PT1549338E - Vacinas polipeptídicas para protecção alargada contra linhagens meningocócicas hipervirulentas - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "VACINAS POLIPEPTIDICAS PARA PROTECÇÀO ALARGADA CONTRA LINHAGENS MENINGOCÓCICAS HIPERVIRULENTAS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção encontra-se incluída nas áreas de imunologia e vacinologia. Em particular, a presente invenção refere-se a antigénios de Neisseria meningitidis (meningococos) e respectiva utilização na imunização.

TÉCNICA ANTERIOR N. meningitidis é um patogénio não móvel, gram-negativo humano que coloniza a faringe e causa meningite (e, ocasionalmente, septicemia na ausência de meningite). N. meningitidis causa tanto doença endémica como epidémica. No seguimento da introdução da vacina conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningitidis é a maior causa de meningite bacteriana nos Estados Unidos da América.

Com base no polissacarídeo capsular do organismo, foram identificados vários serogrupos de N. meningitidis. 0 serogrupo A é o patogénio mais frequentemente implicado na doença epidémica na África subsaariana. Os serogrupos B e C são responsáveis pela grande maioria dos casos nos Estados Unidos da América e na maioria dos países desenvolvidos. Os serogrupos W135 e Y são responsáveis pelos restantes casos nos EUA e países desenvolvidos. Depois do serogrupo, a classificação inclui serotipo, serosubtipo e depois imunotipo e a nomenclatura Standard indica serogrupo, 2 serotipo, serosubtipo e imunotipo, cada um separado por uma vírgula, por exemplo B: 4: Pl. 15: L3,7,9. Dentro do serogrupo B, existem algumas linhagens que causam frequentemente doenças (hiperinvasivas), algumas linhagens que causam formas mais severas de doença do que outras (hipervirulentas) e outras que raramente causam alguma doença. São reconhecidas sete linhagens hipervirulentas, nomeadamente subgrupos I, III e iv-l, complexo ET-5, complexo ET-37, grupo A4 e linhagem 3. Estas foram definidas por electroforese de enzimas multilocus (MLEE), mas a tipagem de sequência multilocus (MLST) foi igualmente utilizada para classificar meningococos [ref. 1] . Há muitos anos que existe uma vacina para os serogrupos A, C, W135 e Y [2,3], mas quanto ao serogrupo B a vacina tem-se revelado difícil de descobrir. Foram testadas vacinas à base de vesículas da membrana externa [por exemplo, vide ref. 4], mas a protecção conseguida com estas vacinas é tipicamente restrita à estirpe utilizada para produzir a vacina. Mantém-se assim a necessidade de uma vacina para o serogrupo B que seja amplamente eficaz. Têm sido registadas sequências genómicas para os serogrupos meningocócicos A [5] e B [6,7] e a sequência do serogrupo B tem vindo a ser estudada para identificar antigénios para vacinas [por exemplo, refs. 8 a 13] . Os antigénios candidatos têm sido manipulados no sentido de se melhorar a expressão heteróloga [refs. 14 a 16. A referência 16 apresenta uma sequência da proteína híbrida (SEQ ID NO: 15 da presente invenção) para a expressão simultânea de duas ou mais proteínas de 3

Neisseria. Esta sequência foi alvo de renúncia (disclaimer) da reivindicação 2 parte (iii). É objecto da presente invenção facultar mais composições melhoradas para proporcionar imunidade contra a doença e/ou infecção meningocócica e, em particular para proporcionar uma maior imunidade contra o meningococo do serogrupo B.

DIVULGAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

As vacinas contra patogénios tais como o vírus da hepatite B, difteria e tétano contêm normalmente um antigénio de proteína única (por exemplo, o antigénio de superfície HBV ou um toxóide tetânico) . Em contraste, a vacina da tosse convulsa celular contém tipicamente, pelo menos, três proteínas B. pertussis e a vacina pneumococica Prevenar™ contém sete antigénios sacarídeos conjugados separados. Outras vacinas, tal como a vacina pertussis celular, a vacina do sarampo, a vacina contra a poliomielite inactivada (IPV) e vacina meningocócica OMV são, pela sua própria natureza, misturas complexas de um grande número de antigénios.

Se a protecção pode ser provocada por um único antigénio, um pequeno número de antigénios definido, ou por uma mistura complexa de antigénios indefinida, depende, assim, do agente patogénico em questão. A invenção é baseada na descoberta que um número pequeno de antigénios definidos tem capacidade de facultar uma protecção alargada contra a infecção meningocócica e a presente invenção 4 apresenta uma composição, a qual após administrada a um sujeito, tem capacidade para induzir uma resposta do anticorpo nesse mesmo sujeito, em que a resposta do anticorpo é bactericida contra duas ou mais (por exemplo, 2 ou 3) das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 do serogrupo B da N. meningitidis.

Em vez de consistir num antigénio único, é preferível que a composição inclua uma mistura de 10 ou menos (por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antigénios purificados, e é particularmente preferível que a composição não inclua misturas complexas ou indefinidas de antigénios, por exemplo, é preferível que não inclua vesículas de membrana exterior na composição.

Para o serogrupo B meningocócico, foi descoberta uma mistura de cinco antigénios de proteínas definidas para desencadear uma boa resposta imune protectora. A presente invenção apresenta, deste modo, uma composição que inclui os seguintes cinco antigénios de proteínas meningocócicas: (1) uma proteína 'NadA'; (2) uma proteína '741'; (3) uma proteína '936'; (4) uma proteína '953'; e (5) uma proteína '287' tal como definido nas reivindicações. Estes antigénios são referidos presentemente como os "cinco antigénios básicos".

Proteína NadA 'NadA' (Neisserial adesina A) do serogrupo B de N. meningitidis é apresentado como proteína '961' na referência 10 (SEQ IDs 2943 e 2944) e como 'NMB1994' na referência 6 (vide igualmente números de acesso de GenBank: 11352904 e 7227256) . Uma descrição detalhada da descrição 5 da proteína pode ser encontrada na referência 17. Não existe proteína correspondente no serogrupo A [5,17].

Quando utilizada, a proteína NadA pode assumir várias formas. As formas preferidas de NadA são variantes de truncação ou eliminação, tal como aquelas divulgadas nas referências 14 a 16. Em particular, é preferível a NadA sem a sua âncora da membrana C-terminal (por exemplo, eliminação dos resíduos 351-405 para estirpe 2996 [SEQ ID 1]), a qual é, por vezes, presentemente distinguida pela utilização de um "C" ao expoente, por exemplo, NadA(c) . A expressão de NadA sem o seu domínio de âncora de membrana (por exemplo, SEQ ID 1) em E. coli resulta na secreção da proteína para o sobrenadante da cultura com remoção concomitante do seu peptídeo líder 23mer (por exemplo, deixar um 327mer para a estirpe 2996 [SEQ ID 2]). Os polipeptídeos sem os seus peptídeo líder são presentemente, por vezes, distinguidos pela utilização de um NL' ao expoente, por exemplo, NadA(NL) ou NadA(c) (NL) .

As sequências de NadA preferidas possuem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a SEQ ID 2. Este inclui as variantes NadA (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, artólogas, paralógas, mutantes etc.). As formas alélicas de NadA são apresentadas na Figura 9 da referência 18.

Outras sequências NadA preferidas incluem, pelo menos, aminoácidos n consecutivos da SEQ ID 1, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos incluem um epítopo de NadA. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos 6 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou o terminal N da SEQ ID 1 (por exemplo, NadA(c), NadA<NL), NadA(c) <NL) . Onde os residuos do terminal N são eliminados, é preferível que a eliminação não remova a capacidade de NadA para aderir às células epiteliais humanas. Um fragmento preferido da SEQ ID 1 é SEQ ID 2. A NadA segregada pode convenientemente ser preparada em forma altamente pura a partir do sobrenadante da cultura por meio de um processo que inclui as fases de: concentração e diafiltração contra um tampão por ultrafiltração, cromatografia em coluna aniónica; cromatografia em coluna de interacção hidrofóbica; cromatografia de coluna de hidroxiapatita cerâmica; diafiltração contra um tampão; e esterilização por filtração. São facultados, nos exemplos abaixo, mais detalhes sobre o processo.

NadA é preferencialmente utilizada numa forma oligomérica (por exemplo, numa forma trimérica).

Proteína 741 A proteína '741' do serogrupo B é divulgada na referência 10 (SEQ IDs 2535 e 2536) e como 'NMB1870' na referência 6 (vide igualmente número de acesso G1 de

Genbank: 7227128). A proteína correspondente no serogrupo A [5] tem o número de acesso de Genbank 7379322. 741 é naturalmente uma lipoproteína.

Quando utilizada, a proteína 741 pode assumir várias formas. As formas preferidas da proteína 741 são variantes de truncação e eliminação, tal como as divulgadas nas referências 14 a 16. Em particular, o terminal N da 741 7 pode ser eliminado e incluir a sua sequência poliglicina (por exemplo, eliminação de resíduos 1 a 72 para estirpe MC58 [SEQ ID 3]), a qual é presentemente, por vezes, distinguida pela utilização de um prefixo 'AG'. Esta eliminação pode intensificar a expressão. A eliminação remove igualmente o local de lipidação da 741.

As sequências 741 preferidas possuem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a SEQ ID 3. Este inclui as variantes de 741 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, artólogas, paralógas, mutantes etc.). As formas alélicas de 741 podem ser encontradas em SEQ IDs 1 a 22 de referência 16, e em SEQ IDs 1 a 23 de referência 19. SEQ IDs 1-299 de referência 20 apresentam mais sequências da 741.

Outras sequências 741 preferidas incluem, pelo menos, aminoácidos n consecutivos da SEQ ID 3, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos incluem um epítopo da 741. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou o terminal N da SEQ ID 3. A proteína 741 é um antigénio extremamente eficaz para desencadear respostas do anticorpo anti-meningocócica, e expressa-se em todo os serogrupos meningocócicos. A análise filogenética mostra que a proteína se divide em dois grupos e que um destes grupos se divide de novo para facultar três variantes no total [21], e embora seja bactericida dentro do mesmo grupo de variantes com aumento sérico em comparação com uma determinada variante, não é activo 8 relativamente às estirpes que expressa, uma das outras duas variantes, isto é, existem uma protecção cruzada intra-variantes, mas não existe uma protecção cruzada inter-variantes. Para uma eficácia máxima de estirpe cruzada é, por conseguinte preferível que uma composição inclua mais do que uma variante da proteína 741. Uma sequência exemplar de cada variante é apresentada em SEQ ID 10, 11 e 12 presentemente, começando com um resíduo de cisteina de terminal C à qual será ligado covalentemente um lípido na forma de lipoproteína da 741. É, por conseguinte, preferível que a composição inclua, pelo menos, duas de: (1) uma primeira proteína que inclua uma sequência de aminoácidos que tenha, pelo menos, a% de identidade de sequência com a SEQ ID 10 e/ou que inclua uma sequência de aminoácidos que consista num fragmento de, pelo menos, x aminoácidos contíguos à SEQ ID 10; (2) uma segunda proteína, que inclua uma sequência de aminoácidos que tenha, pelo menos, b% de identidade de sequência com a SEQ ID 11 e/ou que inclua uma sequência de aminoácidos que consista num fragmento de, pelo menos y aminoácidos contíguos à SEQ ID 11; e (3) uma terceira proteína, que inclua uma sequência de aminoácidos que tenha, pelo menos, c% identidade de sequência com SEQ ID 12 e/ou que inclua uma sequência de aminoácidos que consista num fragmento de, pelo menos z aminoácidos contíguos à SEQ ID 12. O valor de x é de pelo menos, 85, por exemplo, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 , 99, 5, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 90, 99, 5, 140, 160 , 180, 200, 225, 250) . 0 valor de b é de, pelo menos, 85, por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, ou mais. O valor de c é de, pelo 9 menos, 85, por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, ou mais. Os valores de a, b e c não se encontram intrinsecamente relacionados entre si. 0 valor de x é de, pelo menos, 7, por exemplo , 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29 , 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 , 140, 160, 180, 200, 225, 250). O valor de y é de, pelo i menos, 7, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 , 60 , 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . 0 valor de z é de, pelo menos, 7, por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Os valores de y e z nao se encontram intrinsecamente ligados entre si. É preferível que qualquer sequência determinada de 741 aminoácidos não se insira em mais do que uma das categorias (1), (2) e (3). Qualquer sequência determinada de 741 irá, deste modo, ser inserida numa única das categorias (1), (2) e (3). É, assim preferível que: a proteína (1) tenha menos de i% identidade de sequência para a proteína (2); a proteína (1) tenha menos de j% identidade de sequência para a proteína (3); e a proteína (2) tenha menos de k% identidade de sequência para a proteína (3). O valor de i é 60 ou mais (por exemplo , 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, co LO co co 87, 88, 89, 90, etc.) e é no máximo a. 0 valor de j é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, LO QQ 66, 67, CO 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, . 85, 86, CO ^1 co co , 89, 90 , etc.) e é no máximo b. 0 10 valor de k é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc .) e é no máximo c. Os valores de i, j e k nao se encontram intrinsecamente relacionados entre si.

Proteína 936 A proteína '936' do serogrupo B é divulgada na referência 10 (SEQ iDs 2883 e 2884) e como 'NMB20 91' na referência 6 (vide igualmente número de acesso G1 de

Genbank: 7227353). O gene correspondente no serogrupo A [5] tem o número de acesso do Genbank 7379093.

Quando utilizada, a proteína 936 pode assumir várias formas. As formas preferidas da proteína 936 são variantes de truncação ou eliminação, tal como as divulgadas nas referências 14 a 16. Em particular, o peptídeo líder de terminal N da 936 pode ser eliminado (isto é, eliminação de resíduos 1 a 23 para a estirpe MC58 [SEQ ID 4]) para se obter 93 6<NL).

As sequências 936 preferidas possuem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a SEQ ID 4. Este inclui as variantes (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, artólogas, paralógas, mutantes etc.).

Outras sequências 936 preferidas incluem, pelo menos, aminoácidos n consecutivos da SEQ ID 4, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos incluem um epítopo da 936. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos 11 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou o terminal N da SEQ ID 4.

Proteína 953 A proteína '953' do serogrupo B é divulgada na referência 10 (SEQ iDs 2917 e 2918) e como 'NMB1030' na referência 6 (vide igualmente número de acesso G1 de

Genbank: 7226269). A proteína correspondente no serogrupo A [5] tem o número de acesso do Genbank 7380108.

Quando utilizada, a proteína 953 pode assumir várias formas. As formas preferidas da proteína 953 são variantes de truncação ou eliminação, tal como as divulgadas nas referências 14 a 16. Em particular, o peptídeo líder de terminal N da 953 pode ser eliminado (isto é, eliminação de resíduos 1 a 19 para a estirpe MC58 [SEQ ID 5]) para se obter 953(nl).

As sequências 953 preferidas possuem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a SEQ ID 5. Este inclui as variantes de 953 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, artólogas, paralógas, etc.). As formas alélicas da 953 podem ser observadas na Figura 19 da referência 12.

Outras sequências 953 preferidas incluem, pelo menos, aminoácidos n consecutivos da SEQ ID 5, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais) . Os fragmentos preferidos incluem um epítopo da 953. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos 12 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou o terminal N da SEQ ID 5.

Proteína 287 A proteína '287' do serogrupo B é divulgada na referência 10 (SEQ 13lDs 3103 e 3104) e como 'NMB2132' na referência 6 e como 'GNA2132' na referência 13 (vide igualmente número de acesso G1 de Genbank: 7227388) . A proteína correspondente no serogrupo A [5] tem o número de acesso do Genbank 7379057.

Quando utilizada, a proteína 287 pode assumir várias formas. As formas preferidas de 287 são variantes de truncação e eliminação, tal como as divulgadas nas referências 14 a 16. Em particular, o terminal N da 287 pode ser eliminado e incluir a sua sequência poliglicina (por exemplo, eliminação de resíduos 1 a 24 para estirpe MC 5 8 [SEQ ID 6]), a qual é presentemente, por vezes, distinguida pela utilização de um prefixo 'AG'. Esta eliminação pode intensificar a expressão.

As sequências 287 preferidas possuem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para a SEQ ID 6. Este inclui as variantes de 287 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, artólogas, paralógas, etc.). As formas alélicas da 287 podem ser observadas nas Figuras 5 e 15 da referência 12 e no exemplo 13 e figura 21 da referência 10 (SEQ IDs 3179 a 3184) .

Outras sequências 287 preferidas incluem, pelo menos, aminoácidos n consecutivos da SEQ ID 6, em que n é 7 ou 13 mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Os fragmentos preferidos incluem um epitopo da 287. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do terminal C e/ou o terminal N da SEQ ID 6.

Proteínas de fusão

Os cinco antigénios podem ser apresentados na composição como cinco proteínas separadas, mas prefere-se que, pelo menos, dois dos antigénios sejam expressos como uma cadeia simples de polipeptideo (uma proteína 'híbrida' [refs. 14 a 16]) por exemplo, de modo a que os cinco antigénios formem menos do que cinco polipetídeos. Proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: Primeiro, uma proteína que pode ser instável ou fracamente expressa por si só pode ser assistida ao se adicionar um parceiro híbrido adequado que ultrapasse o problema; segundo, a produção comercial é simplificada uma vez que precisam ser empregues apenas uma expressão e purificação de modo a se produzir duas proteínas separadamente úteis.

Uma proteína híbrida incluída numa composição inclui dois ou mais (isto é, 2, 3, 4 ou 5) dos cinco antigénios básicos. São preferidas as híbridas que consistem em dois dos cinco antigénios básicos.

Dentro da combinação dos cinco antigénios básicos, existe um antigénio que pode estar presente em mais doa que uma proteína híbrida e/ou como uma proteína não híbrida. É preferível, no entanto, que um antigénio esteja presente seja como um híbrido ou como não híbrido, mas não ambos, embora possa ser útil incluir a proteína 741 tanto como 14 antigénio híbrido e não híbrido (preferencialmente lipoproteína), particularmente onde se utilize mais do que uma variante de 741.

Dois antigénios híbridos para utilização na presente invenção incluem: NadA e 741; NadA e 936; NadA e 953; NadA e 287; 741 e 936; 741 e 953; 741 e 287; 936 e 953; 936 e 287; 953 e 287. Os dois antigénios híbridos incluem: 741 e 936; 953 e 287.

As proteínas híbridas podem ser representadas pela fórmula NH2-A-[-X-L-] n-B- COOH, em que: X é uma sequência de aminoácidos de um dos cinco antigénios básicos; L é uma sequência de aminoácidos de ligante opcional; A é uma sequência de aminoácidos de terminal N opcional; B é uma sequência de aminoácidos de terminal c opcional; e n é 2, 3, 4 ou 5.

Se uma fracção -X- possuir uma sequência peptídica líder na sua forma de tipo selvagem, esta pode ser incluída ou omitida na proteína híbrida. Em algumas realizações, os peptideos líder serão eliminados excepto no caso da fracção — localizada no terminal N da proteína híbrida, isto é, o peptídeo líder de Xi será retido, mas os peptideos líderes de X2...Xn serão omitidos. Isto é equivalente à eliminação de todos os peptideos lider e utilizando o peptídeo líder de Xi como fracção -A-.

Para cada instância n de [-X-L-] a sequência de aminoácidos líder -L- deverá estar presente ou ausente. Por exemplo, quando n=2 o híbrido pode ser NH2-Xr-Li-X2-L2-COOH, NH2-Xr-X2-COOH, NH2-Xi-Li-X2-COOH, NH2-Xr- X2-L2-COOH, etc. Sequência(s) de aminoácidos ligante (s) -L- serão tipicamente curtas (por exemplo, 20 ou menos aminoácidos, 15 isto é, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1) . Os exemplos incluem sequências peptidicas curtas as quais facilitam a clonagem, ligantes de poliglicina (isto é, incluindo Glyn em que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), e etiqueta de histidina (isto é, Hisn em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) . Outras sequências de aminoácidos de ligantes adequadas serão aparentes para os especialistas na técnica. Um ligante útil é GSGGGG (SEQ ID 9), com o dipeptideo Gly-Ser formado a partir do local de restrição BamEI, deste modo ajudando à clonagem e manipulação, sendo e o tetrapeptídeo (Gly)4 um ligante típico de lipoliglicina . Se Xn+i for uma proteína AG e Ln for um ligante de glicina, isto pode ser equivalente a Xn+i, não sendo uma proteína AG e estando Ln ausente. -A- é uma sequência de aminoácidos de terminal N. Esta será tipicamente uma sequência curta (por exemplo, 40 ou menos aminoácidos, isto é, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2, D · Os exemplos incluem sequências líder para direccionar 0 tráfico da proteína ou sequências de peptídeos as quais facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, etiquetas de histidina, isto é, Hisn em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outras sequências de aminoácidos de terminal N serão aparentes para os especialistas na técnica. Se Xi carecer da sua própria metionina de terminal N, -A- é preferivelmente um oligopeptídeo (por exemplo, com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) a qual apresenta uma metionina de terminal N. 16 -BA- é uma sequência de aminoácidos de terminal C. Esta será tipicamente uma sequência curta (por exemplo, 40 ou menos aminoácidos, isto é, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 , 5, 4, 3, 2, D · Os exemplos incluem sequências para direccionar o tráfico da proteína, sequências de peptídeos curtas, as quais facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, incluindo etiquetas de histidina, isto é, Hisn em que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) ou sequências que intensifiquem a estabilidade da proteína. Outras sequências de aminoácidos de terminal C serão aparentes para os especialistas na técnica.

Mais preferencialmente, n é 2. Duas proteínas preferidas deste tipo são: Xi é uma 936 e X2 é uma 741; Xx é uma 287 e X2 é uma 953.

Duas proteínas híbridas particularmente preferidas da presente invenção são como segue: n A Xi Li X2 l2 B [SEQ ID] 2 MA AG287 GSGGGG 953 (NL) - - 7 2 M 936(NL) GSGGGG AG 741 - - 8

Estas duas proteínas são utilizadas em combinação com NadA (particularmente com SEQ ID 2). A 936-AG741 híbrida pode ser convenientemente preparada em forma altamente pura a partir da expressão E. coli por meio de um processo que inclui as fases de: Homogeneização: centrifugação, cromatografia em coluna catiónica; cromatografia em coluna aniónica; cromatografia de coluna 17 hidrofóbica; diafiltração contra um tampão; e esterilização por filtração. São facultados, nos exemplos abaixo, mais detalhes sobre o processo.

Sequências É divulgado um polipeptideo com uma sequência de aminoácidos seleccionados a partir do grupo que consiste em SEQ iDs 1 a 8. São igualmente divulgados polipeptideos que possuem uma sequência de aminoácidos com identidade de sequência a partir do grupo que consiste em SEQ IDs 1 a 8. Tal como acima descrito, o grau de identidade de sequência é preferencialmente maior do que 50% (eg. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais). É apresentado um polipeptideo que que inclui um fragmento da sequência NadA N. meningitidis, em que o referido fragmento retém a capacidade de NadA aderir às células epiteliais humanas. Os fragmentos que retêm 24-87 aminoácidos de NadA de comprimento integral são, deste modo, os preferidos. Os fragmentos preferidos carecem do peptideo lider de terminal N do referido NadA e/ou o dominio da âncora da membrana de terminal C do referido

NadA. Esta invenção não inclui, dentro do seu âmbito, qualquer dos fragmentos NadA divulgados na técnica anterior, por exemplo, nas referências 6 a 18. Com referência ao NadA [17] de cumprimento integral, a SEQ ID 1 carece do dominio da âncora da membrana e SEQ ID 2 carece do peptideo lider. A presente invenção apresenta igualmente um ácido nucleico que codifica esses peptideos. Mais ainda, apresenta-se o ácido nucleico, o qual pode hibridar para este ácido nucleico, preferencialmente sob condições de 18 "restringência elevada" (por exemplo, 65°C numa solução 0,1 x SSC, 0,5% SDS).

Os polipeptídeos podem ser preparados por várias maneiras (por exemplo, expressão recombinante, purificação de cultura celular, síntese química (pelo menos, em parte), etc.) e em várias formas (por exemplo, nativas, fusões, não-glicosiladas, lipidadas, etc.). Estas são preferencialmente preparadas em formas substancialmente puras (isto é, substancialmente livres de outras N. meningitidis ou proteínas de células hospedeiras). O ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, pode ser preparado de várias formas (por exemplo, por síntese química (pelo menos em parte), a partir de bibliotecas genómicas ou ADN, a partir do próprio organismo, etc.) e podem assumir várias formas (por exemplo, cadeia simples, cadeia dupla, vectores, sondas, etc.) Estas são preferencialmente preparadas em formas substancialmente puras (isto é, substancialmente livres de outras N. meningitidis ou ácidos nucleicos de células hospedeiras) . O termo "ácido nucleico" inclui ADN e ARN e também os seus análogos, tais como os que contêm estruturas modificadas (por exemplo, fosforotioratos, etc) e também ácidos nucleicos do peptídeo (PNA) etc. A presente invenção inclui sequências complementares às acima descritas (por exemplo, para efeitos antisense ou sonda). É igualmente apresentado um processo para produção de um polipeptídeo, que inclui a fase de cultura de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico sob condições que induzem à expressão do polipeptídeo. 19

Estirpes

As proteínas preferidas incluem uma sequência de aminoácidos descoberta no serogrupo B N. meningitidis. Dentro do serogrupo B, as estirpes preferidas são 2996, MC58, 95N477, e 394/98. A estirpe 394/98 é, por vezes, referida presentemente como W, uma vez que é uma estirpe da Nova Zelândia. A proteína 287 é preferencialmente da estirpe 2996 ou, mais preferencialmente, da estirpe 394/98. A proteína 741, é preferencialmente das estirpes do serogrupo B MC58, 2996, 394/98, ou 95N477 ou da estirpe do serogrupo C 90/18311. A mais preferida é a estirpe MC58.

As proteínas 936, 953 e NadA são preferencialmente da estirpe 2996.

As estirpes podem ser indicadas abaixo da linha, ou exemplo, 741mc48 é a proteína 741 da estirpe MC58. Salvo indicação em contrário, as proteínas presentemente mencionadas (por exemplo, sem subscrito) são da estirpe 2996 N. meningitidis, a qual pode ser assumida como uma estirpe de "referência". Será, no entanto, apreciado que a presente invenção não seja, modo geral, limitada por estirpe. Tal como acima mencionado, as referências gerais a uma proteína (por exemplo, '287', '919' etc.) podem ser consideradas para incluir essa proteína de qualquer estirpe. Esta terá tipicamente identidade de sequência para 2996 de 90% ou mais (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) . Onde a composição inclui um 20 determinado antigénio de proteína (por exemplo 741 ou 287), a composição pode incluir esse antigénio em mais de uma forma variante, por exemplo, a mesma proteína, mas de mais do que uma estirpe. Estas proteínas podem ser incluídas em tandem ou proteínas separadas.

Quando as proteínas híbridas são utilizadas, os antigénios individuais dentro da híbrida (isto é, fracções -X- individuais) podem ser de uma ou mais estirpes. Onde n=2, por exemplo, X2 pode ser da mesma estirpe do que X3 ou de uma estirpe diferente. Onde n=3, as estirpes podem ser (i) Xi=X2=X3 (ii) Xi=X2^X3 (iii) Xi#X2=X3 (iv) Xi#X2#X3 ou (v) Xi=X3^X2, etc.

As linhagens hipervirulentas e respostas de anticorpos bactericidas.

De modo geral, as composições da presente invenção têm capacidade de induzir respostas de anticorpo bactericida sérico. Estas respostas são convenientemente medidas em ratinhos e são um indicador modelo de eficácia da vacina [por exemplo, vide nora de rodapé 14 da referência 13]. A actividade bactericida sérica (SBA) mede a morte bacteriana mediada por complemento e pode ser ensaiada utilizando um complemento humano ou de um coelho bebé. Os modelos da WHO requerem uma vacina para induzir, pelo menos, um aumento de 4 vezes do SBA em mais de 90% dos receptores.

Mais que proporcionar uma protecção limitada, as composições da presente invenção podem induzir respostas de anticorpos bactericidas contra mais do que uma linhagem hipervirulenta de serogrupo B. Em particular, estas composições podem induzir a respostas bactericidas contra dois ou três das seguintes linhagens hipervirulentas: (i) 21 grupo A4; (ii) complexo ET5; e (iii) linhagem 3. Estas podem, adicionalmente, induzir respostas de anticorpos bactericidas contra uma ou mais linhagens hipervirulentas subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 ou complexo ET-37 e contra outras linhagens, por exemplo, linhagens hiperinvasivas.

Isto não quer obrigatoriamente dizer que a composição pode induzir anticorpos bactericidas contra cada e todas as estirpes do serogrupo B meningocócico dentro destas linhagens hipervirulentas, por exemplo, ainda, para qualquer grupo determinado de quatro ou mais estirpes do serogrupo B meningocócico dentro de uma linhagem hipervirulenta particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra, pelo menos, 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) do grupo. Os grupos preferidos de estirpes irão incluir estirpes isoladas em, pelo menos, quatro dos seguintes países: RU, AU, CA, NO, IT, EUA, NZ, NL, BR, e CU. O soro tem preferencialmente um título bactericida de, pelo menos, 1024 (por exemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou mais, preferencialmente, pelo menos, 214), isto é matar, pelo menos, 50% das bactérias teste de uma determinada estirpe quando diluídas 1/1024, tal como descrito na referência 13.

As composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes estirpes do serogrupo B meningocócico. (i) do grupo A4, estirpe 961-5945 (B: 2b: Pl. 21, 16) e/ou estirpe G2136 (B:-); (ii) do complexo ET-5, estirpe MC58 (B: 15: Pl. 7, 16b) e/ou estirpe 44/76 (B: 15: Pl. 7, 16); (iii) da linhagem 3, estirpe 394/98 (B: 4: Pl. 4) e/ou estirpe BZ198 (B: NT: -) . As composições mais 22 preferidas podem induzir respostas bactericidas contra estirpes 961-5945, 44/76 e 394/98.

Estirpes 961-5945 e G2136 são ambas estirpes de referência da Neisseria MLST [ids 638 e 1002 em ref. 22], Estirpe MC58 encontra-se amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a estirpe sequenciada na referência 6. Estirpe 44/76 tem sido amplamente utilizada e caracterizada (por exemplo, ref. 23) e é uma das estirpes de referência da Neisseria MLST [id 237 em ref. 22; fila 32 do Quadro 2 na ref. 1]. Estirpe 394/98 foi originalmente isolada na Nova Zelândia em 1998, e foram publicados diversos estudos utilizando esta estirpe (por exemplo, refs. 24 e 25). Estirpe BZ198 é outra estirpe de referência MLST [id 409 em ref. 22; fila 41 do Quadro 2 em ref. 1]. A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra o serogrupo W135 estirpe LNP17592 (W135: 2a: Pl. 5,2), do complexo ET-37. Esta é uma estirpe Haji isolada na França em 2000.

Hospedeiro Heterólogo

Enquanto a expressão das proteínas da presente invenção podem ter lugar na Neisseria, a presente invenção utiliza preferencialmente um hospedeiro heterólogo. O hospedeiro heterólogo pode ser procariota (por exemplo, uma bactéria) ou eucariota. Este é preferencialmente E. coli, mas existem outros hospedeiros adequados e que incluem Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por exemplo, M. tuberculosis), levedura, etc.

Deste modo, a presente invenção apresenta uma composição, a qual, após administração a um sujeito, tem 23 capacidade para induzir uma resposta do anticorpo nesse mesmo sujeito, em que a resposta do anticorpo é bactericida contra duas ou mais (por exemplo, 2 ou 3) linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 do serogrupo B N. meningitidis, e em que os imunogénios na composição que aumentam a resposta do anticorpo são obtidos por meio de expressão recombinante num hospedeiro não de Neisseria. Deste modo, os imunogénios nas composições da presente invenção são preferencialmente imunogénios recombinantes. As composições que não incluem preparações OMV podem, assim, ser preferidas.

Composições e medicamentos imunogénicos

As composições da presente invenção são imunogénicas e são, mais preferencialmente, composições de vacinas. As vacinas, de acordo com a presente invenção, podem ser ou profiláticas (isto é, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a infecção), mas serão tipicamente profiláticas. 0 pH da composição situa-se preferencialmente entre 6 e 8, preferencialmente aproximadamente 7. 0 pH estável pode ser mantido por meio da utilização de um tampão. Quando a composição inclui um sal de hidróxido de alumínio, é preferível utilizar um tampão de histidina [26] . A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogénios. As composições da presente invenção podem ser isotónicas relativamente ao ser humano.

As composições podem ser representadas em frascos, ou podem ser apresentadas em seringas já carregadas. As seringas podem ser facultadas com ou sem agulhas. Uma seringa inclui uma dose única da composição, enquanto o 24 frasco pode incluir uma dose única ou múltipla. As composições injectáveis serão normalmente soluções liquidas ou suspensões. Alternativamente, estas podem ser apresentadas em forma sólida (por exemplo, liofilizadas) para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção.

As composições da presente invenção podem ser embaladas em forma de dose unitária ou em forma de dose múltipla. Para formas de dose múltipla, os fracos são o meio preferido comparativamente às seringas pré-carregadas. Os volumes de dosagem eficaz podem ser, por rotina, estabelecidos, sendo que uma dose típica de um ser humano da composição para injecção tem um volume de 0,5ml.

Quando se pretende que a composição da presente invenção seja preparada extemporaneamente antes da utilização (por exemplo, quando um componente é apresentado sob forma liofilizada) e é apresentada como um kit, o kit pode incluir dois frascos, ou pode incluir uma seringa previamente carregada e um frasco, sendo o conteúdo da seringa utilizado para reactivar o conteúdo do frasco antes da injecção. A presente invenção apresenta igualmente uma composição da invenção para utilização como um medicamento. 0 medicamento é preferencialmente capaz de suscitar uma resposta imune num mamífero (isto é, é uma composição imunogénica) e é preferível uma vacina. A presente invenção apresenta igualmente a utilização da invenção na produção de um medicamento para suscitar uma resposta imune num mamífero. 0 medicamento é preferencialmente uma vacina. 25 A presente invenção apresenta ainda um método para suscitar uma resposta imune num mamífero, incluindo a fase de administração de uma quantidade eficaz de uma composição da invenção. A resposta imune é preferencialmente protectora e envolve preferencialmente anticorpos. 0 método pode suscitar uma resposta de reforço. 0 mamífero é preferencialmente um ser humano. Quando a vacina é para uso profilático, o ser humano é preferencialmente uma criança (por exemplo, bebés e crianças); quando a vacino á para uso terapêutico, o ser humano é preferencialmente um adulto. Uma vacina destinada para crianças pode igualmente ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade, etc.

Estas utilizações e métodos são preferencialmente para a prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por uma Neisseria (por exemplo, meningite, septicemia, bacteremia, gonorreia, etc.). É preferida a prevenção e/ou tratamento da bactéria ou meningite meningocócica.

Uma forma para testar a eficácia do tratamento terapêutico envolve monitorização da infecção com Neisseria após administração da composição da invenção. Uma forma para testar a eficácia do tratamento profilático envolve monitorização da resposta imune contra os cinco antigénios básicos após administração da composição. A imunogenicidade de composições da presente invenção pode ser determinada ao se administrarem as mesmas para testar sujeitos (por exemplo, crianças com 12-16 meses de idade ou modelos animais [27] e depois determinar os parâmetros modelo incluindo anticorpos séricos bactericidas (SBA) e 26 titulações ELISA (GMT) da IgG anti-cápsula de alta avidez e total. Estas respostas imunes irão normalmente ser determinadas em cerca de 4 semanas após administração da composição e comparadas com valores determinados antes da administração da composição. É preferido um aumento da ASBA de, pelo menos, 4 ou 8 vezes. Quando se administra mais do que uma dose da composição, pode determinar-se mais do que uma pós-administração.

As composições preferidas da presente invenção podem oferecer uma titulação de anticorpo, num doente, superior aos critérios para seroprotecção para cada componente antigénico para uma percentagem aceitável de sujeitos humanos. São bem conhecidos os antigénios com uma titulação de anticorpo associada, sobre a qual se considera um hospedeiro como seroconvertido relativamente ao antigénio e estas titulações são publicadas pelas organizações tal como a WHO. Preferencialmente, mais do que 80% de uma amostra estatisticamente significativa de sujeitos é seroconvertida, mais preferencialmente mais do que 90%, ainda mais preferencialmente mais do que 93% e ainda mais preferencialmente 96-100%.

As composições da presente invenção irão, geralmente, ser administradas directamente a um doente. A entrega directa pode ser conseguida por injecção parentérica (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular ou para o espaço intersticial de um tecido) ou por via rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração por via da mucosa. É preferida a administração intramuscular na coxa ou antebraço. A injecção pode ser aplicada através de uma agulha (por exemplo, uma agulha 27 hipodérmica), mas pode ser utilizada, alternativamente, uma injecção sem agulha. Uma dose tipica intramuscular é 0,5 ml. A invenção pode ser utilizada para estimular imunidade sistémica e/ou mucosal. O tratamento por dosagem poderá ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. As doses múltiplas podem ser utilizadas num programa de imunização primária e/ou programa de imunização de reforço. Um programa de dose primária pode ser seguida de um programa de dose de reforço. O horário adequado entre as doses iniciais (por exemplo, entre 4-16 semanas) e entre doses iniciais e de reforço podem ser determinadas por meio de rotina.

As infecções por Neisseria afectam várias áreas do corpo e, por isso, as composições da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injectáveis, ou como soluções líquidas ou suspensões. As formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção podem igualmente ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada). A composição pode ser preparada para administração tópica, por exemplo, como uma pomada, creme ou pó. A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, como um comprimido ou cápsula, ou como um xarope (opcionalmente com aroma). A composição pode ser preparadas para administração pulmonar, por exemplo, como uma inalador, utilizando um pó fino ou um pulverizador. A composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, 28 pulverizador, gotas, gel ou pó [por exemplo, refs 28 e 29]. Foi registado sucesso com a administração aural de sacarideos pneumocócicos [30, 31], polipeptideos

pneumocócicos [32], sacarideos Hib [33], sacarideos MenC

[34] , e misturas de Hib e conjugados de sacarideos MenC

[35] .

As composições imunogénicas utilizadas como vacinas incluem uma quantidade imunologicamente eficaz de antigénio(s), assim como outros componentes, se necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" entende-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, seja em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz em termos de tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), da capacidade do sistema imunitário do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de protecção desejada, da formulação da vacina, da avaliação do médico responsável relativamente à situação clínica e outros factores relevantes. Espera-se que a quantidade caia num intervalo bastante amplo que possa ser determinado por meio de experiências de rotina, e uma quantidade típica de cada antigénio sacarídeo meningocócico por dose situa-se entre 1 pg e 20pg, por exemplo, aproximadamente 1 pg, aproximadamente 2,5pg, aproximadamente 4pg, aproximadamente 5pg, ou aproximadamente lOpg (expressa como sacarídeo).

Outros componentes não antigénicos da composição A composição da presente invenção irá tipicamente, para além dos componentes acima mencionados, incluir um ou mais 29 "veículos farmaceuticamente aceitáveis", os quais incluem qualquer veículo que por si só não induz à produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que se encontra a receber a composição. Os veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sucrose [36], trealose [37], lactose e agregados lípidos (tal como gotículas de óleo ou lipossomas). Estes veículos são bem conhecidos dos especialistas na técnica. As vacinas podem igualmente conter diluentes, tal como água, solução salina, glicerol, etc. Para além disso, podem também encontrar-se presentes substâncias auxiliares, tal como agentes humectantes ou emulsionantes, substâncias tampão do pH e semelhantes. A solução salina estéril livre de pirogénicos e fisiológica tamponada com fosfato é um veículo típico. Uma discussão exaustiva de excipientes farmaceuticamente aceitáveis encontra-se disponível na referência 38.

As composições da presente invenção podem incluir um antimicrobiana, principalmente se embalado num formato de dose múltipla.

As composições da presente invenção podem incluir detergente, por exemplo, um Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Os detergentes encontram-se normalmente presentes a níveis baixos, por exemplo <0,01%.

As composições da presente invenção podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para se obter tonicidade. Uma concentração de 10±2mg/ml NaCl é típica. 30

As composiçoes da presente invenção irao, de modo geral, incluir um tampão. Um tampão de fosfato é típico.

As composições da presente invenção podem incluir um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sucrose ou trehalose), por exemplo em aproximadamente 15-30mg/ml (por exemplo, 25 mg/ml), particularmente se se pretender liofilizar as mesmas ou se estas incluírem material que tenha sido reconstituído a partir de material liofilizado. O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado para aproximadamente 6,1 antes da liofilização.

As vacinas da presente invenção podem ser administradas em conjunto com outros agentes imuno-regulatórios. Em particular, as composições irão normalmente incluir um adjuvante. Os adjuvantes, os quais podem ser utilizados nas composições da presente invenção, incluem, mas não se limitam a:

Composições que contêm minerais

As composições que contêm minerais adequadas para utilização como adjuvantes na presente invenção incluem sais, tal como sais de alumínio e sais de cálcio. A presente invenção inclui sais minerais, tal como hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por exemplo, vide capítulos 8 e 9 da ref. 39], ou misturas de compostos minerais diferentes, em que os compostos assumem qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), e preferindo-se a adsorção. As composições que incluem minerais podem igualmente ser formuladas como uma partícula de sal de metal [40]. 31 São particularmente preferidos fosfatos de alumínio, principalmente em composições que incluem um antigénio do H. influenzae sacarídeo e um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com proporção molar de PO4/AI entre 0,84 e 0,92, incluída a 0,6mg Al3+/ml A adsorção com uma dose baixa de fosfato de alumínio pode ser utilizada, por exemplo, entre 50 e 100 pg Al3+ por conjugado por dose. Quando existe mais do que um conjugado numa composição, nem todos os conjugados precisam ser adsorvidos. B. Emuslões oleosas

As composições de emulsão oleosa adequadas para utilização como adjuvantes na presente invenção incluem emulsões de água-escaleno, tal como MF5 9 [Capítulo 10 de ref. 39; vide igualmente ref. 41] (5% escaleno, 0,5% Tween 80, e 0,5% Span 85, formuladas em partículas de submicrones utilizando uma microfluidificador). 0 adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA) podem igualmente ser utilizados. C. Formulações de Saponinas (capítulo 22 de ref. 39] C. Formulações Saponinas (capítulo 22 de ref. 39]

As formulações saponinas podem igualmente ser utilizadas como adjuvantes na presente invenção. As saponinas são um grupo heterólogo de glicosidos esteróis e glicosidos triterpenóides que se encontram nas cascas, folhas, troncos, raízes e ainda em flores de uma série ampla de espécies vegetais. As saponinas da casca das árvores Quillaia saponaria Molina têm sido grandemente estudadas como adjuvantes. A saponina pode obter-se comercialmente através da Smilax ornata (sarsaprilla), 32

Gypsophilla paniculata (véu-de-noiva e Saponaria officianalis (soap root) . As formulações adjuvantes da saponina incluem formulações purificadas, tal como QS21, assim como formulações lípidas, tal como ISCOMs. QS21 é comercializado como Stimulon™.

As composições saponinas têm sido purificadas utilizando HPLC e RP-HPLC. Foram identificadas fracções purificadas especificas que utilizam estas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C.

Preferencialmente a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é divulgado na ref. 42. As formulações saponinas podem igualmente incluir um esterol, tal como colesterol [43] .

As combinações de saponinas e colesteróis podem ser utilizadas para formar uma única partícula denominada complexos imuno-estimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 da ref. 39] . ISCOMs também incluem tipicamente um fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser utilizada em ISCOMs. Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA & QHC. Os ISCOMs são ainda descritos em refs. 43-45. Opcionalmente, os ISCOMs podem ser desprovidos de detergente adicional [46].

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes com base na saponina pode ser encontrada nas refs. 47 & 48. D. Virossomas e partículas tipo-vírus

Os virossomas e as partículas tipo-vírus (VLPs) podem ser igualmente utilizados como adjuvantes na presente invenção. Estas estruturas contêm normalmente uma ou mais proteínas de um vírus opcionalmente combinado ou formulado 33 com um fosfolípido. Estes são normalmente não-patogénicos, não-replicáveis e normalmente não contêm qualquer genoma virai nativo. As proteínas virais podem ser recombinantemente produzidas ou isoladas de todos os vírus. Estas proteínas virais adequadas para utilização em virossomas ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus influenza (tal como HA ou NA), vírus da Hepatite B (tal núcleo ou proteínas do capsídeo), vírus da Hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavírus, vírus da febre aftosa, Retrovírus, vírus de Norwalk, vírus do papiloma humano, Hiv, ARN-fago, Οβ-fago (tal como proteínas de revestimento), GA-fago, fr-fago, AP205 fago, e Ty (tal como retrotransposão proteína Ty pl) . VLPs são ainda discutidas nas refs. 49-54. Os virossomas são ainda discutidos, por exemplo, na ref. 55. E. Derivados bacterianos ou microbianos

Os adjuvantes adequados para utilização na presente invenção incluem derivados bacterianos e microbianos tal como derivados não tóxicos de lipo-polissacarídeos de enterobactérias (LPS), de derivados de lípidos, oligonucleótidos imuno-estimulantes e toxinas ADP-ribosilação e derivados desintoxicados dos mesmos.

Os derivados não tóxicos de LPS incluem monofosforilo lipídico A (MPL) e MPL 3-0-desacilado 3dMPL é uma mistura de 3 de-O-acilado monofosforil lipídico A com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma de "partícula pequena" preferida de 3 De-O-acilado monofosforil lipídico A é divulgada na ref. 56. Estas "partículas pequenas" de 3dMPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadas por meio de filtro através de uma membrana de 0,22pm [56]. 34

Outros derivados LPs não-tóxicos incluem miméticos de monosfosforilo lipidico A, tal como derivados de aminoalquilo glucosaminida fosfato, por exemplo, RC-529 [57, 58] .

Os derivados do lipido A incluem derivados de lipido A a partir da Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, nas refs. 59 & 60.

Os oligonucleótidos imuno-estimulantes adequados para utilização como adjuvantes na presente invenção incluem sequências nucleótidas que contêm um motivo CpG (uma sequência dinucleótida que contém uma citosina não metilada ligada por uma ligação de fosfato a uma guanosina). Mostrou-se igualmente que os ARNs de cadeia dupla e oligonucleótidos que contêm sequências palindrómicas ou poli(dG) são imuno-estimulantes.

Os CpG's podem incluir modificações/análogos nucleótidos tal como modificações de fosforotioato e podem ser de cadeia simples ou dupla. As referências 61, 62 e 63 apresentam substituições análogas possíveis, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-deoxi-7-deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleótidos CpG é ainda discutido em refs. 64-69. A sequência CpG pode ser direccionada para TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [70] . A sequência CpG pode ser especifica para indução de uma resposta imune Thl, tal como uma CpG-A ODN, ou pode ser mais especifica para a indução de uma resposta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidas nas refs. 71-73. Preferencialmente, a CpG é uma CpG-A ODN. 35

Preferencialmente, o oligonucleótido CpG é construído de modo a que o terminal 5' fique acessível para efeitos de reconhecimento do receptor. Opcionalmente, duas sequências oligonucleótidas CpG podem ser ligadas nos seus terminas 3 para formar "imunómeros". Vide, por exemplo, refs. 70 & 74-76.

As toxinas ADP-ribosilação bacterianas e derivados desintoxicantes dos mesmos podem ser utilizados como adjuvantes na presente invenção. Preferencialmente, a proteína é derivada de E.coli (enterotóxina termicamente lábil de E.coli "LT"), cólera ("CT"), ou pertussis ("PT"). A utilização de toxinas ADP-ribosilação desintoxicantes como adjuvantes das mucosas é descrita na ref. 77 e como adjuvantes parenterais na ref. 78. A toxina ou toxóide encontra-se, preferencialmente, na forma de uma holotoxina incluindo tanto a subunidade A como a subunidade A. Preferencialmente, a subunidade A contém uma mutação desintoxicante; preferencialmente a subunidade B não é mutada. Preferencialmente, o adjuvante é um mutante LT desintoxicante tal como LT-K63, LT-R72, e LT-G192 A utilização de toxinas ADP-ribosilação e derivados desintoxicantes das mesmas , particularmente LT -K63 e LT- R72, como adjuvantes podem ser encontradas nas refs. 79-86. A referência numérica para substituições de aminoácidos é preferencialmente baseada nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas ADP-ribosilação apresentados na ref. 87, especificamente presentemente incorporada na íntegra como referência. F. Imuno-moduladores humanos 36

Os imuno-moduladores humanos adequados para utilização como adjuvantes, na presente invenção, incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [88], etc.) [89], interferões (por exemplo, interferão-y), factor estimulante de colónia de macrofagos e factor necrosante tumoral G. Bio-adesivos e Muco-adesivos

As formulações bio-adesivas e muco-adesivas podem igualmente ser utilizadas como adjuvantes na presente invenção. Os bio-adesivos e muco-adesivos podem igualmente ser utilizados como adjuvantes na presente invenção. Os bio-adesivos adequados incluem micro-esferas de ácido hialurónico esterificado [90] ou muco-adesivos, tal como, derivados de reticulados de ácido poli (acrílico), álcool polivinílico, pirrolidona polivinílica, polissacarídeos e carboximetilcelulose. O quitosano e derivados do mesmo podem igualmente ser utilizados como adjuvantes na presente invenção [91]. H. Micropartícuias

As micropartículas podem igualmente ser utilizadas como adjuvantes na presente invenção. As micro-partículas podem igualmente ser utilizadas como adjuvantes na presente invenção. São preferidas as micro-partículas (isto é, uma particular de -lOOnrn a ~150pm em diâmetro, mais preferencialmente ~200nm a ~30pm em diâmetro, e mais preferencialmente ~500nm a ~10pm em diâmetro) formadas a partir de materiais biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidroxi), um ácido poli- hidroxibutírico, um poliortoéster, um poli-anidrido, uma poli-caprolactona, etc.), com poli(lactido-co-glicólido), 37 opcionalmente tratadas para conterem uma superfície negativamente carregada (por exemplo, com SDS) ou uma superfície positivamente carregada (por exemplo, com um detergente catiónico, tal como CTAB). I. Lipossomas (Capítulos 13 & 14 da ref. 39)

Exemplos de formulações de lipossomas adequados para utilização como adjuvantes são descritos nas refs. 92-94. j. Formulações de éter de polioxietileno e de éster de polioxietileno

Os adjuvantes adequados para utilização na presente invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [95] Estas formulações incluem ainda surfatantes de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol [96] assim como éteres alquílicos de polioxietileno ou surfatantes de éster em combinação com, pelo menos, um surfatante não iónico adicional, tal como um octoxinol [97] . Os éteres de polioxietileno preferidos são seleccionados a partir do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-lauril (lauret 9), éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxiteileno-8-esteoril, éter de polioxietileno -4-lauril, éter de polioxietileno-35-lauril e éter de polioxietileno-23-lauril. K. Polifosfazeno (PCPP)

As formulações PCPP são descritas, por exemplo, nas refs. 98 e 99. L. Peptídeos de muramilo

Exemplos de peptídeos de muramilo adequados para utilização como adjuvantes na presente invenção incluem N-acetil-muramil-L- treonil-D-isoglutamina (tr-MDP), N- 38 acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE) . M. Compostos de imidazoquinolona

Exemplos de compostos de imidazoquinolona adequados para utilização como adjuvantes na presente invenção incluem Imiquamod e seus homólogos (por exemplo, "Resiquimod 3M"), descritos ainda nas refs. 100 e 101. A composição da presente invenção pode igualmente incluir combinações de aspectos de um ou mais dos adjuvantes acima identificados. Por exemplo, as composições adjuvantes que se seguem podem ser utilizadas na presente invenção: (1) uma saponina e uma emulsão óleo em água [102]; (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) [103]; (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL)+ um colesterol; (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) [104]; (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo em água [105]; (6) SAF, contendo 10% esqualano, 0,4% Tween 80™, 5% do polímero bloqueador de plurónico L121, e tr-MDP, microfluidizado numa emulsão de submicrão ou agitada com vórtice para gerar uma emulsão maior do tamanho da partícula. (7) sistema de adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) contendo 2% esqualano, 0,2% Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana a partir do grupo que consiste em monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e estrutura de parede celular (CWS), preferencialmente MPL + 39 CWS (Detox™); e (8) um ou mais sais minerais (tal como um sal de alumínio) + um derivado não tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Outras substâncias que actuam como agentes imuno-estimulantes são apresentadas no capítulo 7 da ref. 39. A utilização de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio é particularmente preferida e os antigénios são normalmente adsorvidos para estes sais. 0 hidróxido de alumínio é preferencialmente evitado como um adjuvante se a composição incluir um antigénio Hib. Quando um fosfato de alumínio é utilizado e se pretende que o mesmo não adsorva um antigénio para o adjuvante, este é favorecido ao se incluir iões livres de fosfato na solução (por exemplo, pela utilização de um tampão de fosfato) A prevenção de adsorção pode ser igualmente conseguida ao se seleccionar o pH correcto durante a mistura de antigénio/adjuvante, um adjuvante com um ponto apropriado de carga zero e uma ordem apropriada para a mistura de antigénios diferentes numa composição [106]. O fosfato de cálcio é outro adjuvante preferido.

Outros antigénios

As composições da presente invenção contêm cinco antigénios básicos de proteínas meningocócicas. Estas composições podem igualmente incluir outros antigénios, embora possam conter antigénios de proteínas não meningocócicas para além dos cinco antigénios básicos. Outros antigénios para inclusão podem ser, por exemplo:

Um antigénio sacarídeo da Haemophilus influenzae B. 40

Um antigénio sacarídeo do serogrupo A C, W135 e/ou Y da N. meningitidis, tal como o oligossacarídeo apresentado na ref. 107 do serogrupo C ou os oligossacarídeos da ref. 108.

Um antigénio sacarídeo de Streptococcus pneumoniae [por exemplo, 155, 156 157],

Um antigénio do vírus da Hepatite A, tal como um vírus inactivado [por exemplo, 109, 110] .

Um antigénio do vírus da Hepatite B, tal como a antigénios de superfície e/ou antigénios do núcleo [por exemplo, 110, 111].

Um antigénio da difteria, tal como um toxóide da difteria [por exemplo, capítulo 3 da ref. 112] por exemplo o mutante CRM197 [por exemplo, 113] .

Um antigénio do tétano, tal como um toxóide do tétano [por exemplo, capítulo 4 de ref. 112].

Um antigénio de Bordetella pertussis, tal como holotóxina pertussis (PT) e filamentos de hemaglutinina (FHA) da B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [por exemplo, refs. 114 & 115]. Pode ser utilizado um antigénio celular pertussis.

Uma preparação de uma vesícula de membrana exterior (OMV) a partir do serogrupo B N. meningitidis, tal como as divulgadas nas refs. 4, 116, 117, 118 etc.

Antigénio(s) polio [por exemplo, 119, 120] tal como OPV ou, preferencialmente, IPV. A composição pode igualmente incluir um ou mais destes outros antigénios. Os antigénios encontrar-se-ão 41 tipicamente presentes a uma concentração de, pelo menos, Ιμ/ml cada. De modo geral, a concentração de cada determinado antigénio será suficiente para suscitar uma resposta imune contra esse antigénio. É preferível que não se remova a eficácia protectora dos antigénios sacarídeos individuais por combinação dos mesmos. No entanto, a imunogeneicidade (por exemplo, titulação de ELISA) pode ser reduzida.

Quando se inclui um antigénio da difteria na composição, é preferível incluir também um antigénio do tétano e antigénios da pertussis. Semelhantemente, quando se inclui um antigénio do tétano na composição, é preferível incluir também um antigénio da difteria e antigénios da pertussis. Semelhantemente, quando se inclui um antigénio da pertussis na composição, é preferível incluir também antigénios da difteria e do tétano. Estas combinações DTP podem ser utilizadas para reconstituir conjugados liofilizados.

Quando se utiliza um ou antigénio sacarídeo ou de hidrato de carbono, é preferível conjugar o mesmo para uma proteína veículo de modo a se intensificar a imunogeneicidade {vide abaixo).

Os antigénios de proteínas tóxicas podem ser desintoxicados quando necessário (por exemplo, desintoxicação de toxina da pertussis por meio químico e/ou genético [115])

Como alternativa à utilização de antigénios de proteínas na composição, pode ser utilizado o ácido nucleico que codifica o antigénio [e. g. refs. 121 to 129]. Os componentes da proteína das composições podem, deste 42 modo, ser substituídos por ácido nucleico (preferencialmente ADN, por exemplo, na forma de plasmídeo) que codifica a proteína. Semelhantemente, as composições da presente invenção podem incluir proteínas que simulam antigénios sacarídeos, por exemplo, mimotopos [130] ou anticorpos anti-idiótipos. Estes podem substituir componentes sacarídeos individuais ou podem funcionar como um suplemento dos mesmos. Como um exemplo, a vacina pode incluir um simulador peptídico do MenC [131] ou o polissacarídeo capsular MenA [132] no lugar do próprio sacarídeo.

As composições particularmente preferidas da presente invenção incluem um, dois ou três de: (a) antigénios sacarídeos dos serogrupos meningocócicos Y, W135, C e (opcionalmente) A; (b) um antigénio sacarídeo da Haemophilus influenzae do tipo B; e/ou (c) um antigénio da Streptococcus pneumoniae. É particularmente preferida uma composição que inclui antigénios do serogrupo B e um conjugado Hib.

Serogrupos meningocócicos Y. W135, C e (opcionalmente)

A

Tal como acima mencionado, as vacinas polissacarídeas contra serogrupos A, C, W135 & Y são há já muito tempo conhecidas. Estas vacinas (MENCEVAX ACWY™ e MENOMUNE™) são baseadas em polissacarídeos capsulares do organismo e, embora sejam eficazes em adolescentes e adultos, oferecem uma resposta imune fraca e uma duração de protecção pequena e não podem ser utilizadas em crianças.

Por contraste aos antigénios polissacarídeos não conjugados nestas vacinas, as vacinas do serogrupo C 43 recentemente aprovadas (Menjugate™ [133, 107], Meningitec™ e NeisVac-C™) incluem sacarídeos conjugados. Menjugate™ e Meningitec™ possuem antigénios oligossacarideos conjugados para um veiculo CRMi97, enquanto a NeisVac-C™ utiliza o polissacarideo (de-O-acetilado) completo para um veiculo toxóide do tétano.

As composições da presente invenção incluem preferencialmente antigénios sacarídeos capsulares de um ou mais serogrupos meningocócicos Y, W135, C e (opcionalmente) A, em que os antigénios são conjugados para proteína (s) veículo e/ou são oligossacarideos.

Uma quantidade típica de cada antigénio sacarídeo meningocócico por dose é de entre lpg e 20pg, por exemplo aproximadamente lpg, aproximadamente 2,5pg, aproximadamente 4pg, aproximadamente 5pg, ou aproximadamente 10pg (expresso como sacarideo).

Quando uma mistura inclui sacarídeos capsulares de ambos os serogrupos A e C, a proporção (p/p) do sacarídeo MenA: O sacarídeo MenC pode ser maior do que 1 (por exemplo, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 10: lou mais) Quando uma mistura inclui sacarídeos capsulares do serogrupo Y e um ou ambos os serogrupos C e W135, a proporção (p/p) do sacarídeo MenY: O sacarídeo MenWl35 pode ser maior do que 1 (por exemplo, 2: 1, 3: 1, 4: 1, 5: 1, 10: 1 ou mais) e/ou que a proporção (p/p) do sacarídeo MenY: o sacarídeo MenC pode ser menor do que 1 (por exemplo, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5, ou menor ainda). As proporções preferidas (p/p) para i; 1 2; 8 2; 4 sacarídeos dos serogrupos A: C: W135: Y são: 1 1: 1: 2; 2: 1: 1: 1; 4: 2: 1: 1; 8: 4: 2: 1; 4 4: 1: 2; 4: 2: 2: 1; 2: 2: 1: 1; 4: 4: 2: 1; 2 44 4: 1: 2; e 2: 2: 2: 1. As proporções preferidas (p/p) para sacarídeos dos serogrupos C: W135: Y são: 1: 1: 1; 1: 1: 2; 1: 1: 1; 2: 1: 1; 4: 2: 1; 2: 1: 2; 4: 1: 2; 2: 2: 1; e 2: 1: 1) É preferível utilizar uma massa substancialmente igual de cada sacarídeo.

Os sacarídeos capsulares serão normalmente utilizados na forma de oligossacarídeos. Estes são convenientemente formados por fragmentação de polissacarídeos capsulares purificados (por exemplo, por hidrólise), a qual será normalmente seguida pelo processo de purificação dos fragmentos do tamanho desejado. A fragmentação de polissacarídeos é preferencialmente realizada de modo a se obter um grau médio final de polimerização (DP) no oligossacarídeo de menos do que 30 (por exemplo, entre 10 e 20, preferencialmente cerca de 10 para o serogrupo A; entre 15 e 25 para os serogrupos W135 e Y, preferencialmente cerca de 15-20; entre 12 e 22 para o serogrupo C; etc.). O DP pode convenientemente ser medido por cromatografia de permuta iónica ou por ensaios colorimétricos [134].

Se for executada a hidrólise, o hidrolisado será normalmente dimensionado de modo a remover oligossacarídeos de curta dimensão. Este processo pode ser obtido de várias formas, tal como ultra-filtração seguida de cromatografia de permuta iónica. Os oligossacarídeos com um grau de polimerização de menos do que ou igual a aproximadamente 6 são preferencialmente removidos para o serogrupo A, e os oligossacarídeos com menos do que aproximadamente 4 são preferencialmente removidos para os serogrupos W135 e Y. 45

Os antigénios sacarídeos MenC são divulgados na referência 133, e utilizados em Menjugate™. 0 antigénio sacarídeo pode ser quimicamente modificado. Isto é particularmente útil para reduzir a hidrólise para o serogrupo A [136; vide abaixo]. Pode ser efectuada a de-O-acetilação de sacarídeos meningocócicos. Para os oligossacarídeos, a modificação pode ocorrer antes ou depois da despolimerização.

Quando uma composição da presente invenção inclui um antigénio sacarídeo MenA, o antigénio é, preferencialmente, um sacarídeo modificado no qual um ou mais dos grupos hidroxilo, no sacarídeo nativo, foi/foram substituído(s) por um grupo de bloqueio [136]. Esta modificação melhora a resistência à hidrólise e significa que o antigénio do serogrupo A pode ser armazenado e utilizado numa formulação liquida, mais do que necessita de liofilização. 0 número de unidades monossacarídeas com grupos de bloqueio pode variar. Por exemplo, todas ou substancialmente todas as unidades monossacarídeas podem ter grupos de bloqueio. Alternativamente, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das unidades monossacarídeas podem ter grupos de bloqueio. Pelo menos, 1, 2, 3, QD LO 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, «sP \—1 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30unidades monossacarídeas podem ter grupos de bloqueio.

Semelhantemente, o número de grupos de bloqueio numa unidade monossacaridea pode variar. Por exemplo, o número de grupos de bloqueio numa unidade monossacaridea pode ser 1 ou 2. O grupo de bloqueio encontrar-se-á normalmente na posição 4 e/ou 46

Posição e das unidades monossacarideas. A unidade monossacaridea terminal pode ou não ter um grupo de bloqueio em vez do seu hidroxilo nativo. É preferível reter um grupo hidroxilo anomérico numa unidade monossacaridea terminal de modo a proporcionar o manuseamento de outras reacções (por exemplo, conjugação). Os grupos hidroxilo anoméricos podem ser convertidos para grupos amino (-NH2 ou -NH-E, em que E é um grupo protector de azoto) por aminação reduzida (utilizando, por exemplo, NaBH3CN/NH4Cl), podendo depois ser regenerada após outros grupos hidroxilo terem sido convertidos em grupos de bloqueio.

Os grupos de bloqueio para substituírem grupos hidroxilo podem ser directamente acedidos por meio de reacção de derivatização do grupo hidroxilo, isto é, ao se substituir o átomo de hidrogénio do grupo hidroxilo por outro grupo. Os derivados adequados dos grupos hidroxilo que actuam como grupos de bloqueio são, por exemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, ésteres, éteres (por exemplo, éteres silílicos ou ésteres alquílicos) e acetais. Alguns exemplos específicos destes grupos de bloqueio são alilo, Aloc, benzilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Outros grupos de bloqueio que não são directamente acessíveis e que substituem completamente o grupo hidroxilo incluem alquilo-C1-12, alquilo-C3_i2, arilo-C5-i2, arilo-C5-i2 alquilo-Ci_6, NRXR2 (R1 e R2 são definidos no parágrafo seguinte), H, F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo-Ci-e), CN, CF3, CCI3, etc. Os grupos de bloqueio preferidos são os grupos de remoção de electrões. 47

Os grupos de bloqueio preferidos são da fórmula: -O-X-Y or-OR3 em que: X é C(0), S (0) ou S02; Y é alquilo-Ci_i2, alcoxi-Ci-12, cicloalquilo-C3-i2, arilo-C5-i2 ou arilo-C5-i2 alquilo-Ci-6, sendo que cada um pode opcionalmente ser substituído por 1, 2 ou 3 grupos independentemente seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo-Ci_6), CN, CF3 ou CCI3; ou Y é NR^2; R1 e R2 são independentemente seleccionados de H, alquilo-Ci-12, cicloalquilo-C3-i2, arilo-C5-i2, arilo-C5-i2 alquilo-Ci-6,· ou R1 e R2 podem ser juntos para formar um grupo heterocíclico saturado C3_12; R3 é alquilo-Ci-i2 ou cicloalquilo-C3-i2, sendo que cada um pode opcionalmente ser substituído por 1, 2 ou 3 grupos independentemente seleccionados de F, Cl, Br, C02(alquilo-Ci_6) , CN, CF3 ou CCI3; ou R3 é arilo-C5-i2 ou arilo-C5-i2 alquilo-Ci-6, sendo que cada um pode opcionalmente ser substituído por 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, C02H, alquilo-Ci_6), CN, CF3 ou CCI3. Quando R3 é alquilo-Ci-i2 ou cicloalquilo-C3_i2, este é tipicamente substituído por 1, 2 ou 3 grupos tal como acima definido. Quando R1 e R2 são juntos para se formar um grupo heterocíclico saturado C3_12, pretende-se dizer que R1 e R2 juntos com o átomo de azoto formam um grupo heterocíclico saturado que contém qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, Cê, C7, Cg, C9, Cio, Cu,. Ci2) . 0 grupo heterocíclico pode conter 1 ou 2 heteroátomos (tais como N, 0 ou S) que não o átomo de azoto. Exemplos de grupos heterocíclicos saturados C3-i2 são pirrolidinilo piperidinilo morfolinilo piperazinilo imidazolidinilo azetidinilo e aziridinilo.

Os grupos de bloqueio -O-X-Y e -0R3 podem ser preparados para formar grupos -OH por meio de procedimentos 48

Standard de derivatização, tais como reacção do grupo hidroxilo com um haleto de acilo, haleto de alquilo, haleto de sulfonilo, etc. Assim, o átomo de oxigénio em -0-X- Y é preferencialmente o átomo de oxigénio do grupo hidroxilo, enquanto o grupo -X-Y no -O-X-Y substitui preferencialmente o grupo hidroxilo. Alternativamente, os grupos de bloqueio pode ser acedidos por meio de uma reacção de substituição, tal como uma substituição do tipo Mitsonobu. Estes e outros métodos de preparação de grupos de bloqueio a partir de grupos hidroxilo são bem conhecidos.

Mais preferencialmente, o grupo de bloqueio é -0C(0)CF3 [137], ou um grupo carbamato -00(0)^^, em que R1 e R2 são independentemente seleccionados de alquilo-Ci_6. Mais preferencialmente, R1 e R2 são ambos metilo, isto é, o grupo de bloqueio é -0C(0)NMe2. Os grupos de bloqueio carbamato possuem um efeito estabilizante na ligação glicosidica e podem ser preparados sob condições amenas.

Os sacarideos modificados MenA preferidos contêm unidades monossacarideas n, em que, pelo menos, h% das unidades monossacarideas não possuem grupos -OH em ambas as posições 3 e 4. 0 valor de h é 24 ou mais (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100) e é preferencialmente 50 ou mais. Os grupos ausentes -OH são preferencialmente grupos de bloqueio como acima definido.

Outros sacarideos modificados MenA preferidos incluem unidades monossacarideas, em que, pelo menos, s das unidades monossacarideas não possui -OH na posição 3 e não tem -OH na posição 4. O valor de s é de, pelo menos, 1, (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 49

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, O LO 60, 70, co o 90) . Os grupos ausentes -OH são preferencialmente grupos de bloqueio como acima definido.

Os sacarideos modificados MenA adequados para utilização com a presente invenção possuem a fórmula:

em que N é um número inteiro de 1 a 100 (preferencialmente um número inteiro de 15 a 25); T é da fórmula (A) ou (B):

Cada grupo z é independentemente seleccionado de OH ou um grupo de bloqueio tal como acima definido; e cada grupo Q é independentemente seleccionado de OH ou um grupo de 50 bloqueio tal como acima definido; Y é seleccionado de OH um grupo de bloqueio tal como acima definido; E é H ou um grupo protector de azoto; E em que mais do que aproximadamente 7% (por exemplo, 8%, 9%, 10% ou mais) dos grupos Q são grupos de bloqueio.

Cada um dos grupos n+2 pode ser igual ou diferente entre si. Igualmente, cada um dos grupos n+2 Q pode ser igual ou diferente entre si. Todos os grupos Z podem ser OH. Em alternativa, pelo menos 10%, 20, 30%, 40%, 50% ou 60% dos grupos Z pode ser OAc. De preferência, cerca de 70% dos grupos Z são OAc, sendo os restantes grupos Z OH ou grupos de bloqueio como anteriormente definido. Pelo menos cerca de 7% dos grupos Q são grupos de bloqueio. De preferência, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% dos grupos Q são grupos de bloqueio.

As composições preferidas da invenção podem ser guardadas durante 28 dias a 37° C e, ao fim desse período, menos de 1% da quantidade inicial total de sacarídeo MenA conjugado será conjugado sendo f 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou menor.

Os polissacarídeos meningocócicos capsulares são tipicamente preparados por um processo que compreende as fase de precipitação do polissacarídeo (por exemplo utilizando um detergente catiónico), fraccionamento etanólico, extracção fenólica a frio (para remover proteína) e ultracentrifugação (para remover LPS) [por exemplo ref. 138]. No entanto, um processo mais preferido [108] envolve a precipitação do polissacarídeo seguida de solubilização do polissacarídeo precipitado utilizando um álcool inferior. A precipitação pode ser efectuada 51 utilizando um detergente catiónico, tal como sais de tetrabutilamónio e cetiltrimetilamónio (por exemplo sais de brometo) ou brometo de hexadimetrina e sais de miristiltrimetilamónio. Brometo de cetiltrimetilamónio ('CTAB') é particularmente preferido [139]. Pode ser conseguida a solubilização do material precipitado utilizando um álcool inferior, tal como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol, 2-metil-propan-2-ol, dióis, etc. sendo o etanol particularmente adequado para a solubilização dos complexos CTAB-polissacarídeo. É adicionado, preferencialmente etanol ao polissacarídeo precipitado para produzir uma concentração final (com base no teor total de etanol e água) entre 50% e 95%.

Após a re-solubilização, o polissacarídeo pode ser tratado mais aprofundadamente para remover os contaminantes. Este passo é particularmente importante em situações em que até a mais pequena contaminação é inaceitável (por exemplo, para produção de vacinas para seres humanos). Serão tipicamente envolvidas duas ou mais fases de filtração, por exemplo filtração em profundidade, pode ser empregue a filtração através de carbono activado, filtração por tamanho e/ou ultrafiltração. Depois de filtrado para remover os contaminantes, o polissacarídeo pode ser precipitado para prosseguir o tratamento e/ou processamento. Este passo pode ser alcançado convenientemente por permuta catiónica (por exemplo por adição de sais de cálcio ou de sódio).

Em alternativa à purificação, os sacarídeos capsulares da presente invenção podem ser obtidos por meio de síntese total ou parcial, por exemplo a síntese de Hib encontra-se 52 descrita na ref. 140 e a síntese de MenA encontra-se na ref. 141.

As composições da invenção compreendem sacarídeos capsulares de pelo menos dois serogrupos de N. meningitidis. Os sacarídeos são preferencialmente preparados separadamente (incluindo qualquer fragmentação, conjugação, modificação, etc.) e depois são misturados para produzir uma composição da invenção.

Quando a composição compreende sacarídeos capsulares do serogrupo A, contudo, prefere-se que o sacarídeo do serogrupo A não seja combinado com outro (s) sacarídeo (s) até pouco antes da a utilização, a fim de minimizar a possibilidade de hidrólise. Esta operação pode ser convenientemente conseguida com o componente serogrupo A (tipicamente em conjunto com excipientes apropriados) sob forma liofilizada e o(s) outro (s) componente(s) serogrupo em forma líquida (também com os excipientes apropriados) sendo os componentes líquidos utilizados para reconstituir o componente MenA liofilizado quando pronto a utilizar. Quando é utilizado um sal de alumínio adjuvante prefere-se incluir o adjuvante num frasco contendo com a vacina líquida e liofilizar o componente Men A sem adjuvante.

Uma composição da invenção pode assim ser preparada a partir de um conjunto compreendendo: (a) sacarídeo capsular do serogrupo A de N. meningitidis sob forma liofilizada e (b) os restantes antigénios da composição em forma líquida. A invenção proporciona ainda um método de preparação de uma composição da invenção, compreendendo a mistura de um sacarídeo capsular liofilizado do serogrupo A de N. 53 meningitidis com outros antigénios, encontrando-se os referidos antigénios adicionais em forma liquida. A presente invenção apresenta igualmente um kit contendo: (a) um primeiro recipiente contendo sacarideos capsulares de dois ou mais dos serogrupos C de N. meningitidis, W135 e Y, todos em forma liofilizada e (b) um segundo recipiente contendo em forma liquida (i) uma composição que, depois de administrada a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta de anticorpos no referido indivíduo, sendo a resposta de anticorpos bactericida contra duas ou mais (por exemplo 2 ou 3) das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 do serogrupo B de N. meningitidis (ii) sacarideos capsulares de nenhum ou de um dos serogrupos C de N. meningitidis W135 e Y e opcionalmente (iii) outros antigénios (vide abaixo) que não incluem sacarideos capsulares meningocócicos, em que, a reconstituição do conteúdo dos recipientes (a) com o conteúdo do recipiente (b) proporciona uma composição da invenção.

Em cada dose, a quantidade de um antigénio sacarídeo individual oscilará geralmente entre 1-50 pg (medido por massa do sacarídeo) com preferência para cerca de 2,5 pg, 5 pg ou 10 pg de cada. Com proporções em peso de A:C:W135:Y de 1: 1: 1: 1; 1: 1: 1: 2; 2: 1: 1: 1; 4: 2: 1: 1; 8: 4: 2: i; 4: 2: 1: 2; 8: 4: 1: 2; 4: 2: 2: 1; 2: 2: 1: 1; 4: 4: 2: i; 2: 2: 1: 2; 4: 4: 1: 2; e 2: 2: 2: 1, por conseguinte a quantidade representada pelo número 1 é preferencialmente cerca de 2,5 pg, 5 pg ou 10 pg. Portanto, para uma proporção de 1:1:1:1 de composição A:C:W:Y e 10 pg por sacarídeo administra-se 40 pg de sacarídeo por dose. As 54 composições preferidas possuem cerca da seguinte quantidade em pg de sacarideo por dose: A 10 0 0 0 10 5 2,5 C 10 10 5 2, 5 5 5 2,5 W135 10 10 5 2, 5 5 5 2,5 Y 10 10 5 2, 5 5 5 2,5

As composições preferidas da invenção compreendem menos de 50 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem <40 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem <30 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem <25 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem <20 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem <10 pg de sacarideo meningocócico por dose mas idealmente as composições da invenção compreendem pelo menos 10 pg de sacarideo meningocócico por dose.

Os conjugados Menjugate™ e NeisVac™ MenC utilizam um adjuvante hidróxido, enquanto o Meningitec™ utiliza um fosfato. É possível, em composições da invenção, adsorver alguns antigénios num hidróxido de aluminio mas ter outros antigénios associados a um fosfato de aluminio. Para combinações do serogrupo tetravalente, por exemplo, são possíveis as seguintes permutações:

Serogrupo sal de alumínio (H = hidróxido; F = fosfato) A P H P H H H P P P H H H P P P H 55

c P H H P H H P H H P P H P H P P W135 P H H H P H H P H H P P P P H P Y P H H H H P H H P P H P H P P P

Para combinações do serogrupo N. meningitidis trivalente são possíveis as seguintes permutações:

Serogrupo sal de alumínio (H = hidróxido; F = fosfato) C P H H H P P P H W135 P H H P H P H P Y P H P H H H P P

Haemophilus influenzae tipo B

Sempre que a composição incluir um antigénio de Haemophilus influenzae tipo B será tipicamente um antigénio sacarídeo Hib capsular. Os antigénios sacarídeos de H. influenzae b são bem conhecidos.

Vantajosamente, o sacarídeo Hib encontra-se conjugado de modo covalente a uma proteína transportadora a fim de intensificar a sua imunogenicidade, em especial com crianças. A preparação de conjugados polissacarídeos em geral e do polissacarídeo capsular Hib em particular encontra-se bem documentada (por exemplo referências 142 a 150, etc.] A invenção pode recorrer a qualquer conjugado Hib adequado. As proteínas de suporte adequadas encontram-se descritas seguidamente e os suportes preferidos para os sacarídeos Hib são CRMi97 ('HbOC'), toxóide tetânico ('PRP-T') e o complexo da membrana exterior de N. meningitidis ('PRP-OMP'). 56 A fracção sacarídea do conjugado pode ser um polissacarídeo (por exemplo um fosfato de polirriboxilribitol integral (PRP)) mas prefere-se hidrolisar polissacarídeos de modo a formar oligossacarídeos (por exemplo MW de -1 a -5 KDa).

Um conjugado preferido compreende um oligossacarídeo Hib ligado covalentemente a CRMi97 através de um ligante ácido adipico [151, 152] . 0 toxóide tetânico é igualmente um suporte preferido. A administração do antigénio Hib resulta de preferência numa concentração de anticorpo anti-PRP de >0,15 pg/ml e mais preferencialmente >1 pg/ml.

As composições da invenção podem incluir mais do que um antigénio Hib.

Sempre que a composição inclui um antigénio sacarideo Hib prefere-se que não inclua também um adjuvante de hidróxido de alumínio. Se a composição inclui um adjuvante de fosfato de alumínio, então o antigénio Hib pode ser adsorvido no adjuvante [153] ou pode ser não-adsorvido [154] .

Os antigénios Hib podem ser liofilizados, por exemplo em conjunto com antigénios meningocócicos.

Streptococcus pneunioniae

Quando a composição inclui um antigénio S. pneumoníae será tipicamente um antigénio sacarideo capsular, que é preferencialmente conjugado com uma proteína transportadora [por exemplo refs. 155 a 157]. Prefere-se incluir sacarídeos de mais do que um serotipo de S. penumoniae. Por exemplo, são amplamente empregues misturas de 57 polissacarídeos de 23 serotipos diferentes, tal como é o caso das vacinas conjugadas com polissacarídeos com entre 5 e 11 serotipos diferentes [158] . Por exemplo, PrevNar™ [159] contém antigénios de sete serotipos (4, 6B. 9V, 9V, 18C, 19F e 23F) sendo cada sacarídeo conjugado individualmente em CRMi97 por meio de aminação redutiva, com 2 pg de cada sacarídeo por dose de 0,5 ml (4 pg de serotipo 6B) e com conjugados adsorvidos num adjuvante de fosfato de alumínio. As composições da invenção incluem de preferência pelo menos os serotipos 6B, 14, 19F e 23F. Os conjugados podem ser adsorvidos num fosfato de alumínio.

Em alternativa à utilização de antigénios sacarídeos de pneumococcus, a composição pode incluir um ou mais antigénios polipeptídeos. Existem sequências do genoma de várias estirpes de pneumococcus [160, 161] e podem ser sujeitas a vacinologia reversa [162-165] para identificar antigénios polipeptídicos adequados [166, 167]. Por exemplo, a composição inclui um ou mais dos seguintes antigénios: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 e Spl30, como definido na referência 168. A composição pode incluir mais de um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14) destes antigénios.

Nalgumas realizações, a composição pode incluir tanto antigénios sacarídeos como polipeptídeos de pneumococcus. Estes podem ser utilizados em mistura simples ou o antigénio sacarídeo de pneumococo pode ser conjugado com uma proteína de pneumococo. Proteínas de suporte adequadas destas realizações incluem os antigénios enumerados no parágrafo anterior [168]. 58

Os antigénios pneumocócicos podem ser liofilizados, por exemplo em conjunto com antigénios meningocócicos e/ou antigénios Hib.

Conjugação Covalente

Os sacarideos capsulares em composições da invenção serão normalmente conjugados com proteína(s) de suporte. Em geral, a conjugação intensifica a imunogenicidade dos sacarideos à medida que os converte de antigénios T-independentes em antigénios T-dependentes, permitindo assim a iniciação da memória imunológica. A conjugação é particularmente útil para vacinas pediátricas e constitui uma técnica bem conhecida [por exemplo analisada nas refs 169 e 142-150].

As proteínas de suporte preferidas são toxinas bacterianas ou toxóides, tal como o toxóide diftérico ou o toxóide tetânico. O toxóide diftérico CRMi97 [170-172] é particularmente preferido. Outras proteínas de suporte adequadas incluem a proteína da membrana exterior de N. meningitidis [173], peptídeos sintéticos [174, 175] proteínas de choque térmico [176, 177], proteínas pertussis [178, 179], citoquinas [180], linfoquinas [180], hormonas [180], factores de crescimento [180], proteínas artificiais compreendendo epítopos da célula T CD4+ humana de vários antigénios derivados de agentes patogénicos [181], proteína D de H. influenziae [182, 183], proteína de superfície pneumocócica PspA [184]. Proteínas da absorção do ferro [185], toxina A ou B de C. difficiie [186], etc. Os suportes preferidos são o toxóide diftérico, o toxóide tetânico, a proteína D de H. influenzae e CRMi97. 59

Na composição da invenção é possível utilizar mais do que uma proteína transportadora, por exemplo para reduzir o risco de supressão do suporte. Deste modo podem ser utilizadas várias proteínas de suporte para diferentes serogrupos, por exemplo sacarídeos do serogrupo A podem ser conjugados com CRMi97 enquanto os sacarídeos do serogrupo C podem ser conjugados com o toxóide tetânico. É também possível utilizar mais do que uma proteína transportadora para um antigénio sacarídeo específico, por exemplo sacarídeos do serogrupo A podem encontrar-se em dois grupos, estando alguns conjugados com CRMi97 e outros conjugados com o toxóide tetânico. No entanto, geralmente prefere-se usar a mesma proteína transportadora para todos os sacarídeos.

Uma única proteína transportadora pode possuir mais do que um antigénio sacarídeo [187] . Por exemplo, uma única proteína transportadora pode ser conjugada com sacarídeos dos serogrupos A e C. Para atingir este objectivo, os sacarídeos podem ser misturados antes da reacção de conjugação. No entanto, geralmente prefere-se ter conjugados separados para cada serogrupo. São preferidos os conjugados com uma proporção de sacarídeo:proteína (p/p) entre 1:5 (isto é proteína em excesso) e 5:1 (isto é sacarídeo em excesso). São mais preferidas as proporções entre 1:2 e 5:1, tal como as proporções entre 1:1,25 e 1:2,5. Pode ser preferencial um excesso da proteína transportadora para MenA e MenC.

Os conjugados podem ser utilizados em conjunto com a proteína transportadora livre [188]. Quando uma dada proteína se encontra presente tanto na forma livre como 60 conjugada numa composição da invenção, a forma não conjugada não é, preferencialmente, mais de 5% da quantidade total da proteína transportadora na composição global e mais preferencialmente encontra-se presente numa quantidade inferior a 2% em peso.

Pode ser empregue qualquer reacção de conjugação adequada com qualquer ligante adequado quando necessário. O sacarídeo será tipicamente activado ou funcionalizado antes da conjugação. A activação pode envolver, por exemplo reagentes de cianilação, tais como CDAP (por exemplo tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridínio [189, 190, etc.]). Outras técnicas mais adequadas recorrem a carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norbornano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDO, TSTU; vide também introdução da referência 148).

As ligações por um grupo ligante podem ser realizadas utilizando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 191 e 192. Um tipo de ligação envolve a aminação redutiva do polissacarídeo, acoplando o grupo amino resultante a uma extremidade do grupo ligante de ácido adípico e depois acoplando uma proteína à outra extremidade do grupo ligante de ácido adípico [146, 193, 194] . Outros ligantes incluem B-proopionamido [195], nitrofeniletilamina [196], halogenetos de haloacilo [197] ligações glicosídicas [198] ácido 6-aminocapróico [199], ADH [200], fracções C4 a C12 [201], etc. Em alternativa à utilização de um ligante pode ser utilizada a ligação directa. As ligações directas á proteína podem incluir a oxidação do polissacarídeo, 61 seguida de aminaçao redutiva com a proteína, como descrito, por exemplo, nas referências 202 e 203. É preferido um processo que envolve a introdução dos grupos amino no sacarídeo (por exemplo substituindo os grupos =0 terminais por -NH2) seguido de derivatização com um diéster de ácido adípico (por exemplo diéster N-hidroxissuccinimido do ácido adípico) e reacção com a proteína transportadora. Outra reacção preferida utiliza a activação CDAP com um suporte de vitamina D, por exemplo para MenA ou MenC.

Após conjugação, podem ser separados sacarídeos livres e conjugados. Existem muitos métodos adequados, incluindo cromatografia de interacção hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração etc. [vide também refs. 204 e 205, etc.].

Quando a composição da invenção inclui um oligossacarídeo conjugado prefere-se que a preparação do oligossacarídeo preceda a conjugação.

Antigénios polipeptídicos do serogrupo B adicionais e alternativos A invenção apresenta uma composição que, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta de anticorpos no referido indivíduo, em que a resposta de anticorpos é bactericida contra duas ou três linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 de N. meningitidis do serogrupo B.

Embora NadA, 741, 936, 953 e 287 sejam antigénios exigidos para se obter esta protecção alargada, outros antigénios de polipeptídeos MenB, os quais podem ser, 62 adicionalmente, incluídos em composições da presente invenção incluem, estes incluem uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 650 de ref. 8; SEQ ID NO: 878 de ref. 8; SEQ ID NO: 884 de ref. 8; SEQ ID NO: 4 de ref. 9; SEQ ID NO: 598 de ref. 10; SEQ ID NO: 818 de ref. 10; SEQ ID NO: 864 de ref. 10; SEQ ID NO: 866 de ref. 10; SEQ ID NO: 1196 de ref. 10; SEQ ID NO: 1272 de ref. 10; SEQ ID NO: 1274 de ref. 10; SEQ ID N0: 1640 de ref. 10; SEQ ID NO: 1788 de ref. 10; SEQ ID NO: 2288 de ref. 10; SEQ ID NO: 2466 de ref. 10; SEQ ID NO: 2554 de ref. 10; SEQ ID NO: 2576 de ref. 10; SEQ ID N0: 2606 de ref. 10; SEQ ID NO: 2608 de ref. 10; SEQ ID NO: 2616 de ref. 10; SEQ ID NO: 2668 de ref. 10; SEQ ID N0: 2780de ref. 10; SEQ ID NO: 2932 de ref. 10; SEQ ID NO: 2958 de ref. 10; SEQ ID N0: 2970 de ref. 10; SEQ ID NO: 2988 de ref. 10, ou um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) para as referidas sequências; e/ou (b) inclui um fragmento de, pelo menos, aminoácidos consecutivos n das referidas sequências, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Os fragmentos preferidos para (b) incluem um epítopo da sequência relevante. Pode ser incluído mais do que um (por exemplo 2, 3, 4, 5, 6) destes polipeptídeos.

Geral O termo "compreendendo" significa "incluindo" bem como "consistindo em" por exemplo uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo mais, por exemplo X + Y. 63 0 termo "cerca de" em relaçao a um valor numérico X significa, significa, por exemplo X ± 10 %. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo uma composição que é "substancialmente isenta" de Y pode ser completamente isenta de Y. Se necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

As referências a uma identidade da sequência percentual entre duas sequências de aminoácidos significa que, quando alinhadas, essa percentagem de aminoácidos é igual na comparação das duas sequências. Este alinhamento e a homologia percentual ou identidade de sequência podem ser determinados utilizando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, os descritos na secção 7.7.18 da referência 206. Um alinhamento preferido é determinado pelo algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman, utilizando uma pesquisa de espaço afim com uma penalização de espaço aberto de 12 e uma penalização de extensão de espaço de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman é explicado na referência 207. O termo "alquilo" refere-se a grupos alquilo tanto na forma linear como ramificada. O grupo alquilo pode ser interrompido por 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados de -O-, -NH- ou -S-. O grupo alquilo pode ainda ser interrompido por 1, 2 ou 3 ligações duplas e/OU triplas. No entanto, o termo "alquilo" refere-se normalmente a grupos alquilo sem interrupções por heteroátomos ou interrupções com cadeias duplas ou triplas. Quando se faz referência a alquilo-Ci-12 significa que o grupo alquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 12 (por 64 exemplo, C i, C2, C3, C4, C5, Cg, C7, C8, C 9, Cio, Cn^ C12) · De modo similar, quando se faz referência a alquilo-Ci-6 significa que o grupo alquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 6 (por exemplo, Ci, C2, C3, C4, C5, Ce) . 0 termo "cicloalquilo" inclui grupos clicloalquilo, policicloalquilo e cicloalcenilo, bem como combinações destes com grupos alquilo, tais como grupos cicloalquilalquilo. O grupo cicloalquilo pode ser interrompido por 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados de entre -0-, -NH- ou -S-. No entanto, o termo "cicloalquilo# refere-se normalmente a grupos cicloalquilo sem interrupções por heteroátomos. Exemplos de grupos cicloalquilo incluem grupos ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexenilo, ciclo-hexilmetilo e adamantilo. Quando se faz referência a cicloalquilo-C3-i2 significa que o grupo cicloalquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Cio, Cu, C12) . 0 termo "arilo" refere-se a um grupo aromático tal como fenilo ou naftilo. Quando se faz referência a arilo-Cs-i2 significa que o grupo arilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 5 e 12 (por exemplo, C5, C6, C7, C8, C9, Cio, Cu, Ci2) . 0 termo "arilo-Cs-^-alquilo-CiV refere-se a grupos tais como benzilo, feniletilo e naftilmetilo.

Os grupos de protecção azoto incluem grupos sililo (tais como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tais como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benziloxicarbonilo 65 (Z ou Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxi, carbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonil (Troe)), derivados de sulfonilo (tais como (β-trimetilsililetanossulfonilo (SES)), derivados de sulfenilo, alquilo-Ci_i2, benzilo, benzidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Um grupo de protecção azoto preferido é Fmoc.

As sequências incluídas para facilitar a clonagem ou purificação etc. não contribuem necessariamente para a invenção e podem ser omitidas ou removidas.

Pode-se observar que podem existir anéis açúcar na forma aberta e fechada e que, embora sejam apresentadas nas fórmulas estruturais do presente documento formas fechadas, as formas abertas são também englobadas pela presente invenção.

MODOS DE EXECUÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Proteína híbrida AG287-953 O ADN que codifica a proteína 287 da estirpe 394/98 do serogrupo B meningocócico e a proteína 953 da estirpe 2996 do serogrupo B meningocócico foi digerido e ligado em conjunto com uma sequência ligante curta para produzir um plasmídeo que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID 7. 0 plasmídeo foi transfectado em E. coli e desenvolveram-se as bactérias para expressar a proteína.

Depois de se desenvolverem adequadamente, as bactérias foram colhidas e a proteína foi purificada. A partir da cultura, as bactérias foram centrifugadas e o pellet foi homogeneizado na presença de 50 mM de tampão de acetato (pH 5) com uma proporção de volume pellet:tampão de 1:8. 66

Executou-se a lise utilizando um homogeneizador de alta pressão (AVESTIN, 4 ciclos a 14000 psi) . Após a lise, adicionou-se ureia à concentração final de 5 M, seguido de agitação durante 1 hora à temperatura ambiente. O pH foi reduzido de 6 para 5 utilizando 200 mM de tampão de acetato (pH 4) + 5 M de ureia. A mistura foi centrifugada a 16.800 g durante 60 minutos entre 2-8° C. O sobrenadante foi recolhido e filtrado por SARTOBRAN P (0,45-0,22 pm SARTORIUS). A proteina no sobrenadante filtrado manteve-se estável durante >30 dias a -20° C e >15 dias entre 2-8° C. A proteina foi submetida a purificação adicional numa coluna de permuta catiónica (SPFF, Amersham Biosciences) eluindo com 350 mM de NaCl + 50 mM de acetato + 5 M de ureia a pH 5,00. A maioria das impurezas encontrava—se presentes na fracção não ligada (flow-through). Uma lavagem antes da eluição utilizando uma concentração de NaCl inferior (180 mM) eliminou vantajosamente duas proteínas de E. coli contaminantes. O material eluído foi ajustado a pH 8 (utilizando 200 mM Tris/HCl + 5 M ureia pH 9) e foi submetido a purificação adicional numa coluna Q Sepharose HP (Amersham) numa eluição com 150 mM de NaCl + 20 mM TRIS/HC1 pH 8,00 em 5 M de ureia. Novamente, uma lavagem antes da eluição com pouco sal (90 mM) foi útil para eliminar as impurezas. O material eluído filtrado de uma coluna Q HP foi diluído 1:2 utilizando PBS pH 7,00 (150 mM NaCl + 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,00) e depois submeteu-se a diafiltração contra 10 volumes de PBS pH 7,00 por ultrafiltração tangencial. Na extremidade de diafiltração, 67 o material foi concentrado 1,6 vezes até cerca de 1,2 mg/ml de proteínas totais. Utilizando uma membrana com um limiar de 30.000 Da (Regenerated Cellulose membrane 50cm2, Millipore PLCTK 30) foi possível dializar o material com um rendimento de cerca de 90%.

Proteína híbrida 936-AG741 O ADN que codifica a proteína 936 da estirpe 2996 do serogrupo B meningocócico e a proteína 741 da estirpe MC58 do serogrupo B meningocócico foi digerido e ligado em conjunto com uma sequência ligante curta para produzir um plasmídeo que codifica a sequência de aminoácido da SEQ ID 8. O plasmídeo foi transfectado em E. coli e desenvolveram-se as bactérias para expressar a proteína. A proteína recombinante não foi segregada mas permaneceu solúvel no interior das bactérias.

Após um desenvolvimento adequado, as bactérias foram centrifugadas para produzir uma pasta húmida que foi tratada da seguinte forma: - Homogeneização por meio de um sistema de alta pressão na presença de 20 mM de fosfato de sódio pH 7.00.

Centrifugação e clarificação mediante filtração ortogonal.

Cromatografia em coluna catiónica (SP Sepharose Fast Flow), com eluição por 150 mM NaCl em 20 mM de fosfato de sódio pH 7.00. - Cromatografia em coluna aniónica (Q Sepharose XL) com colheita do fluído. - Cromatografia em coluna de interacção hidrofóbica (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub), com eluição por 20de fosfato de sódio pH 7.00. 68 - Diafiltração contra PBS pH 7,4 com um limiar de 10 Kd. - Filtração estéril final e armazenagem a -20° C. A proteína e o material final mantiveram-se estáveis durante pelo menos 3 meses tanto a -20° C como 2-8° C.

Proteína NadA(m,) (c) O adn que codifica a proteína NadA da estirpe 2996 do serogrupo B meningocócico foi digerido para remover a sequência que codifica o terminal C da proteína para produzir um plasmídeo que codifica uma sequência de aminoácido da 3EQ ID 1, O plasmídeo foi transfectado em E. coli e desenvolveram-se as bactérias para expressar a proteína. A proteína recombinante foi segredada para o meio de cultura e o peptídeo líder encontrava-se ausente na proteína segregada (SEQ ID 2), O sobrenadante foi tratado da seguinte forma: - concentração a 7x e diafiltração contra tampão 20 mM de TRIS/HC1 pH 7,6 por UF de fluxo cruzado (limiar 30 Kd). - Cromatografia em coluna aniónica (Q Sepharose XL) , com eluição por 400 mM NaCl em 20 mM de TRIS/HC1 pH 7,6. - Cromatografia em coluna de interacção hidrofóbica (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub), com eluição por 50 mM NaCl em TRIS/HC1, pH 7,6. - Cromatografia em coluna com hidroxiapatita cerâmica (HA Macro. Prep.) eluindo com 200 mM de fosfato de sódio a pH 7,4. - Diafiltração (limiar de 30 Kd) contra PBS pH 7,4 - Filtração estéril final e armazenagem a -20° C. 69 A proteína e o material final mantiveram-se estáveis durante pelo menos 6 meses tanto a -20° C como 2-8° C. A proteína NadA é susceptível de degradação e podem ser detectadas formas truncadas de NadA por Western blot ou por espectrometria de massa (por exemplo, por MALDI-TOF) indicando uma perda de 10 kDa MW. Os produtos da degradação podem ser separados do NadA nativo por meio de filtração em gel (por exemplo utilizando a coluna TSK300SWXL, pré-coluna TSKSWXL, TOSOHAAS). Esta filtração produz três picos: (i) um primeiro pico com um tempo de retenção de 12, 637 min e MW aparente de 885,036 Da; (ii) tempo de retenção 13,871 min e MW aparente 530,388 Da; (iii) tempo de retenção 13,871 min e MW aparente 530,388 Da. A análise por difusão luminosa dos três picos revela valores MW reais de (i) 208500 Da, (ii) 98460 Da, (iii) 78760 Da. Assim, o primeiro pico contém agregados NadA e o terceiro pico contém os produtos da degradação.

Como o peso molecular previsto de NadA(NL> (c) é igual a 34,113 Da, o pico (ii) contém uma proteína trimérica que é o antigénio desejado.

Combinações antigénicas

Ratinhos foram imunizados com uma composição compreendendo as três proteínas e um adjuvante de hidróxido de alumínio. Para comparação, as três proteínas foram também testadas individualmente. Foram utilizados dez ratinhos por grupo. A mistura foi capaz de induzir elevados títulos bactericidas contra várias estirpes:

Estirpe meningocócica(ser°9rupo) 70

2 99 6 (B) MC58 (B) NGH38 394/98 (B) H44/76 (B) F6124 (A) BZ133 (c) Cll(c) (1) 32000 16000 130000 16000 32000 8000 16000 8000 (2) 256 131000 128 16000 32000 8000 16000 <4 (3) 32000 8000 - - - 8000 - 32000 Mix 32000 32000 65000 16000 260000 65000 >65000 8000 indica que esta estirpe não contém o gene NadA

Analisando ratinhos individualmente, a mistura tripla induziu títulos bactericidas elevados e consistentes contra as três estirpes do serogrupo B das quais é derivado os antigénios individuais. # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2996 32768 16384 65536 32768 32768 65536 65536 32768 65536 8192 MC58 65536 32768 65536 65536 65536 8192 65536 32768 32768 65536 394/98 65536 4096 16384 4096 8192 4096 32768 16384 8192 16384

Combinação e comparação com OMVs

Em experiências adicionais, os antigénios com adjuvante (20 pg de cada antigénio por dose) foram administrados em combinação com 10 pg OMVs preparados tanto a partir da estirpe H44/76 (Noruega) como da estirpe 394/98 (Nova Zelândia). Os controlos positivos foram SEAM-3 mAb anti-capsular para o serogrupo B ou sacarídeos capsulares CRMi97 para outras estirpes. Os resultados (títulos bactericidas) são apresentados no quadro 1. A mistura produz quase sempre títulos melhores do que OMVs simples e, além disso, a 71 adição da mistura a OMVs quase sempre aumenta significativamente a eficácia dos OMVs. Além disso, em muitos casos a mistura de antigénios equivale ou excede a resposta observada no controlo positivo. Além disso, em muitos casos, a mistura de antigénios equivale ou excede a resposta observada no controlo positivo.

Testes de linhagens hipervirulentas

Os antigénios seguintes foram testados contra uma variedade de estirpes do serogrupo B de uma variedade de linhagens hipervirulentas: (a) NadA(NL) (c) (b) AG287-953 (c) 936-AG741 (d) uma mistura de (a), (b) e (c) (e) OMVs preparados a partir da estirpe H44/76 (Noruega) (f) OMVs preparados a partir da estirpe 394/98 (Nova Zelândia) (g) Uma mistura de AG287 e (e) (h) Uma mistura de (d) e (e) (i) Uma mistura de (d) e (f)

Utilizou-se SEAM-3 como controlo positivo.

Os resultados foram os seguintes, expressos em percentagem das estirpes na linhagem hipervirulenta indicada em que o titulo de soro bactericida excede 1024: # (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) S-3 72

Estirpes A4 4 50 50 0 100 25 25 25 100 100 + ET-5 8 25 75 88 100 71 14 71 100 100 + Linhagem 3 13 0 75 15 93 8 85 8 92 93 + ET-37 4 11 22 0 33 0 0 0 22 25 +

Contra determinadas estirpes de referência, as titulações bactericidas foram as seguintes:

S—3 CN I—1 co 16384 16384 1024 Η 4096 524288 16384 65536 CO co 2" S rH CN CO CN CN CN LO co co co rH co co co rH CO CO co CN θ' r-1 CN CO CN CN LO CN rH LO CN LO CN CN íT σ\ ϊ—1 σ\ ϊ—1 co co CO V co co !—1 co co "3Γ rH CN CO CN V V co CN CN LO CN co Γ- co co 9" o σ> σ> o ϊ—1 o o CN co ϊ—1 co co V co 32 co 0 θ' LO CN CN co co co 2" <N <N o o o o CN CN r-1 rH 'W' 128 <4 <4 co o CN (U o. u LO CN σ\ LO co [-“· co σ^ \ θ'! LO θ' +J n H 961- σο co rH £ Cu £ *· m m < 1 Eh e (0 1 w φ EH θ' w rd Λ C r| hI 73

As composições (d), (h) e (i) induzem, por conseguinte, respostas de anticorpos bactericidas contra uma grande variedade de estirpes de meningococos do serogrupo B da linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3. Os titulos que utilizam composições (h) e (i) foram geralmente superiores do que no caso de (d) mas a cobertura das estirpes nas linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 não foram melhores. A cobertura de estirpes não tipadas foi igualmente elevada com composições (d), (h) e (i) .

Análise do domínio N-terminal NadA A proteína NadA de N. meníngítídís purificada é conhecida por se ligar a células epiteliais humanas [17] (por exemplo células de Chang, células HeLa, células Hep-2) e E. coli recombinante que expressa NadA exibe um fenotipo aderente [18] . Estes E. coli são igualmente capazes de invadir células epiteliais e NadA+ve intracelular de E. coli pode ser detectado em células Chang por imunofluorescência (após permeabilização da membrana) e por microscopia electrónica. Acredita-se, assim, que NadA funciona como uma adesina e invasina para células epiteliais.

Com base numa análise da estrutura secundária, NadA maturo foi subdividido em três domínios putativos. Um domínio globular N-terminal (aa 24-87), uma região interna α-hélice com uma elevada propensão para formar uma estrutura dimérica coiled-coil e um domínio de ancoragem membranar C-terminal (aa 351-405) Foi investigado o papel do domínio globular N-terminal na interacção hospedeiro-célula . 74

Um gene nadA truncado, codificador de uma proteina desprovida dos aminoácidos 30-87 foi clonado no vector pET-21 (pETNadAA30-87) e foi expresso em E. coli estirpe BL21 (DE3). Os aminoácidos 24-29 foram retidos para permitir o processamento do peptideo líder e correcta maturação da proteína. Análise por Western blot e FACS confirmou que NadAA30-87 foi expresso e formou oligómeros na superfície da célula de E. coli, isto é a eliminação do domínio N-terminal não interfere com a expressão, exportação e localização na membrana de NadA. No entanto, a estirpe de E. coli recombinante perdeu completamente a capacidade de aderir a células epiteliais Chang. O domínio N-terminal fica assim implicado na actividade adesina.

Para investigar mais profundamente a parte do domínio N-terminal que está envolvida na interacção, a região foi adicionalmente dividida em três sub-domínios putativos: Aminoácidos 24-42, contendo uma região α-hélice prevista com resíduos hidrofóbicos; aminoácidos 43-70, a parte interna sem uma estrutura secundária prevista definida e aminoácidos 71-87 contendo uma outra estrutura a-hélice prevista. Três construções, cada uma codificadora de uma proteína com deleção de um sub-domínio único, foram geradas e depois introduzidas em E. coli BL21(DE3), obtendo as seguintes estirpes: BL21 (DE3)/pET-NadAA24-42, BL21 (DE3)/pET-NadAA43-70 e BL21 (DE3)/pET-NadAA71-87. A localização superficial dos oligómeros foi confirmada por Western blot e FACS mas a adesão a células epiteliais Chang não foi melhor do que a estirpe de controlo BL21 (DE3)/pET E. coli. Estes resultados, confirmados também por análise por microscopia de imunofluorescência, indicam que todo o 75 domínio N-terminal globular de NadA é importante na interacção com células humanas.

Combinação com conjugados meningocócicos e/ου hib A composição MenB tripla é combinada com uma mistura de conjugados oligossacarídeos para os serogrupos C, W135 e Y para produzir uma vacina contendo os seguintes antigénios:

Componente Quantidade por dose 0,5 ml Conjugado do serogrupo C 10 (pg sacarídeo +12,5-25 pgCRM197 Conjugado do serogrupo W135 10 pg sacarídeo + 6, 6-20 pg CRM197 Conjugado do serogrupo Y 10 pg sacarídeo + 6,6-20 pg CRM197 ΔΘ287-953 20 pg polipeptídeo 936-AG741 20 pg polipeptídeo NadA 20 pg polipeptídeo

Foi preparada uma vacina idêntica, incluindo conjugado MenA (10 pg de sacarídeo + 12,5-33 pg CRMi97) e/ou conjugado HbOC Hib (10 pg de sacarídeo + 2-5 pg CRMi97) .

Utilização de sacarídeo MenA modificado O polissacarídeo capsular foi purificado a partir de MenA e foi hidrolisado para produzir o oligossacarídeo MenA. O polissacarídeo (2 g) foi hidrolisado a 50° C em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,75 a uma concentração de polissacarídeo de 10 mg/mL durante cerca de 4 horas [135] . Após hidrólise, a solução foi concentrada por evaporação rotativa. 76 0 oligossacarídeo foi activado utilizando o seguinte esquema reaccional: 76 Sacc—OH +

Sacc = fracção sacarídeo 0 II . .

Sacc—O—C—NRR2 0 oligossacarídeo foi dissolvido em DMSO para produzir uma concentração de sacarídeo de 10 mg/mL. De acordo com uma proporção molar de oligossacarídeo:CDI de 1:20, adicionaram-se 21,262 g de CDI e a mistura reaccional foi agitada durante 16 horas à temperatura ambiente. O composto de MenA-CDi resultante foi purificado por precipitação selectiva numa mistura de 80:20 (v/v) de acetona:DMSO, seguida de centrifugação. A eficiência da reacção de activação foi calculada como sendo cerca de 67,9%, mediante determinação da proporção de imidazol livre para imidazol ligado.

Numa segunda fase de reacção, o oligossacarídeo MenA-CDI foi solubilizado em DMSO a uma concentração de sacarídeo de cerca de 10 mg/mL. De acordo com uma proporção molar de MenA-unidade CDI:DMA de 1:100, adicionaram-se 36, 288 g de cloridrato de dimetilamina (isto é R1 e R2 =

Me) e a mistura reaccional foi agitada durante 16 horas à 77 temperatura ambiente. 0 produto da reacçao foi liofilizado e re-solubilizado em solução de 10 mg/mL de água.

Para remover o reagente de reacção de baixo peso molecular (em particular a dimetilamina (DMA)) da preparação de oligossacarideos foi efectuada uma etapa de diálise através de uma membrana de 3,5 kDa MWCO (Spectra/Por™). Foram executadas quatro fases de diálise: (i) 16 horas contra 2 L de cloreto de sódio 1 M (factor de diálise 1:20), (ii) 16 horas contra 2 L de cloreto de sódio 0,5 M (factor de diálise 1:20), (iii) e (iv) 16 horas contra 2 L de WFI (factor de diálise 1:20). Para melhorar a purificação foi ainda efectuada uma etapa de diafiltração através de uma membrana MWCO de 1 kDa (Centricon™) . O produto MenA-CDl-DMA purificado foi tamponizado a pH 6,12,70 cm em 25 mM de L-histidina (Fluka™).

Para a preparação de conjugados do sacarídeo MenA modificado (MenA-CDI-DMA), o processo global foi o seguinte: - Hidrólise do polisacarideo para produzir fragmentos de oligossacarideo - Dimensionamento dos fragmentos de oligossacarideo - Aminação redutiva dos grupos aldeido terminais nos oligossacarideos dimensionados

- Protecção de grupos NH2 terminais com o grupo Fmoc antes da reacção com CDI

- Desprotecção intrínseca de grupos -NH2 durante a reacção DMA 78 - A activaçao dos grupos -NH2 terminais por SIDEA (ácido N-hidroxisuccinimida adipico) - Ligação covalente da proteína CRM197 0 conjugado do oligossacarídeo MenA modificado é muito mais resistente à hidrólise do que o seu equivalente natural a temperaturas elevadas. Passados 28 dias a 37° C, por exemplo, a percentagem de sacarídeo libertado é 6,4 % para o oligossacarídeo modificado contra 23,5 % do antigénio natural. Além disso, os títulos induzidos pelos oligossacarídeos modificados não são significativamente menores do que os obtidos utilizando as estruturas açúcar nativas. 0 conjugado MenA modificado é combinado com os conjugados MenC, MenWl35 e MenY como um substituto para o conjugado de oligossacarídeo não-modifiçado. Esta mistura tetravalente é misturada com três polipeptídeos MenB para produzir uma vacina eficaz contra os serogrupos A, B, C W135 e Y de N. meningitidis numa única dose.

Combinações pneumocócicas

As três proteínas MenB combinadas são misturadas com conjugados de sacarídeos pneumocócicos para produzir uma concentração final de 2 pg/dose de cada um dos serotipos pneumocócicos (duplo para serotipo 6B) . A vacina reconstituída contém assim os seguintes antigénios:

Componente Quantidade por dose de 0,5 ml Conjugado do serogrupo A 5 pg sacarídeo + 6,25-16,5 pg CRM197 Conjugado do serogrupo C 5 pg sacarídeo + 6,25-12,5 pg CRM197 79

Conjugado do serogrupo W135 5 pg sacarideo + 3,3-10 pg CRMi97 Conjugado do serogrupo Y 5 pg sacarideo + 3,3-10 pg CRMi97 Conjugado de pneumococus do serotipo 4 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM797 Conjugado de pneumococus do serotipo 9V 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado de pneumococus do serotipo 14 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado de pneumococus do serotipo 18C 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado de pneumococus do serotipo 19F 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado de pneumococus do serotipo 23F 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM797 Conjugado de pneumococus do serotipo 6B 4 pg sacarideo + 5 pg CRM797 Ο 00

QUADRO

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LISTA DE SEQUÊNCIAS SEQ id 1 - NadA da estirpe 2996, com deleçao C-terminal [0241]

MKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDF ΚδΙΛΙΚΚννΤΝίΤΚΤνΝΕΝΚΟΝνϋΑΚνΚΑΑΕΕΕΙΕίΟιΤΤΚΙΑϋΤΟΑΑΙΑΟΤΟΑΑΙ^ΑΤΤΝΑΙιΚΚΙΟΕΚΙΤΤΡΑΕΕΤΚΤΝίν

KIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETtfTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAAD

KAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGIiDKTVS

DLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG SEQ ID 2 - NadA da estirpe 2996, com deleção C-terminal e peptideo lideo processado [0241]

ATNDDDVKKAATVAIAMYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKWTNLTKTVNENKQKIV

DAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNAIiNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDI

ADSLDETKTKADEAVRTAMEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDKI

AKKMSADVYTREESDSKFVKIDGLNATTEKLDTRI^AEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLABQAALSGLFQPY

NVG SEQ ID 3 - AG741 da estirpe MC58 [0243]

VAADIGAGIiADALTAPLDHKDKGIjQSIjTIiDÇSVRKNEKlKIjAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQL

ITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRArYRGTAFGSDDAGGKLTYT

IDFAAKQGNGKIEHLKSPELtíVPLAAADIKPDGKRItAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIG

LAAKQ SEQ ID 4 - 936 da estirpe MC58 com peptideo lider processado [0243]

VSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRISTTARSYLRQNNQTKGYTPQISWGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQ IARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATQARVKIVTYGíWTYVMGILTPEEQAQITQKVST TVGVQKVITLYQNYVQR SEQ ID 5 - 953 da estirpe MC58 com peptideo lider processado [0243]

ATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPIANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIR

FVSrKFNFtíGKKLVSVDGMLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMEKTEVCGGDFSTTIDRTKWGMDYLVNVGMTKSVRIDIQ

IEAAKQ SEQ ID 6 - AG741 da estirpe MC58 [0246] 94

SPDVKSADTLSKPAAPWSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADRPKNEDEVAQNDMPQN

AAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSD

PIPASNPAPANGGSNFGRVDIANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKF

VGLVADSVQMKGlNQYnFYKPKPTSFAftFRRSARSRRSLPAÉMPLlPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGtfYRYL

TYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKF

KAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD SEQ ID 7 - híbrido 287-953 [0247] maspdvksadtlskpaapwseketeakedapqagsqgqgapsaqggqdmaavseentgnggaaatdkpknedegaqndmp

QNAADTDSLTPNlITPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDHANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAEtíKQTAGS

QNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSWIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKÍID gkndkfvglvadsvqmkgikqyiifykpkptsfarfrrsarsrrslpaemplipvnqadtlivdgeavsltghsgnifape

GNYRYLTYGASXLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLH mgtqkfkaaidgngfkgtwtengggdvsgkfygpageevagkysyrptdaekggfgvfagkkeqdgsggggatykvdeyha narfaidhfntstnvggfygltgsvefdqakrdgkiditipvanlqsgsqhftdhlksadifdaaqypdirfvstrfhfng kklvsvdgnlthhgktapvklkaekfmcyqspmaktevcggdfsttidrtkwgvdylvnvgmtksvridiqieaakq* SEQ ID 8 - híbrido 936-741 [0248]

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDHVMAIíRIETTAKSYLRQNNQTKGYTPQISWGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVG qiarseqaaegvynyitvaslprtagdiagdtwntskvratllgispatqarvkivtygnvtyvmgiltpeeqaqitqkvs ttvgvqkvitiyqkyvorgsggggvaadigagladaltapldhkdkglqsltldqsvrkkeklklaaqgaektygngdsln tgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqwkqshsaltafqteqiqdsehsgkmvakrqfrigdiagehtsfdklp

EGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAAriKPDGKRHAVISGSVLYKQAEKGSYSLGI FGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ* SEQ ID 9 - ligante

GSGGGG SEQ ID 10 - sequência 741

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSIiTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGWGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQ

IEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDA

GGECLTYTIDFAAKQGNGK1EHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTV

NGIRHIGLAAKQ SEQ ID 11 - sequência 741

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSlCSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKrYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFlKQ ΙΕνρσ0[,ΙΤΙ,Ε30ΕΡ<5ΙΥΚ<3ΟΗ3ΑννΑΙ,0ΙΕΚΙΝΝΡ0ΚΙΟ3ΠΝ5Κ3ΡΙ,ν3αΐ^ΕΗΤΑΡΙ'ΐςΐ,Ρ0ΟΚΑΕΥΗαΚΑΓ33ΟΟΑΟ

GKLTYTrDFAAKOGHGKIEHLKTPEOMVELAAAELKADEKSHAVlLGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQElAGSATYKlGE

KVHEIGIAGKQ SEQ ID 12 - sequência 741 95

CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADAÍiTAPLDHKDKGIiKSIjTIjEDSrPQNGTIjTIjSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKlJDKI SRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQrEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGK AFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEONVELAAAELKADEKSHAVILGDTR YGSEEKGT YHLALFGDRAQEIAG SATVKIGEKVHEIGIAGKQ SEQ ID 13 - motivo CpG [0253] gtcgtt SEQ ID 14 - motivo CpG ttcgtt SEQ ID 15 - sequência 936-AG741 da referência 16 renunciada

MKPKPHTVRTLIAAIFSLALSGCVSAVIG5AAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRI3TTARSY LRQNNQTKGYTPQ I SWGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARS EQAAEG VYNYITVAS L PRT A GDIAGDTWNT$KVRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQJTQKV$TTVGVQKV ITLYQNYVQRGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKIAAQGAEK TYGNGDSLNTGKLKRDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEH SGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKIíPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEH LKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIR HIGLAAKQ 96

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição: wo 0066791 A [0240] wo 9924578 A [0240] wo 9936544 A [0240] wo 9957280 A [0240] wo 0022430 A [0240] wo 0066741 A [0240] wo 0164920 A [0240] wo 0164922 A [0240] wo 03020756 A [0240] wo 03010194 A [0240] GB 0227346 A [0240] wo 03063766 A [0240] wo 0300986S A [0240] wo 0130390 A [0240] wo 0053221 A [0240] wo 0056365 A [0240] wo 0023105 A [0240] wo 9014837 A [0240] us 5057540 A [0240] wo 9633739 A [0240] EP 0109942 A [0240] wo 9611711 A [0240] 97 wo 0007621 A [0240] wo 03024480 A [0240] wo 03024481 A [0240] EP 0689454 A [0240] WO 0226757 A [0240] WO 9962923 A [0240] wo 9840100 A [0240] us 6207646 B [0240] us 6239116 B [0240] us 6429199 B [0240] wo 0195935 A [0240] wo 03035836 A [0240] wo 9517211 A [0240] wo 9842375 A [0240] wo 9940936 A [0240] wo 9944636 A [0240] wo 9927960 A [0240] us 6090406 A [0240] us 5916588 A [0240] EP 0626169 A [0240] wo 9952549 A [0240] wo 0121207 A [0240] wo 0121152 A [0240] wo 9911241 A [0240] wo 9400153 A [0240] wo 9857659 A [0240] EP 0835318 A [0240] EP 0735898 A [0240] EP 0761231 A [0240] wo 9637222 A [0240] us 6333036 B [0240] 98 wo 03007985 A [0240] wo 0152885 A [0240] wo 03080678 A [0240] EP 0477508 A [0240] US 5306492 A [0240] WO 9842721 A [0240] wo 9700697 A [0240] wo 0200249 A [0240] wo 0222167 A [0240] EP 0372501 A [0240] EP 0378881 A [0240] EP 0427347 A [0240] WO 9317712 A [0240] WO 9403208 A [0240] WO 9858668 A [0240] EP 0471177 A [0240] WO 9101146 A [0240] EP 0594610 A [0240] WO 0056360 A [0240] WO 02091998 A [0240] WO 0172337 A [0240] WO 0061761 A [0240] WO 9942130 A [0240] WO 9640242 A [0240] wo 9508348 A [0240] US 4882317 A [0240] US 4695624 A [0240] EP 0208375 A [0240] WO 0010599 A [0240] US 4057685 A [0240] US 4673574 A [0240] 99 us 4761283 A [0240] us 4808700 A [0240] us 4459286 A [0240] us 4965338 A [0240] us 4663160 A [0240] us 4356170 A [0240] wo 0038711 A [0240] us 6146902 A [0240]

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Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição que, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta de anticorpos no referido indivíduo, em que a resposta de anticorpos é bactericida contra duas ou mais das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 de N. meningitidis do serogrupo B, compreendendo: (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID 2; (ii) uma proteína híbrida representada pela fórmula NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, em que n= 2; A é a sequência de aminoácidos Met-Ala; Xi é uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID 6; Li é a sequência de aminoácidos SEQ ID 9; X2 é uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID 5; L2 está ausente e B está ausente e (iii) uma proteína híbrida representada pela fórmula NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH, em que n= 2; A é o aminoácido Met; X1 é uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID 4; Li é a sequência de aminoácidos SEQ ID 9; X2 é uma sequência de aminoácidos com mais de 95% de identidade com a SEQ ID 3; L2 está ausente e B está ausente.

2. Composição que, após administração a um indivíduo, é capaz de induzir uma resposta de anticorpos no referido indivíduo, em que a resposta de anticorpos é bactericida contra duas ou mais das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 de N. meningitidis do serogrupo B, compreendendo: (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com 2 mais de 99 % de identidade com a SEQ ID 2; (ii) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com mais de 99% de identidade com a SEQ ID 7 e (iii) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos com mais de 99% de identidade com a SEQ ID 8, desde que a referida sequência não seja a SEQ ID NO: 15.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compreendendo: (i) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID 2; (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID 7 e (iii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID 8.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo ainda antigénios sacarídeos dos serogrupos Y, W135, C e (opcionalmente) A de meningococos.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um antigénio sacarídeo de Haemophilus influenzae tipo B.

6. Composição de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que o antigénio sacarídeo é conjugado com uma proteína transportadora.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que o antigénio sacarídeo é conjugado com um transportador 3 seleccionado a partir de: toxóide diftérico, toxóide tetânico, CRMi97 ou proteína D de H. influenziae.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um antigénio sacarídeo de Streptococcus pneumoniae.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização como medicamento.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para utilização na prevenção e/ou tratamento de uma doença provocada por Neisseria.

11. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores na produção de um medicamento destinado à prevenção e/ou tratamento de uma doença provocada por Neisseria.