CZ20021045A3

CZ20021045A3 - Pomocný prostředek

Info

Publication number: CZ20021045A3
Application number: CZ20021045A
Authority: CZ
Inventors: Martin Friede; Philippe Hermand; Veronique Henderickx
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2002-08-14
Also published as: EP1214053A1; AR025749A1; CO5200838A1; CN1399539A; BR0014285A; HK1046861A1; AU766635B2; TR200200777T2; WO2001021152A1; CA2383110A1; PL355232A1; AU7522600A; KR20020048942A; NZ517901A; HUP0203817A2; NO20021432D0; NO20021432L; MXPA02003068A; IL148671A0; JP2003509452A

Description

Pomocný prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká nového pomocného prostředku, kterým je systém, tvořený polyoxyethylenalkyletherem nebo -esterem jako smáčedlem v kombinaci s alespoň jedním dalším neiontovým smáčedlem. Tímto dalším neiontovým smáčedlem je s výhodou oktoxynol. Vynález se týká nových pomocných prostředků, vakcín s jejich obsahem a způsobů jejich výroby a zpracování na vakcíny. Pomocný prostředek nebo vakcíny s jeho obsahem je možno použít k prevenci nebo léčení různých onemocnění. Při jejich použití dochází ke zvýšení odpovědi imunitního systému hostitele. Pomocné prostředky jsou zvláště vhodné k aplikaci na sliznici, jsou však také účinné při systemickém podání.

Dosavadní stav techniky

Kromě výhody, spočívající v tom, že ošetřovaná osoba se vyhne podávání injekcí, které obvykle vyvolávají negativní odezvu, je očkování sliznici výhodné také z toho důvodu, že bylo prokázáno, že toto podání očkovacích materiálů u živočichů je obvykle účinnější při vyvolání ochranné odpovědi právě na povrchu sliznic, které jsou obvyklou vstupní cestou pro řadu patogenních organismů. Mimo to je pravděpodobné, že očkování sliznici, například nosní sliznici, může vyvolat imunitu sliznice nejen v nose, nýbrž i na vzdálenějších sliznicích, například na sliznici pohlavního ústrojí, jak bylo popsáno v publikacích Mestecký, 1987, Journal of Clinical Immunology, 7, 265-276, McGhee and Kiyono, Infectiuos Agents and Disease, 1993, 2, 55-73. Přes intenzivní • · · · • · ·· ···· výzkum v tomto oboru nejsou stále ještě k dispozici dostatečně bezpečné a účinné pomocné prostředky, které by byly vhodné pro použití u člověka. Vynález si klade za úkol tento problém vyřešit.

Bylo již popsáno použití některých neiontových smáčedel v lékařství. Bylo například popsáno podávání polyoxyethylenetherů a -esterů na nosní sliznici pro zlepšení vstřebávání inzulínu nosní sliznici podle publikací Hírai a další, 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 165-172, Hirai a další 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 173-184.

Polyoxyethylenalkylethery byly popsány jako složky v olejových emulzích nebo byly popsány polymery akrylové kyseliny jako pomocné prostředky v dokumentech JP 05 201877, US 3919411.

Ve vakcinách byla použita také další neíontová smáčedla. Například v dokumentu WO 94/17827 byly popsány vakcíny, které obsahovaly směs polyoxyethylenricinového oleje nebo směsi glyceridů kyseliny kaprilové a kaprínové s polyoxyethylensorbitanmonoestery a mimo to antigen, tyto vakcíny byly schopné vyvolat systemickou odpověď imunitního systému po místním podání na sliznici. Tato patentová přihláška popisuje kombinaci neiontového smáčedla Tween20™ (polyoxyethylensorbitanmonoester) a Imwitor742™ (glyceridy kyseliny kaprilové a kaprinové) nebo kombinaci Tween20™ a polyoxyethylenricinového oleje ke zvýšení systemické odpovědi imunitního systému po podání nosní sliznici. Podrobnosti, týkající se účinnosti uvedeného prostředku na zvýšení imunitní odpovědi byly popsány v literatuře, například v publikacích Gizurarson • 4 a další, 1996. Vaccine Research, 5, 69-75, Aggerbeck a další, 1977, Vaccine, 15, 307-316, Tebbey a další, Viral Immunol, 1999, 12(1), 41-5.

Neiontová smáčedla byla také zpracovávána takovým způsobem, aby vznikaly vakuoly neiontového smáčedla, běžně označované jako NISV podle US 5679355. Takové prostředky s obsahem neiontových smáčedel, často v přítomnosti cholesterolu, vytvářejí dvouvrstevné lipidové vakuoly, které zachytí antigen ve své vnitřní vodné fázi nebo přímo ve dvojité vrstvě.

V mezinárodní patentové přihlášce WO 96/36352, která odpovídá dokumentu US 5653987, se popisuje kapalný farmaceutický prostředek, který obsahuje alespoň dvě látky, podporující vstřebávání a vodu. Prostředek je primárně určen pro perorální podávání inzulínu, přičemž množství každé látky, která podporuje vstřebávání, se pohybuje v koncentraci 1 až 10 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost celého prostředku.

Smáčedla se běžně užívají v pomocných prostředcích typu olejových emulzí pro systemické podání, funkcí těchto látek je stabilizace olejových kapek. Například se užívají estery polyoxyethylensorbitanu (Tween™) nebo estery sorbitanu s mastnými kyselinami (Spán™) ke stabilizaci oleje v emulzi ve vodě podle EP 0399843 B nebo WO 95/17210.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na překvapujícím zjištění, že polyoxyethylenalkylethery nebo -estery v kombinaci s • ··· · · ·· • · · « · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ··· ·· ···· • · · · · alespoň jedním dalším neiontovým smáčedlem působí jako účinné pomocné prostředky pro vakcíny. Tyto prostředky je s výhodou možno podávat systemicky, jsou však schopné účinně vyvolat systemickou odpověď imunitního systému i v případě, že se vakcína podává na sliznici. Odpověď imunitního systému, vyvolaná podáváním vakcíny podle vynálezu na sliznici, může být přitom alespoň stejně vysoká jako odpověď, vyvolaná systemickou injekcí běžné vakcíny.

Podstatu vynálezu tedy tvoří bezpečné a účinné pomocné prostředky pro vakciny, které se snadno vyrábějí a obsahují alespoň jeden polyoxyethylenalkylether nebo -ester a alespoň jedno další neiontové smáčedlo.

Smáčedla, použitá k tomuto účelu, mohou být ve vodném roztoku nebo mohou vytvářet suspenze částicové struktury, například vakuoly nebo micelly. S výhodou jde o vodné roztoky nebo micelly.

Polyoxyethylenethery nebo -estery, které je možno zpracovat do pomocného prostředku pro vakcínu podle vynálezu, je možno vyjádřit obecným vzorcem I:

HO (CH₂CH₂O) _n-A-R (I) kde n znamená 1 až 50,

A znamená chemickou vazbu nebo skupinu -C(O)-, a R znamená Cl-C50alkyl nebo fenylCl-C50alkyl.

Podle jednoho z možných provedení vynálezu se tedy vynález týká vakcíny, která obsahuje polyoxyethylenalkylether obecného vzorce I, v němž n znamená 1 až 50, s výhodou 4 až 24, zvláště 6 až 12 a nej výhodněji 9. Symbol R znamená C1-C50 alkyl, s výhodou C4-C20alkyl, zvláště výhodně C12alkyl. Koncentrace polyoxyethylenetherů se pohybuje v rozmezí 0,1 až 25 %, s výhodou 0,1 až 10 % a zvláště 0,1 až 1 %. Vhodné polyoxyethylenethery se volí ze skupiny polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-stearylether, polyoxyethylen-8-stearylether, polyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen-35-laurylether a polyoxyethylen-23-laurylether.

V nejvýhodnějším provedení je použitým polyoxyethylenalkyletherem polyoxyethylen-9-laurylether, označovaný jako laureth 9. Alternativní názvy pro polyoxyethylenlaurylether jsou uvedeny v seznamu CAS. Číslo polyoxyethylen-9-lauryletheru v seznamu CAS je 9002-92-0. Polyoxyethylenethery, například polyoxyethylenlaurylether, jsou popsány také v publikaci Merck index (12. vydání, č. 7717, Merck & Co. Inc. Whitehouse Station, N. J., USA, ISBN 0911910-12-3, podle této publikace je možno uvedenou látku použít v prostředcích pro místní znecitlivění, proti svědění a podobně. Všechny polyoxyethylenethery nebo -estery je možno označit za neiontová smáčedla. Laureth 9 je možno připravit reakcí ethylenoxidu s dodecylalkoholem a obsahuje v průměru 9 ethylenoxidových jednotek.

V případě, že se užije směs smáčedel obecného vzorce I, znamená n průměrný počet ethylenoxidových jednotek, přítomných ve všech smáčedlech v použité směsi.

Poměr délky polyoxyethylenového úseku k délce alkylového řetězce ve smáčedle, to znamená poměr n k délce alkylového řetězce, ovlivňuje rozpustnost těchto • · • 9 • · ► ·· · · smáčedel ve vodném prostředí. To znamená, že pomocné prostředky podle vynálezu mohou vytvořit roztok nebo mohou vytvořit částicové struktury, například micelly nebo vakuoly. V případě roztoku je možno pomocné prostředky podle vynálezu snadno sterilizovat například průchodem přes membránu s otvory 0,22 pm, mimo to jsou tyto roztoky jednoduché pro podání a je možno je připravit jednoduchým způsobem bez použiti GMP a QC jako v případě částicových struktur. Některé polyoxyethylenethery, například laureth 9, jsou schopné vytvářet roztoky bez vakuol. Avšak polyoxyethylen-8-palmitoylether (CigEg) je schopen vytvářet vakuoly. V jednom z možných provedení se tedy při tvorbě pomocného prostředku podle vynálezu užívají vakuoly polyoxyethylen-8-palmitoyletheru v kombinaci s alespoň jedním dalším neiontovým smáčedlem.

Polyoxyethylenalkylether, který tvoří součást pomocného prostředku podle vynálezu má s výhodou hemolitickou účinnost. Tuto hemolitíckou účinnost polyoxyethylenalkyletheru je možno měřit in vitro podle následujícího testu a je možno ji vyjádřit jako nejvyšší koncentraci smáčedla, při níž ještě nedochází k rozrušení červených krvinek.

Provedení pokusu

1. Krev, čerstvě odebraná morčatům, se promyje fyziologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS celkem 3krát pomocí odstředivky. Pak se červené krvinky znovu uvedou do suspenze v původním objemu, načež se krev dále lOkrát ředí pomocí PBS.

• · · · • ♦ · • · · ♦· s obsahem

2.

vždy μΐ suspenze krve se přidá k 800 μΐ PBS dvojnásobného ředění smáčedla.

3. Po 8 hodinách se rozsah hemolýzy stanoví vizuálně nebo se měří optická hustota supematantu. Přítomnost červeného supematantu, který absorbuje světlo s vlnovou délkou 570 nm, prokazuje přítomnost hemolýzy.

4. Výsledky se vyjádří jako koncentrace prvního ředění smáčedla, při níž již nedochází k hemolýze.

Při experimentální variabilitě takových biologických zkoušek mají polyoxyethylenalkylethery nebo smáčedla obecného vzorce I podle vynálezu s výhodou hemolytickou účinnost v rozsahu přibližně 0,5 až 0,0001 %, s výhodou 0,05 až 0,0001 %, zvláště výhodně 0,005 až 0,0001 % a nejvýhodněji 0,003 až 0,0004 %. V ideálním případě by měly mít polyoxyethylen ethery nebo -estery podobnou účinnost (lišící se nejvýš o jeden řád) jako polyoxyethylen-9-laurylether nebo polyoxyethylen-8-stearylether.

K polyoxyethylenalkyletheru nebo -esteru se přidá alespoň jedno další neiontové smáčedlo, kterým může být jakékoliv smáčedlo s vhodnými povrchově aktivními vlastnostmi. Vhodná smáčedla pro toto použití jsou popsána například v souhrnné publikaci Surfactant systems, ed. Attwood and Florence (1983, Chapman and Halí).

Výhodnými neiontovými smáčedly jsou smáčedla, spadající do obecného vzorce I, například oktoxynoly a estery polyoxyethylensorbitanu. Zvláště výhodnými • 4 ► 44 • 4 4 ♦ · 4 > 44 4 ·· *44 4

4 4

4 4 4 4 oktoxynoly jsou Triton X-45, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114,

Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton-57, Triton N-101, Triton N-128, zvláště výhodnou látkou je Triton X-100. Řada typu oktoxynol včetně terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu, Tritonu X-100 je rovněž popsána v Merck Index po číslem 6858 (s. 1162, 12.

vydání, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., USA, ISBN 0911910-12-3).

Dalšími výhodnými neiontovými smáčedly jsou estery polyoxyethylensorbitanu. Tyto estery včetně polyoxyethylensorbitanmonooleátu, Tween 80 jsou rovněž popsány v publikaci Merck Index po číslem 7742 (s. 1308, 12. vydání, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N. J., USA, ISBN 0911910-12-3). Jak oktoxynoly, tak estery polyoxyethylensorbitanu se běžně dodávají (Sigma Inc.). Výhodnou látkou tohoto typu je polyoxyethylensorbitanmonooleát, Tween 80™. .

Nejvýhodnější pomocné prostředky podle vynálezu obsahují polyoxyethylenalkylether a některý z oktoxynolů, například terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100. Tato kombinace může být ještě doplněna esterem polyoxyethylensorbitanu, jako je polyoxyethylensorbitan monooleát, Tween 80. Podle velmi výhodného provedení se v tomto případě jako polyoxyethylenalkylether užije polyoxyethylen-9-alurylether a současně se jako oktoxynol použije terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100.

K výslednému prostředku je ještě možno přidat iontové smáčedlo, např. soli žlučových kyselin nebo jiné deriváty těchto kyselin.

·* ftft • · ♦ 9

9 9 ···

9

9999 99 »* ·«· ·

99 •9 99 * · 9

9 9

9 9 9 • · · ««ft*

Pomocný prostředek tedy může obsahovat polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I, oktoxynol, popřípadě ester polyoxyethylensorbitanu a popřípadě ještě sůl žlučové kyseliny nebo jejich derivát. Ve výhodném provedení obsahuje pomocných prostředek podle vynálezu kombinaci polyoxyethylen-9-lauryletheru, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu, Tritonu X-100, polyoxyethylensorbitanmonooleát a deoxycholát sodný.

Koncentrace polyoxyethylenalkyletheru nebo -esteru, například polyoxyethylen-9-lauryletheru v pomocném prostředku podle vynálezu se bude v typických případech pohybovat v rozmezí 0,001 až 20 %, s výhodou 0,001 až 10 %, zvláště 0,001 až 1 % a nejvýhodněji 0,001 až 0,8 % nebo přibližně 0,5 % (g/100 ml). K této koncentraci se přidá další neiontové smáčedlo, které není typu polyoxyethylenetheru nebo -esteru. Toto neiontové smáčedlo, popřípadě každé další neiontové smáčedlo bude přítomno v konečné vakcině v koncentraci 0,001 až 20, s výhodou 0,01 až 10 a zvláště až 2 % (g/100 ml) . V případě, že se užijí další dvě neiontová smáčedla, jsou tato smáčedla v konečném prostředku s výhodou přítomna každé v koncentraci až 2 %, typicky v koncentraci až 0,6 %. V případě, že se užijí 3 další neiontová smáčedla nebo ještě větší počet neiontových smáčedel, jsou tyto látky obvykle přítomny až do koncentrace 1 % každá, typicky jsou přítomny stopy až 0,2 % nebo 0,1 % každé z těchto látek. Vakcína podle vynálezu může obsahovat jakoukoliv směs smáčedel. Neiontová smáčedla, uvedená svrchu, mají následující výhodné koncentrace ve výsledné vakcině: oktyl- nebo nonylfenoxypolyoxyethanoly, například Triton X-100 nebo jiná smáčedla série Triton 0,001 až 20 %, s výhodou 0,001 až 10 %, zvláště 0,001 až • 44 4

44 ♦ · 4 · · · • 44 « • · 4 •4 4444 % a nejvýhodněji 0,005 až 0,1 % (g/100 ml) polyoxyethylensorbitanu, například Tween 80, nejvýhodněji přibližně 0,1 % (g/100 ml).

a estery 0,01 až 1 %,

Celková koncentrace smáčedla ve vakcíně nebo v pomocném prostředku podle vynálezu včetně polyoxyethylenetheru nebo -esteru a jednoho nebo většího počtu dalších neiontových smáčedel se typicky pohybuje v rozmezí 0,001 až 40 %, s výhodou 0,001 až 20 %, zvláště 0,001 až 10 %, ještě výhodněji 0,001 až 1 % a nejvýhodněji 0,001 až 0,7 % (g/100 ml).

Vakcinu podle vynálezu je možno použít jako ochranný prostředek u savců, kteří jsou ohroženi určitým onemocněním nebo jím trpí. Vakcinu je možno aplikovat na sliznici, například na sliznici dutiny ústní, na střevní sliznici, na poševní sliznici, sliznici konečnímu nebo na nosní sliznici. Vakcinu je možno podávat ve formě kapek, postřiku nebo suchého prášku. Do rozsahu vynálezu spadají rovněž vakciny, určené k rozprašování ve formě aerosolu. Součást vynálezu tvoří také enterosolventní prostředky, například kapsle, odolné proti působení žaludeční šťávy, granuláty pro perorální podání, čípky pro rektální nebo vaginální podání a podobně. Vakcinu podle vynálezu je možno použít ke zvýšení imunogenity antigenů, nanášených na pokožku, transdermálně nebo transkutánně. Mimo to je možno pomocné prostředky podle vynálezu podávat i parenterálně, například nitrosvalově nebo podkožně. V případě použití na nosní sliznici jde s výhodou o vakciny, které mají hemolytickou povahu.

V závislosti na způsobu podání je možno k aplikaci použít řadu pomůcek. Například při aplikaci na nosní ·· 9999

9 9

9 9 99 •9 9 9 ··· ♦··9 99

99 * ♦ · 9 • 9 9

9 9

9999 sliznici je možno použít rozstřikovač, například běžně dodávaný Accuspray™ (Becton Dickinson).

Výhodná zařízení pro použití k aplikaci na nosní sliznici jsou taková zařízení, která nejsou závislá na tlaku, který použije uživatel. Tato zařízení mají určitý práh, při němž dojde k uvolnění určité dávky z trysky. Dávka se uvolní pouze při překročení prahové hodnoty tlaku. Tato zařízení snadno dosahují pravidelný rozměr kapek. Tato zařízení jsou v oboru známa a byla popsána například v dokumentech WO 91/13281 a EP 311863B. Nyní se taková zařízení běžně dodávají (Pfeiffer GmbH).

Výhodná zařízení pro intranazální aplikaci produkují kapky ve vodě v rozmezí 1 až 200, s výhodou 10 až 120 μπι. V případě menší velikosti kapek než 10 μπι vzniká riziko inhalace, takže je žádoucí, aby nejvýš 5 % kapek mělo průměr nižší než 10 μπι. Kapky s vyšším průměrem než 120 μτη se nerozprašují tak dobře jako malé kapky, takže je žádoucí, aby nejvýš 5 % kapek mělo uvedený rozměr.

Výhodnou aplikací na nosní sliznicí může být aplikace pomocí přístroje, který obsahuje vždy 2 poddávky jednotlivé dávky, z nichž každá se aplikuje do jedné nosní dírky. V souvislosti s tímto provedením se vynález týká také balíčku s obsahem takového zařízení pro aplikaci vakciny na nosní sliznici.

V některých případech může vakcina obsahovat ještě další složky. Pomocný prostředek podle vynálezu může obsahovat sůl žlučové kyseliny nebo její derivát. S výhodou je derivátem žlučové kyseliny sůl a zvláště sodná ·«»· • 9

999

sůl. Jako příklad žlučových kyselin a jejich derivátů je možno uvést kyselinu žlučovou jako takovou, kyselinu deoxycholovou, taurodeoxycholát, kyselinu chenodeoxycholovou, lithocholovou, ursodeoxycholovou, hyodeoxycholovou a další deriváty jako glyko-, tauro-, amidopropyl-l-propansulfono-, amidopropyl-2-hydroxy-1-propansulfonové deriváty s vrchu uvedených žlučových kyselin, použitelný je také N,N-bis-(3D-glukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláště výhodným případem je deoxycholát sodný NaDOC v konečné vakcině.

Pomocný prostředek podle vynálezu je výhodný ve formě vodného roztoku nebo suspenze bez obsahu vakuol. Prostředky tohoto typu se snadno reprodukovatelně připravují a snadno se sterilizují, užívá se obyčejně filtrace přes membránu s průměrem otvorů 450 nebo 220 nm. Tyto prostředky se také snadno podávají na nosní sliznici ve formě postřiku, aniž by došlo k rozkladu složité fyzikální struktury prostředku. Například polyoxyethylen-9-laurylether v kombinaci s prostředkem Triton X-100, v některých případech mohou být přítomny i malé micelly.

Podle jednoho provedení vynálezu je tedy možné vyvolat nebo zesílit odpověď imunitního systému hostitele tak, že se smísí antigen a pomocný prostředek podle vynálezu a vzniklá směs se podá hostiteli. S výhodou se vakcína podává na povrch sliznice, zvláště nosní sliznice. V případě podání nosní sliznici se směs s výhodou aplikuje ve formě postřiku. Ve výhodném provedení dojde podáním vakcíny podle vynálezu na nosní sliznici k systemické odpovědi imunitního systému. Pokud jde o vakcinaci, může jít o první dávku nebo o další dávky, které mají udržet nebo zvýšit koncentraci protilátek, ve

444 • 4 • 4

4 4

4··· výhodném provedení obsahuje vakcína antigen chřipkového viru. Výhodným pomocným prostředkem pro nanášení na nosní sliznici při tomto postupu je kombinace polyoxyethylenalkyletheru a oktoxynolu, například jde o výhodnou kombinaci polyoxyethylen-9-lauryletheru a terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu, Triton X-100, popřípadě může pomocný prostředek dále obsahovat ester polyoxyethylensorbitanu, například jeho monooleát,

Tween 80 a/nebo sůl žlučových kyselin nebo jejich derivát, například deoxycholát sodný.

Je zřejmé, že pomocné prostředky podle vynálezu bude možno využít pro výrobu vakcin, obsahujících antigeny z nejrůznějších zdrojů. Může jít například o lidské antigeny, bakteriální antigeny, virové nukleové kyseliny, antigeny, odvozené od různých patogenů, antigeny a antigenní prostředky, odvozené od nádorů, od hostitele, včetně peptidů GnRH a IgE, využít je možno také rekombinantní proteiny nebo peptidy a chimérní fúzní proteiny.

Vakcína podle vynálezu s výhodou obsahuje antigen nebo antigenní prostředek, schopný vyvolat odpověď imunitního systému proti lidskému patogenů, přičemž antigen nebo antigenní prostředek může být odvozen od HIV-1 (jako tat, nef, gpl20 nebo gpl60), od lidského herpetického viru, například gD nebo jeho derivátu nebo může jít o časný protein, jako ICP27 z HSV1 nebo HSV2, dále může jít o antigen cytomegaloviru (esp Human), jako gB nebo deriváty, antigen rotaviru včetně živého zeslabeného viru, viru Epstein Barr, jako gp350 nebo deriváty, viru Varicella Zoster, jako gpl, II a IE63 nebo viru hepatitidy, například viru hepatitidy B, například ·· ··*« »» ,, • · · ♦ · · · • * »·· · < · * · · · · · · • · »« 9999 j eho hepatitidy E • » · · * * · • » · * * • · ·»·· ·» povrchového antigenu viru hepatitidy B nebo derivátu, viru hepatitidy A, hepatitidy C a nebo jiných virových pathogenů, jako jsou paramyxoviry, virus Respirátory Syncytial (například proteiny F a G nebo jejich deriváty, virus parainfluenzy, spalniček, příušnic, lidský papillomavirus, jako HPV6, 11, 16, 18 a podobně), flavivirus, například virus žluté horečky, Dengue nebo klíšťové encafalitidy a japonské encefalitidy nebo chřipkový virus (živý nebo inaktivovaný neporušený virus, části viru, pěstované na vajíčkách nebo buňkách MDCK nebo Věro nebo může jít o chřipkové virusomy, popsané v publikaci R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920, nebo čištěné nebo rekombinantní proteiny, jako HA, NP, NA nebo M nebo jejich kombinace) nebo může jít o antigeny, odvozené od bakteriálních pathogenů, jako jsou Neisseria spp. včetně N. gonorrhea a N. meningitidis (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, proteiny, schopné vázat transferrin nebo laktoferrin, PiLC a adhesiny), S. pyogenes (například proteiny M nebo jejich fragmenty, proteáza C5A, kyseliny lipoteichové),

S. agalactiae, S. mutans, H. ducreyi, Moraxella spp, včetně M. catarrhalis, označovaná také jako Branhamella catarrhalis (například adhesiny a invasiny s vysokou a nízkou molekulovou hmotností, Bordetella spp. včetně B. pertussis (například pertactín, toxin pertusse nebo jeho deriváty, vláknitý hemagglutinin, adenylátcykláza nebo fimbriae), B. parapertussis a B. bronchiseptica, Mycobacterium spp. včetně M. tuberculosis (například ESAT6, Antigen 85A, -B nebo -C) , M. bovis,' M. leprae,

M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis, Legionella spp. včetně L. pneumophila, Escheríchia spp. včetně enterotoxické E. coli (například kolonizační faktory, toxin, labilní při působení tepla nebo jeho deriváty, ** ’· »« ··*« ·· »· * íi » · ·« · ·»· • » · · · ·»· « fi » • ·.·«., » « i » , * · · · · · · · toxin, stabilní za tepla nebo jeho deriváty), enterohemorragická E. coli, enteropathogenni E. coli (například toxin, podobný shigatoxinu nebo jeho deriváty), Vibrio spp. včetně V. cholerae (například cholerový toxin nebo jeho deriváty), Shigella spp. včetně S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii, Yersinia spp. včetně Y. enterocolitica (například protein Yop),

Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Campylobacter spp. včetně C. jejuni (například toxiny, adhesiny a invasiny) a C. coli, Salmonella spp. včetně S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis, Listeria spp. včetně L. monocytogenes, Helicobacter spp. včetně H. pylori (například uráza, kataláza, vakuolační toxin),

Pseudomonas spp. včetně P. aerugínosa, Staphylococcus spp. včetně S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus spp. včetně E. faecalis, E. faecium, Clostridium spp. včetně C. tetani (například tetanotoxin a jeho deriváty),

C. botulinum (například botulotoxin a jeho deriváty),

C. difficile (například toxin A a B a jeho deriváty), Bacillus spp. včetně B anthracis (například botulotoxin a jeho deriváty, Corynebacteríum spp. včetně C. diphtheriae (například toxin záškrtu a jeho deriváty, Borrelia spp. včetně B. burgdorferi (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.andersonii (například OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii, Ehrlichia spp. včetně E. equi a činidla pro lidskou granulocytární ehrlichiózu, Ríckettsía spp. včetně R. rickettsíi, Chlamydia spp. včetně C. trachomatis (například MOMP a proteiny, které se váží na heparin), C. pneumoniae (například MOMP a proteiny, které se váží na heparin), • · · · · ··· • ··· * · · · • · · · · ···· «· «· ··«

C. psittaci, Leptospira spp. včetně L. interrogans, Treponema spp. včetně T. pallidum (například vzácné proteiny zevní membrány), T. denticola,

T. hyodysenteriae, může jít také o antigeny, odvozené od parazitů, jako jsou Plasmodium spp. včetně P. falciparum, Toxoplasma spp. včetně T. gondii (například SAG2, SAG3, Tg34), Entamoeba spp. včetně E. histolytica, Babesia spp. včetně B. microti, Trypanosoma spp. včetně T. cruzí, Giardia spp. včetně G. lamblia, Leshmania spp. včetně L. major, Pneumocystis spp. včetně P. carinii,

Trichomonas spp. včetně T. vaginalis, Schistosoma spp. včetně S. mansoni nebo antigeny, odvozené od kvasinek, jako Candida spp. včetně C. albicans nebo Cryptococcus spp. včetně C. neoformans.

Výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od Streptococcus spp. včetně S. pneumoniae (například kapsulární polysacharidy a jejich konjugáty, PsaA, PspA, streptolysin, protein, schopné vázat cholin) a proteinový antigen pneumolysin (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007, Rubíns a další, Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) a také mutované detoxifikované deriváty tohoto antigenu, popsané v dokumentech WO 90/06951 a WO 99/03884. Další výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od Haemophilus spp. včetně H. influenzae typ B (například PRP a jeho konjugáty), H. influenzae, u nějž není možno určit typ, například OMP26, adhesiny s vysokou molekulovou hmotností, P5, P6, protein D a lipoprotein D, fimbrin a peptidy, odvozené od fimbrinu podle US 5843464 nebo varianty ve vícenásobných kopiích a jejich fúzní proteiny. Další výhodné bakteriální vakcíny obsahují antigeny, odvozené od Moraxella catarrhalis (včetně vesikulů vnější membrány a ·· ·· • · · • · · ·· «»«·

4 4 • · • ···

OMP106 podle WO 97/41731) a antigeny odvozené od

Neisseria meningitidis B (včetně vesikulů vnější membrány a Nspa podle WO 96/29412).

Deriváty povrchového antigenů hepatitidy B jsou v oboru známé a zahrnují mimo jiné antigeny PreSl a PreS2 S, popsané v evropských patentových spisech EP 414374,

EP 304578 a EP 198474. V jednom z výhodných provedení obsahuje vakcína podle vynálezu antigen HIV-1, gpl20, zvláště v případě exprese v buňkách CHO. Podle dalšího možného provedení obsahuje vakcína podle vynálezu gD2t ve svrchu uvedeném významu.

Ve výhodném provedení vakcíny podle vynálezu s obsahem pomocného prostředku podle vynálezu obsahuje vakcína antigen, odvozený od lidského papilomaviru HPV, který je příčinou vzniku genitálních bradavic, HPV 6, HPV 11 a další) a mimo to některé kmeny dávají vznik zhoubným nádorům děložního hrdla (HPV16, HPV18 a další).

Zvláště výhodné vakcíny pro prevenci nebo léčení genitálních bradavic obsahují částice LI nebo capsomery a fuzní proteiny, obsahující jeden nebo větší počet antigenů ze skupiny proteinů E6, E7, LI a L2 kmenů HPV 6 a HPV 11.

Nejvýhodnější formou fúzního proteinu je L2E7, popsaný v dokumentu WO 96/26277 a protein D (1/3)-E7, popsaný v GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).

Výhodná vakcína pro prevenci nebo léčení infekce nebo zhoubného nádoru děložního hrdla může obsahovat antigeny HPV 16 nebo 18. Jde například o monomery • · • ··· antigenu LI nebo L2, dále o antigeny LI nebo L2,. přítomné společně jako částice VLP, podobné viru nebo může jít o samotný protein LI ve struktuře capsomeru nebo ve formě VLP. Tyto antigeny, částice podobné viru a capsomery jsou samy o sobě známé a byly popsány například v dokumentech WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 a WO 93/02184.

Další časné proteiny mohou být ve vakcíně obsaženy jako takové nebo ve formě fúzních proteinů, jde například o E7, E2 nebo E5, ve zvláště výhodném provedení obsahuje vakcina VLP s obsahem fúzního proteinu L1E7 podle dokumentu WO 96/11272.

Zvláště výhodným antigenem HPV 16 jsou časné proteiny E6 nebo E7, spojené s proteinem D jako nosičem za vzniku fúzních proteinů D-E6 nebo D-E7 z kmene HPV 16 nebo kombinaci takových proteinů nebo kombinaci E6 nebo E7 s L2 podle WO 96/26277.

V dalším možném provedení mohou být časné bílkoviny HPV 16 nebo 18, E6 a E7 v jediné molekule, s výhodou jako fúzní protein D-E6/E7. Taková vakcina může popřípadě obsahovat proteiny E6 nebo E7 nebo oba tyto proteiny z HPV 18, s výhodou ve formě fúzního proteinu D-E6 nebo D-E7 nebo D-E6/E7.

Vakcina podle vynálezu může mimo to obsahovat antigeny z jiných kmenů HPV, s výhodou jde o kmeny HPV 6, 11, 31, 33 nebo 45.

Vakcina podle vynálezu může dále obsahovat antigeny, odvozené od parazitů, vyvolávajících malárii. Například výhodnými antigeny Plasmodia falciparum jsou RTS,S a • · · · • · »

• · • · · ·

TRAP. RTS je hybridní protein, který obsahuje v podstatě celý C-konec circumsporozoitu (CS), jde o protein P. falciparum, vázaný čtyřmi aminokyselinami části preS2 povrchového antigenu hepatitidy B na povrchový antigen S viru hepatitidy B. Úplná struktura tohoto materiálu byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/EP92/02591, zveřejněné pod číslem WO 93/10152 s prioritou z britské přihlášky číslo 9124390.7. Při expresi v kvasinkách je RTS produkován jako částice lipoproteinu a při současné expresi s antigenem S z HBV vzniká smíšená částice, známá jako RTS,S. Antigeny TRAP jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce číslo PCT/GB89/00895, zveřejněné pod číslem WO 90/01496. Výhodným provedením je vakcina proti malárii, v níž je antigenem kombinace antigenů RTS,S a TRAP. Dalšími antigeny plasmodia, které mohou být zařazeny do vícevalentní vakcíny proti malárii jsou antigeny P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAPI, RAP2, sequestrin, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs 230 a další analogy Plasmodium spp.

Vakcina podle vynálezu může také obsahovat protinádorový antigen a je možno ji využít pro imunotherapeutické léčení zhoubných nádorů. Pomocný prostředek je v tomto případě možno použít spolu s příslušnými antigeny zhoubných nádorů prostaty, mléčné žlázy, tlustého střeva a konečníku, plic, slinivky břišní, ledvin nebo s antigeny melanomu. Jako příklady takových antigenů je možno uvést MÁGE 1 a MÁGE 3 nebo jiné antigeny MÁGE v případě léčení melanomu, PRÁME, BAGE nebo GAGE podle publikací Robbins a Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, s. 628-636, Van den ···· ·· • ·

Eynde a další, International Journal of Clinical & Laboratory Research, 1997, Correale a další, 1997,

Journal of the National Cancer Institute 89, s. 293. K expresi těchto antigenů dochází u široké škály nádorových typů, například u melanomu, plicního karcinomu, sarkomu a karcinomu močového měchýře. Je také možno použít další antigeny, specifické pro některé nádory, může jít například o antigen PSA, specifický pro prostatu, o antigeny Her-2/neu, KSA (GA733), MUC-1 a karcinoembryonální antigen CEA. Podle jednoho provedení vynálezu se vynález týká vakcíny, která obsahuje pomocný prostředek podle vynálezu a protinádorový antigen.

Antigen může být sám o sobě peptidovým hormonem, může jít například o hormon, uvolňující gonadotropin s plnou délkou GnRH, WO 95/20600, o odvozený peptid s 10 zbytky aminokyselin, vakcíny tohoto typu jsou rovněž vhodné k léčení řady zhoubných nádorů nebo pro imunokastraci.

Předpokládá se, že pomocné prostředky podle vynálezu budou použity také ve vakcínách, obsahujících antigeny, odvozené od Borrelia sp. Například mohou takovými antigeny být nukleové kyseliny, antigeny nebo antigenní prostředky, odvozené od pathogenního organismu, rekombinantní proteiny nebo peptidy a chimérní fúzní proteiny. Vhodným antigenem je například OspA. OspA může být úplný protein v lipidované formě, získaný z hostitelských buněk E. coli, označovaný Lipo-OspA nebo může jít o nelipidovaný derivát. Tyto nelipidované deriváty zahrnují nelipidovaný fúzní protein NSl-OspA, který zahrnuje prvních 81 N-terminálních aminokyselin nestrukturního proteinu NS1 chřipkového viru a úplný • · • · ·· ·· • · · * · protein OspA, další fúzní protein MDP-OspA je nelipidovanou formou OspA, nesoucí 3 přídatné

N-terminální aminokyseliny.

Vakcíny podle vynálezu je možno použít k prevenci nebo k léčení alergií. Vakcíny tohoto typu budou obsahovat antigeny, specifické pro alergen, například Der pl a také antigeny nespecifické pro alergeny, například peptidy, odvozené od lidského IgE, zahrnující dekapeptid podle EP 477231.

Nejvýhodnější vakcíny pro vyvolání odpovědi imunitního systému jsou vakcíny, obsahující antigen chřipkového viru. Usmrcené viry a jejich deriváty je možno získat běžným pěstováním na kuřecích zárodcích nebo je možno je odvodit pomocí jakýchkoliv jiných nových postupů, při nichž se k pěstování viru používá tkáňová kultura. Vhodnými buněčnými substráty pro pěstování viru jsou například buňky psích ledvin, jako MDCK nebo buňky podobné buňkám MDCK, dále buňky opičích ledvin, například buňky AGMK včetně buněk Věro nebo jakékoliv jiné buňky, které jsou vhodné pro produkci chřipkového viru pro účely vakcíny. Vhodným buněčným substrátem jsou například také lidské buňky MRC-5. Vhodné buněčné substráty nejsou omezeny na buněčné linie. Je možno použít také primární buňky, například fibroblasty kuřecích zárodků. Antigen chřipkového viru je možno získat řadou běžně užívaných postupů, například postupem, popsaným v patentovém spisu DD 300 833. Běžně se dodává prostředek Fluarix™ (SmithKline Beecham), obsahující složený antigen, tento prostředek v kombinaci s pomocným prostředkem podle vynálezu může vytvořit výhodné provedení vakcíny podle vynálezu.

Vakcína podle vynálezu proti chřipce je s výhodou multivalentní vakcína, schopná chránit proti dvěma nebo většímu počtu chřipkového viru. S výhodou jde o trivalentní vakcínu, obsahující antigeny tří kmenů. Běžná vakcína obvykle obsahuje antigeny tří kmenů, a to dvou kmenů A a jednoho kmenu B chřipkového viru. Avšak monovalentní vakciny, použitelné například při pandemických situacích, rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Monovalentní vakcína bude obsahovat s největší pravděpodobností antigen z jediného kmene A chřipkového viru.

Výhodná vakcína může tedy obsahovat antigen chřipkového viru, vypěstovaného na kuřecích zárodcích nebo na tkáňové kultuře, dále polyoxyethylenalkylether a alespoň jedno další neiontové smáčedlo, popřípadě sůl žlučové kyseliny nebo její derivát. Ve výhodném provedení vakcína obsahuje antigen chřipkového viru, polyoxyethylen-9-laurylether a Triton X-100™. Ve výhodném provedení může vakcína obsahovat ještě ester polyoxyethylensorbitanu, například Tween80™ a/nebo deoxycholát sodný.

Množství proteinu v každé dávce vakciny se volí jako množství, které vyvolává imunoprotektivní odpověď bez značných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude měnit v závislosti na použitém specifickém imunogenu a na způsobu podání. Obvykle se předpokládá, že jednotlivá dávka bude obsahovat 1 až 1000, s výhodou 1 až 500, zvláště 1 až 100 a nejvýhodněji 1 až 50 pg proteinu. Optimální množství vakciny je možno ověřit standardními pokusy, při nichž se pozoruje odpověď imunitního systému :··· • · ·· • · u různých subjektů. Po prvním očkování mohou být podávány ještě další dávky v příslušném časovém odstupu.

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje pomocný prostředek polyoxyethylenalkylether ve směsi s dalším neiontovým smáčedlem, které působí synergně. Synergii je možno pozorovat v odpovědi imunitního systému na kombinovaný prostředek, přičemž tato odpověď je vyšší, než odpověď vznikající po podání jednotlivých složek samostatně. Synergii je možno pozorovat také v případě, v němž nízké dávky polyoxyethylenetherů a dalšího neiontového smáčedla vyvolají dostatečnou odpověď imunitního systému, přestože každá ze složek jednotlivě nevyvolá podstatnější nebo prokazatelnou odpověď imunitního systému.

V jednom z dalších možných provedení obsahuje vakcína podle vynálezu polyoxyethylenalkylether nebo -ester a alespoň jedno další neiontové smáčedlo, přičemž antigen není zachycen ve vakuole neiontového smáčedla.

Vakcíny podle vynálezu je také možno podávat perorálně. V takových případech mohou být přítomny další pomocné látky, například alkalické pufry nebo může být vakcína uložena do kapslí, rozpouštějících se až ve střevech nebo může být zpracována na mikrogranulát. Vakcíny podle vynálezu je také možno podávat vaginálně. V takovém případě mohou pomocné látky zahrnovat emulgátory, polymery, jako Carbopol^R a další známé stabilizátory vaginálních krémů a čípků. Další možnou cestou podání je rektální způsob podání. V tomto případě je pomocnou látkou vosk nebo polymer pro výrobu čípku.

► ·« ·· · · · · ·· ·· :: : í :í.. $ r J » · · · · · · · · · * ·

Vakciny podle vynálezu a pomocné prostředky podle vynálezu je možno použít pro léčebné i preventivní použití. Je tedy možno léčit savce, ohrožené nebo trpící infekčním onemocněním nebo zhoubným nádorem, alergií nebo autoimunitním onemocněním. Příprava vakcin obecně byla popsána v souhrnném materiálu New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978.

Podle jednoho z možných provedení vynálezu se vynález týká použití neiontových smáčedel, například polyoxyethylenalkyletheru nebo -esteru obecného vzorce I a oktoxynolu při výrobě pomocného prostředku. Vynález se rovněž týká použití polyoxyethylen alkyletheru nebo -esteru obecného vzorce I, oktoxynolu a antigenu pro výrobu vakciny. Pomocný prostředek a vakcina mohou popřípadě dále obsahovat ester polyoxyethylensorbitanu.

Ve všech těchto případech je výhodným polyoxyethylenalkyletherem polyoxyethylen-9-laurylether a výhodným oktoxynolem je terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100.

V dalším možném provedení vynálezu je možno pomocný prostředek podle vynálezu kombinovat s jinými pomocnými prostředky včetně cholerového toxinu a jeho podjednotky B, enterotoxinu LT, labilního za tepla, z E. coli, použít je možno také jeho podjednotku LTB a detoxifikované verze této látky, například mLT. Dále je možno použít monofosforyllipid A a jeho netoxický derivát,

3-0-deacylovaný monofosforyllipid A, 3D-NPL, popsaný v GB 2220211, dále jsou použitelné imunologicky účinné saponinové frakce, například Quil A, odvozené od kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina a jeho « r <

: <

• ·

deriváty, například QS21 podle US 5057540 a také oligonukleotidový pomocný systém CpG, popsaný ve WO 96/02555, zvláště 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEQ ID NO. 1).

V tomto provedení je zvláště výhodná kombinace polyoxyethylenalkyletheru, například polyoxyethylen-9-lauryletheru, dalšího neíontového smáčedla, jako terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu, Tritonu X-100 a 3-0-deacylovaného monofosforyllipidu A, 3D-MPL. Toto výhodné provedení může popřípadě dále obsahovat ester polyoxyethylensorbitanu,· jako Tween80™ a/nebo sůl nebo derivát žlučové kyseliny, jako deoxycholát sodný. Zvláště výhodné jsou vakcíny, obsahující uvedený pomocný prostředek a antigeny chřipkového viru, s výhodou složené antigeny.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsob stanovení odpovědi ve formě protilátek (Ab) v krevním séru

ELISA pro měření specifických Ig Abs proti chřipce u opic

Imunoplotny Maxisorp Nunc se povlékají přes noc při teplotě 4 °C tak, že se užije koncentrace 1 μς/ιηΐ HA chřipkového viru, inaktivovaného β-propiolaktonem BPL (SSD GmBH, Drážďany, SRN) v PBS, užije se 50 μΐ tohoto • · • •ftft · · ···

materiálu na jedno vyhloubení plotny. Volná místa na plotně se blokují (1 hodina, 37 °C) při použití saturačního pufru, kterým je PBS, obsahující 1 % BSA,

0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, Tween 20. Pak se vytvoří sériové, vždy dvojnásobné ředění referenčního séra v saturačním pufru, které se užije v množství 50 μΐ na jedno vyhloubení a vytvoří se standardní křivka, jde o sérum, jehož střední bod titrace se vyjádří v jednotkách ELISA/ml a hodnoty se uloží do řady A. Mimo to se inkubují vzorky séra, počínaje ředěním 1/100 v řadách B až H, inkubace trvá 1 hodinu a 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se pak 3krát promyjí promývacím pufrem PBS s obsahem 0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, Tween 20. Pak se inkubuje biotinylovaný kozí Ig proti lidským tkáním (Amersham) v ředění 1/3000 v saturačním pufru v množství 50 μΐ/vyhloubení celkem 1 h a 30 minut při teplotě 37 °C. Po trojnásobném promytí a následném přidání konjugátu streptavidinu a peroxídázy z křenu (Amersham) se plotny ještě 5krát omyjí a pak se inkubují 20 minut při teplotě místnosti s 50 μΐ/vyhloubení vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H2O2 0,03 % v 50 mM citrátového pufru o pH 4,5). Vyvíjení se zastaví tak, že se přidá 50 μΐ 2N H₂S0₄/vyhloubení. Optická hustota se odečítá při vlnové délce 492 a 630 nm při použití odečítacího zařízení Biorad 3550. Titr protilátek se vypočítává ze čtyř parametrů matematickým postupem při použití programu SoftMaxPro.

Hemaglutinační inhibiční účinnost HAI Flu-specifického séra Abs u opic • Α i· A'»*· ·· ** • ϊ i V” i v t

A AAA A * 1 · · 1 * * * « A · A A · · ->

Aby bylo možno eliminovat nespecifické inhibitory hemaglutinace, které jsou přítomné v krevním séru primátů, inkubuje se 25 μΐ séra přes noc při teplotě 37 °C se 100 μΐ roztoku směsi chloridu vápenatého, a boritanu sodného s obsahem 400 jednotek, rozkládajících enzymatické jednotky neuraminidázy V. cholerae (Boehringer Mannheim). Po přidání 75 μΐ citrátu sodného s koncentrací 2,5 % se séra zahřejí na 30 minut na teplotu 56 °C. Pak se přidá 50 μΐ PBS, takže konečné ředění séra je 1/10. Pak se 25 μΐ tohoto séra zpracovává zředěním ve 20 μΐ PBS (vytvoří se řada vždy dvojnásobného ředění od koncentrace 1/10) na Greinerových plotnách s 96 vyhloubeními. Pak se přidá neporušený virus, inaktivovaný BPL, v množství 25 μΙ/vyhloubení s koncentrací 4 hemaglutinační jednotky (jde o ředění, které je 4krát nižší než poslední ředění, které vyvolá aglutinaci červených krvinek) a směs se inkubuje za míchání 30 minut při teplotě místnosti. Pak se přidají červené krvinky kuřat v množství 25 μΙ/vyhloubení a směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak se plotny ponechají přes noc pří teplotě 4 °C a po této době se odečtou. Titr HAI odpovídá převrácené hodnotě posledního ředění séra, které vyvolá inhibici hemaglutinace, vyvolané virem.

ELISA pro měření toxoidu tetanu TT ve specifickém séru IgG u myši

Imunoplotny Maxisorp Nunc se přes noc při teplotě 4 °C opatří povlakem 1 μς/πιΐ antigenů (TT, Behring) v ředění PBS, užije se množství 50 μΐ tohoto materiálu/vyhloubení v řadách B až H použité plotny, nebo

se do vyhloubení uloží 50 μΐ čištěného kozího Ig proti myším tkáním (Boehringer) v PBS v řadě A, koncentrace Ig je 5 μς/ιηΐ. Volná místa na plotnách se blokují jednu hodinu při 37 °C při použití saturačního pufru PBS s obsahem 1 % BSA, 0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu Tween 20 a 4 % normálního séra skotu NBS. Pak se připraví série vždy dvojnásobných ředění (v saturačním pufru, μΐ/vyhloubení) směsi isotypu IgG a vytvoří se standardní křivka (směs myších monoklonálních protilátek IgGl, IgG2a a IgG2b od Sigma, počínaje 200 ng/ml v řadě A) a vzorky séra (počínaje od ředění 1/100 v řadách B až H) se inkubují 1 hodinu a 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se pak 3krát promyjí promývacím pufrem PBS s obsahem 0,1 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, Tween 20. Pak se inkubuje biotinylovaný kozí Ig proti lidským tkáním (Amersham) v ředění 1/5000 v saturačním pufru v množství 50 μΐ/vyhloubení celkem 1 h a 30 minut při teplotě 37 °C. Po trojnásobném promytí a následném přidání konjugátu streptavidinu a peroxidázy z křenu (Amersham) se plotny ještě 5krát omyjí a pak se inkubují 20 minut při teplotě místnosti s 50 μΐ/vyhloubení vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H₂O₂ 0,03 % v 50 mM citrátového pufru o pH 4,5). Vyvíjení se zastaví tak, že se přidá 50 μΐ 2N H₂S0₄/vyhloubení. Optická hustota se odečítá při vlnové délce 492 a 630 nm při použití odečítacího zařízení Biorad 3550. Titr protilátek se vypočítává ze čtyř parametrů matematickým postupem při použití programu SoftMaxPro.

Příklad 2

Vliv laureth 9 spolu s kombinací Tween 80 a Triton X-100 na imunogenitu vakcíny proti chřipce při aplikaci do nosu u opic Rhesus

První očkování opic Rhesus bylo provedeno v anesthesii tak, že do každé nosní dírky bylo postřikem naneseno 25 μρ HA ve 100 μΐ PBS s obsahem chřipkového viru A/Beijing/262/95, nebo B/Harbin/7/94 po inaktivaci β-propiolaktonem. Po 28 dnech bylo provedeno přeočkování opic ve skupinách po 4 nebo 5 zvířatech, očkovací látka byla opět podána na nosní sliznicí za anesthesie ve 200 μΐ roztoku (100 μΐ do každé nosní dírky pomocí postřikovacího přístroje), v tomto případě bylo podáno 30 μρ HA každého z uvedených virů, přičemž bylo použito A: podání v 0,5% polyoxyethylen-9-lauryletheru L9,

B: podání ve směsi 0,5% polyoxyethylen-9-lauryletheru + 0,11% Tween 80 + 0,074% Triton X-100 nebo

C: podání nitrosvalovou injekcí 15 μρ HA vakcíny, obsahující tytéž kmeny jako v případě A a B. Virové antigeny byly pěstovány na vaječných zárodcích nebo byly použity antigeny, které se běžně dodávají (SSD GmBH, Drážďany, SRN). Odpovědi HAI a Ig Ab byly měřeny v krevním séru způsobem, popsaným v příkladu 1. Výsledky jsou uváděny jako procentuální množství pokusných zvířat, u nichž bylo možno prokázat čtyřnásobný vzestup Ab po přeočkování.

Dřívější zkušenosti s 0,5% polyoxyethylen-9-lauryletherem prokázaly, že tento pomocný prostředek napomáhá vyvolat systemickou odpověď imunitního systému proti chřipkovému viru. Jak je zřejmé z následující

tabulky 1, je tuto účinnost ještě možno podstatným způsobem zlepšit přidáním dalšího neiontového smáčedla. V případě, že byl polyoxyethylen-9-laurylether doplněn prostředky Tween 80 a Triton X-100, došlo k výraznému vzestupu systemické odpovědi Ig Ab, tak jak k tomu dochází v případě klasické, parenterálně podané vakcíny proti chřipkovému viru.

Odpověď typu inhibice hemaglutinace HAI byla rovněž měřena, výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. Nej lepším prostředkem v tomto směru byl opět polyoxyethylen-9-laurylether, doplněný prostředky Tween 80 a Triton X-100. Tento prostředek vyvolával stejnou odpověď imunitního systému jako běžná, parenterálně podávaná vakcina proti chřipkovému viru.

Tabulka 1. Ig v séru opic

Ig protilátky ELISA	Čtyřnásobný vzestup Ab, procento zvířat
Skupina	A/Beijing/262/95	B/Harbin/7/94
A	0	0
B	100	100
C	75	75

Tabulka 2. Titr HAI v séru opic

HAI protilátky ELISA	Čtyřnásobný vzestup Ab, procento zvířat
Skupina	A/Beijing/262/95	B/Harbin/7/94
A	0	0
B	20	0
C	25	0

Příklad 3

Srovnání imunogenity intranasální složené vakcíny proti chřipkovému viru, obsahující jako pomocný prostředek laureth 9 spolu s prostředky Tween 80 a Triton X-100 s imunogenitou běžné parenterálně podávané vakcíny Fluarix™ u zdravých dospělých osob

Intranasální vakcina, obsahující antigeny chřipkového viru, získané pěstováním na vaječných zárodcích a dále obsahující laureth 9 + Tween 80 a Triton X-100 (A) byla vyhodnocena a srovnávána s běžnou vakcínou

Fluaríx™/cc-Rix^R (B) . Vakcíny obsahovaly tři inaktivované virionové antigeny, připravené z kmenů, doporučených WHO pro léta 1998/1999. Vakcina byla nanášena přístrojem Accuspray™ pro intranasální postřik (Becton Dickinson). Přístroj pracuje obdobně jako běžná stříkačka, má však specifický hrot se spirálními kanálky, takže dochází k rozstřikování materiálu při tlaku na píst. Do každé nosní dírky bylo naneseno 100 μΐ vakcíny.

Složení vakcíny

Intranasální vakcina A obsahovala následující inaktivované složené viriony:

1. 30 μρ HA A/Beijing/262/95 (H1N1)

2. 30 μρ HA A/Sydney/5/97 (H3N2)

3. 30 μς HA B/Harbin/7/94, dále vakcina obsahovala fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH 7,4 ± 0,1, Tween 80 0,1 %, Triton X-100 0,015 %, deoxycholát sodný 0,0045 % a thiomersal v množství nižším než 35 μς/ιηΐ.

• ·

Objem na jednu dávku byl 200 μΐ, 100 μΐ do každé nosní dírky.

Prostředek A obsahoval laureth 9 v konečné koncentraci 0,5 g/100 ml.

Srovnávací vakcína Fluarix™/a-Rix^R (B) (SmithKlineBeecham Biologicals') je trivalentní složená vakcína proti chřipkovému viru, která se podává nitrosvalově v dávce 500 μΐ.

Sledování imunogenity

Bylo provedeno otevřené náhodné sledování imunogenity vakcíny, podávané na nosní sliznici a obsahující laureth 9, doplněný prostředky Tween 80 a Triton X-100, výsledky byly srovnávány s výsledky, dosaženými po podávání běžné parenterální vakcíny Fluarix. Do pokusu bylo zařazeno 20 zdravých dospělých osob ve věku 18 až 40 let, kterým byla podána jedna dávka vakcíny Fluarix a 10 osob, jimž byly podány vždy 2 podíly jedné dávky, do každé nosní dírky jeden podíl.

dnů po podání byly sledovány místní a celkové příznaky, obě vakcíny byly dobře snášeny, nebylo možno pozorovat žádné závažné vedlejší příznaky, spojené s aplikací vakcín.

Imunogenita obou vakcín byla stanovena sledováním hemaglutinačního titru HI v krevním séru, aby bylo možno definovat podíl pokusných osob s alespoň čtyřnásobným vzestupem tirtu HI v krevním séru ve dni 21 ve srovnání se dnem 0 pro každou vakcinu, dále byla sledována míra »· ♦» » 8 9

9 99

98 8

Μ» vzestupu, geometrického průměru titru HI, GMT ve dni 21 ve srovnání se dnem 0 pro každou vakcínu a také procentuální podíl očkovaných s titrem HI v séru > 40 po vakcinaci, hodnoty byly stanoveny vždy pro každý kmen, proti němuž bylo očkování provedeno. Mimo to byly stanoveny slizniční protilátky IgA zkouškou ELISA.

Uvedené hodnoty ve srovnání s výsledky po podání vakcíny Fluarix jsou shrnuty v následující tabulce 3.

Tabulka 3. HI seropozitivita, serokonverze a seroprotekce 21 dnů po dávce 1

Kmen	Skupina	Čas den	N	Seropozi tivita	Titr n	HI o. 0	Vzestup titru HI
Ω	o. Ό	n	O, 0
A/Beij ing	Intranasálni vakcina+ laureth 9	0 21	20 20	5 19	25, 0 95, 0	1 10	5,0 50, 0	15	75,0
	Fluarix	0 21	19 19	4 19	21, 1 100,0	3 18	15, 8 94, 7	19	100,0
A/Sydney	Intranasálni vakcina+ laureth 9	0 21	20 20	16 20	80, 0 100, 0	4 19	20, 0 95,0	15	75,0
	Fluarix	0 21	19 19	14 19	73, 7 100,0	1 18	5,3 94,7	16	84,2
B/Harbin	Intranasálni vakcína+ laureth 9	0 21	20 20	18 20	90,0 100, 0	11 19	55,0 95,0	12	60, 0
	Fluarix	0 21	19 19	17 19	89, 5 100,0	11 19	57, 9 100,0	15	78, 9

Seropositivita: počet a procentuální podíl osob s titrem > 10

Seroprotekce: počet a procentuální podíl osob s titrem HI > 40 • * 9

9 9 ·» 9991 osob s alespoň dne 21.

«« 99 <· 9999 99 99.

9 9 9 · · * ♦ · * * t

99 9

Serokonverse: počet a procentuální podíl čtyřnásobným vzestupem titru od dne 0 do

Procentuální podíl osob s dvojnásobným nebo čtyřnásobným vzestupem celkových specifických slizničních protilátek IgA mezi dnem 21 a dnem 0 (1 dávka) je shrnut v následující tabulce 4.

Tabulka 4.

Kmen	Skupina	N	2násob. vzestup %	4násob. vzestup %
A/Beij ing	Laureth-9	20	50,0	20,0
	Fluarix	19	52,6	26, 3
A/Sydney	Laureth-9	20	55,0	25,0
	Fluarix	19	47,4	5,3
B/Harbin	Laureth-9	20	15,0	10, 0
	Fluarix	19	26, 3	5,3

Souhrn

Výsledky zkoušek na imunogenitu, tak jak jsou svrchu uvedeny v tabulkách, prokazují, že při aplikaci vakcíny na nosní sliznici bylo dosaženo podobné úrovně séropozitivity, serokonverze a seroprotekce ve srovnání s běžnou parenterální vakcinou Fluarix 21 dnů po podání 1 dávky vakcíny. Vakclna, podávaná na nosní sliznici, obvykle vyvolávala lepší slizniční odpověď protilátek IgA po jedné dávce než běžná parenterální vakclna Fluarix.

Příklad 4

Vliv laureth-9 v kombinaci s prostředek Triton X-100 na imunogenitu proti tetanu při podání toxoidu tetanu na nosní sliznici u očkovaných myší • Φ φφ φ · φ « φ · φ φφφ φφφ φφ φφφφ ♦ Φ φφ β φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φφ » »»♦* φ φ φ φφφ

V tomto příkladu bylo vyhodnoceno přidávání prostředku Triton X-100 do vakcíny, obsahující nízkou nebo suboptimální dávku laureth-9 a toxoid tetanu TT.

Byla měřena tvorba specifických protilátek v krevním séru. Myší samice kmene balb/c byly nitrosvalově očkovány 20 % lidské dávky běžné vakcíny DTPa (dvakrát 50 μΐ, záškrt, tetanus, černý kašel, Infanrix™, SmithKline Beecham, Belgie). Po 1 měsíci byly myši přeočkovány dávkou 5 μΐ, podanou do každého nosního otvoru za anesthesie při obsahu 5 μς TT, jako další složky obsahovala vakcína A: PBS, B: 0,5% polyoxyethylen-9-laurylether, C: 0,1% polyoxyethylen-9-laurylether, D: 0,1% polyoxyethylen-9-laurylether + 0,02% Triton X-100 nebo E: nitrosvalově byla podána vakcína DTPa v dávce dvakrát 50 μΐ. 2 týdny po přeočkování bylo krevní sérum analyzováno na přítomnost IgG, specifických proti TT.

Jak je zřejmé z obr. 1, byl laureth-9 v nízké dávce, 0,1%, neúčinný pro zvýšení imunitní reakce přeočkováním narozdíl od dávky, která obsahovala 0,5% laureth-9. Bylo však možno pozorovat podstatné zlepšení po přídavku prostředku Triton X-100, p<0,0001. Tvorba protilátek, vyvolaná v tomto případě, byla srovnatelná s tvorbou protilátek po podání běžné vakcíny DTPa.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje

a) polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I

HO (CH₂CH₂O) n-A-R kde n znamená 1 až 50,

A znamená chemickou vazbu nebo skupinu -C(O)- a

R znamená Cl-C50alkyl nebo fenyl Cl-C50alkyl a

b) alespoň jedno další neiontové smáčedlo.
2. Pomocný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako další neiontové smáčedlo obsahuje oktoxynol.
3. Pomocný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako oktoxynol obsahuje terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol, Triton X-100.
4. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že dále obsahuje ester polyoxyethylensorbitanu a/nebo žlučovou kyselinu nebo derivát žlučové kyseliny.
5. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I je hemolytický.

·* ·· • · · · ♦ ♦ ♦ • · • · · » » « ♦ 6 ···♦ ·♦ ·· • 9 ♦ * * · · • · ·>· · * · * · * * · « · • · * · · *

9· ·<* ·· ··♦·
6. Pomocný prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že stupeň hemolytické účinnosti polyoxyethylenalkyletheru nebo -esteru je v rozmezí 0,05 až 0,0001 %, měřeno hemolytickou zkouškou morčecí krve.
7. Pomocný prostředek podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I má hemolytickou účinnost, desetinásobně odlišnou od hemolytické účinnosti polyoxyethylen-9-lauryletheru nebo polyoxyethylen-8-stearyletheru, měřeno hemolytickou zkouškou morčecí krve.
8. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I, v němž n znamená 4 až 24.
9. Pomocný prostředek podle nároku 8, v němž n = 9.
10. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylen alkylether nebo -ester obecného vzorce I, v němž R znamená C8-C20alkyl nebo fenylC8-C20alkyl.
11. Pomocný prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že R znamená

C12alkyl.
12. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že obsahuje

999 « 9

Γ” • 9-99 polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I, v němž A znamená chemickou vazbu, takže se tvoří ether.
13. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylenalkylether nebo -ester obecného vzorce I, v němž A znamená -C(0)-, takže se tvoří ester.
14. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se polyoxyethylenether nebo -ester volí ze skupiny polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-laurylester, polyoxyethylen-9-stearylether, pólyoxyethylen-8-stearylether, pólyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen-35-laurylether nebo polyoxyethylen-23-laurylether.
15. Pomocný prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci polyoxyethylen-9-lauryletheru a terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu,

Triton X-100.
16. Pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že celková koncentrace smáčedla se pohybuje v rozmezí 0,001 až 10 %.
17. Pomocný prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že celková koncentrace smáčedla se pohybuje v rozmezí 0,001 až 1 %.
18. Pomocný prostředek podle nároku 17, vyznačující se tím, že celková koncentrace smáčedla se pohybuje v rozmezí 0,001 až • 9 ··

9 9 9 9

0,7

g.

ο • · »

9 ·
19. Pomocná kombinace, vyznačující se tím, že obsahuje pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 17 v kombinaci s alespoň jedním dalším imunostimulačním prostředkem.
20. Pomocná kombinace podle nároku 19, vyznačující se tím, že se další imunostimulační látka volí ze skupiny LT, CT, 3D-MPL, CpG a QS21.
21. Pomocný prostředek podle nároku 20, vyznačující se tím, že jako další imunostimulační látku ze skupiny CpG obsahuje TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO. 1).
22. Pomocná kombinace, vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylen-9-laurylether, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol a 3D-MPL.
23. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 22 a dále obsahuje antigen.
24. Vakcína podle nároku 23, vyznačuj ící se t í m, že se antigen volí ze skupiny HIV, viru Varicella zoster, Herpes simplex typ 1, Herpes simplex typ 2, lidský cytomegalovirus, virus Dengue, Hepatitis A, B, C nebo E, Respirační syncytiální virus, lidský papilloma virus, chřipkový virus, Hib, virus meningitidy, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, • *

90 90 ·· »»<♦ ·*«···· • · · * · ·*· · · · • 990 990 0009 9

0 9 · · 9 9 9 0

9999 00 90 0·9 09 0090

Plasmodium nebo Toxoplasma, decapeptid stanworth nebo antigeny, spojené s nádory (TMA), MÁGE, BAGE, GAGE, MUC1, Her-2 neu, LnRH, CEA, PSA, KSA nebo PRÁME.
25. Vakcina podle nároku 24, vyznačuj ící se t í m, že jako antigen obsahuje antigen nebo antigenní prostředek z chřipkového viru.
26. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polyoxyethylen-9-laurylether, terč.oktylfenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100) a antigen chřipkového viru.
27. Vakcina podle některého z nároků 23 až 26, vyznačující se tím, že je zpracována na aerosol nebo na sprej.
28. Vakcina podle některého z nároků 23 až 27 pro použití v lékařství.
29. Použití pomocného prostředku podle některého z nároků 1 až 22 pro výrobu farmaceutického prostředku, určeného pro aplikaci na povrch sliznice nebo pokožky nemocného.
30. Použití kombinace polyoxyethylen-9-lauryletheru a terč.oktylfenoxypolyethoxyethanolu (Triton X-100) pro výrobu vakcíny pro aplikaci na povrch sliznice nemocného.
31. Postřikovači přístroj, zvláště k uvolnění dvojité dávky, vyznačující se tím, že je naplněn vakcinou podle některého z nároků 23 až 27.

·» »· • · · < · «· «4 ·· ···· • ♦ · · · · · • · · « · ♦·* • ··· · · ♦ · · * » · • ··· · · * t «··· ·· »· ··· «· ···>·
32. Použití vakcinačního prostředku podle některého z nároků 23 až 27 pro výrobu vakcíny pro léčení virových, bakteriálních nebo parazitických infekcí, alergie nebo zhoubných nádorů.
33. Způsob léčení savců, trpících infekcí patogenními mikroorganismy, zhoubným nádorem nebo alergií, vyznačující se tím, že se podává bezpečné a účinné množství vakcinačního prostředku podle některého z nároků 23 až 27.
34. Způsob léčení savců, trpících infekcí, zhoubným nádorem nebo alergií, vyznačující se tím, že se na sliznici podává bezpečné a účinné množství vakcinačního prostředku podle některého z nároků 23 až 27.
35. Způsob léčení savců, trpících nebo ohrožených infekcí, zhoubným nádorem nebo alergií, vyznačující se tím, že se na nosní sliznici nanese bezpečné a účinné množství vakcinačního prostředku podle některého z nároků 23 až 27.
36. Způsob výroby vakcinačního prostředku podle některého z nároků 23 až 27, vyznačující se tím, že se smísí a) pomocný prostředek podle některého z nároků 1 až 22, b) farmaceuticky přijatelný nosič a c) antigen nebo antigenní prostředek.