PL216780B1

PL216780B1 - Wyizolowane białka zawierające konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna, przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, wyizolowany kwas nukleinowy, konstrukt ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania rekombinowanego białka, sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta oraz zastosowanie wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego

Info

Publication number: PL216780B1
Application number: PL356819A
Authority: PL
Inventors: Ian Richardn Anselm Peak; Michael Paul Jennings
Original assignee: Univ Queensland Of Santa Lucia
Priority date: 2000-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2014-05-30
Also published as: CZ304379B6; JP2012051902A; KR100698561B1; PL356819A1; BR0107857A; US20090068216A1; NO20023487D0; EP2395013A3; NZ520445A; EP1252182A1; US8367070B2; EP1252182A4; NO332229B1; KR20020065938A; HUP0300696A2; US20020160016A1; CN1419564A; JP2014024849A; ES2389719T3; JP2003523208A

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku.

Wynalazek dotyczy wyizolowanego białka zawierającego konserwatywne obszary antygenu powierzchniowego NhhA z Neisseria meningitidis, białka fuzyjnego, kompozycji farmaceutycznej, przeciwciała monoklonalnego lub wiążącego antygen fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wyizolowanego kwasu nukleinowego, konstruktu ekspresyjnego, komórki gospodarza, sposobu wytwarzania rekombinowanego białka, sposobu wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej i sposobu diagnozowania zakażenia N. meningitidis oraz sposobu wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, jak również zastosowania wyizolowanego białka, białka fuzyjnego i konstruktu ekspresyjnego. Wynalazek umożliwia wywołanie krzyżowej, ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciw Neisseria meningitidis, dzięki czemu może być stosowany w diagnostyce, w terapeutycznych i profilaktycznych szczepionkach i w projektowaniu i/lub wyszukiwaniu leków. Wynalazek umożliwia ponadto, skutecznie immunizację przeciw szerszemu spektrum szczepów N. meningitidis niż oczekuje się w przypadku odpowiedniego antygenu powierzchniowego typu dzikiego.

Neisseria meningitidis jest bakterią Gram ujemną powodującą meningokokowe zapalenie opon i posocznicę. Jedynym znanym jej gospodarzem jest człowiek, u którego zarażenie może przebiegać bezobjawowo w przypadku około 10% populacji (Caugant i wsp., 1994, Journal of Clinical Microbiology 32 323).

N. meningitidis może tworzyć polisacharydową otoczkę i to umożliwia klasyfikowanie bakterii zgodnie z charakterem prezentowanego kapsydu. Istnieje przynajmniej dwanaście serotypów N. meningitidis. A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W135, X, Y i Z, spośród których serotypy A, B i C powodują 90% choroby meningokokowej (Poolman i wsp., 1995, Infectious Agents and Disease 4 13). Dostępne są szczepionki skierowane przeciw serotypom A i C, lecz w przypadku serotypu B polisacharydy kapsydu są słabo immunogenne i u człowieka nie wywołują odporności.

Co za tym idzie, sprawdzano inne składniki zewnątrzkomórkowe i błonowe pod względem użyteczności ich uwzględnienia w szczepionkach. Przykłady obejmują białka zewnątrzbłonowe klasy 1, 2 i 3 (poryny kodowane przez geny por) i klasy białek 4 (Rmp) i 5 (białka Opacity; kodowane przez geny opa i opc).

Jednakowoż, do chwili obecnej, żaden z tych kandydatów nie był w stanie wywołać pełnej ochrony, szczególnie u dzieci (Romera i wsp., 1994, Clinical Microbiology Review, 7 559; Poolman i wsp., 1995, powyżej).

Dla stworzenia skutecznej szczepionki konieczne jest zidentyfikowanie składników N. meningitidis występujących w większości szczepów i zdolnych do wywołania obronnej odpowiedzi immunologicznej (przykładowo bakteriobójcze przeciwciała).

Zgodnie z tym uczyniono odniesienie do publikacji międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/58683 i WO 99/57280, z których każda jest włączona tu przez odniesienie literaturowe i opisuje szereg białek będących kandydatami mogącymi być użytecznymi w szczepionkach dla szczepienia przeciw Neisseria meningitidis.

Zgodnie z tym szczególne odniesienie jest uczynione do publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/31132 i Peak i wsp., 2000, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 28:329 każda, włączona tu przez cytowanie, opisuje nowe antygeny powierzchniowe i ich alleliczne postaci, dla celów tego opisu oznaczone NhhA.

Podsumowanie wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest wyizolowane białko zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:35.

Korzystnie, wyizolowane białko ma sekwencję w 80% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych powyżej i jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.

Korzystnie, wyizolowane białko ma sekwencję w 90% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych powyżej, i jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.

Przedmiotem wynalazku jest również białko fuzyjne zawierające partnera fuzyjnego oraz wyizolowane białko określone powyżej.

PL 216 780 B1

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca co najmniej jedno wyizolowane białko albo białko fuzyjne określone powyżej, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna ma postać szczepionki.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego charakteryzujący się tym, że wiąże się z reagującym krzyżowo epitopem wyizolowanego białka określonego powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowany kwas nukleinowy, charakteryzujący się tym, że koduje wyizolowane białko lub białko fuzyjne określone powyżej.

Korzystnie, wyizolowany kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:28.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt ekspresyjny zawierający rolowany kwas nukleinowy określony powyżej, funkcjonalnie połączony z promotorem.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca konstrukt ekspresyjny określony powyżej oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.

Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna ma postać szczepionki.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza zawierająca konstrukt ekspresyjny określony powyżej.

Korzystnie, komórka gospodarza jest bakterią.

Korzystnie, komórka gospodarza jest z gatunku Neisseria meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rekombinowanego białka charakteryzujący się tym, że obejmuje (i) hodowanie komórki gospodarza określonej powyżej, tak że w komórce gospodarza wyrażane jest rekombinowane białko, oraz (ii) izolowanie rekombinowanego białka.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowane białko określone powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.

Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także białko fuzyjne określone powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.

Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt ekspresyjny określony powyżej do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.

Korzystnie, zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej w której podejrzewa się jej obecność, charakteryzujący się tym, że obejmuje (i) łączenie przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego określonego powyżej z próbką biologiczną uzyskaną od ssaka, oraz (ii) wykrywanie swoiście związanego przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wskazującego na obecność N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis u ssaka, znamienny tym, że obejmuje (i) kontaktowanie próbki biologicznej uzyskanej od osobnika z wyizolowanym białkiem albo białkiem fuzyjnym określonych powyżej, oraz (ii) wykrywanie obecności lub nieobecności we wspomnianej próbce kompleksu utworzonego pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym oraz przeciwciałami specyficznymi dla N. meningitidis, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na występowanie zakażenia.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, znamienny tym, że obejmuje etap wykorzystania wyizolowanego kwasu nukleinowego określony powyżej dla wykrycia obecności N. meningitidis W próbce biologicznej.

Korzystnie, próbka pochodzi od człowieka.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie wyizolowanego białka albo białka fuzyjnego określonych powyżej, do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie konstruktu ekspresyjnego określonego powyżej do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.

PL 216 780 B1

Niniejszy wynalazek ujawnia, że powierzchniowy antygen NhhA posiada obszary polipeptydu różniące się pomiędzy szczepami N. meningitidis i inne obszary, konserwatywne pomiędzy szczepami. Obszary zmienne mogą być immunogeniczne i wykazywać skłonność do wywoływania odpowiedzi odpornościowych specyficznych dla szczepu tak, że szczepionki zawierające antygen pochodzący ze szczególnego szczepu N. meningitidis wykazują skłonność do preferencyjnego wywoływania odporności przeciw szczególnemu szczepowi N. meningitidis. W konsekwencji sugerowane jest wytwarzanie zmodyfikowanego polipeptydu NhhA, który wywołuje reakcję odpornościową, która nie jest specyficzna względem szczepu, jak ta wywołana NhhA typu dzikiego. Zmodyfikowany antygen NhhA będzie użyteczny, jak to opisano poniżej, dla wytworzenia leczniczych i/lub profilaktycznych szczepionek przeciw N. meningitidis. Przez ukierunkowanie odpowiedzi immunologicznej pierwotnie przeciw konserwatywnym epitopom, szczepionki takie powinny skutecznie wywoływać odporność przeciw szerszemu zakresowi szczepów N. meningitidis niż w przypadku immunizacji NhhA typu dzikiego.

Białka według wynalazku posiadają, w porównaniu z odpowiadającymi im polipeptydami NhhA typu dzikiego, jedną lub więcej delecji niekonserwatywnych aminokwasów.

Dogodnie, białko według wynalazku jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Korzystnie, odpowiedź immunologiczna jest mniej specyficzna wobec szczepu niż wywołana przez wspomniany polipeptyd NhhA typu dzikiego.

Korzystniej, wspomniana odpowiedź immunologiczna dostarcza ochrony przeciw jednemu lub większej liczbie szczepów N. meningitidis lub jeszcze korzystniej wielu szczepom N. meningitidis.

Sekwencje polipeptydu NhhA typu dzikiego są przykładowo podane na Fig. 1 (SEQ ID NO:1 do 10).

Sekwencja najwyższej zgodności jest również podana na Fig. 1 (SEQ ID NO:1).

Wyizolowane białko według wynalazku korzystnie zawiera jeden lub więcej obszarów stałych polipeptydu NhhA, oznaczonych na Fig. 1 jako obszary C1, C2, C3, C4 i C5. Powinno być dostrzeżone, że zgodnie z tym aspektem, dogodnie jeden lub więcej niekonserwatywnych aminokwasów obszaru zmiennego polipeptydu NhhA oznaczonych jako obszar V1, V2, V3 lub V4 na Fig. 1 jest usuniętych w porównaniu z polipeptydem NhhA typu dzikiego.

Korzystnie usunięty jest obszar V1 lub przynajmniej istotna jego część.

W szczególnej postaci, wyizolowane białko może zawierać sekwencję aminokwasową przedstawioną na którejkolwiek z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:23 do 27), będących przykładem „zmodyfikowanych polipeptydów NhhA według wynalazku. Na Fig. 14 (SEQ ID NO:33 do 39) dostarczone są dalsze przykłady „dojrzałych polipeptydów przypuszczalnie z usuniętymi N-końcowymi sekwencjami sygnałowymi.

Zgodnie z drugim aspektem wynalazek dostarcza wyizolowanego kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd zgodny z pierwszym aspektem.

Sekwencje kwasu nukleinowego nhhA typu dzikiego podano przykładowo na Fig. 2 (SEQ ID NO:12 do 21).

Sekwencja kwasu nukleinowego najwyższej zgodności jest podana również na Fig. 2 (SEQ ID NO:22).

Korzystnie, obszary C1, C2, C3, C4 i C5 są kodowane odpowiednio przez sekwencje nukleotydowe podane na Fig. 2.

Korzystnie, obszary V1, V2, V3 i V4 są kodowane przez odpowiednie sekwencje nukleotydowe podane na Fig. 2.

W szczególnej postaci wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku może posiadać sekwencję jaką podano na którejkolwiek z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:28 do 32), będących szczególnymi przykładami „zmodyfikowanych kwasów nukleinowych nhhA według wynalazku.

Szczególnie, z zakresu wynalazku wyłączone są dzikiego typu polipeptydy NhhA i kwasy nukleinowe nhhA.

W trzecim aspekcie wynalazek dotyczy konstruktu ekspresyjnego obejmującego wektor ekspresyjny i kwas nukleinowy według drugiego aspektu, gdzie wspomniana sekwencja jest połączona funkcjonalnie z jednym lub większą ilością regulatorowych i kwasów nukleinowych wspomnianego wektora ekspresyjnego.

W piątym aspekcie wynalazku dostarczony jest sposób wytwarzania rekombinowanego wyizolowanego białka zgodnego z pierwszym aspektem wynalazku, obejmujący etapy:

(i) hodowania komórki gospodarza zawierającej wektor według trzeciego aspektu tak, że wspomniany polipeptyd jest wyrażany we wspomnianej komórce gospodarza i

PL 216 780 B1 (ii) izolowania wspomnianego zrekombinowanego polipeptydu.

W szóstym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywania N. meningitidis w próbkach biologicznych podejrzanych o ich przenoszenie, obejmujący etapy:

(i) łączenia wyżej wspomnianego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną i (ii) wykrycia swoiście związanego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała co wykazującego obecność N. meningitidis.

W siódmym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu diagnozowania u osobnika infekcji spowodowanej przez N. meningitidis, obejmującego etapy:

(i) kontaktowania próbki biologicznej z osobnika z wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym według wynalazku i (ii) określenie obecności lub nieobecności kompleksu pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem, białkiem fuzyjnym, a specyficznymi dla N. meningitidis przeciwciałami we wspomnianej próbce, gdzie występowanie wspomnianego kompleksu jest wskaźnikiem infekcji.

Korzystnie osobnik jest ssakiem.

Korzystniej osobnik jest człowiekiem.

W ósmym aspekcie wynalazku dostarczona jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyizolowane białko zgodne z pierwszym wspomnianym aspektem.

Korzystnie wspomniana kompozycja farmaceutyczna jest szczepionką.

Szczepionka może być zastosowana do zapobiegania u pacjenta infekcji N. meningitidis.

Krótki opis Fig. i Tabel.

Tabela 1: Identyfikacja aminokwasów z konserwatywnych regionów (C1, C2, C3, C4 i C5) i regionów zmiennych (V1, V2, V3, V3 i V4) polipeptydu NhhA, z każdego z dziesięciu (10) identycznych szczepów N. meningitidis. Podano również odpowiednie SEQ ID NO. Kolumna 1 = oznaczenie szczepu. SEQ ID NO:1-9 były wcześniej opisane w zależnym zgłoszeniu WO 99/31132; sekwencje

NhhA i nhhA szczepu Z2491 uzyskano z http://www.sanger.ac.Uk/Proiects/N meningitidis/; kolumna 2 = numeracja aminokwasu z rejonu C1; kolumna 3 = numeracja aminokwasu z rejonu V1; kolumna 4 = numeracja aminokwasu z rejonu C2; kolumna 5 = numeracja aminokwasu z rejonu V2; kolumna 6 = numeracja aminokwasu z rejonu C3; kolumna 7 = numeracja aminokwasu z rejonu V2; kolumna 8 = numeracja aminokwasu z rejonu C4; kolumna 9 = numeracja aminokwasu z rejonu V4; kolumna 10 = numeracja aminokwasu z rejonu C5. Uwaga podano również numerację sekwencji najwyższej zgodności (SEQ ID NO:11).

Tabela 2: Tabela podstawień aminokwasowych.

Fig. 1: Przyrównanie sekwencji aminokwasowej NhhA z dziesięciu (10) szczepów N. meningitidis (SEQ ID NO:1-10) wraz z sekwencją konsensusową (SEQ ID NO:11). Nazwy szczepów i sekwencje polipeptydowe użyte w przyrównaniu odpowiadają nazwom szczepu i SEQ ID NO z kolumny 1 Tabeli 1. Aminokwasy są wskazane w postaci typowych jednoliterowych skrótów. Aminokwasy konsensusowe są podane jedynie, gdy są całkowicie konserwatywne. Obszary konserwatywne (podwójne podkreślenie oznaczone C1, C2, C3, C4, C5) i obszary zmienne (pojedyncze podkreślenie, oznaczone V1, V2, V3, V4) są podane pod sekwencją konsensusową. Sekwencje aminokwasowe na tej figurze są zgodne z tabelą 1, jak podano poniżej: PMC21 = SEQ ID NO:1; H41 = SEQ ID NO:2; P20 = SEQ ID NO:3; EG327 = SEQ ID NO:4; EG329 = SEQ ID NO:5; H38 = SEQ ID NO:6; H15 = SEQ ID NO:7; BZ10 = SEQ ID NO:8; BZ198 = SEQ ID NO:9; Z2491 = SEQ ID NO:10 oraz sekwencja konsensusowa = SEQ ID NO:11.

Fig. 2: Przyrównanie sekwencji nukleotydowej kwasów nukleinowych nhhA z dziesięciu (10) szczepów N. meningitidis, gdzie sekwencje kodują sekwencje aminokwasowe z fig. 1. Obszary C1, C2, C3, C4, C5 i V1, V2, V3, V4 opisano na fig. 1 i w tabeli 1. Sekwencje kwasów nukleinowych na tej figurze są przypisane następująco PMC21 = SEQ ID NO:12; H41 = SEQ ID NO:13; P20 = SEQ ID NO:14; EG327 = SEQ ID NO:15; EG329 = SEQ ID NO:16; H38 = SEQ ID NO:17; H15 = SEQ ID NO:18; BZ10 = SEQ ID NO:19; BZ198 = SEQ ID NO:20; Z2491 = SEQ ID NO:21 oraz sekwencja konsensusowa = SEQ ID NO:22.

Fig. 3: Mapa plazmidu odpowiadająca pCO14K z produktem amplifikacji PCR kodującym dzikiego typu PMC21 NhhA połączone funkcjonalnie z promotorem porA. (nie narysowane w skali) 3A: wypełnione strzałki pokazują organizację genów porA i kanR w pCO14K. Jak pokazano dla amplifikacji genu nhhA ze szczepu PMC21 użyto oligonukleotydowe startery HOMP5' i ΗΟΜΡ3ΆΝ. Gen nhhA przedstawiono jako wykropkowaną strzałkę, promotor porA jako czarny prostokąt i miejsca restrykcyjne EagI i NcoI użyto dla zastąpienia porA przez nhhA jak to opisano w Przykładzie 2. 3B ułożenie

PL 216 780 B1 genów w pIP52 (PMC21), jak opisano w Przykładzie 2. Przedstawiono miejsce BgIII użyte dla konstrukcji mutanta jak to opisano w Przykładzie 4.

Fig. 4: Schematyczne przedstawienie strategii wydłużania przez PCR nachodzących na siebie fragmentów dla delecji specyficznych obszarów polipeptydów NhhA. Schemat dzikiego typu genu nhhA przedstawiono w górnej części Fig. A-C i zrekombinowany nhhA przedstawiono na dole tych Fig., z obszarami zmiennymi przedstawionymi jako czarne i obszarami stałymi przez niewypełnione prostokąty. Strzałki pokazują przybliżoną lokalizację starterów oligonukleotydowych. Pionowe kreskowane linie wskazują produkty amplifikacji. Gdy sekwencja oligonukleotydowa jest z obszarów nieciągłych kwasu nukleinowego nhhA to jest przedstawiona przez wykropkowaną linię pomiędzy takimi, nieciągłymi obszarami. Podano przybliżoną skalę. Podwójne, pionowe linie wskazują, że przedstawiono jedynie część obszaru C5. A: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 6. B: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 7. C: przedstawia strategię jaką opisano w Przykładzie 8.

Fig. 5: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:23) wytworzonego w Przykładzie 4 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:28).

Fig. 6: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA H41 (SEQ ID NO:24) wytworzonego w Przykładzie 5 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:29).

Fig. 7: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:25) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 6 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:30).

Fig. 8: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:26) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 7 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:31).

Fig. 9: (A) sekwencja aminokwasowa delecyjnego mutanta NhhA PMC 21 (SEQ ID NO:27) wytworzona przez PCR nachodzących na siebie fragmentów w Przykładzie 8 i (B) kodująca sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO:32).

Fig. 10: Przyrównanie sekwencji aminokwasowej typu dzikiego i sekwencji polipeptydów z delecjami. Polipeptydy te wytworzono jak to opisano w Przykładzie 2, Przykładzie 3, Przykładzie 4 i Przykładzie 5. Aminokwasy podano jako jednoliterowe skróty. Obszary konserwatywne oznaczone C1, C2, C3, C4 i C5 odpowiadają tym, które zdefiniowano w Tabeli 1, na Fig. 1 i które są podane przez podwójnie podkreślone pełnej długości sekwencje z H41 i PMC21 i obszary zmienne oznaczone V1, V2, V3 i V4 odpowiadające tym, zdefiniowanym w Tabeli 1 i Fig. 1 są podane przez podkreślone, pełnej długości sekwencje z H41 i PMC21.

Fig. 11: Przedstawia Western blot immunologiczny ujawniający nadekspresję NhhA. 45 μg całkowitego białka rozdzielono w 2-20% gradientowym SDS-PAGE przed przeniesieniem na filtr nitrocelulozowy jak to opisano w Przykładzie 9. Ścieżka 9: szczep P6 (nadekspresja PMC 21 NhhA jak opisano w Przykładzie 2). Ścieżka 3: szczep ΡΔ6 (nadekspresja skróconego PMC 21 NhhA opisanego w Przykładzie 4). Ścieżka 4: szczep H14 (nadekspresja H41 NhhA opisana w Przykładzie 3). Ścieżka 5: szczep ΗΔ8 (nadekspresja skróconego H41 NhhA opisanego w Przykładzie 5). Ścieżka 6: szczep 2A (NhhA ekspresja zniesiona przez mutację w genie NhhA jak opisano w Międzynarodowej Publikacji Patentowej WO 99/31132). Podano migrację standardów: 185 kDa, 119 kDa, 85 kDa, 62 kDa, 51,2 kDa, 38,2 kDa, 22,4 kDa. Niskiego typu polipeptyd NhhA występuje jako immunoreaktywne pasmo cząsteczki o wysokiej masie występujące w ścieżce 1, lecz którego brak w ścieżce 6.

Fig. 12: Wyizolowane polipeptydy NhhA z delecją. Polipeptydy NhhA wyizolowano jak to opisano w Przykładzie 9 przed rozdziałem w 4-20% SDS-PAGE. Żel poliakryloamidowy był barwiony barwnikiem Coomassie. Ścieżka 1: preparat OMC szczepu nadeksprymującego skrócony PMC21 polipeptydu NhhA opisany w Przykładzie 6. Ścieżka 2: oczyszczony, skrócony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 3: preparat OMC szczepu nadeksprymującego skrócony polipeptyd NhhA PMC21 opisany w Przykładzie 4. Ścieżka 4: oczyszczony, skrócony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 5: preparat OMC szczepu nadeksprymującego polipeptyd NhhA opisany w Przykładzie 2. Ścieżka 6: oczyszczony polipeptyd NhhA PMC21. Ścieżka 7: Standardy masy cząsteczkowej 173 kDa, 111 kDa, 80 kDa, 61 kDa, 49 kDa, 36 kDa. Uwaga reaktywne wysokocząsteczkowe rodzaje we wszystkich ścieżkach z wyjątkiem 6 przypuszczalnie przedstawiają multimerowe polipeptydy NhhA. Inne pasma są przypuszczalnie mniej stabilnymi postaciami NhhA lub produktami degradacji. Uwaga nie występują one w ścieżce 6.

Fig. 13: Western blot immunologiczny przeprowadzony przy pomocy mysiej surowicy przeciw białku NhhA. We wszystkich panelach ścieżki 1, 3, 5, 7 zawierają OMC szczepu nadeksprymującego

PL 216 780 B1 polipeptyd NhhA PMC21 i ścieżki 2, 4, 6 i 8 zawierają OMC szczepu 2A, który nie wyraża NhhA. Panel A: ścieżki 1 i 2: mysz A zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz A zaszczepiona NhhA PMC21 typu dzikiego w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6, mysz B zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz B zaszczepiona dzikiego typu NhhA PMC21 w rozcieńczeniu 1:10 000. Panel B: ścieżki 1 i 2: mysz C zaszczepiona skróconym polipeptydem NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz C zaszczepiona skróconym polipeptydem NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6: mysz D zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 4) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz D zaszczepiona skróconym PMC21 NhhA (Przykład 4) rozcieńczenie 1:1000. Panel C: Ścieżki 1 i 2 mysz E zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 3 i 4: mysz E zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:10 000. Ścieżki 5 i 6: mysz F zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000. Ścieżki 7 i 8: mysz F zaszczepiona skróconym NhhA PMC21 (Przykład 6) w rozcieńczeniu 1:1000.

Fig. 14: Wydedukowany delecyjny mutant polipeptydu NhhA. A: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 2 (SEQ ID NO:33); B: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 3 (SEQ ID NO:34); C: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 4 (SEQ ID NO:35); D: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 5 (SEQ ID NO:36); E: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 6 (SEQ ID NO:37); F: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 7 (SEQ ID NO:38) i G: wydedukowane dojrzałe białko opisane w Przykładzie 8 (SEQ ID NO:39).

Szczegółowy opis wynalazku

W tym opisie, chyba że kontekst wymaga inaczej, słowa „zawiera, „zawierają i „zawierając będą rozumiane jako dotyczące określonej całości lub grupy całości, lecz nie dla wyłączenia jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości.

Zgodnie z nomenklaturą, NhhA jest użyte tu dla określenia białek według wynalazku, podczas gdy nhhA jest użyty dla określenia kwasów nukleinowych według wynalazku. Powinno być również zrozumiane, że białka i kwasy nukleinowe NhhA/nhhA obejmują białka i kwasy nukleinowe HiaNm/hianm określone przykładowo w WO 99/31132, bez ograniczeń.

Obecny wynalazek w części jest wydedukowany przez wyjaśnienie konserwatywnych i mniej konserwatywnych obszarów polipeptydu NhhA w dziesięciu (10) szczepach N. meningitidis. Wydedukowano, że odpowiednie obszary są konserwatywne w allelicznych wariantach przykładowych polipeptydów NhhA.

Powinno być docenione, że kluczowe dla niniejszego wynalazku jest uświadomienie sobie, że przez usunięcie niekonserwatywnych aminokwasów z dzikiego typu polipeptydu NhhA w celu uzyskania zmodyfikowanej postaci polipeptydu NhhA, odpowiedź immunologiczna może być wywołana po immunizacji wspomnianym polipeptydem według wynalazku, który przez kierowanie odpowiedzi immunologicznej przeciw konserwatywnym epitopom będzie dostarczał ochrony przeciw jednemu lub większej ilości szczepów N. meningitidis.

W użytym tu znaczeniu „niekonserwatywne aminokwasy są aminokwasami występującymi w polipeptydzie dzikiego typu NhhA z pierwszego szczepu N. meningitidis, lecz które nie występują w dzikiego typu polipeptydzie NhhA z jednego lub większej liczby innych szczepów.

Korzystnie, polipeptydy z pierwszego aspektu wynalazku posiadają usuniętą przynajmniej część jednego z obszarów V1, V2, V3 lub V4 w porównaniu z odpowiednią sekwencją typu dzikiego i zgodnie z tym mogą być zbiorowo określone jako przykłady „mutantów delecyjnych.

Powinno być dostrzeżone, że zidentyfikowano obszary V1, V2, V3 i V4 jako obszary polipeptydu NhhA typu dzikiego posiadające ze względnie dużą częstością niekonserwatywne aminokwasy, w porównaniu ze względnie konserwatywnymi obszarami C1-5.

Obszary V, V1 (hiperzmienny) i V2 zawierają z dużą częstością niekonserwatywne aminokwasy, podczas gdy w obszarach V3 i V4 występują one ze względnie niższą częstością. Jednakowoż, obszar V1 stanowi bardziej znaczącą część polipeptydów NhhA typu dzikiego niż obszar V2 (w kategoriach całkowitej liczby aminokwasów). Co za tym idzie, jest korzystne aby wyizolowane białka według wspomnianego pierwszego aspektu posiadały przynajmniej istotną część usuniętego obszaru V1.

Powinno być również dostrzeżone przez znawcę, że konstruując wspomniane mutanty delecyjne możliwe jest „tasowanie obszarów pomiędzy peptydami NhhA różnych szczepów N. meningitidis. Przykładowo, polipeptyd NhhA według wynalazku może zawierać obszar H41 C1 wraz z obszarem PMC21 C5.

PL 216 780 B1

Takie „tasowanie jest szczególnie użyteczne dla sposobów rekombinowania DNA.

Dla celów wynalazku przez „wyizolowany rozumie się materiał, który został oddzielony od jego naturalnego stanu lub w inny sposób poddany manipulacji człowieka. Wyizolowany materiał może być zasadniczo lub w istotnym stopniu, wolny od naturalnych składników normalnie towarzyszących mu w jego stanie naturalnym, lub może być manipulowany tak, jakby był w stanie sztucznym wraz ze składnikami, które normalnie towarzyszą mu w stanie naturalnym. Wyizolowany materiał może być w postaci naturalnej lub zrekombinowanej.

„Białko oznacza polimer aminokwasowy. Aminokwas może być naturalnym lub nie występującymi w przyrodzie aminokwasami, co jest dobrze rozumiane w dziedzinie.

„Peptyd jest białkiem posiadającym nie więcej niż pięćdziesiąt (50) aminokwasów.

Polipeptyd jest białkiem posiadającym pięćdziesiąt (50) lub więcej aminokwasów.

W użytym tu znaczeniu zwrot „wywołuje odpowiedź immunologiczną określa zdolność wyizolowanego polipeptydu według wynalazku do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej u ssaka, któremu jest podany, gdzie odpowiedź jest skierowana przeciw N. meningitidis i/lub wspomnianemu peptydowi. Korzystnie, odpowiedź immunologiczna obejmuje wytworzenie bakteriobójczych przeciwciał. Korzystniej, odpowiedź immunologiczna chroni przed zarażeniem N. meningitidis.

„Swoista dla szczepu jest użyte tu w kontekście odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw lub przynajmniej głównie przeciw autologicznemu szczepowi N. meningitidis.

W użytym tu znaczeniu „reaktywność krzyżowa jest zdolnością polipeptydu według wynalazku do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw jednemu lub większej liczbie heterologicznych szczepów N. meningitidis.

W użytym tu znaczeniu „krzyżowa ochrona jest zdolnością polipeptydu według wynalazku do wywołania odpowiedzi immunologicznej i, co za tym idzie, dostarczania ochrony przeciw zarażeniu jednym, lub większą liczbą heterologicznych szczepów N. meningitidis.

Tak więc, w świetle poniższego, wspomniany polipeptyd według wynalazku może być określony tu jako „immunogen lub jako będący „immunogenicznym.

Choć dla celów obecnego wynalazku wspomniane zmodyfikowane białka NhhA zostały przykładowo podane jako sekwencje aminokwasowe z Fig. 5 do 9 (SEQ ID NO:23-27) i Fig. 14, niniejszy wynalazek również rozważa fragmenty, pochodne i warianty (takie jak warianty alleliczne) przykładowych białek.

Przykładowo, aminokwasy mogą być usunięte z którejkolwiek sekwencji C1-5 podanej na Fig. 1, podczas gdy nie wszystkie niekonserwatywne aminokwasy w obszarach V1-4 wymagają usunięcia celem ograniczenia immunogeniczności specyficznej wobec szczepu.

Co za tym idzie, wyizolowane białka według wynalazku mogą zawierać fragmenty obszarów C1-5 i V1-4.

W rzeczywistości, jak będzie dyskutowane poniżej, w Przykładach, może być konieczne dla celów wytwarzania polipeptydów według wynalazku, opartego na rekombinowaniu DNA, usunięcie jednego lub kilku aminokwasów z obszaru C1, C2, C3, C4 i/lub C5 lub obszaru V1, V2, V3 i/lub V4, przez wykorzystanie dogodnych miejsc dla endonukleaz restrykcyjnych i uzyskania wysokiego poziomu ekspresji stabilnego, immunogenicznego białka.

W jednej postaci „fragment obejmuje sekwencję aminokwasową zawierającą mniej niż 100%, lecz przynajmniej 20%, korzystnie przynajmniej 50%, korzystniej przynajmniej 80% i jeszcze korzystniej przynajmniej 90% wspomnianych obszarów C1, C2, C3, C4 lub C5.

Fragmenty przykładowo mogą być peptydami zawierającymi tak niewiele jak dwanaście aminokwasów obszaru C2 (SEQ ID NO:11) lub sekwencje przynajmniej dwudziestu aminokwasów, lub więcej niż sto kolejnych aminokwasów odpowiadających pewnym lub wszystkim opisanym obszarom C1, C2, C3, C4 i/lub C5.

Inne fragmenty przykładowo podane tu są zmodyfikowanymi polipeptydami NhhA według wynalazku, które podległy posttranslacyjnej obróbce do postaci dojrzałego polipeptydu, takiego jak przedstawiono na Fig. 14.

W kolejnej postaci „fragment jest małym peptydem przykładowo o długości 6, korzystnie przynajmniej 10 i korzystniej przynajmniej 20 aminokwasach, zawierającym jedną lub więcej determinant antygenowych lub epitopów pochodzących ze zmodyfikowanych białek NhhA według wynalazku. Rozważane są również większe fragmenty zawierające więcej niż jeden polipeptyd, które mogą być otrzymane przez zastosowanie typowych sposobów rekombinowania kwasu nukleinowego lub są zsyntetyzowane przy pomocy tradycyjnych sposobów syntezy w cieczy lub na fazie stałej. PrzykładoPL 216 780 B1 wo, odniesienie literaturowe może być uczynione do syntezy w cieczy lub na fazie stałej jaką przykładowo opisali w Rozdziale 9 zatytułowanym „Peptide Synthesis Atherton i Shephard zawartej w publikacji zatytułowanej „Synthetic Vaccines pod redakcją Nicholson i opublikowanej przez Blackwell Scientific Publications. Alternatywnie, peptydy mogą być wytworzone przez trawienie polipeptydu według wynalazku proteinazami, takimi jak endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C i gronkowcową proteazą V8. Będące produktami trawienia fragmenty mogą być oczyszczone przykładowo sposobami wysoko rozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC).

W użytym tu znaczeniu „wariant polipeptydów to polipeptydy według wynalazku, w których jeden lub więcej aminokwasów zastąpiono innymi aminokwasami. Jest dobrze zrozumiałe w dziedzinie, że pewne aminokwasy mogą być zmienione na inne o z grubsza podobnych właściwościach, bez zmiany charakteru aktywności polipeptydu (konserwatywne podstawienia). Przykładowe konserwatywne podstawienia mogą być dokonane zgodnie z Tabelą 2.

Zasadnicze zmiany w funkcji mogą być dokonane przez wybranie podstawień mniej konserwatywnych niż te, przedstawione w Tabeli 2. Inne zamiany aminokwasów będą podstawieniami niekonserwatywnymi i stosunkowo niewiele z nich może być tolerowane. Ogólnie podstawienia, które przypuszczalnie wytwarzają więcej zmian we właściwościach polipeptydów to te, w których (a) reszta hydrofilowa (np. Ser lub Thr) jest podstawiona przez resztę hydrofilową (np. Ala, Leu, Ile, Phe lub Val); (b) cysteina lub prolina jest podstawiona przez jakikolwiek inny aminokwas; (c) aminokwas o elektrododatnim łańcuchu bocznym (np. Arg, His lub Lys) jest podstawiony przez aminokwas elektroujemny (np. Glu lub Asp) lub (d) aminokwas o masywnym łańcuchu bocznym (np. Phe lub Trp) jest podstawiony przez aminokwas o mniejszym łańcuchu bocznym (Ala, Ser) lub bez łańcucha bocznego (np. Gly).

Termin „wariant obejmuje również polipeptydy NhhA według wynalazku wytworzone z Allelicznych wariantów sekwencji podanych przykładowo w tym opisie.

Warianty polipeptydu NhhA mogą być objęte zakresem terminu „homologi polipeptydu.

Homologi polipeptydu mają wspólnych przynajmniej 70%, korzystnie przynajmniej 80% i korzystniej przynajmniej 90% identycznej sekwencji z sekwencjami aminokwasowymi polipeptydów NhhA według wynalazku, jak to wcześniej opisano. Ogólnie, użyty tu termin „homolog obejmuje możliwą do określenia zależność sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej z kwasem nukleinowym lub polipeptydem według wynalazku.

Przykładowo, takie homologi są rozważone jako posiadające sekwencje aminokwasowe różniące się od tych, przykładowo tu podanych, lecz które są immunogeniczne i dostarczają krzyżowej ochrony immunologicznej.

Specyficznie z zakresu terminu „homologi wyłączone są polipeptydy dzikiego typu NhhA i kwasy nukleinowe nhhA. W zakresie określenia homologi mieszczą się „ortologi, które są funkcjonalnie pokrewnymi polipeptydami i kodujące je kwasy nukleinowe izolowane z gatunków bakterii innych niż AZ. meningitidis.

Terminy użyte tu dla opisania zależności sekwencji pomiędzy odpowiednimi kwasami nukleinowymi i polipeptydami obejmują „okienko porównywania, „identyczność sekwencji, „procentową identyczność sekwencji i „istotną identyczność. Ponieważ odpowiednie kwasy nukleinowe/polipeptydy mogą zawierać (1) jedynie jedną lub więcej części pełnej sekwencji kwasu nukleinowego/polipeptydu, która jest wspólna z kwasami nukleinowymi/polipeptydami i (2) jedną lub więcej części różniących się pomiędzy kwasami nukleinowymi/peptydami, porównania sekwencji są typowo przeprowadzone w „okienku porównywania dla identyfikacji i porównania lokalnych obszarów podobieństwa sekwencji. „Okienko porównywania odnosi się do konceptualistycznego odcinka typowo 12 kolejnych reszt, które są porównane względem sekwencji referencyjnej. Optymalne przyrównanie sekwencji dla przyrównania okienka porównywania może być dokonane przez komputerową implementację algorytmów (program Geneworks z Intelligenetics; GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w pakiecie programów Wisconsin Genetics Software Packge Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA, włączonego tu przez cytowanie) lub przez sprawdzenie i najlepsze przyrównanie (np. dające najwyższą procentową homologię w okienku porównywania) wytworzone jakimkolwiek, wybranym spośród różnych sposobów. Odniesienie literaturowe może również być zrobione do rodziny programów BLAST jakie przykładowo ujawnili Altschul i wsp., 1997, Nucl. Acids Res. 25 3389, który jest włączony tu przez cytowanie.

Szczegółową dyskusję analizy sekwencji można znaleźć w rozdziale 19.3 Current Protocols in Molecular Biology wyd. Ausubel i wsp. (John Willey & Sons Inc., NY, 1995-1999).

PL 216 780 B1

Termin „identyczność sekwencji jest użyty tu w szerokim tego słowa znaczeniu obejmując szereg dokładnie dopasowanych nukleotydów lub aminokwasów zgodnie z odpowiednim przyrównaniem przy pomocy standardowego algorytmu z uwagi na identyczność sekwencji w okienku porównywania. Co za tym idzie, „procentowa identyczność sekwencji jest obliczona przez porównanie dwóch optymalnie przyrównanych sekwencji w okienku porównywania, określając liczbę miejsc, w których występują identyczne zasady (np. A, T, C, G, I) w obu sekwencjach, co daje liczbę dopasowanych miejsc, dzieląc liczbę dopasowanych miejsc przez całkowitą liczbę miejsc w okienku porównywania (tj. wielkość okienka) i mnożąc wynik przez 100 co daje procentową identyczność sekwencji. Przykładowo, „identyczność sekwencji może być rozumiana jako „procentowe dopasowanie obliczone programem komputerowym DNASIS (wersja 2,5 dla Windows, dostępna z Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA).

Tak więc, dobrze mieści się w zakresie umiejętności znawcy przygotowanie homologów peptydowych według wynalazku, takich jak warianty wcześniej zdefiniowane przez technologię rekombinowania DNA. Przykładowo, kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być zmutowane zarówno przez losową mutagenezę, przykładowo mutagenezę transpozonową lub mutagenezę ukierunkowaną. Uzyskane fragmenty DNA są następnie klonowane w dogodnych gospodarzach dla ekspresji, takich jak E. coli przy pomocy tradycyjnych technologii i wykrywane są klony utrzymujące pożądaną aktywność. Gdy klony są otrzymane przy pomocy sposobów losowej mutagenzy, to dla wykrycia mutacji przeprowadzone jest określanie sekwencji nukleotydowej pozytywnych klonów.

W użytym tu znaczeniu „pochodne polipeptydy są polipeptydami według wynalazku, które zmieniono przykładowo przez koniugowanie lub kompleksowanie z innymi cząsteczkami chemicznymi lub sposobami posttranslacyjnej modyfikacji, co jest zrozumiałe w dziedzinie. Takie pochodne obejmują delecje aminokwasu i/lub insercje do polipeptydów NhhA według wynalazku lub ich wariantów, gdzie wspomniane pochodne wywołują odpowiedź immunologiczną.

„Insercje aminokwasów mogą obejmować fuzje polipeptydów lub ich wariantów z innymi polipeptydami lub białkami. W związku z powyższym warto wskazać, że polipeptydy lub warianty według wynalazku mogą być wbudowane do większych polipeptydów i oczekuje się, że takie większe polipeptydy mogą również być immunogeniczne. Polipeptydy jakie opisano powyżej mogą być przyłączone do kolejnego białka, które nie pochodzi z N. meningitidis. Inne białko może, przykładowo, uczestniczyć w oczyszczaniu białka. Przykładowo, użyty może być znacznik histydynowy lub białko wiążące maltozę. Alternatywnie, może wytwarzać odpowiedź immunologiczną skuteczną względem N. meningitidis lub może wytwarzać odpowiedź immunologiczną przeciw innemu patogenowi. Inne możliwe fuzje białkowe to te, które wytwarzają odpowiedź immunomodulującą. Szczególne przykłady takich białek obejmują białko A lub S-transferazę glutationu (GST). Ponadto, polipeptyd może być przyłączony dla składnika szczepionki opartego na oligosacharydzie, działającego jako nośnik białka.

Inne, rozważane pochodne obejmują, lecz nie są ograniczone do modyfikacji łańcuchów bocznych, wbudowania nienaturalnych aminokwasów i/lub ich pochodnych podczas syntezy polipeptydu lub białka, użycia substancji sieciujących i innych sposobów, które narzucają konformację polipeptydów, fragmentów i wariantów według wynalazku. Przykłady modyfikacji łańcucha bocznego rozważane przez obecny wynalazek obejmują modyfikacje grup aminowych takie jak acylacja bezwodnikiem kwasu octowego; acylacja grup aminowych bezwodnikiem bursztynowym i tetrahydroftalowym; amidynacja metyloacetamidem; karbamoilacja grup aminowych cyjanianem; pirydoksylacja lizyny pirydoksylo-5-fosforanem, a następnie redukcja NaBH4; redukcyjna alkilacja przez reakcję z aldehydem, a następnie redukcję NaBH4 i trinitrobenzylacja grup aminowych kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS).

Grupa karboksylowa może być modyfikowana przez aktywowanie karbodiimidem przez tworzenie O-acylomocznika, a następnie przez kolejną modyfikację przykładowo do odpowiedniego amidu.

Guaninowa grupa reszty argininy może być modyfikowana przez heterocykliczną kondensację przy pomocy odczynników takich jak 2,3-butanodion, fenylogIioksaI i glioksal.

Grupy sulfhydrylowe mogą być zmodyfikowane sposobami takimi jak przeprowadzenie utleniania kwasu nadmrówkowego do kwasu cystydylowego, tworzenie pochodnych rtęci przy pomocy kwasu 4-chlorortęciowofenylosulfonowego, 4-chlorortęciowobenzoesowego; 2-chlorortęciowo-4-nitrofenylowego, chlorku fenylortęciowego i innych związków rtęci; tworzenie mieszanych disiarczków z innymi związkami tiolowymi; reakcję z imidem maleinowym, bezwodnikiem maleinowym lub innymi podstawionymi imidami maleinowymi; karboksymetylacją kwasem jodooctowym lub amidem jodooctowym i karbamoilację cyjanianem w alkalicznym pH.

PL 216 780 B1

Reszty tryptofanu mogą być zmodyfikowane przez przykładowo, alkilowanie pierścienia indolowego bromkiem 2-hydroksy-5-nitrobenzylowym, halogenkami kwasu sulfonowego lub przez utlenianie imidem N-bromobursztynowym.

Reszty tyrozyny mogą być modyfikowane przez nitrowanie do postaci pochodnej 3-nitrotyrozyny.

Pierścień imidazolowy reszty histydyny może być modyfikowany przez N-karboetoksylację dietylopirowęglanem lub alkilowanie pochodnymi kwasu jodooctowego.

Przykłady wbudowania nienasyconych aminokwasów i pochodnych podczas syntezy polipeptydu obejmują, lecz nie są ograniczone do użycia kwasu 4-aminomasłowego, kwasu 6-aminoheksenowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-5-fenylopentanowego, kwasu 4-amino-3-hydroksy-6-metyloheptanowgo, t-butyloglicyny, norleucyny, norwaliny, fenyloglicyny, ornityny, sarkozyn, 2-tienyloalaniny i/lub

D-izomerów aminokwasów.

Wynalazek rozważa również kowalencyjne modyfikowanie wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku dinitrofenolem dla uczynienia go immunogenicznym u człowieka.

Wyizolowane białka oraz białka fuzyjne według wynalazku mogą być przygotowane przy pomocy jakiejkolwiek użytecznej procedury znanej znawcom.

Przykładowo, białko może być przygotowane jako rekombinowany polipeptyd przy pomocy procedury obejmującej etapy:

(i) przygotowanie konstruktu ekspresyjnego zawierającego zmodyfikowany kwas nukleinowy nhhA według wynalazku połączony funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą regulatorowych sekwencji nukleotydowych (ii) transfekcję lub transformację użytecznej komórki gospodarza konstruktem ekspresyjnym i (i) ekspresję zrekombinowanego polipeptydu we wspomnianej komórce gospodarza.

Poniżej przedstawiony jest szereg przykładów, opisujących wytworzenie zmodyfikowanych kwasów nukleinowych nhhA przez PCR.

W pewnej, szczególnej postaci PCR jest PCR zachodzących fragmentów jaki będzie opisany poniżej, który to sposób jest oparty na opisanym w Ho i wsp., 1989, Gene 77 51 i przez Horton i wsp., 1989, Gene 77 61, które oba są włączone tu przez cytowanie.

Dla ekspresji w komórce gospodarza rekombinowany kwas nukleinowy jest połączony funkcjonalnie z jedną lub większą liczbą sekwencji regulatorowych w wektorze ekspresyjnym.

„Wektor ekspresyjny może być zarówno samoreplikującym się poza chromosomowym wektorem takim jak plazmid lub wektorem, który wbudowuje się do genomu gospodarza.

„Połączony funkcjonalnie oznacza, że wspomniana regulatorowa sekwencja(e) nukleotydowa jest/są umiejscowiona względem zrekombinowanego kwasu nukleinowego według wynalazku dla zapoczątkowania, regulacji lub kontrolowania transkrypcji w inny sposób.

Nukleotydowe sekwencje regulatorowe ogólnie będą odpowiednie dla użytej dla ekspresji komórki gospodarza. Wiele rodzajów odpowiednich wektorów ekspresyjnych jest użytecznymi sekwencjami regulatorowymi znanymi w dziedzinie dla różnych komórek gospodarzy.

Typowo, wspomniana jedna lub więcej regulatorowych sekwencji nukleotydowych może zawierać, lecz nie tylko, sekwencje promotorowe, sekwencje liderowe lub sygnałowe, miejsca wiązania rybosomu, sekwencje startu i terminacji transkrypcji, sekwencje startu i terminacji translacji i sekwencje enhanserową lub aktywatorową.

W dziedzinie znane są konstytutywne lub indukowalne promotory rozpatrywane przez wynalazek. Promotory mogą być zarówno promotorami występującymi naturalnie, lub promotorami hybrydowymi łączącymi elementy więcej niż jednego promotora.

W korzystnej postaci wektor ekspresyjny zawiera selekcyjny gen znacznikowy pozwalający na selekcję stransformowanych komórek gospodarza. Podlegające selekcji geny znacznikowe są dobrze znane w dziedzinie i będą różniły się zależnie od użytej komórki gospodarza.

W pewnej postaci wektorem ekspresyjnym jest pCO14K posiadający promotor porA i gen selekcyjny warunkujący odporność na kanamycynę, co będzie opisane szczegółowo poniżej. Zgodnie z tą postacią komórką gospodarza jest bakteria wybrana z grupy obejmującej E. coli N. meningitidis.

Wektor ekspresyjny może również zawierać partnera fuzyjnego (typowo dostarczony przez wektor ekspresyjny) tak, że zrekombinowany polipeptyd według wynalazku jest wyrażony jako polipeptyd fuzyjny ze wspomnianym partnerem fuzyjnym. Zasadniczą korzyścią partnerów fuzyjnych jest to, że wspomagają identyfikację i/lub oczyszczanie wspomnianego polipeptydu fuzyjnego.

PL 216 780 B1

Dla ekspresji wspomnianego polipeptydu fuzyjnego niezbędnym jest przyłączenie, przy pomocy Iigazy, sekwencji nukleotydowej zgodnej z wynalazkiem do wektora ekspresyjnego tak, że ramka odczytu fuzyjnego partnera i sekwencji nukleotydowej według wynalazku są zgodne.

Dobrze znane przykłady partnerów fuzyjnych obejmują, lecz nie są ograniczone do S-transferazy glutationu (GST), części Fc ludzkiego IgG, białka wiążącego maltozę (MBP) i heksahistydyny (HIS6), które są szczególnie użyteczne dla izolowania fuzji polipeptydowych przez chromatografię powinowactwa. Dla oczyszczania polipeptydów fuzyjnych przez chromatografię powinowactwa odpowiednimi złożami dla chromatografii są odpowiednio żywice glutationowa, amylozowa i niklowa lub skoniugowana z kobaltem. Wiele takich złóż jest dostępnych w „zestawach takich jak QUIAekspress™ system (Quiagen) użyteczny z (His6), partnerami fuzyjnymi i system oczyszczania Pharmacia GST.

Korzystnym partnerem fuzyjnym jest MBP opisany poniżej w Przykładzie 11.

Kolejnym partnerem fuzyjnym, dobrze znanym w dziedzinie jest zielone białko fluorescencyjne (GFP). Ten partner fuzyjny służy jako „znacznik fluorescencyjny pozwalający na identyfikację polipeptydu fuzyjnego według wynalazku poprzez mikroskopię flourescencyjną lub cytometrię przepływową. Znacznik GFP jest użyteczny dla określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji polipeptydu fuzyjnego według wynalazku lub izolowania komórek wyrażających polipeptyd fuzyjny według wynalazku. Metody cytometrii przepływowej takie jak sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) są szczególnie użyteczne w tym ostatnim zastosowaniu.

Korzystnie, partnerzy fuzyjni posiadają również miejsca cięcia dla proteaz takich jak czynnik X2 lub trombina pozwalających odpowiedniej proteazie częściowo strawić polipeptyd fuzyjny według wynalazku i co za tym idzie uwolnić zrekombinowany polipeptyd według wynalazku. Uwolniony polipeptyd może następnie być oddzielony od partnera fuzyjnego przez kolejny etap rozdziału chromatograficznego.

Fuzyjni partnerzy według wynalazku obejmują również „znaczniki epitopowe, które są zazwyczaj krótkimi sekwencjami peptydowymi, dla których dostępne jest specyficzne przeciwciało. Dobrze znanymi przykładami epitopów znacznikowych, dla których dostępne są gotowe, specyficzne przeciwciała są c-myc, hemaglutynina z wirusa grypy i znaczniki FLAG.

Jak wcześniej, polipeptydy według wynalazku mogą być wytworzone przez hodowanie komórki gospodarza transformowanej wspomnianym konstruktem ekspresyjnym zawierającym kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, lub homolog polipeptydu według wynalazku. Warunki odpowiednie dla ekspresji białka będą różniły się w zależności od wyboru wektora ekspresyjnego i komórki gospodarza. Jest to łatwe do stwierdzenia przez znawcę poprzez rutynowe eksperymentowanie.

Użyteczne dla ekspresji komórki gospodarza mogą być prokariotycznymi lub eukariotycznymi. Pewna, korzystna komórka gospodarza dla ekspresji polipeptydu według wynalazku jest bakterią. Użytą bakterią może być Escherichia coli lub N. meningitidis.

W korzystnej postaci komórką gospodarza jest N. meningitidis, która może być zmodyfikowana tak, aby nie ulegała ekspresji PorA, Opa, Opc lub polisacharyd kapsydu i wyrażany był pożądany fenotyp lipopolisacharydu.

Alternatywnie, komórka gospodarza może być komórką owada, taką jak przykładowo komórki SF9, które mogą być wykorzystane w bakulowirusowym systemie ekspresji.

Zrekombinowane białko może być dogodnie przygotowane przez osobę biegłą w sztuce przy pomocy typowych protokołów jakie przykładowo opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) włączonej tu przez cytowanie, szczególnie rozdziały 16 i 17; Current Protocols in Molecular Biology red. Ausubel i wsp., (John Willey & Sons, Inc. 1995-1999), włączonej tu przez cytowanie, szczególnie rozdziały 10 i 16 i Current Protocols in Protein Science, red. Coligan i wsp., (John Willey & Sons Inc. 1995-1999), która jest włączona tu przez cytowanie w szczególności rozdziały 1, 5 i 6.

Szczególnymi sposobami ekspresji zrekombinowanych zmodyfikowanych białek NhhA według wynalazku i sposobami wykrywania ekspresji białka są podane poniżej Przykłady.

Sekwencje nukleotydowe.

Dostarczony jest wyizolowany kwas nukleinowy kodujący zmodyfikowane białko NhhA według wynalazku.

Korzystnie, wspomniany wyizolowany kwas nukleinowy posiada sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub więcej rejonów stałych (C) polipeptydu NhhA jak opisano na Fig. 1 i 2. Wyizolowany

PL 216 780 B1 kwas nukleinowy może ponadto kodować jeden lub więcej niekonserwatywnych (obszar V) aminokwasów takich jak również zidentyfikowane na Fig. 1 i 2.

Szczególne postaci takich wyizolowanych kwasów nukleinowych są dostarczone w SEQ ID NO:28-32 i na Fig. 5-9.

Termin „kwas nukleinowy w użytym tu znaczeniu oznacza jedno- lub dwuniciowy mRNA, RNA, cRNA i DNA, wspomniany DNA obejmuje cDNA i genomowy DNA.

„Polinukleotyd jest kwasem nukleinowym zawierającym osiemdziesiąt (80) lub więcej kolejnych nukleotydów, podczas gdy „oligonukleotyd zawiera mniej niż osiemdziesiąt (80) kolejnych nukleotydów.

„Sonda może być jedno- lub dwuniciowym oligonukleotydem lub polinukleotydem dogodnie wyznakowanym celem wykrycia komplementarnych sekwencji przykładowo w doświadczeniach typu Northern lub Southern blot.

„Starter jest zazwyczaj jednoniciowym oligonukleotydem, korzystnie posiadającym 15-50 kolejnych nukleotydów, który jest zdolny do związania się z „matrycą komplementarnego kwasu nukleinowego i wydłużanym w sposób zależny od matrycy przez działanie polimerazy DNA, takiej jak Taq polimeraza, RNA zależna DNA polimeraza lub Sekwenaza™. Obecny wynalazek rozważa również homologi kwasów nukleinowych według wynalazku, jakie wcześniej zdefiniowano. Takie homologi kwasu nukleinowego nie obejmują kwasów nukleinowych kodujących pełnej długości polipeptydy dzikiego typu NhhA.

Przykładowo, homologi kwasu nukleinowego kodują peptydy i polipeptydy strukturalnie pokrewne NhhA obszarów V i C według wynalazku, które mogą być użyteczne dla celów dostarczenia krzyżowej ochrony immunologicznej przez immunizację N. meningitidis.

W pewnej postaci homologi kwasu nukleinowego kodują wyizolowane białko i białko fuzyjne według wynalazku. W innej postaci homologi kwasów nukleinowych dzielą przynajmniej 60%, korzystnie przynajmniej 70%, korzystniej przynajmniej 80% i jeszcze korzystniej przynajmniej 90% sekwencji identycznej z kwasami nukleinowymi według wynalazku.

W jeszcze kolejnej postaci, homologi kwasu nukleinowego hybrydyzują z kwasami nukleinowymi według wynalazku w przynajmniej warunkach o niskiej ostrości, korzystnie w przynajmniej średnio ostrych warunkach i korzystniej w bardzo ostrych warunkach.

„Hybrydyzować i hybrydyzacja w użytym tu znaczeniu oznaczają parowanie przynajmniej części komplementarnych sekwencji nukleotydowych dla wytworzenia hybryd DNA-DNA, RNA-RNA lub DNA-RNA. Sekwencje hybryd zawierają komplementarne sekwencje nukleotydowe występujące dzięki parowaniu zasad pomiędzy komplementarnymi purynami i pirymidynami, co dobrze znane jest w dziedzinie.

Zgodnie z tym powinno być dostrzeżone, że zmodyfikowane puryny (przykładowo inozyna, metyIoinożyna i metyloadenozyna) i zmodyfikowane pirymidyny (tiourydyna i metylocytozyna) mogą również uczestniczyć w parowaniu zasad.

„Ostrość w użytym tu znaczeniu określa temperaturę i siłę jonową, i występowanie, lub brak, określonych rozpuszczalników organicznych i/lub detergentów podczas hybrydyzacji. Wyższa ostrość oznacza, że wyższy będzie wymagany poziom komplementarności hybrydyzujących sekwencji nukleotydowych.

„Ostre warunki oznaczają takie warunki, w których hybrydyzować będzie jedynie kwas nukleinowy o większej częstości komplementarnych zasad.

Cytowane tu warunki niskiej ostrości uwzględniają i obejmują:

(i) od przynajmniej około 1% obj./obj. do przynajmniej około 15% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 1 M do przynajmniej około 2 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 1 M do przynajmniej około 2 M soli do płukania w 42°C; i (ii) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C (i) 2 x SSC, 0,1% SDS; lub (ii) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 5% SDS do płukania w temperaturze pokojowej.

Średnio ostre warunki uwzględniają i obejmują:

(iii) od przynajmniej około 16% obj./obj. do przynajmniej około 30% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 0,5 M do przynajmniej około 0,9 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 0,5 M do przynajmniej około 0,9 M soli do płukania w 42°C; i

PL 216 780 B1 (iv) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C i (a) 2 x SSC, 0,1% SDS; lub (b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 5% SDS do płukania w temperaturze pokojowej.

Ostre warunki uwzględniają i obejmują:

(i) od przynajmniej około 31% obj./obj. do przynajmniej około 50% obj./obj. formamidu i od przynajmniej około 0,01 M do przynajmniej około 0,15 M soli do hybrydyzacji zachodzącej w 42°C i przynajmniej 001 M do przynajmniej około 0,15 M soli do płukania w 42°C; i (ii) 1% albumina z surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO4 (pH 7,2), 7% SDS do hybrydyzacji w 65°C i (a) 0,1 x SSC, 0,1% SDS; lub (b) 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO4 (pH 7,2), 1% SDS do płukania w temperaturze przekraczającej 65°C przez około godzinę; i (v) 0,2 x SSC, 0,1% SDS dla płukania w lub powyżej 68°C przez około 20 minut.

Ogólnie, płukanie jest przeprowadzone w Tm=69,3 + 0,41 (G+C)% - 12°C. Ogólnie, Tm dwuniciowego DNA zmniejsza się o około 1°C dla każdego dodatkowego 1% niesparowanych zasad.

Wyżej wspomniane ostre warunki hybrydyzacji są dobrze znane w dziedzinie i opisano je w rozdziałach 2.9 i 2.10 Ausubel i wsp., co włączono tu przez cytowanie. Znawcy dostrzegą również, że można manipulować różnymi czynnikami dla optymalizowania specyficzności hybrydyzacji. Optymalizowanie ostrości końcowych płukań może służyć dla uzyskania pewności o wysokim stopniu hybrydyzacji.

Typowo, komplementarne sekwencje nukleotydowe są zidentyfikowane sposobami blotowania obejmującymi etap, w którym nukleotydy są unieruchomione na macierzy (korzystnie syntetycznej błonie takiej jak nitroceluloza), etap hybrydyzacji i etap wykrycia. Metoda Southern blot jest użyta dla identyfikacji komplementarnej sekwencji DNA; metoda Northern blot jest użyta dla identyfikacji komplementarnej sekwencji RNA. Metody Dot blot i slot blot mogą być użyte dla identyfikacji komplementarnych DNA/DNA, DNA/RNA lub RNA/RNA sekwencji polinukleotydowych. Takie techniki są dobrze znane znawcom i zostały opisane przez Ausubel i wsp., powyżej, na stronach 2.9.1 do 2.9.20. Zgodnie z takimi sposobami Southern blot wymaga rozdzielenia cząsteczek DNA zgodnie z ich wielkością przez elektroforezę w żelu, przenoszenie rozdzielonych pod względem wielkości DNA na syntetyczny filtr i hybrydyzację DNA związanego z filtrem z komplementarną sekwencją nukleotydową.

W metodach dot blot i slot blot próbki DNA są bezpośrednio naniesione na syntetyczny filtr przed przeprowadzoną jak wyżej hybrydyzacją.

Alternatywny etap przenoszenia jest użyty, gdy identyfikowane są komplemetarne kwasy nukleinowe w bibliotece cDNA lub DNA genomowego, tak jak w procesie hybrydyzacji kolonijnej lub łysinkowej. Innymi typowymi przykładami tej procedury jest opisany w rozdziałach 8-12 Sambrook i wsp., powyżej, które są włączone tutaj przez cytowanie.

Typowo, poniższe ogólne procedury mogą być użyte dla określenia warunków hybrydyzacji. Kwasy nukleinowe są wiązane/przenoszone na syntetyczne błony, jak to opisano powyżej. Sekwencja nukleotydowa typu dzikiego według wynalazku jest wyznakowana jak opisano powyżej i badana jest zdolność tego, wyznakowanego kwasu nukleinowego do hybrydyzacji z unieruchomioną sekwencją nukleotydową.

Znawcy dostrzegą, że szereg czynników wpływa na hybrydyzację. Aktywność specyficzna wyznakowanej radioaktywnie sekwencji polinukleotydowej powinna być typowo większa niż, lub równa około 10⁸ dpm/ug dla dostarczenia wykrywalnego sygnału. Radioaktywnie wyznakowana sekwencja

O Q nukleotydowa o aktywności specyficznej 10 do 10 dpm^g może wykryć około 0,5 pg DNA. Jest dobrze znane w dziedzinie, że dostatecznie dużo DNA musi być unieruchomione na filtrze aby umożliwiło wykrycie. Jest pożądane posiadanie nadmiaru unieruchomionego DNA, zazwyczaj 1-10 μg. Dodanie obojętnego polimeru takiego jak 10% (wag./obj.) siarczan dekstranu (MW 500 000) lub glikolu polietylenowego 6000 podczas hybrydyzacji może również zwiększyć czułość hybrydyzacji (patrz Ausubel i wsp., powyżej, w 2.10.10). Dla uzyskania znaczących wyników hybrydyzacji pomiędzy kwasem nukleinowym unieruchomionym na filtrze i wyznakowanym kwasem nukleinowym, przed płukaniem hybrydyzowana musi być z unieruchomionym kwasem nukleinowym dostateczna ilość wyznakowanego kwasu nukleinowego. Płukanie daje pewność, że wyznakowany kwas nukleinowy hybrydyzuje jedynie z unieruchomionym kwasem nukleinowym o pożądanym stopniu komplementarności do wyznakowanego kwasu nukleinowego.

Sposoby wykrywania wyznakowanych kwasów nukleinowych hybrydyzujących z unieruchomionym kwasem nukleinowym są dobrze znane praktykującym znawcom. Sposoby takie obejmują autoradiografię, chemiluminescencję, fluorescencję i wykrywanie kolorymetryczne.

PL 216 780 B1

W pewnej postaci homologiczne kwasy nukleinowe według wynalazku mogą być przygotowane zgodnie z poniższą procedurą:

(i) otrzymanie ekstraktu kwasu nukleinowego od dogodnego gospodarza;

(ii) stworzenie starterów, które są warunkowo zdegenerowane, gdzie każdy zawiera część sekwencji nukleotydowej według wynalazku; i (iii) użycie wspomnianych starterów dla amplifikacji sposobami amplifikacji kwasu nukleinowego jednego lub większej liczby produktów amplifikacji na matrycy wspomnianego ekstraktu kwasu nukleinowego.

Użyteczną komórką gospodarza jest bakteria.

Korzystnie gospodarzem jest rodzaj Neisseria.

Korzystniej gospodarzem jest N. meningitidis lub N. lactamica.

Startery użyte zgodnie ze sposobami amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego obejmują SEQ ID NO:40-41 jak szczegółowo opisano poniżej.

Użyteczne sposoby amplifikacji kwasu nukleinowego są dobrze znane znawcom i obejmują polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) jak przykładowo opisano w rozdziale 15 Ausubel i wsp., powyżej, która jest włączona tu przez cytowanie; amplifikację z zastąpieniem łańcucha (SDA) jak przykładowo opisano w patencie U.S. nr 5,422,252, który jest włączony tu przez cytowanie; replikację według modelu obracającego się koła (RCR) jak przykładowo opisano w Liu i wsp., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587 i Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 92/01813 i Lizardi i wsp., (Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe WO 97/19193), które są włączone tu przez odniesienie literaturowe; amplifikację zależną od sekwencji kwasu nukleinowego (NASBA) jak przykładowo opisali Sooknan i wsp., 1994, Biotechniques 17 1077), które jest włączone tu przez odniesienie literaturowe i amplifikację Q-e, jak przykładowo opisano przez Tyagi i wsp., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395, który jest włączony tu przez cytowanie.

W użytym tu znaczeniu „produkt amplifikacji określa produkt będący kwasem nukleinowym wytworzonym sposobami amplifikacji kwasu nukleinowego.

Przeciwciała.

Wynalazek rozważa również przeciwciała przeciw wyizolowanym białkom i białkom fuzyjnym według wynalazku. Przeciwciała według wynalazku mogą być poliklonalne lub monoklonalne. Dobrze znane protokoły, które mogą być zastosowane dla wytworzenia przeciwciała, jego oczyszczenia i użycia można znaleźć przykładowo w rozdziale 2 Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology (John Willey & Sons NY, 1991-1994) i Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, które są oba włączone tu przez cytowanie.

Ogólnie, przeciwciała według wynalazku wiążą się z, lub koniugują z białkiem fuzyjnym lub białkiem fuzyjnym według wynalazku. Przykładowo, przeciwciała mogą obejmować przeciwciała poliklonalne, takie przeciwciała mogą być przygotowane przykładowo przez wstrzyknięcie wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku do wytwarzających je zwierząt, które mogą obejmować myszy lub króliki, dla otrzymania surowicy poliklonalnej. Przykładowe protokoły, które mogą być użyte są opisane przykładowo w CoIigan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej i w Harlow & Lane 1988, powyżej. W miejsce poliklonalnej surowicy odpornościowej uzyskanej w produkujących gatunkach, wyprodukowane mogą być przeciwciała monoklonalne przy pomocy typowego sposobu jaki przykładowo opisano w artykule Kohler i Milstein, 1975, Nature 256, 495, który jest włączony tu przez cytowanie lub przez bardziej współczesne ich modyfikacje jak przykładowo opisano w Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej, przez immunizowanie komórek śledziony lub innych komórek wytwarzających przeciwciało, pochodzących z gatunków wytwarzających przeciwciała, które zaszczepiono jednym lub większą liczbą wyizolowanych białek lub białek fuzyjnych według wynalazku.

Wynalazek może obejmować również swoim zakresem przeciwciała zawierające fragmenty Fc lub Fab poliklonalnego lub monoklonalnych przeciwciał, które określono powyżej. Alternatywnie, przeciwciała mogą zawierać pojedynczy łańcuch przeciwciał Fv (scFvs) przeciw peptydom według wynalazku. Takie scFvs mogą być przygotowane przykładowo zgodnie ze sposobami opisanymi odpowiednio w patencie US nr 5,091,513, patencie europejskim nr 239,400 lub w artykule Winter i Milstein, 1991, Nature 349 293, które są włączone tu przez cytowanie.

Przeciwciała według wynalazku mogą być użyte dla powinowactwa przy izolowaniu naturalnych lub zrekombinowanych polipeptydów N. meningitidis.

Przykładowo, odniesienie może być uczynione do procedur chromatografii immunopowinowactwa opisanych w rozdziale 9.5 Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej.

PL 216 780 B1

Przeciwciała mogą być użyte do:

(vi) przeszukiwania bibliotek ekspresyjnych dla identyfikacji wariantów polipeptydów według wynalazku;

(vii) identyfikacji reaktywnych immunologicznie fragmentów lub reaktywnych immunologicznie epitopów; i/lub (viii) wykrywania zarażenia N. meningitidis, jak będzie opisane poniżej, lecz bez ograniczenia do tych szczególnych zastosowań.

Wykrywanie N. meningitidis.

Obecność, lub brak N. meningitidis u osobnika może być określone przez izolowanie próbki biologicznej od wspomnianego osobnika, mieszanie przeciwciała lub opisanego powyżej fragmentu przeciwciała z próbką biologiczną i wykrycia specyficznego wiązania przeciwciała, lub fragmentu przeciwciała, co wskazuje na obecność N. meningitidis w próbce.

Termin „próbka biologiczna w użytym tu znaczeniu określa próbki, które mogą być wyekstrahowane, nie poddane obróbce, poddane obróbce, rozcieńczone lub zatężone, pochodzące od osobnika takiego jak pacjent. Dogodnie, próbka biologiczna jest wybrana z grupy obejmującej pełną krew, surowicę, plazmę, ślinę, mocz, pot, płyn wysiękowy, płyn otrzewnowy, płyn maziówkowy, płyn omoczniowy, płyn rdzeniowo-mózgowy, bioptaty skóry i im podobne.

Użyty może być jakikolwiek dogodny sposób dla określenia tworzenia kompleksu. Przykładowo, przeciwciało lub fragment przeciwciała zgodnie z wynalazkiem posiadający związany z nim znacznik, może być użyty w oznaczeniach immunologicznych. Takie oznaczenia immunologiczne mogą obejmować, lecz nie są ograniczone do radioimmuno oznaczeń (RIA), enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) i technik immunochromatograficznych (ICT), które są dobrze znane znawcom.

Przykładowo, odniesienie może być uczynione do Rozdziału 7 z Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej, ujawniającego różnorodne oznaczenia immunologiczne, które mogą być użyte zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Oznaczenia immunologiczne mogą obejmować oznaczenia kompetycyjne jak jest pojmowane w dziedzinie.

Znacznik związany z przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała może obejmować poniższe:

(A) bezpośrednie przyłączenie znacznika do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała;

(B) pośrednie przyłączenie znacznika do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała; tj. przyłączenie znacznika do innego odczynnika w oznaczeniu, który z kolei wiąże przeciwciało lub fragment przeciwciała; i (C) przyłączenie do kolejnego produktu reakcji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała.

Znacznik może być wybrany z grupy obejmującej chromogen, katalizator, enzym, fluorofor, cząsteczkę chemiluminescencyjną, jon Iantanowca takiego jak europ (Eu³⁴), izotop promieniotwórczy i bezpośrednio widoczny znacznik. W przypadku bezpośrednio widocznego znacznika użyty może być metal koloidalny lub cząsteczka nie będąca metalem, cząsteczka barwnika, enzym lub substrat, polimer organiczny, cząsteczka lateksu, Iiposom lub inny nośnik zawierające substancję wytwarzającą sygnał i jemu podobne.

Znaczną ilość enzymów użytecznych jako znaczniki ujawniono w opisach patentowych US 4,366,241, US 4,843,000 i US 4,849,338, z których wszystkie są włączone tu przez cytowanie. Znaczniki enzymatyczne użyteczne w obecnym wynalazku obejmują alkaliczną fosfatazę, peroksydazę chrzanową, lucyferazę, β-galaktozydazę, oksydazę glukozy, lizozym, dehydrogenazę jabłczanową i im podobne. Znacznik enzymatyczny może być użyty sam lub w połączeniu z drugim enzymem w roztworze.

Dogodnie, fluorofor jest wybrany z grupy obejmującej rodanek fluoresceiny (FITC), rodanek tetrametylorodaminy (TRITL) lub R-fikoerytrynę (RPE).

Wynalazek obejmuje również sposób wykrywania infekcji N. meningitidis u pacjentów, wspomniany sposób obejmuje etapy kontaktowania próbki biologicznej z pacjenta z białkiem albo białkiem fuzyjnym według wynalazku i określenia występowania lub braku kompleksu pomiędzy wspomnianym białkiem albo białkami fuzyjnymi N. meningitidis specyficznymi przeciwciałami we wspomnianej surowicy, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na wspomnianą infekcję.

W korzystnej postaci wykrycie powyższego kompleksu jest osiągnięte przez wykrycie modyfikacji wspomnianego białka albo białka fuzyjnego dogodnym znacznikiem, który jest dobrze znany w dziedzinie i użycie takiego zmodyfikowanego związku w oznaczeniu immunologicznym jakie opisano powyżej.

PL 216 780 B1

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywania bakterii N. meningitidis w próbce biologicznej podejrzanej o zawieranie tej bakterii, wspomniany sposób obejmuje etapy wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego zgodnie z wynalazkiem we wspomnianej próbce co wskazuje na obecność tej bakterii. Wykrycie wspomnianej sekwencji kwasu nukleinowego może być określone przy pomocy jakiegokolwiek dogodnego sposobu. Przykładowo, wyznakowany kwas nukleinowy zgodny z wynalazkiem może być użyty jako sonda w doświadczeniu Southern blot z kwasem nukleinowym otrzymanym od pacjenta, co jest dobrze znane w dziedzinie.

Alternatywnie, wyznakowany kwas nukleinowy według wynalazku może być wykorzystany jako sonda w doświadczeniu typu Northern blot z RNA otrzymanym od pacjenta. Korzystnie, otrzymany od pacjenta ekstrakt kwasu nukleinowego jest wykorzystany wraz ze starterami oligonukleotydowymi odpowiadającymi sensownej i antysensownej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku, lub sekwencji go otaczającej w reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego takiej jak PCR lub reakcji łańcuchowej Iigazy (LCR), co przykładowo opisano w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 89/09385, które jest włączone tu przez cytowanie.

Odpowiednie są również różnorodne zautomatyzowane techniki wykrywania na fazie stałej. Przykładowo, wielkoskalowe uporządkowania unieruchomionego startera (VLSIPS™) są użyte dla wykrywania kwasów nukleinowych jak to przykładowo opisali Fodor i wsp., 1991; Science 251 767 i Kazal i wsp., 1996, Nature Medicine 2 753. Powyższe ogólne sposoby są dobrze znane znawcom.

Kompozycje farmaceutyczne.

Dalszą cechą wynalazku jest użycie białka albo białka fuzyjnego, według wynalazku („czynniki immunogeniczne) jako czynników aktywnych w kompozycji farmaceutycznej dla ochrony pacjenta przed infekcją N. meningitidis.

Dogodnie, kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbkę.

Przez „farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozpuszczalnik lub zaróbka rozumiany jest stały lub płynny wypełniacz, rozpuszczalnik lub substancja zamykająca, która może być bezpiecznie użyta w podaniu ogólnoustrojowym. Zależnie od szczególnej drogi podania użyte mogą być różnorodne dobrze znane w dziedzinie nośniki. Nośniki te mogą być wybrane z grupy obejmującej cukry, skrobię, celulozę i jej pochodne, słód, żelatynę, talk, siarczan wapnia, oleje roślinne, oleje syntetyczne, poliole, kwas alginowy, roztwory buforowane fosforanami, emulgatory, izotoniczne roztwory soli fizjologicznej i sole takie jak sole kwasów nieorganicznych obejmujących chlorowodorki, bromki, siarczany, sole kwasów organicznych takich jak octany, propioniany i jabłczany i woda wolna od pirogenów.

Użytecznym odniesieniem literaturowym opisującym farmaceutycznie akceptowalne nośniki, rozpuszczalniki i wypełniacze jest Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. NJ. USA, 1991), która jest włączona tu przez cytowanie.

Jakakolwiek droga podania może być użyta dla dostarczenia pacjentowi kompozycji według wynalazku. Przykładowo, doustna, doodbytnicza, pozajelitowa, podjęzykowa, dopoliczkowa, donaczyniowa, dochrząstkowa, domięśniowa, doskórna, podskórna, przez inhalację, do gałki ocznej, dootrzewnowa, do płynu rdzeniowo-mózgowego, przezskórna i im podobne. Domięśniowy lub podskórny zastrzyk jest przykładowo odpowiedni dla podania immunogenicznych kompozycji, szczepionek i DNA szczepionek.

Postacie dawkowania obejmują tabletki, dyspersje, zawiesiny, zastrzyki, roztwory, syropy, pastylki, kapsułki, czopki, aerozole, plastry przezskórne i temu podobne. Te postaci dawki mogą również obejmować wstrzyki walne lub wszczepialne urządzenia kontrolujące uwalnianie za-projektowane specyficznie dla tego celu, lub inne postaci wszczepów zmienione, aby dodatkowo działały w ten sposób. Kontrolowane uwalnianie czynnika leczniczego może być spowodowane przez jego powlekanie, przykładowo hydrofobowymi polimerami obejmującymi żywice akrylowe, woski, wysoko alifatyczne alkohole, polimleczany i poli(kwasy glikolowe) i określone pochodne celulozy, takie jak hydroksypropylometyloceluloza. Ponadto, kontrolowane uwalnianie może być uzyskane przez zastosowanie innych matryc polimerowych, liposomów i/lub mikrokapsułek.

Kompozycje farmaceutyczne według obecnego wynalazku dla podania doustnego lub pozajelitowego mogą występować jako oddzielne jednostki takie jak kapsułki, saszetki lub tabletki, z których każda zawiera wcześniej określoną ilość jednego lub większej liczby czynników według wynalazku, w postaci proszku lub granulek, lub jako roztwór lub zawiesina w wodnym roztworze, niewodny roztwór, lub emulsja oleju w wodzie, lub emulsja wody w oleju. Takie kompozycje mogą być przygotowane każdym farmaceutycznym sposobem, lecz każdy ze sposobów obejmuje etap połączenia ze sobą

PL 216 780 B1 jednego lub więcej czynników jakie opisano powyżej z czynnikiem stanowiącym jeden lub więcej niezbędnych składników. Ogólnie, kompozycje są przygotowane przez jednorodne i dokładne mieszanie czynników immunogenicznych według wynalazku z płynnymi nośnikami, lub dokładnie rozdrobnionymi nośnikami stałymi lub obydwoma i następnie, jeśli jest to niezbędne, kształtowanie produktu do pożądanej postaci.

Powyższe kompozycje mogą być podane w sposób zgodny z postacią dawkowania i w takiej ilości jaka jest immunogenicznie skuteczna dla ochrony pacjentów przed zarażeniem N. meningitidis. Dawka podana pacjentowi w kontekście niniejszego wynalazku powinna być wystarczająca dla spowodowania u pacjenta korzystnej odpowiedzi przez pewien czas, takiej jak zmniejszenie poziomu N. meningitidis lub zahamowanie infekcji spowodowanej przez N. meningitidis. Ilości czynnika(ów) immunogenicznych, które będą podane mogą zależeć od leczonego podmiotu w tym od wieku, płci, wagi i jego ogólnego stanu zdrowia. Zgodnie z tym dokładne ilości immunogenicznego czynnika(ów) wymaganych dla podania będą zależały od osądu lekarza.

W określaniu skutecznej ilości czynnika immunogenicznego podanego w leczeniu lub profilaktyce przeciw N. meningitidis lekarz może oceniać poziom w osoczu w układzie krążenia postęp choroby i wytwarzanie przeciwciał przeciw N. meningitidis. W każdym przypadku dogodne dawki czynników immunogenicznych według wynalazku mogą być łatwo określone przez znawcę. Takie dawki mogą być w zakresie nanogramów lub miligramów czynników immunogenicznych według wynalazku.

Powyższe kompozycje mogą być użyte jako szczepionki terapeutyczne lub profilaktyczne. Zgodnie z tym, wynalazek rozciąga się na wytwarzanie szczepionek zawierających jako czynnik aktywny jeden lub więcej czynników immunogenicznych według wynalazku. Różnorodne, możliwe do zastosowania procedury są rozważane dla wytworzenia takich szczepionek. Przykładowe procedury obejmują przykładowo opisane w New Generation Vaccines (1997, Levine i wsp., Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, Bazylea, Hong Kong), które jest włączone tu przez cytowanie.

Czynnik immunogeniczny według wynalazku może być zmieszany, skoniugowany lub połączony z innymi antygenami obejmującymi epitopy komórki B lub T lub inne antygeny. Ponadto, może być skoniugowany z nośnikiem jak opisano poniżej.

Gdy użyte jest będące haptenem białko według wynalazku (tj. peptyd reagujący z rozpoznanymi przeciwciałami, lecz same nie mogą wywołać odpowiedzi immunologicznej), może być skoniugowany z immunogenicznym nośnikiem. Użyteczne nośniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują przykładowo: tyroglobulinę; albuminy takie jak albumina ludzkiej surowicy; toksyny, toksoidy lub jakikolwiek zmutowany materiał reagujący krzyżowo (CRM), toksyny z tężca, błonicy, płonicy, Pseudomonas, E. coli, Staphylococcus i Streptococcus, kwasy poliaminowe takie jak kwas poli(lizyna:kwas glutaminowy); grypa; rotawirus VP6, parwowirus VP1 i VP2; białko rdzenia wirusa żółtaczki typu B; zrekombinowana szczepionka przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu B i im podobne. Alternatywnie, fragmenty lub epitopy nośnikowego białka lub innego białka immunogenicznego mogą być użyte. Przykładowo, haptogenowe białko według wynalazku może być związane epitopem komórki T toksyny bakteryjnej, toksoidu, lub CRN. Zgodnie z tym, odniesienie może być uczynione do patentu USA nr 5,785,973, który jest włączony tu przez cytowanie.

Ponadto, białko lub białko fuzyjne według wynalazku może działać jako nośnik białkowy w kompozycji szczepionki skierowanej przeciw Neisseria lub przeciw innej bakterii lub wirusowi.

Czynniki immunogeniczne według wynalazku mogą być podane jako wielowartościowa podjednostka szczepionek w połączeniu z antygenem N. meningitidis, lub antygenami innych organizmów obejmujących patogeniczną bakterię H. influenzae, N. catarrhalis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae itp.. Alternatywnie, lub dodatkowo mogą być one podane wraz z oligosacharydami lub polisacharydowymi składnikami N. meningitidis.

Szczepionki mogą również zawierać farmakologicznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub wypełniacz jaki tu określono.

Szczepionki i kompozycje immunogeniczne mogą zawierać adjuwant jaki jest dobrze znany w dziedzinie. Adjuwanty rozważane przez obecne doświadczenie obejmują, lecz nie są ograniczone do substancji powierzchniowo czynnych, takich jak heksadecyloamina, oktadecyloamina, estry kwasu oktadecyloaminowego, lizolecytyna, bromek dimetylodioktadecyloamonowy, N,N-dikoktadecylo-N',N'bis(2-hydroksyetylopropanodiamina), metoksyheksadecyloglicerol i poliole pluronowe; poliaminy takie jak piran, siarczan dekstranu, poi i IC karbopol; peptydy takie jak dipeptyd muramylu i pochodne, dimetyloglicyna, tuftsyna; emulsje olejowe; żele mineralne takie jak fosforan glinu, wodorotlenek glinu lub alum; limfokiny, QuiIA i kompleks immunopobudzający (ISCOMS).

PL 216 780 B1

Wobec przykładowych adjuwantów uczynione jest również odniesienie literaturowe do publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonej tu poprzez cytowanie.

Szczepienie przez dostarczenie DNA.

Konstrukty ekspresyjne zawierające zmodyfikowane białko NhhA według wynalazku mogą być podane ludziom dla profilaktyki i/lub leczenia. Zgodnie z tym konstrukty ekspresyjne mogą kodować jeden lub więcej zmodyfikowanych polipeptydów NhhA, wyizolowanych białek i białek fuzyjnych, ogólnie określonych jako „czynniki immunogeniczne.

Konstrukty ekspresyjne obejmują również konstrukty do terapii genowej, wykorzystujące wyspecjalizowane wektory dla terapii genowej takie jak krowianka i wektory wirusowe użyteczne w terapii genowej. Te ostatnie obejmują adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusowi (AAV) takie jak opisano w Fraceshii i wsp., 2000, J. Cell Biochem. 76 476, Braun-Falco i wsp., 1999, Gene Ther. 6 432, wektory retrowirusowe i Iantiwirusowe jakie opisano w Buchshacher i wsp., 2000, Blood 95 2499 i wektory pochodzące od wirusa opryszczki i cytomegalowirusa. Ogólny przegląd wektorów dla terapii genowej i sposobu dostarczenia można znaleźć w Robbis i wsp., 1998, Trends in Biotech. 16 35. Przykładową pracą opisującą szereg wektorów potencjalnie użytecznych dla terapii genowej wykorzystują białka Neisseria i sposoby dostarczenia z publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonego tu przez cytowanie.

Immunogeniczne czynniki według wynalazku mogą być wyrażone przez attenuowane wirusy gospodarzy. Przez „atenuowane wirusy gospodarzy rozumie się wektory wirusowe, które są zarówno naturalne lub, które uczyniono zasadniczo awirulentnymi. Wirusy mogą być uczynione zasadniczo awirulentnymi w jakimkolwiek dogodnym, fizycznym (np. działanie temperaturą) lub chemicznym znaczeniu (np. działanie formaldehydem). Przez „zasadniczo awirulentny rozumie się wirus, którego infektywność zniszczono. Idealnie, infektywność wirusa jest zniszczona bez wpływania na białko warunkujące immunogeniczność wirusa. Z powyższego powinno być dostrzeżone, że attenuowani wirusowi gospodarze mogą zawierać żywe wirusy lub inaktywowane wirusy.

Atenuowani gospodarze wirusowi, którzy mogą być użyteczni w szczepionce zgodnej z wynalazkiem mogą zawierać wektory wirusowe obejmujące adenowirusy, cytomegaIowirusy i korzystnie poksywirusy jako szczepionkę (patrz przykładowo Paoletti i Panicali, patent US nr 4,603,112, który jest włączony tu przez cytowanie) i atenuowane szczepy Salmonella (patrz przykładowo Stocker patent US nr 4,550,081, który jest włączony tu przez cytowanie). Żywe szczepionki są szczególnie korzystne ponieważ powodują one przedłużone pobudzenie, które może ustanawiać zasadniczo długotrwałą odpowiedź immunologiczną. Inne cytowania opisujące różnorodne wektory wirusowe potencjalnie użyteczne dla immunizacji białkami Neisseria i sposoby dostarczenia są zawarte w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/36544 włączonej tu przez cytowanie.

Wielowartościowe szczepionki mogą być przygotowane z jednego lub większej liczby mikroorganizmów wyrażających różne epitopy N. meningitidis (np. inne niż białka powierzchniowe lub epitopy N. meningitidis). Ponadto, epitopy innych patogenicznych mikroorganizmów mogą być włączone do szczepionki.

W korzystnej postaci będzie to wymagało konstrukcji zrekombinowanej szczepionki wirusowej dla ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku. Po wprowadzeniu do gospodarza zrekombinowana szczepionka wirusowa wyraża czynnik immunogeniczny i co za tym idzie wywołuje u gospodarza odpowiedź CTL. Przykładowo, odniesienie literaturowe może być uczynione do patentu US nr 4,722,848, włączony tu przez cytowanie, opisujący wektory szczepionki i sposoby użycia ich w protokołach immunizacji.

Szeroka różnorodność innych wektorów użytecznych dla terapeutycznego podania lub immunizacji czynnikami immunogennymi według wynalazku stanie się oczywista dla znawców na podstawie obecnego wynalazku.

W kolejnej postaci sekwencja nukleotydowa może być użyta jako szczepionka w postaci szczepionki z „nagiego DNA co jest znane w dziedzinie. Przykładowo, wektor ekspresyjny według wynalazku może być wprowadzony do ssaka, gdzie powoduje wytwarzanie polipeptydu in vivo, przeciw któremu gospodarz wytwarza odpowiedź immunologiczną, jak to przykładowo opisano w Barry, M. i wsp. (1995, Nature, 377: 632-635), który jest włączony tu przez cytowanie.

PL 216 780 B1

Zestawy do wykrywania.

Obecny wynalazek może być również wykorzystany w zestawach do wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej. Będą one zawierały jeden lub więcej szczególnych czynników opisanych powyżej zależnie od charakteru użytego w teście sposobu. Zgodnie z tym, zestaw może zawierać jedno lub więcej wyizolowane białko, białko fuzyjne, przeciwciało, fragment przeciwciała lub kwas nukleinowy według wynalazku. Zestawy mogą również warunkowo zawierać odpowiednie odczynniki dla wykrywania znaczników, pozytywne i negatywne kontrole, roztwory dla płukania, bufory dla rozcieńczania i im podobne. Przykładowo, zestaw dla wykrywania oparty na kwasie nukleinowym może zawierać (i) kwas nukleinowy według wynalazku (który może być użyty jako pozytywna kontrola), (ii) starter oligonukleotydowy według wynalazku i warunkowo DNA polimerazę, DNA ligazę itd. zależnie od zastosowanego sposobu amplifikowania kwasu nukleinowego.

Przygotowanie fragmentów immunoreaktywnych.

Wynalazek może być również wykorzystany w sposobie identyfikowania immunoreaktywnego wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego według wynalazku. Sposób ten zasadniczo obejmuje wytworzenie fragmentu wyizolowanego białka lub białka fuzyjnego, podanie fragmentu ssakowi; i wykrycie u ssaka odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedź taka będzie obejmowała wytworzenie składników, które specyficznie wiążą N. meningitidis i/lub wspomniane białko lub białko fuzyjne i/lub efekt ochronny przeciw infekcji N. meningitidis.

Przed testowaniem szczególnego fragmentu z uwagi na immunoreaktywność w powyższym sposobie, różnorodne sposoby przewidywania mogą być użyte dla wydedukowania czy szczególny fragment może być użyty dla uzyskania przeciwciała reagującego krzyżowo z naturalnym antygenem.

Te sposoby przewidywania mogą być oparte na sekwencji aminokońcowej lub karboksykońcowej jak przykładowo opisano w rozdziale 11.14 Ausubel i wsp., powyżej. Alternatywnie, te sposoby przewidywania mogą być oparte na przewidywaniu hydrofilowości jak przykładowo opisano przez Kyte i Doolitle 1982, J. Mol. Biol. 157 105 i Hopp i Woods, 1983, Mol. Immunol. 20 483), które są włączone przez cytowanie lub przewidywanie struktury drugorzędowej, jak przykładowo opisali Choo i Fasman, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47 251), które są włączone tu przez cytowanie.

Dodatkowo, „mapowanie epitopu przy pomocy przeciwciał monoklonalnych według wynalazku przez identyfikację krzyżowo reagujących epitopów przez najpierw testowanie ich zdolności do dostarczenia krzyżowej ochrony, a następnie przez identyfikację epitopu rozpoznanego przez wspomniane przeciwciała. Przykładowy sposób jest opisany przez Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, powyżej.

Ogólnie, fragmenty peptydów zawierające 10 do 15 aminokwasów dają optymalne wyniki. Polipeptydy tak małe jak 6 lub tak duże jak 20 aminokwasów działają z powodzeniem. Takie fragmenty peptydowe mogą następnie być związane chemicznie z cząsteczką nośnika taką jak chemocyjanina z czareczki (KLH) lub albumina z surowicy bydlęcej (BSA) jak przykładowo opisano w rozdziałach 11.14 i 11.15 Ausubel i wsp., powyżej).

Powinno być również docenione, że peptydy mogą być sztucznie cyrkularyzowane jak to opisano w Hoogerhout i wsp., 1995, Infect. Immun. 63 3473, która jest włączona tu przez cytowanie.

Peptyd może być użyty dla immunizacji zwierzęcia jak przykładowo opisano powyżej. Miana przeciwciała przeciw naturalnemu lub rodzicielskiemu polipeptydowi, z którego wyselekcjonowano peptyd może następnie być oznaczone przykładowo oznaczeniem radioimmunologicznym lub przez ELISA, jak to przykładowo opisano w rozdziałach 11.16 i 114 Ausubel i wsp., powyżej.

Przeciwciała mogą następnie być oczyszczone z odpowiedniego płynu biologicznego zwierzęcia przez frakcjonowanie siarczanem amonu lub przez chromatografię, co jest dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe protokoły dla oczyszczania przeciwciała podano w rozdziałach 10.11 i 11.13 Ausubel i wsp., powyżej, które włączono tu przez cytowanie.

Reaktywność immunologiczna przeciwciała przeciw naturalnemu lub rodzicielskiemu polipeptydowi może być określona jakąkolwiek odpowiednią procedurą, taką jak przykładowo Western blot.

Funkcjonalne związki blokujące.

Dzikiego typu polipeptydy NhhA/HiaNm ujawnione w WO 99/31132 mają przypuszczalnie właściwości adhezyny. W rzeczywistości wykazują one pewne podobieństwo do adhezyn Haemophilus influenzae będących antygenami powierzchniowymi. Dokładniej są one w przybliżeniu w 67% homologiczne do białka Hia z H. influenzae (Barenkamp i St. Geme III, 1996, Molecular Microbiology 19 1215) i 74% homologii do białka HSF z H. Influenzae (ST. Gene III, J. i wsp., 1996, Journal of Bacteriology 178 6281 i Patent US nr 5,646, 259). W tych porównaniach wartość luki wynosi 3 i długości

PL 216 780 B1

0,01 dla użytego programu GAP (Deveraux, 1984, powyżej). Tak więc zaburzenie funkcji tych polipeptydów będzie znacząco terapeutycznie korzystne, ponieważ będą one zapobiegały wiązaniu się bakterii N. meningitidis z zarażanymi komórkami. Zaburzenie funkcji można osiągnąć różnymi sposobami.

Przykładowo podane mogą być cząsteczki takie jak odczynniki chemiczne lub polipeptydy blokujące receptory na powierzchni komórki. Konkurują one z infektywnym organizmem o miejsca na receptorze. Takie cząsteczki mogą przykładowo obejmować białka według wynalazku, szczególnie fragmenty lub jego funkcjonalne równoważniki jak również mimetyki.

Termin „mimetyki jest użyty tu dla określenia chemikaliów zaprojektowanych aby przypominały szczególne, funkcjonalne obszary białek lub peptydów. Użyte mogą być również antyidiotypowe przeciwciała rozwinięte przeciw wyżej opisanym przeciwciałom blokującym wiązanie bakterii do powierzchni komórki. Alternatywnie, cząsteczki które oddziałują z miejscami wiązania receptora w polipeptydach według wynalazku mogą skutecznie zapobiegać infekcji komórki przez N. meningitidis. Cząsteczki takie mogą zawierać blokujące przeciwciała, peptydy lub inne odczynniki chemiczne.

Wszystkie takie cząsteczki, kompozycje farmaceutyczne, w których są one połączone z farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami i sposoby leczenia pacjentów dotkniętych infekcją N. meningitidis przez podanie takich cząsteczek lub kompozycji mogą być wykorzystane zgodnie z wynalazkiem.

Polipeptydy według wynalazku mogą być użyte dla wyszukiwania związków celem ich użycia w powyższych sposobach. Przykładowo, polipeptydy według wynalazku mogą być połączone ze znacznikiem i prezentowane w hodowli komórkowej w obecności testowanego odczynnika. Następnie może być obserwowana zdolność odczynnika do hamowania wiązania wyznakowanego polipeptydu do powierzchni komórki. W takim wyszukiwaniu użyte mogą być wyznakowane polipeptydy na organizmie takim jak E. coli. Alternatywnie, sama N. meningitidis może być przebudowana do wyrażania zmodyfikowanej i wykrywalnej postaci polipeptydu. Użycie przebudowanych szczepów N. meningitidis jest preferowane, bowiem jest bardziej prawdopodobne, że trzeciorzędowa struktura białka będzie bardziej przypominała to, które ulega ekspresji w bakterii typu dzikiego.

Aby wynalazek mógł być lepiej zrozumiany i zastosowany praktycznie, obecnie opisane będą szczególnie korzystne postaci przez poniższe nieograniczające przykłady.

P r z y k ł a d 1

Identyfikacja stałych i zmiennych obszarów polipeptydów NhhA

Wynalazek wyznacza sekwencje aminokwasowe NhhA, które są konserwatywne i/lub niekonserwatywne pomiędzy dziesięcioma (10) szczepami N. meningitidis. Niekonserwatywne obszary są dalej podzielone na cztery obszary zmienne (V1, V2, V3 i V4) i obszary konserwatywne są dalej podzielone na C1, C2, C3, C4 i C5 (jak przedstawiono na Fig. 1 i w Tabeli 1; SEQ ID NO:1-11). Porównanie odpowiedniej sekwencji nukleotydowej jest przedstawione na Fig. 2 (SEQ ID NO:12-22).

P r z y k ł a d 2

Nadekspresja polipeptydu NhhA w PMC 21.

Białko NhhA kodowane przez gen nhhA N. meningitidis szczepu PMC 21 ulegało nadekspresji przez przygotowanie konstruktu ekspresyjnego, w którym gen nhhA jest połączony funkcjonalnie z promotorem.

Poniższe startery oligonukleotydowe użyto dla amplifikacji przez PCR sekwencji otwartej ramki odczytu dla nhhA szczepu PMC 21 N. meningitidis:

- HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40); zawierająca miejsce restrykcyjne dla EagI (podkreślona) i sekwencję kodującą pierwsze 7 (siedem) aminokwasów NhhA (pogrubione),

- ΗΟΜΡ3ΆΝ 5'-TGG AAT CCATGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41); zawierająca miejsce restrykcyjne dla NcoI (podkreślona) i odwróconą, komplementarną sekwencję 48-61 nukleotydów za końcem otwartej ramki odczytu nhhA szczepu φ3 (pogrubione).

Produkt amplifikacji zawiera miejsca restrykcyjne, które są następnie strawione endonukleazami restrykcyjnymi EagI i NcoI.

Plazmidem dla subklonowania był pCO14K zawierający promotor porA, powyżej genu kodującego ulegające silnej ekspresji białko Klasy 1 z zewnętrznej błony N. meningitidis wraz z otaczającą sekwencją szczepu 2996 N. meningitidis i selekcyjnego genu oporności na kanamycynę co opisali Rouppe van der Voort i wsp., Infect. Immun. 1996 64 2745.

PL 216 780 B1

Strawiony produkt amplifikacji następnie wbudowano przy pomocy Iigazy do strawionego endonukleazami restrykcyjnymi EagI i NcoI pCO14K. Reakcja Iigazy doprowadziła do zastąpienia głównej otwartej ramki odczytu porA produktem amplifikacji nhhA (Fig. 3). Stwarza to konstrukt dla rekombinacyjnej ekspresji kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na SEQ ID NO:12) kodujący polipeptyd o 591 aminokwasach przedstawiony na SEQ ID NO:1.

To powoduje, że ekspresja kwasu nukleinowego dla nhhA według wynalazku znajduje się pod kontrolą silnego promotora porA. Translacja rozpoczyna się od kodonu ATG w pozycji 31 HOMP5'. Dla zapobieżenia tworzeniu fuzji pomiędzy porA i nhhA sekwencja HOMP5' zawiera kodon stop TAA przed opisanym powyżej kodonem inicjacji translacji ATG.

Otrzymany plazmid pIP52(PMC21) Iinearyzowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym i użyto dla transformacji N. meningitidis szczepu G2 przy pomocy sposobu opisanego przez Janik i wsp., 1976, Journal of Clinical Microbiology 4 71. Transformanty selekcjonowano przez całonocną inkubację w 37°C w 5% CO₂ na podłożu stałym zawierającym 100 μg/ml kanamycyny. Selekcjonowano kolonie odporne na kanamycynę, które subhodowano przez noc i sprawdzano pod względem nadekspresji polipeptydu NhhA przez rozdział elektroforetyczny całkowitych białek komórkowych przez SDS-PAGE w 10% żelu, a następnie przeniesienie na filtr nitrocelulozowy przy pomocy Semi-Dry Blotter (BioRad). Filtr następnie inkubowano kolejno z króliczą surowicą anty-NhhA (jak opisano w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym WO 99/31132) i skoniugowane z alkaliczną fosfatazą przeciwciało przeciw króliczemu IgG (Sigma) przed kolorymetrycznym wykryciem przy pomocy NBT/BCIP (Sigma). Wyizolowano jeden klon wyrażający z dużą wydajnością polipeptyd NhhA w porównaniu ze szczepem rodzicielskim (Fig. 11). Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programu eGCG dostępnego w www.angis.org.au) wskazuje, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte wytwarzając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:33).

Konstrukt plazmidu pIP52(PMC21) może być wprowadzony przez transformację do jakiegokolwiek kompetentnego pod względem transformacji szczepu N. meningitidis.

P r z y k ł a d 3

Nadekspresja polipeptydu NhhA w H41.

Białko NhhA kodowane przez gen nhhA szczepu H41 N. meningitidis ulegało nadekspresji przy pomocy tego samego sposobu jaki opisano w Przykładzie 2. Dla stworzenia zrekombinowanego kwasu nukleinowego będącego konstruktem ekspresyjnym (otwarta ramka odczytu przedstawiona na SEQ ID NO:13) kodującego polipeptyd o 591 aminokwasach, przedstawiony na SEQ ID NO:2. W przykładzie tym otrzymany plazmid pIP52(H41) Iinearyzowano i transformowano do N. meningitidis szczepu 7G2. Kolonie odporne na kanamycynę analizowano i wybrano jedną, która w badaniu immunologicznym Western blot ujawniła nadekspresję NhhA (Fig. 11). Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu oprogramowania eGCG dostępnego w www.anais.orq.au) wykazała, że 51 aminokwasów po odcięciu generuje dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:34).

Strategia ta może być zastosowana dla stworzenia konstruktów ekspresyjnych, zawierających dzikiego typu sekwencję nhhA z innych szczepów N. meningitidis.

P r z y k ł a d 4

Konstrukcja mutantów delecyjnych przy pomocy dogodnego miejsca restrykcyjnego.

Dla łatwości cytowania sekwencję aminokwasowa polipeptydu NhhA kodowanego przez kwas nukleinowy nhhA szczepu PMC21 przedstawiono na SEQ ID NO:1, stworzono wersję delecyjnej mutacji dzikiego typu nhhA z PMC21, w którym usunięty był najbardziej zmienny w szczepach obszar. Produkt amplifikacji kodujący aminokwasy 1-54 polipeptydu NhhA z PMC21 typu dzikiego wytworzono przez amplifikację PCR na matrycy kwasu nukleinowego nhhA przy pomocy poniższych starterów:

HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia nadeksprymującego konstruktu pIP52.

NHB'BG: 5'-GGT CAGATCTGT TTC ATT GTT AGC ACT TGC-3' (SEQ ID NO:42) zawierająca miejsce restrykcyjne dla BgIII (pokreślona) i odwróconą komplementarną sekwencję kodująca aminokwasy 134, (podwójnie podkreślone) i 49-54 dzikiego typu PMC21 NhhA (pogrubione).

Otrzymany produkt amplifikacji obejmuje miejsca dla endonukleazy restrykcyjnej EagI i BgIII. pIP52(PMC21) obejmuje jedno miejsce EagI 20 par zasad powyżej miejsca inicjacji otwartej ramki odczytu (ORF) nhhA i pojedynczego miejsca BgIII umiejscowionego w ORF (patrz Fig. 3B). Tak więc,

PL 216 780 B1 pIP52(PMC21) i produkt amplifikacji były poddane trawieniu endonukleazą restrykcyjną EagI i BgIII, łączone przy pomocy Iigazy i użyte dla transformacji kompetentnego szczepu bakterii E. coli DH5a; w ten sposób zastąpiono fragment Eagl/Bglll plazmidu pIP52(PMC21) produktem PCR. Daje to ekspresyjny konstrukt zrekombinowanego kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na Fig. 5; SEQ ID NO:28) kodujący polipeptyd o 512 aminokwasach, przedstawiony na Fig. 5 (SEQ ID NO:23). Ta sekwencja aminokwasowa obejmuje aminokwasy 1-54 i 134-592 sekwencji typu dzikiego, co za tym idzie, z usuniętą większą częścią obszaru V1, całymi obszarami V2 i C2, i częścią obszaru C3 z dzikiego typu polipeptydu NhhA z PMC21.

Plazmid Iinearyzowano przez trawienie restrykcyjne i wprowadzono przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów jakie opisano w Przykładzie 1 wyizolowano jeden klon wykazujący nadekspresję skróconego NhhA z PMC21 (Fig. 11).

Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego

SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego w www.anais.org.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzałe białko (Fig. 14; SEQ ID NO:35). Dla potwierdzenia występowania sekwencji sygnałowej, która może być przecięta i potwierdzenia identyczności ulegającego nadekspresji białka, częściowo oczyszczono zewnętrzne błony białka przez izolowanie frakcji nierozpuszczalnej w detergencie sarkozylu.

Wyizolowane białka błonowe rozdzielono elektroforetycznie przed przeniesieniem na filtr Nylon. Lokalizację białka ulegającego nadekspresji ujawniono przez barwienie Coomassie. Ten obszar filtru wycięto i określono sekwencję nukleotydową N-końca. Pierwsze jedenaście aminokwasów białka było jak następuje XXETDLTSVGT, co odpowiada aminokwasom 52-62 (włącznie) sekwencji aminokwasowej wydedukowanej, że będzie ulegała ekspresji z konstruktu ekspresyjnego określonego w tym przykładzie.

Jest to przykład uzyskania delecji z wykorzystaniem istniejących w sekwencji polinukleotydowej miejsc restrykcyjnych. Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek, zdolnej do transformacji N. meningitidis.

P r z y k ł a d 5

Konstrukcja mutanta NhhA z delecją przy pomocy dogodnego miejsca restrykcyjnego.

Konstrukt ekspresyjny zawierający dzikiego typu sekwencję nhhA z H41 skonstruowano tak, jak opisano to w Przykładzie 2. Otrzymany konstrukt ekspresyjny nazwano pIP52(H41). Mutant delecyjny został sporządzony przy pomocy strategii podanej w tym Przykładzie. W tym przypadku użyto następujących starterów oligonukleotydowych:

HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia konstruktu pIP52 wykazującego nadekspresję.

NH3'BG: 5'-GAT CAG GCC TGT ATC TTC ATC GGT AGC ATT-3' (SEQ ID NO:43) zawierająca miejsce restrykcyjne dla Stul (pokreślona) i odwróconą komplementarną sekwencję kodującą aminokwasy 134, (podwójnie podkreślone) i 49-54 dzikiego typu H41 NhhA (pogrubione).

Otrzymany produkt amplifikacji obejmuje pojedyncze miejsca restrykcyjne dla endonukleazy EagI i Stul. pIP52(H41) zawiera te miejsca restrykcyjne. Tak więc, pIP52(PMC21) i produkt amplifikacji były poddane trawieniu endonukleazą restrykcyjną EagI i Stul, łączone przy pomocy Iigazy i użyte dla transformacji kompetentnego szczepu bakterii E. coli DH5a; w ten sposób zastąpiono fragment Eagl/Stul plazmidu pIP52(PMC21) produktem PCR. Daje to ekspresyjny konstrukt zrekombinowanego kwasu nukleinowego (otwarta ramka odczytu przedstawiona na Fig. 6; SEQ ID NO:29) kodujący polipeptyd o 513 aminokwasach przedstawiony na Fig. 6 i SEQ ID NO:23. Ta sekwencja aminokwasowa obejmuje aminokwasy 1-54 i 134-593 sekwencji typu dzikiego, co za tym idzie, z usuniętą większą częścią obszaru V1, całymi obszarami V2 i C2 i częścią obszaru C3 z dzikiego typu polipeptydu NhhA z H41.

Plazmid Iinearyzowano przez trawienie restrykcyjne i wprowadzono przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów jakie opisano w Przykładzie 1 wyizolowano jeden klon wykazujący nadekspresję skróconego NhhA z H41 (Fig. 11).

Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego w www.anqis.orq.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzałe białko (Fig. 14; SEQ ID NO:36).

Konstrukt ten może zostać wprowadzony do jakichkolwiek kompetentnych komórek N. meningitidis.

PL 216 780 B1

P r z y k ł a d 6.

Konstrukcja mutanta z delecją w NhhA przy pomocy PCR na zakładkę.

Ponadto, poza wykorzystaniem dogodnych miejsc restrykcyjnych dla usunięcia obszarów zmiennych z nukleotydów kodujących NhhA mogą być również skonstruowane mutanty przy pomocy PCR „na zakładkę jak to opisali Ho i wsp., 1989, powyżej i Horton, R.M. i wsp., 1989, powyżej. W ten sposób mogą być wytworzone polinukleotydy kodujące obszary stałe, lecz z usuniętymi obszarami zmiennymi (patrz Fig. 5A, 5B, 5C).

W tym przykładzie sporządzono konstrukt zawierający obszary C1 i C5 z usuniętymi wszystkimi pozostałymi obszarami (patrz Fig. 5A).

Poniższe oligonukleotydowe startery użyto w reakcjach PCR dla amplifikacji odpowiedniego obszaru DNA dla C1 (patrz Fig. 1) na matrycy chromosomowego DNA szczepu PMC21:

HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40), który jest tym samym oligonukleotydem, który użyto dla stworzenia nadeksprymującego konstruktu pIP52(PMC21).

SO-C: 5'-GAC GAA ATC AAC GTT CTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT TGC-3' (SEQ ID NO:44); która to sekwencja jest odwrotna i komplementarna do sekwencji kodującej aminokwasy 237-241 począwszy od rejonu C5 (podkreślony) i aminokwasy 45-52 na końcu obszaru C1 (pogrubionym drukiem) i dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21.

Produktem amplifikacji tej reakcji jest HOMP5'/SO-C.

Poniższe oligonukleotydowe startery użyto w reakcjach PCR dla amplifikacji C5 z chromosomalnego DNA szczepu PMC21:

SO-D: 5'-AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT -3' (SEQ ID NO:45); kodująca aminokwasy 237-244 od początku C5 (podkreślenie wskazuje odwrotną komplementarną sekwencję startera SO-C),

ΗΟ3ΆΝ: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41); który jest tym samym starterem użytym dla konstrukcji pIUP52.

Produktem reakcji amplifikacji jest SO-D/H03'AN.

Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-C i SO-D/H03'AN oczyszczono w żelu agarozowym, po rozdzieleniu przez elektroforezę, zmieszano i poddano dalszej amplifikacji przy pomocy starterów HOMP5' i ΗΟ3ΆΝ. Otrzymany produkt amplifikacji kodował aminokwasy 1-52 i 337-591 dzikiego typu NhhA z PMC21. Ten produkt amplifikacji poddano trawieniu restrykcyjnemu EagI i NcoI i klonowano w pCO14K jak to opisano w Przykładzie 1. Taka zrekombinowana cząsteczka posiada obszary C1 i C5, ale ma usunięte obszary V1 do 4 i C2 do 4. Sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu jest przedstawiona na Fig. 7 i SEQ ID NO:30 i wydedukowana sekwencja polipeptydowa pochodząca z sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona na Fig. 7 i SEQ ID NO:25.

Plazmid ten był Iinearyzowany przez trawienie restrykcyjne i wprowadzony przez transformację do szczepu 7G2 N. meningitidis. Przy pomocy sposobów opisanych w Przykładzie 2 wyizolowano jeden klon, który wykazywał nadekspresję skróconego NhhA z PMC21.

Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego z www.angis.org.au) wskazuje, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte, dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:37).

Plazmid może być wprowadzony do jakiegokolwiek kompetentnego pod względem transformacji szczepu N. meningitidis.

P r z y k ł a d 7

Konstrukcja mutanta delecyjnego NhhA przez PCR na zakładkę.

Powinno być dostrzeżone, że ta sama strategia może być użyta dla stworzenia zrekombinowanych polinukleotydów kodujących różne obszary kodujące NhhA. Wykonany może być konstrukt zawierający obszary C1, C4, V4 i C5 przy pomocy następującej strategii (patrz Fig. 5B):

obszar C1 jest amplifikowany przy pomocy starterów oligonukleotydowych:

HOMP5': 5'-CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40);

SO-E: 5'-AAC GCT TGC CGC ACG CTT AGC ACT TGC CTG CAA CGT TGC-3' (SEQ ID NO:46); będąca sekwencją odwrotną i komplementarną do kodującej aminokwasy 211-215 począwszy od obszaru C4 (podkreślony) skończywszy na obszarze C1 (pogrubiona czcionka) szczepu PMC21.

PL 216 780 B1

Produktem amplifikacji w tej reakcji jest HOMP5'/SO-E.

Poniższe startery oligonukleotydowe są użyte w reakcjach PCR dla amplifikacji obszaru C4, V4 i C5 na matrycy chromosomalnego DNA szczepu PMC21:

SO-F: 5'-CGT GCG GCA AGC GTT AAA GAC GTA- 3' (SEQ ID NO 47); kodująca aminokwasy 211-218 począwszy od początku C4 (podkreślone wskazują obszar odwrócony i komplementarny do startera SO-E),

HO3ΆΝ: 5'-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3 (SEQ ID NO:41).

Produkt amplifikacji tej reakcji to SO-F/HOMP3'.

Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-E I SO-F/H03'AN oczyszczono z żelu agarozowego po rozdzieleniu przez elektroforezę, zmieszano i poddano kolejnej amplifikacji stosując startery HOMP5' i HO3ΆΝ. Uzyskany produkt koduje aminokwasy 1-52 i 211-591 dzikiego typu nhhA z PMC21. Produkt amplifikacji będzie poddany trawieniu enzymami restrykcyjnymi EagI i NcoI i sklonowano go w pCO14K. Ta zrekombinowana cząsteczka zawiera obszary C1, C4, V4 i C5 tak więc ma usunięte obszary V1-3 i C2-3. Sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu przedstawiono na Fig. 8 i jako SEQ ID NO:31 i wydedukowaną sekwencję nukleotydową pochodzącą z tej sekwencji nukleotydowej przedstawiono na Fig. 8 i SEQ ID NO: 26. Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu SIGCLEAVE (część pakietu eGCG oprogramowania dostępnego z www.angis.org.au) wykazała, że pierwsze 51 aminokwasów będzie odcięte dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:38). Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek kompetentnej pod względem transformacji N. meningitidis.

P r z y k ł a d 8

Konstrukcja mutanta delecyjnego przez PCR na zakładkę.

Powinno być docenione, że podobna strategia może być użyta dla stworzenia zrekombinowanych polinukleotydów kodujących różne obszary NhhA. Może być sporządzony konstrukt zawierający obszary C1, C2, C3, C4 i C5 przy pomocy poniższej strategii (patrz Fig. 5C):

C1 i C2 będą amplifikowane przy pomocy oligonukleotydowych starterów

HOMP5': 5'- CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO:40);

SO-G: 5' - CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT CAG GTT GTC GCC GGC TTT GAG GGT GTT AGC ACT TGC CTG AAC CGT-3' (SEQ ID NO: 48); nici odwrotnej i komplementarnej dla kodującej aminokwasy 125-129 od początku obszaru C3 (podkreślony), cały obszar C2 (aminokwasy 109-120, pogrubione i podwójnie podkreślone) i koniec obszaru C1 (aminokwasy 46-52, pogrubione) szczepu PMC21.

Produktem amplifikacji w tej reakcji jest HOMP5'/SO-G.

Obszar C3 i część obszaru C4 będzie amplifikowany przy pomocy poniższych oligonukleotydowych starterów:

SO-H: 5'- TTC ACC TAC TCG CTG AM AAA GAC-3' (SEQ ID NO:49); kodujący aminokwasy 125-132 od początku C3 (podkreślenie wskazuje obszar odwrócony i komplementarny do startera SO-G).

SO I: 5 - GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC CGC ACG ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT-3' (SEQ ID NO:50); kodująca odwrócone i komplementarne aminokwasy 182-88 na końcu C3 (podkreślone) i aminokwasy 211-222 z C4 (pogrubiona czcionka).

Produktem amplifikacji jest SO-H/SO-I.

Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-G i SO-H/SO-I są oczyszczone z żelu agarazowego po rozdziale elektroforetycznym, zmieszane i poddane dalszej amplifikacji przy pomocy starterów HOMP5' i SO-I co daje produkt kodujący aminokwasy 1-52, 103-114, 125-188 i 211-222, to jest obszary C1, C2, C3 i częściowo C4. Produkt amplifikacji tej reakcji to HOMP5'/SO-I.

C5 i część obszarów C4 zamplifikowano przy pomocy poniższych starterów oligonukleotydowych:

SO-J: 5'- GTA TTA AAC CGT GGC TGG AAC ATT AAA GGC GTT AAA AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT-3' (SEQ ID NO:51) kodujący aminokwasy 218-229 z C4 (podkreślone) i aminokwasy 237-243 z C5 (pogrubione) dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21 (obszar pogrubiony i podkreślony oznacza sekwencję odwróconą i komplementarną do SO-I).

HO3ΆΝ: 5'- TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C-3' (SEQ ID NO:41). Produktem amplifikacji w tej reakcji jest SO-J/H03'AN.

Produkty amplifikacji HOMP5'/SO-I I SO-J/H03'AN będą oczyszczone z żelu agarazowego po rozdziale elektroforetycznym, i będą zmieszane, i poddane kolejnej amplifikacji przy pomocy starterów

PL 216 780 B1

HOMP5' i HO3ΆΝ. Otrzymany produkt koduje aminokwasy 1-52, 103-114, 125-188, 211-229 i 237-591 dzikiego typu NhhA ze szczepu PMC21. Otrzymany produkt będzie poddany trawieniu restrykcyjnemu przy pomocy EagI i NcoI i klonowany w pCO14K. Taka zrekombinowana cząsteczka zawiera obszary C1, C2, C3, C4 i C5 i co za tym idzie usunięte są obszary V1, V2, V3 i V4. Sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu przedstawiono na Fig. 9 i SEQ ID NO:32 i wydedukowaną sekwencję polipeptydu pochodzącą od tej sekwencji nukleotydowej przedstawiono na Fig. 9 i SEQ ID NO:27. Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej przy pomocy programu komputerowego SIGCLEAVE (część pakietu programów eGCG dostępnego z www.anqis.org.au) wykazała, że pierwsze 49 aminokwasów będzie odcięte dając dojrzały polipeptyd (Fig. 14; SEQ ID NO:39).

Konstrukt ten może być wprowadzony przez transformację do jakiejkolwiek kompetentnej pod względem transformacji N. meningitidis.

P r z y k ł a d 9

Oczyszczanie polipeptydów NhhA po nadekspresji.

Zrekombinowany polipeptyd NhhA jaki opisano we wcześniejszych Przykładach może być wyizolowany przy pomocy poniższej procedury. Bakterie są hodowane przez noc (12-14 godzin) w 37°C w atmosferze z 5% CO2. (W tym Przykładzie pożywką był agar BHI uzupełniony podłożem Laventhala. Inne pożywki hodowlane są dobrze znane znawcom). Bakterie z dziesięciu 25 ml szalek z agarem zbierano i zawieszano w 25 ml 10 mM Tris, którego pH ustalono do 8,0 przy pomocy HCI. Równa objętość 10 mM Tris (pH 8,0) zawierająca 2% sarkozyl była dodana i mieszaninę dokładnie mieszano przez 1 godzinę w 4°C. Następnie wirowano ją przy 100 tys. x g przez 70 minut w 20°C i nadsącz odrzucano. Osad zawieszono w 25 ml 10 mM Tris (pH 8,0) zawierającym 1% sarkozyl przepuszczając przez igłę o rozmiarze 25. Tak otrzymany roztwór wirowano przy 100 000 x g przez 70 minut w 20°C i nadsącz odrzucono. Osad zawieszono w 10 ml 10 mM Tris (pH 8,0) przepuszczając przez igłę o rozmiarze 25. Frakcja ta zawiera składniki komórkowe nie rozpuszczalne w sarkozylu i jest wzbogacona w białka zewnętrznej błony. (Dodatkowy etap może być uwzględniony dla usunięcia resztek sarkozylu, co za tym idzie, roztwór białka jest dializowany przez cztery cykle 4-8 godzinne wobec 100-1000 objętości przykładowo 10 mM Tris-HCI pH 8,0 lub PBS (bufor fosforanowo solankowy) w 4°C.

Posiadając określone stężenia białka w zawiesinie przez pomiar adsorbancji przy długości fali 280 nm lub przy pomocy zestawu BCA (Pierce) około 1 ml roztworu zawierającego 10 mg białka w roztworze zawierającym 1% SDS (sól sodowa siarczanu laurylu), 2% β-merkaptoetanol rozdzielono w 6% SDS-PAGE o grubości 1,5 mm w aparacie BioRad mini-protean II. Wysoko cząsteczkowe NhhA wymywano z żelu przy pomocy „miniWholegelEluter firmy BioRad. Około 10% każdej wymytej frakcji sprawdzano przez rozdział SDS-PAGE, a następnie barwienie Coomassie. Łączono frakcje zawierające NhhA zasadniczo wolny od innych białek. Procedurę tą przeprowadzono celem wyizolowania ulegającego nadekspresji dojrzałego NhhA jaki opisano w Przykładzie 2 (SEQ ID NO:1), ulegającego nadekspresji dojrzałego NhhA mutanta delecyjnego BgIII jakiego opisano w Przykładzie 4 (SEQ ID NO:23) i ulegającego nadekspresji mutanta delecyjnego NhhA jaki opisano w Przykładzie 6 (SEQ ID NO:25). Wyizolowane białko przedstawiono na Fig. 12.

P r z y k ł a d 10

Immunogeniczność polipeptydów NhhA z delecją.

Myszy zaszczepiono oczyszczonymi polipeptydami NhhA typu dzikiego i ich wariantami delecyjnymi, jakie wcześniej opisano w Przykładach. W jednej grupie każda mysz BaIb/c była zaszczepiona podskórnie 130 μg NhhA z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 115 ng w dniu 14. W drugiej grupie każda mysz była zaszczepiona podskórnie 120 μg białka z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 190 μg w dniu 14. W trzeciej grupie każda mysz była zaszczepiona podskórnie około 260 μg białka z MPL+TDM™ jako adjuwantem (otrzymany z Sigma-Aldrich) w dniu 0 i 1240 μg w dniu 14. Próbki krwi pobrano w dniu 21 i wyekstrahowano surowicę. Surowicę tę testowano z uwagi na występowanie pełnej długości NhhA z PMC 21 przez blot immunologiczny typu Western (Fig. 13). Preparaty OMC (5 mg) P6 (nadekspresja NhhA z PMC21) i szczepu 2A (zniesienie ekspresji NhhA) rozdzielono przez SDS-PAGE w 6% żelu prowadząc elektroforezę w aparacie Mini Protean II firmy BioRad. Białka przeniesiono elektroforetycznie na nitrocelulozę i filtry cięto na 3 mm paski, a następnie blokowano w 5% odtłuszczonym mleku w PBS. Mysią surowicę rozcieńczono 1:1000 i 1:10 000 w 5% odtłuszczonym mleku w proszku i inkubowano z paskami nitrocelulozy. Wiązanie przeciwciała wykryto stosując alkaliczną fosfatazę skonigowaną z przeciwciałem anty mysie IgG (Sigma) przed kolorymetrycznym wykryciem NBT/BCIP (Sigma). Z Fig. 13 można zobaczyć, ze możliwym jest wywołanie odpowiedzi immunologicznej przePL 216 780 B1 ciw dojrzałemu, o pełnej długości, polipeptydowi NhhA z PMC21, przez zaszczepienie NhhA z delecjami lub pełnej długości dojrzałymi polipeptydami NhhA.

P r z y k ł a d 11

Ekspresja mutanta delecyjnego polipeptydu w E. coli.

Poza ekspresją zmienionych w wyniku mutacji polipeptydów według wynalazku w N. meningitidis mogą być one również wyrażone w bakterii E. coli. Jako matryca dla amplifikacji przez PCR użyty może być którykolwiek z mutantów delecyjnych zrekombinowanego nhhA z Przykładów 4-8. Startery oligonukleotydowe mogą być użyte jak opisano w Międzynarodowej Publikacji Patentowej WO 99/31132 (takie jak SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 z tego dokumentu). Produkt amplifikacji może być strawiony restrykcyjnie enzymami BamHI/Hindlll i włączony przy pomocy Iigazy do plazmidu pMALC2 strawionego enzymami restrykcyjnymi BamHI/Hindlll i uzyskany plazmid jest wprowadzony przez transformację do kompetentnych komórek E. coli szczepu DH5a. Uzyskany szczep może być zaindukowany dla ekspresji na wysokim poziomie zrekombinowanego białka przez zastosowanie warunków zalecanych przez producenta pMALC2. Otrzymane zrekombinowane białko jest fuzją białka wiążącego maltozę i zmienionego w wyniku mutacji typu delecja polipeptydu NhhA według wynalazku. Może być on częściowo oczyszczony przez rozdział w SDS-PAGE, a następnie elektroelucję przy pomocy urządzenia Mini-Gel Electro-eluter (BioRad) zgodnie z zaleceniami producentów. Częściowo oczyszczone białko fuzyjne może być następnie dializowane wobec PBS, przed trawieniem proteazą Xa dla odcięcia od zrekombinowanego białka NhhA cząsteczki białka wiążącego maltozę. Zrekombinowane białko NhhA może być oczyszczone typowymi sposobami, jak przykładowo opisali R.K. Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, Nowy Jork, NY USA, 1993).

Przez wyszczególnienie opisano cel korzystnych postaci wynalazku nieograniczając wynalazku do jakiejkolwiek postaci lub specyficznego zbioru właściwości. Co za tym idzie, powinno być dostrzeżone przez znawcę, że w świetle tego ujawnienia różne modyfikacje i zmiany mogą być wprowadzone do określonych przykładowych postaci bez odbiegania od zakresu obecnego wynalazku.

Wszystkie programy komputerowe, algorytmy, patentowa i naukowa literatura, które są tu cytowane są włączone tu przez cytowanie.

T a b e l a 1

	C1	V1	C2	V2	C3	V3	C4	V4	C5
Konsensus SEQ ID NO:11	1-50	51-108	109-120	121-134	135-198	199-220	221-239	240-248	249-604
PMC21 SEQ ID NO: 1	1-50	51-108	109-120	121-124	125-188	189-210	211-229	230-236	237-591
H41 SEQ ID NO: 2	1-50	51-102	103-114	115-124	125-188	189-210	211-229	230-236	237-591
P20 SEQ ID NO: 3	1-50	51-105	106-117	118-121	122-185	186-205	206-224	225-234	235-589
EG327 SEQ ID NO: 4	1-50	51-104	105-116	117-126	127-190	191-212	213-231	232-238	239-594
EG329 SEQ ID NO: 5	1-50	51-108	109-120	121-124	125-188	189-210	211-229	230-236	237-591
H38 SEQ ID NO: 6	1-50	51-105	106-117	118-131	132-195	196-217	218-236	237-243	244-599
H15 SEQ ID NO: 7	1-50	51-104	105-116	117-130	131-194	195-216	217-235	236-242	243-598
BZ10 SEQ ID NO: 8	1-50	51-104	105-116	117-130	131-194	195-216	217-235	236-242	243-598
BZ198 SEQ ID NO: 9	1-50	51-104	105-116	117-126	127-190	191-212	213-231	232-238	239-594
Z2491 SEQ ID NO:10	1-50	51-102	103-114	115-124	125-188	189-208	209-227	228-236	237-592

PL 216 780 B1

T a b e l a 2

Oryginalny aminokwas	Przykładowa substytucja
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn, Gln
He	Leu, Val
Leu	He, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	He, Leu

PL 216 780 B1

Lista sekwencji <110> Uniwersytet Queensland <120> Zmodyfikowany antygen powierzchniowy <130> jenningspeak <140> ΧΧΧΧΧ <141> 2001-01-25 <150> US 60/177,917 <151> 2000-01-25 <150> PCT/AU01/00069 <151> 2001-01-25 <160> 52 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 591 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile 1 5

Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg 20

Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala 35 40

Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gin 50 55

Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro 60

Val Gin Arg Thr Val Ala Val Leu 65 70

Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly 75 80

Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu 85

Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 90 95 '

Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr 100

Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 105 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin 115 120

Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu

Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu

PL 216 780 B1

130 135 140

Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

PL 216 780 B1

Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser 435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495

Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525

Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn 565 570 575

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp 580 585 590 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2

PL 216 780 B1

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 500 505 510

Asn Val Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 515 520 525

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 530 535 540

Gly Gly Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser 545 550 555 560

Ser Ile Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly 565 570 575

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 3 <211> 589 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Glu Asp Glu Glu Leu Glu Ser Val Ala 50 55 60

Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80

Glu Ile Glu Ser Thr Gly Asp Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110

PL 216 780 B1

LŚu Lys Ile Lys Gin Ser Gly Lys Asp Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 115. 120 125

Glu Leu Lys Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 130 135 140

Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 145 150 155 160

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu 165 170 175

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Ala Gly Ser Ser Ala 180 185 190

Ser His Val Asp Ala Gly Asn Gin Ser Thr His Tyr Thr Arg Ala Ala 195 200 205

Ser Ile Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys 210 215 220

Thr Gly Ser Thr Thr Gly Gin Ser Glu Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 225 230 235 240

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val 245 250 255

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly 260 265 270

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 275 280 285

Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 290 295 300

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 305 310 315 320

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 325 330 335

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 340 345 350

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys

PL 216 780 B1

355 360 365

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 370 375 380

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 385 390 395 400

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 405 410 415

Val Asn. Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 420 425 430

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 435 440 445

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 450 455 460

Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 465 470 475 480

Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin 485 490 495

Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 500 505 510

Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 515 520 525

Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 530 535 540

Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 545 550 555 560

Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 565 570 575

Gly His Phe Gly Thr Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 <210> 4 <211> 594

PL 216 780 B1 <212> PRT <213> Neisseria meningitićtis <400> 4

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Ser Thr Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Val Thr Glu Asp Ser Asn Trp Gly Val Tyr Phe Asp Lys Lys 85 90 95

Gly Val Leu Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr 115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu 130 135 140

Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Ser Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Lys Thr Ala Glu Thr Asn Gly Asp 165 170 175

Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 195 200 205

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220

PL 216 780 B1

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 225 230 235 240

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 245 250 255

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Arg Thr 260 265 270

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285

Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Asp Ser Ser Thr Asp 290 295 300

Lys Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 305 310 315 320

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 340 345 350

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 355 360 365

Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 370 375 380

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 385 390 395 400

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile 420 425 430

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 435 440 445

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys

PL 216 780 B1

465	470	475	480
Pro Val Arg Ile Thr	Asn Val Ala	Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp	Val
485		490 495
Thr Asn Val Ala Gin	Leu Lys Gly	Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn	His
500		505 510
Ile Asp Asn Val Asp	Gly Asn Ala	Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala	Ile
515	520	525
Ala Thr Ala Gly Leu	Val Gin Ala	Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met	Met
530	535	540
Ala Ile Gly Gly Gly	Thr Tyr Arg	Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile	Gly
545	550	555	560
Tyr Ser Ser Ile Ser	Asp Gly Gly	Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr	Ala
565		570 575
Ser Gly Asn Ser Arg	Gly His Phe	Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly	Tyr
580		585 590
Gin Trp
<210> 5
<211> 591
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 5
Met Asn Glu Ile Leu	Arg Ile Ile	Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala	Trp
1 5		10 15
Val Val Val Ser Glu	Leu Thr Arg	Asn His Thr Lys Arg Ala Ser	Ala
20		25 30
Thr Val Lys Thr Ala	Val Leu Ala	Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val	Gin
35	40	45
Ala Ser Ala Asn Asn	Glu Glu Gin	Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp	Pro
50	55	60
Val Leu Arg Thr Val	Ala Val Leu	Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu	Gly
65	70	75	80

PL 216 780 B1

Thr Gly Glu. Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr 85 90 95

Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala 100 105 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser 115 120 125

Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu 130 135 140

Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys 145 150 155 160

Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr 165 170 175

Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn 180 185 190

Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu 195 200 205

Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn 210 215 220

Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe 225 230 235 240

Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr 245 250 255

Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val 260 265 270

Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu 275 280 285

Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly 290 295 300

Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala 305 310 315 320

PL 216 780 B1

Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala 325 330 335

Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser 340 345 350

Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile 355 360 365

Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin 370 375 380

Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser 385 390 395 400

Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met ' 405 410 415

Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg 420 425 430

Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser 435 440 445

Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp 450 455 460

Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg 465 470 475 480

Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val 485 490 495

Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn 500 505 510

Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala 515 520 525

Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly 530 535 540

Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser 545 550 555 560

Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn

PL 216 780 B1

565

570

575

Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590

<210>	6
<211>	599
<212>	PRT
<213>	Neisseria	meningitidis
<400>	6
Met Asn Lys Ile	Tyr Arg Ile I

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Pro Val Val 50 55 60

Arg Ser Ala Leu Val Leu Gin Phe Met Ile Asp Lys Glu Gly Asn Gly 65 70 75 80

Glu Asn Glu Ser Thr Gly Asn Ile Gly Trp Ser Ile Tyr Tyr Asp Asn 85 90 95

His Asn Thr Leu His Gly Ala Thr Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 100 105 110

Leu Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Lys Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn 115 120 125

Asp Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr 130 135 140

Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val 145 150 155 160

Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala .165 170 175

Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr 180 185 190

PL 216 780 B1

Leu Thr Asp- Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn 195 200 205

Asp Asn Val Thr Asp Asp Lys Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp 210 215 220

Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240

Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val His Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe 245 250 255

Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp 260 265 270

Asn Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile 275 280 285

Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn 290 295 300

Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val 305 310 315 320

Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala 325 330 335

Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly 340 345 350

Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser 355 360 365

Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly 370 375 380

Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp 385 390 395 400

Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val 405 410 415

Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly 420 425 430

PL 216 780 B1

Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr 435 440 445

Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp 450 455 460

Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Lys Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser 465 470 475 480

Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val 485 490 495

Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin 500 505 510

Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly 515 520 525

Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 530 535 540

Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 545 550 555 560

Gly Tyr Ala He Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 565 570 575

Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser 580 585 590

Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 7 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 7

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

PL 216 780 B1

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270

Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285

PL 216 780 B1

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly 290 295 300

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Vał Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335

Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365

Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380

Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445

Met Thr Pro Gln Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480

Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn 500 505 510

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525

PL 216 780 B1

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 580 585 590

Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 8 <211> 598 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 8

Met Asn Lys Ile Ser Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu ' 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp 115 120 125

Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser 130 135 140

PL 216 780 B1

Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn 145 150 155 160

Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly 165 170 175

Thr Asn Gly Asp Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu 180 185 190

Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp 195 200 205

Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val 210 215 220

Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala 225 230 235 240

Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 245 250 255

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 260 265 270

Gly Lys Arg Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 275 280 285

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly 290 295 300

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 305 310 315 320

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 325 330 335

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr 340 345 350

Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys 355 360 365

Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp 370 375 380

PL 216 780 B1

Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser 385 390 395 400

Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser 405 410 415

Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn 420 425 430

Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser 435 440 445

Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala 450 455 460

Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys 465 470 475 480

Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys 485 490 495

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn 500 505 510

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 515 520 525

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Ala Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 530 535 540

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 545 550 555 560

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Gly Asn Trp Val Ile 565 570 575

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Thr Ser Ala 580 585 590

Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 <210> 9 <211> 594 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

PL 216 780 B1 <400> 9

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Ala Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Asp Asp Asp Leu Tyr Leu Glu Pro Val Gin Arg 50 55 60

Thr Ala Val Val Leu Ser Phe Arg Ser Asp Lys Glu Gly Thr Gly Glu 65 70 75 80

Lys Glu Gly Thr Glu Asp Ser Asn Trp Ala Val Tyr Phe Asp Glu Lys 85 90 95

Arg Val Leu Lys Ala Gly Ala Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu 100 105 110

Lys Ile Lys Gin Asn Thr Asn Glu Asn Thr Asn Asp Ser Ser Phe Thr 115 120 125

Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu 130 135 140

Lys Leu Ser Phe Gly Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp 145 150 155 160

Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gły Asp 165 170 175

Pro Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu 180 185 190

Leu Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp 195 200 205

Asp Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 210 215 220

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 225 230 235 240

PL 216 780 B1

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 245 250 255

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 260 265 270

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 275 280 285

Lys Leu Val Thr Gly Lys Gly Lys Asp Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 290 295 300

Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 305 310 315 320

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 325 330 335

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 340 345 350

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 355 360 365

Asn Ile Thr Val Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 370 375 380

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 385 390 395 400

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 405 410 415

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile ~ 420 425 430

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Ala Pro Gin 435 440 445

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 450 455 460

Val Asp Asp Glu Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Thr Asn Lys 465 470 475 480

PL 216 780 B1

Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val 485 490 495

Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg 500 505 510

Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile 515 520 525

Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met 530 535 540

Ala Ile Gly Gly Asp Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly 545 550 555 560

Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala 565 570 575

Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr * 580 585 590

Gin Trp <210> 10 <211> 592 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 10

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Ala Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Asn Ala Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gin 50 55 60

Arg Ser Val Val Gly Ser Ile Gin Ala Ser Met Glu Gly Ser Gly Glu 65 70 75 80

Leu Glu Thr Ile Ser Leu Ser Met Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val

PL 216 780 B1

Asp Lys Phe Glu. Thr Val 340

Thr Ser Gly Thr Asn 345

Val Thr Phe Ala Ser 350

Gly Lys Gly Thr Thr 355

Ala Thr Val Ser Lys Asp 360

Asp Gin Gly Asn Ile 365

Thr Val Met Tyr Asp 370

Val Asn Val Gly Asp Ala 375

Leu Asn Val Asn Gin 380

Leu Gin Asn Ser Gly 385

Trp Asn Leu Asp Ser Lys 390 395

Ala Val Ala Gly Ser 400

Ser Gly Lys Val Ile 405

Ser Gly Asn Val Ser Pro 410

Ser Lys Gly Lys Met 415

Asp Glu Thr Val Asn 420

Ile Asn Ala Gly Asn Asn 425

Ile Glu Ile Ser Arg 430

Asn Gly Lys Asn Ile 435

Asp Ile Ala Thr Ser Met 440

Ala Pro Gin Phe Ser 445

Ser Val Ser Leu Gly 450

Ala Gly Ala Asp Ala Pro 455

Thr Leu Ser Val Asp 460

Asp Glu Gly Ala Leu 465

Asn Val Gly Ser Lys Asp 470 475

Ala Asn Lys Pro Val 480

Arg Ile Thr Asn Val ~ 485

Ala Pro Gly Val Lys Glu 490

Gly Asp Val Thr Asn 495

Val Ala Gin Leu Lys 500

Gly Val Ala Gin Asn Leu 505

Asn Asn Arg Ile Asp 510

Asn Val Asp Gly Asn 515

Ala Arg Ala Gly Ile Ala 520

Gin Ala Ile Ala Thr 525

Ala Gly Leu Val Gin 530

Ala Tyr Leu Pro Gly Lys 535

Ser Met Met Ala Ile 540

Gly Gly Gly Thr Tyr 545

Arg Gly Glu Ala Gly Tyr 550 555

Ala Ile Gly Tyr Ser 560

Ser Ile Ser Asp Gly 565

Gly Asn Trp Ile Ile Lys 570

Gly Thr Ala Ser Gly 575

PL 216 780 B1

Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 580 585 590 <210> 11 <211> 604 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(596) <223> X oznacza jakikolwiek lub brak aminokwasu w odpowiednim miejscu którejkolwiek z sekwencji SEQ ID NR <400> 11

Met Asn Xaa Ile Xaa Arg Ile Ile Trp 1 5

1-10 lub jej konserwatywne podstawienie.

Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 10 15

Val Xaa Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn 20 25

His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 30

Thr Val Xaa Thr Ala Val Leu Ala Thr 35 40

Leu Leu Xaa Ala Thr Val Gin 45

Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa 60

Val Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa 65 70

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly 75 80

Xaa Xaa Glu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 85

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105

Xaa Xaa Xaa Thr Leu Lys Ala 110

Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Xaa 115 120

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 125

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Thr Tyr 130 135

Ser Leu Lys Lys Xaa Leu Xaa 140

Xaa Leu Xaa Xaa Val Xaa Thr Glu Lys 145 150

Leu Ser Phe Xaa Ala Asn Xaa 155 160

Xaa Lys Val Asn Ile Xaa Ser Asp Thr 165

Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys 170 175

PL 216 780 B1

Xaa Thr Ala Xaa Thr Asn Gly Asp Xaa Thr Val His Leu Asn Gly Ile 180 185 190

Gly Ser Thr Leu Thr Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 195 200 205

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Ala Ala Ser 210 215 220

Xaa Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Xaa 225 230 235 240

Gly Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Val Asp Phe Val Xaa Thr Tyr 245 250 255

Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn 260 265 270

Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Xaa Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala 275 280 285

Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys 290 295 300

Xaa Lys Xaa Glu Asn Xaa Ser Ser Thr Asp Xaa Gly Glu Gly Leu Val 305 310 315 320

Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met 325 330 335

Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys Phe Glu 340 345 350

Thr Val Thr Ser Gly Thr Xaa Val Thr Phe Ala Ser Gly Xaa Gly Thr 355 360 365

Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val Xaa Tyr 370 375 380

Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln Asn Ser 385 390 395 400

Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val 405 410 415

PL 216 780 B1

Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val 420 425 430

Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Xaa Arg Asn Gly Lys Asn 435 440 445

Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Xaa Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu 450 455 460

Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Xaa Xaa Xaa Ala 465 470 475 480

Leu Asn Val Gly Ser Lys Xaa Xaa Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn 485 490 495

Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu 500 505 510

Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Xaa Ile Asp Asn Val Xaa Gly 515 520 525

Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Xaa 530 535 540

Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Xaa Thr 545 550 555 560

Tyr Xaa Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Xaa 565 570 575

Xaa Gly Asn Trp Xaa Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly 580 585 590

His Phe Gly Xaa Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 595 600 <210> 12 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 12

atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaacaatg aagagcaaga	agaagattta	180
tatttagacc ccgtacaacg cactgttgcc gtgttgatag tcaattccga	taaagaaggc	240

PL 216 780 B1

acgggagaaa	aagaaaaagt	agaagaaaat	tcagattggg	cagtatattt	caacgagaaa	300
ggagtactaa	cagccagaga	aatcaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
aacggcacaa	acttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	420
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtattggtt	cgactttgac	cgatacgctg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gctggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaagaca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatga	ccccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttgagcgtgg	atggggacgc	attgaatgtc	ggcagcaaga	aggacaacaa	acccgtccgc	1440
attaccaatg	tcgccccggg	cgttaaagag	ggggatgtta	caaacgtcgc	acaacttaaa	1500
ggcgtggcgc	aaaacttgaa	caaccgcatc	gacaatgtgg	acggcaacgc	gcgtgcgggc	1560
atcgcccaag	cgattgcaac	cgcaggtctg	gttcaggcgt	atttgcccgg	caagagtatg	1620
atggcgatcg	gcggcggcac	ttatcgcggc	gaagccggtt	acgccatcgg	ctactccagt	1680
atttccgacg	gcggaaattg	gattatcaaa	ggcacggctt	ccggcaattc	gcgcggccat	1740
ttcggtgctt	ccgcatctgt	cggttatcag	tggtaa			1776

<210> 13 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 13 atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgccgtatcc 60

PL 216 780 B1

gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaatccgtac	aacgctctgt	cgtagggagc	attcaagcca	gtatggaagg	cagcgtcgaa	240
ttggaaacga	tateattate	aatgactaac	gacagcaagg	aatttgtaga	cccatacata	300
gtagttacce	tcaaagccgg	cgacaacctg	aaaatcaaac	aaaacaccaa	tgaaaacacc	360
aatgccagta	gcttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	caggcctgat	caatgttgaa	420
actgaaaaat	tatcgtttgg	cgcaaacggc	aagaaagtca	acatcataag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	tcgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtatcggtt	cgactttgac	egatatgetg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gcaggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	egagttettg	agegeagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaaggca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	agtaaccttt	gctagtggta	atggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	aagtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	teateagegg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gcaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatga	ccccgcaatt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttaagcgtgg	atgacgaggg	cgcgttgaat	gteggeagea	aggatgccaa	caaacccgtc	1440
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcgcaactt	1500
aaaggtgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tgaacggcaa	cgcgcgtgcg	1560
ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	ctggttcagg	cgtatctgcc	cggcaagagt	1620
atgatggcga	teggeggegg	cacttatctc	ggcgaagccg	gttatgccat	cggctactca	1680
agcatttccg	ccggcggaaa	ttggattatc	aaaggcacgg	cttccggcaa	ttcgcgcggc	1740
catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	cagtggtaa			1779

<210> 14

PL 216 780 B1

<211> 1770
<212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 14 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	agtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaecg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgctgt	ccgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgata	ccgatgaaga	tgaagagtta	180
gaatccgtag	cacgctctgc	tctggtgttg	caattcatga	tcgataaaga	aggcaatgga	240
gaaatcgaat	ctacaggaga	tataggttgg	agtatatatt	acgacgatca	caacactcta	300
cacggcgcaa	ccgttaccct	caaagccggc	gacaacctga	aaatcaaaca	aagcggcaaa	360
gacttcacct	actcgctgaa	aaaagagctg	aaagacctga	ccagtgttga	aactgaaaaa	420
ttatcgtttg	gcgcaaacgg	taataaagtc	aacatcacaa	gcgacaccaa	aggcttgaat	480
tttgcgaaag	aaacggctgg	gacgaacggc	gaccccacgg	ttcatctgaa	cggtatcggt	540
tcgactttga	ccgatacgct	tgcgggttct	tctgcttctc	acgttgatgc	gggtaaccaa	600
agtacacatt	acactcgtgc	agcaagtatt	aaggatgtgt	tgaatgcggg	ttggaatatt	660
aagggtgtta	aaactggctc	aacaactggt	caatcagaaa	atgtcgattt	cgtccgcact	720
tacgacacag	tcgagttctt	gagcgcagat	acgaaaacaa	cgactgttaa	tgtggaaagc	780
aaagacaacg	gcaagagaac	cgaagttaaa	atcggtgcga	agacttctgt	tattaaagaa	840
aaagacggta	agttggttac	tggtaaaggc	aaaggcgaga	atggttcttc	tacagacgaa	900
ggcgaaggct	tagtgactgc	aaaagaagtg	attgatgcag	taaacaaggc	tggttggaga	960
atgaaaacaa	caaccgctaa	tggtcaaaca	ggtcaagctg	acaagtttga	aaccgttaca	1020
tcaggcacaa	aagtaacctt	tgctagtggt	aatggtacaa	ctgcgactgt	aagtaaagat	1080
gatcaaggca	acatcactgt	taagtatgat	gtaaatgtcg	gcgatgccct	aaacgtcaat	1140
cagctgcaaa	acagcggttg	gaatttggat	tccaaagcgg	ttgcaggttc	ttcgggcaaa	1200
gtcatcagcg	gcaatgtttc	gccgagcaag	ggaaagatgg	atgaaaccgt	caacattaat	1260
gccggcaaca	acatcgagat	tacccgcaac	ggcaaaaata	tcgacatcgc	cacttcgatg	1320
accccgcaat	tttccagcgt	ttcgctcggc	gcgggggcgg	atgcgcccac	tttaagcgtg	1380
gatgacgagg	gcgcgttgaa	tgtcggcagc	aaggatgcca	acaaacccgt	ccgcattacc	1440
aatgtcgccc	cgggcgttaa	agagggggat	gttacaaacg	tcgcacaact	taaaggtgtg	1500
gcgcaaaact	tgaacaaccg	catcgacaat	gtgaacggca	acgcgcgcgc	gggtatcgcc	1560
caagcgattg	caaccgcagg	tttggctcag	gcctatttgc	ccggcaagag	tatgatggcg	1620
atcggcggcg	gtacttatct	cggcgaagcc	ggttacgcca	tcggctactc	gagcatttct	1680

PL 216 780 B1

gacactggga	attgggttat	caagggcacg	gcttccggca	attcgcgcgg	tcatttcggt	1740
acttccgcat	ctgtcggtta	tcagtggtaa				1770
<210> 15 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 15 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgagt	actaccgatg	acgacgattt	atatttagaa	180
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	ttccgttccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaagtta	cagaagattc	aaattgggga	gtatatttcg	acaagaaagg	agtactaaca	300
gccggaacaa	tcaccctcaa	agccggcgac	aacctgaaaa	tcaaacaaaa	caccaatgaa	360
aacaccaatg	ccagtagctt	cacctactcg	ctgaaaaaag	acctcacaga	tctgaccagt	420
gttggaactg	aaaaattatc	gtttagcgca	aacagcaata	aagtcaacat	cacaagcgac	480
accaaaggct	tgaatttcgc	gaaaaaaacg	gctgagacca	acggcgacac	cacggttcat	540
ctgaacggta	tcggttcgac	tttgaccgat	acgctgctga	ataccggagc	gaccacaaac	600
gtaaccaacg	acaacgttac	cgatgacgag	aaaaaacgtg	cggcaagcgt	taaagacgta	660
ttaaacgcag	gctggaacat	taaaggcgtt	aaacccggta	caacagcttc	cgataacgtt	720
gatttcgtcc	gcacttacga	cacagtcgag	ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	780
gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	agaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	840
tctgttatca	aagaaaaaga	cggtaagttg	gttactggta	aagacaaagg	cgagaatgat	900
tcttctacag	acaaaggcga	aggcttagtg	actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	960
aaggctggtt	ggagaatgaa	aacaacaacc	gctaatggtc	aaacaggtca	agctgacaag	1020
tttgaaaccg	ttacatcagg	cacaaatgta	acctttgcta	gtggtaaagg	tacaactgcg	1080
actgtaagta	aagatgatca	aggcaacatc	actgttatgt	atgatgtaaa	tgtcggcgat	1140
gccctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	1200
ggttcttcgg	gcaaagtcat	cagcggcaat	gtttcgccga	gcaagggaaa	gatggatgaa	1260
accgtcaaca	ttaatgccgg	caacaacatc	gagattaccc	gcaacggcaa	aaatatcgac	1320
atcgccactt	cgatgacccc	gcaattttcc	agcgtttcgc	tcggcgcggg	ggcggatgcg	1380
cccactttaa	gcgtggatga	cgagggcgcg	ttgaatgtcg	gcagcaagga	tgccaacaaa	1440
cccgtccgca	ttaccaatgt	cgccccgggc	gttaaagagg	gggatgttac	aaacgtcgca	1500

PL 216 780 B1

caacttaaag	gcgtggcgca	aaacttgaac	aaccacatcg	acaatgtgga	cggeaacgcg	1560
cgtgcgggca	tcgcccaagc	gattgcaacc	gcaggtctgg	ttcaggcgta	tctgcccggc	1620
aagagtatga	tggcgatcgg	cggcggcact	tatcgcggcg	aagccggtta	tgccatcggc	1680
tactcaagca	tttccgacgg	cggaaattgg	attatcaaag	gcacggcttc	cggcaattcg	1740
cgcggccatt	tcggtgcttc	cgcatctgtc	ggttatcagt	ggtaa		1785

<210> 16 <211> 1776 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 16

atgaacgaaa	tattgcgcat	catttggaat	agcgccctca	atgcctgggt	cgttgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaatg	aagagcaaga	agaagattta	180
tatttagacc	ccgtgctacg	cactgttgcc	gtgttgatag	tcaattccga	taaagaaggc	240
acgggagaaa	aagaaaaagt	agaagaaaat	tcagattggg	cagtatattt	caacgagaaa	300
ggagtactaa	cagccagaga	aatcaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
aacggcacaa	acttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	420
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtattggtt	cgactttgac	cgatacgctg	ctgaataccg	gagcgaccac	aaacgtaacc	600
aacgacaacg	ttaccgatga	cgagaaaaaa	cgtgcggcaa	gcgttaaaga	cgtattaaac	660
gctggctgga	acattaaagg	cgttaaaccc	ggtacaacag	cttccgataa	cgttgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	cgagttcttg	agcgcagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagaaaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaagaca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	tcatcagcgg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	acccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320

PL 216 780 B1

acttcgatga	ccccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcgga	tgcgcccact	1380
ttgagcgtgg	atggggacgc	attgaatgtc	ggcagcaaga	aggacaacaa	acccgtccgc	1440
attaccaatg	tcgccccggg	cgttaaagag	ggggatgtta	caaacgtcgc	acaacttaaa	1500
ggcgtggcgc	aaaacttgaa	caaccgcatc	gacaatgtgg	acggcaacgc	gcgtgcgggc	1560
atcgcccaag	cgattgcaac	cgcaggtctg	gttcaggcgt	atttgcccgg	caagagtatg	1620
atggcgatcg	gcggcggcac	ttatcgcggc	gaagccggtt	acgccatcgg	ctactccagt	1680
atttccgacg	gcggaaattg	gattatcaaa	ggcacggctt	ccggcaattc	gcgcggccat	1740
ttcggtgctt	ccgcatctgt	cggttatcag	tggtaa			1776

<210> 17 <211> 1800 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 17

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
acgctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaacccgtag	tacgctctgc	tctggtgttg	caattcatga	tcgataaaga	aggcaatgga	240
gaaaacgaat	ctacaggaaa	tataggttgg	agtatatatt	acgacaatca	caacactcta	300
cacggcgcaa	ccgttaccct	caaagccggc	gacaacctga	aaatcaaaca	aaacaccaat	360
aaaaacacca	atgaaaacac	caatgacagt	agcttcacct	actcgctgaa	aaaagacctc	420
acagatctga	ccagtgttga	aactgaaaaa	ttatcgtttg	gcgcaaacgg	caataaagtc	480
aacatcacaa	gcgacaccaa	aggcttgaat	ttcgcgaaag	aaacggctgg	gacgaacggc	540
gacaccacgg	ttcatctgaa	cggtattggt	tcgactttga	ccgatacgct	gctgaatacc	600
ggagcgacca	caaacgtaac	caacgacaac	gttaccgatg	acaagaaaaa	acgtgcggca	660
agcgttaaag	acgtattaaa	cgcaggctgg	aacattaaag	gcgttaaacc	cggtacaaca	720
gcttccgata	acgttgattt	cgtccacact	tacgacacag	tcgagttctt	gagcgcagat	780
acgaaaacaa	cgactgttaa	tgtggaaagc	aaagacaacg	gcaagagaac	cgaagttaaa	840
atcggtgcga	agacttctgt	tattaaagaa	aaagacggta	agttggttac	tggtaaaggc	900
aaaggcgaga	atggttcttc	tacagacgaa	ggcgaaggct	tagtgactgc	aaaagaagtg	960
attgatgcag	taaacaaggc	tggttggaga	atgaaaacaa	caaccgctaa	tggtcaaaca	1020
ggtcaagctg	acaagtttga	aaccgttaca	tcaggcacaa	atgtaacctt	tgctagtggt	1080
aaaggtacaa	ctgcgactgt	aagtaaagat	gatcaaggca	acatcactgt	taagtatgat	1140

PL 216 780 B1

gtaaatgtcg	gcgatgccct	aaacgtcaat	cagctgcaaa	acagcggttg	gaatttggat	1200
tccaaagcgg	ttgcaggttc	ttcgggcaaa	gtcatcagcg	gcaatgtttc	gccgagcaag	1260
ggaaagatgg	atgaaaccgt	caacattaat	gccggcaaca	acatcgagat	tacccgcaac	1320
ggtaaaaata	tcgacatcgc	cacttcgatg	accccgcagt	tttccagcgt	ttcgctcggc	1380
gcgggggcgg	atgcgcccac	tttgagcgtg	gatgacaagg	gcgcgttgaa	tgtcggcagc	1440
aaggatgcca	acaaacccgt	ccgcattacc	aatgtcgccc	cgggcgttaa	agagggggat	1500
gttacaaacg	tcgcacaact	taaaggcgtg	gcgcaaaact	tgaacaaccg	catcgacaat	1560
gtggacggca	acgcgcgtgc	gggcatcgcc	caagcgattg	caaccgcagg	tctggttcag	1620
gcgtatctgc	ccggcaagag	tatgatggcg	atcggcggcg	gcacttatcg	cggcgaagcc	1680
ggttacgcca	tcggctactc	cagtatttcc	gacggcggaa	attggattat	caaaggcacg	1740
gcttccggca	attcgcgcgg	tcatttcggt	gcttccgcat	ctgtcggtta	tcagtggtaa	1800

<210> 18 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 18

atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcctgggt cgtcgtatcc	60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tggcgaccgc cgtattggcg	120
acactgttgt ttgcaacggt tcaggcgaat gctaccgatg acgacgattt atatttagaa	180
cccgtacaac gcactgctgt cgtgttgagc ttccgttccg ataaagaagg cacgggagaa	240
aaagaaggta cagaagattc aaattgggca gtatatttcg acgagaaaag agtactaaaa	300
gccggagcaa tcaccctcaa agccggcgac aacctgaaaa tcaaacaaaa caccaatgaa	360
aacaccaatg aaaacaccaa tgacagtagc ttcacctact ccctgaaaaa agacctcaca	420
gatctgacca gtgttgaaac tgaaaaatta tcgtttggcg caaacggtaa taaagtcaac	480
atcacaagcg acaccaaagg cttgaatttt gcgaaagaaa cggctgggac gaacggcgac	540
cccacggttc atctgaacgg tatcggttcg actttgaccg atacgctgct gaataccgga	600
gcgaccacaa acgtaaccaa cgacaacgtt accgatgacg agaaaaaacg tgcggcaagc	660
gttaaagacg tattaaacgc aggctggaac attaaaggcg ttaaacccgg tacaacagct	720
tccgataacg ttgatttcgt ccgcacttac gacacagtcg agttcttgag cgcagatacg	780
aaaacaacga ctgttaatgt ggaaagcaaa gacaacggca agaaaaccga agttaaaatc	840
ggtgcgaaga cttctgttat taaagaaaaa gacggtaagt tggttactgg taaaggcaaa	900
gacgagaatg gttcttctac agacgaaggc gaaggcttag tgactgcaaa agaagtgatt	960

PL 216 780 B1

gatgcagtaa acaaggctgg ttggagaatg aaaacaacaa ccgctaatgg tcaaacaggt	1020
caagctgaca agtttgaaac cgttacatca ggcacaaaag taacctttgc tagtggtaat	1080
ggtacaactg cgactgtaag taaagatgat caaggcaaca tcactgttaa gtatgatgta	1140
aatgtcggcg atgccctaaa cgtcaatcag ctgcaaaaca gcggttggaa tttggattcc	1200
aaagcggttg caggttcttc gggcaaagtc atcagcggca atgtttcgcc gagcaaggga	1260
aagatggatg aaaccgtcaa cattaatgcc ggcaacaaca tcgagattac ccgcaacggc	1320
aaaaatatcg acatcgccac ttcgatgacc ccgcaatttt ccagcgtttc gctcggcgcg	1380
ggggcggatg cgcccacttt aagcgtggat gacgagggcg cgttgaatgt cggcagcaag	1440
gatgccaaca aacccgtccg cattaccaat gtcgccccgg gcgttaaaga gggggatgtt	1500
acaaacgtcg cacaacttaa aggtgtggcg caaaacttga acaaccgcat cgacaatgtg	1560
gacggcaacg cgcgcgcggg tatcgcccaa gcgattgcaa ccgcaggttt ggctcaggcg	1620
tatttgcccg gcaagagtat gatggcgatc ggcggcggta cttatcgcgg cgaagccggt	1680
tacgccatcg gctactcgag catttctgac actgggaatt gggttatcaa gggcacggct	1740
tccggcaatt cgcgcggcca tttcggtgct tccgcatctg tcggttatca gtggtaa	1797

<210> 19 <211> 1797 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 19

atgaacaaaa	tatcccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	acgacgattt	atatttagaa	180
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	ttccgttccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaaggta	cagaagattc	aaattgggca	gtatatttcg	acgagaaaag	agtactaaaa	300
gccggagcaa	tcaccctcaa	agccggcgac	aacctgaaaa	tcaaacaaaa	caccaatgaa	360
aacaccaatg	aaaacaccaa	tgacagtagc	ttcacctact	ccctgaaaaa	agacctcaca	420
gatctgacca	gtgttgaaac	tgaaaaatta	tcgtttggcg	caaacggtaa	taaagtcaac	480
atcacaagcg	acaccaaagg	cttgaatttt	gcgaaagaaa	cggctgggac	gaacggcgac	540
cccacggttc	atctgaacgg	tatcggttcg	actttgaccg	atacgctgct	gaataccgga	600
gcgaccacaa	acgtaaccaa	cgacaacgtt	accgatgacg	agaaaaaacg	fcęrcggcaagc	660
gttaaagacg	tattaaacgc	aggctggaac	attaaaggcg	ttaaacccgg	tacaacagct	720
tccgataacg	tcgatttcgt	ccgcacttac	gacacagtcg	agttcttgag	cgcagatacg	780

PL 216 780 B1

aaaacaacga	ctgttaatgt	ggaaagcaaa	gacaacggca	agagaaccga	agttaaaatc	840
ggtgcgaaga	cttctgttat	taaagaaaaa	gacggtaagt	tggttactgg	taaaggcaaa	900
ggcgagaatg	gttcttctac	agacgaaggc	gaaggcttag	tgactgcaaa	agaagtgatt	960
gatgcagtaa	acaaggctgg	ttggagaatg	aaaacaacaa	ccgctaatgg	tcaaacaggt	1020
caagctgaca	agtttgaaac	cgttacatca	ggcacaaaag	taacctttgc	tagtggtaat	1080
ggtacaactg	cgactgtaag	taaagatgat	caaggcaaca	tcactgttaa	gtatgatgta	1140
aatgtcggcg	atgccctaaa	cgtcaatcag	ctgcaaaaca	gcggttggaa	tttggattcc	1200
aaagcggttg	caggttcttc	gggcaaagtc	atcagcggca	atgtttcgcc	gagcaaggga	1260
aagatggatg	aaaccgtcaa	cattaatgcc	ggcaacaaca	tcgagattac	ccgcaacggc	1320
aaaaatatcg	acatcgccac	ttcgatgacc	ccgcaatttt	ccagcgtttc	gctcggcgcg	1380
ggggcggatg	cgcccacttt	aagcgtggat	gacgagggcg	cgttgaatgt	cggcagcaag	1440
gatgccaaca	aacccgtccg	cattaccaat	gtcgccccgg	gcgttaaaga	gggggatgtt	1500
acaaacgtcg	cacaacttaa	aggtgtggcg	caaaacttga	acaaccgcat	cgacaatgtg	1560
gacggcaacg	cgcgcgcggg	tatcgcccaa	gcgattgcaa	ccgcaggttt	ggctcaggcc	1620
tatttgcccg	gcaagagtat	gatggcgatc	ggcggcggta	cttatcgcgg	cgaagccggt	1680
tacgccatcg	gctactcgag	catttctgac	actgggaatt	gggttatcaa	gggcacggct	1740
tccggcaatt	cgcgcggtca	tttcggtact	tccgcatctg	tcggttatca	gtggtaa	1797

<210> 20 <211> 1785 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 20

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tggcgaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	acgacgattt	atatttagaa	180
cccgtacaac	gcactgctgt	cgtgttgagc	ttccgttccg	ataaagaagg	cacgggagaa	240
aaagaaggta	cagaagattc	aaattgggca	gtatatttcg	acgagaaaag	agtactaaaa	300
gccggagcaa	tcaccctcaa	agccggcgac	aacctgaaaa	tcaaacaaaa	caccaatgaa	360
aacaccaatg	acagtagctt	cacctactcc	ctgaaaaaag	acctcacaga	tctgaccagt	420
gttgaaactg	aaaaattatc	gtttggcgca	aacggtaata	aagtcaacat	cacaagcgac	480
accaaaggct	tgaattttgc	gaaagaaacg	gctgggacga	acggcgaccc	cacggttcat	540
ctgaacggta	tcggttcgac	tttgaccgat	acgctgctga	ataccggagc	gaccacaaac	600

PL 216 780 B1

gtaaccaacg	acaacgttac	cgatgacgag	aaaaaacgtg	cggcaagcgt	taaagacgta	660
ttaaacgcag	gctggaacat	taaaggcgtt	aaacccggta	caacagcttc	cgataacgtt	720
gatttcgtcc	gcacttacga	cacagtcgag	ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	780
gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	aaaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	840
tctgttatta	aagaaaaaga	cggtaagttg	gttactggta	aaggcaaaga	cgagaatggt	900
tcttctacag	acgaaggcga	aggcttagtg	actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	960
aaggctggtt	ggagaatgaa	aacaacaacc	gctaatggtc	aaacaggtca	agctgacaag	1020
tttgaaaccg	ttacatcagg	eacaaatgta	acctttgcta	gtggtaaagg	tacaactgcg	1080
actgtaagta	aagatgatca	aggcaacatc	actgttaagt	atgatgtaaa	tgtcggcgat	1140
gccctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	1200
ggttcttcgg	gcaaagtcat	cagcggcaat	gtttcgccga	gcaagggaaa	gatggatgaa	1260
accgtcaaca	ttaatgccgg	caacaacatc	gagattaccc	gcaacggtaa	aaatatcgac	1320
atcgccactt	cgatggcgcc	gcagttttcc	agcgtttcgc	tcggtgcggg	ggcggatgcg	1380
cccactttga	gcgtggatga	cgagggcgcg	ttgaatgtcg	gcagcaagga	taccaacaaa	1440
cccgtccgca	ttaccaatgt	cgccccgggc	gttaaagagg	gggatgttac	aaacgtcgca	1500
caacttaaag	gcgtggcgca	aaacttgaac	aaccgcatcg	acaatgtgga	cggcaacgcg	1560
cgtgcgggca	tcgcccaagc	gattgcaacc	gcaggtctag	ttcaggcgta	tctgcccggc	1620
aagagtatga	tggcgatcgg	cggcgacact	tatcgcggcg	aagccggtta	cgccatcggc	1680
tactcaagta	tttccgacgg	cggaaattgg	attatcaaag	gcacggcttc	cggcaattcg	1740
cgcggccatt	tcggtgcttc	cgcatctgtc	ggttatcaat	ggtaa		1785

<210> 21 <211> 1779 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 21

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aagatgaaga	agaagagtta	180
gaatccgtac	aacgctctgt	cgtagggagc	attcaagcca	gtatggaagg	cagcggcgaa	240
ttggaaacga	tatcattatc	aatgactaac	gacagcaagg	aatttgtaga	cccatacata	300
gtagttaccc	tcaaagccgg	cgacaacctg	aaaatcaaac	aaaacaccaa	tgaaaacacc	360
aatgccagta	gcttcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	caggcctgat	caatgttgaa	420

PL 216 780 B1

actgaaaaat	tatcgtttgg	cgcaaacggc	aagaaagtca	acatcataag	cgacaccaaa	480
ggcttgaatt	tcgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	540
ggtatcggtt	cgactttgac	egataegett	gcgggttctt	ctgcttctca	cgttgatgcg	600
ggtaaccaaa	gtacacatta	cactcgtgca	gcaagtatta	aggatgtgtt	gaatgcgggt	660
tggaatatta	agggtgttaa	aactggctca	acaactggtc	aatcagaaaa	tgtcgatttc	720
gtccgcactt	acgacacagt	egagttettg	agegeagata	cgaaaacaac	gactgttaat	780
gtggaaagca	aagacaacgg	caagagaacc	gaagttaaaa	tcggtgcgaa	gacttctgtt	840
attaaagaaa	aagacggtaa	gttggttact	ggtaaaggca	aaggcgagaa	tggttcttct	900
acagacgaag	gcgaaggctt	agtgactgca	aaagaagtga	ttgatgcagt	aaacaaggct	960
ggttggagaa	tgaaaacaac	aaccgctaat	ggtcaaacag	gtcaagctga	caagtttgaa	1020
accgttacat	caggcacaaa	tgtaaccttt	gctagtggta	aaggtacaac	tgcgactgta	1080
agtaaagatg	atcaaggcaa	catcactgtt	atgtatgatg	taaatgtcgg	cgatgcccta	1140
aacgtcaatc	agctgcaaaa	cagcggttgg	aatttggatt	ccaaagcggt	tgcaggttct	1200
tcgggcaaag	teateagegg	caatgtttcg	ccgagcaagg	gaaagatgga	tgaaaccgtc	1260
aacattaatg	ccggcaacaa	catcgagatt	agccgcaacg	gtaaaaatat	cgacatcgcc	1320
acttcgatgg	cgccgcagtt	ttccagcgtt	tcgctcggcg	cgggggcaga	tgcgcccact	1380
ttaagcgtgg	atgacgaggg	cgcgttgaat	gteggeagea	aggatgccaa	caaacccgtc	1440
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	1500
aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	1560
ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	ctggttcagg	cgtatctgcc	cggcaagagt	1620
atgatggcga	teggeggegg	cacttatcgc	ggcgaagccg	gttacgccat	cggctactcc	1680
agtatttccg	acggcggaaa	ttggattatc	aaaggcacgg	cttccggcaa	ttcgcgcggc	1740
catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	cagtggtaa			1779

<210> 22 <211> 1815 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(1815) <223> η oznacza jakikolwiek synonimiczny nukleotyd lub brak nukleotydu w odpowiednim miejscu którejkolwiek z SEQ ID NR:12-21 <400> 22 atgaacnaaa tatnncgcat catttggaat agngccctca atgcntgggt ngnngtatcc 60

PL 216 780 B1

gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgnngaccgc	cgtattggcg	120
acnctgntgt	nngcaacggt	tcaggcnant	nctancnatn	nngannnnnn	nnnngannna	180
nanttagann	ccgtnnnacg	cnctgnnnnn	gnrmnimnnn	tnnnnnncnn	tanngaaggc	240
anngnngaan	nngaannnnn	annnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnannn	nnnnnnnnnn	300
nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nntnaccctc	aaagccggcg	acaacctgaa	aatcaaacaa	360
ancnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	nnnnnnnnnn	ncttcaccta	ctcnctgaaa	420
aaaganctna	nagnnctgan	cantgttgna	actgaaaaat	tatcgtttng	cgcaaacngn	480
aanaaagtca	acatcanaag	cgacaccaaa	ggcttgaatt	tngcgaaana	aacggctgng	540
acnaacggcg	acnccacggt	tcatctgaac	ggtatnggtt	cgactttgac	cgatangctn	600
nngnntncnn	nngcnncnnn	nnnngnnncn	nnnnacnann	ntacnnatna	cnnnnnnann	660
cgtgcngcaa	gnnttaanga	ngtnttnaan	gcnggntgga	anattaangg	ngttaaancn	720
ggnncaacan	ctnnnnnntc	nganaangtn	gatttcgtcc	ncacttacga	cacagtcgag	780
ttcttgagcg	cagatacgaa	aacaacgact	gttaatgtgg	aaagcaaaga	caacggcaag	840
anaaccgaag	ttaaaatcgg	tgcgaagact	tctgttatna	aagaaaaaga	cggtaagttg	900
gttactggta	aagncaaagn	cgagaatgnt	tcttctacag	acnaaggcga	aggcttagtg	960
actgcaaaag	aagtgattga	tgcagtaaac	aaggctggtt	ggagaatgaa	aacaacaacc	1020
gctaatggtc	aaacaggtca	agctgacaag	tttgaaaccg	ttacatcagg	cacaaangta	1080
acctttgcta	gtggtaangg	tacaactgcg	actgtaagta	aagatgatca	aggcaacatc	1140
actgttangt	atgatgtaaa	tgtcggcgat	gccctaaacg	tcaatcagct	gcaaaacagc	1200
ggttggaatt	tggattccaa	agcggttgca	ggttcttcgg	gcaaagtcat	cagcggcaat	1260
gtttcgccga	gcaagggaaa	gatggatgaa	accgtcaaca	ttaatgccgg	caacaacatc	1320
gagattancc	gcaacggnaa	aaatatcgac	atcgccactt	cgatgncncc	gcanttttcc	1380
agcgtttcgc	tcggngcggg	ggcngatgcg	cccactttna	gcgtggatnn	nnnggncgcn	1440
ttgaatgtcg	gcagcaagna	nnncaacaaa	cccgtccgca	ttaccaatgt	cgccccgggc	1500
gttaaagagg	gggatgttac	aaacgtcgcn	caacttaaag	gngtggcgca	aaacttgaac	1560
aaccncatcg	acaatgtgna	cggcaacgcg	cgngcgggna	tcgcccaagc	gattgcaacc	1620
gcaggtntng	ntcaggcnta	tntgcccggc	aagagtatga	tggcgatcgg	cggcgnnact	1680
tatcncggcg	aagccggtta	ngccatcggc	tactcnagna	tttcngncnn	nggnaattgg	1740
nttatcaang	gcacggcttc	cggcaattcg	cgcggncatt	tcggtncttc	cgcatctgtc	1800
ggttatcant	ggtaa					1815

PL 216 780 B1 <210> 23 <211> 512 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 23

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln 35 40 45

Ala Ser Ala Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys 50 55 60

Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr 65 70 75 80

Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr ’ 85 90 95

Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu 100 105 110

Asn Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp 115 120 125

Glu Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp 130 135 140

Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp 145 150 155 160

Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys ~ 165 170 175

Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu 180 185 190

Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys 195 200 205

Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu

PL 216 780 B1

210 215 220

Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys 225 230 235 240

Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin 245 250 255

Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala * 260 265 270

Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn 275 280 285

Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn 290 295 300

Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly 305 310 315 320

Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys 325 330 335

Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr 340 345 350

Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe 355 360 365

Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val 370 375 380

Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val 385 390 395 400

Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn 405 410 415

Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp 420 425 430

Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr 435 440 445

Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile 450 455 460

PL 216 780 B1

Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser

465

470

475

480

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

485

490

495

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

500 505 510 <210> 24 <211> 513 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

<400> 24

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ala

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

val

Lys 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gin

Ala

Asn 50

Ala

Thr

Asp

Glu

Thr 55

Gly

Leu

Ile

Asn

Val 60

Glu

Thr

Glu

Lys

Leu 65

Ser

Phe

Gly

Ala

Asn 70

Gly

Lys

Val

Asn 75

Ile

Ser

Asp

Thr 80

Lys

Gly

Leu

Asn

Phe 85

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala 90

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp 95

Thr

Val

His

Leu 100

Asn

Gly

Ile

Gly

Ser 105

Thr

Leu

Thr

Asp

Met 110

Leu

Asn

Thr

Gly 115

Ala

Thr

Asn

Val 120

Thr

Asn

Asp

Asn

Val 125

Thr

Asp

Glu

Lys 130

Lys

Arg

Ala

Ser 135

Val

Lys

Asp

Val

Leu 140

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn 145

Ile

Lys

Gly

Val

Lys 150

Pro

Gly

Thr

Ala 155

Ser

Asp

Asn

Val

Asp 160

PL 216 780 B1

405

410

415

Asn

Val

Ala

Gin 420

Leu

Lys

Gly

Val

Ala 425

Gin

Asn

Leu

Asn

Asn 430

Arg

Ile

Asp

Asn

Val 435

Asn

Gly

Asn

Ala

Arg 440

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin 445

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala 450

Gly

Leu

Val

Gin

Ala 455

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys 460

Ser

Met

Ala

Ile 465

Gly

Thr

Tyr 470

Leu

Gly

Glu

Ala

Gly 475

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr 480

Ser

Ile

Ser

Ala 485

Gly

Asn

Trp

Ile 490

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala 495

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

500 505 510

Trp <210> 25 <211> 407 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

<400> 25

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

Val

Lys 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gin

Ala

Ser 50

Ala

Asn

Val

Asp 55

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr 60

Asp

Thr

Val

Glu

Phe 65

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr 70

Lys

Thr

Val 75

Asn

Val

Glu

Ser

Lys 80

Asp

Asn

Gly

Lys

Lys 85

Thr

Glu

Val

Lys

Ile 90

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser 95

Val

PL 216 780 B1

Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro 340 345 350

Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala 355 360 365

Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile 370 375 380

Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser 385 390 395 400

Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 405 <210> 26 <211> 433 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 26

Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp 15 10 15

Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala 20 25 30

Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gin 35 40 45

Ala Ser Ala Asn Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly 50 55 60

Trp Asn Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val 65 70 75 80

Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr 85 90 95

Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr 100 105 110

Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly 115 120 125

Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp 130 135 140

PL 216 780 B1

Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn 145 150 155 160

Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly 165 170 175

Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe 180 185 190

Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly 195 200 205

Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val 210 215 220

Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala 225 230 235 240

Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly 245 250 255

Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile * 260 265 270

Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin 275 280 285

Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser 290 295 300

Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro 305 310 315 320

Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr 325 330 335

Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile 340 345 350

Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala 355 360 365

Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala 370 375 380

PL 216 780 B1

Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr

385

390

395

400

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

405

410

415

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gln

420 425 430

Trp <210> 27 <211> 502 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 27

Met 1

Asn

Lys

Ile

Tyr 5

Arg

Ile

Trp

Asn 10

Ser

Ala

Leu

Asn

Ala 15

Trp

Val

Ser 20

Glu

Leu

Thr

Arg

Asn 25

His

Thr

Lys

Arg

Ala 30

Ser

Ala

Thr

Val

Lys 35

Thr

Ala

Val

Leu

Ala 40

Thr

Leu

Phe

Ala 45

Thr

Val

Gln

Ala

Ser 50

Ala

Asn

Thr

Leu

Lys 55

Ala

Gly

Asp

Asn

Leu 60

Lys

Ile

Lys

Gln

Phe 65

Thr

Tyr

Ser

Leu

Lys 70

Lys

Asp

Leu

Thr

Asp 75

Leu

Thr

Ser

Val

Gly 80

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser 85

Phe

Ser

Ala

Asn

Gly 90

Asn

Lys

Val

Asn

Ile 95

Thr

Ser

Asp

Thr

Lys 100

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala 105

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly 110

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr 115

Thr

Val

His

Leu

Asn 120

Gly

Ile

Gly

Ser

Thr 125

Leu

Thr

Asp

Arg

Ala 130

Ala

Ser

Val

Lys

Asp 135

Val

Leu

Asn

Ala

Gly 140

Trp

Asn

Ile

Lys

Gly

Val

Lys

Asn

Val

Asp

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr

Asp

Thr

Val

Glu

Phe

PL 216 780 B1

Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn * 405 410 415

Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile 420 425 430

Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly 435 440 445

Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly 450 455 460

Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile 465 470 475 480

Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala 485 490 495

Ser Val Gly Tyr Gin Trp 500

<210> 28 <211> 1539 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis
<400> 28 atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaatg	aaacagatct	gaccagtgtt	180
ggaactgaaa	aattatcgtt	tagcgcaaac	ggcaataaag	tcaacatcac	aagcgacacc	240
aaaggcttga	attttgcgaa	agaaacggct	gggacgaacg	gcgacaccac	ggttcatctg	300
aacggtattg	gttcgacttt	gaccgatacg	ctgctgaata	ccggagcgac	cacaaacgta	360
accaacgaca	acgttaccga	tgacgagaaa	aaacgtgcgg	caagcgttaa	agacgtatta	420
aacgctggct	ggaacattaa	aggcgttaaa	cccggtacaa	cagcttccga	taacgttgat	480
ttcgtccgca	cttacgacac	agtcgagttc	ttgagcgcag	atacgaaaac	aacgactgtt	540
aatgtggaaa	gcaaagacaa	cggcaagaaa	accgaagtta	aaatcggtgc	gaagacttct	600
gttattaaag	aaaaagacgg	taagttggtt	actggtaaag	acaaaggcga	gaatggttct	660
tctacagacg	aaggcgaagg	cttagtgact	gcaaaagaag	tgattgatgc	agtaaacaag	720
gctggttgga	gaatgaaaac	aacaaccgct	aatggtcaaa	caggtcaagc	tgacaagttt	780

PL 216 780 B1

gaaaccgtta	catcaggcac	aaatgtaacc	tttgctagtg	gtaaaggtac	aactgcgact	840
gtaagtaaag	atgatcaagg	caacatcact	gttatgtatg	atgtaaatgt	cggcgatgcc	900
ctaaacgtca	atcagctgca	aaacagcggt	tggaatttgg	attccaaagc	ggttgcaggt	960
tcttcgggca	aagtcatcag	cggcaatgtt	tcgccgagca	agggaaagat	ggatgaaacc	1020
gtcaacatta	atgccggcaa	caacatcgag	attacccgca	acggtaaaaa	tatcgacatc	1080
gccacttcga	tgaccccgca	gttttccagc	gtttcgctcg	gcgcgggggc	ggatgcgccc	1140
actttgagcg	tggatgggga	cgcattgaat	gtcggcagca	agaaggacaa	caaacccgtc	1200
cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	1260
aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	1320
ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	ctggttcagg	cgtatttgcc	cggcaagagt	1380
atgatggcga	tcggcggcgg	cacttatcgc	ggcgaagccg	gttacgccat	cggctactcc	1440
agtatttccg	acggcggaaa	ttggattatc	aaaggcacgg	cttccggcaa	ttcgcgcggc	1500
catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	cagtggtaa			1539

<210> 29 <211> 1542 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 29

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcctgggt	cgccgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
acactgttgt	ttgcaacggt	tcaggcgaat	gctaccgatg	aaacaggcct	gatcaatgtt	180
gaaactgaaa	aattatcgtt	tggcgcaaac	ggcaagaaag	tcaacatcat	aagcgacacc	240
aaaggcttga	atttcgcgaa	agaaacggct	gggacgaacg	gcgacaccac	ggttcatctg	300
aacggtatcg	gttcgacttt	gaccgatatg	ctgctgaata	ccggagcgac	cacaaacgta	360
accaacgaca	acgttaccga	tgacgagaaa	aaacgtgcgg	caagcgttaa	agacgtatta	420
aacgcaggct	ggaacattaa	aggcgttaaa	cccggtacaa	cagcttccga	taacgttgat	480
ttcgtccgca	cttacgacac	agtcgagttc	ttgagcgcag	atacgaaaac	aacgactgtt	540
aatgtggaaa	gcaaagacaa	cggcaagaaa	accgaagtta	aaatcggtgc	gaagacttct	600
gttattaaag	aaaaagacgg	taagttggtt	actggtaaag	gcaaaggcga	gaatggttct	660
tctacagacg	aaggcgaagg	cttagtgact	gcaaaagaag	tgattgatgc	agtaaacaag	720
gctggttgga	gaatgaaaac	aacaaccgct	aatggtcaaa	caggtcaagc	tgacaagttt	780
gaaaccgtta	catcaggcac	aaaagtaacc	tttgctagtg	gtaatggtac	aactgcgact	840

PL 216 780 B1

gtaagtaaag	atgatcaagg	caacatcact	gttaagtatg	atgtaaatgt	cggcgatgcc	900
ctaaacgtca	atcagctgca	aaacagcggt	tggaatttgg	attccaaagc	ggttgcaggt	960
tcttcgggca	aagtcatcag	cggcaatgtt	tcgccgagca	agggaaagat	ggatgaaacc	1020
gtcaacatta	atgccggcaa	caacatcgag	attacccgca	acggcaaaaa	tatcgacatc	1080
gccacttcga	tgaccccgca	attttccagc	gtttcgctcg	gcgcgggggc	ggatgcgccc	1140
actttaagcg	tggatgacga	gggcgcgttg	aatgtcggca	gcaaggatgc	caacaaaccc	1200
gtccgcatta	ccaatgtcgc	cccgggcgtt	aaagaggggg	atgttacaaa	cgtcgcgcaa	1260
cttaaaggtg	tggcgcaaaa	cttgaacaac	cgcatcgaca	atgtgaacgg	caacgcgcgt	1320
gcgggcatcg	cccaagcgat	tgcaaccgca	ggtctggttc	aggcgtatct	gcccggcaag	1380
agtatgatgg	cgatcggcgg	cggcacttat	ctcggcgaag	ccggttatgc	catcggctac	1440
tcaagcattt	ccgccggcgg	aaattggatt	atcaaaggca	cggcttccgg	caattcgcgc	1500
ggccatttcg	gtgcttccgc	atctgtcggt	tatcagtggt	aa		1542

<210> 30 <211> 1224 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 30

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaacg	ttgatttcgt	ccgcacttac	180
gacacagtcg	agttcttgag	cgcagatacg	aaaacaacga	ctgttaatgt	ggaaagcaaa	240
gacaacggca	agaaaaccga	agttaaaatc	ggtgcgaaga	cttctgttat	taaagaaaaa	300
gacggtaagt	tggttactgg	taaagacaaa	ggcgagaatg	gttcttctac	agacgaaggc	360
gaaggcttag	tgactgcaaa	agaagtgatt	gatgcagtaa	acaaggctgg	ttggagaatg	420
aaaacaacaa	ccgctaatgg	tcaaacaggt	caagctgaca	agtttgaaac	cgttacatca	480
ggcacaaatg	taacctttgc	tagtggtaaa	ggtacaactg	cgactgtaag	taaagatgat	540
caaggcaaca	tcactgttat	gtatgatgta	aatgtcggcg	atgccctaaa	cgtcaatcag	600
ctgcaaaaca	gcggttggaa	tttggattcc	aaagcggttg	caggttcttc	gggcaaagtc	660
atcagcggca	atgtttcgcc	gagcaaggga	aagatggatg	aaaccgtcaa	cattaatgcc	720
ggcaacaaca	tcgagattac	ccgcaacggt	aaaaatatcg	acatcgccac	ttcgatgacc	780
ccgcagtttt	ccagcgtttc	gctcggcgcg	ggggcggatg	cgcccacttt	gagcgtggat	840
ggggacgcat	tgaatgtcgg	cagcaagaag	gacaacaaac	ccgtccgcat	taccaatgtc	900

PL 216 780 B1

gccccgggcg	ttaaagaggg	ggatgttaca	aacgtcgcac	aacttaaagg	cgtggcgcaa	960
aacttgaaca	accgcatcga	caatgtggac	ggcaacgcgc	gtgcgggcat	cgcccaagcg	1020
attgcaaccg	caggtctggt	tcaggcgtat	ttgcccggca	agagtatgat	ggcgatcggc	1080
ggcggcactt	atcgcggcga	agccggttac	gccatcggct	actccagtat	ttccgacggc	1140
ggaaattgga	ttatcaaagg	cacggcttcc	ggcaattcgc	gcggccattt	cggtgcttcc	1200
gcatctgtcg	gttatcagtg	gtaa				1224

<210> 31 <211> 1302 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 31

atgaacaaaa tataccgcat catttggaat agtgccctca atgcatgggt cgtcgtatcc	60
gagctcacac gcaaccacac caaacgcgcc tccgcaaccg tgaagaccgc cgtattggcg	120
actctgttgt ttgcaacggt tcaggcaagt gctaaccgtg cggcaagcgt taaagacgta	180
ttaaacgctg gctggaacat taaaggcgtt aaacccggta caacagcttc cgataacgtt	240
gatttcgtcc gcacttacga cacagtcgag ttcttgagcg cagatacgaa aacaacgact	300
gttaatgtgg aaagcaaaga caacggcaag aaaaccgaag ttaaaatcgg tgcgaagact	360
tctgttatta aagaaaaaga cggtaagttg gttactggta aagacaaagg cgagaatggt	420
tcttctacag acgaaggcga aggcttagtg actgcaaaag aagtgattga tgcagtaaac	480
aaggctggtt ggagaatgaa aacaacaacc gctaatggtc aaacaggtca agctgacaag	540
tttgaaaccg ttacatcagg cacaaatgta acctttgcta gtggtaaagg tacaactgcg	600
actgtaagta aagatgatca aggcaacatc actgttatgt atgatgtaaa tgtcggcgat	660
gccctaaacg tcaatcagct gcaaaacagc ggttggaatt tggattccaa agcggttgca	720
ggttcttcgg gcaaagtcat cagcggcaat gtttcgccga gcaagggaaa gatggatgaa	780
accgtcaaca ttaatgccgg caacaacatc gagattaccc gcaacggtaa aaatatcgac	840
atcgccactt cgatgacccc gcagttttcc agcgtttcgc tcggcgcggg ggcggatgcg	900
cccactttga gcgtggatgg ggacgcattg aatgtcggca gcaagaagga caacaaaccc	960
gtccgcatta ccaatgtcgc cccgggcgtt aaagaggggg atgttacaaa cgtcgcacaa	1020
cttaaaggcg tggcgcaaaa cttgaacaac cgcatcgaca atgtggacgg caacgcgcgt	1080
gcgggcatcg cccaagcgat tgcaaccgca ggtctggttc aggcgtattt gcccggcaag	1140
agtatgatgg cgatcggcgg cggcacttat cgcggcgaag ccggttacgc catcggctac	1200
tccagtattt ccgacggcgg aaattggatt atcaaaggca cggcttccgg caattcgcgc	1260

PL 216 780 B1 ggccatttcg gtgcttccgc atctgtcggt tatcagtggt aa 1302 <210> 32 <211> 1509 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 32

atgaacaaaa	tataccgcat	catttggaat	agtgccctca	atgcatgggt	cgtcgtatcc	60
gagctcacac	gcaaccacac	caaacgcgcc	tccgcaaccg	tgaagaccgc	cgtattggcg	120
actctgttgt	ttgcaacggt	tcaggcaagt	gctaacaccc	tcaaagccgg	cgacaacctg	180
aaaatcaaac	aattcaccta	ctcgctgaaa	aaagacctca	cagatctgac	cagtgttgga	240
actgaaaaat	tatcgtttag	cgcaaacggc	aataaagtca	acatcacaag	cgacaccaaa	300
ggcttgaatt	ttgcgaaaga	aacggctggg	acgaacggcg	acaccacggt	tcatctgaac	360
ggtattggtt	cgactttgac	cgatcgtgcg	gcaagcgtta	aagacgtatt	aaacgctggc	420
tggaacatta	aaggcgttaa	aaacgttgat	ttcgtccgca	cttacgacac	agtcgagttc	480
ttgagcgcag	atacgaaaac	aacgactgtt	aatgtggaaa	gcaaagacaa	cggcaagaaa	540
accgaagtta	aaatcggtgc	gaagacttct	gttattaaag	aaaaagacgg	taagttggtt	600
actggtaaag	acaaaggcga	gaatggttct	tctacagacg	aaggcgaagg	cttagtgact	660
gcaaaagaag	tgattgatgc	agtaaacaag	gctggttgga	gaatgaaaac	aacaaccgct	720
aatggtcaaa	caggtcaagc	tgacaagttt	gaaaccgtta	catcaggcac	aaatgtaacc	780
tttgctagtg	gtaaaggtac	aactgcgact	gtaagtaaag	atgatcaagg	caacatcact	840
gttatgtatg	atgtaaatgt	cggcgatgcc	ctaaacgtca	atcagctgca	aaacagcggt	900
tggaatttgg	attccaaagc	ggttgcaggt	tcttcgggca	aagtcatcag	cggcaatgtt	960
tcgccgagca	agggaaagat	ggatgaaacc	gtcaacatta	atgccggcaa	caacatcgag	1020
attacccgca	acggtaaaaa	tatcgacatc	gccacttcga	tgaccccgca	gttttccagc	1080
gtttcgctcg	gcgcgggggc	ggatgcgccc	actttgagcg	tggatgggga	cgcattgaat	1140
gtcggcagca	agaaggacaa	caaacccgtc	cgcattacca	atgtcgcccc	gggcgttaaa	1200
gagggggatg	ttacaaacgt	cgcacaactt	aaaggcgtgg	cgcaaaactt	gaacaaccgc	1260
atcgacaatg	tggacggcaa	cgcgcgtgcg	ggcatcgccc	aagcgattgc	aaccgcaggt	1320
ctggttcagg	cgtatttgcc	cggcaagagt	atgatggcga	tcggcggcgg	cacttatcgc	1380
ggcgaagccg	gttacgccat	cggctactcc	agtatttccg	acggcggaaa	ttggattatc	1440
aaaggcacgg	cttccggcaa	ttcgcgcggc	catttcggtg	cttccgcatc	tgtcggttat	1500

cagtggtaa ¹⁵⁰⁹

PL 216 780 B1 <210> 33 <211> 540 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 33

Asn Asn Glu Glu Gin Glu Glu Tyr Leu Tyr Leu His Pro Val Gin Arg 15 10 15

Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly Ala Gly Glu 20 25 30

Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr Phe Asn Glu 35 40 45

Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn 50 55 60

Leu Lys Ile Lys Gin Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80

Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe Ser 85 90 95

Ala His Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160

Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175

Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val “ ' 195 200 205

PL 216 780 B1

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly 210 215

Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 220

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu 225 230

Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 235 240

Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser 245

Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 250 255

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp 260

Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 265 270

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly 275 280

Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 285

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn 290 295

Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly 300

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp 305 310

Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met 315 320

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala 325

Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn 330 335

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys 340

Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 345 350

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro 355 360

Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 365

Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn 370 375

Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 380

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met 385 390

Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 395 400

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro 405

Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala 410 415

Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp 420

Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn 425 430

Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly 435 440

Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu 445

Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn

Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly

PL 216 780 B1

450 455 460

Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu Val 465 470 475 480

Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly Thr 485 490 495

Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp 500 505 510

Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg Gly 515 520 525

His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp 530 535 540 <210> 34 <211> 541 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 34

Thr Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Leu Glu Ser Val Gln Arg Ser Val 15 10 15

Val Gly Ser Ile Gln Ala Ser Met Glu Gly Ser Val Glu Leu Glu Thr 20 25 30

Ile Ser Leu Ser Met Thr Asn Asp Ser Lys Glu Phe Val Asp Pro Tyr 35 40 45

Ile Val Val Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn 50 55 60

Thr Asn Glu Asn Thr Asn Ala Ser Ser Phe Thr Tyr Ser Leu Lys Lys 65 70 75 80

Asp Leu Thr Gly Leu Ile Asn Val Glu Thr Glu Lys Leu Ser Phe Gly 85 90 95

Ala Asn Gly Lys Lys Val Asn Ile Ile Ser Asp Thr Lys Gly Leu Asn 100 105 110

Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His Leu 115 120 125

PL 216 780 B1

Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly Ala 130 135 140

Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys Arg 145 150 155 160

Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 165 170 175

Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg Thr 180 185 190

Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val ^J ' 195 200 205

Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly 210 215 220

Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly 225 230 235 240

Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu 245 250 255

Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg 260 265 270

Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 275 280 285

Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn Gly 290 295 300

Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Lys 305 310 315 320

Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn ' 325 330 335

Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys 340 345 350

Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr 355 360 365

PL 216 780 B1

Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys 370 375 380

Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser 385 390 395 400

Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu Gly 405 410 415

Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr 420 425 430

Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Vał Ala Gin 435 440 445

Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val Asn 450 455 460

Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly Leu 465 470 475 480

Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly Gly 485 490 495

Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile Ser 500 505 510

Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser Arg 515 520 525

Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 530 535 540 <210> 35 <211> 461 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 35

Asn Asn Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu Ser Phe 15 10 15

Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys Gly Leu 20 25 30

Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr Val His 35 40 45

PL 216 780 B1

Thr Val Asn

Ile

Asn

Ala Gly Asn 295

Asn Ile

Glu

Ile 300

Thr

Arg

Asn

Gly

290

Lys

Asn

Ile

Asp

Ile

Ala

Thr

Ser

Met

Thr

Pro

Gin

Phe

Ser

Val

305

310

315

320

Ser

Leu

Gly

Ala

Gly

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Leu

Ser

Val

Asp

Gly

Asp

325

330

335

Ala

Leu

Asn

Val

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Lys

Pro

Val

Arg

Ile

Thr

340

345

350

Asn

Val

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

Glu

Gly

Asp

Val

Thr

Asn

Val

Ala

Gin

355

360

365

Leu

Lys

Gly

Val

Ala

Gin

Asn

Leu

Asn

Arg

Ile

Asp

Asn

Val

Asp

370

375

380

Gly

Asn

Ala

Arg

Ala

Gly

Ile

Ala

Gin

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

385

390

395

400

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

Met

Ala

Ile

Gly

405

410

415

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

420

425

430

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

435

440

445

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Tyr

Gin

Trp

450 455 460 <210> 36 <211> 462 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis

<400> :

36

Thr 1

Asp

Glu

Thr

Gly 5

Leu

Ile

Asn

Val

Glu 10

Thr

Glu

Lys

Leu

Ser 15

Phe

Gly

Ala

Asn

Gly 20

Lys

Val

Asn

Ile 25

Ile

Ser

Asp

Thr

Lys 30

Gly

Leu

Asn

Phe

Ala

Lys

Glu

Thr

Ala

Gly

Thr

Asn

Gly

Asp

Thr

Val

His

PL 216 780 B1

40 45

Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Met Leu Leu Asn Thr Gly 50 55 60

Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu Lys Lys 65 70 75 80

Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys 85 90 95

Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe Val Arg 100 105 110

Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr 115 120 125

Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile 130 135 140

Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr 145 150 155 160

Gly Lys Gly Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly 165 170 175

Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp 180 185 190

Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala Asp Lys 195 200 205

Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Lys Val Thr Phe Ala Ser Gly Asn 210 215 220

Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile Thr Val 225 230 235 240

Lys Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln Leu Gln 245 250 255

Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly 260 265 270

Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu 275 280 285

PL 216 780 B1

Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly 290 295 300

Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val 305 310 315 320

Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Glu ^J 325 330 335

Gly Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Asp Ala Asn Lys Pro Val Arg Ile 340 345 350

Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val Ala 355 360 365

Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn Val 370 375 380

Asn Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin Ala Ile Ala Thr Ala Gly 385 390 395 400

Leu Val Gin Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly Gly 405 410 415

Gly Thr Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser Ile “ 420 425 430

Ser Ala Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn Ser 435 440 445

Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 450 455 460 <210> 37 <211> 356 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 37

Asn Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser 15 10 15

Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly ‘ 20 25 30

PL 216 780 B1

Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu 35 40 45

Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser 50 55 60

Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp 65 70 75 80

Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly 85 90 95

Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn 100 105 110

Val Thr Phe Ala Ser Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp 115 120 125

Asp Gin Gly Asn Ile Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala 130 135 140

Leu Asn Val Asn Gin Leu Gin Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys 145 150 155 160

Ala Val Ala Gly Ser Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro 165 170 175

Ser Lys Gly Lys Met Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn 180 185 190

Ile Glu Ile Thr Arg Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met 195 200 205

Thr Pro Gin Phe Ser Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro 210 215 220

Thr Leu Ser Val Asp Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp 225 230 235 240

Asn Lys Pro Val Arg Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly 245 250 255

Asp Val Thr Asn Val Ala Gin Leu Lys Gly Val Ala Gin Asn Leu Asn 260 265 270

Asn Arg Ile Asp Asn Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gin

PL 216 780 B1

275

280

285

Ala

Ile

Ala

Thr

Ala

Gly

Leu

Val

Gin

Ala

Tyr

Leu

Pro

Gly

Lys

Ser

290

295

300

Met

Ala

Ile

Gly

Thr

Tyr

Arg

Gly

Glu

Ala

Gly

Tyr

Ala

305

310

315

320

Ile

Gly

Tyr

Ser

Ile

Ser

Asp

Gly

Asn

Trp

Ile

Lys

Gly

325

330

335

Thr

Ala

Ser

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

His

Phe

Gly

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

340

345

350

Gly

Tyr

Gin

Trp

355 <210> 38 <211> 382 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 38

Asn 1

Arg

Ala

Ser 5

Val

Lys

Asp

Val

Leu 10

Asn

Ala

Gly

Trp

Asn 15

Ile

Lys

Gly

Val

Lys 20

Pro

Gly

Thr

Ala 25

Ser

Asp

Asn

Val

Asp 30

Phe

Val

Arg

Thr

Tyr 35

Asp

Thr

Val

Glu

Phe 40

Leu

Ser

Ala

Asp

Thr 45

Lys

Thr

Val 50

Asn

Val

Glu

Ser

Lys 55

Asp

Asn

Gly

Lys

Lys 60

Thr

Glu

Val

Lys

Ile 65

Gly

Ala

Lys

Thr

Ser 70

Val

Ile

Lys

Glu

Lys 75

Asp

Gly

Lys

Leu

Val 80

Thr

Gly

Lys

Asp

Lys 85

Gly

Glu

Asn

Gly

Ser 90

Ser

Thr

Asp

Glu

Gly 95

Glu

Gly

Leu

Val

Thr 100

Ala

Lys

Glu

Val

Ile 105

Asp

Ala

Val

Asn

Lys 110

Ala

Gly

Trp

Arg

Met 115

Lys

Thr

Ala 120

Asn

Gly

Gin

Thr

Gly 125

Gin

Ala

Asp

PL 216 780 B1

Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gin Trp 370 375 380 <210> 39 <211> 201 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 39

Ser Ala Asn Thr Leu Lys Ala Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gin Phe 15 10 15

Thr Tyr Ser Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr 20 25 30

Glu Lys Leu Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser 35 40 45

Asp Thr Lys Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly 50 55 60

Asp Thr Thr Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Arg 65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn Ile Lys Gly 85 90 95

Val Lys Asn Val Asp Phe Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu 100 105 110

Ser Ala Asp Thr Lys Thr Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn 115 120 125

Gly Lys Lys Thr Glu Val Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys 130 135 140

Glu Lys Asp Gly Lys Leu Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly 145 150 155 160

Ser Ser Thr Asp Glu Gly Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile 165 170 175

Asp Ala Val Asn Lys Ala Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn 180 185 190

Gly Gin Thr Gly Gin Ala Asp Lys Phe 195 200

PL 216 780 B1 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 40 caattaacgg ccgaataaaa ggaagccgat atgaacaaaa tataccgcat c 51 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 41 tggaatccat ggaatcgcca cccttccctt c „<210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 42 ggtcagatct gtttcattgt tagcacttgc 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 43 gatcaggcct gtatcttcat cggtagcatt <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 44 gacgaaatca acgttcttag cacttgcctg aaccgttgc 39 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis <400> 45 aacgttgatt tcgtccgcac ttac <210>

<211>

<212>

<213>

DNA

Neisseria meningitidis

PL 216 780 B1

<210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <220>

<221> cecha polimorficzna <222> (1)..(2) <223> X jesy jakimkolwiek aminokwasem lub oznacza brak aminokwasu <400> 52

Xaa Xaa Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr

10

100

PL 216 780 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyizolowane białko zawierające sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO:23 i SEQ ID NO:35.
2. Wyizolowane białko, znamienne tym, że ma sekwencję w 80% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych zastrz. 1, które jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
3. Wyizolowane białko, znamienne tym, że ma sekwencję w 90% identyczną z sekwencjami wyizolowanych białek określonych zastrz. 1, które jest zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej względem wielu szczepów N. meningitidis, z wyłączeniem polipeptydu NhhA typu dzikiego.
4. Białko fuzyjne, znamienne tym, że zawiera partnera fuzyjnego oraz wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3.
5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedno wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3 albo białko fuzyjne określone w zastrz. 4, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że ma postać szczepionki.
7. Przeciwciało monoklonalne lub wiążący antygen fragment przeciwciała monoklonalnego, znamienny tym, że wiąże się z reagującym krzyżowo epitopem wyizolowanego białka określonego w jednym z zastrz. 1-3.
8. Wyizolowany kwas nukleinowy, znamienny tym, że koduje wyizolowane białko określone w jednym z zastrz. 1-3 lub białko fuzyjne określone w zastrz. 4.
9. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID NO:28.
10. Konstrukt ekspresyjny zawierający wyizolowany kwas nukleinowy określony w jednym z zastrz. 8-9 funkcjonalnie połączony z promotorem.
11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że ma postać szczepionki.
13. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10.
14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że jest bakterią.
15. Komórka gospodarza według zastrz. 14, znamienna tym, że jest z gatunku Neisseria meningitidis.
16. Sposób wytwarzania rekombinowanego białka, znamienny tym, że obejmuje (i) hodowanie komórki gospodarza określonej w jednym z zastrz. 13-15, tak że w komórce gospodarza wyrażane jest rekombinowane białko, oraz (ii) izolowanie rekombinowanego białka.
17. Wyizolowane białko określone w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
18. Wyizolowane białko do zastosowania według zastrz. 17, znamienne tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
19. Białko fuzyjne określone w zastrz. 4 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
20. Białko fuzyjne do zastosowania według zastrz. 19, znamienne tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
21. Konstrukt ekspresyjny określony w zastrz. 10 do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu zakażenia N. meningitidis.
22. Konstrukt ekspresyjny do zastosowania według zastrz. 21, znamienny tym, że zakażenie N. meningitidis występuje u człowieka.
23. Sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej, w której podejrzewa się jej obecność, znamienny tym, że obejmuje (i) łączenie przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego określonego w zastrz. 7 z próbką biologiczną uzyskaną od ssaka, oraz

PL 216 780 B1

101 (ii) wykrywanie swoiście związanego przeciwciała monoklonalnego lub fragmentu przeciwciała monoklonalnego, wskazującego na obecność N. meningitidis.
24. Sposób diagnozowania zakażenia N. meningitidis u ssaka, znamienny tym, że obejmuje (i) kontaktowanie próbki biologicznej uzyskanej od osobnika z wyizolowanym białkiem określonym w jednym z zastrz. 1-3 albo białkiem fuzyjnym określonym w zastrz. 4, oraz (ii) wykrywanie obecności lub nieobecności we wspomnianej próbce kompleksu utworzonego pomiędzy wspomnianym wyizolowanym białkiem lub białkiem fuzyjnym oraz przeciwciałami specyficznymi dla N. meningitidis, gdzie obecność wspomnianego kompleksu wskazuje na występowanie zakażenia.
25. Sposób wykrywania N. meningitidis w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta, znamienny tym, że obejmuje etap wykorzystania wyizolowanego kwasu nukleinowego określony w zastrzeżeniu 8 albo 9 dla wykrycia obecności N. meningitidis w próbce biologicznej.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że próbka pochodzi od człowieka.
27. Zastosowanie wyizolowanego białka określonego w jednym zastrz. 1-3 albo białka fuzyjnego określonego w zastrz. 4 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.
28. Zastosowanie konstruktu ekspresyjnego określonego w zastrz. 10 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zakażenia N. meningitidis.