MXPA02003068A - Adyuvante que comprende un eter o ester alquilo de polioxietileno y al menos un tensioactivo no ionico.. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un sistema adyuvante novedoso que comprende un tensioactivo de eter o ester alquilo de polioxietileno en combinacion con al menos un tensioactivo no ionico adicional, preferentemente, el tensioactivo no ionico adicional es un octoxinol de la serie (TRITONTM). La presente invencion proporciona los adyuvantes novedosos, las vacunas que los contienen y metodos para su fabricacion y su formulacion en vacunas. Tambien se proporciona el uso de adyuvantes o vacunas de la presente invencion, en la profilaxis o terapia de una enfermedad.

Description

ADYUVANTE QUE COMPRENDE UN ÉTER O ESTER ALQUILO DE POLIOXIETILENO Y AL MENOS UN TENSIOACTIVO NO IÓNICO Campo del Invento La presente invención se refiere a un sistema de adyuvante novedoso que comprende un éter o éster alquilo de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional. Preferentemente, el tensioactivo no iónico adicional es un Octoxinol. La presente invención proporciona los adyuvantes novedosos, vacunas que los comprenden y métodos para su fabricación y su formulación en vacunas. También se proporciona el uso de los adyuvantes o vacunas de la presente invención en la profilaxis o terapia de padecimientos. También se proporciona un método para aumentar una respuesta inmune en un huésped que utiliza el adyuvante y vacuna de la presente invención. Los adyuvantes son particularmente útiles como un adyuvante mucoso, aunque también son sistémicamente efectivos. Además de eliminar el requerimiento de inyecciones dolorosas y el efecto negativo asociado con respecto al cumplimiento por parte del paciente debido al "miedo de la aguja", la vacunación mucosa es atractiva ya que sea ha demostrado en animales que la administración mucosa de antígenos tiene una mayor eficacia de inducir respuestas protectoras en superficies mucosas, las cuales son la ruta de entrada de muchos patógenos. Además, se ha sugerido que la vacunación mucosa, tal como vacunación intranasal, puede inducir la inmunidad mucosa no únicamente en la mucosa nasal, si no también en sitios de mucosa distantes tales como la mucosa genital (Mestecky, 1987, Revista de Inmunología Clínica, tií:Í...íLáii.. ;?!íí.... 7, 265-276; McGhee y Kiyono, Agentes Infecciosos y enfermedad 1993, 2, 55-73). Además de la mucha investigación en el campo, los adyuvantes de mucosa seguros y efectivos que son adecuados para uso en humanos, permanecen para ser identificados. La presente invención proporciona una solución a éste problema. Se han descrito los usos médicos de ciertos tensioactivos no iónicos. Por ejemplo, se ha descrito la administración intranasal de éteres y esteres de polioxietileno para aumentar la captación de insulina en la cavidad nasal (Hirai y asociados, 1981, Revista internacional de Farmacéuticas, 9, 165-172; Hirai y asociados, 1981, Revista Internacional de Farmacéuticas, 9, 173-184). Se han descrito los esteres alquilo de polioxietileno como componentes en emulsión de aceite o adyuvantes de polímero de ácido acrílico (JP 05201877; US 3,919,411). Se han utilizado otros tensioactivos no iónicos en formulaciones de vacunas. Por ejemplo, las preparaciones de vacunas que comprenden una mezcla con adiciones ya sea de aceite de castor de polioxietileno o glicéridos de ácido caprílicos/cápricos, con monoésteres de sorbitano de polioxietileno, y un antígeno, tienen la capacidad de inducir respuestas inmunes sistémicas después de la administración tópica a una membrana mucosa (WO 94/17827). Ésta solicitud de patente describe la combinación del tensioactivo no iónico TWEEN20™ (monoéster sorbitano de polioxietileno) y lmwitor742™ (glicéridos de ácido caprílico/cáprico), o una combinación de TWEEN20™ y aceite de castor de polioxietileno, tienen la capacidad de aumentar la respuesta inmune sistémica después ^ _-__. ^A.. a L JL de la inmunización intranasal. También se han descrito en la literatura (Gizurarson y asociados, 1996, Investigación de Vacunas, 5, 69-75; Aggerbeck y asociados, 1997, Vacuna, 15, 307-316; Tebbey y asociados, Inmunología Viral, 1999; 12(1 ):41 -5), detalles del efecto de ésta formulación en el aumento de la respuesta inmune hacia antígenos administrados en forma intranasal. Los tensioactivos no iónicos también han sido formulados de tal manera que forman vesículas de tensioactivos no iónicos (comúnmente conocidas como NISV, Patente Norteamericana No. 5, 679, 355). Tales formulaciones de tensioactivos no iónicos, con frecuencia en la presencia de colesterol, forman vesículas de bicapas de lípidos que atrapan el antígeno dentro de la fase acuosa interna o dentro de la propia bicapa. La solicitud de Patente Internacional WO 96/36352 (Patente Norteamericana No. 5, 653, 987), describe un agente farmacéutico líquido que comprende al menos dos aumentadores de absorción y agua, principalmente para la administración oral de insulina en donde la cantidad de cada agente que aumenta la absorción está presente en una concentración de desde 1 hasta 10% p/p de la formulación total. Los tensioactivos comúnmente se utilizan en la formulación de adyuvantes de emulsión de aceite para administración sistémica, y funcionan para estabilizar las gotas de aceite. Por ejemplo, los esteres de sorbitano de polioxietileno (TWEEN™) y los esteres de ácido graso de sorbitano (SPAN™), se utilizan para estabilizar el aceite en emulsiones de agua (EP 0399843 B, WO 95/17210).

La presente solicitud descubrió de manera sorprendente que los éteres o esteres alquilo de polioxietileno, en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional, actúan juntos como adyuvantes potentes para vacunas. De manera conveniente, tales composiciones pueden ser administradas en forma sistémica, aunque también son potentes en la inducción de respuestas inmunes sistémicas cuando las composiciones de vacunas son administradas en la mucosa. Las respuestas inmunes inducidas por la administración mucosa de vacunas de la presente invención, pueden ser al menos tan altas como las observadas después de una inyección sistémica de una vacuna convencional. La presente invención proporciona adyuvantes seguros y potentes que son fabricados fácilmente, y comprenden al menos un éter o éster alquilo de polioxietileno y al menos un tensioactivo no iónico adicional. Los tensioactivos empleados en la presente invención, pueden estar en una solución acuosa o pueden formar suspenciones de estructuras de particulado tales como vesículas o micelas. Preferentemente, los tensioactivos están en la forma de una solución acuosa o una micela. Los éteres o esteres de polioxietileno que pueden ser formulados en las vacunas y adyuvantes de la presente invención, comprenden moléculas de la formula general (I): HO(CH2CH2O)n-A-R en donde, n es 1-50, A es un enlace ó -C(O)-, R es alquilo C?.5o ó alquilo C?-5o de fenilo. Í r?rrt :í j sjjkni . - ,a_fc-J.._... .«Jal-i., Por lo tanto, una modalidad de la presente invención consiste en una formulación de vacuna que comprende un éter alquilo de polioxietileno de la formula general (I), en donde n es de entre 1 y 50, preferentemente de 4 a 24, más preferentemente de 6 a 12 y lo más preferentemente 9; el componente R es alquilo C?-50, preferentemente alquilo C -C20, y lo más preferentemente alquilo C12. La concentración de los éteres de polioxietileno debe estar dentro del rango de 0.1 a 20%, preferentemente de 0.1 a 10% y lo más preferentemente dentro del rango de 0.1 a 1%. Los éteres de polioxíetileno adecuados son seleccionados del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-9-estearilo, éter de polioxietileno-8-estearilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo y éter de polioxietileno-23-laurilo. Más preferentemente, el éter alquilo de polioxietileno es éter de polioxietileno-9-laurilo (laureto 9). Los términos o nombres alternativos para el éter laurilo de polioxietileno se describen en el registro CAS. El número de registro CAS del éter de polioxietileno-9-laurilo es: 9002-92-0. Los éteres de polioxietileno tales como éter laurilo de polioxietileno, se describen en el índice Merck (12° edíción:7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., EUA; ISBN 0911910-12-3), en donde los usos terapéuticos son establecidos para incluir: anestésicos tópicos; antipruríticos; y actividades de agente de esclerosización. Como una clase, tales éteres o esteres de polioxietileno son tensioactivos no iónicos. El laureto 9 se forma haciendo reaccionar óxido de etileno con alcohol dodecilo, y tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etileno. En el caso en que se utiliza una mezcla de tensioactivos de la j?.á tAii ? jt &.1..1 formula (I), dentro del contexto de la presente invención se pretende que n sea = al número promedio de unidades de óxido de etileno presentes en todos los tensioactivos en la mezcla. La proporción de la longitud de la sección de polioxietileno a la longitud de la cadena de alquilo en el tensioactivo (por ejemplo, la proporción de n: longitud cadena de alquilo), afecta la solubilidad de esta clase de detergente en un medio acuoso. Por lo tanto, el adyuvante de la presente invención puede ser una solución o puede formar estructuras particuladas tales como micelas o vesículas. Como una solución, los adyuvantes de la presente invención son esterilizables fácilmente y seguros, pasando por ejemplo a través de una membrana de 0.22µm, simples de administrar y pueden ser fabricados en un modo simple sin las emisiones de GMP y QC asociadas con la formación de estructuras de particulado uniforme. Algunos éteres de polioxietileno, tal como laureto 9, tienen la capacidad de formar soluciones no vesiculares. Sin embargo, el éter polioxietileno-8-palmitoilo (d8E8) tienen la capacidad de formar vesículas. Por lo tanto, se contempla de manera específica el uso de vesículas de éter de polioxietileno-8-palmitoilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional para formar los adyuvantes de la presente invención. Preferentemente, el elemento de éter alquilo de polioxietileno presente en las combinaciones de adyuvante de la presente invención, tiene actividad hemolítica. La actividad hemolítica de un éter alquilo de polioxietileno puede ser medida In vitro, con referencia al siguiente l.l i . i j % i. *!, . ensayo, y se expresa como la concentración más alta del detergente el cual falla para originar la lisis de las células de glóbulos rojos: 1. Se lavó 3 veces sangre fresca procedente de cerdos de guinea con una solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en un centrifugador de escritorio. Después de resuspender al volumen original, la sangre se diluye 10 dobleces adicionales en PBS. 2. Se agregan 50µl de ésta suspensión de sangre a 800µl de PBS que contiene diluciones de dos dobleces del detergente. 3. Después de 8 horas de hemolisis, se evalúa visualmente o midiendo la densidad óptica del sobrenadante. La presencia de un sobrenadante rojo, el cual absorbe luz a 570nm indica la presencia de hemolisis. 4. Los resultados expresan como la concentración de la primera dilución de detergente en la cual ya no ocurre la hemolisis. Dentro de la variabilidad experimental inherente de un ensayo biológico, los éteres alquilo de polioxietileno, o tensioactivos de la formula general (I), de la presente invención, tienen preferentemente una actividad hemolítica aproximadamente de entre 0.5 a 0.0001%, más preferentemente entre 0.05 a 0.0001%, aún más preferentemente entre 0.005 a 0.0001%, y lo más preferentemente 0.003 a 0.0004%. Idealmente, los éteres o esteres de polioxietileno deben tener una actividad hemolítica similar (por ejemplo, dentro de una diferencia de diez dobleces) a la de ya sea el éter de polioxietileno-9-laurilo o éter de polioxietileno-8-estearilo. Al éster o éter alquilo de polioxietileno se le agrega al menos un tensioactivo no iónico adicional, el cual puede ser cualquier detergente ^¡^^¿¡¿¿^¿¿^^¿^ con propiedades de superficie activa adecuada. Los detergentes adecuados se describen en la publicación de "Sistemas de tensioactivos" edición: Attwood y Florence (1983, Chapman y Hall). Los tensioactivos no iónicos preferidos no son los que caen dentro 5 de la fórmula general (I), por ejemplo, esteres sorbitano Octoxinoles y de Polioxietileno. Los Octoxinoles particularmente preferidos incluyen Tritón X-45, polioxietanol t-octilfenoxi (Tritón X-100), Tritón X-102, Tritón X-114, Tritón X-165, Tritón X-205, Tritón X-305, Tritón N-57, Tritón N-101, Tritón N-128. El Tritón X-100es particularmente preferido. Las series Octoxinol, 10 incluyendo t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™) se describe en la Entrada de índice Merck 6858 (Página 1162, 12° edición Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J., E.U. A., ISBN 0911910-12-3). Otros tensioactivos no iónicos preferidos son esteres sorbitano de polioxietileno. Los esteres sorbitano de polioxietileno, incluyendo 15 monooleato sorbitano de políoxietileno (TWEEN80™) se describen en la Entrada de índice Merck 7742 (Página 1308, 12° edición, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J., E.U.A., ISBN 0911910-12-3). Los esteres sorbitanos tanto de Octoxinoles como de polioxietileno pueden ser comprados en Sigma Inc. El éster sorbitano de polioxíetileno preferido es 20 monooleato sorbitano de polioxietileno (Tween 80™). Los adyuvantes más preferidos de la presente invención, comprenden éster alquilo de polioxietileno y un Octoxinol, tal como t- octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™). Opcionalmente, la combinación puede comprender además un éster sorbitano de 25 polioxietileno, tal como monooleato sorbitano de polioxietileno (TRITÓN ^gag IM&ÉBÉIÉÉ..» 1 i ;j., ,?, , - i i X80™). Más preferentemente, el éter alquilo de polioxietileno es éter de polioxietileno-9-laurilo, y el Octoxinol es t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™). A éstas formulaciones, se les puede agregar un detergente iónico, tal como una sal biliar o derivado de ácido cólico. Por lo tanto, la formulación adyuvante puede comprender un éter o éster alquilo de polioxietileno (fórmula I), un octoxinol, que comprende opcionalmente un éster sorbitano de polioxietileno, y que comprende opcíonalmente una sal biliar o un derivado de ácido cólico. La modalidad preferida de ésta formulación comprende una combinación de éter de polioxietileno-9-laurilo, t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™), monooleato sorbitano de polioxietileno y deoxicolato de sodio. La concentración de éter o éster alquilo de polioxietileno, tal como éter de polioxietileno-9-laurilo, en los adyuvantes de la presente invención, normalmente estará dentro del rango de 0.001 a 20%, preferentemente de 0.001 a 10% y más preferentemente de 0.001 a 1%, y lo más preferentemente en entre 0.001 y 0.8% o aproximadamente de 0.5% (p/v). A esto se le agrega el tensioactivo no iónico adicional el cual no es un éter o éster de polioxietileno. El o cada uno de los tensioactivos no ¡ónicos adicionales estará presente normalmente en la formulación de vacuna final en una concentración de entre 0.001 a 20%, más preferentemente entre 0.01 a 10%, y lo más preferentemente hasta aproximadamente 2% (p/v). En donde están presentes dos de dichos tensioactivos no iónicos adicionales, éstos están presentes preferentemente en la formulación final en una concentración de hasta aproximadamente 2% de cada uno, normalmente en una concentración de hasta aproximadamente 0.6% de cada uno. Si están presentes tres o más tensioactivos no iónicos adicionales, generalmente estarán presentes en una concentración de hasta aproximadamente 1% de cada uno y normalmente en trazos de hasta aproximadamente 0.2% ó 0.1% de cada uno. Cualquier mezcla de tensioactivos puede estar presente en las formulaciones de vacuna de acuerdo con la presente invención. Los tensioactivos no iónicos tales como los mencionados anteriormente, tienen concentraciones preferidas en la composición de vacuna final como se indica a continuación: polioxietanoles de octilo o de nonil fenoxi tales como Tritón X-100™ u otros detergentes de la serie Tritón: desde 0.001% hasta 20%, preferentemente desde 0.001% hasta 10%, más preferentemente desde 0.001 hasta 1%, y lo más preferentemente desde 0.005 hasta 0.1% (p/v); y en caso de estar presentes esteres sorbitano de polioxietileno tales como Tween 80™: de 0.01 hasta 1%, lo más preferentemente aproximadamente 0.1% (p/v). La concentración total de detergente en la vacuna o formulaciones adyuvantes de la presente invención, incluyendo el éter o éster de polioxietileno y uno o más tensioactivos no iónicos adicionales, normalmente está dentro del rango de 0.001 a 40%, preferentemente entre 0.001 y 20%, más preferentemente entre 0.001 y 10%, aún más preferentemente entre 0.001 y 1%, y lo más preferentemente entre 0.001 a 0.7% (p/v). Las preparaciones de vacuna de la presente invención, se pueden utilizar para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece de .jja¿.i.i. í * |lguna enfermedad, administrando la vacuna a través de una ruta mucosa, tal como la ruta ora/vocal/intestinal/vaginal/rectal o nasal. Tal administración puede tener forma de gota, rocío o polvo seco. Las formulaciones de vacunas nebulizadas o aerosolizadas también forman 5 parte de la presente invención. Las formulaciones entéricas tales como cápsulas y granulos gastro resistentes para administración oral, supositorios para administración rectal o vaginal también forman parte de la presente invención. La presente invención también puede ser utilizada para aumentar la inmunogenicidad de antígenos aplicados a la piel 10 (administración dérmica o transcutánea). Además, los adyuvantes de la presente invención pueden ser administrados en forma parenteral, por ejemplo intramuscular o administración subcutánea. Cuando se utilizan para vacunación intranasal, las vacunas de la presente invención tienen una naturaleza preferentemente hemolítica. 15 Dependiendo de la ruta de administración, se puede utilizar una variedad de aparatos de administración. Por ejemplo, para administración intranasal se puede utilizar un aparato de rocío tal como el disponible en el mercado en Acuspray™ (Becton Dickinson). Los aparatos de rocío preferidos para uso intranasal, son aparatos 0 para los cuales el desempeño del aparato no depende de la presión aplicada por parte del usuario. Éstos aparatos son conocidos como aparatos de umbral de presión. El líquido es liberado de la boquilla únicamente cuando se logra una presión de umbral. Éstos aparatos hacen más fácil lograr un rocío con un tamaño de gota regular. Los aparatos de 5 umbral de presión adecuados para utilizarse con la presente invención, -.1 Ai aj=jfe- b; .?.& i • •*» *"- »'• f -Al' "son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en el documento Í.-WO 91/13281 y EP 311 863 B. Tales aparatos están disponibles en el mercado en Pfeiffer GmbH. Los aparatos intranasales preferidos producen gotas (medidas utilizando agua como líquido) dentro del rango de 1 a 200µm, preferentemente 10 a 120µm. Debajo de 10µm existe el riesgo de inhalación, por lo tanto es deseable tener gotas de no más del 5% debajo de 10µm. Las gotas arriba de 120µm no se pueden esparcir así como las gotas más pequeñas, de modo que es deseable tener gotas no mayores a aproximadamente 5% arriba de 120µm. La administración de bidosis es una característica preferida adicional de un aparato de administración intranasal para utilizarse con las vacunas de acuerdo con la presente invención. Los aparatos bidosis contienen dos subdosis de una sola dosis de vacuna, una subdosis para administración en cada fosa nasal. La presente invención proporciona en un aspecto adicional un equipo que comprende un aparato de administración intranasal tal como se describe en la presente invención, que contiene una formulación de vacuna de acuerdo con la presente invención Para ciertas formulaciones de vacuna, se pueden incluir otros componentes de vacunas en la formulación. Como tal, las formulaciones de adyuvante de la presente invención también pueden comprender un ácido biliar o derivado de ácido cólico. Preferentemente, el derivado de ácido cólico es una sal del mismo, y más preferentemente una sal de sodio del mismo. Los ejemplos de ácidos biliares y derivados de los mismos ¡ncluyen el propio ácido cólico, ácido deoxicólico, taurodeoxicolato, ácido cólico quenodeoxi, ácido ursodeoxicólico, ácido litocólico, ácido yodeoxicolicólico y derivados similares a derivados amidoprop¡l-2-hidroxi-1-propanosulfónico, glico, tauro, amidopropil-1-propanosulfónico de los ácidos biliares antes mencionados, o deoxicolamida N, N-bis (3DGIuconoamidopropilo). Un ejemplo preferido particular es deoxicolato de sodio (NaDOC) el cual puede estar presente en la dosis de vacuna final. Preferentemente, la formulación adyuvante de la presente invención es conveniente cuando está en la forma de una solución acuosa o una suspensión de formas no vesiculares. Tales formulaciones son fáciles de fabricar en forma reproducible, y también fáciles de esterilizar (filtración terminal a través de una membrana de poros de 450 ó 220nm) y también son fáciles de administrar a la mucosa nasal en la forma de un rocío sin la degradación de la estructura física del complejo del adyuvante. El éter de polioxietileno-9-laurilo en combinación con TRITON-X 100™, forman una solución acuosa (también pueden estar presentes pequeñas micelas). En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para inducir o aumentar una respuesta inmune en un huésped, que comprende la mezcla con adiciones del antígeno y los adyuvantes de la presente invención, y administrar la mezcla al huésped. Preferentemente, la ruta de administración al huésped es a través de una superficie mucosa, y más preferentemente a través de la mucosa nasal. Cuando la mezcla se administra a través de la mucosa nasal, la mezcla es administrada preferentemente en la forma de un rocío. En un método ii ?jü.i preferido para induci r una respuesta inm une, la respuesta i nm une sistémica es inducida mediante una administración nasal de las vacunas de la presente invención. Se prefiere que los métodos para aumentar una respuesta inm une puedan ser ya sea una dosis de inicio o de refuerzo de la vacuna, y que la vacuna com prenda una preparación antigénica o de antígeno de i nfluenza. La form ulación adyuvante preferida para administrar a la mucosa nasal en éstos métodos, son combinaciones de éter alquilo de polioxietileno y un octoxinol , tal como una com binación preferida de éter de pol ioxietileno-9-laurilo y t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X1 00™) , com prendiendo opcional mente la com binación de adyuvante un éster sorbitano de polioxietileno (tal como el m onooleato, TWE E N 80™) y/o un derivado de sal biliar o ácido cól ico, tal como deoxicolato de sodio. Se considera que las composiciones de la presente invención, serán utilizadas para form ular vacunas que contengan antígenos derivados de una am plia variedad de fuentes. Por ejem plo, los antígenos pueden incluir preparaciones antigénicas o de antígenos derivados de humano, bacterias, ácido nucleico viral o patógenos, antígeno derivado de tumor o preparaciones antigénicas, antígenos derivados de huésped, incluyendo péptidos GnRH e Ig E , proteínas o péptidos producidos en form a recom binante y proteínas de fusión quim érica. Preferentemente, las formulaciones de la presente invención contienen un antígeno o com posición antigénica que tiene la capacidad de obtener una respuesta inm une contra un patógeno humano, en donde el antígeno o com posición antigénica es derivada de VI H-1 , (tal como tat, t¿i í¿,.,i.r¡.Á.¡ .r. nef, gp120 ó gp160), víruses de herpes humano, tal como gD ó derivados de los mismos o proteína Temprana Inmediata tal como ICP27 procedente de VSH1 ó VSH2, citomegatovirus (esp. Humanos) tal como gB ó derivados de los mismos), Rotavirus (incluyendo víruses atenuados vivos), virus Epstein Barr (tal como gp350 ó derivados de los mismos), Virus Zoster Varicela (tal como gpl, II y IE63), o de un virus de hepatitis tal como virus de hepatitis B (por ejemplo antígeno de Superficie de Hepatitis o un derivado del mismo), virus de hepatitis A, virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos vírales, tales como paramixovíruses: virus Sincitial Respiratorio (tal como proteínas F y G ó derivados de las mismas), virus de parainfluenza, virus de sarampión, virus de paperas, viruses de papiloma humano (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18, ..), flavivíruses (por ejemplo Virus de Fiebre Amarilla, Virus del Dengue, virus de Encefalitis por nacimiento de garrapata, Virus de Encefalitis Japonesa) o virus de Influenza (todo el virus vivo o desactivado, virus de influenza de división crecido en huevesillos o células MCDK, o células Vero o todos los virosomas flu (tal como son descritos por R. Glick, Vacuna 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como HA, NP, NA, ó proteínas M, o combinaciones de los mismos) o derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea, incluyendo N. meningitidis, (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de enlace de transferina, proteínas de enlace de lactoferina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M ó fragmentos de los mismos, protease C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, Incluyendo M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejem plo adhesi nas e i nvasinas de peso molecular alto y bajo); Bordetella spp, incluyendo B. pertussis (por ejem plo pertactina, toxina de pertussis ó derivados de la m isma, hem aglutinina filamentosa, ciclasa de adenilato, fim briae), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp; incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B ó -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, i ncl uyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo enterotoxic E. coli (por ejem plo factores de colonización , toxina lábil por calor derivados de la m isma, toxina estable por calor o derivados de la m ism a), E. coli enterohemorrágico, E. coli enteropatogénico (por ejem plo toxina sim ilar a toxina shiga o derivados de la m ism a); Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejem plo toxina de cólera y derivados de la m isma); Shigella spp, I ncluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersina spp, i ncluyendo Y. Enterocolítica (por ejem plo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejem plo toxinas, adhesinas e i nvasinas) y C coli; Salmonella spp, incluyendo S. tiphi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp, incl uyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejem plo ureasa, catalasa, toxina de vacuolación) ; Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa; Staphilococcus spp, i ncluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp, incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp, incluyendo C. tetani (por ejem plo toxina de tétanos y derivados de la m ism a), C. botulinum (por ejem plo toxina de botulinum y ¡fc &-&*>** i's i®r'vados de la misma), C. difficile (por ejemplo toxina de clostridium A ó B y derivados de los mismos); Bacillus spp, incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina de botulinum y derivados de la misma); Corynebacterium spp, incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina de difteria y derivados 5 de la misma); Borrelia spp, incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), ß. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp, incluyendo E. equi y el agente del Ehrliquiosis Granulocítico Humano; Rickettsia spp, 10 incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp, incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de enlace de eparina) C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de enlace de eparina) C. psittaci; Leptospira spp, incluyendo T. interrogans; Treponema spp, incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana exterior raras), T. denticola, T. 15 hyodysenteriae; ó derivados de parásitos tales como Plasmodium spp, incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp, incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp, incluyendo histolytica; Babesia spp, incluyendo B. microti; Trypanosoma spp, incluyendo T. Cruzi; Giardia spp, incluyendo G. lamblia; Leshmania spp, incluyendo L. 20 major; Pneumocystis spp, incluyendo P. carinii; Trichomonas spp, incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp, incluyendo S. mansoni, ó derivados de levadura tales como Candida spp, incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp, incluyendo C. neoformans. Las vacunas de bacteria preferidas comprenden antígenos 25 derivados de Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de enlace de colina) y el Pneumolicin de antígeno de proteína (Acta Bioquímica Biofísica, 1989, 67, 1007; Rubins y asociados, Patogénesis Microbiana, 25, 337-342), y derivados de toxificados mutantes de los mismos (WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas de bacterias preferidas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp, incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenzae no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fímbrina (Patente Norteamericana 5, 843, 464) ó múltiples variantes de copia o proteínas de fusión de los mismos. Otras vacunas de bacterias preferidas comprenden antígenos derivados de Morexella Catarrhalis (incluyendo vesículas de membrana exterior de los mismos, y OMP106 (WO 97/41731)) y de Neisseria mengitidis B (incluyendo vesículas de membrana exterior del mismo, (WO 96/29412). Los derivados del antígeno de Superficie de Hepatitis B son bien conocidos en la técnica e incluyen, inter alia, aquellos antígenos PreS1, PreS2 S establecidos y descritos en las solicitudes de Patente Europea No. EP-A-414 374; EP-A-0304 578, y EP 198-474. En un aspecto preferido la formulación de vacuna de la presente invención comprende el antígeno VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en células CHO. En una modalidad adicional, la formulación de vacuna de la presente invención comprende gD2t, tal como se definió anteriormente.

?.J.? i li En una modalidad preferida de la presente invención, las vacunas que contienen el adyuvante reclamado comprenden antígeno derivado del Virus de Papiloma Humano (VPH) considerado por ser el responsable de verrugas genitales, (VPH 6 ó VPH 11 y otros), y los víruses VPH responsables de cáncer cervical (VPH16, VPH18 y otros). Las formas particularmente preferidas de vacunas profilácticas o terapéuticas de verrugas genitales comprenden partículas L1 ó capsómeros y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de las proteínas de VPH 6 y VPH 11 E6, E7, L1, y L2. Las fórmulas más preferidas de proteína de fusión son: L2E7 tal como se describe en el documento WO 96/26277, y la proteína D (1/3)-E7 descrita en el documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Una composición de vacuna de profilaxis o terapéutica de infección o cáncer cervical por VPH preferida, puede comprender antígenos VPH 16 ó 18. Por ejemplo, los monómeros de antígeno L1 ó L2 ó los antígenos L1 ó L2 presentados juntos como una partícula similar a virus (VLP) o la proteína L1 sola presentada sola en un VLP o estructura de capsómero. Tales antígenos, partículas similares a virus y capsómeros ya son conocidos. Se debe ver por ejemplo los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792, y WO93/02184. Se pueden incluir proteínas tempranas adicionales solas o como proteínas de fusión tales como preferentemente E7, E2 ó E5 por ejemplo; las modalidades particularmente preferidas de esto incluyen un VLP que comprende proteínas de fusión L1E7 (WO 96/11272).

Los antígenos VPH 16 particularmente preferidos comprenden proteínas tempranas E6 ó E7 en fusión con un portador de proteína D para formar Proteína D-E6 ó E7 procedentes de VPH 16 o combinaciones de las mismas; o combinaciones de E6 ó E7 con L2 (WO 96/26277). De manera alternativa, el E6 y E7 de proteínas tempranas de VPH 16 ó 18, pueden ser presentadas en una sola molécula, preferentemente una fusión de Proteínas D-E6/E7. Tal vacuna puede contener opcionalmente cualquiera o ambas de las proteínas E6 y E7 procedentes de VPH 18, preferentemente en la forma de una proteína de fusión de Proteína D-E6 ó Proteína D-E7Ó una proteína de fusión de Proteína D E6/E7. La vacuna de la presente invención puede comprender tradicionalmente antígenos de otras cepas de VPH, preferentemente de las cepas VPH 6, 11, 31, 33 ó 45. Las vacunas de la presente invención comprenden además antígenos derivados de parásitos que causan Malaria. Por ejemplo, los antígenos preferidos procedentes de Plasmodia falciparum incluyen RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende substancialmente toda la parte de terminal C de la proteína circumsporozoite (CS) de P. falciparum enlazada a través de cuatro aminoácidos de la parte preS2 del antígeno de superficie de Hepatitis B al antígeno de la superficie (S) del virus de hepatitis B. su estructura completa se describe en la solicitud de Patente Internacional No. PCT/EP92/02591, publicada bajo el número WO 93/10152 que reclama la prioridad de la solicitud de patente de Reino Unido No. 9124390.7.

Cuando se expresa en RTS de levadura se produce una partícula de lipoproteína, y cuando sé coexpresa con el antígeno S procedente de VBH, se produce una partícula mezclada conocida como RTS.S. En la solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB89/00895, publicada bajo el número WO 90/01496 se describen antígenos TRAP. Una modalidad de la presente invención es una vacuna de Malaria en donde la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodia que son probablemente candidatos para ser componentes de una vacuna de Malaria de multietapas son P.faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrim, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PÍEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp. Las formulaciones también pueden contener un antígeno anti-tumor y ser útiles para cánceres de tratamiento inmunoterapéutico. Por ejemplo, la formulación adyuvante tiene utilidad con antígenos de expulsión de tumores tales como cánceres de próstata, mamarios, colorectales, de pulmón, pancreáticos, renales o de melanoma. Los antígenos de ejemplo incluyen MAGE 1 y MAGE 3 u otros antígenos MAGE para el tratamiento de melanoma, PRAME, BAGE o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Opciones Normales en Inmunología 8, páginas 628 a 636; Van den Eynde y asociados, Revista Internacional de Investigación Clínica y de Laboratorio (presentada en 1997); Corréale y asociados (1997), Revista del Instituto Nacional de Cáncer 89, página 293. De hecho estos antígenos son expresados en un amplio rango de tipos de tumor tales *lréomo melanoma, carcinoma de tumor, carcinoma de sarcoma y de vejiga. Otros antígenos específicos de tumor son adecuados para utilizarse con el adyuvante de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a antígeno específico de próstata (PSA) o Her-2/neu, KSA (GA733), MUC-1 y antígeno carcinoembriónico (CEA). Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, se proporciona una vacuna que comprende una composición adyuvante de acuerdo con la presente invención y un antígeno de expulsión de tumor. Adicionalmente, el antígeno puede ser una auto hormona de péptido tal como una hormona de liberación de hormonas de Gonadotropina de toda la longitud (GnRH, WO 95/20600), un péptido largo de 10 aminoácidos cortos, en el tratamiento de muchos cánceres o ínmunocastración. Se considera que las composiciones de la presente invención serán utilizadas para formular vacunas que contienen antígenos derivados de Borrelia sp.. Por ejemplo, los antígenos pueden incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno o preparaciones antigénicas, proteínas o péptidos producidos en forma recombinante y proteínas de fusión quimérica. En particular, el antígeno es OspA. El OspA puede ser una proteína madura total en una forma lipidada en virtud de la célula huésped (E: Coli) denominada (Lipo-OspA) o un derivado no lipidado. Tales derivados no lipidados incluyen una proteína de fusión NS1-OspA no lipidada que tiene los primeros 81 aminoácidos de terminal N de la proteína no estructural (NS1) del virus influenza y la proteína OspA iú &¿A¿?*r.ít??é*i-~.?¡?áui*.- completa, y otra, MDP-OspA, es una forma no lipidada de OspA que transporta 3 aminoácidos de terminal N adicionales. Las vacunas de la presente invención pueden utilizarse para la profilaxis o terapia de alergia. Tales vacunas podrían comprender antígenos específicos de alergénicos (por ejemplo Der p1) y no específicos de alergénicos (por ejemplo péptidos derivados de IgE humano, incluyendo pero sin limitarse a decapéptido Stanworth (EP 0 477 231 B1)). Las vacunas más preferidas, y los métodos de inducir una respuesta inmune de la presente invención, comprenden el antígeno del virus influenza. Las preparaciones del virus influenza no vivo puede ser derivada del método de huevos embrionarios convencionales, o pueden ser derivados de cualesquiera de los nuevos métodos de generación que utilizan cultivo de tejido para crecer el virus. Los substratos de célula adecuados para crecer el virus incluyen por ejemplo células de riñon de perro, tales MDCK o células de un clon de MDCK, células similares a MDCK, células de riñon de mono tales como células AGMK que incluyen células Vero, o cualquier otro tipo de células adecuadas para la producción del virus influenza para propósitos de vacuna. Los substratos de células adecuados incluyen células humanas, por ejemplo células MRC-5. Los substratos de células adecuados no se limitan a líneas celulares; por ejemplo también se incluyen células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo. La preparación del antígeno del virus de influenza puede ser producido mediante cualquiera de un número de procesos aplicables comercialmente, por ejemplo el proceso de división fafel AA ?*k> «.«--*- i * «*_.,«__..,_.<. , ... . ,„„.. * «üfe§lfc flu descrito en la Patente No. DD 300 833. La influenza de división disponible comercialmente incluye Fluarix™, la cual es vendida por SmithKIine Beecham, de modo que Fluarix en combinación con el adyuvante de la presente invención constituyen una vacuna preferida de la presente invención. La vacuna de influenza de acuerdo con la presente invención, es preferentemente una vacuna de influenza multivalente que comprende dos o más cepas de influenza. Más preferentemente, es una vacuna trivalente que comprende tres cepas. La vacuna de influenza convencional comprende generalmente tres cepas de influenza, dos cepas A y una cepa B. Sin embargo, las vacunas monovalentes, las cuales pueden ser útiles por ejemplo en una situación pandémica, no se excluyen de la presente invención. Una vacuna de flu pandémica monovalente, probablemente contiene el antígeno influenza de una sola cepa A. Por lo tanto, una formulación de vacuna preferida comprende huevos o cultivo de tejido del antígeno influenza, preferentemente antígeno de influenza de división, éter alquilo de polioxietileno y al menos un tensioactivo no iónico adicional, que comprende además una sal biliar o derivado de ácido cólico. Las modalidades preferidas de la vacuna comprenden el antígeno del virus influenza de división, éter de polioxietileno-9 laurilo y Triton-X 100™. Opcionalmente, esta vacuna más preferida puede comprender además un éster sorbitano de polioxietileno tal como TWEEN80™, y/o deoxicolato de sodio. 1 a -S.-t Jd J__ ¿É-t-3-. .t-'-iit......... ...,^ft Já«___t-ul„ La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna es seleccionada como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos, adversos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo del inmunogén específico que se emplee y de cómo se presente. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá de 1 a 1000 µg de proteína, preferentemente de 1 a 500 µg, preferentemente de 1 a 100 µg, lo más preferentemente de 1 a 50 µg. Se puede determinar una cantidad óptima de una vacuna en particular mediante estudios estándares que comprenden la observación de una respuesta inmune apropiada en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o más inmunizaciones de refuerzo espaciadas en forma adecuada. Un aspecto preferido de la presente invención, es cuando el efecto adyuvante del éter alquilo de polioxietileno es aumentado en forma sinérgica mediante el tensioactivo no iónico adicional. A este respecto, la sinergia puede ser observada en la magnitud de la respuesta inmune procedente de la formulación de adyuvante combinado que es mayor a la suma de las respuestas inmune generadas por cada componente individual, cuando se utiliza solo. De manera alternativa, también se puede observar la sinergia cuando bajas dosis de éter de polioxietileno y tensioactivo no iónico adicional generan respuestas inmunes significativas, aún cuando uno o cada componente puede no generar respuestas inmunes significativas o detectables cuando se utilizan solas. Un aspecto de la presente invención es formulaciones de adyuvante y vacuna que comprenden un éter o éster alquilo de polioxietileno y al -A- t-.- --b-fc . | |¡t|Hr»»^ «. ---«- .. -..«.-. , . ,. . __ fcJjÉ¡i¡ menos un tensioactivo no iónico adicional , en donde el antígeno presenta una vacuna no está atrapado dentro de una vesícula de tensioactivo no iónico. Las vacunas de la presente invención tam bién pueden ser adm inistradas de forma oral. En tales casos el excipiente farmacéuticam ente aceptable tam bién puede incluir amortiguadores alcalinos, o cápsulas entéricas o microgránulos. Las vacunas de la presente invención tam bién pueden ser adm i nistradas a través de la ruta vagi nal . En tales casos, los excipientes farm acéuticam ente aceptables tam bién pueden incluir em ulsificantes, pol ímeros, tales como CARBOPOL® , y otros estabilizadores conocidos de crem as y supositorios vaginales. Las vacunas de la presente invención, tam bién pueden ser adm inistradas en forma rectal . En tales casos los excipientes tam bién pueden incluir ceras y pol ímeros conocidos en la técnica para formar supositorios rectales. Las form ulaciones de la presente invención tam bién pueden ser utilizadas para propósitos tanto profilácticos como terapéuticos. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para tratar a un mam ífero susceptible a o que padece de una enfermedad infecciosa o cáncer, o alergia, o padecim iento auto inm unológico. En un aspecto adicional de la presente invención , se proporciona una com binación de adyuvante y una vacuna tal com o se describe en la presente invención, para utilizarse en medicina. La preparación de vacuna general mente se describe en la publicación de N uevas Tendencias y Desarrollo en Vacunas, editada por Vollet y asociados, University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 1978. Una modalidad de la presente invención, se refiere al uso de tensioactivos no iónicos tales como éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula general (I), y un octoxinol, en la fabricación de la formulación adyuvante. La presente invención también se relaciona con el uso de un éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula general (I), o un octoxinol, y un antígeno en la fabricación de formulaciones de vacuna. Opcionalmente, el adyuvante y vacunas fabricados tal como se describe, pueden comprender además un éster sorbitano de polioxietileno. En todos estos aspectos de la presente invención, el éter alquilo de polioxietileno preferido es éter de polioxietileno-9-laurilo y el octoxinol preferido es t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X- 100™). En una modalidad alternativa relacionada con la presente invención, los adyuvantes de la presente invención pueden ser combinados adicionalmente con otros adyuvantes, incluyendo toxina de Cólera y su sub-unidad B, enterotoxina labile por calor E.Coli, LT, su LTB de subunidad B y versiones detoxificadas de los mismos, tales como mLT; el lípido Monofosforilo A y su derivado no tóxico lípido monofosforilo 3-O-deacilado A (3D-MPL, tal como se describe en la Patente del Reino Unido No. GB 2,220,211), fracciones de saponina inmunológicamente activa, por ejemplo, Quil A derivado de la corteza del árbol de Quíllaja Saponaria Molina de América del Sur y derivados de las mismas (por ejemplo QS21, Patente Norteamericana No. 5,057,540), y el sistema adyuvante de oligonucleótido CpG (tal como se describe en la publicación WO ;.Ji-a-tJ.,MdjÍ,.,.-.^«.. 96/0255), especialmente 5TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT3' (SEQ ID NO. 1). Se prefiere de manera particular una combinación adyuvante de un éter alquilo de polioxietileno (tal como éter de polioxietileno-9-laurilo), un tensioactivo no iónico adicional (tal como t-octilfenoxi Polietoxietanol (Tritón X-100™)), y el lípido monofosforilo 3-O-deacilado (3D-MPL). Esta modalidad preferida puede comprender adicionalmente de manera opcional un éster sorbitano de polioxietileno tal como TWEEN80™, y/o una sal biliar o derivado de ácido cólico tal como deoxicolato de sodio. Las vacunas que comprenden esta formulación adyuvante y los antígenos de influenza, especialmente antígenos de influenza de división son particularmente preferidos. La presente invención se ilustra, pero no se limita a los siguientes ejemplos. EJEMPLOS Ejemplo 1, Método que se utiliza para medir las respuestas de anticuerpo (Ab) en sueros ELISA para la medida de Abs Ig de suero específico de influenza en monos: Se recubre una inmuno placa Maxisorp Nunc durante la noche a una temperatura de 4°C con 50 µl/depósito de 1 µg/ml HA de virus de influenza desactivada ß-propiolactona (BPL) (suministrado por el fabricante SSD GmBH, Dresden, Alemania) diluido en PBS. Se bloquean los sitios libres en la placas (1 hora a 37°C), utilizando amortiguador de saturación: PBS que contiene 1% de BSA, 01% de Monolaurato sorbitano de polioxietileno (TWEEN 20). Posteriormente, se incuban durante 1 hora 30 minutos a una temperatura de 37°C, diluciones en serie de 2 dobleces (en amortiguador de saturación, 50 µl por depósito) de un suero de referencia agregado en la forma de una curva estándar (suero que tiene un titulador de punto medio expresado como ELISA Unidad/ml y puesto en la flecha A) y muestras de suero (comenzando con una dilución 1/100 y puestos en las flechas de la B a la H). Posteriormente, la placas son lavadas (x3) con amortiguador de lavado (PBS, 0.1% de Monolaurato sorbitano de polioxietileno (TWEEN 20)). Posteriormente, se incuban (50 µl/depósito) durante 1 hora 30 minutos a una temperatura de 37°C, Ig antihumano de cabra biotinado (Amersham) diluido 1/3000 en amortiguador de saturación. Después de 3 lavados, y la adición subsecuente de conjugado de peroxidasa de estreptavidin-rábano (Amersham) las placas son lavadas 5 veces e incubadas durante 20 minutos a temperatura ambiente con 50 µl/depósito del amortiguador de revelación (OPDA 0.4 mg/ml (Sigma) y H2O2 0.3% en 50mM pH 4.5 de amortiguador de citrato). La revelación se detiene agregando 50 µl/depósito de H2SO 2N. Las densidades ópticas son medidas a 492 y 630 nm utilizando un inmulector Biorad 3550. Las titulaciones de anticuerpo son calculadas por el método matemático de 4 parámetros utilizando el software SoftMaxPro. Actividad de Inhibición de Hemaglutinación (HAI) de suero específico de Flu Abs en monos. Con el objeto de eliminar los inhibidores no específicos de hemaglutínación presente en los sueros de primates, estos (25 µl) son incubados durante la noche a una temperatura de 37°C con una solución de mezcla de cloruro de calcio/borato/borato de sodio que contiene 400 unidades de enzima de recepción de destrucción de receptor por ml neuraminidasa de V. Cholerae (Boerhinger Mannheim). Después de la adición de 75 µl de citrato de sodio al 2.5%, los sueros son calentados durante 30 minutos a una temperatura de 56°C. Se agrega una solución de 50µl de PBS para producir una dilución de suero final de 1/10th. Posteriormente, se diluyen 25 µl de sueros tratados en 25 µl de PBS (diluciones en serie de 2 dobleces comenzando en 1/10) en placas Greiner de 96 depósitos. El virus completo desactivado por BPL, se agrega (25 µl/depósito) en una concentración de 4 Unidades de Hemaglutinación (por ejemplo en una dilución la cual es 4 dobleces inferior a la última que provoca la aglutinación de las células de glóbulos rojos) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) bajo agitación. Posteriormente, se agregan células de glóbulos rojos de pollo (25 µl/depósito) durante 1 hora a RT. Las placas se mantienen finalmente durante la noche a una temperatura de 4°C antes de ser leídas. El titulador HAI corresponde al inverso de la última dilución de suero que inhibe la hemaglutinación inducida por virus. ELISA para la medida de suero específico de toxoide de tétanos (TT) IgG en ratones: Se recubrieron en unas placas Maxisorp Nunc durante la noche a una temperatura de 4°C con 50 µl/depósito de 1 µg/ml de antígeno (TT abastecido por Boerhinger) diluido en PBS (en las flechas de la B a la H de la placa) o con 50 µl de 5 µg/ml de Ig antiratón de cabra purificado ?iiit :i A m, ¡t . Ui á? •*•-- i-*----* - . ?- --J-.-J (Boerhinger), en PBS (flecha A). Se bloquearon los sitios libres en las placas (1 hora, 37°C) utilizando un amortiguador de saturación: PBS que contiene 1% de BSA, 0.1% de Monolaurato sorbitano de polioxietileno (TWEEN 20), y 4% de Suero de Bovino Normal (NBS). Posteriormente, se incubaron series de diluciones de 2 dobleces (en amortiguador de saturación 50 µl por depósito) de la mezcla de isotipo IgG agregada como una curva estándar (mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón y lgG1, lgG2a e lgG2b procedente de Sigma, comenzando a 200 ng/ml y puestos en la flecha A) y muestras de suero (comenzando en una dilución de 1/100 puestas en las flechas de la B a la H) durante 1 hora 30 minutos a una temperatura de 37°C. Posteriormente, las placas fueron lavadas (x3) con amortiguador de lavado (PBS, 0.1% de Monolaurato sorbitano de polioxietileno (TWEEN 20)). Posteriormente, el IgG antiratón de cabra biotinilado (Amersham) diluido 1/5000 en amortiguador de saturación, se incubaron (50 µl/depósito) durante 1 hora 30 minutos a una temperatura de 37°C. Después de 3 lavados y de la adición subsecuente de conjugado de peroxidasa de rábano-estreptavidin (Amersham) las placas fueron lavadas 5 veces e incubadas durante 20 minutos a temperatura ambiente con 50 µl/depósito de un amortiguador de revelación (OPDA 0.4% mg/ml (Sigma) y H2O2 0.03% en 50 mM pH 4.5 de amortiguador de citrato). Se detuvo la revelación agregando 50 µl/depósito de H2SO 2N. Las densidades ópticas fueron leídas a 492 y 630 nm utilizando un inmunolector Biorad 3550. Los tituladores de anticuerpo fueron calculados a través del método matemático de 4 parámetros utilizando software SoftMaxPro.

« Ejemplo 2, Efecto de laureto 9 junto con una combinación de TWEEN80 y TritonXlOO en la inmunogenicidad de una vacuna de influenza intranasal en monos Rhesus preparados. Se realizó la preparación en monos Rhesus administrando con un aparato de rocío (bajo anestesia) en cada fosa nasal 25 µg HA por cepa de virus de influenza A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94 desactivado por ß-propiolactona contenido en 100 µl de PBS. Después de 28 días, los monos (4 ó 5 animales del mismo grupo) fueron reforzados en forma intranasal (bajo anestesia) con 200 µl de solución (100 µl por fosa nasal, administrada con un aparato de rocío) que contiene 30 µg HA/cepa del virus influenza A/Beijing/262/95 y B/Harbin/7/94 desactivado por BPL ya sea en A: 0.5% de éter de polioxietileno-9-lauril (L9); B: 0.5% de éter de polioxietileno-9-laurilo + TWEEN80 (0.11%) + triton-X-100 (0.074%); o por C: inyección intramuscular de 15 µg HA/cepa de una vacuna de influenza que contiene las mismas cepas que en A y B. Los antígenos virales fueron crecidos en huevecillos procedentes de existencias en semillas proporcionadas por el proveedor (SSD GmBH, Dresden, Alemania). Las respuestas HAI e Ig Ab fueron medidas en sueros tal como se describe en el ejemplo 1. Los resultados son expresados como porcentajes de animales que han experimentado una elevación Ab de 4 dobleces al momento del refuerzo. La experiencia previa con 0.5% de éter de polioxietileno-9-laurilo ha demostrado que esta formulación es potente en la inducción de respuestas inmunes sistémicas anti-influenza. Sin embargo, tal como se muestra en la tabla 1, este nivel de capacidad de adyuvancia se mejora lAsl.A?.áxk.juii ?. -J-i--i.t.. en forma significativa con la adición de tensioactivos no iónicos adicionales. Por lo tanto, cuando el éter de polioxietileno-9-laurilo es suplementado con TWEEN80 y Triton-X-100, esta formulación tiene la capacidad de reforzar las respuestas Ig Ab sistémicas establecidas previamente, en forma tan eficiente como la vacuna de influenza parenteral clásica. La respuesta de inhibición de hemaglutinación (HAI) también fue medida (tabla 2) una vez más, la mejor formulación intranasal es éter de polioxietileno-9-laurilo suplementado con TWEEN80 y Triton-X-100. Esta formulación fue igualmente tan inmunogénica como la vacuna parenteral clásica. Tabla 1, respuestas Ig de suero en monos Ejemplo 3: Comparación de la Inmunogenicidad de una vacuna de influenza de división intranasal formulada con laureto 9 con TWEEN80 y Triton-X-100, con la inmunogenicidad de una vacuna parenteral convencional con licencia (Fluarix™) en sujetos adultos saludables.

LA j ?._l.--t?- j.-.iLi-i-h.; .... ? Se evaluó una formulación mtranasal de antígenos de influenza de división derivados de huevecillos, formulada con laureto 9 + TWEEN80 y Triton-X-100 (A) y se comparó con Fluarix™/a-Rix® (B). Las formulaciones contenían 3 antígenos de virión de división desactivados preparados a partir de las cepas recomendadas por WHO de la temporada 1998/1999. El aparato utilizado para la administración de las vacunas, fue la jeringa intranasal Accuspray™ de Becton Dickinson. El aparato trabaja en bases similares a una jeringa convencional, pero tiene una punta especial que contiene canales en espiral que dan como resultado la producción de un rocío cuando se ejerce una presión uniforme en el embolo. Se rociaron 100 µl de la formulación en cada fosa nasal. Composición de la Formulación La formulación ¡ntranasal (A) contenía los siguientes virions de división desactivados: 1.30µg HA A/beijing/262/95 (H1IM1) 2.30µg HA A/Sydney/5/97 (H3N2) 3.30µg HA de B/Harbin/7/94 y solución salina amortiguada por fosfato con pH 7.4 ± 0.1, 0.1% de TWEEN80, 0.015% de Triton-X-100, 0.0045% de deoxicolato de sodio y tiomersal debajo de 35 µg/ml. El volumen de una dosis fue de 200 µl (subdosis de 100µl para cada fosa nasal). La formulación A fue adyuvada con laureto 9 para obtener una concentración final de 0.5% (p/v). b. i.-.A.i i.r *fl*t**.all áAi>*.« ¿.. .-.. . „ _. „ ._.__.>_tAtJttJ^^.^, .,., ____, __^._,._. , .._.___,-_ .I, _fc.

El comparador Fluarix™/ -Rix® (B) es la vacuna de influenza de división trivalente desactivada comercializada por SmithKMneBeecham Biologicals', la cual es administrada en forma intramuscular en una dosis de 500 µl. Estudio de Inmunogenicidad Un estudio abierto controlado y aleatorio evaluó la inmunogenicidad de una vacuna de influenza de división intranasal formulada con laureto 9 y suplementado con TWEEN80 y Triton-X-100 comparado con la vacuna parenteral convencional (por ejemplo, Fluarix™). Veinte sujetos adultos saludables (con edades de 18 a 40 años) recibieron una dosis de Fluarix™, y diez sujetos recibieron una dosis (dos sub-dosis, una por fosa nasal) de la vacuna de influenza intranasal. Existió un período de seguimiento de ocho días para que los síntomas locales y generales y ambas vacunas fueran bien toleradas en relación con la seguridad y reactogenicidad. No se reportaron eventos adversos serios relacionados con la vacunación. La inmunogenicidad de las vacunas se examinó evaluando los tituladores de inhibición de hemaglutinación de suero (Hl) para determinar el rango de suero conversión (definido como el porcentaje de vacunas que tienen al menos un incremento de 4 dobleces en los tituladores Hl de suero en el día 21, comparados con el día 0 para cada cepa de vacuna), factor de conversión (definido como el incremento en dobleces en Tituladores Promedio Geométricos Hl (GMTs) en el día 21 comparados con el día 0 para cada cepa de vacuna) y rango de suero protección (definido como el porcentaje de vacunas con un titulador Hl de suero >40 después de la vacunación (para cada cepa de la vacuna), esto es aceptado como protección de indicación. Además, la respuesta del anticuerpo IgA de mucosa fue evaluado mediante el Ensayo Inmunoabsorbente enlazado por Enzimas (ELISA). Los rangos de suero de positividad, suero conversión y suero protección de Hl 21 días después de una dosis de Fluarix™ o la formulación intranasal, se pueden observar en la tabla 3. Tabla 3: Rangos sueropositividad, sueroconversión y sueroprotección de Hl en 21 días después de la dosis 1: Seropositividad (n,%): número y porcentaje de sujetos con titulación = 10 Seroprotección (n,%): número y porcentaje de sujetos con titulación > 40 Seroconversión (n,%): número y porcentaje de sujetos con al menos un incremento de 4 dobleces en tituladores a partir del día 0 al día 21. ii AA4-J.a *??4??nt ii t-miBTtif mi • rfi ii-WfílifttiÉiiiii'"" - ^~------- -.X?? El porcentaje de sujetos con un incremento de 2 dobleces o de 4 dobleces en la proporción de anticuerpo IgA de mucosa específica/total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis), se puede observar en la tabla 4. Tabla 4: Porcentajes de sujetos con un incremento de 2 dobleces o de 4 dobleces en la proporción IgA específica /total entre el día 21 y el día 0 (1 dosis) Resumen Los resultados de inmunogenicidad tabulados anteriormente, muestran que la formulación intranasal produjo niveles similares de seropositividad, seroconversión y seroprotección a los de la vacuna parenteral convencional (Fluarix™) 21 días después de una dosis. La formulación intranasal generalmente produjo una mejor respuesta IgA mucosa después de una dosis, que la vacuna parenteral convencional (Fluarix™) Ejemplo 4, El efecto de laureto-9 junto con Triton-X-100 en la inmunogenicidad de una vacuna de toxoide de tétanos intranasal en ratones preparados. En el presente ejemplo, evaluamos el efecto de agregar Tritón X100 a una dosis baja y sub-óptima de laureto-9 en el refuerzo intranasal de los anticuerpos de suero específicos de toxoide de tétanos (TT). Se m»-,.A.-. -. ..... aMuutáí?Uf-gtmff f- - •--• prepararon ratones hembra balb/c en forma intramuscular con 20% (2x50 µl) de la dosis humana de la vacuna DTPa comercial (Difteria, Tétanos, vacuna Pertussis acelular: INFANRIX™ SmithKIine Beecham, Bélgica). Un mes después los ratones fueron reforzados en forma intranasal (5 µl en cada fosa nasal bajo anestesia) con 5 µg TT en A:PBS; B: 0.5% de éter de polioxietileno-9-laurilo; C: 0.1% de éter de polioxietileno-9-laurilo; D: 0.1% de éter de polioxietileno-9-laurilo + 0.02% de Tritón X100 o; E: mediante inyección intramuscular de la vacuna de DTPa (2x50 µl). Dos semanas después del refuerzo, se analizaron dos sueros con respecto a su IgG específico de TT. Tal como se muestra en la Figura 1, la dosis baja de laureto-9 (0.1%) no fue efectiva en aumentar la respuesta de refuerzo para TT, en forma contraria la dosis de 0.5%. Sin embargo, la capacidad de adyuvancia de la formulación fue altamente mejorada suplementandola con Tritón X100 (p<0.0001). La respuesta de anticuerpo obtenida fue similar a la vacuna DTPa comercial. l.tA .ái^.faJá^....

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición adyuvante que comprende (a) éter o éster alquilo de políoxietileno de la fórmula general (I): HO(CH2CH2O)n-A-R en donde, n es de 1 a 50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo d. 5o o alquilo C?-50 fenilo; y (b) al menos un tensioactivo no iónico adicional. 2. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 1, en donde el tensioactivo no iónico adicional es un Octoxinol. 3. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 2, en donde el Octoxinol es t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X100™). 4. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, que comprende además uno o ambos de un éster sorbitano de polioxietileno o ácido cólico o derivado de los mismos. 5. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque el éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I) es hemolítico. 6. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque el grado de actividad hemolítica del éter o éster alquilo de polioxietileno está dentro del rango de 0.05 a 0.0001 %, tal como se mide en el análisis de hemolisis de sangre de Cerdo de Guinea. 7. Un adyuvante tal como se describe en la reivindicación 5 o en la reivindicación 6, en donde el éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I) tiene una actividad hemolítica con una diferencia de diez dobleces a la del éter de polioxietileno-9-laurilo o éter de polioxietileno-8- 5 estearilo, tal como se mide en el ensayo de hemolisis de sangre de Cerdo de Guinea. 8. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, que comprenden un éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I), en donde n es de 4 10 a 24. 9. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 8, en donde n es 9. 10. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, que comprende un 15 éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I), en donde R es alquilo C8-2o o alquilo Cs-?o fenilo. 11. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 10, en donde R es alquilo C12. 12. Una composición adyuvante tal como se describe en 20 cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, que comprende un éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I), en donde A es un enlace, por lo que se forma un éter. 13. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, que comprende un -.*» ; AÁsti * .i-a.^*----.^ éter o éster alquilo de polioxietileno de la fórmula (I), en donde A es -C(O)-, por lo que se forma un éster. 14. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en donde el éter o éster de polioxietileno de la fórmula (I), es seleccionado del grupo que comprende: éter de polioxietileno-9-laurilo, éster de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-9-estearilo, éter de polioxietileno-8-estearilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, éter de polioxietileno-23-laurilo. 15. Una combinación adyuvante que comprende éter de polioxietileno-9-laurilo y t-octilfenoxipolietoxíetanol (TRITÓN X100™). 16. Una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde la concentración total del detergente presente está dentro del rango de 0.001 al 10%. 17. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 16, en donde la concentración total del detergente está dentro del rango de 0.01 a 1%. 18. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 17, en donde la concentración total del detergente está dentro del rango de 0.01 a 0.7%. 19. Una combinación adyuvante, que comprende un adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17, en combinación con al menos un inmunoestimulante adicional. ÍA. ii BHf *jt--mfcf ¿a*-*..-».. - 'M»-r -t-A.l. 20. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 19, en donde al menos un inmunoestimulante adicional es seleccionado del grupo que comprende: LT, CT, 3D-MPL, CpG, y QS21. 21. Una composición adyuvante tal como se describe en la reivindicación 20, en donde el adyuvante CpG es: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEQ ID NO. 1). 22. Una combinación adyuvante que comprende éter de polioxietileno-9-laurilo, t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™), y 3D-MPL. 23. Una vacuna que comprende un adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, que comprende además un antígeno. 24. Una vacuna tal como se describe en la reivindicación 23 en donde el antígeno es seleccionado del grupo que comprende: Virus de Inmunodeficíencia Humana, Virus Zoster de Varicela, Virus de Herpes Simple tipo 1, Virus de Herpes Simple tipo 2, citomegalovirus Humano, Virus del Dengue, Hepatitis A, B, C, o E, Virus Sincitial Respiratorio, Virus de Papiloma Humano, Virus Influenza, Hib, Virus de Meningitis, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Micoplasma, Micobacteria, Hemofilus, Plasmodium o Toxoplasma, stanworth o antígenos asociados con tumor (TMA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, LnRH, CEA, PSA, KSA, o PRAME. 25. Una vacuna de tal como se describen en la reivindicación 24, en donde el antígeno es un antígeno o preparación antigénica del virus Influenza. L¿J*?Jbi fc .®&¿J&teis -^-¿¿s ax^i 26. Una composición de vacuna que comprende éter de polioxietileno-9-laurilo, t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™) de un antígeno de virus Influenza. 27. Una composición de vacuna tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 26, en donde la vacuna esta en la forma de un aerosol o rocío. 28. Una vacuna tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27, para utilizarse en medicina. 29. El uso de una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, en la fabricación de un medicamento para aplicación en una superficie mucosa o la piel del paciente. 30. El uso de una combinación de éter de polioxietileno-9-laurilo y t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITÓN X100™) en la fabricación de una vacuna para aplicación en una superficie mucosa de un paciente. 31. Un aparato de rocío, más particularmente un aparato de rocío de bi-dosis, lleno con una vacuna, tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27. 32. El uso de una composición de vacuna tal como se define en cualesquiera de las reivindicaciones de 23 a la 27, para la fabricación de una vacuna para el tratamiento de infecciones virales, bacterianas o de parásitos, alergia o cáncer. 33. Un método para tratar a un mamífero que padece o es susceptible a una infección patógena, o cáncer o alergia, que comprende la administración al mamífero de una cantidad segura y efectiva de ?i?l????? .*.,„. ^^^ ..-...^.. **&*& ? i afai vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27. 34. Un método para tratar a un mamífero que padece o es susceptible a una infección patógena, o cáncer o alergia, que comprende la administración mucosa de una cantidad segura y efectiva de una composición de vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27. 35. Un método para tratar a un mamífero que padece o es susceptible a una infección patógena, o cáncer o alergia, que comprende la administración intranasal de una cantidad segura y efectiva de una composición de vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27. 36. Un proceso para elaborar una composición de vacuna de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 23 a la 27, que comprende mezclar (a) una composición adyuvante tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 22, (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable, y (c) un antígeno o composición antigénica. JM*«* *-*» |J. ..J;JÍ._,<Í_L,*