KR20170028442A

KR20170028442A - 인자 h 결합 단백질 변이체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20170028442A
Application number: KR1020177004378A
Authority: KR
Inventors: 피터 티. 비어닝크
Original assignee: 칠드런즈 하스피틀 앤드 리써치 센터 앳 오클랜드
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2017-03-13
Also published as: JP2021000121A; JP2017522877A; US11834476B2; US11673920B2; JP2023011916A; US20200109179A1; EP3172224A4; EP4074726A2; RU2017104742A; AU2021203828B2; NZ766005A; CA3212723A1; ES2922554T3; NZ729206A; US20240101610A1; MX2023000204A; AU2015292615A1; US20240025951A1; US10836799B2; WO2016014719A1

Abstract

나이세리아 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 대해 살균성인 항체를 유도할 수 있는, 변이체 인자 H 결합 단백질, 상기 단백질을 포함하는 조성물, 및 상기 단백질의 사용 방법이 제공된다.

Description

인자 H 결합 단백질 변이체 및 이의 사용 방법{FACTOR H BINDING PROTEIN VARIANTS AND METHODS OF USE THEREOF}

교차 참조

본 출원은, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된, 2014년 7월 23일 수요일자로 출원된 미국 가특허원 제62/028,123호에 대한 우선권을 청구한다.

도입

나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitides)는 인간 상부 호흡관에 군집하는 그람-음성 세균이고 가장 악명높게 전세계적으로 만연되고 주기적 유행성의 수막염 및 패혈증의 발병에 관여한다. 질환위협 비율 및 이환율은 2세 미만의 어린이에서 가장 높다. 다른 그람-음성 세균 처럼, 나이세리아 메닌기티디스는 전형적으로 세포질막, 펩티도글리칸 층, 외부 환경으로 돌출된 세포 벽 및 필리(pili)를 캡슐 다당류와 함께 구성하는 외막을 갖는다. 나이세리아 메닌기티디스의 캡슐화된 균주는 어린이 및 젊은 성인에서 세균 수막염 및 패혈증의 주요 원인이다. 침습성 나이세리아 메닌기티디스 감염의 유병률 및 경제적 중요성은 상이한 균주에 걸쳐서 그리고 특히 상이한 혈청형 또는 혈청아유형을 갖는 유전학적으로 다양한 그룹 B 균주에 걸쳐 면역성을 부여할 수 있는 효과적인 백신에 대한 연구를 가동시켰다.

인자 H 결합 단백질(fHbp, 또한 당업계에서 지질단백질 2086(문헌참조: Fletcher et al (2004) Infect Immun 72:2088-2100),게놈-구동된 나이세리아 항원(GNA) 1870(문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99)또는 "741"로서 언급됨)은 세균에서 표면 노출된 지질단백질로서 발현되는 엔. 메닌기티 디스 단백질이다. fHbp의 중요 작용은 보체 활성화를 하향조절하는 인간 보체 인자 H(fH)에 결합한다는 것이다. fH의 상기 세균 표면으로의 결합은, 병원체가 비-면역 인간 혈청 또는 혈액에서 생존하고 순수한 숙주 방어를 공격하는 중요한 기작이다. 최근에, 인간 인자 H 유전자 클러스터에서 유전학적 변화는 뇌척수막염 질환의 발병에 대한 감수성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Davila S et al. (2010) Nat Genetics doi:10.1038/ng.640). fH의 fHbp로의 결합은 인간 fH 및 몇몇의 비-인간 영장류에 대해 특이적이고 이는 나이세리아 메닌기티디스가 전적으로 인간 병원체인지에 대한 이유를 부분적으로 설명할 수 있다. fHbp는 인터넷(pubmlst(dot)org/neisseria/fHbp) 상의 fHbp 데이터베이스 내에 배정된 식별 (ID) 번호에 의하여 지정된 많은 천연 서열 변이체 내에서 발생한다.

효과적인 살균 항체 반응을 유도할 수 있는 fHbp 폴리펩티드가 여전히 요구된다.

요약

특징

본 개시내용은 인자 H 결합 단백질 (fHbp) ID 1의 변이체를 제공한다. 본 개시내용은 fHbp의 변이체를 제공하며, 여기서 상기 변이체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환; b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환; d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환, 여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 1 (서열 번호: 1)에 대한 것이며, 상기 변이체는 서열 번호: 1에 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 나이세리아 메닌기티디스 중 적어도 하나의 균주에 반응하는 살균성 항체를 유도한다. 일부 경우에서, Q38에서의 아미노산 치환은 Q38R, Q38K, Q38H, Q38F, Q38Y, 또는 Q38W이다. 일부 경우에서, E92에서의 아미노산 치환은 E92K, E92R, E92H, E92F, E92Y, 또는 E92W이다. 일부 경우에서, S223에서의 아미노산 치환은 S223R, S223K, S223H, S223F, S223Y, 또는 S223W이다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 하기를 추가로 포함할 수 있다: fHbp ID 1에 대한 R41S 또는 R41A 치환. 예를 들어 변이체 fHbp는 하기를 포함할 수 있다: fHbp ID 1에 대한, R41S 또는 R41A 치환 및 S223에서의 치환, 예컨대 R41S/S223R. 기타 경우에서, 변이체 fHbp 하기를 추가로 포함할 수 있다: fHbp ID 1에 대한, R41S 또는 R41A 치환 및 H248L 치환. 특정 경우에서, 변이체 fHbp는 본원에 개시된 치환 중 2개, 3개, 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 특정 예시에서, 변이체 fHbp는 하기 치환을 포함할 수 있다: fHbp ID 1에 대한, S223R 및 H248L. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다.

본 개시내용은 fHbp ID 22의 변이체를 제공한다. 본 개시내용은 fHbp의 변이체를 제공하며, 상기 변이체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환; b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환; c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환; d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환 ; e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환, 여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 것이며, 상기 변이체는 서열 번호: 2에 적어도 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, V131에서의 아미노산 치환은 V131D, V131E, V131K, V131R, V131H, V131F, V131Y, 또는 V131W이다. 일부 경우에서, K219에서의 아미노산 치환은 K219N, K219Q, K219D, K219E, K219F, K219Y, 또는 K219W이다. 일부 경우에서, G220에서의 아미노산 치환은 G220S, G220N, G220Q, G220D, G220E, G220K, G220R, G220H, G220F, G220Y, 또는 G220W이다.

일부 경우에서, 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: 야생형 (WT) fHbp, 예컨대 WT fHbp ID 22의 열 안정성과 비교한, 변이체 fHbp의 열 안정성을 증가시키는 이중 돌연변이. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 하기를 포함할 수 있다: fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 치환 L130R 및 G133D, 여기서 상기 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체는 fHbp ID 22의 열 안정성과 비교하여, 보다 높은 열 안정성을 갖는다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 of 치환, 예컨대, L130R, G133D, 및 하기로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환의 조합을 포함할 수 있다: a) N115I; b) D121G; c) S128T; d) V131; e) K219 (예컨대 K219N); 및 f) G220 (예컨대 G220S), 여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 것이고, 상기 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다. 변이체 fHbp의 열 안정성은 WT fHbp (예컨대 fHbp ID 22) 보다 하기만큼 더 높을 수 있다: 적어도 5℃, 10℃ , 15℃, 20℃ 이상, 예컨대 5℃-30℃, 5℃-25℃, 5℃-20℃, 10℃-20℃, 또는 15℃-20℃. 본원에 사용된 바와 같이, "열 안정성"은 보다 높은 온도에 노출될 경우의 단백질의 안정성; 변이체 단백질이 야생형 단백질 보다 높은 온도에서 이의 배좌를 유지하는 열 안정성을 지칭한다. 예를 들어, 야생형 (WT) fHbp, 예컨대 WT fHbp ID 22의 열 안정성과 비교한, 열 안정성을 증가시키는 이중 돌연변이를 포함하는 변이체 fHbp는, 예컨대 WT fHbp와 비교하여, 보다 높은 온도에서 언폴딩(unfold)될 수 있다. 특정 경우에서, 변이체 fHbp의 N-말단 도메인은 WT fHbp (예컨대 fHbp ID 22)의 N-말단 도메인보다 더 높은 온도에서 언폴딩될 수 있다.

또한 본원에 개시된 것은, WT fHbp와 비교하여 열 안정성을 증진시키는 돌연변이를 포함하고, fH의 결합을 감소시키는 것으로 알려진 추가적인 돌연변이, 예컨대 Us2011/0256180에 개시된 것들을 추가로 포함하는, fHbp 변이체이다. 특정 구현예에서, 인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체가 개시되며, 여기서 상기 변이체는 하기를 포함한다: 아미노산 치환 L130R 및 G133D 및 하기 중 적어도 하나의 치환: R80A, D211A, E218A, E248A, G236I, T221A, 및 H223A (fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대하여), 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다.

본 개시내용은 fHbp ID 55의 변이체를 제공한다. 본 개시내용은 fHbp의 변이체를 제공하며, 상기 변이체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환, 여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 55 (서열 번호: 3)에 대한 것이고, 상기 변이체는 서열 번호: 3에 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 약 50% 미만인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 살균성 항체 반응을 유도한다.

그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합한다. 일부 경우에서, E92에서의 아미노산 치환은 E92K, E92R, E92H, E92F, E92Y, 또는 E92W이다. 일부 경우에서, S223에서의 아미노산 치환은 S223R, S223K, S223H, S223F, S223Y, 또는 S223W이다. 일부 경우에서, H248에서의 아미노산 치환은 H248L, H248I, H248V, H248D, H248E, H248F, H248Y, 또는 H248W이다.

본 개시내용은 본 개시내용의 변이체 fHbp를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 하기를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다: a) 변이체 fHbp (상기 문단 0006-0010 중 임의의 하나에 따름); 및 b) 약제학적으로 허용가능한 부형제. 일부 경우에서, fHbp 변이체는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 제조된 소포체 제제에 존재한다. 일부 경우에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 하기를 포함한다: 보조제 (예컨대 상기 보조제가 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄일 경우). 일부 경우에서, 약제학적 조성물은 추가로 나이세리아(Neisserial) 표면 단백질 A을 포함한다.

본 개시내용은 하기를 암호화하는 핵산을 제공한다: 변이체 fHbp (상기 문단 0006-0010 중 임의의 하나에 따름). 본 개시내용은 하기를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다: 변이체 fHbp (상기 문단 0006-0010 중 임의의 하나에 따름). 본 개시내용은 하기를 암호화하는 핵산을 포함하는 시험관내 숙주 세포를 제공한다: 변이체 fHbp (상기 문단 0006-0010 중 임의의 하나에 따름). 본 개시내용은 하기를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 시험관내 숙주 세포를 제공한다: 변이체 fHbp (상기 문단 0006-0010 중 임의의 하나에 따름).

본 개시 내용은 포유동물에서 항체 반응을 유도하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 문단 0011의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 포유동물은 인간이다. 일부 경우에서, 상기 항체 반응은 엔. 메닌기티디스 (N. meningitides)의 하나 이상의 균주에 대한 살균성 항체 반응이다.

도 1은 하기를 도시한다: 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된, 정제된 재조합 fHbp ID 1 돌연변이체. 레인 1, 칼레이도스코프(Kaleidoscope) 분자량 마커 (Bio-Rad Laboratories); 2, fHbp ID 1 야생형; 3, Q38R; 4, E92K; 5, R130G; 6, S223R; 7, H248L.
도 2A 및 2B는 하기를 도시한다: ELISA에 의하여 측정시, 인간 fH에 대한 fHbp ID 1 돌연변이체의 결합. 중복 측정에 대한 평균치 및 범위가 나타난다.
도 3A-3E는 하기를 도시한다: 표면 플라스몬 공명에 의하여 측정시, 인간 fH에 대한 fHbp ID 1 돌연변이체의 결합. 참고로, ID 1 야생형 (WT) 단백질에 대한 상동한 데이터가 하기에 나타난다: 각각의 도 3A-3E.
도 4A-4E는 하기를 도시한다: ELISA에 의하여 측정시, fHbp ID 1 돌연변이체 단백질에 대한 뮤린 항fHbp 단클론성 항체 (mAb)의 결합. 중복 측정에 대한 평균치 및 범위가 나타난다.
도 5A 및 5B는 하기를 도시한다: fHbp ID 1 돌연변이체로 면역화된 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 각 부호는 개별 마우스의 역가를 나타내고, 수평 막대는 기하학적 평균 역가를 나타낸다. 도 5A는 하기를 도시한다: fHbp ID 1 돌연변이체로 면역화된 야생형 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 도 5B는 하기를 도시한다: fHbp ID 1 돌연변이체로 면역화된 인간 fH 형질전환 마우스 유래의 혈청의 살균 활성.
도 6A 및 6B는 하기를 도시한다: fHbp ID 1 단일 또는 이중 돌연변이체의 특성화. 도 6A는 하기를 도시한다: fHbp ID 1 이중 돌연변이체에 대한 인간 fH의 결합. 도 6B는 하기를 도시한다: 돌연변이체에 대한 뮤린 항fHbp 단클론성 항체 (mAb) JAR 4의 결합.
도 7은 하기를 도시한다: fHbp ID 1 단일 또는 이중 돌연변이체로 면역화된 야생형 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 각 부호는 개별 마우스의 역가를 나타내고, 수평 막대는 기하학적 평균 역가를 나타낸다.
도 8A 및 8B는 하기를 도시한다: fHbp ID 55 돌연변이체의 특성화. 도 8A는 ELISA에 의하여 측정시, 고정화된 fHbp ID 55 돌연변이체에 대한 인간 fH의 결합을 나타내고, 도 8B는 하기를 도시한다: ELISA에 의하여 측정시, fHbp 돌연변이체 ID 55 단백질에 대한 뮤린 항fHbp 단클론성 항체 (mAb) JAR 41의 결합. 2 내지 4회의 중복에 대한 평균치 및 범위가 나타난다.
도 9는 하기를 도시한다: fHbp ID 55 돌연변이체로 면역화된 야생형 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 각 부호는 개별 마우스의 역가를 나타내고, 수평 막대는 기하학적 평균 역가를 나타낸다.
도 10A 및 10B는 하기를 도시한다: fHbp ID 55로 면역화된 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 도 10A는 하기를 도시한다: 허가받은 트루멘바 백신 또는 조사용 fHbp ID 55 돌연변이체 S223R로 면역화된 인간 fH 형질전환 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 도 10B는 하기를 도시한다: 개별 형질전환 마우스 내 혈청 인간 fH 농도 및 혈청 살균성 항체 역가 (원형 부호) 사이의 관계. 비교를 위하여, 야생형 (WT) 마우스의 역가가 나타난다 (사각형).
도 11A-11D는 하기를 도시한다: fHbp ID 22 돌연변이체의 특성화. 도 11A-11C는 하기를 도시한다: ELISA에 의하여 측정시, 인간 fH에 대한 fHbp ID 22 돌연변이체의 결합. 2 내지 4회의 중복 평균치 및 범위가 나타난다. 도 11D는 하기를 도시한다: ELISA에 의하여 측정시, fHbp 돌연변이체 ID 22 단백질에 대한 뮤린 항fHbp 단클론성 항체 (mAb) JAR 4의 결합. fHbp ID 22 야생형 (WT) 및 D211A 돌연변이체는 대조군으로서 나타난다. 중복 측정 평균치 및 범위가 나타난다.
도 12A 및 12B는 하기를 나타낸다: fHbp ID 22 돌연변이체로 면역화된 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. 각 부호는 개별 마우스의 역가를 나타내고, 수평 막대는 기하학적 평균 역가를 나타낸다. 도 12A및 도 12B는 상이한 fHbp ID 22 돌연변이체를 시험하기 위한 2개의 실험에서의 야생형 마우스 유래의 혈청의 살균 활성을 나타낸다.
도 13은 하기를 도시한다: fHbp ID 22 돌연변이체로 면역화된 인간 fH 형질전환 마우스 유래의 혈청의 살균 활성.
도 14는 하기를 도시한다: 시차 주사 미세열량측정에 의하여 측정된, fHbp ID 22 야생형 (WT) 및 L130R/G133D 이중 돌연변이체의 열적 언폴딩.
도 15는 하기를 도시한다: fHbp ID 22 삼중 돌연변이체의 특성화. 도 15A는 하기를 도시한다: fHbp ID 22 삼중 돌연변이체에 대한 인간 fH의 결합. DM은 L130R/G133D 이중 돌연변이체를 지칭한다. 도 15B는 하기를 도시한다: fHbp ID 22 삼중 돌연변이체에 대한 뮤린 항-fHbp 단클론성 항체 (mAb) JAR 4의 결합.
도 16은 하기를 도시한다: fHbp ID 22 삼중 돌연변이체로 면역화된 인간 fH 형질전환 마우스 유래의 혈청의 살균 활성. DM은 L130R/G133D 이중 돌연변이체를 지칭한다.
도 17은 하기를 제공한다: 인간 fH의 감소된 결합을 갖는 예시적 fHbp 돌연변이체의 표.
도 18은 하기를 제공한다: 야생형 인간 인자 H의 아미노산 서열.
도 19는 하기를 제공한다: 엔 . 메닌기티디스 균주 유래의 fHbp ID 1, ID 22, 및 ID 55의 아미노산 서열.
도 20-24는 하기를 제공한다: fHbp ID 1 변이체의 아미노산 서열.
도 25- 30는 하기를 제공한다: fHbp ID 22 변이체의 아미노산 서열.
도 31- 33는 하기를 제공한다: fHbp ID 55 변이체의 아미노산 서열.
도 34- 36는 하기를 제공한다: fHbp ID 1 이중 돌연변이체 변이체의 아미노산 서열.
도 37-39는 하기를 제공한다: fHbp ID 22 이중 및 삼중 돌연변이체 변이체의 아미노산 서열.
도 40은 하기를 제공한다: NspA의 아미노산 서열.
정의
"인자 H 결합 단백질"(fHbp)은 또한 문헌에서 GNA1870, GNA 1870, ORF2086, LP2086 (지질단백질 2086)로서 공지되어 있고, "741"은 한 부류의 엔. 메닌기티디 스 폴리펩티드를 지칭한다. fHbp는 천연에서 세균 엔 . 메닌기티디스의 표면 상에서 발현되는 지질단백질로서 발견된다. fHbp는 아미노산 서열 다양성 및 면역학적 교차-반응성을 기준으로 3개의 fHbp 변이체 군 (일부 보고 (문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99)에서 변이체 군 1(v.1), 변이체 군 2(v.2) 및 변이체 군 3(v.3)으로서 언급되고 다른 보고(문헌참조: 예를 들어, Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100)에서 패밀리 A 및 B로 언급됨)로 세분되었다(문헌참조: Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-99). fHbp는 또한 6개의 가장 통상적인 fHbp 모듈 군 중 하나로 분류된다 (하기의 도 2에서 나타난, 지정된 모듈 군 I 내지 모듈 군 VI: Vu et al. (2012) Sci . Reports 2:341. 엔. 메닌기티디스에서 발견된 각각의 독특한 fHbp는 또한 웹사이트(pubmlst.org/neisseria/fHbp/ website)에 따라 fHbp 펩티드 ID로 할당된다. 변이체 2 (v.2) fHbp 단백질(균주 8047로부터, fHbp ID 77) 및 변이체 3 (v.3) fHbp (균주 M1239로부터, fHbp ID 28)의 길이가 균주 MC58(fHbp ID1) 유래의 것의 길이와 각각 -1 및 +7개의 아미노산 잔기만큼 차이가 있기 때문에, v.2 및 v.3 fHbp 단백질에 대한 잔기들을 언급하기 위해 본원에 사용된 넘버링은 이들 단백질의 실제 아미노산 서열을 기준으로 하는 넘버링과는 상이하다. 따라서, 예를 들어, v.2 또는 v.3 fHbp 서열의 위치 166의 류신 잔기 (L)에 대한 언급은 v.3 단백질 내의 위치 173에서의, 그리고 v.2 단백질의 위치 165에서의 잔기를 지칭한다. 달리 언급되지 않는다면, fHbp 변이체 내 존재하는 아미노산 치환의 넘버링은 fHbp ID 1 내 아미노산 잔기의 넘버링에 대해 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 인간 인자 H("인간 fH")는 도 18에 나타낸 아미노산 서열(서열번호: 4)을 포함하는 단백질, 및 이의 천연적으로 발생하는 인간 대립형질 변이체를 언급한다.
아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 "로부터 유래된" (예를 들어, fHbp ID 1 "로부터 유래된" 아미노산 서열)은 상기 폴리펩티드 또는 핵산이 표준 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, 천연적으로 발생하는 fHbp 단백질 또는 암호화 핵산)을 기초로 하는 서열을 가짐을 지적하는 것으로 의미되고 상기 단백질 또는 핵산이 제조된 공급원 또는 방법으로서 제한하는 것으로 의미되지 않는다. 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 "로부터 유래된" 것일 수 있는 표준 폴리펩티드 및 표준 뉴클레오티드의 비제한적인 예는 천연적으로 발생하는 fHbp, fHbp ID 1, 및 비-천연적으로 발생하는 fHbp를 포함한다. 세균 균주와 관련하여 "로부터 유래된"은 균주가 친계 균주의 생체내 또는 시험관내 계대 배양을 통해 수득되고/되거나 친계 균주의 변형에 의해 수득된 재조합 세포임을 지적하는 것으로 의미된다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 측쇄의 화학적 및 물리적 성질(예를 들어, 전하, 크기, 소수성/친수성)을 공유하는 하나의 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환을 언급한다. "보존성 치환"은 아미노산 잔기들의 하기 그룹 내의 치환을 포함하는 것으로 의도된다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 상기 치환을 위한 지침은 목적하는 에피토프를 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 정렬로부터 이끌어질 수 있다.
용어 "보호 면역"은 포유동물에 투여되는 백신 또는 면역화 스케줄이 나이세리아 메닌기티디스에 의해 유도되는 질환을 예방하거나, 이의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키거나 질환 증상을 감소시키거나, 또는 함께 제거하는 면역 반응을 유도함을 의미한다. 보호 면역은 살균성 항체의 생성을 수반할 수 있다. 나이세리아 메닌기티디스에 대한 살균성 항체의 생성은 인간에서 백신 보호 효과를 예측하는 것으로서 당해 분야에서 수용되고 있음을 주지해야 한다. (Goldschneider et al. (1969) J. Exp . Med . 129:1307; Borrow et al. (2001) Infect Immun . 69:1568).
어구 "나이세리아 메닌기티디스의 균주에 의해 유도된 질환"은 엔. 메닌기티디스에 의한 인간 감염에서 존재하는 임상적 증상 또는 임상적 증상들의 합병증을 포함한다. 이들 증상들은 나이세리아 메닌기티디스의 병원성 균주에 의한 상부 호흡관(예를 들어, 인두 및 편도의 점막)의 군집화, 상기 세균의 점막 및 점막하 혈관 베드로의 침투, 패혈증, 패혈성 쇼크, 염증, 출혈성 피부 병변, 섬유소용해 활성화 및 혈액 응고의 활성화, 신장, 폐와 같은 기관 기능부전, 및 심부전증, 부신 출혈 및 근육 경색, 모세관 누출, 부종, 말초 사지 허혈, 호흡 곤란 증후군, 심낭염 및 수막염을 포함하지만 이에 의해 제한되지 않는다.
항원(예를 들어, 폴리펩티드 항원)과 관련하여 어구 "특이적으로 항체에 결합하는" 또는 "특이적으로 면역반응성인"은 또한 다른 분자들의 이종성 집단을 포함할 수 있는 샘플에서 항원의 존재를 기초로 하고/하거나 입증하는 결합 반응을 언급한다. 따라서, 지정된 조건하에서, 특이적 항체 또는 항체들은 샘플에서 특정 항원 또는 항원들에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 분자들에 상당량으로 결합하지 않는다. 항원의 에피토프(예를 들어, 폴리펩티드의 에피토프)와 관련하여 "항체에 특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 면역반응성인"은 항원의 이종성 집단 뿐만 아니라 다른 에피토프들의 이종성 집단을 포함할 수도 있는 항원(예를 들어, 폴리펩티드) 중 에피토프의 존재를 기초로 하고/하거나 입증하는 결합 반응을 언급한다. 따라서, 지정된 조건하에, 특이적인 항체 또는 항체들은 항원의 특정 에피토프에 결합하고 항원 및/또는 샘플 중에 존재하는 다른 에피토프들에 상당량으로 결합하지 않는다.
어구 "면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로"는 특정 항원 제제의 투여 전 또는 투여 후 측정되는 면역 반응 표지자간의 검출가능한 차이가 있음을 의미한다. 면역 반응 표지자는 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 살균성 검정, 유동 세포측정, 면역침전, 오우크테를로니 면역 확산; 예를 들어, 스팟, 웨스턴 블롯 또는 항원 어레이의 결합 검출 검정; 세포독성 검정 등과 같은 검정에 의한 검출시 항체 역가 또는 특이성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"표면 항원"은 나이세리아 메닌기티디스의 표면 구조(예를 들어, 외막, 캡슐, 필리 등)에 존재하는 항원이다.
"단리된"은 화합물이 천연에 존재할 수 있는 것과는 상이한 환경에 존재하는 관심 단위체를 지칭한다. "단리된"은 목적하는 화합물이 실질적으로 풍부한 샘플 내에 존재하고/하거나 목적하는 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 화합물을 포함하는 것으로 의미된다. 일부 경우에서, 단리 성분 (예컨대 폴리펩티드, 예컨대 본 개시내용의 fHbp 변이체; 본 개시내용의 핵산; 본 개시내용의 재조합 벡터)은 정제되며, 예컨대 단리된 성분은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 99% 초과로, 순수하다.
"풍부한"은 샘플이 비-천연적으로 조작되어 (예를 들어, 실험자 또는 임상의에 의해) 목적하는 화합물이 생물학적 샘플(예를 들어, 화합물이 천연적으로 발생하거나 이것이 투여 후에 존재하는 샘플) 또는 화합물이 제조된 (예를 들어, 세균성 폴리펩티드, 항체, 핵산 등에서와 같이) 출발 샘플 중에 화합물의 농도보다 큰 농도(예를 들어, 적어도 3배 큰, 적어도 4배 큰, 적어도 8배 큰 또는 적어도 64배 큰)로 존재한다.
본 발명을 추가로 기술하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며 그 자체가 물론 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 기술이 단지 특정 구현예를 기재할 목적인 것이고 이를 제한고자 하는 것이 아닌 것으로 이해되어야만 하는데 그 이유는 본 발명의 범위가 단지 첨부된 특허청구범위에 의해 제한되기 때문이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 각각의 그 사이의 값은, 맥락을 명백히 달리 나타내지 않는 한 하한의 단위의 1/10까지, 상기 범위의 상한과 하한 사이 및 상기 언급된 범위에서 임의의 기타 언급된 또는 그 사이의 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 본 발명의 범위내에 포함되며, 상기 언급된 범위에서 구체적으로 제외된 것이 적용된다. 상기 언급된 범위가 상하한의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 하나 또는 둘 모두를 제외하는 범위는 또한 본 발명에 포함될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자 중 일인에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보는 공보가 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 재료를 기재하고 기술하기 위해 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 그리고 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형 "a," "an," 및 "the"는 문맥에 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함함을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들면, "인자 H 결합 단백질"에 대한 언급은, 복수의 상기 인자 H 결합 단백질을 포함하고, "면역원성 조성물"에 대한 언급은, 본 분야의 숙련가에게 공지된 하나 이상의 면역원성 조성물 및 이의 등가물 등을 포함한다. 추가로, 청구항은 임의의 선택적 요소를 배제하도록 초안을 작성할 수 있음을 주목한다. 이와 같이, 이러한 언급은 청구항 요소의 언급 또는 "부정적인" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로," "유일한"으로서 이러한 배타적인 용어의 사용을 위한 선행 기초로서 작용할 것이다.
명백하게 하기 위해 별도의 양태와 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 구현예와 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해한다. 역으로, 간결하게 하기 위해 단일 양태와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관계하는 이들 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 특이적으로 포섭되고, 그리고 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에서 개시된다. 이에 더하여, 다양한 구현예 및 이들의 원소의 모든 하위조합 역시 본 발명에 의해 특이적으로 포섭되고, 그리고 마치 각각의 모든 이런 하위조합이 본원에서 개별적으로 및 명시적으로 개시되는 것처럼 본원에서 개시된다.
본원에서 논의된 공보는 본원의 출원일 전에 이들의 기재에 대해 단독으로 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 공보를 보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 추가로, 제공된 공보의 날짜는 실제 공보 날짜와 상이할 수 있고 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.

본 개시내용은 하기를 제공한다: 나이세리아 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 대해 살균성인 항체를 유도할 수 있는 변이체 인자 H 결합 단백질 (fHbp). 본 개시내용은 본 개시내용의 변이체 fHbp를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본 개시내용의 변이체 fHbp를 포함하는 조성물, 또는 본 개시내용의 변이체 fHbp의 사용 방법을 제공한다.

변이체 fHbp

본 개시내용은 1 내지 10 아미노산 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산) 10 아미노산 내지 15 아미노산, 15 아미노산 내지 20 아미노산, 20 아미노산 내지 30 아미노산, 30 아미노산 내지 40 아미노산, 또는 40 아미노산 내지 50 아미노산 만큼 야생형 엔 . 메닌기티디스 fHbp유래의 아미노산 서열과 상이한 변이체 fHbp를 제공하며, 이로써 상기 변이체 fHbp는 참조 fHbp와 비교하여, 인간 인자 H (fH)에 대한 감소된 친화도를 나타내고, 여기서 상기 변이체 fHbp는, 포유동물 숙주 내로 투여될 경우, 하나 이상의 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살균성 면역 반응을 유도한다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 1 내지 10 이하의 산 치환 만큼 참조 야생형 엔 . 메닌기티디스 fHbp유래의 아미노산 서열과 상이하다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 오직 1 산 치환 만큼 참조 야생형 엔 . 메닌기티디스 fHbp유래의 아미노산 서열과 상이하다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 참조 fHbp 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 변이체 fHbp는 참조 fHbp 서열에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이로써 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 참조 fHbp의 결합 친화도가 85% 이하인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 예컨대 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 참조 fHbp의 친화도의 결합 친화도가 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 미만 0.1%인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 그리고 변이체 fHbp는 포유동물 숙주 (예컨대 인간; 또는 비-인간 동물 모델)에 투여될 경우, 적어도 하나의 균주의 엔. 메닌기티디스에 대한 살균성 면역 반응을 유도한다.

본 개시내용의 변이체 fHbp는, 참조 fHbp가 이의 천연 배좌에 존재할 경우, 인간 fH에 결합하는 참조 (예컨대 야생형) fHbp의 실질적으로 상동한 배좌를 유지한다. 본 개시내용의 변이체 fHbp가 인간 fH에 결합하는 참조 (예컨대 야생형) fHbp의 실질적으로 상동한 배좌를 유지하는지 여부는, 참조 fHbp가 이의 천연 배좌에 존재할 경우, 야생형 fHbp에 결합하는 항체를 사용하여 측정될 수 있다. 상기 항체 예를 들면, 하기를 포함한다: JAR 41; JAR 4; 및 JAR 31. 예를 들어, 참고: Vu et al. (2012) Sci . Reports2:341.JAR4단클론성 항체를 생산하는 혼성세포는 하기를 갖는다: 미국 유형 배양 수집물 (American Type Culture Collection; (ATCC)) 번호 PTA-8943; 또한 참고: USPN 8,470,340. 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 JAR 4에 대한 결합을 유지하며; 예컨대 본 개시내용의 변이체 fHbp는 이의 천연 배좌 내에서 참조 fHbp (예컨대 fHbp ID 1, fHbp ID 22, 또는 fHbp ID 55)의 JAR 4에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 결합을 유지한다.

fHbp ID 1의 변이체

본 개시 내용의 변이체 fHbp가 유도되는 "참조 fHbp"는, 일부 경우에, fHbp ID 1이다. fHbp ID 1의 아미노산 서열은 하기에 나타난다.

fHbp ID 1: CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ (서열 번호:1).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 1 fHbp이다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 1 fHbp이며, 그리고 모듈 군 I fHbp이다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 변이체 fHbp는 fHbp ID 1에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이로써 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 결합 친화도가 85% 이하인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 예컨대 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도의 결합 친화도가 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 미만 0.1%인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 그리고 변이체 fHbp는 포유동물 숙주 (예컨대 인간; 또는 비-인간 동물 모델)에 투여될 경우, 적어도 하나의 균주의 엔. 메닌기티디스에 대한 살균성 면역 반응을 유도한다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 적어도 1종으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환; b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환; d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 변이체 fHbp는 Q38R 치환을 포함한다. 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 리신, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: Q38K 치환, Q38H 치환, Q38F 치환, Q38Y 치환, 또는 Q38W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 5에 명시되고 도 20에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 E92K 치환을 포함한다. 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: E92R 치환, E92H 치환, E92F 치환, E92Y 치환, 또는 E92W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 6에 명시되고 도 21에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 7에 명시되고 도 22에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 음으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 아스파르트산염, 글루탐산염, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 R130에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: R130D 치환, R130E 치환, R130F 치환, R130Y 치환, 또는 R130W 치환.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 S223R 치환을 포함한다. 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 리신, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: S223K 치환, S223H 치환, S223F 치환, S223Y 치환, 또는 S223W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 8에 명시되고 도 23에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 9에 명시되고 도 24에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 비극성이거나, 음으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 이소류신, 발린, 아스파르트산염, 글루탐산염, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 H248에서 치환될 수 있다. 따라서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: H248I 치환, H248V 치환, H248D 치환, H248E 치환, H248F 치환, H248Y 치환, 또는 H248W 치환.

아미노산 치환의 조합

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 2종 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환; b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환; d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

치환의 조합이 포함될 수 있으며, 여기서 상기 2개 치환은 상이한 구조적 도메인에 존재하고, 각각은 독립적으로 fHbp에 대한 fH의 결합을 감소시킨다 (예컨대 C-말단 도메인 내 아미노산 치환과 조합된, N-말단 도메인 내 1개 치환. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 N-말단 도메인 내 제1 아미노산 치환; 및 C-말단 도메인 내 제2 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 N-말단 도메인 내 제1 아미노산 치환; 및 N-말단 도메인 내 제2 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 C-말단 도메인 내 제1 아미노산 치환; 및 C-말단 도메인 내 제2 아미노산 치환을 포함한다.

예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환, 및 b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 38 (Q38)의 글루타민의 아미노산 치환 및 c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환; 및 d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

추가의 비제한적 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환 및 d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환; 또는 상기 변이체는 fHbp 하기를 포함한다: d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환 및 e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

추가의 비제한적 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: i) Q38R 치환; 및 ii) R130G 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

또한 본원에 제공된 것은 상기 제시된 fHbp ID 1의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환을 포함하는 변이체 fHbp 단백질이며, 이는 추가로 치환 R41S을 포함한다. 예시적 변이체 fHbp는 R41S 치환 및 S223에서의 치환, 예컨대 fHbp ID 1에 대한 R41S/S223R 또는 fHbp ID 1에 대한 R41S 치환 및 H248L 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 1에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 2종 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 41 (R41S)에서의 아르기닌에 대한 세린의 치환; b) 아미노산 223 (S223R)에서의 세린에 대한 아르기닌의 치환; c) 아미노산 248 (H248L)에서의 히스티딘에 대한 류신의 치환 (fHbp ID 1의 넘버링 기반).

또한 본원에 개시된 것은 상기 제시된 fHbp ID 1의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환을 포함하는 변이체 fHbp 단백질이며, 이는 추가로 본원에 그 전체가 참조로 편입된, Us2011/0256180에 개시된 치환을 포함한다.

fHbp ID 22의 변이체

본 개시 내용의 변이체 fHbp가 유도되는 "참조 fHbp"는, 일부 경우에, fHbp ID 22이다. fHbp ID 22의 아미노산 서열은 하기에 나타난다.

fHbp ID 22: CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ (서열 번호:2).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 2 fHbp이다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 2 fHbp이며, 그리고 모듈 군 III fHbp이다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 변이체 fHbp는 fHbp ID 22에 대한 1종 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이로써 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 결합 친화도가 85% 이하인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 예컨대 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도의 결합 친화도가 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 미만 0.1%인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 그리고 변이체 fHbp는 포유동물 숙주 (예컨대 인간; 또는 비-인간 동물 모델)에 투여될 경우, 적어도 하나의 균주의 엔. 메닌기티디스에 대한 살균성 면역 반응을 유도한다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환; b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환; c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환; d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 치환; e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대하여). 본원에 언급된 바와 같이, 아미노산 잔기의 넘버링은 fHbp ID 1의 것에 기반한다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 10에 명시되고 도 25에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 비극성이거나, 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 발린, 류신, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 N115에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: N115V 치환, N115L 치환, N115K 치환, N115R 치환, N115H 치환, N115F 치환, N115Y 치환, 또는 N115W 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대해).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 11에 명시되고 도 26에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 비극성이거나, 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 류신, 이소류신, 발린, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 D121에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: D121L 치환, D121I 치환, D121V 치환, D121K 치환, D121R 치환, D121H 치환, D121F 치환, D121Y 치환, 또는 D121W 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대해).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 12에 명시되고 도 27에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 극성이거나, 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산염, 글루탐산염, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 S128에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: S128M 치환, S128N 치환, S128D 치환, S128E 치환, S128K 치환, S128R 치환, S128H 치환, S128F 치환, S128Y 치환, 또는 S128W 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대해).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 V131D 치환을 포함한다. 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 글루탐산염, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: V131E 치환, V131K 치환, V131R 치환, V131H 치환, V131F 치환, V131Y 치환, 또는 V131W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대한, 서열 번호: 13에 명시되고 도 28에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 K219N 치환을 포함한다. 극성이거나, 음으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 글루타민, 아스파르트산염, 글루탐산염, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: K219Q 치환, K219D 치환, K219E 치환, K219F 치환, K219Y 치환, 또는 K219W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 14에 명시되고 도 29에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 G220S 치환을 포함한다. 극성이거나, 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산염, 글루탐산염, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: G220N 치환, G220Q 치환, G220D 치환, G220E 치환, G220K 치환, G220R 치환, G220H 치환, G220F 치환, G220Y 치환, 또는 G220W 치환. 예를 들어, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 15에 명시되고 도 30에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

아미노산 치환의 조합

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 2종 이상으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환; b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환; c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환; d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 치환; e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대하여). 본원에 언급된 바와 같이, 잔기의 넘버링은 fHbp ID 1 내 아미노산의 넘버링에 기반한다.

예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환 및 b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환; 및 c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환 및 d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환 및 e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환 및 f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대하여, fHbp ID 1의 아미노산 서열의 넘버링에 기반한 치환된 잔기의 넘버링).

추가의 비제한적 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환 및 c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함거나: b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환 및 d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환 ; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환 및 e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환 및 f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환 (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대하여). 치환된 잔기(들)의 넘버링은 fHbp ID 1의 아미노산 서열의 넘버링에 기반한다.

추가의 비제한적 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환 및 d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환 및 e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환 및 f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 포함하거나: d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환 및 e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환 및 f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환 및 f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환, ), (fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대하여). 치환된 잔기(들)의 넘버링은 fHbp ID 1의 아미노산 서열의 넘버링에 기반한다.

치환의 조합이 포함될 수 있으며, 여기서 상기 2개 치환은 상이한 구조적 도메인에 존재하고, 각각은 독립적으로 fHbp에 대한 fH의 결합을 감소시킨다 (예컨대 C-말단 도메인 (예컨대 D211A, K219N, G220S) 유래의 1개와 조합한, N-말단 도메인 (예컨대 N115I, D121G, S128T 또는 V131D) 유래의 1개).

예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: i) N115I 치환; 및 ii) D211A 치환.

또 다른 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: i) N115I 치환; 및 ii) K219N 치환.

또 다른 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: i) N115I 치환; 및 ii) G220S 치환.

또한 본원에 개시된 것은, 야생형 fHbp ID22와 비교하여, 증가된 열 안정성을 갖는 변이체 fHbp 폴리펩티드이다. 일부 경우에서, 변이체 fHbp는 하기를 포함할 수 있다: fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 치환 L130R 및 G133D, 여기서 상기 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체는 WT fHbp ID 22의 것에 비하여, 보다 높은 열 안정성을 갖는다. 변이체 fHbp의 열 안정성은 WT fHbp (예컨대 fHbp ID 22) 보다 하기만큼 더 높을 수 있다: 적어도 5℃, 10℃ , 15℃, 20℃ 이상, 예컨대 5℃-30℃, 5℃-25℃, 5℃-20℃, 10℃-20℃, 또는 15℃-20℃. 본원에 사용된 바와 같이, "열 안정성"은 보다 높은 온도에 노출될 경우의 단백질의 안정성; 변이체 단백질이 야생형 단백질 보다 높은 온도에서 이의 배좌를 유지하는 열 안정성을 지칭한다. 예를 들어, 야생형 (WT) fHbp, 예컨대 WT fHbp ID 22의 열 안정성과 비교한, 열 안정성을 증가시키는 이중 돌연변이를 포함하는 변이체 fHbp는, WT fHbp와 비교하여, 보다 높은 온도에서 언폴딩(unfold)될 수 있다. 특정 경우에서, 변이체 fHbp의 N-말단 도메인은 WT fHbp (예컨대 fHbp ID 22)의 N-말단 도메인보다 더 높은 온도에서 언폴딩될 수 있다.

특정 구현예에서, 인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체가 개시되며, 여기서 상기 변이체는 하기를 포함한다: 아미노산 치환 L130R 및 G133D 및 하기 중 적어도 하나의 치환: R80A, N115I, D121G, S128T, V131, D211A, E218A, K219 (예컨대 K219N), G220 (예컨대 G220S), E248A, G236I, T221A, 및 H223A (fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대하여), 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다.

일부 경우에서, 변이체 fHbp는 of 치환, 예컨대, L130R, G133D, 및 하기로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환의 조합을 포함할 수 있다: a) N115I; b) D121G; c) S128T; d) V131D; e) K219 (예컨대 K219N); 및 f) G220 (예컨대 G220S), 여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 것이고, 상기 변이체 fHbp는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다.

특정 구현예에서, 인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체가 개시되며, 여기서 상기 변이체는 하기를 포함한다: 아미노산 치환 L130R 및 G133D 및 하기 중 적어도 하나의 치환: R80A, D211A, E218A, E248A, G236I, T221A, 및 H223A (fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대하여), 여기서 상기 변이체는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 약 50% 이하인 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도한다.

예시적 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: 서열 번호: 2에 대하여 85% 초과의 아미노산 서열 동일성 (예컨대 적어도 90% 동일성, 적어도 95%, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성을 갖고, 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대한 하기 치환을 포함하는, 폴리펩티드: L130R 및 G133D; L130R, G133D, 및 K219N; 또는 L130R, G133D, 및 G220S.

또한 본원에 개시된 것은 상기 제시된 fHbp ID 22의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환을 포함하는 변이체 fHbp 단백질이며, 이는 추가로 본원에 그 전체가 참조로 편입된, Us2011/0256180에 개시된 치환을 포함한다.

fHbp ID 55의 변이체

본 개시 내용의 변이체 fHbp가 유도되는 "참조 fHbp"는, 일부 경우에, fHbp ID 55이다. fHbp ID 55의 아미노산 서열은 하기에 나타난다.

fHbp ID 55: CSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (서열 번호:3).

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 1 fHbp이다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 변이체 군 1 fHbp이며, 그리고 모듈 군 IV fHbp이다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 여기서 상기 변이체 fHbp는 fHbp ID 55에 대한 1종 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 이로써 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 결합 친화도가 85% 이하인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 예컨대 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도의 결합 친화도가 약 85% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 65%, 약 65% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 미만 0.1%인 인간 fH에 대한 친화도를 나타내며, 그리고 변이체 fHbp는 포유동물 숙주 (예컨대 인간; 또는 비-인간 동물 모델)에 투여될 경우, 적어도 하나의 균주의 엔. 메닌기티디스에 대한 살균성 면역 반응을 유도한다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기 중 적어도 1종으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환 (fHbp ID 55의 아미노산 서열에 대하여), 여기서 상기 아미노산 잔기의 넘버링은 fHbp ID 1의 넘버링을 기반으로 한다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 E92K 치환을 포함한다. 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 아르기닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: E92R 치환, E92H 치환, E92F 치환, E92Y 치환, 또는 E92W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 16에 명시되고 도 31에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 S223R 치환을 포함한다. 양으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 리신, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: S223K 치환, S223H 치환, S223F 치환, S223Y 치환, 또는 S223W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 17에 명시되고 도 32에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 fHbp 변이체는 H248L 치환을 포함한다. 비극성이거나, 음으로 하전되거나 방향족 측쇄, 예컨대 이소류신, 발린, 아스파르트산염, 글루탐산염, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판을 갖는 기타 아미노산이 또한 이러한 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 일부 경우에서, fHbp 변이체는 하기를 포함한다: H248I 치환, H248V 치환, H248D 치환, H248E 치환, H248F 치환, H248Y 치환, 또는 H248W 치환. 일 예시로서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는, 서열 번호: 18에 명시되고 도 33에 도시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

아미노산 치환의 조합

일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 아미노산 치환을 포함한다: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환; b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환 (fHbp ID 55에 대하여), 여기서 상기 잔기의 넘버링은 fHbp ID 1에 대한 서열 내 아미노산의 넘버링을 기반으로 한다.

예를 들어, 일부 경우에서, 본 개시내용의 변이체 fHbp는 서열 번호: 3에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 50% 이하 (예컨대 약 50% 내지 약 45%, 약 45% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 1%, 또는 약 1% 내지 약 0.1%, 또는 0.1% 미만)인 친화도로 인간 fH에 결합하며, 여기서 상기 변이체는 포유동물 숙주 내 엔. 메닌기티디스의 적어도 하나의 균주에 살균성 항체 반응을 유도하고, 그리고 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함하거나: b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환; 또는 상기 변이체 fHbp는 하기를 포함한다: a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환 및 b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환 및 c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환 (fHbp ID 55에 대하여), 여기서 상기 잔기의 넘버링은 fHbp ID 1에 대한 서열 내 아미노산의 넘버링을 기반으로 한다.

또한 본원에 개시된 것은 상기 제시된 fHbp ID 55의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 치환을 포함하는 변이체 fHbp 단백질이며, 이는 추가로 본원에 그 전체가 참조로 편입된, Us2011/0256180에 개시된 치환을 포함한다.

융합 폴리펩티드

본 개시내용의 변이체 fHbp는 하기일 수 있다: 융합 폴리펩티드, 예컨대 상기 기술된 변이체 fHbp, 및 이종성 폴리펩티드 (예컨대 융합 상대)를 포함하는 폴리펩티드. 융합 상대는 하기에 위치할 수 있다: 변이체 fHbp의 N-말단, 변이체 fHbp의 C-말단, 또는 fHbp 내 내부 부위.

적합한 융합 상대는 하기인 펩티드 및 폴리펩티드를 포함한다: 증진된 생체내 안정성 (예컨대 증진된 혈청 반감기)을 부여함; 정제의 완화, 예컨대 (His)_n,예컨대, 6His 등을 제공함; 세포 유래의 융합 단백질의 분비를 제공함; 에피토프 태그, 예컨대 GST, 혈구응집소 (HA; 예컨대 YPYDVPDYA; 서열 번호: 26), FLAG (예컨대 DYKDDDDK; 서열 번호: 27), c-myc (예컨대 EQKLISEEDL; 서열 번호: 28) 등을 제공함; 검출가능한 생성물 (예컨대 β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제)을 생성하는 검출가능한 신호, 예컨대 효소, 또는 그 자체로 검출가능한 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 등; 다량체화, 예컨대 다량체화 도메인, 예컨대 면역글로불린의 Fc 부분을 제공함; 등.

생산 방법

본 발명의 fHbp는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있고 이는 재조합 및 비-재조합 방법(예를 들어, 화학적 합성)을 포함한다. 대상체의 fHbp가 재조합 기술을 사용하여 제조되는 경우, 상기 방법은 임의의 적합한 작제물 및 임의의 적합한 숙주 세포를 포함할 수 있고, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 일반적으로 세균 또는 효모 숙주 세포, 보다 일반적으로 세균 세포일 수 있다. 유전학적 물질의 숙주 세포로의 도입을 위한 방법은 예를 들어, 형질전환, 전기천공, 콘주게이트, 인산칼슘 방법 등을 포함한다. 전달 방법은 도입된 fHbp-암호화 핵산의 안정한 발현을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 상기 fHbp-암호화 핵산은 유전성 에피좀 요소(예를 들어, 플라스미드)로서 제공되거나 게놈에 통합될 수 있다.

본 개시내용 하기를 제공한다: 본 개시내용의 fHbp 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (단리된 핵산을 포함). 일부 구현예에서, fHbp 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 전사 조절 요소 (예컨대 프로모터)에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는, 일부 경우에서, 구성적(constitutive)이다. 프로모터는, 일부 경우에서, 유도성이다. 일부 경우에서, 프로모터는 원핵 숙주 세포 (예컨대, 이에서 활성인) 용도에 적합하다. 일부 경우에서, 프로모터는 진핵 숙주 세포 (예컨대, 이에서 활성인) 용도에 적합하다.

일부 경우에서, 본 개시내용의 fHbp 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 발현 벡터 내에 존재한다. 본 개시내용 하기를 제공한다: 본 개시내용의 fHbp 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 (예컨대 단리된 재조합 발현 벡터)를 제공한다 일부 구현예에서, fHbp 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 전사 조절 요소, 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는, 일부 경우에서, 구성적(constitutive)이다. 프로모터는, 일부 경우에서, 유도성이다. 일부 경우에서, 프로모터는 원핵 숙주 세포 (예컨대, 이에서 활성인) 용도에 적합하다. 일부 경우에서, 프로모터는 진핵 숙주 세포 (예컨대, 이에서 활성인) 용도에 적합하다.

fHbp-암호화 핵산을 전달하기 위해 적합한 벡터는 조성에 있어서 다양할 수 있다. 통합 벡터는 조건적으로 복제하거나 자살 플라스미드, 박테리오파아지 등일 수 있다. 상기 작제물은 다양한 요소들을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어, 프로모터, 선택가능한 유전학적 마커(예를 들어, 항생제(예를 들어, 가나마이신, 에리트로마이신, 클로르암페니콜 또는 겐타마이신)에 대한 내성을 부여하는 유전자들), 복제 오리진(숙주 세포, 예를 들어, 세균 숙주 세포에서 복제를 촉진시키기 위해) 등을 포함한다. 벡터의 선택은 증식이 요망되는 세포의 유형 및 증식 목적과 같은 다양한 인자들에 따라 다양하다. 특정 벡터는 대량의 목적하는 DNA 서열을 증폭하고 제조하기 위해 유용하다. 다른 벡터는 배양 중에 세포에서 발현하기 위해 적합하다. 여전히 다른 벡터는 전체 동물에서 세포에서 전달 및 발현을 위해 적합하다. 적당한 벡터의 선택은 당업자의 기술 범위내에 있다. 많은 이러한 벡터들이 시판되고 있다.

일 예에서, 벡터는 선택가능한 약물 내성 마커 및 상이한 숙주 세포(예를 들어, E. 콜리 및 엔. 메닌기티디스둘다에서)에서 자가 복제를 제공하는 요소들을 함유하는 에피좀 플라스미드를 기반으로 하는 발현 벡터이다. 상기 "셔틀 벡터"의 한 예는 플라스미드 pFP10이다(문헌참조: Pagotto et al. (2000) Gene 244:13-19).

작제물 (재조합 벡터)은 예를 들어, 전형적으로 벡터에서 절단된 제한 효소 부위로의 DNA 리가제 부착을 수단으로 목적하는 폴리뉴클레오티드를 작제물 골격에 삽입함에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 목적하는 뉴클레오티드 서열은 동일성 재조합 또는 부위-특이적 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 전형적으로, 동일성 재조합은 동일성 영역을 목적하는 뉴클레오티드 서열의 플랭크상에 벡터에 부착시킴에 의해 성취될 수 있고, 부위-특이적 재조합은 부위-특이적 재조합(예를 들어, cre-lox, att 부위 등)을 촉진시키는 서열의 사용을 통해 성취될 수 있다. 상기 서열을 함유하는 핵산은 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 결찰 또는 동일성 영역 및 목적하는 뉴클레오티드 서열 부분 둘다를 포함하는 프라이머를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응에 의해 부가될 수 있다.

벡터는 숙주 세포에서 염색체외 유지를 제공하거나 숙주 세포 게놈으로의 통합을 제공할 수 있다. 벡터는 당업자에게 널리 공지된 다수의 공개 문헌에 기재되어 있고 상기 문헌은 예를 들어, Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, et al., eds., Wiley & Sons을 포함한다. 벡터는 대상체의 fHbp를 암호화하는 핵산의 발현을 제공할 수 있고 대상체의 핵산을 증폭시킬 수 있거나 둘다를 제공할 수 있다.

사용될 수 있는 벡터의 예는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 및 M13 mp 계열의 벡터와 같은 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. pET21은 또한 사용될 수 있는 발현 벡터이다. 박테리오파아지 벡터는 λgt10, λgt11, λgt18-23, λZAP/R 및 EMBL 계열의 박테리오파아지 벡터를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 추가의 벡터는 pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 및 카로미드 9 계열의 벡터들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

대상체의 fHbp의 발현을 위해, 발현 카세트가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 전사 및 번역 조절 서열을 제공하고 유도성 또는 구성적 발현을 제공할 수 있고, 여기서, 상기 암호화 영역은 전사 개시 영역, 및 전사 및 번역 종결 영역의 전사 조절하에 작동적으로 연결된다. 이들 조절 영역은 대상체의 fHbp가 유래된 fHbp에 고유한 것이거나 외인성 공급원으로부터 기원한 것일 수 있다. 일반적으로, 상기 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 액티베이터 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있고 강한 구성적 프로모터(예를 들어, T7 등)일 수 있다.

발현 벡터는 일반적으로, 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 삽입을 제공하기 위해 프로모터 서열 근처에 위치된 간편한 제한 부위를 갖는다. 발현 숙주에서 작동하는 선택가능한 마커는 벡터를 함유하는 세포의 선택을 촉진시키기 위해 존재할 수 있다. 또한, 상기 발현 작제물은 추가의 요소들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 발현 벡터는 1개 또는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 따라서 이것이 유기체, 예를 들어, 발현을 위한 포유동물 또는 곤충 세포, 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에 유지되도록 한다. 추가로, 발현 작제물은 변형된 숙주 세포의 선택을 가능하기 위해 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다. 선택 유전자는 당업자에게 널리 공지되어 있고 사용되는 숙주 세포에 따라 다양하다.

본 발명의 fHbp는 검출가능한 표지, 예를 들어, 방사성 표지, 형광성 표지, 비오틴 표지, 면역학적으로 검출가능한 표지(예를 들어, 혈구응집소 태그, 폴리-히스티딘 태그) 등과 같은 추가의 요소들을 포함할 수 있는 것으로 주지되어야 한다. fHbp의 추가의 요소들은 다양한 방법(예를 들어, 친화성 포획 등)을 통한 단리(예를 들어, 비오틴 태그, 면역학적으로 검출가능한 태그)를 촉진시키기 위해 제공될 수 있다. 대상체의 fHbp는 임의로 공유 또는 비-공유 부착을 통해 지지체 상에 고정화시킬 수 있다.

fHbp의 단리 및 정제는 당업계에 공지된 방법에 따라 성취될 수 있다. 예를 들어, fHbp는 일반적으로 샘플을 항-fHbp 항체(예를 들어, 항-fHbp 단클론성 항체 (mAb), 예를 들어, 당업계에 공지된 JAR 4 MAb 또는 다른 적당한 JAR MAb)와 접촉시키고, 세척하여 비-특이적으로 결합된 물질을 제거하고 특이적으로 결합된 fHbp를 용출시킴을 포함하는 면역친화성 정제에 의해 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 세포의 용해물 또는 합성 반응 혼합물로부터 단리될 수 있다. 단리된 fHbp는 투석 및 단백질 정제 방법에 통상적으로 사용되는 다른 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다. 하나의 예에서, fHbp는 금속 킬레이트 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리될 수 있다.

숙주 세포

임의의 다수의 적합한 숙주 세포가 fHbp의 제조에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 상기 fHbp는 통상적인 기술에 따라 원핵 세포 또는 진핵 세포, 세균, 예컨대 에스케리치아 콜라이 또는 나이세리아(예를 들어, 엔. 메닌기티디스)에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 추가로 대상체의 fHbp를 암호화하는 핵산을 함유하는 유전학적으로 시험관내 변형된 숙주 세포를 제공한다. 대상체의 fHbp의 제조(대량 제조를 포함하는)를 위한 숙주 세포는 임의의 다양한 가용한 숙주 세포로부터 선택될 수 있다. 발현을 위한 숙주 세포의 예는 원핵 또는 진핵 단일 세포 유기체, 예를 들어, 세균(예를 들어, 에스케리치아 콜라이 균주), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomycescerevisiae),피키아 종(Pichia spp.), 등)을 포함하고, 본래에 곤충, 척추동물, 포유동물과 같은 고등 유기체로부터 유래된 숙주 세포를 포함할 수 있다. 적합한 포유동물 세포주는 비제한적으로 하기를 포함한다: HeLa 세포 (예컨대 미국 유형 배양 수집물 (American Type Culture Collection; (ATCC)) 번호: CCL-2), CHO 세포 (예컨대 ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포 (예컨대 ATCC 번호: CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포 (예컨대 ATCC 번호: CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포 (예컨대 ATCC 번호: CCL10), PC12 세포 (ATCC 번호: CRL1721), COS 세포, COS-7 세포 (ATCC 번호: CRL1651), RAT1 세포, 마우스 L 세포 (ATCC 번호: CCLI.3), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 (ATCC 번호: CRL1573), HLHepG2 세포 등). 일부 경우에서, 세균 숙주 세포 및 효모 숙주 세포가 특히 대상체의 fHbp 생성에 대한 관심 대상이다.

대상체 fHbp는 실질적으로 순수하거나 실질적으로 단리된 형태(즉, 다른 나이세리아 또는 숙주 세포 폴리펩티드가 실질적으로 없는) 또는 실질적으로 단리된 형태로 제조될 수 있다. 상기 대상체 fHbp는 존재할 수 있는 다른 성분(예를 들어, 다른 폴리펩티드 또는 다른 숙주 세포 성분)에 비해 폴리펩티드가 풍부한 조성물에 존재할 수 있다. 정제된 대상체 fHbp는 폴리펩티드가 다른 발현된 폴리펩티드가 없는 조성물에 존재하도록 제공될 수 있고, 예를 들어, 조성물의 90% 미만, 일반적으로 60% 미만, 및 보다 일반적으로 50% 미만이 다른 발현된 폴리펩티드로 구성된다.

소포체 제조를 위한 숙주 세포

대상체 fHbp가 막 소포체 중에 제공되어야만 하는 경우(하기에 보다 상세하게 논의된 바와 같이), 나이세리아 숙주 세포는 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된다. 임의의 다양한 나이세리아 종 균주는 대상체 fHbp를 생성하도록 변형되고 임의로 PorA와 같은 목적하는 다른 항원들을 생성하거나 생성하도록 변형될 수 있는 균주가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.

나이세리아 균주의 유전학적 변형 및 목적하는 폴리펩티드의 발현을 제공하는 방법 및 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 벡터 및 방법의 예는 문헌[참조: WO 02/09746 and O'Dwyer et al. (2004) Infect Immun 72:6511-80]에서 찾을 수 있다. 강한 프로모터, 특히 구성적으로 강한 프로모터는 특정 관심 대상이다. 프로모터의 예는 porA, porB, lbpB, tbpB, p110, hpuAB, lgtF, opa, p110, lst, hpuAB, 및 rmp의 프로모터를 포함한다.

병원성 나이세리아 종으로부터 유래된 병원성 나이세리아 종 또는 균주, 특히, 인간에 대해 병원성이거나 인간에 대해 병원성이거나 공생하는 균주로부터 유래된 균주는 특히 막 소포체 제조에 사용하기 위한 관심 대상이다. 나이세리아 종(Neisserial spp.)의 예는 엔. 메닌기티디스 (N. meningitidis), 엔. 플라베센스 (N. flavescens), 엔. 고노로에아 (N. gonorrhoeae), 엔. 락타미카 (N. lactamica), 엔. 폴리사카레아 (N. polysaccharea), 엔. 시네레아 (N. cinerea), 엔. 뮤코사 (N. mucosa), 엔. 서브플라바 (N. subflava), 엔. 시카 (N. sicca), 엔. 엘론가타 (N. elongata) 등을 포함한다.

엔. 메닌기티디스 균주는 특히 대상체 fHbp를 발현시키고 소포체 제조에 사용하기 위한 유전학적 변형에 대한 관심 대상이다. 소포체 제조를 위해 사용되는 균주는 요망될 수 있는 다수의 상이한 특징에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 요망되는 PorA 유형("혈청아유형"), 캡슐 그룹, 혈청형 등; 감소된 캡슐 다당류 제조 등에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 제조 균주는 임의의 목적하는 PorA 폴리펩티드를 생성할 수 있고 하나 이상의 PorA 폴리펩티드(천연적으로 또는 유전학적 가공으로 인해)를 발현할 수 있다. 균주의 예는 혈청아유형 분류에 사용되는 통상적인 혈청학적 시약과의 반응성을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 PorA 폴리펩티드의 변이체 뿐만 아니라 P1.7,16; P1.19,15; P1.7,1; P1.5,2; P1.22a, 14; P1.14; P1.5,10; P1.7,4; P1.12,13의 혈청아유형을 부여하는 PorA 폴리펩티드를 생성하는 것들을 포함한다. 또한, PorA 가변 영역(VR) 분류에 따라 특징화되는 PorA 폴리펩티드가 또한 관심 대상이다(문헌참조: 예를 들어, Russell et al. (2004) Emerging Infect Dis 10:674-678; Sacchi CT et al. (1998) Clin Diagn Lab Immunol 5:845-55; Sacchi et al (2000) J. Infect Dis 182:1169-1176). 상당수의 독특한 VR 유형이 동정되었고 VR1 및 VR2 계열 "원형"으로 분류될 수 있다. 이전의 분류 계획에 대한 상기 명명법 및 이의 관계를 기재하는 웹-접근가능한 데이터베이스는 웹사이트(neisseria.org/nm/typing/pora)에서 발견된다. 특정 PorA VR1 및 VR2 유형의 정렬은 문헌[참조: Russell et al. (2004) Emerging Infect Dis 10:674-678]에 제공된다.

대안적으로 또는 추가로, 상기 생성 균주는 캡슐 결핍 균주일 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 백신이 투여되는 대상체에서 상당한 자가항체 반응을 유도하는 감소된 위험을 제공하는(예를 들어, 숙주 세포 표면에 대한 시알산과 교차 반응하는 항체의 생성으로 인해) 소포체 기반 백신을 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "캡슐 결핍" 또는 "캡슐 다당류 결핍"은 천연적으로 발생하는 균주보다 낮거나 상기 균주가 유전학적으로 변형된 경우 캡슐 결핍 균주가 유래된 친계 균주의 수준보다 낮은 세균 표면상에 캡슐 다당류 수준을 언급한다. 캡슐 결핍 균주는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상까지 표면 캡슐 다당류 생성이 감소된 균주를 포함하고 캡슐 다당류가 세균 표면 상에 검출가능 하지 않은(예를 들어, 항-캡슐 다당류 항체를 사용한 전세포 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해) 균주를 포함한다. 캡슐 결핍 균주는 천연적으로 발생하거나 재조합적으로 생성된 유전자 변형으로 인해 캡슐 결핍인 것들을 포함한다.

천연적으로 발생하는 캡슐 결핍 균주(문헌참조: 예를 들어, Dolan-Livengood et al. (2003) J. Infect. Dis. 187:1616-28), 및 캡슐 결핍 균주를 동정하고/하거나 생성시키는 방법(문헌참조: 예를 들어, Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73:4070-4080; Stephens et al. (1991) Infect Immun 59:4097-102; Frosch et al. (1990) Mol Microbiol.4:1215-1218)은 당업계에 공지되어 있다.

캡슐 다당류의 감소된 생성을 제공하는 나이세리아 숙주 세포의 변형은 캡슐 합성에 관여하는 하나 이상의 유전자의 변형을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 변형은 예를 들어, 변형 전에 친계와 비교하여 캡슐 다당류의 감소된 수준을 제공한다. 상기 유전학적 변형은 균주의 캡슐이 결핍되게 하는(예를 들어, 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 하나 이상의 삽입, 결실, 치환 등으로 인해) 하나 이상의 캡슐 생합성 유전자에서 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열에서의 변화를 포함할 수 있다. 캡슐 결핍 균주는 하나 이상의 캡슐 유전자가 결핍이거나 비-기능성일 수 있다.

시알산 생합성이 결핍인 균주가 특정 관심 대상이다. 상기 균주는 인간 시알산 항원과 교차 반응하는 항-시알산 항체를 유도하는 감소된 위험을 갖는 소포체의 생성을 제공하고 추가로 개선된 제조 안정성을 제공할 수 있다. 시알산 생합성에서 결핍을 갖는 균주(천연적으로 발생하는 변형 또는 가공된 변형으로 인해)는 시알산 생합성 경로에서 임의의 다수의 상이한 유전자가 결핍일 수 있다. N-아세틸글루코사민 -6-포스페이트 2-에피머라제 유전자(synX AAF40537.1 또는 siaA AAA20475로서 공지된)에 의해 암호화된 유전 생성물이 결핍인 균주가 특정 관심 대상이고, 상기 유전자가 불활성화된 균주가 특정 관심 대상이다. 예를 들어, 하나의 양태에서, 캡슐 결핍 균주는 기능성 synX 유전자 생성물의 생성을 붕괴시킴에 의해 제조된다(문헌참조: 예를 들어, Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176:1530-4).

캡슐-결핍 균주는 또한 감소된 수준의 캡슐 다당류를 갖는 균주를 선택하기 위해 살균 항-캡슐 항체를 사용함으로써, 비-재조합 기술을 사용하여 천연적으로 발생하는 균주로부터 제조될 수 있다.

본 개시내용이 2 이상의 균주의 사용을 포함하는 경우(예를 들어, 상이한 균주로부터 대상체 fHbp-제공 소포체를 함유하는 항원성 조성물을 제조하기 위해), 상기 균주는 예를 들어, 사용되는 대상체 fHbp, PorA 등이 상이한 소포체를 제공하기 위해 하나 이상의 균주 특징을 상이하게 하기 위해 선택될 수 있다.

소포체의 제조

본 개시내용에 의해 고려되는 항원성 조성물은 일반적으로 대상체 fHbp를 발현하는 나이세리아 세포로부터 제조된 소포체를 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, -소포체-는 미세소포체(또한 블레브로서 언급되는) 뿐만 아니라 외막 소포체를 포함함을 의미한다.

상기 항원성 조성물은 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 나이세리아 메닌기티디스 종의 배양된 균주의 외막으로부터 제조된 외막 소포체(OMV)를 함유할 수 있다. OMV는 바람직하게 배양 배지로부터 세균 세포를 단리함에 의해(예를 들어, 세포 등을 펠렛화하는 여과에 의해 또는 저속 원심단리에 의해), 세포를 용해시킴에 의해(예를 들어, 세제의 첨가, 삼투압 쇼크, 초음파 처리, 공동현상, 균질화 등에 의해) 및 세포질막으로부터 외막 분획을 단리함에 의해(예를 들어, 여과에 의해 또는 차등 침전 또는 외막의 응집화 및/또는 외막 소포체에 의해 또는 외막 분자를 특이적으로 인지하는 리간드를 사용한 친화성 단리 방법에 의해 또는 외막 및/또는 외막 소포체 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 브로쓰 또는 고체 배지 배양물에서 성장시킨 나이세리아 메닌기티디스로부터 수득될 수 있고; 외막 분획은 OMV를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

상기 항원성 조성물은 대상체 fHbp를 함유하는 미세소포체(MV) (또는 "블레브")를 함유할 수 있고, 여기서, MV 또는 블레브는 대상체 fHbp를 발현하도록 유전학적으로 변형된 나이세리아 메닌기티디스 균주의 배양 동안에 방출된다. 예를 들어, MV는 브로쓰 배양 배지에서 나이세리아 메닌기티디스의 균주를 배양하고, 전 세포를 상기 브로쓰 배양 배지로부터 단리시키고 (예를 들어, 여과에 의해 또는 세포만을 펠렛화하고 보다 작은 블레브 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 이어서 세포 부재 배양 배지에 존재하는 MV를 수거함에 의해(예를 들어, 여과, 차등 침전 또는 MV의 응집에 의해 또는 블레브 등을 펠렛화하는 고속 원심단리에 의해) 수득될 수 있다. MV의 생성에 사용하기 위한 균주는 일반적으로 배양에서 생성된 블레브의 양을 기준으로 선택될 수 있다(예를 들어, 세균은 합당한 수로 본원에 기재된 방법에서 단리 및 투여를 위해 적합한 블레브의 생성을 제공하도록 배양될 수 있다). 고수준의 블레브를 생성하는 예시적 균주는 PCT 공보 번호 WO 01/34642에 기재되어 있다. 블레브 생성에 추가로 MV 생성에 사용하기 위한 균주는 또한 NspA 생성을 기초로 선택될 수 있고, 여기서, 보다 높은 수준의 NspA를 생성하는 균주가 특정 관심 대상일 수 있다 (상이한 NspA 생성 수준을 갖는 엔. 메닌기티디스 균주의 예에 대해, 예를 들어, 문헌(Moe et al. (1999 Infect. Immun. 67: 5664). 블레브의 생성에 사용하기 위한 목적하는 다른 균주는 세포 단리, 막 구조 및 독성을 위해 요구되는 지질단백질을 암호화하는 불활성화된 GNA33 유전자를 갖는 균주를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun.72:1914-1919).

본 발명의 항원성 조성물은 하나의 균주로부터 또는 2, 3, 4, 5개 이상의 균주로부터 기원하는 소포체를 함유할 수 있고, 상기 균주는 서로에 대해 동일성 또는 이종성, 일반적으로, 이종성일 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 대상체 fHbp가 유래된 PorA 및/또는 fHbp와 관련하여 동일성 또는 이종성 일 수 있다. 상기 소포체는 상이한 변이체(v.1, v.2 또는 v.3) 또는 아변이체(예를 들어, v.1, v.2 또는 v.3의 아변이체)로부터의 fHbp 아미노산 서열로 구성될 수 있는 하나 이상의 대상체 fHbp(예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 대상체 fHbp)를 발현하는 균주로부터 제조될 수 있다.

상기 항원성 조성물은 동일하거나 상이한 대상체 fHbp를 제공하는 OMV 및 MV의 혼합물을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 대상체 fHbp는 임의로 fHbp 변이체 및/또는 아변이체의 상이한 조합 기원의 에피토프를 제공할 수 있고, 상기 OMV 및 MV는 동일하거나 상이한 균주로부터 기원할 수 있다. 상이한 균주 기원의 소포체는 혼합물로서 투여될 수 있거나 연속으로 투여될 수 있다.

경우에 따라 (예를 들어, 소포체를 제조하기 위해 사용되는 균주가 내독소 또는 특정 고수준의 내독소와 관련되는 경우), 상기 소포체는 임의로 내독소를 감소시키기 위해, 예를 들어, 투여 후 독성을 감소시키기 위해 처리된다. 하기 논의된 바와 같이 덜 요구될 수 있지만, 내독소의 감소는 적합한 세제(예를 들어, BRIJ-96, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 라우로일사코시네이트, 엠피겐(Empigen) BB, Triton X-100, 비-이온성 세정제 TWEEN 20 (소르비탄 모노라우레이트 폴리옥시에틸렌), 비-이온성 세정제 TWEEN 80, 0.1-10%, 바람직하게는 0.5-2%의 농도에서,및 나트륨 도데실 설페이트(SDS))로 추출함에 의해 달성될 수 있다. 세제 추출이 사용되는 경우, 데옥시콜레이트 이외의 다른 세제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

항원성 조성물의 소포체는 세제 없이, 예를 들어, 데옥시콜레이트 사용 없이 제조될 수 있다. 세제 처리가 내독소 활성을 제거하기 위해 유용하지만, 소포체 생성 동안에 추출에 의해 원산 fHbp 지질단백질 및/또는 대상체 fHbp(지질화된 fHbp를 포함하는)가 고갈될 수 있다. 따라서, 특히 세제를 요구하지 않는 기술을 사용하여 내독소 활성을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 방법에서, 내독소(리포다당류, LPS)의 비교적 낮은 생성자인 균주는 인간에서 사용하기 전 최종 제제로부터 내독소가 제거할 필요성을 회피하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 소포체는 백신(예를 들어, Rmp)에서 요망되지 않을 수 있는 리포다당류 또는 다른 항원이 감소되거나 제거된 나이세리아 돌연변이체로부터 제조될 수 있다.

소포체는 감소되거나 검출가능하지 않은 지질 A의 독성 활성을 유도하는 유전학적 변형을 함유하는 엔. 메닌기티디스 균주로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 균주는 지질 A 생합성에서 유전학적으로 변형될 수 있다(문헌참조: Steeghs et al. (1999) Infect Immun 67:4988-93; van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90; Steeghs et al. (2004) J Endotoxin Res 10:113-9; Fissha et al, (2005) Infect Immun 73:4070). 상기 면역원성 조성물은 각각 lpxL1 또는 lpxL2에 의해 암호화된 효소의 하향조절 및/또는 불활성화 같이 LPS의 변형에 의해 번역될 수 있다. lpxL1 돌연변이체에서 제조된 펜타-아실화된 지질 A의 생성은 lpxL1에 의해 암호화된 효소가 GlcN II의 2' 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 C12를 부가함을 지적한다. lpxL2 돌연변이체에서 발견되는 주요 지질 A 종은 테트라-아실화되고 이는 즉, lpxL2에 의해 암호화된 효소가 GlcN I의 2 위치에서 N-결합된 3-OH C14에 다른 C12를 부가함을 지적한다. 이들 유전자의 감소된(또는 부재) 발현을 유도하는 돌연변이(이들 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 부재)는 지질 A의 변화된 독성 활성을 유도한다 (문헌참조 : van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90). 테트라-아실화된 (lpxL2 돌연변이체) 및 펜타 아실화된(lpxL1 돌연변이체) 지질 A는 야생형 지질 A보다 덜 독성이다. 지질 A 4'-키나제 암호화 유전자(lpxK)에서의 돌연변이는 또한 지질 A의 독성 활성을 감소시킨다. 소포체의 제조(예를 들어, MV 또는 OMV)에 사용하기 위한 특정 관심 대상은 감소되거나 검출가능하지 않은 기능성 LpxL1-암호화된 단백질을 제공하도록 유전학적으로 변형된 엔. 메닌기티디스 균주이고, 예를 들어, 여기서, 상기 나이세리아 세균(예를 들어, 엔. 메닌기티디스 균주)은 lpxL1 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형된다. 예를 들어, 상기 나이세리아 세균은 예를 들어, lpxL1 유전자가 파괴된 lpxL1 유전자 녹아웃을 갖도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개공보 제2009/0035328호]를 참조한다. 상기 나이세리아 세균은 lpxL2 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 상기 나이세리아 세균은 lpxL1 유전자 및 lpxL2 유전자의 유전자 생성물의 감소된 활성 또는 활성 부재를 제공하도록 유전학적으로 변형될 수 있다. 상기 소포체는 LPS 생성을 위해 야생형인 엔. 메닌기티디스 균주와 비교하여 감소된 활성을 제공하고 대상체 fHbp의 면역원성을 유지한다.

LPS 독성 활성은 또한 폴리믹신 B 내성(이러한 내성은 지질 A의 4' 포스페이트상에 아미노아라비노스를 부가하는 것과 상호관련된다)에 관여하는 유전자/유전자좌에 돌연변이를 도입함에 의해 변화될 수 있다. 이들 유전자/유전자좌는 UDP-글루코스 데하이드로게나제를 암호화하는 pmrE 또는 아미노아라비노스 합성 및 전달에 관여할 수 있는 많은 엔테로박테리아세애에 공통된 항미생물 펩티드 내성 유전자 영역일 수 있다. 상기 영역에 존재하는 유전자 pmrF는 돌리콜-포스페이트 만노실 트랜스퍼라제를 암호화한다(문헌참조: Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).

포스포-릴레이 2개 성분 조절 시스템인 PhoP-PhoQ 조절 시스템(예를 들어, PhoP 구성적 표현형, PhoPc)에서 돌연변이 또는 낮은 Mg⁺⁺환경 또는 배양 조건 (PhoP-PhoQ 조절 시스템을 활성화시키는) 4'-포스페이트 및 미리스테이트를 대신하는 2-하이드록시미리스테이트(미리스테이트의 하이드록실화) 상에 아미노아라비노스의 부가를 유도한다. 상기 변형된 지질 A는 인간 내피 세포에 의한 E-셀렉틴 발현 및 인간 단핵구로부터 TNF-분비를 자극하기 위해 감소된 능력을 나타낸다.

폴리믹신 B 내성 균주는 또한 상기 균주가 감소된 LPS 독성을 갖는 것으로 나타남으로써 사용하기에 적합하다(문헌참조: 예를 들어, van der Ley et al. (1994) In: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England). 대안적으로, 폴리믹신 B의 결합 활성을 모방하는 합성 펩티드는 LPS 독성 활성을 감소시키기 위해 항원성 조성물에 부가될 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Rustici et al. (1993) Science 259:361-365; Porro et al. (1998) Prog Clin Biol Res.397:315-25).

내독소는 또한 배양 조건의 선택을 통해 감소될 수 있다. 예를 들어, 배지 리터당 0,1mg 내지 100mg의 아미노아라비노스를 함유하는 성장 배지에서 균주의 배양은 감소된 지질 독성을 제공한다(문헌참조: 예를 들어, WO 02/097646).

조성물 및 제형

"조성물", "항원 조성물", "항원성 조성물" 또는 "면역원성 조성물"은 본원에서 편의적으로 본원에 기재된 대상체 fHbp를 포함하는 조성물을 언급하기 위해 사용되고, 상기 대상체 fHbp는 임의로 콘주게이트되어 면역원성을 추가로 증진시킬 수 있다. 인간에서 항체, 예를 들어, 나이세리아 메닌기티디스에 대한 항체, 예를 들어, 나이세리아 메닌기티디스에 대한 살균 항체를 유도하기 위해 유용한 조성물은 본 개시내용에 의해 구체적으로 고려된다. 항원성 조성물은 1개, 2개, 또는 그 이상의 상이한 대상체 fHbp를 함유할 수 있다. 1 초과 유형의 fHbp가 존재할 경우, 각각의 대상체 fHbp는 fHbp 변이체 및/또는 아변이체의 상이한 조합 유래의 에피토프를 제시할 수 있다.

항원성 조성물은 면역학적 유효량의 대상체의 fHbp를 함유하고 필요시 다른 적합한 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 낮은 fH 결합제인 fHbp를 함유할 수 있다. 상기 조성물은, 적어도 하나의 fHbp가 낮은 fH 결합제인, 하나 이상의 fHbp를 함유한다. 1 초과의 fHbp가 조성물 내 존재할 경우, 각각의 fHbp는 상이할 수 있다 (예컨대 아미노산 서열 및/또는 콘주게이션 내에서).

일부 경우에서, 본 개시내용의 항원성 조성물은 본 개시내용의 오직 하나의 fHbp 변이체를 포함한다. 일부 경우에서, 본 개시내용의 항원성 조성물은 본 개시내용의 2 이상의 상이한 fHbp 변이체를 포함한다. 비제한적 예시로서, 일부 경우에서, 본 개시내용의 항원성 조성물은 하기를 포함한다:

1) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

2) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 R130 (예컨대 R130G)에서의 아미노산 치환을 포함함);

3) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 S223 (예컨대 S223R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

4) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

5) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 N115 (예컨대 N115I)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

6) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 D121 (예컨대 D121G)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

7) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 S128 (예컨대 S128T)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

8) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 V131 (예컨대 V131D)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

9) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 K219 (예컨대 K219N)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

10) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 Q38 (예컨대 Q38R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

11) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 N115 (예컨대 N115I)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

12) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 D121 (예컨대 D121G)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 S223 (예컨대 S223R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

13) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 S128 (예컨대 S128T)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

14) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 V131 (예컨대 V131D)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

15) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 K219 (예컨대 K219N)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

16) fHbp ID 22의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함);

17) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

18) fHbp ID 1의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 1 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 1의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 1 변이체는 S223 (예컨대 S223R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

19) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 N115 (예컨대 N115I)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 D211 (예컨대 D211A)에서의 아미노산 치환을 포함함);

20) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 N115 (예컨대 N115I)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 K219 (예컨대 K219N)에서의 아미노산 치환을 포함함);

21) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 N115 (예컨대 N115I)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함);

22) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 D121 (예컨대 D121G)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함);

23) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 S128 (예컨대 S128T)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함);

24) fHbp ID 22의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 22 변이체는 V131 (예컨대 V131D)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 22의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 22 변이체는 G220 (예컨대 G220S)에서의 아미노산 치환을 포함함);

25) fHbp ID 55의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 55 변이체는 S223 (예컨대 S223R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

26) fHbp ID 55의 제1 변이체 (여기서 상기 제1 fHbp ID 55 변이체는 E92 (예컨대 E92K)에서의 아미노산 치환을 포함함); 및 fHbp ID 55의 제2 변이체 (여기서 상기 제2 fHbp ID 55 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

27) 하기 아미노산 치환을 포함하는 fHbp ID22의 변이체: L130R 및 G133D 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 S223 (예컨대 S223R)에서의 아미노산 치환을 포함함);

28) 하기 아미노산 치환을 포함하는 fHbp ID22의 변이체: L130R 및 G133D 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함);

29) 하기 아미노산 치환을 포함하는 fHbp ID22의 변이체: L130R, G133D, 및 K219N 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 S223 (예컨대 S223R) 또는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함); 또는

30) 하기 아미노산 치환을 포함하는 fHbp ID22의 변이체: L130R, G133D, 및 G220S 및 fHbp ID 1의 변이체 (여기서 상기 fHbp ID 1 변이체는 S223 (예컨대 S223R) 또는 H248 (예컨대 H248L)에서의 아미노산 치환을 포함함).

본 개시내용에 의해 고려되는 면역원성 조성물은 하기를 포함하는 조성물을 비제한적으로 포함한다:

1) 본 개시내용의 적어도 하나의 변이체 fHbp; 및

2) NspA;

여기서, fHbp 및/또는 NspA는 재조합 단백질로서 및/또는 소포체 기반 조성물(예를 들어, OMV 또는 MV)로 제공될 수 있다. 하기가 주지되어야 한다: 조성물이 NspA 및 fHbp, 둘 모두를 포함할 경우, 조성물에 투여에 의하여 유도된 항체의 살균 활성은 하나 또는 둘 모두의 항원에 대한 항체의 협력작용으로부터 유도될 수 있다. 본 개시내용에 의하여 제공된 면역원성 조성물의 예시는 하기를 포함한다:

a) 상기 기술된 fHbp 변이체 (예컨대 변이체 fHbp가 적어도 하나의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대해 살균성 항체 반응을 유도할 경우)를 포함하는 면역원성 조성물;

b) 상기 기술된 fHbp 변이체 (예컨대 변이체 fHbp가 적어도 하나의 나이세리아 메닌기티디스 균주에 대해 살균성 항체 반응을 유도할 경우) 및 재조합 NspA 단백질을 포함하는 면역원성 조성물;

c) 본 개시내용의 변이체 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전적으로 변형된, 유전적으로 변형된 나이세리아 숙주 세포로부터 수득된 천연 OMV를 포함하여, 이로써 상기 암호화된 변이체 fHbp가 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 생산되고, 여기서 OMV는 암호화된 변이체 fHbp를 포함하는, 면역원성 조성물; 및

d) 본 개시내용의 변이체 fHbp를 암호화하는 핵산으로 유전적으로 변형된, 유전적으로 변형된 나이세리아 숙주 세포로부터 수득된 천연 OMV를 포함하여, 이로써 상기 암호화된 비-천연 발생 fHbp가 유전학적으로 변형된 숙주 세포에 의해 생산되고, 여기서 OMV는 암호화된 변이체 fHbp를 포함하는, 그리고 나이세리아 숙주 세포 또한 보다 높은 수준의 NspA를 생산하고, 이로써 OMV는 또한 NspA를 포함하는, 면역원성 조성물. 예를 들어, 나이세리아 숙주 세포는 NspA의 증가된 발현을 위하여 유전적으로 변형된 것일 수 있다.

"면역학적 유효량"이란 일련의 동일하거나 상이한 항원성 조성물의 일부로서 단일 용량으로 상기 양의 개체로의 투여가 예를 들어, 나이세리아, 특히, 엔. 메닌 기티디스, 보다 특히, 그룹 B 엔. 메닌기티디스에 의한 감염에 의해 유도된 증상 또는 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 항체 반응을 유도하는데 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료될 개체의 건강 및 물리적 조건, 연령, 항체를 생성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호 정도, 백신의 제형, 의학적 상황에 대한 치료 담당의의 평가 및 다른 관련 인자들에 따라 다양하다. 상기 양은 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 광범위에 속하는 것으로 예상된다.

NspA 폴리펩티드의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 참고: 예컨대, WO 96/29412; 및 Martin et al. (1997) J. Exp. Med. Exp. Med. 185:1173; 유전자은행 수탁 번호: U52066; 및 유전자은행 수탁 번호: AAD53286. "NspA 폴리펩티드"는, 도 40 및 서열 번호: 25에 명시된 아미노산 서열의 약 75 아미노산 내지 약 100 아미노산, 약 100 아미노산 내지 약 150 아미노산 또는 약 150 아미노산 내지 약 174 아미노산의 인접 연신부에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "NspA 폴리펩티드"는, 도 40 및 서열 번호: 25에 명시된 20 아미노산 내지 약 174 아미노산 서열의 약 75 아미노산 내지 약 100 아미노산, 또는 약 100 아미노산 내지 약 155 아미노산의 인접 연신부에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, NspA 폴리펩티드는 신호 서열이 없으며; 기타 경우 (예컨대 숙주 세포 내 발현을 위하여)에서, NspA 폴리펩티드는 신호 서열을 포함한다.

투여 용법은 상이한 시점에 투여되는 항원성 조성물의 단위 투여 형태와 함께 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄(예를 들어, 부스터 용량을 포함하는)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 상기 용어 "단위 용량 형태"는 인간 및 동물 대상체에 대한 단위 투여 형태로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 언급하고, 각각의 단위는 목적하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 본 발명의 항원성 조성물의 소정량을 함유하고, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제(예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클)와 연합되어 제공된다. 상기 항원성 조성물은 다른 면역조절제와 연계하여 투여될 수 있다.

항원성 조성물은 멸균 수용액, 흔히 식염 용액과 같은 용액일 수 있는 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 제공될 수 있거나, 이들은 분말 형태로 제공될 수 있다. 상기 부형제는 요구되는 경우 실질적으로 불활성일 수 있다.

일부 구현예에서, 대상체 면역원성 조성물은 소포체에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 면역원성 조성물은 MV에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 면역원성 조성물은 OMV에 존재하는 대상체 fHbp를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체 면역원성 조성물은 대상체 fHbp를 포함하는 MV 및 OMV의 혼합물을 포함한다. MV 및 OMV와 같은 소포체는 상기된 바와 같다.

상기 항원성 조성물은 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 인간에서 사용될 수 있는 공지된 적합한 보조제의 예는 알루미늄 보조제 (예컨대 인산알루미늄, 또는 수산화알루미늄), MF59 (4.3% w/v 스쿠알렌, 0.5% w/v Tween 80^TM 0.5% w/v Span 85), CpG-함유 핵산(여기서, 시토신은 비메틸화되어 있다), QS21, MPL, 3DMPL, 아퀼라(Aquilla)로부터의 추출물, ISCOMS, LT/CT 돌연변이체, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 퀼(Quil) A, 인터류킨 등을 포함하지만 이에 필연적으로 제한되지 않는다. 실험 동물을 위해, 프로인트 보조제 (불완전 프로인트 보조제; 완전 프로인트 보조제), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라닐-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디프-알미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로서 언급됨), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 중 세균으로부터 추출된 3개의 성분, 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 및 세포 벽 골격 (MPL+TDM+CWS)을 함유하는 RIBI를 사용할 수 있다. 보조제의 효과는 면역원성 항원 또는 이의 항원성 에피토프에 대해 지시된 항체의 양을 측정함에 의해 결정될 수 있다.

조성물의 효과를 증진시키기 위한 추가의 예시적인 보조제는 비제한적으로 하기를 포함한다: (1) 수중유 에멀젼 제형 (무라밀 펩티드(하기 참조) 또는 세균 세포벽 성분과 같은 다른 특이적 면역자극제 존재 또는 부재), 예를 들어 (a) 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화된 5% 스쿠알렌, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85 (임의로 MTP-PE를 함유하는)를 함유하는 MF59 (문헌참조: WO 90/14837; Vaccine Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), (b) 10% 스쿠알란, 0.4% Tween 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 서브마이크론 에멀젼으로 제형화되거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼으로 볼텍싱된 thr-MDP을 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포리지질 A(MPL), 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS), 예컨대 MPL+CWS (Detox TM)과 같은 하나 이상의 세포벽 성분을 함유하는 RIBI 보조제 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.); (2) 사포닌 보조제, 예를 들어, QS21 또는 Stimulon^TM(Cambridge Bioscience, Worcester, Mass.)(이는 사용될 수 있거나 ISCOMs (면역자극 복합체)와 같은 것으로부터 생성된 입자이다) (이러한 ISCOMS은 추가의 세제가 없을 수 있다, 예를 들어 WO 00/07621); (3) 완전 프로인트(Complete Freund's) 보조제 (CFA) 또는 불완전 프로인트 (Incomplete Freund's) 보조제 (IFA); (4) 사이토킨, 예를 들어, 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO99/44636), 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 마크로파아지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 등; (5) 모노포스포릴지질 A (MPL) 또는 3-O-탈아실화된 MPL (3dMPL) 예를 들어, GB-2220221, EP-A-0689454, 임의로 폐렴 당류와 사용되는 경우 실질적으로 알룸의 부재하에, 예를 들어, WO 00/56358; (6) 예를 들어, QS21과 3dMPL의 병용물 및/또는 수중유 에멀젼, 예를 들어, EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) CpG 모티프를 포함하는 올리고뉴클레오티드 (문헌참조: 예컨대, WO 98/52581), 예컨대, 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 함유(여기서, 시토신은 비메틸화되어 있다); (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르, (문헌참조: WO 99/52549); (9) 옥톡시놀과 병용된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (WO 01/21207) 또는 옥톡시놀과 같은 하나 이상의 추가의 비-이온성 계면활성제와 병용되는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제 (WO 01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드) (WO 00/62800); (11) 면역자극제 및 금속염의 입자, 예를 들어, WO 00/23105; (12) 사포닌 및 수중유 에멀젼, 예를 들어, WO 99/11241; (13) 사포닌 (예를 들어, QS21)+3dMPL+IM2 (임의로 +스테롤) 예를 들어, WO 98/57659; (14) 조성물의 효능을 증진시키기 위한 면역자극 제제로서 작용하는 다른 물질. 무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(노르-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타르니닐 -L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-- sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE) 등을 포함한다. 인간에 투여하기 위해 적합한 보조제는 특정 관심 대상이다. 일부 경우에서, 보조제는 알루미늄 염 보조제 (예컨대 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)이다.

상기 항원 조성물은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 마그네슘, 카보네이트 등과 같은 다른 성분을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 대략적인 생리학적 조건에 요구되는 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수 있다.

제형 중 대상체 fHbp의 농도는 광범위하게 다양할 수 있고(예를 들어, 약 0.1중량% 미만, 예컨대 적어도 약 2중량%에서, 많게는 20중량% 내지 50중량%) 일반적으로 주로 유체 용적, 점도 및 선택된 투여의 특정 방식 및 환자의 필요성에 따른 환자 기반 인자들을 기초로 선택된다.

fHbp-함유 제형은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 겔, 크림, 로션, 연고, 에어로졸 등의 형태로 제공될 수 있다. 경구 투여는 분해로부터 조성물의 보호를 필요로 할 수 있는 것으로 인지된다. 이것은 전형적으로 이것이 산성 및 효소적 가수분해에 내성이 되게 하는 제제와 조성물을 연합하거나 상기 조성물을 적당한 내성 담체 중에 포장함에 의해 성취된다. 분해로부터 보호하는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다.

fHbp-함유 제형은 또한 투여 후 fHbp의 혈청 반감기를 증진시키도록 제공될 수 있다. 예를 들어, 단리된 fHbp가 주사용으로 제형화되는 경우, 상기 fHbp는 콜로이드로서 제조되는 리포좀 제형 중에 또는 혈청 반감기를 연장하기 위한 다른 통상의 기술로 제공될 수 있다. 하기 문헌에 기술된 다양한 방법이 리포좀을 제조하는데 이용가능하다 [참조: 예를 들어, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 미국 특허 번호 4,235,871, 4,501,728 및 4,837,028]. 상기 제제는 또한 조절 방출 또는 서방출 형태로 제공될 수 있다.

면역 반응을 유도하는 방법

본 발명은 포유동물 숙주에서 하나 이상의 나이세리아 균주에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 대상체 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다.

상기 fHbp-함유 항원성 조성물은 일반적으로 질환 및 이의 합병증의 발병을 예방하거나 적어도 부분적으로 억제하기 위해 나이세리아 질환을 나타낼 위험에 처한 인간 대상체에게 투여된다. 이를 성취하기 위해 적당한 양은 "치료학적 유효 용량"으로서 정의된다. 치료학적 용도를 위한 유효량은 예를 들어, 항원성 조성물, 투여 방식, 환자의 체중 및 건강의 일반적 상태 및 처방 담당의의 판단에 따라 다양하다. 항원성 조성물의 단일 또는 다중 용량은 환자에 의해 요구되고 관용성이고 용량 및 횟수 및 투여 경로에 따라 투여될 수 있다.

상기 fHbp-함유 항원성 조성물은 일반적으로 숙주에서 면역 반응, 특히, 체액성 면역 반응, 예를 들어, 살균성 항체 반응을 유도하기 위한 유효량으로 투여된다. 상기된 바와 같이, 면역화를 위한 양은 다양하고 환자 70kg당 약 1㎍ 내지 100㎍의 범위, 일반적으로 5㎍ 내지 50㎍/70kg일 수 있다. 실질적으로 보다 높은 용량 (예를 들어, 10 mg 내지 100 mg이상)은 경구, 비강 또는 국소 투여 경로에서 적합할 수 있다. 초기 투여 후 동일하거나 상이한 fHbp-함유 항원성 조성물로 부스터 면역화시킬 수 있다. 일부 경우에서 백신 접종은 적어도 하나의 부스터, 일부 경우에서 2종의 부스터를 포함한다.

일반적으로 면역화는 부가된 부형제의 존재 또는 부재하에 경구적으로, 비강으로, 비인두로, 비경구로, 대장으로, 위장으로, 국소적으로, 경피로, 피하로, 근육내로, 정제로, 고체로, 분말로, 액체, 에어로졸 형태로, 국소적으로 또는 전신으로 조성물의 투여를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 투여에 의해 성취될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있고 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)]과 같은 공개 문헌에 보다 상세하게 기재되어 있다. (1980).

항-fHbp 면역 반응은 공지된 방법(예를 들어, 초기 면역화 전후 개체 기원의 혈청을 수득하고 개체의 면역 상태의 변화를 입증함에 의해, 예를 들어, 면역침전 검정 또는 ELISA, 또는 살균성 검정 또는 웨스턴 블롯 검정 또는 유동 세포측정 검정 등)에 의해 평가할 수 있다.

본 개시내용의 변이체 fHbp가 포유동물 숙주 내 하나 이상의 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살균성 반응을 유도하는지 여부는 임의의 잘 알려진 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 인간 fH 형질전환 마우스가 사용될 수 있으며, 여기서 상기 마우스는 인간 fH를 발현한다 (예컨대 인간 fH는 약 100 μg/ml 또는 100 μg/ml 초과의 농도에서 마우스 혈청 내에 존재한다). 본 개시내용의 변이체 fHbp는 인간 fH 형질전환 마우스에 투여된다. 일정 기간 후, 마우스 유래 혈청은 엔. 메닌기티디스의 하나 이상의 균주에 대한 살균 활성에 대해 시험된다. 적합한 대조군은, 예를 들어, fHbp ID 1를 포함한다. 적합한 검정의 예시가 하기에 기술된다: Vu et al. (2012) Sci.Reports2:341.

상기 항원성 조성물은 나이세리아 메닌기티디스에 대하여 면역학적으로 순수한 포유동물 숙주 (예컨대 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 약 5세 이하 및 바람직하게는 약 2세 이하의 인간 어린이이고 상기 항원성 조성물은 하기의 시점 중 어느 하나 이상에서 투여된다: 생후 2주, 1개월, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개월, 또는 1년 또는 15, 18, 또는 21개월 또는 2, 3, 4 또는 5세.

일반적으로 질환 증상의 첫번째 징후 전에 또는 감염 또는 질환(예를 들어, 나이세리아에 의한 노출 또는 감염으로 인해)에 대한 가능하거나 실제 노출의 첫번째 징후에 면역화를 개시하는 것이 바람직할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당해 분야의 숙련가에게 제공하기 위해 제시되며, 발명자가 자신의 발명으로서 여기는 본 발명의 범주를 제한하거나 아래의 실험이 전부 또는 유일하게 수행된 실험이라는 것을 나타내려는 것은 아니다. 사용된 숫자(예컨대, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 확보하기 위해 노력하였지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부는 중량부, 분자량은 중량 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다. 예를 들어, bp, 염기쌍; kb, 킬로베이스; pl, 피코리터; s 또는 sec, 초; min, 분; h 또는 hr, 시간; aa, 아미노산; kb, 킬로베이스; bp, 염기쌍; nt, 뉴클레오티드; i.m., 근육내; i.p., 복강내; s.c., 피하 등과 같은 표준 약어를 사용할 수 있다.

실시예 1 : fHbp ID 1 돌연변이체의 식별 및 특성화

물질 및 방법

라이브러리 스크리닝(library screening)

랜덤 돌연변이체 fHbp 라이브러리는 오류-유도 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성되었으며, 이어서 E. 콜리에 표면 표시를 허용하는 신호 서열을 포함하는 pET28 발현 플라스미드로 PCR 생성물을 클로닝하였다. 형광-활성화 세포 분류는 정렬은 fHbp 돌연변이체의 충분한 발현과 적절한 접힘을 보장하는 인간 fH의 결합이 낮고 대조군 항-fHbp 단클론성 항체의 높은 결합을 갖는 돌연변이체 클론을 단리하는 데 사용되었다. 수집한 세포를 한천 플레이트(50 μg/ml 카나마이신 설페이트 함유 LB 한천)에 도말하고 37℃에서 밤새 배양했다. 단일 E. 콜리 콜로니를 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하고 DNA 증폭산물을 정제(PCR 정제 키트, 키아젠(Qiagen))하고 T7 프로모터 및 T7 종결자에 어닐링된 프라이머를 사용하여 fHbp 유전자의 DNA 서열분석을 수행하였다. 랜덤 돌연변이체 fHbp 라이브러리를 스크리닝하는 접근법은, 1) 결정 구조만으로는 예측할 수 없는 fH 결합에 영향을 주는 위치; 및 2) 알라닌 치환이 fH 결합의 충분한 감소를 초래하지 않는 경우에 fH의 결합에 영향을 주는 알라닌 이외의 치환;을 확인할 수 있는 가능성을 가지고 있다.

추가 연구를 위한 돌연변이체 선택

FACS 실험으로부터 동정된 아미노산 치환 위치를 인간 fH 단편과의 복합체 중의 fHbp의 결정 구조에서 조사하였다. fH 결합 계면에 근접한(5Å 미만) 돌연변이체가 부위-특이적 돌연변이 유도을 위해 선택되었다. 부위-특이적 돌연변이 유도에 의한 라이브러리 돌연변이체의 재현이 추가 특성 결정을 위한 가용성 재조합 fHbp 단백질을 만들기 위해 필요했다. 이 접근법은 정렬된 많은 클론에 존재하고 fH 결합 부위로부터 멀리 떨어져 있는 원하지 않는 2차 돌연변이를 또한 제거했다. 부위-특이적 돌연변이체는 퓨젼 사이트-지향 돌연변이유도 키트(Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit)(써모 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Scientific, Inc.))로 제작되었다.

가용성 돌연변이체 fHbps의 발현 및 정제

가용성 재조합 fHbps를 E. 콜리에서 발현시키고 용해액을 전술한 바와 같이 제조하였다. fHbps는 히트랩 킬레이팅(HiTrap Chelating) HP 칼럼(5 ml; GE Life Sciences 인코포레이티드(GE Life Sciences, Inc.)) 및 아크타 퓨리파이어(Akta Purifier) 크로마토그래피 시스템(GE Life Sciences)을 사용하여 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제했다. 이미다졸 구배를 사용하여 결합 및 용출을위한 버퍼를 칼럼 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. 정제된 fHbp를 함유하는 분획을 합치고, 3% 수크로오스를 함유하는 PBS에 대해 투석하고, 사용하기 전에 -80℃에서 저장하였다.

마우스 면역원성 연구를 위해, 히트랩(HiTrap) SP HP 칼럼(5 ml; GE Life Sciences)을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 두 번째 정제 단계를 수행했다. 결합 및 용출 버퍼는 각각 150 mM 및 750 mM NaCl을 함유하는 25 mM MES, pH 5.5이었다. 결합된 fHbp는 결합 및 용출 버퍼에 의해 형성된 선형 구배를 가지는 SP 칼럼으로부터 용출되었다. 정제된 fHbp를 함유하는 분획을 합치고, 3% 수크로오스를 함유하는 PBS에 대해 투석하고, 사용하기 전에 -80℃에서 저장하였다.

인간 인자 H(fH)의 정제

인간 fH를 fHbp 친화성 칼럼상에서 정제하였다. 제조사의 프로토콜을 사용하여 5 mg의 fHbp ID 1을 NHS-활성화 HP 칼럼(5 ml; GE Life Sciences)에 커플 링시켜 칼럼을 제조하였다. 건강한 개인 공여체의 인체 혈청을 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 1:1 희석시켰다. 혈청을 칼럼에 가하고 칼럼을 10 용적의 PBS(즉, 50 ml)로 세척하였다. 결합된 fH는 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7의 5개의 칼럼 용적으로 용출되었다. 용출 분획을 50 ㎕의 1 M TRIS-HCl, pH 9.0을 함유하는 튜브에 수집하였다. fH를 함유하는 분획을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(4-12% NuPAGE; 인비트로겐(Invitrogen))으로 동정하였다. 전기영동은 1x MES 작동 버퍼(Running Buffer)(인비트로겐)를 사용하여 200V에서 45분 동안 수행되었다. 단백질을 쿠마시(Coomassie) G-250(심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain); 인비트로겐)으로 염색하여 시각화하였다. fH를 함유한 분획을 모으고 PBS에 대해 투석하고 fH의 분액을 사용 전에 -30℃에서 저장하였다.

fHbp 돌연변이체의 특성화

SDS-PAGE. 정제된 fHbp 돌연변이체 단백질의 크기 및 순도는 4-12% 폴리아크릴아미드 구배 겔(NuPAGE; 인비트로겐 인코포레이티드(Invitrogen, Inc.))을 사용하여 SDS-PAGE로 평가하였다. 각 단백질 2 μg을 상기 겔에 로딩하였다. SDS-PAGE를 fH에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의한 fHbp에 대한 fH의 결합. 96-웰 미세적정 플레이트(이뮬론(Immulon) 2HB; 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))의 웰을 2 μg/ml의 정제된 재조합 야생형 fHbp(양성 대조군) 또는 돌연변이체 fHbp(실험예)로 코팅하였다. 1% BSA(라이프블러드 메디칼 인코포레이티드(Lifeblood Medical, Inc.)) 또는 5% 탈지 분유(카네이션(Carnation); 네슬레 인코포레이티드(Nestle, Inc.))를 함유하는 PBS로 웰에 대한 비특이적 결합을 차단하였다. 희석 버퍼(0.1% 트윈(Tween)-20, 0.01% 나트륨 아자이드 및 1% BSA를 함유하는 PBS)에서 25 내지 0.0016 ㎍/ml 범위의 정제된 인간 fH의 5배 계대 희석액을 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 2시간 배양하였다. 0.1% 트윈-20(시그마(Sigma)) 및 0.01% 나트륨 아자이드(시그마)를 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 결합된 fH를 희석 버퍼 중의 양(sheep) 항-인간 fH(1:7,000; 앱캠 인코포레이티드(Abcam, Inc.)로 검출하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 다시 세척한 후, 결합된 1차 항체를 희석 버퍼 중의 알칼리성 포스파타제(1:5,000; 시그마-알드리치 인코포레이티드(Sigma-Aldrich, Inc.))에 콘주게이트된 당나귀 항-양 IgG로 검출하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온 배양하고 웰을 다시 세척하였다. ELISA는 기질 버퍼(50 mM 탄산나트륨, 1 mM MgCl₂, pH 9.8) 중의 포스파타제 기질(1 mg/ml 파라-니트로페닐 포스페이트; 시그마)으로 전개되었다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 405 nm에서의 흡광도를 UV-VIS 플레이트 리더(스펙트로맥스(Spectromax) 190; 몰레큘러 디바이시스 인코포레이티드(Molecular Devices, Inc.))에서 측정하였다.

ELISA에 의한 fHbp에 대한 항-fHbp 단클론성 항체의 결합. 마이크로타이 터 플레이트의 웰을 fHbp로 코팅하고, fH ELISA에 대해 상기 기재된 바와 같이 차단하고 세척하였다. 희석 버퍼 중의 25 내지 0.0016 μg/ml의 뮤린 항-fHbp 단클론성 항체(mAb)의 5배 계대 희석액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 세척한 후, 알칼리성 포스파타아제(1;5,000; 시그마-알드리치)에 콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG로 1차 항체를 검출하였다. 상기한 바와 같이 ELISA를 전개하여 판독하였다.

표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 fHbp에 대한 fH의 결합. SPR 실험은 비아코어(Biacore) X100 플러스 기기(GE Life Sciences)에서 수행되었다. 정제된 인간 fH의 3,000 반응 단위는 아민 커플링 키트(GE Life Sciences)를 사용하여 CM5 칩(GE Life Sciences)에 연결되었다. fH를 유동 세포 2에 고정화시키고 블랭크 고정화(fH 없음)를 유동 세포 1에서 참조기준으로 수행하였다. 3 mM EDTA를 함유하는 HEPES-완충 식염수 및 0.05% 계면활성제 P-20(GE Life Sciences)로 이루어진 3회의 시동 사이클 및 100 mM 글리신, 3M NaCl, pH 2.0을 갖는 재생화가 칩 표면을 컨디셔닝하기 위해 수행되었다. 100에서 1 nM(야생형) 또는 316 내지 3.16 nM 범위의 정제된 재조합 fHbp의 희석액을 150초 동안 주입했다. 해리를 300초 동안 모니터링하고, 데이터를 비아코어 X100 이밸류에이션 소프트웨어로 분석하였다.

마우스 면역원성. 야생형 CD-1 마우스 그룹(N = 14 내지 21)을 수산화 알루미늄으로 흡착된 fHbp 백신으로 면역화시켰다. 백신의 각 용량은 10 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, pH 6.5 중에 fHbp 10 μg 및 알하이드로겔(Alhydrogel)(브렌탁 바이오섹터(Brenntag Biosector)) 600 μg을 함유하였다. 3주 간격으로 2회 투여하고 2회 투여 후 3주 후에 심장 채혈에 의해 혈액을 수집하였다. 혈액을 처리하여 혈청을 얻었으며, 이를 장기 저장(> 2주)의 경우 -80℃ 또는 단기 저장(< 2주)의 경우 4℃에서 유지했다.

인간 fH 형질전환 BALB/c 마우스를 먼저 fHbp ELISA 및 정제된 인간 fH의 표준 곡선을 사용하여 240 μg/ml 초과의 혈청 인간 fH 농도를 갖는 동물을 동정하기 위해 스크리닝하였다. ELISA는 플레이트 상에 고정화된 정제된 fHbp ID 1을 사용하여 수행하였고, fH를 검출하기 위한 1차 및 2차 항체는 상기한 바와 동일하였다("ELISA에 의한 fHbp에의 fH의 결합" 참조).

형질전환 마우스 그룹(N = 11 내지 21)을 수산화 알루미늄(상기 기재된 야생형 CD-1 마우스에 대한 것과 동일한 양의 항원 및 보조제)으로 흡착된 fHbp 백신으로 면역화시켰다. 3주 간격으로 3회 투여하고 3회 백신 접종 후 3주 후에 혈액을 채취하였다. 혈청은 전술한 바와 같이 처리되고 저장되었다.

혈청 살균성 항체(SBA) 반응. 인간 보체-매개 SBA 반응은 각각의 백신 항원과 비교하여 동일하거나 근접하게 일치하는 fHbp 서열을 갖는 수막구균 균주에 대해 측정되었다. 박테리아를 4 mM 락테이트 및 0.02 mM CMP-NANA를 함유하는 정규 프란츠(Frantz) 배지(문헌[Frasch et al. “Outer membrane protein vesicle vaccines for meningococcal disease.” In Methods in Molecular Medicine, v. 66. Meningococcal Vaccines: Methods and Protocols. Edited by Pollard, A.J. and Maiden, M.C. Humana Press Inc. Totowa, NJ])에서 중간-지수 상(OD620nm = 0.6)으로 성장시켰다. 박테리아를 1% BSA를 함유한 둘베코(Dulbecco)의 PBS(에퀴테크 바이오(Equitech Bio.))에서 1:25,000으로 희석하였다. 인간 보체는 내인성 살균 항체가 없는 공여체로부터 얻어지며 히트랩 프로틴(HiTrap Protein) G 칼럼(5 ml, GE Life Sciences)을 사용하여 IgG 항체를 고갈시켰다. 각 반응에는 25% 인간 보체, 약 400 cfu의 박테리아 및 시험 항혈청 또는 대조군 항체의 희석액이 함유되어 있다. SBA 역가(titer)는 37℃에서 60분 배양 후 음성 대조군 웰에 비해 cfu가 50% 감소하는 혈청 희석액으로 계산되었다. 단백질 정제: C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 E. 콜리에서 재조합 fHbps를 발현시키고 금속 킬레이트 크로마토그래피(히트랩 킬레이팅(HiTrap Chelating) HP; GE Life Sciences)에 이어 이온 교환 크로마토그래피 (히트랩 SP; GE Life Sciences)로 정제하였다. 단백질(각각 2 μg)을 MES 작동 버퍼(인비트로겐)를 사용하여 4-12% NuPAGE 겔(인비트로겐)에서 분리하고 쿠마시 블루 염색(심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain), 인비트로겐)으로 시각화했다.

결과

인간 fH의 결합이 감소된 fHbp 돌연변이체를 동정하기 위해 랜덤 돌연변이체 라이브러리-기반 접근법이 개발되었다. 이 접근법은 구조 정보만으로는 예측할 수없는 fH의 결합 감소로 이어지는 돌연변이를 동정할 수 있었으며 주어진 위치에서 여러 아미노산 치환을 생성할 수 있었다. 이 접근법은 선택된 위치에서 알라닌을 대체하는 일반적인 접근법과 대조되며, 이는 때로는 fH의 결합이 약간 감소한다.

랜덤 돌연변이체 라이브러리 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 5개의 유망한 새로운 fHbp ID 1 돌연변이체를 확인하였다. 정제된 재조합 돌연변이체 fHbp ID 1 항원 Q38R, E92K, R130G, S223R 및 H248L을 도 1에 나타내었다.

도 1. fHbp ID 1 돌연변이체의 순도. 재조합 fHbp는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 E. 콜리에서 발현되고 금속 킬레이트 크로마토그래피(히트랩 킬레이팅 HP; GE Life Sciences)에 이어 이온 교환 크로마토그래피(히트랩 SP; GE Life Sciences)에 의해 정제되었다. 단백질(각각 2 μg)을 MES 작동 버퍼(인비트로겐)를 사용하여 4-12% NuPAGE 겔(인비트로겐)에서 분리하고 쿠마시 블루 염색(심플리 블루 세이프 스테인, 인비트로겐)으로 시각화했다. 레인 1, 칼레이도스코프(Kaleidoscope) 분자량 마커(바이오-래드 래보로토리즈(Bio-Rad Laboratories)); 2, fHbp ID 1 야생형; 3, Q38R; 4, E92K; 5, R130G; 6, S223R; 7, H248L.

이들 돌연변이체는 약 10배(R130G) 내지 약 20배(Q38R) 내지 약 100배(E92K, S223R 및 H248L)의 범위에서 감소된 fH의 결합을 나타낸다(도 2).

도 2A 및 2B. ELISA에 의한 fHbp ID 1 돌연변이체의 fH 결합. 미세적정 플레이트의 웰을 정제된 재조합 ID 1 야생형(WT) 또는 6개의 상이한 돌연변이체 단백질 중 하나로 코팅하였다. 상이한 농도의 정제된 인간 fH를 웰에 첨가하였다. 결합된 fH는 알칼리성 포스파타제(시그마)에 콘주게이트된 양의 항-인간 fH(Abcam) 및 당나귀의 항-양 IgG로 검출되었다. A. 인간 fH의 높은 결합력을 지닌 양성 대조군 fHbp ID 1 야생형(WT) 단백질. 낮은 fH 결합을 갖는 음성 대조군 fHbp ID 1 R41S 돌연변이체. B, fH의 결합이 감소된 새로운 fHbp ID 1 돌연변이체. R130G 돌연변이체는 fH의 중등도 결합을 보였으며, Q38R은 낮은 결합을 보였으며, E92K, S223R 및 H248L은 R41S보다 현저히 낮은 결합을 나타냈다. 반복 측정의 평균 및 표준편차가 도시된다.

R130G 및 Q38R 돌연변이체가 약간의 결합을 나타내는 표면 플라스몬 실험으로부터 돌연변이체 단백질에 대한 fH의 감소된 결합의 유사 패턴이 얻어졌지만, 다른 3개의 돌연변이체는 검출가능한 결합을 나타내지 않았다(도 3A 및 3B).

도 3A 내지 3E. 표면 플라스몬 공명에 의한 fHbp ID 1 돌연변이체의 fH 결합. 정제된 인간 fH의 3000개의 반응 단위를 CM5 칩(GE Life Sciences)에 연결하고 316 nM의 정제된 재조합 fHbp를 150초 동안 주입하였다. 참고로, ID 1 야생형(WT) 단백질에 대한 동일한 데이터를 각 패널에 표시하였다. 동일한 결합 패턴이 ELISA에서 관찰되었다(도 2); R130G 돌연변이체의 경우 fH에 대한 중간 정도의 결합, Q38R에 대한 낮은 결합 및 E92K, S223R 및 H248L에 대한 매우 낮은 결합. 모든 실험은 HBS-EP 작동 버퍼 및 비아코어 X100 플러스 표면 플라스몬 공명 기기를 사용하였다. 비아코어 X100 이밸류에이션 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.

돌연변이체 fHbp ID 1 단백질 5개 모두는 항-fHbp 단클론성 항체에 의해 인식된 구조적 에피토프를 유지하였다. 야생형 또는 돌연변이체 fHbps에 대한 5개의 항-fHbp 단클론성 항체의 농도-의존성 결합이 도 4에 도시되어 있다.

도 4A 내지 4E. ELISA로 측정한 fHbp 돌연변이체 단백질에 대한 뮤린 항-fHbp 단클론성 항체의 결합. 유사한 항-fHbp 단클론성 항체의 농도-의존적 결합은 야생형 및 돌연변이체 fHbps가 미세적정 플레이트의 웰에 유사한 양으로 존재하고 돌연변이체 fHbp가 5개의 별개의 단클론성 항체에 의해 인식된 구조적 에피토프를 보유함을 나타내었다. 2차 항체는 알칼리성 포스파타제(시그마)에 콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG이었다. 반복 측정에 대한 평균 및 표준편차가 도시되어 있다.

돌연변이체 단백질은 또한 다소 감소된 안정성을 갖는 E92K 돌연변이체를 제외하고는 야생형 fHbp ID 1과 유사한 열 안정성을 보유한다. 최종적으로, 돌연변이체는 혈청군 B 균주 H44/76에 대해 시험하였을 때 야생형 CD-1 마우스에서 유사한 살균성 항체 반응을 유도하였다(도 5A 및 5B).

도 5A 및 5B. 마우스에서 fHbp ID 1 돌연변이체에 대한 살균성 항체 반응. 도 5A에서, 12 내지 14개 그룹의 야생형 마우스를 3주 간격으로 정제된 재조합 fHbp(투여 당 10 ㎍)의 2회 투여로 복강내 면역화시켰다. 2차 투여 후 3주 후에 혈청을 얻었다. 혈청 살균성 활성은 보체 공급원으로서 IgG-고갈된 인간 혈청 및 시험 균주로서 혈청군 B 균주 H44/76을 사용하여 측정하였다. H44/76은 대조군 fHbp ID 1 WT 백신과 일치하는 fHbp ID 1을 발현한다. 각 기호는 개별 마우스의 역가를 나타내고, 수평 막대는 기하 평균 역가를 나타낸다. WT 그룹과 각 돌연변이체 그룹 간의 차이는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(t-테스트에 의해 p> 0.4). 도 5B에서, 14 내지 15개 그룹의 인간 fH 형질전환 마우스를 3주 간격으로 정제된 재조합 fHbp(투여 당 10 ㎍)의 3회 투여로 복강내 면역화시켰다. 3회 복용 후 3주 후에 혈청을 얻었다. 혈청 살균성 활성은 야생형 마우스에 대해 전술한 바와 같이 측정하였다.

도 6A 및 6B. ELISA에 의한 fHbp ID 1 단일 및 이중 돌연변이체에 대한 인간 fH의 결합. 실험은 도 2A 내지 2B에 대해 전술한 바와 같이 수행되었다.

도 7. 마우스에서 fHbp ID 1 단일 및 이중 돌연변이체에 대한 살균성 항체 반응. 20마리의 야생형 마우스 그룹을 면역화시키고 혈청 살균성 항체 반응을 도 5a에 대해 상기 기재된 바와 같이 결정하였다.

실시예 2: fHbp ID 55 돌연변이체의 특성화

물질 및 방법

실험은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

결과

fHbp ID 1에서 동정된 3개의 유망한 돌연변이체도 fHbp ID 55에 구축되었다; 여기에는 E92K, S223R 및 H248L이 포함되었다. 3개의 fHbp ID 55 돌연변이체 모두는 fH의 결합을 현저히 감소시켰다(도 8A). 돌연변이체는 뮤린 항-fHbp 단클론성 항체 JAR 41의 결합으로 판단할 때 구조적 완전성을 보존했다(도 8B).

도 8A 및 8B. fHbp ID 55 돌연변이체의 fH 결합. A. ELISA에 의한 고정된 fHbp ID 55 돌연변이체에의 fH의 결합. 실험은 도 2의 범례에서 기술한 대로 수행되었다. 2 내지 4회의 중복에 대한 평균치 및 범위가 나타난다. B. 항-fHbp 단클론성 항체(mAb) JAR 41의 농도 의존성 결합은 재조합 fHbps가 미세적정 플레이트의 웰에 유사한 양으로 존재하고 JAR 41에 의해 인식된 에피토프 영역에서 보존된 형상을 가짐을 나타냈다(N-말단 도메인; 상기 문헌[Vu et al. (2012) Sci . Reports]). 2차 항체는 알칼리성 포스파타제(시그마)에 콘주게이트된 염소 항-마우스 IgG이었다.

도 9. 야생형 마우스에서 fHbp ID 55 돌연변이체에 대한 살균성 항체 반응. 12마리의 마우스 그룹을 면역화시키고 혈청 살균성 항체 반응을 도 5a에 대해 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. fHbp ID 55를 발현하는 H44/76 균주의 돌연변이체에 대한 살균성 활성을 측정하였다.

도 10A, fHbp ID 55 S223R 돌연변이체에 대한 인간 fH 형질전환 마우스의 살균성 항체 반응. 11 내지 12마리의 형질전환 마우스 그룹을 정제된 재조합 fHbp 3회 투여량(투여 당 12 μg) 또는 인간 투여량의 10분의 1로 허가받은 총 12 μg fHbp를 함유한 트루멘바(Trumenba)(파이저(Pfizer)) 백신으로 면역화시켰다. 형질전환 마우스를 면역화시키고 혈청 살균성 항체 반응을 도 5B에 대해 전술한 바와 같이 결정하였다. 도 10B, 혈청 인간 fH 농도와 관련하여 야생형 및 인간 fH 형질전환 마우스에서 트루멘바에 대한 살균성 항체 반응. 혈청 인간 fH 농도를 이전에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다(문헌[Beernink et al. (2011) Journal of Immunology 186(6):3606-14]).

실시예 3: fHbp ID 22 돌연변이체의 식별 및 특성화

물질 및 방법

실험은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

결과

fH의 결합이 감소된 랜덤 fHbp 돌연변이체에 대한 독립적 검색은 변이체 군 2(서브-패밀리 A)에 있는 fHbp ID 22를 사용하여 수행되었다. 이 스크린은 6개의 유망한 새로운 돌연변이체를 만들었다(도 17). ELISA에 의해 ID 22 야생형 및 이전에 기술된 D211A 돌연변이체에 대한 fH 결합이 도 11A에 도시되어 있다. 6개의 새로운 돌연변이체 ID 22 단백질에 대한 fH 결합이 도 11B에 도시되어 있다.

도 11A-11D. fHbp ID 22 라이브러리 돌연변이체의 fH 결합. 도 11A, 인간 fH의 높은 결합을 갖는 양성 대조군 fHbp ID 22 야생형(WT) 단백질. fH의 낮은 결합을 갖는 음성 대조군 fHbp ID 22 D211A 돌연변이체. 도 11B, fH의 결합이 감소된 새로운 fHbp ID 22 돌연변이체. 모든 돌연변이체는 낮은 결합을 나타내었고 V131D는 D211A와 유사한 매우 낮은 결합을 보였다. 실험은 도 2의 범례에서 기술한 대로 수행되었다. 2 내지 4회의 중복에 대한 평균치 및 범위가 나타난다. 도 11C, 100 ㎍/ml 이하의 fH 농도에서 fHbp ID 22 돌연변이체의 부분 집합의 fH 결합. 도 11D, 돌연변이체의 부분 집합에 대한 항-fHbp 단클론성 항체 JAR 4의 결합(도 11C에서 사용된 것과 동일한 부호). 신규 돌연변이체 K219N은 JAR 4 결합을 유지하는 반면, G220S 돌연변이체는 JAR 4의 결합을 감소시킨다. 모든 돌연변이체는 다른 항-fHbp 단클론성 항체 JAR 31의 정규 결합을 가졌다(데이터 도시되지 않음). 반복 측정의 평균 및 표준 편차가 도시된다.

신규 돌연변이체 V131D 및 K219N에 대한 야생형 CD-1 마우스의 살균성 항체 반응을, 대조군 야생형 ID 22 단백질 및 이전에 특성화된 돌연변이체 D211A와 함께, 도 12에 나타내었다.

도 12A-12B. 야생형 마우스에서 fHbp ID 22 라이브러리 돌연변이체에 대한 살균성 항체 반응. 인간 fH의 낮은 결합을 갖는 라이브러리 돌연변이체가 면역화를 위해 선택되었다. 10 내지 21마리의 마우스 그룹을 3주 간격으로 정제된 재조합 fHbp(투여 당 10 ㎍)의 2회 투여로 면역화시켰다. 2차 투여 후 3주 후에 혈청을 얻었다. IgG 고갈된 인간 혈청을 보체 공급원으로서 사용하고 혈청군 B 균주 CH597을 시험 균주로서 사용하여 혈청 살균성 활성을 측정하였다. 이 균주는 대조군 fHbp ID 22 WT 백신과 거의 일치하는 fHbp ID 23을 발현한다. 도 12A, 신규 돌연변이체 V131D 및 K219N을 시험하는 실험. D211A 돌연변이체는 면역원성을 감소시키지 않는 대조군 돌연변이체 fHbp 백신으로서 사용되었다. 각 기호는 개별 마우스의 역가를 나타내고 수평 막대는 기하 평균 역가를 나타낸다. 도 12B, 신규 돌연변이체 D121G, S128T, F129S 및 G220S를 시험하는 두 번째 실험. V131D에 대한 소량의 손실을 제외하고는 신규 돌연변이체 fHbp에 대한 면역원성의 유의한 손실은 관찰되지 않았다.

도 13. 인간 fH 형질전환 마우스에서의 fHbp ID 22 라이브러리 돌연변이체 K219N에 대한 살균성 항체 반응. 대조군 돌연변이체 D211A는 더 높은 반응을 나타내었고 K219N 돌연변이체는 fHbp ID 22 야생형(WT) 항원과 유사한 반응을 나타냈다.

도 14. 시차 주사 미세열량계에 의해 측정된 fHbp ID 22의 열적 안정성. fHbp ID 22 야생형(WT, 실선)은 38(N-말단) 및 81℃(C-말단 도메인)에서 전개 전이를 수행한다. fHbp ID 22 L130R/G133D 이중 돌연변이체는 ID 22 WT와 비교하여 N-말단 도메인에 대해 19℃ 높은 열적 안정성을 나타낸다.

도 15A-15B. 치환 L130R 및 G133D(이중 돌연변이체, DM)를 라이브러리 유래 돌연변이체와 결합시켜 fH 결합을 감소시키는 fHbp ID 22 삼중 돌연변이체. A, fHbp ID 22 삼중 돌연변이체에 결합하는 fH. B, 대조군 뮤린 항-fHbp 단클론성 항체(mAb) JAR 4 결합(패널 A에서와 동일한 부호). 모든 안정화된 돌연변이체는 JAR 4를 fHbp ID 22 WT보다 잘 결합시킨다.

도 16. 인간 fH 형질전환 마우스에서 fHbp ID 22 삼중 돌연변이체에 대한 살균성 항체 반응. 시험된 두 돌연변이체는 안정성 이중 돌연변이체(DM)와 K219N 및 G220S를 각각 결합시킨다. 삼중 돌연변이체는 대조군 ID 22 WT 항원보다 8배 및 18배 더 높은 반응을 유도했다.

전술한 예시적인 fHbp ID 1 및 ID 22 돌연변이체의 요약을 도 17의 표에 제시하였다.

본 발명은 이의 특정 구현예를 참조로 기재되었지만 이는 다양한 변화가 본 발명의 진정한 취지 및 및 범위부터 벗어나는 것 없이 만들어질 수 있고 이의 등가물이 대체될 수 있다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 부가적으로, 특정 상황, 물질, 성분의 조성, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 객관적인 사상 및 범위에 적용하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이런 변형들은 첨부된 청구범위내에 포함되는 것으로 의도된다.

<110> Beernink, Peter T <120> Factor H Binding Protein Variants and Methods of Use Thereof <130> CHOR-076WO <150> US 62/028,123 <151> 2014-07-23 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 1 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 3 <211> 260 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60 Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110 Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125 Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140 Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205 His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu 245 250 255 Ala Ala Lys Gln 260 <210> 4 <211> 1231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys 65 70 75 80 Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr 100 105 110 Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu 115 120 125 Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val 130 135 140 Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser 145 150 155 160 Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe 165 170 175 Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys 180 185 190 Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile 195 200 205 Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys 210 215 220 Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly 225 230 235 240 Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile 260 265 270 Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp 275 280 285 Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly 290 295 300 Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys 305 310 315 320 Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr 340 345 350 Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr 355 360 365 Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro 370 375 380 Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln 385 390 395 400 Asn Tyr Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys 405 410 415 His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met 420 425 430 Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys 435 440 445 Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln 450 455 460 Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly 465 470 475 480 Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys 485 490 495 Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro 500 505 510 Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu 515 520 525 Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr 530 535 540 Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp 545 550 555 560 Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val 565 570 575 His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val 580 585 590 Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser 595 600 605 Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys 610 615 620 Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn 625 630 635 640 Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu 645 650 655 Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln 660 665 670 Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu 675 680 685 Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu 690 695 700 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser 705 710 715 720 Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly 725 730 735 Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys 740 745 750 Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys 755 760 765 Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys 770 775 780 Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu 785 790 795 800 Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln 805 810 815 Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly 820 825 830 Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly 835 840 845 Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys 850 855 860 Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr 865 870 875 880 Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys 885 890 895 Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu 900 905 910 Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly 915 920 925 Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His 930 935 940 Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe 945 950 955 960 Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu 965 970 975 Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu 980 985 990 Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr 995 1000 1005 Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met 1010 1015 1020 Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg 1025 1030 1035 1040 Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn 1045 1050 1055 Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg 1060 1065 1070 Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu 1075 1080 1085 Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp 1090 1095 1100 Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile 1105 1110 1115 1120 Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr 1125 1130 1135 Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys 1140 1145 1150 Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val 1155 1160 1165 Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr 1170 1175 1180 Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val 1185 1190 1195 1200 Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr 1205 1210 1215 Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 1220 1225 1230 <210> 5 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Arg Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 6 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Lys Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 7 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Gly Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Arg Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 9 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg Leu Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 10 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Ile Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 12 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Thr 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 13 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 13 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Asp Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 14 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 14 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Asn Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 15 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 15 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Ser Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 16 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 16 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60 Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Lys Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110 Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125 Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140 Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205 His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu 245 250 255 Ala Ala Lys Gln 260 <210> 17 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 17 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60 Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110 Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125 Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140 Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205 His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu 245 250 255 Ala Ala Lys Gln 260 <210> 18 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 18 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60 Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg 65 70 75 80 Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95 Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110 Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125 Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140 Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175 Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190 Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205 His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220 Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala 225 230 235 240 Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His Leu Ile Gly Leu 245 250 255 Ala Ala Lys Gln 260 <210> 19 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 19 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Arg Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 20 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg Leu Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 21 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp 180 185 190 Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile 195 200 205 Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Arg Leu 210 215 220 Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg Leu Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 255 <210> 22 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Arg Val Ser Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 23 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 23 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Arg Val Ser Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Asn Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 24 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 24 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110 Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Arg Val Ser Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly 165 170 175 Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Ser Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 25 <211> 174 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 25 Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala 20 25 30 His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro 35 40 45 Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro 85 90 95 Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val 100 105 110 Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly 115 120 125 Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp 130 135 140 Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn 145 150 155 160 Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Val Gly Val Arg Val Lys Phe 165 170 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 26 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10

Claims

인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체로서,
상기 변이체는 하기 중 적어도 하나로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고:
a) 아미노산 38 (Q38)에서의 글루타민의 아미노산 치환;
b) 아미노산 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환;
c) 아미노산 130 (R130G)에서의 아르기닌에 대한 글리신의 치환;
d) 아미노산 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및
e) 아미노산 248 (H248L)에서의 류신에 대한 히스티딘의 치환;
상기 아미노산 치환은 fHbp ID1 (서열 번호: 1)에 대한 것이고, 상기 변이체는 서열 번호: 1에 대한 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 50% 이하인 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 나이세리아 메닌기티디스 (Neisseria meningitides)의 적어도 하나의 균주에 대해 살균성 항체 반응을 유도하는, 변이체.
청구항 1에 있어서, Q38에서의 아미노산 치환은 Q38R, Q38K, Q38H, Q38F, Q38Y, 또는 Q38W인, 변이체 fHbp.
청구항 1에 있어서, E92에서의 아미노산 치환은 E92K, E92R, E92H, E92F, E92Y, 또는 E92W인, 변이체 fHbp.
청구항 1에 있어서, S223에서의 아미노산 치환은 S223R, S223K, S223H, S223F, S223Y, 또는 S223W인, 변이체 fHbp.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 1의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, R41S 및 R41A로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환 S223R 및 H248L을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체로서, 상기 변이체는 하기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고:
a) 아미노산 115 (N115I)에서의 아스파라긴에 대한 이소류신의 치환;
b) 아미노산 121 (D121G)에서의 아스파르트산에 대한 글리신의 치환;
c) 아미노산 128 (S128T)에서의 세린에 대한 트레오닌의 치환;
d) 위치 131 (V131)에서의 발린의 아미노산 치환;
e) 위치 219 (K219)에서의 리신의 아미노산 치환;
f) 위치 220 (G220)에서의 글리신의 아미노산 치환;
상기 아미노산 치환은 fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 것이고, 상기 변이체는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 50% 이하인 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도하는, 변이체.
청구항 10에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, V131 에서의 아미노산 치환은 V131D, V131E, V131K, V131R, V131H, V131F, V131Y, 또는 V131W인, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, K219 에서의 아미노산 치환은 K219N, K219Q, K219D, K219E, K219F, K219Y, 또는 K219W인, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, G220 에서의 아미노산 치환은 G220S, G220N, G220Q, G220D, G220E, G220K, G220R, G220H, G220F, G220Y, 또는 G220W인, 변이체 fHbp.
청구항 10 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp: L130R 및 G133D (여기서 상기 아미노산 치환은 fHbp ID 22에 대한 것임).
청구항 10에 있어서, 치환 L130R, G133D, 및 N115I을 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, 치환 L130R, G133D, 및 D121G을 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, 치환 L130R, G133D, 및 K219N 또는 치환 L130R, G133D, 및 D211A을 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 10에 있어서, 하기의 치환을 포함하는, 변이체 fHbp: L130R, G133D, 및 G220S.
인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체로서,
상기 변이체는 하기로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고:
a) 위치 92 (E92)에서의 글루탐산의 아미노산 치환;
b) 위치 223 (S223)에서의 세린의 아미노산 치환; 및
c) 위치 248 (H248)에서의 히스티딘의 아미노산 치환;
상기 아미노산 치환은 fHbp ID 55 (서열 번호: 3)에 대한 것이고, 상기 변이체는 서열 번호: 3에 대한 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 50% 미만의 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도하는, 변이체.
청구항 22에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 25% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 22에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 10% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 22에 있어서, 상기 변이체 fHbp는 인간 fH에 대한 fHbp ID 55의 친화도가 5% 이하인 친화도로 인간 fH에 결합하는, 변이체 fHbp.
청구항 22에 있어서, E92에서의 아미노산 치환은 E92K, E92R, E92H, E92F, E92Y, 또는 E92W인, 변이체 fHbp.
청구항 22에 있어서,S223 에서의 아미노산 치환은 S223R, S223K, S223H, S223F, S223Y, 또는 S223W인, 변이체 fHbp.
청구항 22에 있어서, H248에서의 아미노산 치환은 H248L, H248I, H248V, H248D, H248E, H248F, H248Y, 또는 H248W인, 변이체 fHbp.
면역원성 조성물로서,
a) 청구항 1 내지 28 중 어느 한 항의 변이체 fHbp; 및
b) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 면역원성 조성물.
청구항 29에 있어서, 상기 변이체 fHbp가 상기 fHbp를 발현하는 나이세리아 메닌기티디스 균주로부터 제조된 소포체 제제(vesicle preparation) 내에 존재하는, 면역원성 조성물.
청구항 29 또는 30에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 보조제를 포함하는, 면역원성 조성물.
청구항 29 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 나이세리아 표면 단백질 A를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
청구항 31에 있어서, 상기 보조제는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄인, 면역원성 조성물.
청구항 1 내지 28 중 어느 한 항의 변이체 fHbp를 암호화하는, 핵산.
청구항 34의 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터.
청구항 34의 핵산 또는 청구항 35의 재조합 발현 벡터를 포함하는, 시험관내 숙주 세포.
포유동물에서 항체 반응을 유도하는 방법으로서,
청구항 29내지 33 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 37에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
청구항 37에 있어서, 상기 항체 반응은 엔. 메닌기티디스 (N. meningitides)의 하나 이상의 균주에 대한 살균성 항체 반응인, 방법.
인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체로서,
상기 변이체는 fHbp ID 22 (서열 번호: 2)에 대한 아미노산 치환 L130R 및 G133D을 포함하고,
상기 변이체는 서열 번호: 2에 대한 85% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 변이체 fHbp는 50% 이하인 인간 fH에 대한 fHbp ID 22의 친화도로 인간 인자 H (fH)에 결합하고, 그리고 상기 변이체는 포유동물 숙주 내에서 살균성 항체 반응을 유도하는, 변이체.
청구항 40에 있어서, 상기 변이체는 하기 치환 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp: R80A, D211A, E218A, E248A, G236I, T221A, 및 H223A.
청구항 40에 있어서, 상기 변이체는 하기 치환 R80A을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 또는 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 상기 치환 D211A을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 또는 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 상기 치환 E218A을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 또는 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 상기 치환 E248A을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 또는 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 상기 치환 G236I을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 또는 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는 상기 치환 T221A 및 H223A을 추가로 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 90% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 95% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 fHbp.
청구항 40 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체가 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 99% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변이체 fHbp.