112, który jest włączony tu przez cytowanie) i atenuowane szczepy Salmonella (patrz przykładowo Stocker patent US nr 4,550,081, który jest włączony tu przez cytowanie). Żywe szczepionki są szczególnie korzystne ponieważ powodują one przedłużone pobudzenie, które może ustanawiać zasadniczo długotrwałą odpowiedź immunologiczną. Inne cytowania opisujące różnorodne wektory wirusowe potencjalnie użyteczne dla immunizacji białkami Neisseria i sposoby dostarczenia są zawarte w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonej tu przez cytowanie.
Wielowartościowe szczepionki mogą być przygotowane z jednego lub większej liczby mikroorganizmów wyrażających różne epitopy N. meningitidis (np. inne niż białka powierzchniowe lub epitopy N. meningitidis). Ponadto, epitopy innych patogenicznych mikroorganizmów mogą być włączone do szczepionki.
W korzystnej postaci będzie to wymagało konstrukcji zrekombinowanej szczepionki wirusowej dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku. Po wprowadzeniu do gospodarza zrekombinowana szczepionka wirusowa wyraża czynnik immunogeniczny i co za tym idzie wywołuje u gospodarza odpowiedź CTL. Przykładowo, odniesienie literaturowe może być uczynione do patentu US nr 4,722,848, włączony tu przez cytowanie, opisujący wektory szczepionki i sposoby użycia ich w protokołach immunizacji.
Szeroka różnorodność innych wektorów użytecznych dla terapeutycznego podania lub immunizacji czynnikami immunogennymi według wynalazku stanie się oczywista dla znawców na podstawie obecnego wynalazku.
W kolejnej postaci sekwencja nukleotydowa może być użyta jako szczepionka w postaci szczepionki z „nagiego DNA co jest znane w dziedzinie. Przykładowo, wektor ekspresyjny według wynalazku może być wprowadzony do ssaka, gdzie powoduje wytwarzanie polipeptydu in vivo, przeciw któremu gospodarz wytwarza odpowiedź immunologiczną, jak to przykładowo opisano w Barry, M. i wsp. (1995, Nature, 377: 632-635), który jest włączony tu przez cytowanie.
PL 216 780 B1
Zestawy do wykrywania.
Obecny wynalazek może być również wykorzystany w zestawach do wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej. Będą one zawierały jeden lub więcej szczególnych czynników opisanych powyżej zależnie od charakteru użytego w teście sposobu. Zgodnie z tym, zestaw może zawierać jedno lub więcej wyizolowane białko, białko fuzyjne, przeciwciało, fragment przeciwciała lub kwas nukleinowy według wynalazku. Zestawy mogą również warunkowo zawierać odpowiednie odczynniki dla wykrywania znaczników, pozytywne i negatywne kontrole, roztwory dla płukania, bufory dla rozcieńczania i im podobne. Przykładowo, zestaw dla wykrywania oparty na kwasie nukleinowym może zawierać (i) kwas nukleinowy według wynalazku (który może być użyty jako pozytywna kontrola), (ii) starter oligonukleotydowy według wynalazku i warunkowo DNA polimerazę, DNA ligazę itd. zależnie od zastosowanego sposobu amplifikowania kwasu nukleinowego.
Przygotowanie fragmentów immunoreaktywnych.
Wynalazek może być również wykorzystany w sposobie identyfikowania immunoreaktywnego wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku. Sposób ten zasadniczo obejmuje wytworzenie fragmentu wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego, podanie fragmentu ssakowi; i wykrycie u ssaka odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedź taka będzie obejmowała wytworzenie składników, które specyficznie wiążą N. meningitidis i/lub wspomniane białko lub białko fuzyjne i/lub efekt ochronny przeciw infekcji N. meningitidis.
Przed testowaniem szczególnego fragmentu z uwagi na immunoreaktywność w powyższym sposobie, różnorodne sposoby przewidywania mogą być użyte dla wydedukowania czy szczególny fragment może być użyty dla uzyskania przeciwciała reagującego krzyżowo z naturalnym antygenem.
Te sposoby przewidywania mogą być oparte na sekwencji aminokońcowej lub karboksykońcowej jak przykładowo opisano w rozdziale 11.14 Ausubel i wsp., powyżej. Alternatywnie, te sposoby przewidywania mogą być oparte na przewidywaniu hydrofilowości jak przykładowo opisano przez Kyte i Doolitle 1982, J. Mol. Biol. 157 105 i Hopp i Woods, 1983, Mol. Immunol. 20 483), które są włączone przez cytowanie lub przewidywanie struktury drugorzędowej, jak przykładowo opisali Choo i Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 251), które są włączone tu przez cytowanie.
Dodatkowo, „mapowanie epitopu przy pomocy przeciwciał monoklonalnych według wynalazku przez identyfikację krzyżowo reagujących epitopów przez najpierw testowanie ich zdolności do dostarczenia krzyżowej ochrony, a następnie przez identyfikację epitopu rozpoznanego przez wspomniane przeciwciała. Przykładowy sposób jest opisany przez Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej.
Ogólnie, fragmenty peptydów zawierające 10 do 15 aminokwasów dają optymalne wyniki. Polipeptydy tak małe jak 6 lub tak duże jak 20 aminokwasów działają z powodzeniem. Takie fragmenty peptydowe mogą następnie być związane chemicznie z cząsteczką nośnika taką jak chemocyjanina z czareczki (KLH) lub albumina z surowicy bydlęcej (BSA) jak przykładowo opisano w rozdziałach 11.14 i 11.15 Ausubel i wsp., powyżej).
Powinno być również docenione, że peptydy mogą być sztucznie cyrkularyzowane jak to opisano w Hoogerhout i wsp., 1995, Infect. Immun. 63 3473, która jest włączona tu przez cytowanie.
Peptyd może być użyty dla immunizacji zwierzęcia jak przykładowo opisano powyżej. Miana przeciwciała przeciw naturalnemu lub rodzicielskiemu polipeptydowi, z którego wyselekcjonowano peptyd może następnie być oznaczone przykładowo oznaczeniem radioimmunologicznym lub przez ELISA, jak to przykładowo opisano w rozdziałach 11.16 i 114 Ausubel i wsp., powyżej.
Przeciwciała mogą następnie być oczyszczone z odpowiedniego płynu biologicznego zwierzęcia przez frakcjonowanie siarczanem amonu lub przez chromatografię, co jest dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe protokoły dla oczyszczania przeciwciała podano w rozdziałach 10.11 i 11.13 Ausubel i wsp., powyżej, które włączono tu przez cytowanie.
Reaktywność immunologiczna przeciwciała przeciw naturalnemu lub rodzicielskiemu polipeptydowi może być określona jakąkolwiek odpowiednią procedurą, taką jak przykładowo Western blot.
Funkcjonalne związki blokujące.
Dzikiego typu polipeptydy NhhA/HiaNm ujawnione w WO 99/31132 mają przypuszczalnie właściwości adhezyny. W rzeczywistości wykazują one pewne podobieństwo do adhezyn Haemophilus influenzae będących antygenami powierzchniowymi. Dokładniej są one w przybliżeniu w 67% homologiczne do białka Hia z H. influenzae (Barenkamp i St. Geme III, 1996, Molecular Microbiology 19 1215) i 74% homologii do białka HSF z H. Influenzae (ST. Gene III, J. i wsp., 1996, Journal of Bacteriology 178 6281 i Patent US nr 5,646, 259). W tych porównaniach wartość luki wynosi 3 i długości
PL 216 780 B1
0,01 dla użytego programu GAP (Deveraux, 1984, powyżej). Tak więc zaburzenie funkcji tych polipeptydów będzie znacząco terapeutycznie korzystne, ponieważ będą one zapobiegały wiązaniu się bakterii N. meningitidis z zarażanymi komórkami. Zaburzenie funkcji można osiągnąć różnymi sposobami.
Przykładowo podane mogą być cząsteczki takie jak odczynniki chemiczne lub polipeptydy blokujące receptory na powierzchni komórki. Konkurują one z infektywnym organizmem o miejsca na receptorze. Takie cząsteczki mogą przykładowo obejmować białka według wynalazku, szczególnie fragmenty lub jego funkcjonalne równoważniki jak również mimetyki.
Termin „mimetyki jest użyty tu dla określenia chemikaliów zaprojektowanych aby przypominały szczególne, funkcjonalne obszary białek lub peptydów. Użyte mogą być również antyidiotypowe przeciwciała rozwinięte przeciw wyżej opisanym przeciwciałom blokującym wiązanie bakterii do powierzchni komórki. Alternatywnie, cząsteczki które oddziałują z miejscami wiązania receptora w polipeptydach według wynalazku mogą skutecznie zapobiegać infekcji komórki przez N. meningitidis. Cząsteczki takie mogą zawierać blokujące przeciwciała, peptydy lub inne odczynniki chemiczne.
Wszystkie takie cząsteczki, kompozycje farmaceutyczne, w których są one połączone z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i sposoby leczenia pacjentów dotkniętych infekcją N. meningitidis przez podanie takich cząsteczek lub kompozycji mogą być wykorzystane zgodnie z wynalazkiem.
Polipeptydy według wynalazku mogą być użyte dla wyszukiwania związków celem ich użycia w powyższych sposobach. Przykładowo, polipeptydy według wynalazku mogą być połączone ze znacznikiem i prezentowane w hodowli komórkowej w obecności testowanego odczynnika. Następnie może być obserwowana zdolność odczynnika do hamowania wiązania wyznakowanego polipeptydu do powierzchni komórki. W takim wyszukiwaniu użyte mogą być wyznakowane polipeptydy na organizmie takim jak E. coli. Alternatywnie, sama N. meningitidis może być przebudowana do wyrażania zmodyfikowanej i wykrywalnej postaci polipeptydu. Użycie przebudowanych szczepów N. meningitidis jest preferowane, bowiem jest bardziej prawdopodobne, że trzeciorzędowa struktura białka będzie bardziej przypominała to, które ulega ekspresji w bakterii typu dzikiego.
Aby wynalazek mógł być lepiej zrozumiany i zastosowany praktycznie, obecnie opisane będą szczególnie korzystne postaci przez poniższe nieograniczające przykłady.
P r z y k ł a d 1
Identyfikacja stałych i zmiennych obszarów polipeptydów NhhA
Wynalazek wyznacza sekwencje aminokwasowe NhhA, które są konserwatywne i/lub niekonserwatywne pomiędzy dziesięcioma (10) szczepami N. meningitidis. Niekonserwatywne obszary są dalej podzielone na cztery obszary zmienne (V1, V2, V3 i V4) i obszary konserwatywne są dalej podzielone na C1, C2, C3, C4 i C5 (jak przedstawiono na Fig. 1 i w Tabeli 1; SEQ ID NO:1-11). Porównanie odpowiedniej sekwencji nukleotydowej jest przedstawione na Fig. 2 (SEQ ID NO:12-22).
P r z y k ł a d 2
Nadekspresja polipeptydu NhhA w PMC 21.
Białko NhhA kodowane przez gen nhhA N. meningitidis szczepu PMC 21 ulegało nadekspresji przez przygotowanie konstruktu ekspresyjnego, w którym gen nhhA jest połączony funkcjonalnie z promotorem.
Poniższe startery oligonukleotydowe użyto dla amplifikacji przez PCR sekwencji otwartej ramki odczytu dla nhhA szczepu PMC 21 N. meningitidis:
- HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40); zawierająca miejsce restrykcyjne dla EagI (podkreślona) i sekwencję kodującą pierwsze 7 (siedem) aminokwasów NhhA (pogrubione),
- ΗΟΜΡ3ΆΝ 5'-TGG AAT CCATGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41); zawierająca miejsce restrykcyjne dla NcoI (podkreślona) i odwróconą, komplementarną sekwencję 48-61 nukleotydów za końcem otwartej ramki odczytu nhhA szczepu φ3 (pogrubione).
Produkt amplifikacji zawiera miejsca restrykcyjne, które są następnie strawione endonukleazami restrykcyjnymi EagI i NcoI.
Plazmidem dla subklonowania był pCO14K zawierający promotor porA, powyżej genu kodującego ulegające silnej ekspresji białko Klasy 1 z zewnętrznej błony N. meningitidis wraz z otaczającą sekwencją szczepu 2996 N. meningitidis i selekcyjnego genu oporności na kanamycynę co opisali Rouppe van der Voort i wsp., Infect. Immun. 1996 64 2745.
PL 216 780 B1
Strawiony produkt amplifikacji następnie wbudowano przy pomocy Iigazy do strawionego endonukleazami restrykcyjnymi EagI i NcoI pCO14K. Reakcja Iigazy doprowadziła do zastąpienia głównej otwartej ramki odczytu porA produktem amplifikacji nhhA (Fig. 3). Stwarza to konstrukt dla rekombinacyjnej ekspresji kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na SEQ ID NO:12) kodujący polipeptyd o 591 aminokwasach przedstawiony na SEQ ID NO:1.
To powoduje, że ekspresja kwasu nukleinowego dla nhhA według wynalazku znajduje się pod kontrolą silnego promotora porA. Translacja rozpoczyna się od kodonu ATG w pozycji 31 HOMP5'. Dla zapobieżenia tworzeniu fuzji pomiędzy porA i nhhA sekwencja HOMP5' zawiera kodon stop TAA przed opisanym powyżej kodonem inicjacji translacji ATG.
Otrzymany plazmid pIP52(PMC21) Iinearyzowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i użyto dla transformacji N. meningitidis szczepu G2 przy pomocy sposobu opisanego przez Janik i wsp., 1976, Journal of Clinical Microbiology 4 71. Transformanty selekcjonowano przez całonocną inkubację w 37°C w 5% CO2 na podłożu stałym zawierającym 100 μg/ml kanamycyny. Selekcjonowano kolonie odporne na kanamycynę, które subhodowano przez noc i sprawdzano pod względem nadekspresji polipeptydu NhhA przez rozdział elektroforetyczny całkowitych białek komórkowych przez SDS-PAGE w 10% żelu, a następnie przeniesienie na filtr nitrocelulozowy przy pomocy Semi-Dry Blotter (BioRad). Filtr następnie inkubowano kolejno z króliczą surowicą anty-NhhA (jak opisano w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 99/31132) i skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przeciwciało przeciw króliczemu IgG (Sigma) przed kolorymetrycznym wykryciem przy pomocy NBT/BCIP (Sigma). Wyizolowano jeden klon wyrażający z dużą wydajnością polipeptyd NhhA w porównaniu ze szczepem rodzicielskim (Fig. 11). Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programu eGCG dostępnego w www.angis.org.au) wskazuje, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte wytwarzając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:33).
Konstrukt plazmidu pIP52(PMC21) może być wprowadzony przez transformację do jakiegokolwiek kompetentnego pod względem transformacji szczepu N. meningitidis.
P r z y k ł a d 3
Nadekspresja polipeptydu NhhA w H41.
Białko NhhA kodowane przez gen nhhA szczepu H41 N. meningitidis ulegało nadekspresji przy pomocy tego samego sposobu jaki opisano w Przykładzie 2. Dla stworzenia zrekombinowanego kwasu nukleinowego będącego konstruktem ekspresyjnym (otwarta ramka odczytu przedstawiona na SEQ ID NO:13) kodującego polipeptyd o 591 aminokwasach, przedstawiony na SEQ ID NO:2. W przykładzie tym otrzymany plazmid pIP52(H41) Iinearyzowano i transformowano do N. meningitidis szczepu 7G2. Kolonie odporne na kanamycynę analizowano i wybrano jedną, która w badaniu immunologicznym Western blot ujawniła nadekspresję NhhA (Fig. 11). Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu oprogramowania eGCG dostępnego w www.anais.orq.au) wykazała, że 51 aminokwasów po odcięciu generuje dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:34).
Strategia ta może być zastosowana dla stworzenia konstruktów ekspresyjnych, zawierających dzikiego typu sekwencję nhhA z innych szczepów N. meningitidis.
P r z y k ł a d 4
Konstrukcja mutantów delecyjnych przy pomocy dogodnego miejsca restrykcyjnego.
Dla łatwości cytowania sekwencję aminokwasowa polipeptydu NhhA kodowanego przez kwas nukleinowy nhhA szczepu PMC21 przedstawiono na SEQ ID NO:1, stworzono wersję delecyjnej mutacji dzikiego typu nhhA z PMC21, w którym usunięty był najbardziej zmienny w szczepach obszar. Produkt amplifikacji kodujący aminokwasy 1-54 polipeptydu NhhA z PMC21 typu dzikiego wytworzono przez amplifikację PCR na matrycy kwasu nukleinowego nhhA przy pomocy poniższych starterów:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia nadeksprymującego konstruktu pIP52.
NHB'BG: 5'-GGT CAGATCTGT TTC ATT GTT AGC ACT TGC-3' (SEQ ID NO:42) zawierająca miejsce restrykcyjne dla BgIII (pokreślona) i odwróconą komplementarną sekwencję kodująca aminokwasy 134, (podwójnie podkreślone) i 49-54 dzikiego typu PMC21 NhhA (pogrubione).
Otrzymany produkt amplifikacji obejmuje miejsca dla endonukleazy restrykcyjnej EagI i BgIII. pIP52(PMC21) obejmuje jedno miejsce EagI 20 par zasad powyżej miejsca inicjacji otwartej ramki odczytu (ORF) nhhA i pojedynczego miejsca BgIII umiejscowionego w ORF (patrz Fig. 3B). Tak więc,
PL 216 780 B1 pIP52(PMC21) i produkt amplifikacji były poddane trawieniu endonukleazą restrykcyjną EagI i BgIII, łączone przy pomocy Iigazy i użyte dla transformacji kompetentnego szczepu bakterii E. coli DH5a; w ten sposób zastąpiono fragment Eagl/Bglll plazmidu pIP52(PMC21) produktem PCR. Daje to ekspresyjny konstrukt zrekombinowanego kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na Fig. 5; SEQ ID NO:28) kodujący polipeptyd o 512 aminokwasach, przedstawiony na Fig. 5 (SEQ ID NO:23). Ta sekwencja aminokwasowa obejmuje aminokwasy 1-54 i 134-592 sekwencji typu dzikiego, co za tym idzie, z usuniętą większą częścią obszaru V1, całymi obszarami V2 i C2, i częścią obszaru C3 z dzikiego typu polipeptydu NhhA z PMC21.
Plazmid Iinearyzowano przez trawienie restrykcyjne i wprowadzono przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów jakie opisano w Przykładzie 1 wyizolowano jeden klon wykazujący nadekspresję skróconego NhhA z PMC21 (Fig. 11).
Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego
SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego w www.anais.org.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzałe białko (Fig. 14; SEQ ID NO:35). Dla potwierdzenia występowania sekwencji sygnałowej, która może być przecięta i potwierdzenia identyczności ulegającego nadekspresji białka, częściowo oczyszczono zewnętrzne błony białka przez izolowanie frakcji nierozpuszczalnej w detergencie sarkozylu.
Wyizolowane białka błonowe rozdzielono elektroforetycznie przed przeniesieniem na filtr Nylon. Lokalizację białka ulegającego nadekspresji ujawniono przez barwienie Coomassie. Ten obszar filtru wycięto i określono sekwencję nukleotydową N-końca. Pierwsze jedenaście aminokwasów białka było jak następuje XXETDLTSVGT, co odpowiada aminokwasom 52-62 (włącznie) sekwencji aminokwasowej wydedukowanej, że będzie ulegała ekspresji z konstruktu ekspresyjnego określonego w tym przykładzie.
Jest to przykład uzyskania delecji z wykorzystaniem istniejących w sekwencji polinukleotydowej miejsc restrykcyjnych. Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek, zdolnej do transformacji N. meningitidis.
P r z y k ł a d 5
Konstrukcja mutanta NhhA z delecją przy pomocy dogodnego miejsca restrykcyjnego.
Konstrukt ekspresyjny zawierający dzikiego typu sekwencję nhhA z H41 skonstruowano tak, jak opisano to w Przykładzie 2. Otrzymany konstrukt ekspresyjny nazwano pIP52(H41). Mutant delecyjny został sporządzony przy pomocy strategii podanej w tym Przykładzie. W tym przypadku użyto następujących starterów oligonukleotydowych:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia konstruktu pIP52 wykazującego nadekspresję.
NH3'BG: 5'-GAT CAG GCC TGT ATC TTC ATC GGT AGC ATT-3' (SEQ ID NO:43) zawierająca miejsce restrykcyjne dla Stul (pokreślona) i odwróconą komplementarną sekwencję kodującą aminokwasy 134, (podwójnie podkreślone) i 49-54 dzikiego typu H41 NhhA (pogrubione).
Otrzymany produkt amplifikacji obejmuje pojedyncze miejsca restrykcyjne dla endonukleazy EagI i Stul. pIP52(H41) zawiera te miejsca restrykcyjne. Tak więc, pIP52(PMC21) i produkt amplifikacji były poddane trawieniu endonukleazą restrykcyjną EagI i Stul, łączone przy pomocy Iigazy i użyte dla transformacji kompetentnego szczepu bakterii E. coli DH5a; w ten sposób zastąpiono fragment Eagl/Stul plazmidu pIP52(PMC21) produktem PCR. Daje to ekspresyjny konstrukt zrekombinowanego kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na Fig. 6; SEQ ID NO:29) kodujący polipeptyd o 513 aminokwasach przedstawiony na Fig. 6 i SEQ ID NO:23. Ta sekwencja aminokwasowa obejmuje aminokwasy 1-54 i 134-593 sekwencji typu dzikiego, co za tym idzie, z usuniętą większą częścią obszaru V1, całymi obszarami V2 i C2 i częścią obszaru C3 z dzikiego typu polipeptydu NhhA z H41.
Plazmid Iinearyzowano przez trawienie restrykcyjne i wprowadzono przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów jakie opisano w Przykładzie 1 wyizolowano jeden klon wykazujący nadekspresję skróconego NhhA z H41 (Fig. 11).
Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego w www.anqis.orq.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzałe białko (Fig. 14; SEQ ID NO:36).
Konstrukt ten może zostać wprowadzony do jakichkolwiek kompetentnych komórek N. meningitidis.
PL 216 780 B1
P r z y k ł a d 6.
Konstrukcja mutanta z delecją w NhhA przy pomocy PCR na zakładkę.
Ponadto, poza wykorzystaniem dogodnych miejsc restrykcyjnych dla usunięcia obszarów zmiennych z nukleotydów kodujących NhhA mogą być również skonstruowane mutanty przy pomocy PCR „na zakładkę jak to opisali Ho i wsp., 1989, powyżej i Horton, R.M. i wsp., 1989, powyżej. W ten sposób mogą być wytworzone polinukleotydy kodujące obszary stałe, lecz z usuniętymi obszarami zmiennymi (patrz Fig. 5A, 5B, 5C).
W tym przykładzie sporządzono konstrukt zawierający obszary C1 i C5 z usuniętymi wszystkimi pozostałymi obszarami (patrz Fig. 5A).
Poniższe oligonukleotydowe startery użyto w reakcjach PCR dla amplifikacji odpowiedniego obszaru DNA dla C1 (patrz Fig. 1) na matrycy chromosomowego DNA szczepu PMC21:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia nadeksprymującego konstruktu pIP52(PMC21).
SO-C: 5'-GAC GAA ATC AAC GTT CTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT TGC-3' (SEQ ID NO:44); która to sekwencja jest odwrotna i komplementarna do sekwencji kodującej aminokwasy 237-241 począwszy od rejonu C5 (podkreślony) i aminokwasy 45-52 na końcu obszaru C1 (pogrubionym drukiem) i dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21.
Produktem amplifikacji tej reakcji jest HOMP5'/SO-C.
Poniższe oligonukleotydowe startery użyto w reakcjach PCR dla amplifikacji C5 z chromosomalnego DNA szczepu PMC21:
SO-D: 5'-AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT -3' (SEQ ID NO:45); kodująca aminokwasy 237-244 od początku C5 (podkreślenie wskazuje odwrotną komplementarną sekwencję startera SO-C),
ΗΟ3ΆΝ: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41); który jest tym samym starterem użytym dla konstrukcji pIUP52.
Produktem reakcji amplifikacji jest SO-D/H03'AN.
Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-C i SO-D/H03'AN oczyszczono w żelu agarozowym, po rozdzieleniu przez elektroforezę, zmieszano i poddano dalszej amplifikacji przy pomocy starterów HOMP5' i ΗΟ3ΆΝ. Otrzymany produkt amplifikacji kodował aminokwasy 1-52 i 337-591 dzikiego typu NhhA z PMC21. Ten produkt amplifikacji poddano trawieniu restrykcyjnemu EagI i NcoI i klonowano w pCO14K jak to opisano w Przykładzie 1. Taka zrekombinowana cząsteczka posiada obszary C1 i C5, ale ma usunięte obszary V1 do 4 i C2 do 4. Sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu jest przedstawiona na Fig. 7 i SEQ ID NO:30 i wydedukowana sekwencja polipeptydowa pochodząca z sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona na Fig. 7 i SEQ ID NO:25.
Plazmid ten był Iinearyzowany przez trawienie restrykcyjne i wprowadzony przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów opisanych w Przykładzie 2 wyizolowano jeden klon, który wykazywał nadekspresję skróconego NhhA z PMC21.
Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego z www.angis.org.au) wskazuje, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:37).
Plazmid może być wprowadzony do jakiegokolwiek kompetentnego pod względem transformacji szczepu N. meningitidis.
P r z y k ł a d 7
Konstrukcja mutanta delecyjnego NhhA przez PCR na zakładkę.
Powinno być dostrzeżone, że ta sama strategia może być użyta dla stworzenia zrekombinowanych polinukleotydów kodujących różne obszary kodujące NhhA. Wykonany może być konstrukt zawierający obszary C1, C4, V4 i C5 przy pomocy następującej strategii (patrz Fig. 5B):
obszar C1 jest amplifikowany przy pomocy starterów oligonukleotydowych:
HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40);
SO-E: 5'-AAC GCT TGC CGC ACG CTT AGC ACT TGC CTG CAA CGT TGC-3' (SEQ ID NO:46); będąca sekwencją odwrotną i komplementarną do kodującej aminokwasy 211-215 począwszy od obszaru C4 (podkreślony) skończywszy na obszarze C1 (pogrubiona czcionka) szczepu PMC21.
PL 216 780 B1
Produktem amplifikacji w tej reakcji jest HOMP5'/SO-E.
Poniższe startery oligonukleotydowe są użyte w reakcjach PCR dla amplifikacji obszaru C4, V4 i C5 na matrycy chromosomalnego DNA szczepu PMC21:
SO-F: 5'-CGT GCG GCA AGC GTT AAA GAC GTA- 3' (SEQ ID NO 47); kodująca aminokwasy 211-218 począwszy od początku C4 (podkreślone wskazują obszar odwrócony i komplementarny do startera SO-E),
HO3ΆΝ: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3 (SEQ ID NO:41).
Produkt amplifikacji tej reakcji to SO-F/HOMP3'.
Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-E I SO-F/H03'AN oczyszczono z żelu agarozowego po rozdzieleniu przez elektroforezę, zmieszano i poddano kolejnej amplifikacji stosując startery HOMP5' i HO3ΆΝ. Uzyskany produkt koduje aminokwasy 1-52 i 211-591 dzikiego typu nhhA z PMC21. Produkt amplifikacji będzie poddany trawieniu enzymami restrykcyjnymi EagI i NcoI i sklonowano go w pCO14K. Ta zrekombinowana cząsteczka zawiera obszary C1, C4, V4 i C5 tak więc ma usunięte obszary V1-3 i C2-3. Sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu przedstawiono na Fig. 8 i jako SEQ ID NO:31 i wydedukowaną sekwencję nukleotydową pochodzącą z tej sekwencji nukleotydowej przedstawiono na Fig. 8 i SEQ ID NO: 26. Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu SIGCLEAVE (część pakietu eGCG oprogramowania dostępnego z www.angis.org.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:38). Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek kompetentnej pod względem transformacji N. meningitidis.
P r z y k ł a d 8
Konstrukcja mutanta delecyjnego przez PCR na zakładkę.
Powinno być docenione, że podobna strategia może być użyta dla stworzenia zrekombinowanych polinukleotydów kodujących różne obszary NhhA. Może być sporządzony konstrukt zawierający obszary C1, C2, C3, C4 i C5 przy pomocy poniższej strategii (patrz Fig. 5C):
C1 i C2 będą amplifikowane przy pomocy oligonukleotydowych starterów
HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40);
SO-G: 5' - CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT CAG GTT GTC GCC GGC TTT GAG GGT GTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT-3' (SEQ ID NO: 48); nici odwrotnej i komplementarnej dla kodującej aminokwasy 125-129 od początku obszaru C3 (podkreślony), cały obszar C2 (aminokwasy 109-120, pogrubione i podwójnie podkreślone) i koniec obszaru C1 (aminokwasy 46-52, pogrubione) szczepu PMC21.
Produktem amplifikacji w tej reakcji jest HOMP5'/SO-G.
Obszar C3 i część obszaru C4 będzie amplifikowany przy pomocy poniższych oligonukleotydowych starterów:
SO-H: 5'- TTC ACC TAC TCG CTG AM AAA GAC-3' (SEQ ID NO:49); kodujący aminokwasy 125-132 od początku C3 (podkreślenie wskazuje obszar odwrócony i komplementarny do startera SO-G).
SO I: 5 - GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC CGC ACG ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT-3' (SEQ ID NO:50); kodująca odwrócone i komplementarne aminokwasy 182-88 na końcu C3 (podkreślone) i aminokwasy 211-222 z C4 (pogrubiona czcionka).
Produktem amplifikacji jest SO-H/SO-I.
Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-G i SO-H/SO-I są oczyszczone z żelu agarazowego po rozdziale elektroforetycznym, zmieszane i poddane dalszej amplifikacji przy pomocy starterów HOMP5' i SO-I co daje produkt kodujący aminokwasy 1-52, 103-114, 125-188 i 211-222, to jest obszary C1, C2, C3 i częściowo C4. Produkt amplifikacji tej reakcji to HOMP5'/SO-I.
C5 i część obszarów C4 zamplifikowano przy pomocy poniższych starterów oligonukleotydowych:
SO-J: 5'- GTA TTA AAC CGT GGC TGG AAC ATT AAA GGC GTT AAA AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT-3' (SEQ ID NO:51) kodujący aminokwasy 218-229 z C4 (podkreślone) i aminokwasy 237-243 z C5 (pogrubione) dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21 (obszar pogrubiony i podkreślony oznacza sekwencję odwróconą i komplementarną do SO-I).
HO3ΆΝ: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41). Produktem amplifikacji w tej reakcji jest SO-J/H03'AN.
Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-I I SO-J/H03'AN będą oczyszczone z żelu agarazowego po rozdziale elektroforetycznym, i będą zmieszane, i poddane kolejnej amplifikacji przy pomocy starterów
PL 216 780 B1
HOMP5' i HO3ΆΝ. Otrzymany produkt koduje aminokwasy 1-52, 103-114, 125-188, 211-229 i 237-591 dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21. Otrzymany produkt będzie poddany trawieniu restrykcyjnemu przy pomocy EagI i NcoI i klonowany w pCO14K. Taka zrekombinowana cząsteczka zawiera obszary C1, C2, C3, C4 i C5 i co za tym idzie usunięte są obszary V1, V2, V3 i V4. Sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu przedstawiono na Fig. 9 i SEQ ID NO:32 i wydedukowaną sekwencję polipeptydu pochodzącą od tej sekwencji nukleotydowej przedstawiono na Fig. 9 i SEQ ID NO:27. Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego z www.anqis.org.au) wykazała, że pierwsze 49 aminokwasów będzie odcięte dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:39).
Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek kompetentnej pod względem transformacji N. meningitidis.
P r z y k ł a d 9
Oczyszczanie polipeptydów NhhA po nadekspresji.
Zrekombinowany polipeptyd NhhA jaki opisano we wcześniejszych Przykładach może być wyizolowany przy pomocy poniższej procedury. Bakterie są hodowane przez noc (12-14 godzin) w 37°C w atmosferze z 5% CO2. (W tym Przykładzie pożywką był agar BHI uzupełniony podłożem Laventhala. Inne pożywki hodowlane są dobrze znane znawcom). Bakterie z dziesięciu 25 ml szalek z agarem zbierano i zawieszano w 25 ml 10 mM Tris, którego pH ustalono do 8,0 przy pomocy HCI. Równa objętość 10 mM Tris (pH 8,0) zawierająca 2% sarkozyl była dodana i mieszaninę dokładnie mieszano przez 1 godzinę w 4°C. Następnie wirowano ją przy 100 tys. x g przez 70 minut w 20°C i nadsącz odrzucano. Osad zawieszono w 25 ml 10 mM Tris (pH 8,0) zawierającym 1% sarkozyl przepuszczając przez igłę o rozmiarze 25. Tak otrzymany roztwór wirowano przy 100 000 x g przez 70 minut w 20°C i nadsącz odrzucono. Osad zawieszono w 10 ml 10 mM Tris (pH 8,0) przepuszczając przez igłę o rozmiarze 25. Frakcja ta zawiera składniki komórkowe nie rozpuszczalne w sarkozylu i jest wzbogacona w białka zewnętrznej błony. (Dodatkowy etap może być uwzględniony dla usunięcia resztek sarkozylu, co za tym idzie, roztwór białka jest dializowany przez cztery cykle 4-8 godzinne wobec 100-1000 objętości przykładowo 10 mM Tris-HCI pH 8,0 lub PBS (bufor fosforanowo solankowy) w 4°C.
Posiadając określone stężenia białka w zawiesinie przez pomiar adsorbancji przy długości fali 280 nm lub przy pomocy zestawu BCA (Pierce) około 1 ml roztworu zawierającego 10 mg białka w roztworze zawierającym 1% SDS (sól sodowa siarczanu laurylu), 2% β-merkaptoetanol rozdzielono w 6% SDS-PAGE o grubości 1,5 mm w aparacie BioRad mini-protean II. Wysoko cząsteczkowe NhhA wymywano z żelu przy pomocy „miniWholegelEluter firmy BioRad. Około 10% każdej wymytej frakcji sprawdzano przez rozdział SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie. Łączono frakcje zawierające NhhA zasadniczo wolny od innych białek. Procedurę tą przeprowadzono celem wyizolowania ulegającego nadekspresji dojrzałego NhhA jaki opisano w Przykładzie 2 (SEQ ID NO:1), ulegającego nadekspresji dojrzałego NhhA mutanta delecyjnego BgIII jakiego opisano w Przykładzie 4 (SEQ ID NO:23) i ulegającego nadekspresji mutanta delecyjnego NhhA jaki opisano w Przykładzie 6 (SEQ ID NO:25). Wyizolowane białko przedstawiono na Fig. 12.
P r z y k ł a d 10
Immunogeniczność polipeptydów NhhA z delecją.
Myszy zaszczepiono oczyszczonymi polipeptydami NhhA typu dzikiego i ich wariantami delecyjnymi, jakie wcześniej opisano w Przykładach. W jednej grupie każda mysz BaIb/c była zaszczepiona podskórnie 130 μg NhhA z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 115 ng w dniu 14. W drugiej grupie każda mysz była zaszczepiona podskórnie 120 μg białka z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 190 μg w dniu 14. W trzeciej grupie każda mysz była zaszczepiona podskórnie około 260 μg białka z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 1240 μg w dniu 14. Próbki krwi pobrano w dniu 21 i wyekstrahowano surowicę. Surowicę tę testowano z uwagi na występowanie pełnej długości NhhA z PMC 21 przez blot immunologiczny typu Western (Fig. 13). Preparaty OMC (5 mg) P6 (nadekspresja NhhA z PMC21) i szczepu 2A (zniesienie ekspresji NhhA) rozdzielono przez SDS-PAGE w 6% żelu prowadząc elektroforezę w aparacie Mini Protean II firmy BioRad. Białka przeniesiono elektroforetycznie na nitrocelulozę i filtry cięto na 3 mm paski, a następnie blokowano w 5% odtłuszczonym mleku w PBS. Mysią surowicę rozcieńczono 1:1000 i 1:10 000 w 5% odtłuszczonym mleku w proszku i inkubowano z paskami nitrocelulozy. Wiązanie przeciwciała wykryto stosując alkaliczną fosfatazę skonigowaną z przeciwciałem anty mysie IgG (Sigma) przed kolorymetrycznym wykryciem NBT/BCIP (Sigma). Z Fig. 13 można zobaczyć, ze możliwym jest wywołanie odpowiedzi immunologicznej przePL 216 780 B1 ciw dojrzałemu, o pełnej długości, polipeptydowi NhhA z PMC21, przez zaszczepienie NhhA z delecjami lub pełnej długości dojrzałymi polipeptydami NhhA.
P r z y k ł a d 11
Ekspresja mutanta delecyjnego polipeptydu w E. coli.
Poza ekspresją zmienionych w wyniku mutacji polipeptydów według wynalazku w N. meningitidis mogą być one również wyrażone w bakterii E. coli. Jako matryca dla amplifikacji przez PCR użyty może być którykolwiek z mutantów delecyjnych zrekombinowanego nhhA z Przykładów 4-8. Startery oligonukleotydowe mogą być użyte jak opisano w Międzynarodowej Publikacji Patentowej WO 99/31132 (takie jak SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 z tego dokumentu). Produkt amplifikacji może być strawiony restrykcyjnie enzymami BamHI/Hindlll i włączony przy pomocy Iigazy do plazmidu pMALC2 strawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI/Hindlll i uzyskany plazmid jest wprowadzony przez transformację do kompetentnych komórek E. coli szczepu DH5a. Uzyskany szczep może być zaindukowany dla ekspresji na wysokim poziomie zrekombinowanego białka przez zastosowanie warunków zalecanych przez producenta pMALC2. Otrzymane zrekombinowane białko jest fuzją białka wiążącego maltozę i zmienionego w wyniku mutacji typu delecja polipeptydu NhhA według wynalazku. Może być on częściowo oczyszczony przez rozdział w SDS-PAGE, a następnie elektroelucję przy pomocy urządzenia Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) zgodnie z zaleceniami producentów. Częściowo oczyszczone białko fuzyjne może być następnie dializowane wobec PBS, przed trawieniem proteazą Xa dla odcięcia od zrekombinowanego białka NhhA cząsteczki białka wiążącego maltozę. Zrekombinowane białko NhhA może być oczyszczone typowymi sposobami, jak przykładowo opisali R.K. Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, Nowy Jork, NY USA, 1993).
Przez wyszczególnienie opisano cel korzystnych postaci wynalazku nieograniczając wynalazku do jakiejkolwiek postaci lub specyficznego zbioru właściwości. Co za tym idzie, powinno być dostrzeżone przez znawcę, że w świetle tego ujawnienia różne modyfikacje i zmiany mogą być wprowadzone do określonych przykładowych postaci bez odbiegania od zakresu obecnego wynalazku.
Wszystkie programy komputerowe, algorytmy, patentowa i naukowa literatura, które są tu cytowane są włączone tu przez cytowanie.
T a b e l a 1
C1 V1 C2 V2 C3 V3 C4 V4 C5
Konsensus SEQ ID NO:11 1-50 51-108 109-120 121-134 135-198 199-220 221-239 240-248 249-604
PMC21 SEQ ID NO: 1 1-50 51-108 109-120 121-124 125-188 189-210 211-229 230-236 237-591
H41 SEQ ID NO: 2 1-50 51-102 103-114 115-124 125-188 189-210 211-229 230-236 237-591
P20 SEQ ID NO: 3 1-50 51-105 106-117 118-121 122-185 186-205 206-224 225-234 235-589
EG327 SEQ ID NO: 4 1-50 51-104 105-116 117-126 127-190 191-212 213-231 232-238 239-594
EG329 SEQ ID NO: 5 1-50 51-108 109-120 121-124 125-188 189-210 211-229 230-236 237-591
H38 SEQ ID NO: 6 1-50 51-105 106-117 118-131 132-195 196-217 218-236 237-243 244-599
H15 SEQ ID NO: 7 1-50 51-104 105-116 117-130 131-194 195-216 217-235 236-242 243-598
BZ10 SEQ ID NO: 8 1-50 51-104 105-116 117-130 131-194 195-216 217-235 236-242 243-598
BZ198 SEQ ID NO: 9 1-50 51-104 105-116 117-126 127-190 191-212 213-231 232-238 239-594
Z2491 SEQ ID NO:10 1-50 51-102 103-114 115-124 125-188 189-208 209-227 228-236 237-592
PL 216 780 B1
T a b e l a 2
Oryginalny aminokwas Przykładowa substytucja
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln, His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn, Gln
He Leu, Val
Leu He, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe Met, Leu, Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp, Phe
Val He, Leu
PL 216 780 B1
Lista sekwencji <110> Uniwersytet Queensland <120> Zmodyfikowany antygen powierzchniowy <130> jenningspeak <140> ΧΧΧΧΧ <141> 2001-01-25 <150> US 60/177,917 <151> 2000-01-25 <150> PCT/AU01/00069 <151> 2001-01-25 <160> 52 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile 1 5
Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg 20
Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala 35 40
Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45
Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin 50 55
Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 60
Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu 65 70
Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 75 80
Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu 85
Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 90 95 '
Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr 100
Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 105 110
Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin 115 120
Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 125
Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu
Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu
PL 216 780 B1
130 135 140
Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160
Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175
Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190
Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205
Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220
Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240
Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255
Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270
Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285
Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300
Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320
Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335
Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350
Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365
Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380
PL 216 780 B1
Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400
Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415
Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430
Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser 435 440 445
Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460
Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480
Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495
Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510
Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525
Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540
Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560
Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 565 570 575
Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp 580 585 590 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 500 505 510
Asn Val Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 515 520 525
Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 530 535 540
Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser 545 550 555 560
Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly 565 570 575
Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 3 <211> 589 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Val Ala 50 55 60
Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80
Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95
His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110
PL 216 780 B1
LŚu Lys Ile Lys Gin Ser Gly Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 115. 120 125
Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 130 135 140
Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 145 150 155 160
Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu 165 170 175
Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala 180 185 190
Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gin Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala 195 200 205
Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys 210 215 220
Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gin Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 225 230 235 240
Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 245 250 255
Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly 260 265 270
Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 275 280 285
Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 290 295 300
Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 305 310 315 320
Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 325 330 335
Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 340 345 350
Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys
PL 216 780 B1
355 360 365
Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 370 375 380
Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 385 390 395 400
Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 405 410 415
Val Asn. Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 420 425 430
Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 435 440 445
Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 450 455 460
Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 465 470 475 480
Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin 485 490 495
Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 500 505 510
Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 515 520 525
Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 530 535 540
Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 545 550 555 560
Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 565 570 575
Gly His Phe Gly Thr Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 <210> 4 <211> 594
PL 216 780 B1 <212> PRT <213> Neisseria meningitićtis <400> 4
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Ser Thr Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60
Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80
Lys Glu Val Thr Glu Asp Ser Asn Trp Gly Val Tyr Phe Asp Lys Lys 85 90 95
Gly Val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110
Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr 115 120 125
Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu 130 135 140
Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160
Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp 165 170 175
Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190
Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 195 200 205
Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220
PL 216 780 B1
Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 225 230 235 240
Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 245 250 255
Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr 260 265 270
Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285
Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Asp Ser Ser Thr Asp 290 295 300
Lys Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 305 310 315 320
Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335
Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 340 345 350
Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 355 360 365
Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 370 375 380
Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 385 390 395 400
Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415
Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile 420 425 430
Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 435 440 445
Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460
Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys
PL 216 780 B1
465 470 475 480
Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val
485 490 495
Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn His
500 505 510
Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile
515 520 525
Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met
530 535 540
Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly
545 550 555 560
Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala
565 570 575
Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr
580 585 590
Gin Trp
<210> 5
<211> 591
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 5
Met Asn Glu Ile Leu Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
1 5 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala
20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin
35 40 45
Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro
50 55 60
Val Leu Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
PL 216 780 B1
Thr Gly Glu. Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 85 90 95
Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 100 105 110
Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 115 120 125
Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140
Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160
Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175
Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190
Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205
Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220
Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240
Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255
Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270
Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285
Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300
Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320
PL 216 780 B1
Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335
Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350
Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365
Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380
Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400
Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met ' 405 410 415
Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430
Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser 435 440 445
Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460
Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480
Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495
Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510
Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525
Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540
Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560
Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn
PL 216 780 B1
565
570
575
Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590
<210> 6
<211> 599
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 6
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile I
Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Pro Val Val 50 55 60
Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80
Glu Asn Glu Ser Thr Gly Asn Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn 85 90 95
His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110
Leu Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Lys Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn 115 120 125
Asp Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr 130 135 140
Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val 145 150 155 160
Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala .165 170 175
Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr 180 185 190
PL 216 780 B1
Leu Thr Asp- Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn 195 200 205
Asp Asn Val Thr Asp Asp Lys Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp 210 215 220
Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val His Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe 245 250 255
Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp 260 265 270
Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile 275 280 285
Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn 290 295 300
Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val 305 310 315 320
Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala 325 330 335
Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly 340 345 350
Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser 355 360 365
Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly 370 375 380
Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp 385 390 395 400
Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val 405 410 415
Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly 420 425 430
PL 216 780 B1
Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr 435 440 445
Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp 450 455 460
Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Lys Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser 465 470 475 480
Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val 485 490 495
Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin 500 505 510
Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly 515 520 525
Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 530 535 540
Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 545 550 555 560
Gly Tyr Ala He Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 565 570 575
Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser 580 585 590
Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 7 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 7
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
PL 216 780 B1
Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60
Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80
Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95
Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110
Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125
Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140
Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160
Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175
Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190
Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205
Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220
Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240
Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255
Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270
Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285
PL 216 780 B1
Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly 290 295 300
Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Vał Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320
Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335
Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350
Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365
Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380
Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400
Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415
Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430
Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445
Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460
Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480
Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495
Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn 500 505 510
Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525
PL 216 780 B1
Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540
Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560
Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575
Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 580 585 590
Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 8 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 8
Met Asn Lys Ile Ser Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60
Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80
Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95
Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu ' 100 105 110
Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125
Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140
PL 216 780 B1
Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160
Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175
Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190
Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205
Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220
Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240
Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255
Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270
Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285
Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly 290 295 300
Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320
Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335
Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350
Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365
Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380
PL 216 780 B1
Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400
Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415
Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430
Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445
Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460
Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480
Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495
Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn 500 505 510
Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525
Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540
Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560
Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575
Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Thr Ser Ala 580 585 590
Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 9 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis
PL 216 780 B1 <400> 9
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60
Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80
Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95
Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110
Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp Ser Ser Phe Thr 115 120 125
Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu 130 135 140
Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160
Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gły Asp 165 170 175
Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190
Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 195 200 205
Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220
Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 225 230 235 240
PL 216 780 B1
Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 245 250 255
Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 260 265 270
Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285
Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 290 295 300
Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 305 310 315 320
Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335
Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 340 345 350
Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 355 360 365
Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 370 375 380
Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 385 390 395 400
Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415
Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile ~ 420 425 430
Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Ala Pro Gin 435 440 445
Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460
Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Thr Asn Lys 465 470 475 480
PL 216 780 B1
Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val 485 490 495
Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg 500 505 510
Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile 515 520 525
Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met 530 535 540
Ala Ile Gly Gly Asp Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly 545 550 555 560
Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala 565 570 575
Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr * 580 585 590
Gin Trp <210> 10 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 10
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin 50 55 60
Arg Ser Val Val Gly Ser Ile Gin Ala Ser Met Glu Gly Ser Gly Glu 65 70 75 80
Leu Glu Thr Ile Ser Leu Ser Met Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Asp Lys Phe Glu. Thr Val 340
Thr Ser Gly Thr Asn 345
Val Thr Phe Ala Ser 350
Gly Lys Gly Thr Thr 355
Ala Thr Val Ser Lys Asp 360
Asp Gin Gly Asn Ile 365
Thr Val Met Tyr Asp 370
Val Asn Val Gly Asp Ala 375
Leu Asn Val Asn Gin 380
Leu Gin Asn Ser Gly 385
Trp Asn Leu Asp Ser Lys 390 395
Ala Val Ala Gly Ser 400
Ser Gly Lys Val Ile 405
Ser Gly Asn Val Ser Pro 410
Ser Lys Gly Lys Met 415
Asp Glu Thr Val Asn 420
Ile Asn Ala Gly Asn Asn 425
Ile Glu Ile Ser Arg 430
Asn Gly Lys Asn Ile 435
Asp Ile Ala Thr Ser Met 440
Ala Pro Gin Phe Ser 445
Ser Val Ser Leu Gly 450
Ala Gly Ala Asp Ala Pro 455
Thr Leu Ser Val Asp 460
Asp Glu Gly Ala Leu 465
Asn Val Gly Ser Lys Asp 470 475
Ala Asn Lys Pro Val 480
Arg Ile Thr Asn Val ~ 485
Ala Pro Gly Val Lys Glu 490
Gly Asp Val Thr Asn 495
Val Ala Gin Leu Lys 500
Gly Val Ala Gin Asn Leu 505
Asn Asn Arg Ile Asp 510
Asn Val Asp Gly Asn 515
Ala Arg Ala Gly Ile Ala 520
Gin Ala Ile Ala Thr 525
Ala Gly Leu Val Gin 530
Ala Tyr Leu Pro Gly Lys 535
Ser Met Met Ala Ile 540
Gly Gly Gly Thr Tyr 545
Arg Gly Glu Ala Gly Tyr 550 555
Ala Ile Gly Tyr Ser 560
Ser Ile Ser Asp Gly 565
Gly Asn Trp Ile Ile Lys 570
Gly Thr Ala Ser Gly 575
PL 216 780 B1
Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 11 <211> 604 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <220>
<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(596) <223> X oznacza jakikolwiek lub brak aminokwasu w odpowiednim miejscu którejkolwiek z sekwencji SEQ ID NR <400> 11
Met Asn Xaa Ile Xaa Arg Ile Ile Trp 1 5
1-10 lub jej konserwatywne podstawienie.
Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15
Val Xaa Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn 20 25
His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 30
Thr Val Xaa Thr Ala Val Leu Ala Thr 35 40
Leu Leu Xaa Ala Thr Val Gin 45
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 60
Val Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa 65 70
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly 75 80
Xaa Xaa Glu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 85
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105
Xaa Xaa Xaa Thr Leu Lys Ala 110
Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Xaa 115 120
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 125
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Tyr 130 135
Ser Leu Lys Lys Xaa Leu Xaa 140
Xaa Leu Xaa Xaa Val Xaa Thr Glu Lys 145 150
Leu Ser Phe Xaa Ala Asn Xaa 155 160
Xaa Lys Val Asn Ile Xaa Ser Asp Thr 165
Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys 170 175
PL 216 780 B1
Xaa Thr Ala Xaa Thr Asn Gly Asp Xaa Thr Val His Leu Asn Gly Ile 180 185 190
Gly Ser Thr Leu Thr Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 195 200 205
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Ala Ala Ser 210 215 220
Xaa Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Xaa 225 230 235 240
Gly Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Phe Val Xaa Thr Tyr 245 250 255
Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn 260 265 270
Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Xaa Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala 275 280 285
Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys 290 295 300
Xaa Lys Xaa Glu Asn Xaa Ser Ser Thr Asp Xaa Gly Glu Gly Leu Val 305 310 315 320
Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met 325 330 335
Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe Glu 340 345 350
Thr Val Thr Ser Gly Thr Xaa Val Thr Phe Ala Ser Gly Xaa Gly Thr 355 360 365
Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Xaa Tyr 370 375 380
Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn Ser 385 390 395 400
Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val 405 410 415
PL 216 780 B1
Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val 420 425 430
Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Xaa Arg Asn Gly Lys Asn 435 440 445
Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Xaa Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu 450 455 460
Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Xaa Xaa Xaa Ala 465 470 475 480
Leu Asn Val Gly Ser Lys Xaa Xaa Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn 485 490 495
Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu 500 505 510
Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Xaa Ile Asp Asn Val Xaa Gly 515 520 525
Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Xaa 530 535 540
Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Xaa Thr 545 550 555 560
Tyr Xaa Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Xaa 565 570 575
Xaa Gly Asn Trp Xaa Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly 580 585 590
His Phe Gly Xaa Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 600 <210> 12 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 12
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagattta 180
tatttagacc ccgtacaacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga taaagaaggc 240
PL 216 780 B1
acgggagaaa aagaaaaagt agaagaaaat tcagattggg cagtatattt caacgagaaa 300
ggagtactaa cagccagaga aatcaccctc aaagccggcg acaacctgaa aatcaaacaa 360
aacggcacaa acttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca cagatctgac cagtgttgga 420
actgaaaaat tatcgtttag cgcaaacggc aataaagtca acatcacaag cgacaccaaa 480
ggcttgaatt ttgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcatctgaac 540
ggtattggtt cgactttgac cgatacgctg ctgaataccg gagcgaccac aaacgtaacc 600
aacgacaacg ttaccgatga cgagaaaaaa cgtgcggcaa gcgttaaaga cgtattaaac 660
gctggctgga acattaaagg cgttaaaccc ggtacaacag cttccgataa cgttgatttc 720
gtccgcactt acgacacagt cgagttcttg agcgcagata cgaaaacaac gactgttaat 780
gtggaaagca aagacaacgg caagaaaacc gaagttaaaa tcggtgcgaa gacttctgtt 840
attaaagaaa aagacggtaa gttggttact ggtaaagaca aaggcgagaa tggttcttct 900
acagacgaag gcgaaggctt agtgactgca aaagaagtga ttgatgcagt aaacaaggct 960
ggttggagaa tgaaaacaac aaccgctaat ggtcaaacag gtcaagctga caagtttgaa 1020
accgttacat caggcacaaa tgtaaccttt gctagtggta aaggtacaac tgcgactgta 1080
agtaaagatg atcaaggcaa catcactgtt atgtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta 1140
aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggatt ccaaagcggt tgcaggttct 1200
tcgggcaaag tcatcagcgg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc 1260
aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt acccgcaacg gtaaaaatat cgacatcgcc 1320
acttcgatga ccccgcagtt ttccagcgtt tcgctcggcg cgggggcgga tgcgcccact 1380
ttgagcgtgg atggggacgc attgaatgtc ggcagcaaga aggacaacaa acccgtccgc 1440
attaccaatg tcgccccggg cgttaaagag ggggatgtta caaacgtcgc acaacttaaa 1500
ggcgtggcgc aaaacttgaa caaccgcatc gacaatgtgg acggcaacgc gcgtgcgggc 1560
atcgcccaag cgattgcaac cgcaggtctg gttcaggcgt atttgcccgg caagagtatg 1620
atggcgatcg gcggcggcac ttatcgcggc gaagccggtt acgccatcgg ctactccagt 1680
atttccgacg gcggaaattg gattatcaaa ggcacggctt ccggcaattc gcgcggccat 1740
ttcggtgctt ccgcatctgt cggttatcag tggtaa 1776
<210> 13 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 13 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60
PL 216 780 B1
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg aagatgaaga agaagagtta 180
gaatccgtac aacgctctgt cgtagggagc attcaagcca gtatggaagg cagcgtcgaa 240
ttggaaacga tateattate aatgactaac gacagcaagg aatttgtaga cccatacata 300
gtagttacce tcaaagccgg cgacaacctg aaaatcaaac aaaacaccaa tgaaaacacc 360
aatgccagta gcttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca caggcctgat caatgttgaa 420
actgaaaaat tatcgtttgg cgcaaacggc aagaaagtca acatcataag cgacaccaaa 480
ggcttgaatt tcgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcatctgaac 540
ggtatcggtt cgactttgac egatatgetg ctgaataccg gagcgaccac aaacgtaacc 600
aacgacaacg ttaccgatga cgagaaaaaa cgtgcggcaa gcgttaaaga cgtattaaac 660
gcaggctgga acattaaagg cgttaaaccc ggtacaacag cttccgataa cgttgatttc 720
gtccgcactt acgacacagt egagttettg agegeagata cgaaaacaac gactgttaat 780
gtggaaagca aagacaacgg caagaaaacc gaagttaaaa tcggtgcgaa gacttctgtt 840
attaaagaaa aagacggtaa gttggttact ggtaaaggca aaggcgagaa tggttcttct 900
acagacgaag gcgaaggctt agtgactgca aaagaagtga ttgatgcagt aaacaaggct 960
ggttggagaa tgaaaacaac aaccgctaat ggtcaaacag gtcaagctga caagtttgaa 1020
accgttacat caggcacaaa agtaaccttt gctagtggta atggtacaac tgcgactgta 1080
agtaaagatg atcaaggcaa catcactgtt aagtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta 1140
aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggatt ccaaagcggt tgcaggttct 1200
tcgggcaaag teateagegg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc 1260
aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt acccgcaacg gcaaaaatat cgacatcgcc 1320
acttcgatga ccccgcaatt ttccagcgtt tcgctcggcg cgggggcgga tgcgcccact 1380
ttaagcgtgg atgacgaggg cgcgttgaat gteggeagea aggatgccaa caaacccgtc 1440
cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa gagggggatg ttacaaacgt cgcgcaactt 1500
aaaggtgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tgaacggcaa cgcgcgtgcg 1560
ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatctgcc cggcaagagt 1620
atgatggcga teggeggegg cacttatctc ggcgaagccg gttatgccat cggctactca 1680
agcatttccg ccggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1740
catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1779
<210> 14
PL 216 780 B1
<211> 1770
<212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 14 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt agtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaecg tggcgaccgc cgtattggcg 120
acactgctgt ccgcaacggt tcaggcgaat gctaccgata ccgatgaaga tgaagagtta 180
gaatccgtag cacgctctgc tctggtgttg caattcatga tcgataaaga aggcaatgga 240
gaaatcgaat ctacaggaga tataggttgg agtatatatt acgacgatca caacactcta 300
cacggcgcaa ccgttaccct caaagccggc gacaacctga aaatcaaaca aagcggcaaa 360
gacttcacct actcgctgaa aaaagagctg aaagacctga ccagtgttga aactgaaaaa 420
ttatcgtttg gcgcaaacgg taataaagtc aacatcacaa gcgacaccaa aggcttgaat 480
tttgcgaaag aaacggctgg gacgaacggc gaccccacgg ttcatctgaa cggtatcggt 540
tcgactttga ccgatacgct tgcgggttct tctgcttctc acgttgatgc gggtaaccaa 600
agtacacatt acactcgtgc agcaagtatt aaggatgtgt tgaatgcggg ttggaatatt 660
aagggtgtta aaactggctc aacaactggt caatcagaaa atgtcgattt cgtccgcact 720
tacgacacag tcgagttctt gagcgcagat acgaaaacaa cgactgttaa tgtggaaagc 780
aaagacaacg gcaagagaac cgaagttaaa atcggtgcga agacttctgt tattaaagaa 840
aaagacggta agttggttac tggtaaaggc aaaggcgaga atggttcttc tacagacgaa 900
ggcgaaggct tagtgactgc aaaagaagtg attgatgcag taaacaaggc tggttggaga 960
atgaaaacaa caaccgctaa tggtcaaaca ggtcaagctg acaagtttga aaccgttaca 1020
tcaggcacaa aagtaacctt tgctagtggt aatggtacaa ctgcgactgt aagtaaagat 1080
gatcaaggca acatcactgt taagtatgat gtaaatgtcg gcgatgccct aaacgtcaat 1140
cagctgcaaa acagcggttg gaatttggat tccaaagcgg ttgcaggttc ttcgggcaaa 1200
gtcatcagcg gcaatgtttc gccgagcaag ggaaagatgg atgaaaccgt caacattaat 1260
gccggcaaca acatcgagat tacccgcaac ggcaaaaata tcgacatcgc cacttcgatg 1320
accccgcaat tttccagcgt ttcgctcggc gcgggggcgg atgcgcccac tttaagcgtg 1380
gatgacgagg gcgcgttgaa tgtcggcagc aaggatgcca acaaacccgt ccgcattacc 1440
aatgtcgccc cgggcgttaa agagggggat gttacaaacg tcgcacaact taaaggtgtg 1500
gcgcaaaact tgaacaaccg catcgacaat gtgaacggca acgcgcgcgc gggtatcgcc 1560
caagcgattg caaccgcagg tttggctcag gcctatttgc ccggcaagag tatgatggcg 1620
atcggcggcg gtacttatct cggcgaagcc ggttacgcca tcggctactc gagcatttct 1680
PL 216 780 B1
gacactggga attgggttat caagggcacg gcttccggca attcgcgcgg tcatttcggt 1740
acttccgcat ctgtcggtta tcagtggtaa 1770
<210> 15 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 15 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgagt actaccgatg acgacgattt atatttagaa 180
cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240
aaagaagtta cagaagattc aaattgggga gtatatttcg acaagaaagg agtactaaca 300
gccggaacaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360
aacaccaatg ccagtagctt cacctactcg ctgaaaaaag acctcacaga tctgaccagt 420
gttggaactg aaaaattatc gtttagcgca aacagcaata aagtcaacat cacaagcgac 480
accaaaggct tgaatttcgc gaaaaaaacg gctgagacca acggcgacac cacggttcat 540
ctgaacggta tcggttcgac tttgaccgat acgctgctga ataccggagc gaccacaaac 600
gtaaccaacg acaacgttac cgatgacgag aaaaaacgtg cggcaagcgt taaagacgta 660
ttaaacgcag gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt 720
gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact 780
gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag agaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact 840
tctgttatca aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aagacaaagg cgagaatgat 900
tcttctacag acaaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac 960
aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag 1020
tttgaaaccg ttacatcagg cacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaactgcg 1080
actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttatgt atgatgtaaa tgtcggcgat 1140
gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca 1200
ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa 1260
accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggcaa aaatatcgac 1320
atcgccactt cgatgacccc gcaattttcc agcgtttcgc tcggcgcggg ggcggatgcg 1380
cccactttaa gcgtggatga cgagggcgcg ttgaatgtcg gcagcaagga tgccaacaaa 1440
cccgtccgca ttaccaatgt cgccccgggc gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgca 1500
PL 216 780 B1
caacttaaag gcgtggcgca aaacttgaac aaccacatcg acaatgtgga cggeaacgcg 1560
cgtgcgggca tcgcccaagc gattgcaacc gcaggtctgg ttcaggcgta tctgcccggc 1620
aagagtatga tggcgatcgg cggcggcact tatcgcggcg aagccggtta tgccatcggc 1680
tactcaagca tttccgacgg cggaaattgg attatcaaag gcacggcttc cggcaattcg 1740
cgcggccatt tcggtgcttc cgcatctgtc ggttatcagt ggtaa 1785
<210> 16 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 16
atgaacgaaa tattgcgcat catttggaat agcgccctca atgcctgggt cgttgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga agaagattta 180
tatttagacc ccgtgctacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga taaagaaggc 240
acgggagaaa aagaaaaagt agaagaaaat tcagattggg cagtatattt caacgagaaa 300
ggagtactaa cagccagaga aatcaccctc aaagccggcg acaacctgaa aatcaaacaa 360
aacggcacaa acttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca cagatctgac cagtgttgga 420
actgaaaaat tatcgtttag cgcaaacggc aataaagtca acatcacaag cgacaccaaa 480
ggcttgaatt ttgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcatctgaac 540
ggtattggtt cgactttgac cgatacgctg ctgaataccg gagcgaccac aaacgtaacc 600
aacgacaacg ttaccgatga cgagaaaaaa cgtgcggcaa gcgttaaaga cgtattaaac 660
gctggctgga acattaaagg cgttaaaccc ggtacaacag cttccgataa cgttgatttc 720
gtccgcactt acgacacagt cgagttcttg agcgcagata cgaaaacaac gactgttaat 780
gtggaaagca aagacaacgg caagaaaacc gaagttaaaa tcggtgcgaa gacttctgtt 840
attaaagaaa aagacggtaa gttggttact ggtaaagaca aaggcgagaa tggttcttct 900
acagacgaag gcgaaggctt agtgactgca aaagaagtga ttgatgcagt aaacaaggct 960
ggttggagaa tgaaaacaac aaccgctaat ggtcaaacag gtcaagctga caagtttgaa 1020
accgttacat caggcacaaa tgtaaccttt gctagtggta aaggtacaac tgcgactgta 1080
agtaaagatg atcaaggcaa catcactgtt atgtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta 1140
aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggatt ccaaagcggt tgcaggttct 1200
tcgggcaaag tcatcagcgg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc 1260
aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt acccgcaacg gtaaaaatat cgacatcgcc 1320
PL 216 780 B1
acttcgatga ccccgcagtt ttccagcgtt tcgctcggcg cgggggcgga tgcgcccact 1380
ttgagcgtgg atggggacgc attgaatgtc ggcagcaaga aggacaacaa acccgtccgc 1440
attaccaatg tcgccccggg cgttaaagag ggggatgtta caaacgtcgc acaacttaaa 1500
ggcgtggcgc aaaacttgaa caaccgcatc gacaatgtgg acggcaacgc gcgtgcgggc 1560
atcgcccaag cgattgcaac cgcaggtctg gttcaggcgt atttgcccgg caagagtatg 1620
atggcgatcg gcggcggcac ttatcgcggc gaagccggtt acgccatcgg ctactccagt 1680
atttccgacg gcggaaattg gattatcaaa ggcacggctt ccggcaattc gcgcggccat 1740
ttcggtgctt ccgcatctgt cggttatcag tggtaa 1776
<210> 17 <211> 1800 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 17
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
acgctgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg aagatgaaga agaagagtta 180
gaacccgtag tacgctctgc tctggtgttg caattcatga tcgataaaga aggcaatgga 240
gaaaacgaat ctacaggaaa tataggttgg agtatatatt acgacaatca caacactcta 300
cacggcgcaa ccgttaccct caaagccggc gacaacctga aaatcaaaca aaacaccaat 360
aaaaacacca atgaaaacac caatgacagt agcttcacct actcgctgaa aaaagacctc 420
acagatctga ccagtgttga aactgaaaaa ttatcgtttg gcgcaaacgg caataaagtc 480
aacatcacaa gcgacaccaa aggcttgaat ttcgcgaaag aaacggctgg gacgaacggc 540
gacaccacgg ttcatctgaa cggtattggt tcgactttga ccgatacgct gctgaatacc 600
ggagcgacca caaacgtaac caacgacaac gttaccgatg acaagaaaaa acgtgcggca 660
agcgttaaag acgtattaaa cgcaggctgg aacattaaag gcgttaaacc cggtacaaca 720
gcttccgata acgttgattt cgtccacact tacgacacag tcgagttctt gagcgcagat 780
acgaaaacaa cgactgttaa tgtggaaagc aaagacaacg gcaagagaac cgaagttaaa 840
atcggtgcga agacttctgt tattaaagaa aaagacggta agttggttac tggtaaaggc 900
aaaggcgaga atggttcttc tacagacgaa ggcgaaggct tagtgactgc aaaagaagtg 960
attgatgcag taaacaaggc tggttggaga atgaaaacaa caaccgctaa tggtcaaaca 1020
ggtcaagctg acaagtttga aaccgttaca tcaggcacaa atgtaacctt tgctagtggt 1080
aaaggtacaa ctgcgactgt aagtaaagat gatcaaggca acatcactgt taagtatgat 1140
PL 216 780 B1
gtaaatgtcg gcgatgccct aaacgtcaat cagctgcaaa acagcggttg gaatttggat 1200
tccaaagcgg ttgcaggttc ttcgggcaaa gtcatcagcg gcaatgtttc gccgagcaag 1260
ggaaagatgg atgaaaccgt caacattaat gccggcaaca acatcgagat tacccgcaac 1320
ggtaaaaata tcgacatcgc cacttcgatg accccgcagt tttccagcgt ttcgctcggc 1380
gcgggggcgg atgcgcccac tttgagcgtg gatgacaagg gcgcgttgaa tgtcggcagc 1440
aaggatgcca acaaacccgt ccgcattacc aatgtcgccc cgggcgttaa agagggggat 1500
gttacaaacg tcgcacaact taaaggcgtg gcgcaaaact tgaacaaccg catcgacaat 1560
gtggacggca acgcgcgtgc gggcatcgcc caagcgattg caaccgcagg tctggttcag 1620
gcgtatctgc ccggcaagag tatgatggcg atcggcggcg gcacttatcg cggcgaagcc 1680
ggttacgcca tcggctactc cagtatttcc gacggcggaa attggattat caaaggcacg 1740
gcttccggca attcgcgcgg tcatttcggt gcttccgcat ctgtcggtta tcagtggtaa 1800
<210> 18 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 18
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg acgacgattt atatttagaa 180
cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240
aaagaaggta cagaagattc aaattgggca gtatatttcg acgagaaaag agtactaaaa 300
gccggagcaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360
aacaccaatg aaaacaccaa tgacagtagc ttcacctact ccctgaaaaa agacctcaca 420
gatctgacca gtgttgaaac tgaaaaatta tcgtttggcg caaacggtaa taaagtcaac 480
atcacaagcg acaccaaagg cttgaatttt gcgaaagaaa cggctgggac gaacggcgac 540
cccacggttc atctgaacgg tatcggttcg actttgaccg atacgctgct gaataccgga 600
gcgaccacaa acgtaaccaa cgacaacgtt accgatgacg agaaaaaacg tgcggcaagc 660
gttaaagacg tattaaacgc aggctggaac attaaaggcg ttaaacccgg tacaacagct 720
tccgataacg ttgatttcgt ccgcacttac gacacagtcg agttcttgag cgcagatacg 780
aaaacaacga ctgttaatgt ggaaagcaaa gacaacggca agaaaaccga agttaaaatc 840
ggtgcgaaga cttctgttat taaagaaaaa gacggtaagt tggttactgg taaaggcaaa 900
gacgagaatg gttcttctac agacgaaggc gaaggcttag tgactgcaaa agaagtgatt 960
PL 216 780 B1
gatgcagtaa acaaggctgg ttggagaatg aaaacaacaa ccgctaatgg tcaaacaggt 1020
caagctgaca agtttgaaac cgttacatca ggcacaaaag taacctttgc tagtggtaat 1080
ggtacaactg cgactgtaag taaagatgat caaggcaaca tcactgttaa gtatgatgta 1140
aatgtcggcg atgccctaaa cgtcaatcag ctgcaaaaca gcggttggaa tttggattcc 1200
aaagcggttg caggttcttc gggcaaagtc atcagcggca atgtttcgcc gagcaaggga 1260
aagatggatg aaaccgtcaa cattaatgcc ggcaacaaca tcgagattac ccgcaacggc 1320
aaaaatatcg acatcgccac ttcgatgacc ccgcaatttt ccagcgtttc gctcggcgcg 1380
ggggcggatg cgcccacttt aagcgtggat gacgagggcg cgttgaatgt cggcagcaag 1440
gatgccaaca aacccgtccg cattaccaat gtcgccccgg gcgttaaaga gggggatgtt 1500
acaaacgtcg cacaacttaa aggtgtggcg caaaacttga acaaccgcat cgacaatgtg 1560
gacggcaacg cgcgcgcggg tatcgcccaa gcgattgcaa ccgcaggttt ggctcaggcg 1620
tatttgcccg gcaagagtat gatggcgatc ggcggcggta cttatcgcgg cgaagccggt 1680
tacgccatcg gctactcgag catttctgac actgggaatt gggttatcaa gggcacggct 1740
tccggcaatt cgcgcggcca tttcggtgct tccgcatctg tcggttatca gtggtaa 1797
<210> 19 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 19
atgaacaaaa tatcccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg acgacgattt atatttagaa 180
cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240
aaagaaggta cagaagattc aaattgggca gtatatttcg acgagaaaag agtactaaaa 300
gccggagcaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360
aacaccaatg aaaacaccaa tgacagtagc ttcacctact ccctgaaaaa agacctcaca 420
gatctgacca gtgttgaaac tgaaaaatta tcgtttggcg caaacggtaa taaagtcaac 480
atcacaagcg acaccaaagg cttgaatttt gcgaaagaaa cggctgggac gaacggcgac 540
cccacggttc atctgaacgg tatcggttcg actttgaccg atacgctgct gaataccgga 600
gcgaccacaa acgtaaccaa cgacaacgtt accgatgacg agaaaaaacg fcęrcggcaagc 660
gttaaagacg tattaaacgc aggctggaac attaaaggcg ttaaacccgg tacaacagct 720
tccgataacg tcgatttcgt ccgcacttac gacacagtcg agttcttgag cgcagatacg 780
PL 216 780 B1
aaaacaacga ctgttaatgt ggaaagcaaa gacaacggca agagaaccga agttaaaatc 840
ggtgcgaaga cttctgttat taaagaaaaa gacggtaagt tggttactgg taaaggcaaa 900
ggcgagaatg gttcttctac agacgaaggc gaaggcttag tgactgcaaa agaagtgatt 960
gatgcagtaa acaaggctgg ttggagaatg aaaacaacaa ccgctaatgg tcaaacaggt 1020
caagctgaca agtttgaaac cgttacatca ggcacaaaag taacctttgc tagtggtaat 1080
ggtacaactg cgactgtaag taaagatgat caaggcaaca tcactgttaa gtatgatgta 1140
aatgtcggcg atgccctaaa cgtcaatcag ctgcaaaaca gcggttggaa tttggattcc 1200
aaagcggttg caggttcttc gggcaaagtc atcagcggca atgtttcgcc gagcaaggga 1260
aagatggatg aaaccgtcaa cattaatgcc ggcaacaaca tcgagattac ccgcaacggc 1320
aaaaatatcg acatcgccac ttcgatgacc ccgcaatttt ccagcgtttc gctcggcgcg 1380
ggggcggatg cgcccacttt aagcgtggat gacgagggcg cgttgaatgt cggcagcaag 1440
gatgccaaca aacccgtccg cattaccaat gtcgccccgg gcgttaaaga gggggatgtt 1500
acaaacgtcg cacaacttaa aggtgtggcg caaaacttga acaaccgcat cgacaatgtg 1560
gacggcaacg cgcgcgcggg tatcgcccaa gcgattgcaa ccgcaggttt ggctcaggcc 1620
tatttgcccg gcaagagtat gatggcgatc ggcggcggta cttatcgcgg cgaagccggt 1680
tacgccatcg gctactcgag catttctgac actgggaatt gggttatcaa gggcacggct 1740
tccggcaatt cgcgcggtca tttcggtact tccgcatctg tcggttatca gtggtaa 1797
<210> 20 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 20
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg acgacgattt atatttagaa 180
cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa 240
aaagaaggta cagaagattc aaattgggca gtatatttcg acgagaaaag agtactaaaa 300
gccggagcaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa 360
aacaccaatg acagtagctt cacctactcc ctgaaaaaag acctcacaga tctgaccagt 420
gttgaaactg aaaaattatc gtttggcgca aacggtaata aagtcaacat cacaagcgac 480
accaaaggct tgaattttgc gaaagaaacg gctgggacga acggcgaccc cacggttcat 540
ctgaacggta tcggttcgac tttgaccgat acgctgctga ataccggagc gaccacaaac 600
PL 216 780 B1
gtaaccaacg acaacgttac cgatgacgag aaaaaacgtg cggcaagcgt taaagacgta 660
ttaaacgcag gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt 720
gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact 780
gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag aaaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact 840
tctgttatta aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aaggcaaaga cgagaatggt 900
tcttctacag acgaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac 960
aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag 1020
tttgaaaccg ttacatcagg eacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaactgcg 1080
actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttaagt atgatgtaaa tgtcggcgat 1140
gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca 1200
ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa 1260
accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggtaa aaatatcgac 1320
atcgccactt cgatggcgcc gcagttttcc agcgtttcgc tcggtgcggg ggcggatgcg 1380
cccactttga gcgtggatga cgagggcgcg ttgaatgtcg gcagcaagga taccaacaaa 1440
cccgtccgca ttaccaatgt cgccccgggc gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgca 1500
caacttaaag gcgtggcgca aaacttgaac aaccgcatcg acaatgtgga cggcaacgcg 1560
cgtgcgggca tcgcccaagc gattgcaacc gcaggtctag ttcaggcgta tctgcccggc 1620
aagagtatga tggcgatcgg cggcgacact tatcgcggcg aagccggtta cgccatcggc 1680
tactcaagta tttccgacgg cggaaattgg attatcaaag gcacggcttc cggcaattcg 1740
cgcggccatt tcggtgcttc cgcatctgtc ggttatcaat ggtaa 1785
<210> 21 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 21
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg aagatgaaga agaagagtta 180
gaatccgtac aacgctctgt cgtagggagc attcaagcca gtatggaagg cagcggcgaa 240
ttggaaacga tatcattatc aatgactaac gacagcaagg aatttgtaga cccatacata 300
gtagttaccc tcaaagccgg cgacaacctg aaaatcaaac aaaacaccaa tgaaaacacc 360
aatgccagta gcttcaccta ctcgctgaaa aaagacctca caggcctgat caatgttgaa 420
PL 216 780 B1
actgaaaaat tatcgtttgg cgcaaacggc aagaaagtca acatcataag cgacaccaaa 480
ggcttgaatt tcgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcatctgaac 540
ggtatcggtt cgactttgac egataegett gcgggttctt ctgcttctca cgttgatgcg 600
ggtaaccaaa gtacacatta cactcgtgca gcaagtatta aggatgtgtt gaatgcgggt 660
tggaatatta agggtgttaa aactggctca acaactggtc aatcagaaaa tgtcgatttc 720
gtccgcactt acgacacagt egagttettg agegeagata cgaaaacaac gactgttaat 780
gtggaaagca aagacaacgg caagagaacc gaagttaaaa tcggtgcgaa gacttctgtt 840
attaaagaaa aagacggtaa gttggttact ggtaaaggca aaggcgagaa tggttcttct 900
acagacgaag gcgaaggctt agtgactgca aaagaagtga ttgatgcagt aaacaaggct 960
ggttggagaa tgaaaacaac aaccgctaat ggtcaaacag gtcaagctga caagtttgaa 1020
accgttacat caggcacaaa tgtaaccttt gctagtggta aaggtacaac tgcgactgta 1080
agtaaagatg atcaaggcaa catcactgtt atgtatgatg taaatgtcgg cgatgcccta 1140
aacgtcaatc agctgcaaaa cagcggttgg aatttggatt ccaaagcggt tgcaggttct 1200
tcgggcaaag teateagegg caatgtttcg ccgagcaagg gaaagatgga tgaaaccgtc 1260
aacattaatg ccggcaacaa catcgagatt agccgcaacg gtaaaaatat cgacatcgcc 1320
acttcgatgg cgccgcagtt ttccagcgtt tcgctcggcg cgggggcaga tgcgcccact 1380
ttaagcgtgg atgacgaggg cgcgttgaat gteggeagea aggatgccaa caaacccgtc 1440
cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa gagggggatg ttacaaacgt cgcacaactt 1500
aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg 1560
ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatctgcc cggcaagagt 1620
atgatggcga teggeggegg cacttatcgc ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc 1680
agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1740
catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1779
<210> 22 <211> 1815 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>
<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(1815) <223> η oznacza jakikolwiek synonimiczny nukleotyd lub brak nukleotydu w odpowiednim miejscu którejkolwiek z SEQ ID NR:12-21 <400> 22 atgaacnaaa tatnncgcat catttggaat agngccctca atgcntgggt ngnngtatcc 60
PL 216 780 B1
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgnngaccgc cgtattggcg 120
acnctgntgt nngcaacggt tcaggcnant nctancnatn nngannnnnn nnnngannna 180
nanttagann ccgtnnnacg cnctgnnnnn gnrmnimnnn tnnnnnncnn tanngaaggc 240
anngnngaan nngaannnnn annnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnannn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntnaccctc aaagccggcg acaacctgaa aatcaaacaa 360
ancnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ncttcaccta ctcnctgaaa 420
aaaganctna nagnnctgan cantgttgna actgaaaaat tatcgtttng cgcaaacngn 480
aanaaagtca acatcanaag cgacaccaaa ggcttgaatt tngcgaaana aacggctgng 540
acnaacggcg acnccacggt tcatctgaac ggtatnggtt cgactttgac cgatangctn 600
nngnntncnn nngcnncnnn nnnngnnncn nnnnacnann ntacnnatna cnnnnnnann 660
cgtgcngcaa gnnttaanga ngtnttnaan gcnggntgga anattaangg ngttaaancn 720
ggnncaacan ctnnnnnntc nganaangtn gatttcgtcc ncacttacga cacagtcgag 780
ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag 840
anaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact tctgttatna aagaaaaaga cggtaagttg 900
gttactggta aagncaaagn cgagaatgnt tcttctacag acnaaggcga aggcttagtg 960
actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc 1020
gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag tttgaaaccg ttacatcagg cacaaangta 1080
acctttgcta gtggtaangg tacaactgcg actgtaagta aagatgatca aggcaacatc 1140
actgttangt atgatgtaaa tgtcggcgat gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc 1200
ggttggaatt tggattccaa agcggttgca ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat 1260
gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc 1320
gagattancc gcaacggnaa aaatatcgac atcgccactt cgatgncncc gcanttttcc 1380
agcgtttcgc tcggngcggg ggcngatgcg cccactttna gcgtggatnn nnnggncgcn 1440
ttgaatgtcg gcagcaagna nnncaacaaa cccgtccgca ttaccaatgt cgccccgggc 1500
gttaaagagg gggatgttac aaacgtcgcn caacttaaag gngtggcgca aaacttgaac 1560
aaccncatcg acaatgtgna cggcaacgcg cgngcgggna tcgcccaagc gattgcaacc 1620
gcaggtntng ntcaggcnta tntgcccggc aagagtatga tggcgatcgg cggcgnnact 1680
tatcncggcg aagccggtta ngccatcggc tactcnagna tttcngncnn nggnaattgg 1740
nttatcaang gcacggcttc cggcaattcg cgcggncatt tcggtncttc cgcatctgtc 1800
ggttatcant ggtaa 1815
PL 216 780 B1 <210> 23 <211> 512 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 23
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln 35 40 45
Ala Ser Ala Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys 50 55 60
Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr 65 70 75 80
Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr ’ 85 90 95
Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu 100 105 110
Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp 115 120 125
Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp 130 135 140
Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp 145 150 155 160
Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys ~ 165 170 175
Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 180 185 190
Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys 195 200 205
Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu
PL 216 780 B1
210 215 220
Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys 225 230 235 240
Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin 245 250 255
Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala * 260 265 270
Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn 275 280 285
Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn 290 295 300
Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly 305 310 315 320
Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys 325 330 335
Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr 340 345 350
Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe 355 360 365
Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val 370 375 380
Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val 385 390 395 400
Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 405 410 415
Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 420 425 430
Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 435 440 445
Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 450 455 460
PL 216 780 B1
Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser
465 470 475 480
Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly
485 490 495
Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp
500 505 510 <210> 24 <211> 513 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis
<400> 24
Met 1 Asn Lys Ile Tyr 5 Arg Ile Ile Trp Asn 10 Ser Ala Leu Asn Ala 15 Trp
Val Ala Val Ser 20 Glu Leu Thr Arg Asn 25 His Thr Lys Arg Ala 30 Ser Ala
Thr val Lys 35 Thr Ala Val Leu Ala 40 Thr Leu Leu Phe Ala 45 Thr Val Gin
Ala Asn 50 Ala Thr Asp Glu Thr 55 Gly Leu Ile Asn Val 60 Glu Thr Glu Lys
Leu 65 Ser Phe Gly Ala Asn 70 Gly Lys Lys Val Asn 75 Ile Ile Ser Asp Thr 80
Lys Gly Leu Asn Phe 85 Ala Lys Glu Thr Ala 90 Gly Thr Asn Gly Asp 95 Thr
Thr Val His Leu 100 Asn Gly Ile Gly Ser 105 Thr Leu Thr Asp Met 110 Leu Leu
Asn Thr Gly 115 Ala Thr Thr Asn Val 120 Thr Asn Asp Asn Val 125 Thr Asp Asp
Glu Lys 130 Lys Arg Ala Ala Ser 135 Val Lys Asp Val Leu 140 Asn Ala Gly Trp
Asn 145 Ile Lys Gly Val Lys 150 Pro Gly Thr Thr Ala 155 Ser Asp Asn Val Asp 160
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
405 410 415
Asn Val Ala Gin 420 Leu Lys Gly Val Ala 425 Gin Asn Leu Asn Asn 430 Arg Ile
Asp Asn Val 435 Asn Gly Asn Ala Arg 440 Ala Gly Ile Ala Gin 445 Ala Ile Ala
Thr Ala 450 Gly Leu Val Gin Ala 455 Tyr Leu Pro Gly Lys 460 Ser Met Met Ala
Ile 465 Gly Gly Gly Thr Tyr 470 Leu Gly Glu Ala Gly 475 Tyr Ala Ile Gly Tyr 480
Ser Ser Ile Ser Ala 485 Gly Gly Asn Trp Ile 490 Ile Lys Gly Thr Ala 495 Ser
Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin
500 505 510
Trp <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis
<400> 25
Met 1 Asn Lys Ile Tyr 5 Arg Ile Ile Trp Asn 10 Ser Ala Leu Asn Ala 15 Trp
Val Val Val Ser 20 Glu Leu Thr Arg Asn 25 His Thr Lys Arg Ala 30 Ser Ala
Thr Val Lys 35 Thr Ala Val Leu Ala 40 Thr Leu Leu Phe Ala 45 Thr Val Gin
Ala Ser 50 Ala Asn Asn Val Asp 55 Phe Val Arg Thr Tyr 60 Asp Thr Val Glu
Phe 65 Leu Ser Ala Asp Thr 70 Lys Thr Thr Thr Val 75 Asn Val Glu Ser Lys 80
Asp Asn Gly Lys Lys 85 Thr Glu Val Lys Ile 90 Gly Ala Lys Thr Ser 95 Val
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 340 345 350
Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 355 360 365
Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 370 375 380
Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser 385 390 395 400
Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 405 <210> 26 <211> 433 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 26
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45
Ala Ser Ala Asn Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 50 55 60
Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 65 70 75 80
Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 85 90 95
Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 100 105 110
Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 115 120 125
Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 130 135 140
PL 216 780 B1
Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 145 150 155 160
Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 165 170 175
Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 180 185 190
Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 195 200 205
Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 210 215 220
Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 225 230 235 240
Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 245 250 255
Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile * 260 265 270
Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 275 280 285
Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 290 295 300
Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro 305 310 315 320
Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr 325 330 335
Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile 340 345 350
Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala 355 360 365
Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala 370 375 380
PL 216 780 B1
Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr
385 390 395 400
Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser
405 410 415
Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln
420 425 430
Trp <210> 27 <211> 502 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 27
Met 1 Asn Lys Ile Tyr 5 Arg Ile Ile Trp Asn 10 Ser Ala Leu Asn Ala 15 Trp
Val Val Val Ser 20 Glu Leu Thr Arg Asn 25 His Thr Lys Arg Ala 30 Ser Ala
Thr Val Lys 35 Thr Ala Val Leu Ala 40 Thr Leu Leu Phe Ala 45 Thr Val Gln
Ala Ser 50 Ala Asn Thr Leu Lys 55 Ala Gly Asp Asn Leu 60 Lys Ile Lys Gln
Phe 65 Thr Tyr Ser Leu Lys 70 Lys Asp Leu Thr Asp 75 Leu Thr Ser Val Gly 80
Thr Glu Lys Leu Ser 85 Phe Ser Ala Asn Gly 90 Asn Lys Val Asn Ile 95 Thr
Ser Asp Thr Lys 100 Gly Leu Asn Phe Ala 105 Lys Glu Thr Ala Gly 110 Thr Asn
Gly Asp Thr 115 Thr Val His Leu Asn 120 Gly Ile Gly Ser Thr 125 Leu Thr Asp
Arg Ala 130 Ala Ser Val Lys Asp 135 Val Leu Asn Ala Gly 140 Trp Asn Ile Lys
Gly Val Lys Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn * 405 410 415
Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 420 425 430
Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 435 440 445
Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 450 455 460
Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile 465 470 475 480
Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 485 490 495
Ser Val Gly Tyr Gin Trp 500
<210> 28 <211> 1539 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 28 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aaacagatct gaccagtgtt 180
ggaactgaaa aattatcgtt tagcgcaaac ggcaataaag tcaacatcac aagcgacacc 240
aaaggcttga attttgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 300
aacggtattg gttcgacttt gaccgatacg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 360
accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa agacgtatta 420
aacgctggct ggaacattaa aggcgttaaa cccggtacaa cagcttccga taacgttgat 480
ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt 540
aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa accgaagtta aaatcggtgc gaagacttct 600
gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt actggtaaag acaaaggcga gaatggttct 660
tctacagacg aaggcgaagg cttagtgact gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag 720
gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt 780
PL 216 780 B1
gaaaccgtta catcaggcac aaatgtaacc tttgctagtg gtaaaggtac aactgcgact 840
gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact gttatgtatg atgtaaatgt cggcgatgcc 900
ctaaacgtca atcagctgca aaacagcggt tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt 960
tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc 1020
gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag attacccgca acggtaaaaa tatcgacatc 1080
gccacttcga tgaccccgca gttttccagc gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc 1140
actttgagcg tggatgggga cgcattgaat gtcggcagca agaaggacaa caaacccgtc 1200
cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa gagggggatg ttacaaacgt cgcacaactt 1260
aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg 1320
ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt ctggttcagg cgtatttgcc cggcaagagt 1380
atgatggcga tcggcggcgg cacttatcgc ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc 1440
agtatttccg acggcggaaa ttggattatc aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc 1500
catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat cagtggtaa 1539
<210> 29 <211> 1542 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 29
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg aaacaggcct gatcaatgtt 180
gaaactgaaa aattatcgtt tggcgcaaac ggcaagaaag tcaacatcat aagcgacacc 240
aaaggcttga atttcgcgaa agaaacggct gggacgaacg gcgacaccac ggttcatctg 300
aacggtatcg gttcgacttt gaccgatatg ctgctgaata ccggagcgac cacaaacgta 360
accaacgaca acgttaccga tgacgagaaa aaacgtgcgg caagcgttaa agacgtatta 420
aacgcaggct ggaacattaa aggcgttaaa cccggtacaa cagcttccga taacgttgat 480
ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt 540
aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa accgaagtta aaatcggtgc gaagacttct 600
gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt actggtaaag gcaaaggcga gaatggttct 660
tctacagacg aaggcgaagg cttagtgact gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag 720
gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt 780
gaaaccgtta catcaggcac aaaagtaacc tttgctagtg gtaatggtac aactgcgact 840
PL 216 780 B1
gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact gttaagtatg atgtaaatgt cggcgatgcc 900
ctaaacgtca atcagctgca aaacagcggt tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt 960
tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc 1020
gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag attacccgca acggcaaaaa tatcgacatc 1080
gccacttcga tgaccccgca attttccagc gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc 1140
actttaagcg tggatgacga gggcgcgttg aatgtcggca gcaaggatgc caacaaaccc 1200
gtccgcatta ccaatgtcgc cccgggcgtt aaagaggggg atgttacaaa cgtcgcgcaa 1260
cttaaaggtg tggcgcaaaa cttgaacaac cgcatcgaca atgtgaacgg caacgcgcgt 1320
gcgggcatcg cccaagcgat tgcaaccgca ggtctggttc aggcgtatct gcccggcaag 1380
agtatgatgg cgatcggcgg cggcacttat ctcggcgaag ccggttatgc catcggctac 1440
tcaagcattt ccgccggcgg aaattggatt atcaaaggca cggcttccgg caattcgcgc 1500
ggccatttcg gtgcttccgc atctgtcggt tatcagtggt aa 1542
<210> 30 <211> 1224 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 30
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaacg ttgatttcgt ccgcacttac 180
gacacagtcg agttcttgag cgcagatacg aaaacaacga ctgttaatgt ggaaagcaaa 240
gacaacggca agaaaaccga agttaaaatc ggtgcgaaga cttctgttat taaagaaaaa 300
gacggtaagt tggttactgg taaagacaaa ggcgagaatg gttcttctac agacgaaggc 360
gaaggcttag tgactgcaaa agaagtgatt gatgcagtaa acaaggctgg ttggagaatg 420
aaaacaacaa ccgctaatgg tcaaacaggt caagctgaca agtttgaaac cgttacatca 480
ggcacaaatg taacctttgc tagtggtaaa ggtacaactg cgactgtaag taaagatgat 540
caaggcaaca tcactgttat gtatgatgta aatgtcggcg atgccctaaa cgtcaatcag 600
ctgcaaaaca gcggttggaa tttggattcc aaagcggttg caggttcttc gggcaaagtc 660
atcagcggca atgtttcgcc gagcaaggga aagatggatg aaaccgtcaa cattaatgcc 720
ggcaacaaca tcgagattac ccgcaacggt aaaaatatcg acatcgccac ttcgatgacc 780
ccgcagtttt ccagcgtttc gctcggcgcg ggggcggatg cgcccacttt gagcgtggat 840
ggggacgcat tgaatgtcgg cagcaagaag gacaacaaac ccgtccgcat taccaatgtc 900
PL 216 780 B1
gccccgggcg ttaaagaggg ggatgttaca aacgtcgcac aacttaaagg cgtggcgcaa 960
aacttgaaca accgcatcga caatgtggac ggcaacgcgc gtgcgggcat cgcccaagcg 1020
attgcaaccg caggtctggt tcaggcgtat ttgcccggca agagtatgat ggcgatcggc 1080
ggcggcactt atcgcggcga agccggttac gccatcggct actccagtat ttccgacggc 1140
ggaaattgga ttatcaaagg cacggcttcc ggcaattcgc gcggccattt cggtgcttcc 1200
gcatctgtcg gttatcagtg gtaa 1224
<210> 31 <211> 1302 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 31
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaaccgtg cggcaagcgt taaagacgta 180
ttaaacgctg gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt 240
gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact 300
gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag aaaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact 360
tctgttatta aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aagacaaagg cgagaatggt 420
tcttctacag acgaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac 480
aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag 540
tttgaaaccg ttacatcagg cacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaactgcg 600
actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttatgt atgatgtaaa tgtcggcgat 660
gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca 720
ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa 780
accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggtaa aaatatcgac 840
atcgccactt cgatgacccc gcagttttcc agcgtttcgc tcggcgcggg ggcggatgcg 900
cccactttga gcgtggatgg ggacgcattg aatgtcggca gcaagaagga caacaaaccc 960
gtccgcatta ccaatgtcgc cccgggcgtt aaagaggggg atgttacaaa cgtcgcacaa 1020
cttaaaggcg tggcgcaaaa cttgaacaac cgcatcgaca atgtggacgg caacgcgcgt 1080
gcgggcatcg cccaagcgat tgcaaccgca ggtctggttc aggcgtattt gcccggcaag 1140
agtatgatgg cgatcggcgg cggcacttat cgcggcgaag ccggttacgc catcggctac 1200
tccagtattt ccgacggcgg aaattggatt atcaaaggca cggcttccgg caattcgcgc 1260
PL 216 780 B1 ggccatttcg gtgcttccgc atctgtcggt tatcagtggt aa 1302 <210> 32 <211> 1509 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 32
atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc 60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg 120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaccc tcaaagccgg cgacaacctg 180
aaaatcaaac aattcaccta ctcgctgaaa aaagacctca cagatctgac cagtgttgga 240
actgaaaaat tatcgtttag cgcaaacggc aataaagtca acatcacaag cgacaccaaa 300
ggcttgaatt ttgcgaaaga aacggctggg acgaacggcg acaccacggt tcatctgaac 360
ggtattggtt cgactttgac cgatcgtgcg gcaagcgtta aagacgtatt aaacgctggc 420
tggaacatta aaggcgttaa aaacgttgat ttcgtccgca cttacgacac agtcgagttc 480
ttgagcgcag atacgaaaac aacgactgtt aatgtggaaa gcaaagacaa cggcaagaaa 540
accgaagtta aaatcggtgc gaagacttct gttattaaag aaaaagacgg taagttggtt 600
actggtaaag acaaaggcga gaatggttct tctacagacg aaggcgaagg cttagtgact 660
gcaaaagaag tgattgatgc agtaaacaag gctggttgga gaatgaaaac aacaaccgct 720
aatggtcaaa caggtcaagc tgacaagttt gaaaccgtta catcaggcac aaatgtaacc 780
tttgctagtg gtaaaggtac aactgcgact gtaagtaaag atgatcaagg caacatcact 840
gttatgtatg atgtaaatgt cggcgatgcc ctaaacgtca atcagctgca aaacagcggt 900
tggaatttgg attccaaagc ggttgcaggt tcttcgggca aagtcatcag cggcaatgtt 960
tcgccgagca agggaaagat ggatgaaacc gtcaacatta atgccggcaa caacatcgag 1020
attacccgca acggtaaaaa tatcgacatc gccacttcga tgaccccgca gttttccagc 1080
gtttcgctcg gcgcgggggc ggatgcgccc actttgagcg tggatgggga cgcattgaat 1140
gtcggcagca agaaggacaa caaacccgtc cgcattacca atgtcgcccc gggcgttaaa 1200
gagggggatg ttacaaacgt cgcacaactt aaaggcgtgg cgcaaaactt gaacaaccgc 1260
atcgacaatg tggacggcaa cgcgcgtgcg ggcatcgccc aagcgattgc aaccgcaggt 1320
ctggttcagg cgtatttgcc cggcaagagt atgatggcga tcggcggcgg cacttatcgc 1380
ggcgaagccg gttacgccat cggctactcc agtatttccg acggcggaaa ttggattatc 1440
aaaggcacgg cttccggcaa ttcgcgcggc catttcggtg cttccgcatc tgtcggttat 1500
cagtggtaa 1509
PL 216 780 B1 <210> 33 <211> 540 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 33
Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Tyr Leu Tyr Leu His Pro Val Gin Arg 15 10 15
Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly Ala Gly Glu 20 25 30
Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr Phe Asn Glu 35 40 45
Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 50 55 60
Leu Lys Ile Lys Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80
Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe Ser 85 90 95
Ala His Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110
Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125
Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140
Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160
Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175
Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190
Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val “ ' 195 200 205
PL 216 780 B1
Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly 210 215
Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 220
Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu 225 230
Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 235 240
Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser 245
Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 250 255
Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp 260
Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 265 270
Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly 275 280
Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 285
Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn 290 295
Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly 300
Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp 305 310
Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met 315 320
Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala 325
Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 330 335
Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys 340
Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 345 350
Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro 355 360
Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 365
Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn 370 375
Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 380
Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met 385 390
Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 395 400
Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro 405
Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala 410 415
Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp 420
Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn 425 430
Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly 435 440
Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu 445
Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn
Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly
PL 216 780 B1
450 455 460
Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val 465 470 475 480
Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr 485 490 495
Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp 500 505 510
Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly 515 520 525
His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp 530 535 540 <210> 34 <211> 541 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 34
Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gln Arg Ser Val 15 10 15
Val Gly Ser Ile Gln Ala Ser Met Glu Gly Ser Val Glu Leu Glu Thr 20 25 30
Ile Ser Leu Ser Met Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val Asp Pro Tyr 35 40 45
Ile Val Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn 50 55 60
Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80
Asp Leu Thr Gly Leu Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 85 90 95
Ala Asn Gly Lys Lys Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110
Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125
PL 216 780 B1
Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140
Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160
Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175
Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190
Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val J ' 195 200 205
Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 210 215 220
Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 225 230 235 240
Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 245 250 255
Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 260 265 270
Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 275 280 285
Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 290 295 300
Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys 305 310 315 320
Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn ' 325 330 335
Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 340 345 350
Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 355 360 365
PL 216 780 B1
Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 370 375 380
Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 385 390 395 400
Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 405 410 415
Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 420 425 430
Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Vał Ala Gin 435 440 445
Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 450 455 460
Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 465 470 475 480
Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 485 490 495
Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 500 505 510
Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 515 520 525
Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 530 535 540 <210> 35 <211> 461 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 35
Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe 15 10 15
Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu 20 25 30
Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His 35 40 45
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 295 Asn Ile Glu Ile 300 Thr Arg Asn Gly
290
Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val
305 310 315 320
Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp
325 330 335
Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr
340 345 350
Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin
355 360 365
Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp
370 375 380
Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu
385 390 395 400
Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly
405 410 415
Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser
420 425 430
Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg
435 440 445
Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp
450 455 460 <210> 36 <211> 462 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis
<400> : 36
Thr 1 Asp Glu Thr Gly 5 Leu Ile Asn Val Glu 10 Thr Glu Lys Leu Ser 15 Phe
Gly Ala Asn Gly 20 Lys Lys Val Asn Ile 25 Ile Ser Asp Thr Lys 30 Gly Leu
Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His
PL 216 780 B1
40 45
Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly 50 55 60
Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys 65 70 75 80
Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 85 90 95
Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg 100 105 110
Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr 115 120 125
Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile 130 135 140
Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr 145 150 155 160
Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly 165 170 175
Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp 180 185 190
Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys 195 200 205
Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn 210 215 220
Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val 225 230 235 240
Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln 245 250 255
Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly 260 265 270
Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu 275 280 285
PL 216 780 B1
Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly 290 295 300
Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val 305 310 315 320
Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu J 325 330 335
Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile 340 345 350
Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala 355 360 365
Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val 370 375 380
Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly 385 390 395 400
Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly 405 410 415
Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile “ 420 425 430
Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser 435 440 445
Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 450 455 460 <210> 37 <211> 356 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 37
Asn Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser 15 10 15
Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly ‘ 20 25 30
PL 216 780 B1
Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu 35 40 45
Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser 50 55 60
Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp 65 70 75 80
Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly 85 90 95
Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn 100 105 110
Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp 115 120 125
Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala 130 135 140
Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys 145 150 155 160
Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro 165 170 175
Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn 180 185 190
Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met 195 200 205
Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro 210 215 220
Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp 225 230 235 240
Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly 245 250 255
Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn 260 265 270
Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin
PL 216 780 B1
275 280 285
Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser
290 295 300
Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala
305 310 315 320
Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly
325 330 335
Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val
340 345 350
Gly Tyr Gin Trp
355 <210> 38 <211> 382 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 38
Asn 1 Arg Ala Ala Ser 5 Val Lys Asp Val Leu 10 Asn Ala Gly Trp Asn 15 Ile
Lys Gly Val Lys 20 Pro Gly Thr Thr Ala 25 Ser Asp Asn Val Asp 30 Phe Val
Arg Thr Tyr 35 Asp Thr Val Glu Phe 40 Leu Ser Ala Asp Thr 45 Lys Thr Thr
Thr Val 50 Asn Val Glu Ser Lys 55 Asp Asn Gly Lys Lys 60 Thr Glu Val Lys
Ile 65 Gly Ala Lys Thr Ser 70 Val Ile Lys Glu Lys 75 Asp Gly Lys Leu Val 80
Thr Gly Lys Asp Lys 85 Gly Glu Asn Gly Ser 90 Ser Thr Asp Glu Gly 95 Glu
Gly Leu Val Thr 100 Ala Lys Glu Val Ile 105 Asp Ala Val Asn Lys 110 Ala Gly
Trp Arg Met 115 Lys Thr Thr Thr Ala 120 Asn Gly Gin Thr Gly 125 Gin Ala Asp
PL 216 780 B1
PL 216 780 B1
Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 370 375 380 <210> 39 <211> 201 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 39
Ser Ala Asn Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Phe 15 10 15
Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr 20 25 30
Glu Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser 35 40 45
Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly 50 55 60
Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Arg 65 70 75 80
Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 85 90 95
Val Lys Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 100 105 110
Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 115 120 125
Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 130 135 140
Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly 145 150 155 160
Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 165 170 175
Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 180 185 190
Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 195 200
PL 216 780 B1 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 40 caattaacgg ccgaataaaa ggaagccgat atgaacaaaa tataccgcat c 51 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 41 tggaatccat ggaatcgcca cccttccctt c „<210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 42 ggtcagatct gtttcattgt tagcacttgc 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 43 gatcaggcct gtatcttcat cggtagcatt <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 44 gacgaaatca acgttcttag cacttgcctg aaccgttgc 39 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 45 aacgttgatt tcgtccgcac ttac <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Neisseria meningitidis
PL 216 780 B1
<210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <220>
<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(2) <223> X jesy jakimkolwiek aminokwasem lub oznacza brak aminokwasu <400> 52
Xaa Xaa Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr
10
100
PL 216 780 B1

Claims (28)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Wyizolowane białko zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:35.
  2. 2. Wyizolowane białko, znamienne tym, że ma sekwencję w 80% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych zastrz. 1, które jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
  3. 3. Wyizolowane białko, znamienne tym, że ma sekwencję w 90% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych zastrz. 1, które jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
  4. 4. Białko fuzyjne, znamienne tym, że zawiera partnera fuzyjnego oraz wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3.
  5. 5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedno wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3 albo białko fuzyjne określone w zastrz. 4, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
  6. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać szczepionki.
  7. 7. Przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, znamienny tym, że wiąże się z reagującym krzyżowo epitopem wyizolowanego białka określonego w jednym z zastrz. 1-3.
  8. 8. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3 lub białko fuzyjne określone w zastrz. 4.
  9. 9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:28.
  10. 10. Konstrukt ekspresyjny zawierający wyizolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. 8-9 funkcjonalnie połączony z promotorem.
  11. 11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
  12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że ma postać szczepionki.
  13. 13. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10.
  14. 14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że jest bakterią.
  15. 15. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że jest z gatunku Neisseria meningitidis.
  16. 16. Sposób wytwarzania rekombinowanego białka, znamienny tym, że obejmuje (i) hodowanie komórki gospodarza określonej w jednym z zastrz. 13-15, tak że w komórce gospodarza wyrażane jest rekombinowane białko, oraz (ii) izolowanie rekombinowanego białka.
  17. 17. Wyizolowane białko określone w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
  18. 18. Wyizolowane białko do zastosowania według zastrz. 17, znamienne tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
  19. 19. Białko fuzyjne określone w zastrz. 4 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
  20. 20. Białko fuzyjne do zastosowania według zastrz. 19, znamienne tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
  21. 21. Konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
  22. 22. Konstrukt ekspresyjny do zastosowania według zastrz. 21, znamienny tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
  23. 23. Sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, w której podejrzewa się jej obecność, znamienny tym, że obejmuje (i) łączenie przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 7 z próbką biologiczną uzyskaną od ssaka, oraz
    PL 216 780 B1
    101 (ii) wykrywanie swoiście związanego przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wskazującego na obecność N. meningitidis.
  24. 24. Sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis u ssaka, znamienny tym, że obejmuje (i) kontaktowanie próbki biologicznej uzyskanej od osobnika z wyizolowanym białkiem określonym w jednym z zastrz. 1-3 albo białkiem fuzyjnym określonym w zastrz. 4, oraz (ii) wykrywanie obecności lub nieobecności we wspomnianej próbce kompleksu utworzonego pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym oraz przeciwciałami specyficznymi dla N. meningitidis, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na występowanie zakażenia.
  25. 25. Sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, znamienny tym, że obejmuje etap wykorzystania wyizolowanego kwasu nukleinowego określony w zastrzeżeniu 8 albo 9 dla wykrycia obecności N. meningitidis w próbce biologicznej.
  26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że próbka pochodzi od człowieka.
  27. 27. Zastosowanie wyizolowanego białka określonego w jednym zastrz. 1-3 albo białka fuzyjnego określonego w zastrz. 4 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.
  28. 28. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego określonego w zastrz. 10 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.
PL356819A 2000-01-25 2001-01-25 Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego PL216780B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17791700P 2000-01-25 2000-01-25
PCT/AU2001/000069 WO2001055182A1 (en) 2000-01-25 2001-01-25 PROTEINS COMPRISING CONSERVED REGIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS SURFACE ANTIGEN NhhA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL356819A1 PL356819A1 (pl) 2004-07-12
PL216780B1 true PL216780B1 (pl) 2014-05-30

Family

ID=22650445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL356819A PL216780B1 (pl) 2000-01-25 2001-01-25 Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego

Country Status (18)

Country Link
US (4) US7947291B2 (pl)
EP (2) EP1252182B1 (pl)
JP (3) JP2003523208A (pl)
KR (1) KR100698561B1 (pl)
CN (2) CN1419564A (pl)
AU (1) AU2818101A (pl)
BR (1) BR0107857A (pl)
CA (1) CA2398139A1 (pl)
CZ (1) CZ304379B6 (pl)
ES (1) ES2389719T3 (pl)
HU (1) HUP0300696A3 (pl)
IL (2) IL150822A0 (pl)
MX (1) MXPA02007184A (pl)
NO (1) NO332229B1 (pl)
NZ (1) NZ520445A (pl)
PL (1) PL216780B1 (pl)
WO (1) WO2001055182A1 (pl)
ZA (1) ZA200206153B (pl)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1047784E (pt) * 1998-01-14 2009-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Antigénios de neisseria meningitidis
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
ES2397918T3 (es) * 1999-04-30 2013-03-12 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Antígenos Neisseriales conservados
CN100338218C (zh) * 1999-05-19 2007-09-19 启龙股份公司 组合式奈瑟球菌组合物
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
CN1419564A (zh) * 2000-01-25 2003-05-21 昆士兰大学 包含脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守区域的蛋白质
EP2270030B1 (en) * 2000-02-28 2012-05-23 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Heterologous expression of Neisserial proteins
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
GB0220199D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Univ Utrecht Mutant protein and refolding method
TWI360424B (en) * 2002-08-02 2012-03-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
PT1549338E (pt) 2002-10-11 2011-02-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Vacinas polipeptídicas para protecção alargada contra linhagens meningocócicas hipervirulentas
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
WO2007042326A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Intercell Ag Neisseria meningitidis antigens
JP5275983B2 (ja) 2006-06-12 2013-08-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
JP2012512240A (ja) 2008-12-17 2012-05-31 ノバルティス アーゲー ヘモグロビン受容体を含む髄膜炎菌ワクチン
US20120070458A1 (en) 2009-03-24 2012-03-22 Novartis Ag Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
WO2011024071A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
NZ622048A (en) 2009-08-27 2015-10-30 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
CN102724988B (zh) 2009-09-30 2014-09-10 诺华股份有限公司 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达
BR112012010531A2 (pt) 2009-10-27 2019-09-24 Novartis Ag "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp"
EP2544713A1 (en) 2010-03-10 2013-01-16 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
JP2013522177A (ja) 2010-03-11 2013-06-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム グラム陰性細菌性、例えば髄膜炎菌性の感染または疾患に対する免疫原性組成物またはワクチン
CN102802662A (zh) 2010-03-18 2012-11-28 诺华有限公司 用于脑膜炎球菌血清组b的含佐剂疫苗
AU2011268507B2 (en) 2010-06-25 2014-08-14 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor H binding proteins
EP2598521A4 (en) * 2010-07-30 2014-03-19 Univ Griffith RECOMBINANT NEISSERIA MENINGITIDIS-POR-A-PORIN PROTEINS
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
WO2012032498A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Novartis Ag Developments in meningococcal outer membrane vesicles
WO2012054879A1 (en) * 2010-10-22 2012-04-26 Duke University Compositions and methods for the treatment of septic arthritis, osteomyelitis, and bacteremia
US20150147356A1 (en) 2011-05-12 2015-05-28 Alan Kimura Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
CA2862247A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
AU2013214105A1 (en) 2012-02-02 2014-07-24 Novartis Ag Promoters for increased protein expression in meningococcus
ES2750366T3 (es) 2012-03-08 2020-03-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Ensayo de potencia in vitro para vacunas meningocócicas basadas en proteína
CN104602704B (zh) 2012-06-14 2019-08-06 诺华股份有限公司 针对血清组x脑膜炎球菌的疫苗
CA2882619A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 Novartis Ag Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p
SG11201606478YA (en) 2014-02-28 2016-09-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Modified meningococcal fhbp polypeptides
CN110214022A (zh) 2016-11-25 2019-09-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性缀合物及其用途
BR112019010625A2 (pt) 2016-11-25 2019-10-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa conjugado imunogênico, processo para preparar o conjugado imunogênico, nomv-ligante intermediário, usos do mesmo e de nomv, composição imunogênica, e, vacina.
WO2024178355A1 (en) * 2023-02-24 2024-08-29 BioNTech SE Systems and methods for engineering synthetic antigens to promote tailored immune responses

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4843000A (en) 1979-12-26 1989-06-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4849338A (en) 1982-07-16 1989-07-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay
US4550081A (en) 1980-05-19 1985-10-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Non-reverting salmonella
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0273116A3 (en) * 1986-10-09 1990-05-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Gonococcal and meningococcal polypeptides, vaccines and diagnostics
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5785973A (en) 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
WO1989009385A1 (fr) 1988-03-24 1989-10-05 Zach, Johann Dispositif manometrique ou dynamometrique
EP0449958B9 (en) * 1988-12-19 2003-05-28 American Cyanamid Company Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
WO1992001813A1 (en) 1990-07-25 1992-02-06 Syngene, Inc. Circular extension for generating multiple nucleic acid complements
US5422252A (en) 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
US5646259A (en) 1995-03-24 1997-07-08 St. Louis University DNA encoding haemophilus adhesion proteins
US6143495A (en) 1995-11-21 2000-11-07 Yale University Unimolecular segment amplification and sequencing
GB9611673D0 (en) * 1996-06-05 1996-08-07 Peptide Therapeutics Ltd Meningococcal vaccine
EP1900818A3 (en) 1997-11-06 2008-06-11 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisserial antigens
GB9726398D0 (en) * 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
PT1047784E (pt) 1998-01-14 2009-12-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Antigénios de neisseria meningitidis
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
GB9810276D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
WO2000061165A1 (en) * 1999-04-13 2000-10-19 Smithkline Beecham Corporation Conserved adhesin motif and methods of use thereof
ES2397918T3 (es) 1999-04-30 2013-03-12 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Antígenos Neisseriales conservados
WO2000066791A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Chiron Corporation Neisseria genomic sequences and methods of their use
GB9916529D0 (en) * 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
CN1419564A (zh) * 2000-01-25 2003-05-21 昆士兰大学 包含脑膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守区域的蛋白质
TWI360424B (en) * 2002-08-02 2012-03-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US7628995B2 (en) * 2003-12-23 2009-12-08 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Outer membrane vesicles and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CZ304379B6 (cs) 2014-04-09
JP2012051902A (ja) 2012-03-15
KR100698561B1 (ko) 2007-03-21
PL356819A1 (pl) 2004-07-12
BR0107857A (pt) 2002-10-29
US20090068216A1 (en) 2009-03-12
NO20023487D0 (no) 2002-07-22
EP2395013A3 (en) 2012-03-21
NZ520445A (en) 2004-02-27
EP1252182A1 (en) 2002-10-30
US8367070B2 (en) 2013-02-05
EP1252182A4 (en) 2005-03-02
NO332229B1 (no) 2012-08-06
KR20020065938A (ko) 2002-08-14
HUP0300696A2 (hu) 2003-07-28
US20020160016A1 (en) 2002-10-31
CN1419564A (zh) 2003-05-21
JP2014024849A (ja) 2014-02-06
ES2389719T3 (es) 2012-10-30
JP2003523208A (ja) 2003-08-05
US20090068229A1 (en) 2009-03-12
IL150822A0 (en) 2003-02-12
HUP0300696A3 (en) 2004-10-28
US7947291B2 (en) 2011-05-24
CN102417537A (zh) 2012-04-18
EP2395013A2 (en) 2011-12-14
US8383790B2 (en) 2013-02-26
IL150822A (en) 2011-06-30
MXPA02007184A (es) 2004-02-26
NO20023487L (no) 2002-09-24
CZ20022482A3 (cs) 2003-01-15
ZA200206153B (en) 2003-11-03
EP1252182B1 (en) 2012-06-20
AU2818101A (en) 2001-08-07
CA2398139A1 (en) 2001-08-02
WO2001055182A1 (en) 2001-08-02
US20130136762A1 (en) 2013-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100698561B1 (ko) Neisseria Meningitidis 표면 항원ΝhhΑ의 보존 부위를 포함하는 단백질
JP4651703B2 (ja) 新規表面抗原
PL197449B1 (pl) Wyizolowane polipeptydy, immunogenne fragmenty tych polipeptydów, wyizolowane polinukleotydy, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza zawierająca taki wektor, sposób wytwarzania polipeptydu, sposób ekspresji polinukleotydu, kompozycja szczepionki, przeciwciało immunospecyficzne w stosunku do polipeptydu lub jego immunogennego fragmentu, sposób diagnozowania zakażenia Neisseria meningitidis, zastosowania kompozycji zawierającej polipeptyd lub jego immunogenny fragment, lub polinukleotyd i kompozycja terapeutyczna do leczenia choroby wywołanej przez Neisseria meningitidis
KR0170752B1 (ko) 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법
US9150621B2 (en) Mutant bacterial glycoproteins and uses thereof
AU2005202972B2 (en) Proteins comprising conserved regions of neisseria meningitidis surface antigen NhhA
US20030219454A1 (en) Haemagglutinin antigen
AU2001270348B2 (en) Haemagglutinin antigen
JP2013541322A (ja) 組換え髄膜炎菌(ナイセリア・メニンギティディス)PorAポーリンタンパク質
AU2001270348A1 (en) Haemagglutinin antigen
CZ2000530A3 (cs) Protein Neisserie vázající laktoferin

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140125