RU2665841C2 - Композиции neisseria meningitidis и способы их применения - Google Patents
Композиции neisseria meningitidis и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665841C2 RU2665841C2 RU2014136401A RU2014136401A RU2665841C2 RU 2665841 C2 RU2665841 C2 RU 2665841C2 RU 2014136401 A RU2014136401 A RU 2014136401A RU 2014136401 A RU2014136401 A RU 2014136401A RU 2665841 C2 RU2665841 C2 RU 2665841C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- amino acid
- lipidated
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 312
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 title claims abstract description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 56
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 463
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 457
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 451
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 235
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 213
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 78
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 71
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 71
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 47
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 188
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 153
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 148
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 132
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 104
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 100
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 97
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 87
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 87
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 80
- 101710186862 Factor H binding protein Proteins 0.000 description 75
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 55
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 52
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 50
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 38
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 35
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 30
- 241000588677 Neisseria meningitidis serogroup B Species 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 29
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 24
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 22
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 19
- 230000004044 response Effects 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 18
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- -1 series Chemical compound 0.000 description 17
- 241001573069 Neisseria meningitidis serogroup Y Species 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 241000921898 Neisseria meningitidis serogroup A Species 0.000 description 15
- 241000947238 Neisseria meningitidis serogroup C Species 0.000 description 15
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 14
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 14
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 14
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 14
- 229910017119 AlPO Inorganic materials 0.000 description 13
- 241001174901 Neisseria meningitidis alpha275 Species 0.000 description 13
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 13
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 11
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 9
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 8
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 7
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 7
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 6
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 5
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 5
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000759568 Corixa Species 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 4
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 101000679903 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Proteins 0.000 description 3
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 3
- 238000002169 hydrotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 3
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 229940032046 DTaP vaccine Drugs 0.000 description 2
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N Ethylamine Chemical compound CCN QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 229940124951 Menveo Drugs 0.000 description 2
- 108700015872 N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229920001219 Polysorbate 40 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 2
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 2
- 229940124731 meningococcal vaccine Drugs 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 2
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229940101027 polysorbate 40 Drugs 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000001881 scanning electron acoustic microscopy Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dimethylphenyl)ethanone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C(C)=C1 WPRAXAOJIODQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hexadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO NLMKTBGFQGKQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-dodecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO IEQAICDLOKRSRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical group N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 241000272478 Aquila Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100291031 Caenorhabditis elegans gly-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101710088341 Dermatopontin Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 101100390711 Escherichia coli (strain K12) fhuA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229940124897 Gardasil Drugs 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101100100117 Homo sapiens TNFRSF10B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000679921 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 1
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 1
- 108010055795 Integrin alpha1beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037872 Intercellular adhesion molecule 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710148794 Intercellular adhesion molecule 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010060408 Member 25 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027249 Meningitis meningococcal Diseases 0.000 description 1
- 201000010924 Meningococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000588649 Neisseria lactamica Species 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 102100028688 Putative glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical group CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100022205 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- FZLJPEPAYPUMMR-WLYGPBHPSA-N [(3S,4R,5S,6R)-3-[(2-deuterioacetyl)amino]-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound P(=O)(O)(O)OC1[C@@H](NC(C[2H])=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO FZLJPEPAYPUMMR-WLYGPBHPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H aluminium sulfate (anhydrous) Chemical compound [Al+3].[Al+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DIZPMCHEQGEION-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001948 anti-meningococcal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N ara-adenosine Natural products Nc1ncnc2n(cnc12)C1OC(CO)C(O)C1O OIRDTQYFTABQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150035354 araA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#CNC(=N/C)\NCCSCC1=NC=N[C]1C CCGSUNCLSOWKJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001380 cimetidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- GQOKIYDTHHZSCJ-UHFFFAOYSA-M dimethyl-bis(prop-2-enyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C=CC[N+](C)(C)CC=C GQOKIYDTHHZSCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940124508 injectable medicine Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical class O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000002418 meninge Anatomy 0.000 description 1
- 229960005037 meningococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108700007621 mifamurtide Proteins 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000625 opsonophagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 1
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 1
- 239000001818 polyoxyethylene sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 235000010989 polyoxyethylene sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940113124 polysorbate 60 Drugs 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical class O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M sodium octadecanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O RYYKJJJTJZKILX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 108010012704 sulfated glycoprotein p50 Proteins 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940048910 thiosulfate Drugs 0.000 description 1
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L thiosulfate(2-) Chemical compound [O-]S([S-])(=O)=O DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/36—Neisseria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Предложены рекомбинантный полипептид для индуцирования иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего, иммуногенная композиция, его включающая, и рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный полипептид. Рекомбинантный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Иммуногенная композиция для индуцирования иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего включает эффективное количество указанного полипептида и фармацевтически приемлемый носитель. Уровень экспрессии указанного рекомбинантного полипептида больше, чем уровень экспрессии соответствующей немутантного типа последовательности SEQ ID NO: 70. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 34 табл., 23 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается композиций Neisseria meningitidis и способов их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, способной вызывать сепсис, менингит и смерть. N. meningitidis может разделяться приблизительно на 13 серогрупп (включая серогруппы А, В, С, Е29, H, I, К, L, W-135, X, Y и Z) на основе химических и антигенных различий полисахаридных капсул. Болезнь обусловлена, главным образом, пятью из серогрупп (А, В, С, Y и W135).
Менингококковый менингит является тяжелым заболеванием, способным убивать детей и молодых взрослых людей за несколько часов, несмотря на наличие антибиотиков. Существует потребность в улучшенных иммуногенных композициях против менингококковых серогрупп А, В, С, Y и W135 и/или X.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для удовлетворения этой и других потребностей настоящее изобретение обеспечивает композиции Neisseria meningitidis и способы их применения.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 76, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является нелипидированным. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является иммуногенным.
В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей полипептид согласно любому из описанных авторами вариантов осуществления.
В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, два конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, три конъюгата, выбранных из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства А.
В одном варианте осуществления полипептид является полипептидом подсемейства В.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А05.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А12.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В01.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В09.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В44.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В22.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным В24.
В одном варианте осуществления полипептид является непирувилированным нелипидированным А62.
В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.
В одном аспекте изобретение касается способа вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппы С у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis серогруппа Y у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В.
В одном варианте осуществления полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, или аминокислотной последовательности, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления цистеин в позиции 1 полипептида делетирован. В еще одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактериального антитела против Neisseria meningitidis у млекопитающего, включая введение млекопитающему эффективного количества иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1A-1F: Вариантные нуклеиновокислотные последовательности Р2086.
Фигура 2А-2С: Вариантные аминокислотные последовательности Р2086. Ствол Gly/Ser в N-концевом хвосте каждого варианта подчеркнут.
Фигура 3: Структура белка ORF2086
Фигура 4: Удаление N-концевого Cys в результате ведет к потере экспрессии в Е. coli.
Фигура 5: Влияние длины ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта ORF2086. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В01, представлена в SEQ ID NO: 35. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В44, представлена в SEQ ID NO: 36. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А05, представлена в SEQ ID NO: 37. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А22, представлена в SEQ ID NO: 38. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как В22, представлена в SEQ ID NO: 39. Последовательность, ассоциированная с белком, обозначенным как А19, представлена в SEQ ID NO: 40.
Фигура 6: Высокий уровень экспрессии нелипидированного В09, несмотря на короткий ствол Gly/Ser. Первые две полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-делетированного варианта В09 до и после индукции. Третья и четвертая полосы демонстрируют экспрессию N-концевого Cys-положительного варианта В09 до и после индукции. Крайняя правая полоса представляет стандарт молекулярной массы. Аминокислотная последовательность, показанная под изображением, представлена в SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант А22, указанный на фигуре как "А22_001", представлена в последовательности SEQ ID NO: 42, показанной на фигуре под SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В22, указанный на фигуре как "В22_001", представлена в SEQ ID NO: 52. Нуклеотидная последовательность, представляющая N-концевой Cys-делетированный вариант В09, указанный на фигуре как "В09_004", представлена в SEQ ID NO: 53.
Фигура 7: Оптимизация кодонов повышает экспрессию нелипидированных вариантов В22 и А22. Слева показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта В22 до (полосы 1 и 3) и после (полосы 2 и 4) индукции IPTG. Справа показана экспрессия N-концевого Cys-делетированного варианта А22 до (полоса 7) и после (полоса 8) индукции IPTG. Полосы 5 и 6 представляют стандарты молекулярной массы.
Фигура 8А-8Н: Вариантные нуклеиново- и аминокислотные последовательности Р2086
Фигура 9А-9В: Выравнивание последовательности выбранных вариантов дикого типа подсемейств А и В ffHBP, обсуждаемых в Примерах 15-19. Следует заметить, что N-конец А62 является на 100% идентичным В09, а его С-конец является на 100% идентичным А22. Показанными последовательностями являются А05 (SEQ ID NO: 13); А12 (SEQ ID NO: 14); A22 (SEQ ID NO: 15); A62 (SEQ ID NO: 70); B09 (SEQ ID NO: 18); B24 (SEQ ID NO: 20); и консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 78).
ОПРЕДЕЛИТЕЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А04 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 3 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 4 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А12-2 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 5 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 6 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В02 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 7 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант ВОЗ гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 8 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 9 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В22 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 10 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В24 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 11 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, которая включает кодон, кодирующий N-концевой Cys.
SEQ ID NO: 12 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А04, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 13 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 14 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А12, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 15 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 16 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В02, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 17 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант ВОЗ, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 18 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 19 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 20 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 21 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 22 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2.
SEQ ID NO: 23 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2.
SEQ ID NO: 24 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 25 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 26 представляет последовательность ДНК для прямого праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 27 представляет последовательность ДНК для обратного праймера, показанную в Примере 2, Таблица 1.
SEQ ID NO: 28 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 29 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 30 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 31 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 30.
SEQ ID NO: 32 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 33 представляет аминокислотную последовательность для ствола Gly/Ser, которая кодируется, например, SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 34.
SEQ ID NO: 34 представляет последовательность ДНК для ствола Gly/Ser, показанную в Примере 4.
SEQ ID NO: 35 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 36 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 37 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 38 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 39 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 40 представляет аминокислотную последовательность для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А19, показанную на Фигуре 5.
SEQ ID NO: 41 представляет аминокислотную последовательность для N-конца а N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 42 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 43 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pDK087 включает SEQ ID NO: 43.
SEQ ID NO: 44 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В44. SEQ ID NO: 44 идентична SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 21 делетирован. SEQ ID 44 кодируется, например, SEQ ID NO: 43.
SEQ ID NO: 45 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован, и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ0б3 включает SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 46 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ064 включает SEQ ID NO: 46.
SEQ ID NO: 47 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида рЕВ065 включает SEQ ID NO: 47.
SEQ ID NO: 48 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В09 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 8. Плазмида pLA134 включает SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 49 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09. SEQ ID NO: 49 идентична SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 18 делетирован. SEQ ID 49 кодируется, например, последовательностью ДНК, выбранной из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48.
SEQ ID NO: 50 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован и последовательность включает кодоны, кодирующие дополнительную область Gly/Ser, по сравнению с SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 50 кодируется, например, SEQ ID NO: 45.
SEQ ID NO: 51 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант В44 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 11. Плазмида pLN056 включает SEQ ID NO: 51.
SEQ ID NO: 52 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 53 представляет последовательность ДНК для N-конца N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В09, показанную на Фигуре 6.
SEQ ID NO: 54 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 55 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 55 идентична SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 13 делетирован. SEQ ID NO: 55 кодируется, например, SEQ ID NO: 54.
SEQ ID NO: 56 представляет аминокислотную последовательность серино-глициновой последовательности повтора, как показано в Примере 7.
SEQ ID NO: 57 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01. SEQ ID NO: 57 идентична SEQ ID NO: 58, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 58 делетирован.
SEQ ID NO: 58 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В01, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 59 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В15, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 60 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В16, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 61 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на кодон для глицина.
SEQ ID NO: 62 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 19 заменен на глицин.
SEQ ID NO: 63 представляет последовательность ДНК для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой кодон для N-концевого Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на кодон для глицина.
SEQ ID NO: 64 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22, в которой N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1 SEQ ID NO: 15 заменен на глицин.
SEQ ID NO: 65 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (рЕВ042), кодирующую нелипидированный, непирувилированный полипептид А05.
SEQ ID NO: 66 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант A12. SEQ ID NO: 66 идентична SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 14 делетирован. SEQ ID NO: 66 кодируется, например, SEQ ID NO: 67.
SEQ ID NO: 67 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида A12.
SEQ ID NO: 68 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А22. SEQ ID NO: 68 идентична SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 15 делетирован. SEQ ID NO: 68 кодируется, например, SEQ ID NO: 69.
SEQ ID NO: 69 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для нелипидированного, непирувилированного полипептида А22.
SEQ ID NO: 70 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis серогруппа В, 2086, вариант А62, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 71 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А62. SEQ ID NO: 71 идентична SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 70 делетирован.
SEQ ID NO: 72 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК для SEQ ID NO: 71.
SEQ ID NO: 73 представляет кодон-оптимизированную последовательность ДНК (pDK086) для N. meningitidis, серогруппа В, вариант А05 гена 2086, в которой кодон, кодирующий N-концевой цистеин, делетирован по сравнению с SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 74 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А29, которая включает N-концевой Cys в аминокислотной позиции 1.
SEQ ID NO: 75 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В22. SEQ ID NO: 75 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 19 делетирован.
SEQ ID NO: 76 представляет аминокислотную последовательность для N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05.
SEQ ID NO: 77 представляет аминокислотную последовательность для нелипидированной N. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант А05. SEQ ID NO: 77 идентична SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 76 отсутствует.
SEQ ID NO: 78 представляет аминокислотную последовательность для консенсусной последовательности, показанной на ФИГ. 9А-9В.
SEQ ID NO: 79 идентична SEQ ID NO: 78, за исключением того, что Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 78 отсутствует.
SEQ ID NO: 80 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 80 идентична SEQ ID NO: 20, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 SEQ ID NO: 20 делетирован.
SEQ ID NO: 81 представляет аминокислотную последовательность для Ν. meningitidis, серогруппа В, 2086, вариант В24. SEQ ID NO: 81 идентична SEQ ID NO: 20, в которой остатки в позициях 1-3 SEQ ID NO: 20 делетированы.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если нет иного определения, все применяемые авторами технические и научные термины имеют такие же значения, общепринятые среди специалистов в области, к которой относится это изобретение. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, подобные или равноценные описываемым авторами, приемлемые способы и материалы описываются ниже. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничительные. Все публикации, патенты и другие упомянутые авторами документы включены путем ссылки в их полном объеме.
Определения
Термин "антиген" в целом касается биологической молекулы, как правило, белка, пептида, полисахарида, липида или конъюгата, который содержит по меньшей мере один эпитоп, с которым может быть выборочно связано родственное антитело; или, в некоторых случаях, иммуногенного вещества, которое может стимулировать выработку антител или вызывать Т-клеточные иммунные реакции, или и то, и другое, в организме животного, включая композиции, вводимые путем инъекции или абсорбируемые организмом животного. Иммунная реакция может быть вызвана для всей молекулы или для одной или нескольких разных частей молекулы (например, эпитопа или гаптена). Этот термин может применяться по отношению к отдельной молекуле или к гомогенной или гетерогенной популяции антигенных молекул. Антиген распознается антителами, Т-клеточными рецепторами или другими элементами специфического гуморального и/или клеточного иммунитета. Термин "антиген" включает все соответствующие антигенные эпитопы. Эпитопы данного антигена могут быть распознаны с применением любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных среди специалистов в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N.J. Например, линейные эпитопы могут определяться путем одновременного синтезирования большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям молекулы белка, и приведения пептидов в реакцию с антителами, пока пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие технологии известны специалистам в данной области и описываются, например, в Патенте США №4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Подобным образом конформационные эпитопы могут распознаваться путем определения пространственной конформации аминокислот, например, при помощи рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Кроме того, в контексте настоящего изобретения термин "антиген" также может применяться по отношению к белку, включающему модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (как правило, консервативного характера, хотя они могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, путем сайт-специфического мутагенеза или с применением конкретных процедур синтеза или при помощи генной инженерии, или же могут быть случайными, например, при мутации хозяев, вырабатывающих антигены. Кроме того, антиген может быть извлечен, получен или выделен из микроба, например, бактерии, или может быть целым организмом. Подобным образом определение также включает олигонуклеотид или полинуклеотид, экспрессирующий антиген, например, при иммунизации нуклеиновой кислотой. Также включаются синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 - Jul. 3, 1998).
Термин "консервативные" по отношению к аминокислотным замещениям может применяться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатического характера задействованных остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, триптофан и метионин; к полярным/нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. В некоторых вариантах осуществления изменения консервативной аминокислоты меняют первичную последовательность полипептидов ORF2086, но не меняют функцию молекулы. При создании этих мутантов может учитываться индекс гидропатичности аминокислот. Значение индекса гидропатичности аминокислот в обеспечении интерактивной биологической функции на полипептиде в целом осознается специалистами в данной области (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1): 105-32). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими подобный индекс или показатель гидропатичности, и образуемый в результате полипептид все равно обладает подобной биологической активностью. Каждая аминокислота получает свой индекс гидропатичности на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Их показатели таковы: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3.9); и аргинин (-4,5).
Считается, что относительный гидропатический характер аминокислотного остатка определяет вторичную и третичную структуру образуемого в результате полипептида, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими, как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и т.п. Специалистам в данной области известно, что аминокислота может быть замещена другой аминокислотой, имеющей подобный индекс гидропатичности, и при этом может быть получен функционально равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтение отдается замещению аминокислот, индексы гидропатичности которых находятся в пределах +/-2, особенно предпочтительно - в пределах +/-1, и еще более предпочтительно - в пределах +/-0,5.
Консервативные аминокислотные замещения или вставки также могут осуществляться на основе гидрофильности. Как описывается в Патенте США №4,554,101, включенном в данное описание путем ссылки, наибольшая локальная средняя гидрофильность полипептида, определяемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е., с биологическими свойствами полипептида. В Патенте США №4,554,101 указывается, что аминокислотные остатки имеют следующие показатели гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5±1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Следует понимать, что аминокислота может быть замещена другой, имеющей подобный показатель гидрофильности, и при этом может быть получен биологически равноценный, в частности, иммунологически равноценный полипептид. При таких изменениях предпочтительными являются замещения аминокислот, показатели гидрофильности которых находятся в пределах ±2; особенно предпочтительно - в пределах ±1; и еще более предпочтительно - в пределах ±0,5. Типичные замещения, при которых учитываются разные из вышеуказанных характеристик, хорошо известны специалистам в данной области, и к ним, помимо прочих, относятся: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
Термин "эффективное иммуногенное количество" в контексте данного описания означает количество полипептида или композиции, включающей полипептид, которое является эффективным для вызывания иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Например, эффективное иммуногенное количество белка rLP2086 согласно этому изобретению означает количество, которое является эффективным при вызывании иммунной реакции у хозяина - позвоночного. Конкретная "эффективная иммуногенная доза или количество" зависит от возраста, массы и медицинского состояния хозяина, а также от способа введения. Соответствующие дозы легко определяются специалистами в данной области.
Термин "ствол Gly/Ser" в контексте данного описания означает ряд остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys остатка белка, кодируемого ORF2086. В стволе Gly/Ser может существовать от 5 до 12 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Предпочтительно ствол Gly/Ser состоит из аминокислот от 2 до 7-13 белка, кодируемого ORF2086. Стволы Gly/Ser вариантов Р2086 согласно настоящему изобретению представлены подчеркнутыми последовательностями на Фигуре 2 (SEQ ID NO: 12-21). Как показано авторами, длина ствола Gly/Ser может влиять на устойчивость уровня экспрессии нелипидированного варианта Р2086. В типичном варианте осуществления эффект от влияния на длину ствола Gly/Ser сравнивают с показателями соответствующего варианта дикого типа.
Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, или обоих типов.
Термины "иммуногенное количество" или "иммунологически эффективное количество" или "доза", которых в контексте данного описания являются взаимозаменяемыми, в целом касаются количества антигена или иммуногенной композиции, достаточного для вызывания иммунной реакции, клеточной (Т-клетки) или гуморальной (В-клетки или антитело) реакции, или обоих типов, согласно измерениям с применением стандартных анализов, известных специалистам в данной области.
Термин "иммуногенная композиция" относится к фармацевтической композиции, содержащей антиген, например, микроорганизм или его компонент, причем композиция может применяться для вызывания иммунной реакции у субъекта. Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения человека, восприимчивого к инфекции N. meningidis, с введением иммуногенных композиций системным трансдермальным или мукозальным путем. Такое введение может включать инъекцию внутримышечным (i.m.), внутрибрюшинным (i.p.), внутрикожным (i.d.) или подкожным способами; нанесение в форме пластыря или другого трансдермального средства доставки; или путем мукозального введения через ротовую полость / пищеварительный, дыхательный или мочеполовой тракты. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция может применяться в производстве вакцины или при выработке поликлональных или моноклональных антител, которые могут применяться для пассивной защиты или лечения субъекта.
Оптимальное количество компонентов конкретной иммуногенной композиции определяют путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.
Термин "выделенный" означает, что материал удаляют из его первоначальной среды (например, естественной среды, если он встречается в природе, или из организма-хозяина, если это рекомбинантное образование, или переносят из одной среды в другую среду). Например, "выделенный" белок или пептид практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков клеточного или тканевого источника, из которого взят белок, или практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ в случае химического синтеза, или иным образом присутствует в смеси как компонент химической реакции. Согласно настоящему изобретению, белки могут быть выделены из бактериальных клеток или из клеточного дебриса, и, таким образом, они обеспечиваются в форме, применяемой в производстве иммуногенной композиции. Термин "выделенный" или "выделение" может включать очистку, включая, например, способы очистки белков, как описывается авторами. Выражение "практически не содержит клеточного материала" включает композиции полипептида или белка, в которых полипептид или белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантным путем. Таким образом, белок или пептид, который практически не содержит клеточного материала, включает композиции капсульного полисахарида, белка или пептида, включающие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1%, (сухой массы) примесного белка или полисахарида или другого клеточного материала. В случае получения полипептида / белка рекомбинантным путем он предпочтительно практически не содержит культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет около 20%, 10% или 5% объема белковой композиции. В случае получения полипептида или белка путем химического синтеза он предпочтительно практически не содержит химических прекурсоров или других химических веществ, т.е. отделен от химических прекурсоров или других химических веществ, участвующих в синтезе белка или полисахарида. Соответственно, такие композиции полипептида или белка включают менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% (сухой массы) химических прекурсоров или соединений, отличных от нужных фрагментов полипептидов / белков или полисахаридов.
Термин "N-концевой хвост" в контексте данного описания относится к N-концевой части белка, кодируемого ORF2086, прикрепляющей белок к клеточной мембране. N-концевой хвост показан в нижней части боковой проекции структуры с Фигуры 3. N-концевой хвост, как правило, включает N-концевые 16 аминокислот белка, кодируемого ORF2086. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост представляет собой аминокислоты 1-16 любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21. Термин "ORF2086" в контексте данного описания означает открытую рамку считывания 2086 бактерий вида Neisseria. ORF2086 Neisseria, кодируемые из нее белки, фрагменты этих белков и иммуногенные композиции, включающие эти белки, известны специалистам в данной области и описываются, например, в документе WO 2003/063766 и в публикациях патентных заявок США №№ US 20060257413 и US 20090202593, включенных в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Термин "Р2086" в целом касается белка, кодируемого ORF2086. Буква "Р" перед "2086" является аббревиатурой для белка ("protein"). Белки Р2086 согласно изобретению могут быть липидированными или нелипидированными. "LP2086" и "Р2086", как правило, означают липидированные и нелипидированные формы белка 2086, соответственно. Белок Р2086 согласно изобретению может быть рекомбинантным. Как правило, "rLP2086" и "rР2086" означают липидированные и нелипидированные формы рекомбинантного белка 2086, соответственно. "2086" также известен как фактор Н-связывающий белок (fHBP) благодаря его способности к связыванию с фактором Н.
Термин "фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель" в контексте данного описания охватывает любые и все растворители, диспергаторы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающий абсорбцию агенты и т.п., совместимые с введением человеку и другим хозяевам - позвоночным. Как правило, фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель и/или носитель представляет собой разбавитель, наполнитель и/или носитель, утвержденный федеральным регулирующим органом, правительством штата или другим регулирующим органом, или занесенным в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею в качестве средства для применения на животных, включая человека и отличных от человека млекопитающих. Термин "разбавитель", "наполнитель" и/или "носитель" означает разбавитель, адъювант, наполнитель или основу, с которыми вводят фармацевтическую композицию. Такими фармацевтическими разбавителями, наполнителями и/или носителями могут быть стерильные жидкости, такие, как вода и масла, включая минеральные, животные, растительные или синтетические. Вода, солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина могут применяться в качестве жидких разбавителей, наполнителей и/или носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящими фармацевтическими разбавителями и/или наполнителями являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т.п. В случае необходимости композиция также может содержать небольшое количество увлажнителя, объемообразующего агента, эмульгаторов или pH-буферы. Эти композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, композиций с замедленным высвобождением и т.п. Примеры подходящих фармацевтических разбавителей, наполнителей и/или носителей описываются в публикации "Remington's Pharmaceutical Sciences", Ε.W. Martin. Композиция должна соответствовать режиму введения. Подходящий разбавитель, наполнитель и/или носитель станет очевидным для специалиста в данной области и во многом зависит от пути введения.
"Защитная" иммунная реакция означает способность иммуногенной композиции к вызыванию иммунной реакции, гуморальной или клеточно-опосредованной, которая служит для защиты субъекта от инфекции. Обеспечиваемая защита не обязательно должна быть абсолютной, т.е. не требуется полное предотвращение или устранение инфекции, если наблюдается статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией субъектов, например, инфицированных животных, которым не вводили вакцину или иммуногенную композицию. Защита может ограничиваться уменьшением тяжести или замедлением возникновения симптомов инфекции. В целом "защитная иммунная реакция" должна включать вызывание повышение уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В конкретных ситуациях "защитная иммунная реакция" может включать вызывание двухкратного повышения уровня антитела или четырехкратного повышения уровня антитела, специфичного к конкретному антигену, по меньшей мере у 50% субъектов, включая определенный уровень измеримых реакций функционального антитела на каждый антиген. В некоторых вариантах осуществления опсонизирующие антитела коррелируют с защитной иммунной реакцией. Таким образом, защитная иммунная реакция может анализироваться путем измерения процента снижения численности бактерий в анализе бактерицидной активности сыворотки (SBA) или в опсоно-фагоцитарной пробе, например, как описано ниже. Такие анализы также известны специалистам в данной области. Для менингококковых вакцин, например, анализ SBA является общепринятым суррогатным средством защиты. В некоторых вариантах осуществления наблюдается снижение численности бактерий по меньшей мере на 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более по сравнению с численностью бактерий при отсутствии иммуногенной композиции.
Термины "белок", "полипептид" и "пептид" относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, это определение охватывает пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. Определение охватывает как белки полной длины, так и их фрагменты. Термины также включают модификации, такие, как делеции, добавления и замещения (которые в целом носят консервативный характер, но могут быть и неконсервативными) в природной последовательности, предпочтительно такие, что белок сохраняет способность к вызыванию иммунологической реакции у животного, которому вводят белок. Также включаются постэкспрессионные модификации, например, гликозилирование, ацетилирование, липидирование, фосфорилирование и т.п.
Авторами также описываются активные варианты и фрагменты раскрываемых полинуклеотидов и полипептидов. "Варианты" означают по сути подобные последовательности. В контексте данного описания "вариантный полипептид" означает полипептид, полученный из природного белка путем модификации одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка. Модификация может включать делецию (так называемое срезание) одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце природного белка; делеция и/или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких внутренних сайтах природного белка; или замещение одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах природного белка. Вариантные полипептиды сохраняют нужную биологическую активность природного полипептида, то есть, являются иммуногенными. Описываемый авторами вариант полипептидной или полинуклеотидной последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1-25 или 39), как правило, имеет по меньшей мере приблизительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с контрольной последовательностью.
Термин "фрагмент" относится к части аминокислотной или нуклеотидной последовательности, включающей указанное количество смежных аминокислотных или нуклеотидных остатков. В конкретных вариантах осуществления описываемый авторами фрагмент полипептида может сохранять биологическую активность полипептида полной длины и, таким образом, быть иммуногенным. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность белка, и, таким образом, могут быть иммуногенными. В альтернативном варианте фрагменты полинуклеотида, используемые в качестве праймеров ПЦР, как правило, не сохраняют биологическую активность. Таким образом, описываемые авторами фрагменты нуклеотидной последовательности могут включать по меньшей мере приблизительно 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 или 1500 смежных нуклеотидов или составлять полинуклеотид до полной длины. Описываемые авторами фрагменты полипептидной последовательности могут включать по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ПО, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 425, 450, 475 или 500 смежных аминокислот или до полного количества аминокислот, присутствующих в полипептиде полной длины.
Термин "рекомбинантный" в контексте данного описания означает любой белок, полипептид или клетку, экспрессирующие нужный ген, получаемые с применением способов генной инженерии. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к белку или полипептиду, означает полипептид, полученный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Белки согласно настоящему изобретению могут быть выделены из природного источника или получены способами генной инженерии. "Рекомбинантная" в контексте данного описания также означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая, по причине ее происхождения или манипуляции, не ассоциирована с полным полинуклеотидом, с которым она ассоциируется в природе, или его частью. Термин "рекомбинантный", применяемый по отношению к клетке-хозяину, означает клетку-хозяин, которая включает рекомбинантный полинуклеотид.
Термин "субъект" означает млекопитающее, птицу, рыбу, пресмыкающееся или любое другое животное. Термин "субъект" также включает человека. Термин "субъект" также включает домашних животных. Неограничивающими примерами домашних животных могут быть: собаки, кошки, свиньи, кролики, крысы, мыши, песчанки, хомяки, морские свинки, хорьки, птицы, змеи, ящерицы, рыбы, черепахи и лягушки. Термин "субъект" также включает домашний скот. Неограничивающими примерами домашнего скота могут быть: альпака, бизон, верблюд, крупный рогатый скот, олени, свиньи, лошади, ламы, мулы, ослы, овцы, козы, кролики, северные олени, яки, куры, гуси и индюки.
Термин "млекопитающие" в контексте данного описания означает любое млекопитающее, например, человека, мышь, кролика, нечеловекообразных приматов. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающим является человек.
Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые являются взаимозаменяемыми, относятся к фармацевтическим композициям, включающим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, вызывающую иммунную реакцию у субъекта.
Общее описание
Настоящее изобретение также выявляет ранее не выявленные трудности с экспрессией нелипидированных вариантов Р2086 и обеспечивает способы преодоления этих трудностей и их новые композиции. Хотя плазмидные последовательности, кодирующие нелипидированные варианты Р2086, обеспечивали сильную экспрессию нелипидированных вариантов, эти варианты были пирувилированными на N-концевом Cys. Пирувилирование исключает или уменьшает вероятность однородности процесса производства или однородность полипептидов. Авторами изобретения также было обнаружено, что делеция N-концевого Cys из нелипидированных вариантных последовательностей Р2086 позволяет избегать пирувилирования нелипидированных вариантов Р2086. Попытки преодоления пирувилирования путем делеции кодона для N концевого Cys либо устраняли экспрессию, либо приводили к экспрессии нерастворимых вариантов. В альтернативном варианте удаление N-концевого Cys из нелипидированных вариантов Р2086 снижало экспрессию в некоторых вариантах. Однако неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что по меньшей мере непирувилированные нелипидированные варианты А05, A12, А22, А62, В01, В09, В22 и В44 могут быть экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. Как правило, эти полипептиды могут быть экспрессированы без дополнительных модификаций, помимо делеции Cys, в отличие от соответствующей нелипидированной последовательности дикого типа. См., например, Примеры 2 и 4. Кроме того, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что непирувилированные нелипидированные варианты являются иммуногенными и вырабатывают бактерицидные антитела.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает два способа преодоления или уменьшения вероятности возникновения этих трудностей, связанных с экспрессией нелипидированных вариантов. Однако настоящее изобретение предусматривает и дополнительные способы. Первый способ состоит в изменении длины ствола Gly/Ser в N-концевом хвосте, непосредственно после N-концевого Cys. Второй способ состоит в оптимизации кодонов в N-концевом хвосте. Однако настоящее изобретение предусматривает и оптимизацию дополнительных кодонов. Эти способы обеспечивают усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086. Например, в одном варианте осуществления усиленную экспрессию растворимых нелипидированных вариантов Р2086 сравнивают с экспрессией соответствующих нелипидированных вариантов дикого типа.
Выделенные полипептиды
Авторами изобретения неожиданно были открыты выделенные непирувилированные, нелипидированные полипептиды ORF2086. Авторы изобретения также неожиданно было открыто, что полипептиды являются иммуногенными и способными вызывать бактерицидную иммунную реакцию.
В контексте данного описания термин "непирувилированный" относится к полипептиду, не содержащему пирувата. Нелипидированные полипептиды ORF2086, содержащие пируват, обычно демонстрируют сдвиг массы +70 по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. В одном варианте осуществления полипептид согласно изобретению не демонстрирует сдвига массы +70 по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом дикого типа при измерении путем масс-спектрометрии. См., например, Пример 10.
В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 включает делецию N-концевого цистеинового остатка по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Термин "N-концевой цистеин" означает цистеин (Cys) на N-конце или в N-концевом хвосте полипептида. Более конкретно "N-концевой цистеин" в контексте данного описания означает N-концевой цистеин, в котором липопротеины LP2086 являются липидированными трипальмитоиловым липидным хвостом, как известно специалистам в данной области. Например, если взять любую из последовательностей SEQ ID NO: 12-21 в качестве контрольной последовательности, N-концевой цистеин располагается в позиции 1. В другом примере, если взять в качестве контрольной последовательности SEQ ID NO: 70, N-концевой цистеин располагается в позиции 1.
Термин "нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид 2086 дикого типа" или "нелипидированный полипептид дикого типа" в контексте данного описания означает полипептид ORF2086, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности соответствующей зрелому липидированному полипептиду ORF2086, встречающемуся в природе. Единственное различие между нелипидированными и липидированными молекулами состоит в том, что нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа не липидирован трипальмитоиловым липидным хвостом в N-концевом цистеине.
Как известно специалистам в данной области, нелипидированная форма 2086 образуется белком, в котором отсутствует первоначальная лидерная последовательность, или лидерной последовательностью, замененной частью последовательности, которая не указывает сайт для ацилирования жирной кислотой в клетке-хозяине. См., например, заявку WO 2003/063766, включенную в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Примерами нелипидированного ORF2086 могут быть не только вышеописанный нелипидированный полипептид ORF2086 дикого типа, но и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другой пример нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44 (В44), SEQ ID NO: 49 (B09), SEQ ID NO: 55 (A05), SEQ ID NO: 57 (B01), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 62 (B22), SEQ ID NO: 64 (A22) и SEQ ID NO: 75 (B22). Другие примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 66 (А12), SEQ ID NO: 68 (A22) и SEQ ID NO: 71 (A62). Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (B24) и SEQ ID NO: 81 (B24). Дополнительные примеры нелипидированного полипептида ORF2086 включают аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 77. В одном варианте осуществления нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.
Примеры нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 12-21, показанную на Фигуре 2, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60. Еще один пример нелипидированного полипептида ORF2086 дикого типа включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 70. Эти типичные нелипидированные полипептиды ORF2086 дикого типа включают N-концевой Cys.
В контексте данного описания, например, "нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. "Непирувилированный нелипидированный" полипептид В44 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 44.
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50. "Нелипидированный дикого типа" полипептид В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. "Непирувилированный нелипидированный" В09 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50.
В качестве еще одного примера в контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Дополнительный пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76. Другой пример "нелипидированного" полипептида А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 77. "Нелипидированный дикого типа" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. "Непирувилированный нелипидированный" А05 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. Другие примеры "непирувилированного нелипидированного" А05 включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70. "Непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 71. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида А62 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А62 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71.
В контексте данного описания "нелипидированный" полипептид A12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. "Непирувилированный нелипидированный" A12 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 66.
В контексте данного описания "нелипидированный" А22 полипептид включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. "Нелипидированный дикого типа" полипептид А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. "Непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 68. Предпочтительно "непирувилированный нелипидированный" А22 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 68.
Термин "делеция" N-концевого Cys в контексте данного описания включает мутацию с делецией N-концевого Cys в отличие от последовательности нелипидированного полипептида дикого типа. Например, "делеция" N-концевого Cys означает удаление аминокислоты Cys из контрольной последовательности, например, из соответствующей последовательности дикого типа, что в результате ведет в уменьшению аминокислотного остатка по сравнению с контрольной последовательностью. Если нет иного описания термины "N-концевой Cys", "N-концевой Cys в позиции 1" и "Cys в позиции 1" являются взаимозаменяемыми.
В другом варианте осуществления N-концевой Cys замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Например, в типичном варианте осуществления N-концевой Cys в позиции 1 SEQ ID NO: 12-21 включает замещение С→G в позиции 1. См., например, SEQ ID NO: 62 по сравнению с SEQ ID NO: 19 (В22 дикого типа) и SEQ ID NO: 64 по сравнению с SEQ ID NO: 15 (А22 дикого типа). К типичным аминокислотам для замены N-концевого Cys относится любая отличная от Cys аминокислота, предпочтительно полярная незаряженная аминокислота, например, глицин. В предпочтительном варианте осуществления осуществляют замещение неконсервативным остатком к Cys.
Авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что экспрессия нелипидированных полипептидов ORF2086 с делецией N-концевого остатка Cys не приводит к обнаруживаемому пирувилированию при измерении при помощи масс-спектрометрии по сравнению с соответствующим нелипидированным полипептидом ORF2086 дикого типа. Примерами непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 могут быть имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (А05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Другой пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 (В01), в которой цистеин в позиции 1 делетирован. Дополнительные примеры выделенных непирувилированных, нелипидированных полипептидов ORF2086 включают полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. Еще один пример непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 (В01). Еще один пример выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086 включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77 (А05); полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 делетирован; и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76 (А05), в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие примеры непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 включают имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12 (А04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 58 (B01), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24), SEQ ID NO: 21 (B44) и SEQ ID NO: 70 (A62) в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный 2086 полипептид включает, по меньшей мере, приблизительно 250, 255 или 260 последовательных аминокислот и не более приблизительно 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263, 260, 259, 258, 257, 256 или 255 последовательных аминокислот. Любое минимальное значение может комбинироваться с любым максимальным значением в пределах диапазона. В более предпочтительном варианте полипептид включает, по меньшей мере, 254 или 262 последовательных аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает не более 262 последовательных аминокислот. В других вариантах осуществления полипептид включает не более 254 последовательных аминокислот. В одном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, кодирующей соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид. Например, в типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 71.
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный, нелипидированный полипептид ORF2086 кодируется нуклеотидной последовательностью, функционально связанной с экспрессирующей системой, причем экспрессирующая система способна экспрессироваться в бактериальной клетке. В типичном варианте осуществления нуклеотидная последовательность связана с регулирующей последовательностью, контролирующей экспрессию нуклеотидной последовательности.
Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области. Например, может применяться любой плазмидный вектор экспрессии, например, PET™ (Novogen, Madison Wis.) или PMAL™ (New England Biolabs, Beverly, Mass.) при условии, что полипептид может экспрессироваться в бактериальной клетке. Предпочтительно применяют вектор PET™ для клонирования и экспрессии рекомбинантных белков в Е. coli. В системе PET™ клонированный ген может быть экспрессирован под контролем фагового промотора Т7. Типичными бактериальными клетками являются Pseudomonas fluorescens и, предпочтительно, Е. coli.
В одном аспекте изобретение касается непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086, получаемого описанным способом. Полипептид предпочтительно является выделенным. Изобретение также касается композиций, включающих непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, получаемый описанным способом. Композиция предпочтительно является иммуногенной композицией. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В еще одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке.
В одном варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность выбрана из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 72. Предпочтительно бактериальной клеткой является Ε. coli.
B09, B44, A05: В одном аспекте изобретение касается композиции, включающей первый выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49 (В09), и второй выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44 (В44). В предпочтительном варианте осуществления полипептиды являются иммуногенными. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает полипептид ORF2086 подсемейства А из серогруппы В N. meningitidis. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является непирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 подсемейства А. В типичном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, примером которого может быть, например, SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой цистеин в позиции 1 делетирован, и SEQ ID NO: 55. В другом типичном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 делетирован; SEQ ID NO: 76, в которой Cys в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком; и SEQ ID NO: 77.
Полипептидные домены
В другом аспекте изобретение касается способа получения выделенного полипептида. Способ включает экспрессию в бактериальной клетке полипептида, который включает последовательность, имеющую более 90% идентичности с SEQ ID NO: 21, причем вышеупомянутая последовательность включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21, или их комбинация, причем в полипептиде отсутствует N-концевой цистеин. Способ также включает очистку полипептида. Полученный таким способом полипептид включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Предпочтительно, полипептид является иммуногенным. В предпочтительном варианте осуществления бактериальной клеткой является Е. coli.
Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 12 (A04), SEQ ID NO: 13 (A05), SEQ ID NO: 14 (A12), SEQ ID NO: 15 (A22), SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. В другом варианте осуществления цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. Другие типичные полипептиды включают SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 64. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 71. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 76. Еще один типичный полипептид включает SEQ ID NO: 77. Дополнительные примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (B24).
В одном типичном варианте осуществления выделенная полипептидная последовательность также включает, по меньшей мере, один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация. Примеры полипептидов, которые включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 13-18 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 21-34 SEQ ID NO: 21 и аминокислоты 70-80 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, а также включают по меньшей мере один домен, выбранный из группы, к которой относятся аминокислоты 96-116 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 158-170 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 172-185 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 187-199 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 213-224 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 226-237 SEQ ID NO: 21, аминокислоты 239-248 SEQ ID NO: 21 или их комбинация, включают SEQ ID NO: 16 (B02), SEQ ID NO: 17 (B03), SEQ ID NO: 18 (B09), SEQ ID NO: 19 (B22), SEQ ID NO: 20 (B24) и SEQ ID NO: 21 (B44). Предпочтительно цистеин в позиции 1 этих полипептидов делетирован. Другие типичные полипептиды включают полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 62.
В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, полученного описанным авторами способом. В одном варианте осуществления выделенный полипептид является непирувилированным нелипидированным полипептид. В другом аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, полученной описанным авторами способом.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды
В09: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 49, включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 46. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 47. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 48.
В одном аспекте изобретение касается плазмиды, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 45, причем плазмида может экспрессироваться в бактериальной клетке. Подходящие экспрессирующие системы, регулирующие последовательности и бактериальные клетки известны специалистам в данной области, как описывается выше. Предпочтительно бактериальной клеткой является Е. coli.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50. В типичном варианте осуществления SEQ ID NO: 50 кодируется последовательностью SEQ ID NO: 45.
В44: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 44 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 51. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 43. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 43.
А05: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 55 включают последовательности, выбранные из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 73. Предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 54. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 65. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 73.
А12: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 (А12), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 66, включают SEQ ID NO: 67. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 67.
А22: В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15 (А22), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 68, включают SEQ ID NO: 69. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 69.
А62: В одном аспекте изобретение касается выделенного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, причем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид включает аминокислотную последовательность, показанную в позициях 1-184 SEQ ID NO: 71. Полипептид предпочтительно является нелипидированным и непирувилированным. В другом варианте осуществления полипептид является иммуногенным.
В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает фрагмент А62. Типичные фрагменты А62 включает любое количество смежных остатков из SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 158-185 SEQ ID NO: 71. В другом варианте осуществления выделенный полипептид включает аминокислотную последовательность в позициях 159-186 SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления полипептид включает, по меньшей мере, 6 смежных аминокислот из аминокислотной последовательности в позициях 185-254 SEQ ID NO: 71.
В другом аспекте изобретение касается выделенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 71, при чем первые 20 аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина. Предпочтительно полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71. В одном варианте осуществления выделенная нуклеиновокислотная последовательность включает SEQ ID NO: 72.
В другом аспекте изобретение касается выделенного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70 (А62), в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 71, включают SEQ ID NO: 72. В одном аспекте изобретение касается выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO: 72.
Иммуногенные композиции
В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами композиции, включающие выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, являются иммуногенными. Иммуногенные композиции, включающие белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria meningitidis, известны специалистам в данной области. Типичные иммуногенные композиции включают описываемые в документе WO2003/063766 и Публикациях патентных заявок США US 20060257413 и US 20090202593, которые включены в данное описание путем ссылки в полном объеме. Такие описанные авторами иммуногенные композиции включают белок, демонстрирующий бактерицидную активность и обозначенный как белок ORF2086, его иммуногенные части и/или его биологические эквиваленты. Белок ORF2086 означает белок, кодируемый открытой рамкой считывания 2086 вида Neisseria.
Белок может быть рекомбинантным белком или выделенным белком из природного вида Neisseria. Например, белки ORF2086 Neisseria могут быть выделены из бактериальных штаммов, например, относящихся к виду Neisseria, включая штаммы Neisseria meningitidis (серогрупп А, В, С, D, W-135, Χ, Υ, Ζ и 29Е), Neisseria gonorrhoeae и Neisseria lactamica, а также могут быть иммуногенными частями и/или биологическими эквивалентами вышеупомянутых белков.
Белки ORF2086 включают белки 2086 подсемейства А и белки подсемейства В, их иммуногенные части и/или биологические эквиваленты. Белки 2086 подсемейства А и белки 2086 подсемейства В известны специалистам в данной области; см., например, вышеупомянутую публикацию Fletcher et al., 2004, и Murphy et al., J Infect Dis. 2009 Aug 1; 200(3): 379-89. См. также заявку WO 2003/063766, в которой раскрываются SEQ ID NO с 260 по 278 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства А. Кроме того, в документе WO 2003/063766 описываются SEQ ID NO с 279 по 299 как представляющие аминокислотные последовательности, ассоциированные с белками 2086 подсемейства В. Документ WO 2003/063766 включается в данное описание путем ссылки в полном объеме. Белки ORF2086 или их эквиваленты и т.п. могут быть липидированными или нелипидированными. Предпочтительно белок ORF2086 не является липидированным. В альтернативном варианте иммуногенные композиции могут быть комбинациями липидированных и нелипидированных белков ORF2086.
В (одном) варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности с белком, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, A12, А62 или А22. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, A12 или А22.
Комбинация полипептидов подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства А. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства А включают, например, А05 и А12; А05 и А22; А05 и А62; А12 и А62; А12 и А22; А22 и А62; А05, А12 и А22; А05, А12 и А62; А12, А22 и А62; и А05, А22 и А62. Предпочтительно полипептид ORF2086 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.
В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В22 или В09.
Комбинация полипептидов подсемейства В: В одном варианте осуществления композиция включает любую комбинацию полипептидов ORF2086 подсемейства В. Типичные комбинации полипептидов ORF2086 подсемейства В включают, например, В09 и В22; В22 и В44; В44 и В09; В01 и В09; В01 и В22; В01 и В44; и В09, В22 и В44; В09 и В24; В22 и В24; В24 и В44; В01 и В24; В02 и В24; В02 и В01; В02 и В09; В02 и В44; В01, В09 и В24; В01, В24 и В44.
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. Например, в некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой последовательности, выбранные из В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; В01, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 58; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию.
В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 или их комбинации. В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный вариант В09, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает непирувилированный нелипидированный В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 49, непирувилированный нелипидированный В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 44, или их комбинацию.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, которая включает полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем полипептид является непирувилированным нелипидированным В44. В44 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 44. В одном варианте осуществления композиция также включает второй полипептид ORF2086 подсемейства В из серогруппы В N. meningitidis, причем второй полипептид является непирувилированным нелипидированным В09. В09 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 49. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция является вакциной.
В другом варианте осуществления композиция включает не более 3-х полипептидов ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 2-х полипептидов ORF2086 подсемейства В.
В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства В. В еще одном варианте осуществления композиция включает не более 1, 2 или 3-х видов варианта ORF2086 подсемейства А.
Композиции, включающие полипептид подсемейства В и полипептид подсемейства А: В одном варианте осуществления композиция также включает один или несколько полипептидов ORF2086 подсемейства А. В предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А05 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А05 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция включает полипептид А62 подсемейства А. В более предпочтительном варианте полипептид А62 подсемейства А является нелипидированным и непирувилированным.
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства А, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок, имеющий по меньшей мере 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком подсемейства В, кодируемым нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria.
Предпочтительно иммуногенная композиция включает выделенный белок подсемейства А, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, и выделенный белок подсемейства В, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria. В более предпочтительном варианте иммуногенная композиция включает выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А и выделенный непирувилированный нелипидированный Полипептид ORF2086 подсемейства В.
Комбинации: предполагается любая комбинация полипептидов ORF2086. В одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один Полипептид подсемейства А при отсутствии полипептидов подсемейства В. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один полипептид подсемейства В при отсутствии полипептидов подсемейства А. Например, композиция включает только полипептиды подсемейства А.
Иммуногенная композиция может включать любой полипептид подсемейства А или его комбинацию. В некоторых вариантах осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой вариант А05, А04, А12 или А22. В другом варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А включает А62. В предпочтительном варианте осуществления полипептид ORF2086 подсемейства А представляет собой А05, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13; А04, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12; A12, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14; или вариант А22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или любую их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и А62. Например, иммуногенная композиция может включать полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 55 и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных Полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и A12. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А12 и А62.
Иммуногенная композиция может включать любой из полипептидов подсемейства В или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой вариант В44, В02, В03, В22, В24 или В09. В предпочтительном варианте осуществления белок ORF2086 подсемейства В представляет собой В44, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 21; В02, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16; В03, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 17; В22, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 19; В24, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 20; или вариант В09, с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys делетирован, или их комбинацию. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09 и В22. Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Дополнительная типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В09, В22 и В44.
В одном варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает нелипидированный полипептид ORF2086 и по меньшей мере один липидированный полипептид ORF2086.
В одном варианте осуществления композиция включает непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 при отсутствии липидированного полипептида ORF2086. В другом варианте осуществления композиция включает липидированный полипептид ORF2086 и непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. Например, композиция может включать липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 77. Другая типичная композиция включает липидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 76, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71. Дополнительная типичная композиция включает липидированный полипептид В01, имеющий последовательность SEQ ID NO: 58, и непирувилированный нелипидированный А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 71.
Типичные комбинации: одна типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных нелипидированных полипептидов ORF2086 А05, В09, В22 и В44. Например, иммуногенная композиция может включать непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086 подсемейства А А05 (SEQ ID NO: 55) и выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды ORF2086 подсемейства В В09 (SEQ ID NO: 49), В22 (SEQ ID NO: 75) и B44 (SEQ ID NO: 44).
Другая типичная иммуногенная композиция включает комбинацию выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства А А05 и A12 и выделенных непирувилированных нелипидированных полипептидов ORF2086 подсемейства В В22 и В44. Еще одна типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А12, А62, В09 и В44. Еще один пример включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А12, А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В09. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А62, В09 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62 и В44. Другая типичная иммуногенная композиция включает выделенные непирувилированные нелипидированные полипептиды А05, А62, В09 и В44.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает белок подсемейства А и белок подсемейства B в соотношении 1:1. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства А с полипептидом подсемейства В: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция включает любое из следующих соотношений полипептида подсемейства В с полипептидом подсемейства А: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; или 1:10.
Бактерицидные иммунные реакции
В одном аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции любой серогруппы N. meningitidis, такой, как серогруппа, выбранная из числа серогрупп А, В, С, Е29, H, I, K, L, W-135, Χ, Y и Z. В предпочтительном варианте осуществления описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против инфекции из серогрупп А, В, С, W-135, Y и/или X.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают у млекопитающего бактерицидную иммунную реакцию против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis. Композиции способны индуцировать бактерицидные антименингококковые антитела после введения млекопитающему и в предпочтительных вариантах осуществления могут индуцировать антитела, являющиеся бактерицидными против штаммов с соответствующими подсемействами. Дополнительная информация о бактерицидных реакциях представлена ниже. См., например, Примеры 6, 11, 12 и 13.
В одном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против гетерологичного подсемейства серогруппы В N. meningitidis. Например, композиция, включающая нелипидированный полипептид подсемейства А, может вызывать бактерицидную иммунную реакцию против варианта N. meningitidis подсемейства А серогруппы В и/или против варианта N. meningitidis подсемейства В серогруппы В. См., например, Примеры 18-19.
В другом аспекте описанные авторами выделенные полипептиды и композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию против по меньшей мере одного из штаммов N. meningitidis серогруппы А, серогруппы В, серогруппы С, серогруппы W135 и/или серогруппы Y В предпочтительном варианте осуществления композиции вызывают бактерицидную иммунную реакцию по меньшей мере против серогруппы В, серогруппы С и серогруппы Y N. meningitidis. См., например, Пример 21.
Бактерицидные антитела являются показателем защиты для человека, и доклинические исследования служат в качестве суррогата, и любая описанная авторами новая потенциально иммуногенная композиция должна вызывать выработку этих функциональных антител.
В09: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В09 и их иммуногенные композиции, вызывает выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В09, имеющий последовательность SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А или, предпочтительно, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13); варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта B16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. В типичном варианте осуществления непирувилированный нелипидированный полипептид В09 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11, Пример 12 и Пример 13.
В44: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В другом типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В44, имеющий последовательность SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 11. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В02 (SEQ ID NO: 16). См., например, Пример 12 и Пример 13. Кроме того, непирувилированный нелипидированный полипептид В44 и его иммуногенные композиции также могут вызывать выработку бактерицидных антител, которые связываются с вариантом В03 (SEQ ID NO: 17) и вариантом В15 (SEQ ID NO: 59). См., например, Пример 6.
В22: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид В22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид В22, имеющий последовательность SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный полипептид В22 вызывает выработку бактерицидных антител против варианта В44 (SEQ ID NO: 21); варианта В16 (SEQ ID NO: 60); варианта B24 (SEQ ID NO: 20); варианта B09 (SEQ ID NO: 18) или их комбинации. См., например, Пример 13.
А05: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А05, имеющий последовательность SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 55, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А05 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А05 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14) или их комбинации. См., например, Пример 6 и 13.
А62: В одном аспекте выделенный нелипидированный полипептид А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А. В одном варианте осуществления выделенный полипептид А62 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62, имеющий последовательность SEQ ID NO: 70, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 71, и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Например, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А12 (SEQ ID NO: 14), варианта A22 (SEQ ID NO: 15) и варианта A62 (SEQ ID NO: 70). В качестве еще одного примера, непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А29, варианта В09 и варианта В24. См., например, Примеры 18-19. В другом варианте осуществления непирувилированный нелипидированный А62 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта В16.
A12: В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А12, имеющий последовательность SEQ ID NO: 14, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 66 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный A12 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A12 (SEQ ID NO: 14), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29, вариант B09. См., например, Примеры 18-19.
В одном варианте осуществления выделенный непирувилированный нелипидированный А22 полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 15, в которой N-концевой Cys делетирован, или SEQ ID NO: 68 и их иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител (например, способных связываться) против полипептида ORF2086 из серогруппы В N. meningitidis, подсемейство А и/или подсемейство В. Предпочтительно непирувилированный нелипидированный А22 и его иммуногенные композиции вызывают выработку бактерицидных антител против варианта А05 (SEQ ID NO: 13), варианта А22 (SEQ ID NO: 15), варианта A62 (SEQ ID NO: 70), варианта A29. См., например, Примеры 18-19.
Способ вызывания выработки бактерицидных антител
В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе А N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе W135 N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппам А, В, С, W-135, X и/или Y N. meningitidis. В одном аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе В N. meningitidis. В типичном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis или их комбинации.
Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Примеры 18-19 и 22.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид В44. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В09. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 44, или их комбинация. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 18, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В еще одном типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 19, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства В серогруппы В N. meningitidis, включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, А12 и А62. См., например, Пример 19.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает вызывание выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis. Выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают непирувилированный нелипидированный полипептид А05. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. В другом предпочтительном варианте осуществления композиция также включает непирувилированный нелипидированный полипептид В44. См., например, Пример 6 и 13. В типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 44 или их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или их комбинацию. В другом типичном варианте осуществления выделенный полипептид или иммуногенная композиция включают SEQ ID NO: 77 (А05), SEQ ID NO: 44 (B44) или их комбинацию. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция для вызывания выработки бактерицидных антител, специфичных к ORF2086 подсемейства А серогруппы В N. meningitidis включает, по меньшей мере, один из непирувилированных нелипидированных полипептидов А05, A12 и А62. См., например, Примеры 18-19.
Когда типичную иммуногенную композицию, включающую по меньшей мере два непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086, как описывается выше, вводили млекопитающим, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может возникать синергетическая бактерицидная иммунная реакция против серогруппы В Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей один соответствующий непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086. См., например, Пример 19. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, первый непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере вторым пирувилированным нелипидированным полипептидом ORF2086 для вызывания иммунной реакции против серогруппы В Neisseria meningitidis.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе С N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y. Типичная иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, выделенный непирувилированный нелипидированный полипептид А62 и а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки у млекопитающего бактерицидных антител, специфичных к серогруппе Y N. meningitidis. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В другом аспекте изобретение касается способа выработки бактерицидных антител, специфичных к серогруппе X N. meningitidis у млекопитающего. Способ включает введение млекопитающему эффективного количества выделенного непирувилированного нелипидированного полипептида 2086 из N. meningitidis серогруппы В или его иммуногенной композиции, как описывается выше. См., например, Пример 22. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком. В другом варианте осуществления иммуногенная композиция также включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
Когда млекопитающему вводили типичную иммуногенную композицию, включающую четыре непирувилированных нелипидированных полипептида ORF2086 и конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, как описывается выше, авторами изобретения неожиданно было обнаружено, что может быть вызвана синергетическая бактерицидная иммунная реакция по меньшей мере против серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis по сравнению с иммуногенной композицией, включающей полипептиды ORF2086, в которой конъюгаты капсульного сахарида отсутствуют, и по сравнению с иммуногенной композицией, включающей конъюгат капсульного сахарида каждой из серогрупп Neisseria meningitidis А, С, W135 и Y, в которой полипептид ORF2086 отсутствует. См., например, Пример 22. Соответственно, в одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает, по меньшей мере, один непирувилированный нелипидированный полипептид ORF2086, действующий синергетически с по меньшей мере одним конъюгатом капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, С, W135 и Y для вызывания иммунной реакции против Neisseria meningitidis. Вызванная иммунная реакция может быть направлена против по меньшей мере одной из серогрупп В, С и Y Neisseria meningitidis. Иммуногенная композиция может включать белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью из ORF2086 Neisseria, полинуклеотиды или их эквиваленты в качестве единственного активного иммуногена в иммуногенной композиции. В альтернативном варианте иммуногенная композиция также может включать активные иммуногены, включая другие иммуногенные полипептиды видов Neisseria, или иммунологически активные белки одного или нескольких других микробных патогенов (к которым, помимо прочих относятся, например, вирус, прион, бактерия или грибок) или капсульный полисахарид. Композиции могут включать один или несколько нужных белков, фрагментов или фармацевтических соединений, необходимых для выбранного показания.
Настоящее изобретение предусматривает любую мультиантигенную или поливалентную иммуногенную композицию. Например, иммуногенная композиция может включать комбинации двух или более белков ORF2086, комбинацию белка ORF2086 с одним или несколькими белками Роr А, комбинацию белка ORF2086 с полисахаридами и/или конъюгатами полисахаридов meningococcus серогруппы А, С, Y и W135, комбинацию белка ORF2086 с комбинациями meningococcus и pneumococcus или комбинацию любого из вышеупомянутых компонентов в форме, подходящей для нужного введения, например, для мукозального введения. Специалисты в данной области смогут легко составить такие мультиантигенные или поливалентные иммунологические композиции.
В одном аспекте изобретение касается иммуногенной композиции, включающей выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В, и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере два из конъюгатов. В другом варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, три из конъюгатов. Например, композиции могут включать сахариды из: серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп W135 и Y; серогрупп А, С и W135; серогрупп А, С и Y; серогрупп A, W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y. Предпочтение отдается композициям, включающим по меньшей мере один сахарид серогруппы С (например, С и Y).
В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и четыре конъюгата, например, конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С; конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135; и конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y.
В предпочтительном варианте осуществления конъюгат является конъюгатом капсульного сахарида и белка-носителя. Подходящие белки-носители известны специалистам в данной области. Предпочтительно белок-носитель является бактериальным токсином, таким, как токсин дифтерии или столбняка, или их токсоидами или мутантами. В наиболее предпочтительном варианте белком-носителем является CRM197. Например, в одном варианте осуществления композиция включает, по меньшей мере, один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся (а) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы А N. meningitidis и (ii) CRM197; (b) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы С N. meningitidis и (ii) CRM197; (с) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы W135 N. meningitidis и (ii) CRM197; и (d) конъюгат (i) капсульного сахарида серогруппы Y N. meningitidis и (ii) CRM197.
Капсульные сахариды серогрупп А, С, W135 и Y изучены и известны специалистам в данной области. Например, капсульный сахарид серогруппы A meningococcus является гомополимером (α 1→6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата, с частичным O-ацетилированием в позициях С3 и С4. Ацетилирование в позиции С-3 может составлять 70-95%. Условия, применяемые для очистки сахарида, в результате могут приводить к де-O-ацетилированию (например, в основных условиях), однако применяются для удерживания ОАс в этой позиции С-3. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50% (например, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более) маннозаминовых остатков в сахаридах серогруппы А являются O-ацетилированными в позиции С-3. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами для предотвращения гидролиза, и такие модифицированные сахариды остаются сахаридами серогруппы А в рамках изобретения.
Капсульный сахарид серогруппы С является гомополимером (α 2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты). Большинство штаммов серогруппы С имеют O-ацетильные группы в позициях С-7 и/или С-8 сиаловокислотных остатков, но некоторые клинические изоляты не имеют этих O-ацетильных групп.
Сахарид серогруппы W135 является полимером дисахаридных единиц сиаловой кислоты - галактозы. Подобно сахариду серогруппы С, он обладает изменчивым O-ацетилированием, но в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты. Структура записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.
Сахарид серогруппы Y подобен сахариду серогруппы W135, за исключением того, что повторяющаяся дисахаридная единица включает глюкозу вместо галактозы. Структура серогруппы Y записывается следующим образом: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→. Подобно серогруппе W135, он обладает изменчивым O-ацетилированием в позициях 7 и 9 сиаловой кислоты.
Сахариды, применяемые согласно изобретению, могут быть O-ацетилированы, как описывается выше, например, с такой же схемой O-ацетилирования, как та, что наблюдается в природных капсульных сахаридах, или же они могут быть частично или полностью де-O-ацетилированы в одной или нескольких позициях сахаридных колец, или они могут быть гипер-O-ацетилированы относительно природных капсульных сахаридов.
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция включает выделенный нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 из Neisseria meningitidis серогруппы В и по меньшей мере один конъюгат, выбранный из группы, к которой относятся: а) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы А, b) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы С, с) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы W135 и d) конъюгат капсульного сахарида Neisseria meningitidis серогруппы Y, причем нелипидированный, непирувилированный полипептид ORF2086 включает, по меньшей мере, один из следующих компонентов: В44, В09, А05, В22, A12, А22, А62, В24, В16, В15, и В03. В одном варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. В другом варианте осуществления полипептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, к которой относятся SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 20, в которой цистеин в позиции 1 замещен аминокислотой, которая не является цистеиновым остатком.
Настоящее изобретение также предусматривает режимы мультииммунизации, при которых любая композиция, применяемая против патогена, может комбинироваться с композициями согласно настоящему изобретению. Например, пациенту, помимо прочих, может вводиться иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению и другая иммунологическая композиция для иммунизации против папилломавируса человека (HPV), например, вакцина HPV GARDASIL®, в рамках режима мультииммунизации. Специалисты в данной области легко смогут выбрать иммуногенные композиции для применения в связи с иммуногенными композициями согласно настоящему изобретению с целью разработки и реализации режимов мультииммунизации.
Полипептиды ORF2086, фрагменты и эквиваленты могут применяться в качестве компонента композиции иммуногенного конъюгата; в которой один или несколько белков или полипептидов конъюгированы с носителем с целью создания композиции, обладающей иммуногенными свойствами против нескольких серотипов или серотипов N. meningitidis, в частности, серогрупп менингококков, в частности, серогруппы В, и/или против нескольких болезней. В альтернативном варианте один из полипептидов ORF2086 может использоваться как белок-носитель для других иммуногенных полипептидов. Рецептирование таких иммуногенных композиций хорошо известно специалистам в данной области.
Иммуногенные композиции согласно изобретению предпочтительно включают фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавители и/или носитель. К подходящим фармацевтически приемлемым наполнителям, носителям и/или разбавителям относятся любые и все традиционные растворители, диспергаторы, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п. Подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями, разбавителями и/или носителями являются, например, один или несколько компонентов, к которым относятся вода, солевой раствор, фосфатно-буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации.
Фармацевтически приемлемые наполнители, разбавители и/или носители также могут включать в малых количествах вспомогательные вещества, такие, как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, продлевающие срок хранения иди повышающие эффективность антитела. Приготовление и применение фармацевтически приемлемых наполнителей, разбавителей и/или носителей хорошо известно среди специалистов в данной области. Если какие-либо традиционные среды или носители не являются несовместимыми с активным ингредиентом, предусматривается их применение в иммуногенных композициях согласно настоящему изобретению.
Иммуногенные композиции могут вводиться парентерально, например, путем инъекции, подкожно или внутримышечно, а также перорально или интраназально. Способы внутримышечной иммунизации описываются в публикациях Wolff et al. Biotechniques; 11(4): 474-85, (1991) и Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994). Другие режимы введения, помимо прочих, предполагают, например, пероральные композиции, пульмональные композиции, суппозитории и трансдермальные аппликаторы. Пероральные композиции, помимо прочих, включают, например, такие традиционно применяемые наполнители, как отвечающие фармацевтическим требованиям маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят внутримышечно.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению также могут включать один или несколько дополнительных "иммуномодуляторов", которые являются агентами, нарушающими или изменяющими иммунную систему таким образом, что наблюдается либо повышающая регуляция, либо понижающая регуляция гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунитета. В одном конкретном варианте осуществления предпочтение отдается повышающей регуляции гуморальной и/или клеточно-опосредованной групп иммунной системы. Примерами некоторых иммуномодуляторов, помимо прочих, могут быть, например, адъювант или цитокин или ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанный в Патенте США №5,254,339.
Неограничивающими примерами адъювантов, которые могут применяться в вакцине согласно настоящему изобретению, могут быть адъювантная система RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие, как гидроксид алюминия, эмульсии типа масло в воде, эмульсии типа вода в масле, например, полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil А или другая сапониновая фракция, монофосфорил-липид А и адъювант Авридин липид-амин. Неограничивающими примерами эмульсий типа масло в воде, применяемых в вакцине согласно изобретению, являются модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена (Sigma), 1% (объем/объем) детергента SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (объем/объем) этанола, 200 мкг/мл Quil А, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (объем/объем) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 является эмульсией типа масло в воде, содержащей 5% (объем/объем) сквалена, 1% (объем/объем) детергента SPAN® 85, 0,7% (объем/объем) детергента polysorbate-80, 2,5% (объем/объем) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина.
К другим "иммуномодуляторам", которые могут быть включены в вакцину, относятся, например, один или несколько интерлейкинов, интерферонов или другие известные цитокины или хемокины. В одном варианте осуществления адъювант может быть производной циклодекстрина или полианионным полимером, таким, как описанные в патентах США 6,165,995 и 6,610,310, соответственно. Следует понимать, что применяемый иммуномодулятор и/или адъювант зависит от субъекта, которому вводят вакцину или иммуногенную композицию, пути инъекции и предусмотренного количества инъекций.
В некоторых вариантах осуществления адъювантом является сапонин. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет от 1 мкг/мл до 250 мкг/мл; от 5 мкг/мл до 150 мкг/мл; или от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация сапонина составляет приблизительно 1 мкг/мл; приблизительно 5 мкг/мл; приблизительно 10 мкг/мл; приблизительно 20 мкг/мл; приблизительно 30 мкг/мл; приблизительно 40 мкг/мл; приблизительно 50 мкг/мл; приблизительно 60 мкг/мл; приблизительно 70 мкг/мл; приблизительно 80 мкг/мл; приблизительно 90 мкг/мл; приблизительно 100 мкг/мл; приблизительно 110 мкг/мл; приблизительно 120 мкг/мл; приблизительно 130 мкг/мл; приблизительно 140 мкг/мл; приблизительно 150 мкг/мл; приблизительно 160 мкг/мл; приблизительно 170 мкг/мл; приблизительно 180 мкг/мл; приблизительно 190 мкг/мл; приблизительно 200 мкг/мл; приблизительно 210 мкг/мл; приблизительно 220 мкг/мл; приблизительно 230 мкг/мл; приблизительно 240 мкг/мл; или приблизительно 250 мкг/мл.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления белки согласно изобретению применяют в иммуногенной композиции для перорального введения, которая включает мукозный адъювант и применяется для лечения или профилактики инфекции N. meningitidis у человека. Мукозным адъювантом может быть токсин холеры; однако предпочтительно мукозные адъюванты, отличные от токсина холеры, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают нетоксичные производные голотоксина холеры, в которых субъединица А представляет собой мутагенизированный, химически модифицированный токсин холеры или подобные белки, получаемые путем модификации аминокислотной последовательности токсина холеры. Примером конкретного токсина холеры, который может быть особенно подходящим для приготовления иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению, может быть мутантный голотоксин холеры Е29Н, описываемый в опубликованной международной заявке WO 00/18434, включенной в данное описание путем ссылки в полном объеме. Они могут быть добавлены к полипептидам согласно настоящему изобретению или конъюгированы с ними. Такие же технологии могут применяться к другим молекулам с мукозными адъювантными свойствами или особенностями доставки, таким, как термолабильный токсин (LT) Escherichia coli.
Могут применяться и другие соединения с мукозной адъювантной активностью или доставкой, такие, как желчь; поликатионы, такие, как DEAE-декстран и полиорнитин; детергенты, такие, как додецилбензолсульфат натрия; липид-конъюгированные материалы; антибиотики, такие, как стрептомицин; витамин А; и другие соединения, которые изменяют структурную или функциональную целостность поверхности слизистой оболочки. К другим активным в слизистой оболочке соединениям относятся производные микробных структур, такие, как MDP; акридин и циметидин. Также могут применяться STIMULON™ QS-21, MPL и IL-12, как описывается выше.
Иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению могут доставляться в форме ISCOMS (иммуностимулирующих комплексов), ISCOMS, содержащих СТВ, липосомы или инкапсулированных в такие соединения, как акрилаты или поли(DL-лактид-ко-гликозид) для образования микросфер подходящего для адсорбции размера. Белки согласно изобретению также могут быть включены в масляные эмульсии.
Количество (т.е. доза) иммуногенной композиции, вводимой пациенту, может определяться в соответствии со стандартными технологиями, известными специалистам в данной области, с учетом таких факторов, как конкретный антиген, адъювант (при наличии), возраст, пол, вес, вид, состояние конкретного пациента и путь введения.
Например, доза для пациентов-подростков может включать по меньшей мере 0,1 мкг, 1 мкг, 10 мкг или 50 мкг белка ORF2086 Neisseria и не более 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг или 200 мкг белка ORF2086 Neisseria. Возможны комбинации любого минимального значения и любого максимального значения для определения соответствующего диапазона.
Адъюванты
Иммуногенные композиции, описываемые авторами, также включают в некоторых вариантах осуществления один или несколько адъювантов. Адъювант является веществом, усиливающим иммунную реакцию при введении вместе с иммуногеном или антигеном. Многие цитокины или лимфокины обладают иммуномодулирующей активностью и, таким образом, могут использоваться в качестве адъювантов, включая, помимо прочих интерлейкины 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (см., например, Патент США №5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 и 18 (и его мутантные формы); интерфероны-α, β и γ; гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (см., например, Патент США №5,078,996 и номер доступа АТСС 39900); макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF); и факторы некроза опухолей α и β.
К другим адъювантам, применяемым с описанными авторами иммуногенными композициями, относятся хемокины, включая, помимо прочих, МСР-1, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β и RANTES; адгезивные молекулы, такие, как селектин, например, L-селектин, Р-селектин и Е-селектин; муциноподобные молекулы, например, CD34, GlyCAM-1 и MadCAM-1; представители семейства интегринов, такие, как LFA-1, VLA-1, Мас-1 и p150.95; представители надсемейства иммуноглобулинов, такие, как РЕСАМ, ICAM, например, ICAM-1, ICAM-2 и ICAM-3, CD2 и LFA-3; костимулирующие молекулы, такие, как В7-1, B7-2,CD40 и CD40L; факторы роста, включая фактор роста сосудов, фактор роста нервов, фактор роста фибробластов, фактор роста эпидермиса, PDGF, BL-1 и фактор роста эндотелия сосудов; рецепторные молекулы, включая Fas, рецептор TNF, Flt, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 и DR6; и Caspase (ICE).
Другими примерами адъювантов могут быть, помимо прочих, гидроксид алюминия; фосфат алюминия; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.); MPL™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид A; Corixa, Hamilton, Mont.), 529 (соединение аминоалкилглюкозамина фосфата, Corixa, Hamilton, Mont.), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, Mass.); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Wash.); N-ацетил-мурамил-L-теронил-D-изоглутамин (тре-MDP); N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, под названием нор-MDP); N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилоксиэтиламин) (CGP 19835А, под названием МТР-РЕ); и токсин холеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления адъювантом является QS-21.
Дополнительные типичные адъюванты включают нетоксичные производные токсина холеры, включая его субъединицу А, и/или конъюгаты или подвергнутые генной инженерии слияния полипептида N. meningitidis с токсином холеры или его субъединицей В ("СТВ"), термоинактивированный агрегат холерного энтеротоксина, грибковые полисахариды, включая шизофиллан, мурамилдипептид, производные мурамилдипептида ("MDP"), форболовые эфиры, термолабильный токсин Е. coli, блок-полимеры или сапонины.
Фосфат алюминия применяют в качестве адъюванта в клинических исследованиях 1-й фазы в концентрации до 0,125 мг/дозу, значительно ниже предела 0,85 мг/дозу, указанного в Своде федеральных постановлений США [610.15(a)]. Алюминийсодержащие адъюванты широко применяются в лечении людей для усиления иммунной реакции антигенов при внутримышечном или подкожном введении. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мкг/мл до 0,5 мкг/мл; от 0,20 мкг/мл до 0,40 мкг/мл; или от 0,20 мкг/мл до 0,30 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мкг/мл; приблизительно 0,15 мкг/мл; приблизительно 0,175 мкг/мл; приблизительно 0,20 мкг/мл; приблизительно 0,225 мкг/мл; приблизительно 0,25 мкг/мл; приблизительно 0,275 мкг/мл; приблизительно 0,30 мкг/мл; приблизительно 0,325 мкг/мл; приблизительно 0,35 мкг/мл; приблизительно 0,375 мкг/мл; приблизительно 0,40 мкг/мл; приблизительно 0,425 мкг/мл; приблизительно 0,45 мкг/мл; приблизительно 0,475 мкг/мл; или приблизительно 0,50 мкг/мл.
В предпочтительном варианте осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет от 0,125 мг/мл до 0,5 мг/мл; от 0,20 мг/мл до 0,40 мг/мл; или от 0,20 мг/мл до 0,30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация алюминия в иммуногенной композиции составляет приблизительно 0,125 мг/мл; приблизительно 0,15 мг/мл; приблизительно 0,175 мг/мл; приблизительно 0,20 мг/мл; приблизительно 0,225 мг/мл; приблизительно 0,25 мг/мл; приблизительно 0,275 мг/мл; приблизительно 0,30 мг/мл; приблизительно 0,325 мг/мл; приблизительно 0,35 мг/мл; приблизительно 0,375 мг/мл; приблизительно 0,40 мг/мл; приблизительно 0,425 мг/мл; приблизительно 0,45 мг/мл; приблизительно 0,475 мг/мл; или приблизительно 0,50 мг/мл.
Подходящими адъювантами, применяемыми для усиления иммунной реакции, также могут быть, помимо прочих, MPL™ (3-О-деацилированный монофосфорил-липид A, Corixa, Hamilton, МТ), описываемый в Патенте США №4,912,094. Также подходящими для использования в качестве адъювантов являются аналоги синтетического липида А или соединения аминоалкилглюкозамин фосфата (AGP) или их производные или аналоги от компании Corixa (Hamilton, МТ), а также описываемые в Патенте США №6,113,918. Одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил 2-дезокси-4-O-фосфоно-3-О-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, также известный как 529 (ранее известный как RC529). Этот адъювант 529 рецептирован в водной форме (AF) или в форме устойчивой эмульсии (SE).
К другим адъювантам относятся мурамилпептиды, такие, как N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (тре-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ); эмульсии типа масло в воде, такие, как MF59 (Патент США №6,299,884) (содержащие 5% сквалена, 0,5% polysorbate-80 и 0,5% SPAN 85 (необязательно содержащие различные количества МТР-РЕ) в форме субмикронных частиц, получаемых при помощи микрофлюидизатора, такого, как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) и SAF (содержащие 10% сквалена, 0,4% polysorbate-80, 5% PLURONIC-блокированного полимера L121 и тре-MDP, либо микрофлюидизированных в субмикронную эмульсию, либо перемешанных вихревым способом для образования эмульсии с большим размером частиц); неполный адъювант Фрейнда (IFA); соли алюминия (квасцы), такие, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия; AMPHIGEN; авридин; L121/сквален; D-лактид-полилактид/гликозид; полиолы PLURONIC; убитые клетки Bordetella; сапонины, такие, как Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), описанные в Патенте США №5,057,540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), описанные в Патенте США №5,254,339 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis; бактериальные липополисахариды; синтетические полинуклеотиды, такие, как олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG (см., например, Патент США №6,207,646); IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), описанные в европейских патентах №№1,296,713 и 1,326,634; коклюшный токсин (РТ) или его мутант, токсин холеры или его мутант (см., например, Патенты США №№7,285,281, 7,332,174, 7,361,355 и 7,384,640); или термолабильный токсин (LT) Е. coli или его мутант, в частности, LT-K63, LT-R72 (см., например, Патенты США №№6,149,919, 7,115,730 и 7,291,588).
Способы получения нелипидированных антигенов Р2086
В одном аспекте изобретение касается способа получения непирувилированного нелипидированного полипептида ORF2086. Способ включает экспрессию нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид ORF2086, в которой N-концевой цистеин делетирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа, и нуклеотидная последовательность функционально связана с экспрессирующей системой, которая может быть экспрессирована в бактериальной клетке. К типичным полипептидам, получаемым этим способом, относится любой описанный авторами полипептид. Например, в предпочтительном варианте полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 70, в которой цистеин в позиции 1 делетирован по сравнению с соответствующей последовательностью дикого типа. В другом предпочтительном варианте осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, в которой цистеин в позиции 1 делетирован. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотные последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 75. К дополнительным типичным полипептидам относится полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77. Другие примеры включают SEQ ID NO: 80 (В24) и SEQ ID NO: 81 (B24). Способ также включает очистку полипептида.
В некоторых вариантах осуществления изобретение обеспечивает способ получения растворимых нелипидированных антигенов Р2086, включающий этапы клонирования нуклеиновокислотной последовательности варианта ORF2086 в вектор экспрессии Е. coli без контрольной последовательности липидизации, преобразования бактерий Е. coli с вектором экспрессии ORF2086, включая экспрессию и выделение экспрессированного белка Р2086. В некоторых вариантах осуществления экспрессия вызывается IPTG.
В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 делетирован. Примеры таких кодонов включают TGC. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys варианта ORF2086 подвергают мутации путем точечного мутагенеза для образования кодона Ala, Gly или Val. В некоторых вариантах осуществления кодоны Ser и Gly добавляют к N-концевому хвосту варианта ORF2086 для продления ствола Gly/Ser непосредственно после N-концевого Cys. В некоторых вариантах осуществления общее количество остатков Gly и Ser в стволе Gly/Ser составляет по меньшей мере 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В некоторых вариантах осуществления кодон для N-концевого Cys делетирован. В некоторых вариантах осуществления N-концевые 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков являются Gly или Ser.
В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста нелипидированного варианта ORP2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют для приведения в соответствие N-концевому хвосту варианта В09. В некоторых вариантах осуществления кодоны N-концевого хвоста варианта ORF2086 оптимизируют путем точечного мутагенеза, таким образом, чтобы кодон, кодирующий пятую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 13-15 SEQ ID NO: 8, а кодон, кодирующий тринадцатую аминокислоту варианта ORF2086, был на 100% идентичным нуклеотидам 37-39 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 45 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 1-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 42 нуклеиновых кислоты были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-45 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта ORF2086 оптимизируют таким образом, чтобы 5' 39 нуклеиновых кислот были на 100% идентичными нуклеиновым кислотам 4-42 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 1-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает, по меньшей мере, одно аминокислотное замещение по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост нелипидированного варианта Р2086 включает два аминокислотных замещения по сравнению с аминокислотами 2-15 SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замещения являются консервативными аминокислотными замещениями.
В некоторых вариантах осуществления кодоны нелипидированного варианта являются оптимизированными для усиления экспрессии. Оптимизация кодонов известна специалистам в данной области. См., например, Sastalla et al, Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009) и Coleman et al, Science, vol. 320: 1784 (2008). В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов включает приведение использования кодона аминокислотной последовательности в соответствие с частотой кодона выбранного организма-хозяина при включении и/или исключении конкретных последовательностей ДНК. В некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов также включает минимизацию соответствующей вторичной структуры мРНК для снижения помех трансляции. В некоторых вариантах осуществления N-концевой хвост подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал одну из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34. В некоторых вариантах осуществления ствол Gly/Ser подвергнут оптимизации кодона, таким образом, чтобы он включал любую из последовательностей SEQ ID NO: 28, 30, 32 и 34.
Для лучшего понимания данного изобретения далее представлены примеры. Примеры предназначены лишь для пояснения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Рецептирование иммуногенных композиций
В некоторых вариантах осуществления иммуногенные композиции согласно изобретению также включают по меньшей мере один из компонентов, к которым относятся адъюванты, буферы, криопротекторы, соли, двухвалентные катионы, неионные детергенты, ингибиторы окисления свободными радикалами, разбавители или носители.
Иммуногенные композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько консервантов в дополнение к множеству менингококковых белковых антигенов и конъюгатов капсульных полисахаридов - белков. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) требует, чтобы биологические продукты в многодозовых флаконах содержали консервант, лишь с несколькими исключениями. К вакцинным продуктам, содержащим консерванты, относятся вакцины, содержащие хлорид бензетония (сибирская язва), 2-феноксиэтанол (DTaP, НерА, Lyme, Polio (парентеральная)), фенол (Pneumo, Typhoid (парентеральная), Vaccinia) и тимеросал (DTaP, DT, Td, НерВ, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Консерванты, утвержденные к применению в инъекционных медикаментах, включают, например, хлоробутанол, м-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, 2-феноксиэтанол, хлорид бензетония, хлорид бензалкония, бензойная кислота, бензиловый спирт, фенол, тимеросал и нитрат фенилртути.
Композиции согласно изобретению также могут включать один или несколько компонентов, к которым относятся буфер, соль, двухвалентный катион, неионный детергент, криопротектор, такой, как сахар, и антиоксидант, такой, как акцептор свободных радикалов или комплексообразующий агент, или любую их множественную комбинацию. Выбор любого одного компонента, например, комплексона, может определять, требуется ли еще какой-либо компонент (например, акцептор). Готовая композиция, рецептированная для введения, должна быть стерильной и/или апирогенной. Специалист в данной области может эмпирическим путем определить, какие комбинации этих и других компонентов будут оптимальными для включения в содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению в зависимости от разных факторов, таких, как конкретные требуемые условия хранения и введения.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, которая является совместимой с парентеральным введением, включает один или несколько физиологически приемлемых буферов, выбранных из группы, к которой, помимо прочих, относятся Tris (триметамин), фосфат, ацетат, борат, цитрат, глицин, гистидин и сукцинат. В некоторых вариантах осуществления композицию буферируют до уровня рН в диапазоне от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, предпочтительно от приблизительно 6,4 до приблизительно 7,4.
В некоторых вариантах осуществления желательным может быть регулирование уровня рН иммуногенной композиции или препарата согласно изобретению. Уровень рН композиции согласно изобретению может регулироваться с применением стандартных технологий, известных специалистам в данной области. Уровень рН композиции может регулироваться до показателя от 3,0 до 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до показателя от 3,0 до 6,0, от 4,0 до 6,0 или от 5,0 до 8,0. В других вариантах осуществления уровень рН композиции может составлять или может регулироваться до приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 5,8, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления уровень pН может составлять или может регулироваться до показателя в диапазоне от 4,5 до 7,5 или от 4,5 до 6,5, от 5,0 до 5,4, от 5,4 до 5,5, от 5,5 до 5,6, от 5,6 до 5,7, от 5,7 до 5,8, от 5,8 до 5,9, от 5,9 до 6,0, от 6,0 до 6,1, от 6,1 до 6,2, от 6,2 до 6,3, от 6,3 до 6,5, от 6,5 до 7,0, от 7,0 до 7,5 или от 7,5 до 8,0. В конкретном варианте осуществления уровень рН композиции составляет приблизительно 5,8.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько двухвалентных катионов, включая, помимо прочих, MgCl2, СаСl2 и МnСl2 в концентрации от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 10 мМ, причем предпочтение отдается концентрации до приблизительно 5 мМ.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одну или несколько солей, включая, помимо прочих, хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия и сульфат калия, присутствующих с ионной силой, которая физиологически приемлема для субъекта при парентеральном введении, и включенных в конечной концентрации для обеспечения выбранной ионной силы или осмолярности в готовой композиции. Конечная ионная сила или осмоляльность композиции определяется несколькими компонентами (например, ионами буферного(ых) соединения(й) и других небуферных солей. Предпочтительная соль, NaCl, присутствует в количестве до приблизительно 250 мМ, причем концентрацию солей выбирают таким образом, чтобы дополнять другие компоненты (например, сахара), чтобы конечная общая осмолярность композиции была совместима с парентеральным введением (например, внутримышечной или подкожной инъекцией) и способствовала долгосрочной устойчивости иммуногенных компонентов иммуногенной композиции в разных диапазонах температур. Бессолевые композиции выдерживают расширенные диапазоны одного или нескольких выбранных криопротекторов для поддержания нужного конечного уровня осмолярности.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько криопротекторов, выбранных, помимо прочих, из дисахаридов (например, лактозы, мальтозы, сахарозы или трегалозы) и полигидрокси-углеводородов (например, дульцита, глицерина, маннита и сорбита).
В некоторых вариантах осуществления осмолярность композиции составляет от приблизительно 200 мОсм/л до приблизительно 800 мОсм/л, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 250 мОсм/л до приблизительно 500 мОсм/л или от приблизительно 300 мОсм/л до приблизительно 400 мОсм/л. Бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 5% до приблизительно 25% сахарозы, предпочтительно - от приблизительно 7% до приблизительно 15% или от приблизительно 10% до приблизительно 12% сахарозы. В альтернативном варианте бессолевая композиция может содержать, например, от приблизительно 3% до приблизительно 12% сорбита, предпочтительно - приблизительно от 4% до 7% или от приблизительно 5% до приблизительно 6% сорбита. Если добавляют соль, такую, как хлорид натрия, эффективный диапазон сахарозы или сорбита соответственно снижается. Эти и другие подобные показатели осмоляльности и осмолярности легко определяются специалистами в данной области.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов и/или комплексообразующих агентов. Разные акцепторы свободных радикалов и комплексоны известны специалистам в данной области и могут применяться для описываемых авторами композиций и способов применения. Примеры включают, помимо прочих, этанол, EDTA, комбинацию EDTA / этанола, триэтаноламин, маннит, гистидин, глицерин, цитрат натрия, инозит-гексафосфат, триполифосфат, аскорбиновую кислоту / аскорбат, янтарную кислоту / сукцинат, яблочную кислоту / малеат, десферал, EDDHA и DTPA и различные комбинации двух или более из вышеупомянутых соединений. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере может добавляться невосстанавливающий акцептор свободных радикалов в концентрации, которая эффективно повышает долгосрочную устойчивость композиции. Также в разных комбинациях могут добавляться один или несколько ингибиторов окисления свободных радикалов / комплексонов, такие, как акцептор и двухвалентный катион. Выбор комплексона определяет, требуется ли добавление акцептора.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению, совместимая с парентеральным введением, включает одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, включая, помимо прочих, сложные эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбита, Polysorbate-80 (TWEEN 80), Polysorbate-60 (TWEEN 60), Polysorbate-40 (TWEEN 40) и Polysorbate-20 (TWEEN 20), алкиловые эфиры полиоксиэтилена, включая, помимо прочих, BRIJ 58, BRIJ 35, а также другие, такие, как TRITON Х-100; TRITON Х-114, NP40, SPAN 85 и серии PLURONIC неионных поверхностно-активных веществ (например, PLURONIC 121), причем предпочтительными компонентами являются Polysorbate-80 в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 2% (более предпочтительно - до приблизительно 0,25%) или Polysorbate-40 в концентрации от приблизительно 0,001% до 1% (более предпочтительно - до приблизительно 0,5%).
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно изобретению включает один или несколько дополнительных стабилизирующих агентов, подходящих для парентерального введения, например, восстановитель, включающий по меньшей мере одну тиольную (-SH) группу (например, цистеин, N-ацетилцистеин, восстановленный глутатион, тиогликолят натрия, тиосульфат, монотиоглицерин или их смеси). В альтернативном или необязательном варианте содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть дополнительно стабилизированы путем удаления кислорода из тары для хранения, защиты композиции от света (например, путем использования посуды из янтарного стекла).
Содержащие консервант иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей или наполнителей, включая любой наполнитель, который сам по себе не вызывает иммунную реакцию. Подходящими наполнителями, помимо прочих, могут быть макромолекулы, такие, как белки, сахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза (Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19: 2118), трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие, как капли масла или липосомы). Такие разбавители, наполнители и/или носители хорошо известны специалистам в данной области. Фармацевтически приемлемые наполнители обсуждаются, например, в публикации Gennaro, 2000, Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472.
Композиции согласно изобретению могут быть лиофилизированными или рецептированными в водной форме, т.е., в форме растворов или суспензий. Жидкие композиции в предпочтительном варианте могут вводиться непосредственно из фасованной формы и, таким образом, являются идеальными для инъекций без необходимости в восстановлении влагосодержания в водной среде, которое иначе требовалось бы для лиофилизированной композиции согласно изобретению.
Прямая доставка иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению в организм субъекта может выполняться путем парентерального введения (внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутривенно или в межклеточное пространство ткани); или путем ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, пульмонального или другого мукозального введения. В предпочтительном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют путем внутримышечной инъекции, например, в бедро или плечо субъекта. Инъекцию выполняют через иглу (например, иглу для подкожных инъекций), однако в альтернативном варианте может применяться безыгольная инъекция. Типичная внутримышечная доза составляет 0,5 мл. Композиции согласно изобретению могут быть рецептированы в разных формах, например, для инъекций в форме жидких растворов или суспензий. В некоторых вариантах осуществления композицию рецептируют в форме порошка или аэрозоля для пульмонального введения, например, при помощи ингалятора. В других вариантах осуществления композиция может быть рецептирована в форме суппозитория или пессария, или для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка.
Оптимальное количество компонентов для конкретной иммуногенной композиции может определяться путем стандартных исследований, включающих наблюдение за соответствующими иммунными реакциями у субъектов. После первоначальной вакцинации субъекты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций с надлежащими интервалами.
Упаковка и лекарственные формы
Иммуногенные композиции согласно изобретению могут быть расфасованы в форме единичной дозы или в многодозовой форме (например, 2 дозы, 4 дозы или более). Для многодозовых форм обычно, хотя и не обязательно, предпочтение отдается флаконам перед предварительно заполненными шприцами. К подходящим многодозовым форматам помимо прочих, относятся: от 2 до 10 доз на вместилище при 0,1-2 мл на дозу. В некоторых вариантах осуществления доза составляет 0,5 мл. См., например, Международную патентную заявку WO 2007/127668, включенную в данное описание путем ссылки.
Композиции могут быть расфасованы в флаконы или другую подходящую тару для хранения или могут находиться в предварительно заполненных устройствах для доставки, например, одно- или многокомпонентных шприцах, которые могут поставляться с иглами или без них. Шприц обычно, но не обязательно, содержит единичную дозу содержащей консервант иммуногенной композиции согласно изобретению, хотя также предусматриваются многодозовые предварительно заполненные шприцы. Подобным образом флакон может включать единичную дозу, хотя в альтернативном варианте может включать несколько доз.
Объемы эффективных доз могут определяться традиционными способами, хотя типичная доза композиция для инъекций имеет объем 0,5 мл. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения человеку. В некоторых вариантах осуществления дозу рецептируют для введения взрослому человеку, подростку, ребенку преддошкольного или грудного возраста (т.е. не старше одного года) и в предпочтительных вариантах осуществления вводят путем инъекции.
Жидкие иммуногенные композиции согласно изобретению также являются подходящими для восстановления влагосодержания других иммуногенных композиций, присутствующих в лиофилизированной форме. Если иммуногенная композиция предназначена для такого немедленного восстановления влагосодержания, изобретение предусматривает комплект с двумя флаконами, двумя или более предварительно наполненными шприцами или одним или несколькими из тех и других, причем содержимое шприца используют для восстановления влагосодержания содержимого флакона перед инъекцией, или наоборот.
В альтернативном варианте иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению подвергают лиофилизации и восстановлению влагосодержания, например, с применением множества способов высушивания замораживанием, хорошо известных среди специалистов в данной области, для образования сухих частиц правильной (например, сферической) формы, таких, как микропеллеты или микросферы, обладающие характеристиками частиц, такими, как средний диаметр, которые могут выбираться и регулироваться путем изменения конкретных способов, применяемых для их изготовления. Иммуногенные композиции также могут включать адъювант, который необязательно может быть приготавливаться в форме отдельных сухих, правильной (например, сферической) формы частиц, таких, как микропеллеты или микросферы, или содержаться в них. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение также обеспечивает комплект иммуногенной композиции, включающий первый компонент, включающий стабилизированную, сухую иммуногенную композицию, которая необязательно также включает один или несколько консервантов согласно изобретению и второй компонент, включающий стерильный, водный раствор для восстановления влагосодержания первого компонента. В некоторых вариантах осуществления водный раствор включает один или несколько консервантов и необязательно может включать по меньшей мере один адъювант (см., например, заявку WO 2009/109550 (включенную в данное описание путем ссылки).
В еще одном варианте осуществления тару для многодозового формата выбирают из одной или нескольких групп, к которым, помимо прочих, относятся общая лабораторная стеклянная посуда, колбы, мензурки, мерные цилиндры, ферментаторы, биореакторы, системы для инфузий, трубки, пакеты, банки, флаконы, крышки для флаконов (например, резиновые пробки, навинчивающиеся крышки), ампулы, шприцы, двух- или многокамерные шприцы, пробки шприцев, поршни шприцев, резиновые крышки, пластиковые крышки, стеклянные крышки, картриджи и одноразовые шприц-ручки и т.п. Вместилище согласно настоящему изобретению не ограничивается конкретным материалом и включает такие материалы, как стекло, металлы (например, сталь, нержавеющая сталь, алюминий и т.п.) и полимеры (например, термопласты, эластомеры, термопласты-эластомеры). В конкретном варианте осуществления вместилище подходящего формата представляет собой 5 мл стеклянный флакон Schott Туре 1 с бутиловой пробкой. Специалисту в данной области станет понятно, что список вышеизложенных форматов ни в коей мере не является исчерпывающим, а лишь служит в качестве рекомендации для специалиста в отношении различных форматов, доступных с точки зрения настоящего изобретения. Дополнительные форматы, предусмотренные для использования согласно настоящему изобретению, можно найти в опубликованных каталогах от поставщиков и производителей лабораторного оборудования, таких, как United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Экспериментальные процедуры
Сывороточный бактерицидный анализ
Яванских макаков (n = 5/группу) внутримышечно иммунизировали белками rLP2086 или гР2086 (А+В), адсорбированными в AlPO4. Яванские макаки представляют собой пример нечеловекообразных приматов. Животных вакцинировали на 0, 4 и 24 недели и титры ОRF2086-специфического IgG и функционального антитела определяли на 0, 4, 6 и 26 недели. Титры ОRF2086-специфического IgG в сыворотке определяли против rLP2086A и В.
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis, экспрессирующих LP2086, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине.
Бактерицидные антитела сыворотки у макаков или кроликов, иммунизированных вакциной ORF2086, определяли с применением SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов или иммунные сыворотки макаков подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведений 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD650 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ с 20% комплементом человека.
Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. Требовалось десять уникальных источников комплементов для выполнения SBA, описываемых в данном исследовании.
После 30 мин инкубации при 37°С с 5% СО2 к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, заполненные 50% среды GCK. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°С с 5% СО2 и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Титр SBA определяют как обратное значение интерполированного разбавления испытываемой сыворотки, которое вызывает 50% снижение численности бактерий после 30 мин инкубации при 37°С. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток ORF2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток ORF2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы (т.е. 4).
Пример 2: Клонирование и экспрессия нелипидированных вариантов ORF2086
Зрелую аминокислотную последовательность Р2086, соответствующую остаткам 27-286 из N. meningitidis штамма М98250771 (А05), первоначально получали путем ПЦР-амплификации из геномной ДНК. Прямой праймер, имеющий последовательность TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG (SEQ ID NO: 22), был соединен с 5' концом и содержал сайт NdeI для клонирования. Обратный праймер, имеющий последовательность CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC (SEQ ID NO: 23), был соединен с 3' концом гена и содержал терминирующий кодон TAG, за которым следовал сайт рестрикции BamHI. Амплифицированный фрагмент из 799 п.о. сначала клонировали в промежуточный вектор PCR2.1 (Invitrogen, Carlesbac, СА) Эту плазмиду расщепляли при помощи NdeI и BamHI и лигировали в вектор экспрессии рЕТ9а (Novagen, Madison, WI), который был расщеплен при помощи NdeI и BamHI. Образованный в результате вектор pLA100 (который включает SEQ ID NO: 54) экспрессировал зрелый Р2086 подсемейства А05 из штамма М98250771 без N-концевого цистеина (см. SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55), который присутствовал бы в липидированном белке. Штамм-хозяин BLR(DE3) Е. coli [F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm Δ(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3)] (Novagen) использовали для обеспечения экспрессии fHBP.
Такие же этапы клонирования применяли для получения N-концевых Cys-делетированных вариантов В02, В03, В09, В22, В24, В44, А04, А12 и А22. N-концевые Cys-содержащие варианты также получали тем де способом с применением прямых праймеров, которые также включали Cys кодон (например, первый кодон SEQ ID NO: 1-11). На основе представленных авторами последовательностей специалист в данной области сможет построить прямой и обратный праймеры для каждого из этих вариантов. Например, указанные ниже праймеры использовали для амплификации нелипидированного варианта В44 с последующим клонированием в рЕТ9а с применением Ndel и Blpl.
Результаты
Нелипидированные плазмидные последовательности были сильно экспрессированы, однако нелипидированные варианты белка были пирувилированы в N-концевом цистеиновом остатке. См. Примеры 8 и 9, в которых описывается, например, способ экспрессии последовательностей. Для преодоления этого пирувилирования N-концевой Cys кодон был делетирован. См., например, Пример 10. Однако делеция N-концевого Cys исключает экспрессию вариантов А22 и В22. См., например, Фигуру 4. Однако варианты А05, В01 и В44 все же были экспрессированы, несмотря на делецию N-концевого цистеинового остатка. См., например, SEQ ID NO: 13 (А05), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, SEQ ID NO: 35 (В01 N-конец) и SEQ ID NO: 21 (B44), в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован. См., например, Фигуру 5. Кроме того, на экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка. См., например, Пример 4.
Пример 3: Влияние ствола Gly/Ser на экспрессию нелипидированного варианта
Чтобы определить, почему варианты В44 А05, В01 и В44 экспресировались при отсутствии N-концевого Cys, а варианты А22 и В22 не экспрессировались, последовательности этих вариантов выравнивали. Варианты В44 А05, В01 и В44 имеют продленный ряд из 10 или 11 остатков Gly и Ser непосредственно после N-концевого Cys (т.е. ствол Gly/Ser). Однако варианты А22 и В22 имели только ствол Gly/Ser, состоявший из 6 остатков Gly и Ser. Соответственно, ствол Gly/Ser вариантов А22 и В22 был продлен вставкой дополнительных остатков Gly и Ser.
Длинные варианты ствола Gly/Ser получали с применением способов, описанных в Примере 2, используя прямые праймеры, кодирующие ствол Gly/Ser с 10 или 11 остатками Gly и Ser.
Варианты А22 и В22 N-концевого Cys-делетированного длинного ствола Gly/Ser (10-11 остатков Gly/Ser) демонстрировали повышенную экспрессию относительно вариантов А22 и В22 N-концевой Cys-делетированного короткого ствола Gly/Ser (6 остатков Gly/Ser). Однако эти уровни экспрессии все же были сниженными по сравнению с уровнями экспрессии вариантов А05, В01 и В44.
Пример 4: Оптимизация кодонов
На экспрессию нелипидированного варианта В09 не влияла делеция N-концевого цистеинового остатка (см. SEQ ID NO: 18, в которой цистеин в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 49). См., например, Фигуру 6. Оценка последовательности варианта В09 продемонстрировала, что вариант В09 имеет ствол Gly/Ser, состоящий из 6 остатков Gly и Ser, подобный стволу Gly/Ser вариантов А22 и В22. Действительно, N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 идентичны на уровне аминокислот. Однако N-концевые хвосты вариантов В09 и А22 (SEQ ID NO: 53 и 42, соответственно) отличаются на уровне нуклеиновых кислот двумя нуклеиновыми кислотами: нуклеиновыми кислотами 15 и 39 SEQ ID NO: 8. См., например, Фигуру 6. Первые 14 аминокислот N-концевого хвоста варианта В22 идентичны вариантам В09 и А22, и N-концевой хвост варианта В22 отличается только в 15-й аминокислоте. Нуклеиновые кислоты 1-42 варианта В22 идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта А22. Нуклеиновые кислоты 1-42 варианта В22 (см. SEQ ID NO: 52) идентичны нуклеиновым кислотам 1-42 варианта В09 (см. SEQ ID NO: 53), за исключением различий в нуклеиновых кислотах 15 и 39 при оптимальном выравнивании. Соответственно, вариант В22 отличается от варианта В09 в аминокислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8. В последнем предложении содержится опечатка, и правильно было бы указать, что вариант В22 отличается от варианта В09 в нуклеиновых кислотах 15 и 39 SEQ ID NO: 8.
Чтобы определить, влияют ли различия в нуклеиновых кислотах на уровень экспрессии варианта В09 по сравнению с вариантами А22 и В22, варианты А22 и В22 подвергали точечной мутации для включения нуклеиновых кислот 15 и 39 в соответствующие кодоны для Gly5 и Gly 13. Включение этих молчащих мутаций нуклеиновых кислот значительно повышало экспрессию N-концевых Cys-делетированных вариантов А22 и В22 до уровня, подобного показателю N-концевого Cys-делетированного варианта В09. См., например, Фигуру 7. Соответственно, оптимизация кодонов для соответствия варианта В09 может повышать экспрессию N-концевых Cys-делетированных нелипидированных вариантов Р2086.
Дальнейший анализ нелипидированных вариантных последовательностей указывает на дополнительную оптимизацию кодонов в стволе Gly/Ser для улучшения экспрессии. Соответственно, дополнительные нелипидированные варианты строили с применением способа согласно Примеру 2 с использованием прямых праймеров, включающих такие кодон-оптимизированные последовательности. Прямые праймеры, используемые для получения оптимизированного ствол Gly/Sers включают любые из следующих последовательностей:
Пример 5: Оптимизация иммуногенной композиции
Рецептированные вакцины от ISCOMATRIX вызывали быструю иммунную реакцию, которая в результате приводила к снижению количества доз, необходимых для достижения более чем 4-кратного повышения скорости реакции, измеряемой с применением сывороточного бактерицидного анализа. Группы из пяти макаков-резусов подвергали иммунизации различными композициями двухвалентной нелипидированной вакцины rP2086. Вакцина включала непирувилированный нелипидированный вариант А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55, кодируемая SEQ ID NO: 54) и непирувилированный нелипидированный вариант В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 51). Единицы количества адъюванта следующие: AlPO4 составляет 250 мкг, ISCOMATRIX составляет от 10 до 100 мкг. Единицы количества адъюванта для AlPO4, показанные в Таблицах 2-5, представлены в миллиграммах и, таким образом, указываются как 0,25 (мг) в отличие от 250 мкг.
Протокол иммунизации предусматривал 0, 4 и 24 недели с кровопусканием на 0, 4, 6 и 26 неделях. Не наблюдалось повышения титров SBA после введения первой дозы ни в одной из групп. После введения второй дозы повышение титров SBA и количество респондеров, определяемое по 4-кратному повышению титра SBA относительно исходного показателя, наблюдалось для композиций, содержащих адъювант ISCOMATRIX. В Таблицах 2 и 3 представлены GMT SBA, наблюдаемые для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно. GMT SBA для композиций ISCOMATRIX были в 3-19 и 4-24 раза выше, чем наблюдаемые для композиции AlPO4 для штаммов подсемейств А и В, соответственно. Повышенные титры также наблюдались после введения третьей дозы для композиций ISCOMATRIX с повышением в 13-95 и 2-10 раз для штамма fHBP подсемейств А и В, соответственно, по сравнению с композицией AlPO4. Анализ показателей ответа, определяемых по четырехкратному или большему повышению титра SBA относительно исходного показателя обнаружил подобную тенденцию (Таблицы 4 и 5).
Пример 6: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированными и нелипидированными вариантами
Рекомбинантно экспрессированный нелипидированный вариант Р2086 (В44) обеспечивает широкую защиту, измеряемую по SBA против штаммов, представляющих различные варианты fHBP (от приблизительно 85% до приблизительно <92% ID) последовательностей LP2086. Эти показатели реакции получали для нелипидированной вакцины, рецептированной с AlPO4. См. Таблицу 6, в которой представлены показатели реакции SBА на штамм MnB fHBP подсемейства В, вызванной двухвалентной вакциной fHBP. Нелипидированная вакцина (представленная знаком "-" под колонкой "липидирование") включала 1 мкг на белок непирувилированного нелипидированного варианта А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован) и непирувилированного нелипидированного варианта В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован).
В альтернативном варианте рекомбинантно экспрессированный нелипидированный вариант Р2086 (В44) вызывает большую иммунную реакцию, измеряемую по титру SBA, по сравнению с липидированным вариантом (В01) против штаммов, включающих подобные (>92% ID) и различные (<92% ID) последовательности LP2086. Более высокие показатели реакции (определяемые четырехкратным или большим повышением в титрах SBA относительно исходного показателя) наблюдали для вакцины, содержащей нелипидированный rP2086 В44 по сравнению с вакциной, содержащей липидированный rLP2086 В01 (Таблица 6).
Согласно Таблице 6, нелипидированный В44 является предпочтительным компонентом fHBP подсемейства В в композиции для обеспечения широкой защиты (например, через выработку бактерицидных антител) против многих вариантных штаммов LP2086.
Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что штаммы LP2086 варианта В09 имеют наименьшую вероятность положительных показателей реакции SBA в отношении гетерологичных (отличных от В09) полипептидов ORF2086. В частности, авторами изобретения было обнаружено, что LP2086 В09 является исключением с точки зрения аналитического штамма, против которого иммуногенная композиция А05/В44, описанная в Таблице 6 вызывала выработку бактерицидных антител. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно изобретению включает полипептид В09, в частности, в контексте композиции, включающей более одного полипептида ORF2086 подсемейства В. В предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция, которая включает нелипидированный В44, также может включать нелипидированный полипептид В09.
Пример 7: Оптимизация кодонов вариантов В44 и В09
Хотя показатели уровня экспрессии, достигаемые согласно представленным выше примерам, были во многих случаях достаточными, требовалась дальнейшая оптимизация, и приготавливали и испытывали экспрессионные последовательности Е. coli, включающие дополнительную оптимизацию кодонов по всей длине белка. Было обнаружено, что одна такая улучшенная последовательность для экспрессии отличного от цистеина белка В44 является нуклеиновокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43. Как показано в Примере 9, экспрессионная последовательность, содержащая SEQ ID NO: 43, продемонстрировала усиленную экспрессию по сравнению с показателем неоптимизированной последовательности дикого типа.
Экспрессия N-концевого Cys-делетированного белка В09 была улучшена путем применения смены кодона с вышеупомянутой оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43) на В09 (SEQ ID NO: 48). Для создания оптимизированных последовательностей В09 оптимизированную последовательность ДНК В44 (SEQ ID NO: 43) сначала сопоставляли с последовательностью ДНК аллеля В09 (SEQ ID NO: 48). Полная нелипидированная кодирующая последовательность аллеля В09 (SEQ ID NO: 48) была оптимизирована таким образом, чтобы отражать изменения кодона, наблюдаемые в оптимизированном аллеле В44 (SEQ ID NO: 43), всюду, где аминокислоты между В44 (SEQ ID NO: 44) и В09 (SEQ ID NO: 49) были идентичными. Последовательности кодонов в аллеле В09, соответствующие идентичным аминокислотам между аллелем В09 и аллелем В44, были изменены таким образом, чтобы отражать кодон, используемый в оптимизированной последовательности В44 (SEQ ID NO: 43). Последовательности кодонов для аминокислот, которые являются различными между В09 (SEQ ID NO: 49) и В44 (SEQ ID NO: 44), были неизменными в последовательности ДНК В09.
Кроме того, аминокислотная последовательность нелипидированного В44 (SEQ ID NO: 44) содержит два последовательных серино-глициновых повтора (S-G-G-G-G) (SEQ ID NO: 56) (см. также аминокислоты с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) на ее N-конце, в то время как аллель В09 содержит только один серино-глициновый повтор на N-конце (см. аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 49). Два серино-глициновых повтора на N-конце В44 (аминокислоты с 2 по 6 и аминокислоты с 7 по 11 SEQ ID NO: 44) также имеют разную частоту использования кодона (см. нуклеотиды с 4 по 18 и нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43), и различные комбинации оптимизированного серино-глицинового повтора В44 (например, либо нуклеотиды с 4 по 18 SEQ ID NO: 43, либо нуклеотиды с 19 по 33 SEQ ID NO: 43, или их комбинация) применяли к последовательности ДНК В09 (SEQ ID NO: 48, например, к нуклеотидами с 4 по 18 SEQ ID NO: 48) с целью исследования влияния на экспрессию рекомбинантного белка.
Строили три разных варианта оптимизированного В09: SEQ ID NO: 45 содержит оба серино-глициновых повтора (GS1 и GS2) (нуклеиновые кислоты с 4 по 33 SEQ ID NO: 43) из оптимизированного В44, SEQ ID NO: 46 содержит GS1 (нуклеиновые кислоты с 4 по 18 SEQ ID NO: 43) и SEQ ID NO: 47 содержит GS2 (нуклеиновые кислоты с 19 по 33 SEQ ID NO: 43). ДНК для всех из вышеупомянутых кодон-оптимизированных последовательностей химически синтезировали с применением стандартных для данной области химических способов. Полученную в результате ДНК клонировали в соответствующие плазмидные векторы экспрессии и испытывали на экспрессию в клетках-хозяевах Е. Coli, как описывается в Примерах 8 и 9.
Пример 8: Способ экспрессии ORF2086, вариант В09
Клетки Е. coli штамма K-12 (производные W3110 дикого типа (CGSC4474) с делециями в recA, fhuA и аrаА) преобразовывали плазмидой рЕВ063, которая включает SEQ ID NO: 45, рЕВ064, которая включает SEQ ID NO: 46, плазмидой рЕВ065, которая включает SEQ ID NO: 47, или плазмидой pLA134, которая включает SEQ ID NO: 48. Предпочтительные модификации штамма K-12 могут применяться для ферментации, но не требуются для экспрессии белков.
Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°С применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°С. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 xg в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Осветленные лизаты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 7:
Пример 9: Способ экспрессии ORF2086 варианта В44
Клетки Е. coli штамма В (BLR(DE3), Novagen) преобразовывали плазмидой pLN056, которая включает SEQ ID NO: 51. Клетки Е. coli штамма K-12 (производная W3110 дикого типа) преобразовывали плазмидой pDK087, которая включает SEQ ID NO: 43. Клетки инокулировали в определенную среду с солями глюкозы. После 8 часов инкубации при 37°С применяли линейную подачу глюкозы и инкубацию продолжали в течение дополнительных 3 часов. К культуре добавляли изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ с последующей 12-часовой инкубацией при 37°С. Клетки собирали путем центрифугирования при 16000 xg в течение 10 минут и подвергали лизису путем добавления комплекта для лизиса клеток Easy-Lyse™ от Lienco Technologies (St. Louis, МО) и загрузочный буфер. Супернатанты подвергали анализу на экспрессию В09 путем окрашивания Кумасси гелей SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга, с количественным определением при помощи сканирующего денситометра. Результаты сканирующей денситометрии представлены ниже в Таблице 8:
Пример 10: Пирувилирование
Представленный пример демонстрирует, что N-концевой цистеиновый остаток нелипидированных белков ORF2086 может стать пирувилированным при экспрессии, например, в Е. coli.
Накопление гетерологичного белка во время образования вариантов А05 (SEQ ID NO: 13) и В44 (SEQ ID NO: 21) наблюдали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращением фаз (RP-HPLC). Это разделение осуществляли во взаимодействии с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром (QTOF-MS) для обеспечения средства наблюдения за образованием связанных с продуктом вариантов.
После экспрессии в Е. coli В и/или клетках-хозяевах K-12 продукты, полученные в результате этих ферментаций, подвергали процедуре очистки, во время которой наблюдали модификацию продукта. Деконволюция масс-спектров характеризовала варианты как демонстрирующие сдвиги масс +70 Да по сравнению с природными продуктами 27640 и 27572 Да для А05 и В44, соответственно.
В опубликованной литературе указывается, что сдвиг массы +70 Да ранее наблюдался в белках и объяснялся пирувилированием амино-концевого остатка.
Присутствие и расположение пируватной группы подтверждали с использованием данных масс-спектральной фрагментации (MS/MS). Данные показывали, что модификация происходила на амино-концевом цистеиновом остатке, т.е. аминокислоте в позиции 1 согласно А05 и В44. Для А05 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 30% по сравнению с общим количеством полипептидов А05 (SEQ ID NO: 13). Для В44 процент пирувилированных полипептидов составлял приблизительно 25% по сравнению с общим количеством полипептидов В44 (SEQ ID NO: 21).
Когда А05 (SEQ ID NO: 13, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 55) и варианты В44 (SEQ ID NO: 21, в которой N-концевой Cys в позиции 1 делетирован, или SEQ ID NO: 44), которые не содержат амино-концевого цистеина, очищали, обнаружимого пирувилирования (+70 Да) не наблюдалось.
Пример 11: Иммуногенность В09 и В44, отдельно и в комбинации
5-10 групп макаков-резусов подвергали иммунизации вариантом В09 (SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48) или вариантом В44 (SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43), или A05, B09 и B44 (SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 49, кодируемая SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 44, кодируемая SEQ ID NO: 43, соответственно), рецептированным с 250 мкг AlPO4 на дозу. Обезьян вакцинировали внутримышечным путем на 0, 4 и 8 неделях с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как представлено в Таблице 9 и 10. Образцы сыворотки 0 и 12 недель анализировали в SBА против штаммов МnВ с вариантами fHBP подсемейства А или подсемейства В. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра. Испытанный вариант В44 был оптимизированной последовательностью (SEQ ID NO: 43), и широкие показатели реакции, которые наблюдались в предыдущих исследованиях (см. таблицу выше), поддерживались для оптимизированной последовательности (Таблица 9) вакцины В44 отдельно или в комбинации с В09. Вакцина В09 отдельно (Таблица 10) также может вызывать широкие перекрестные иммунные реакции (Таблица 10).
Макаков-резусов (п=10) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации, как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO4. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBА относительно штаммов МnВ, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.
Таблица 9 показывает, например, что композиция, включающая комбинацию непирувилированного нелипидированного В44, В09 и А05 демонстрирует большую перекрестную защиту против испытываемых вариантов по сравнению с перекрестной защитой от композиции, включающей только В44. С учетом результатов, показанных в данной заявке, включая, в частности, Таблицу 6 и Таблицу 9 вместе, композиции, включающие В44, В09 и А05, отдельно или в комбинации, представляют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, описываются композиции, включающие В44 и В09. Такая композиция предпочтительно также включает полипептид подсемейства А, в частности, А05.
Макаков-резусов (n=5) подвергали иммунизации внутримышечно на 0, 4 и 8 недели с использованием 10 мкг каждого из нелипидированных fHBP отдельно или в комбинации как показано в колонке «Вакцина» в композиции с 250 мкг AlPO4. Образцы сыворотки 0 и 10 недель анализировали в SBА относительно штаммов МnВ, перечисленных в таблице. К респондерам относили животных с 4-кратным повышением титра.
Пример 12: Иммунологическая защита, обеспечиваемая липидированными и нелипидированными вариантами последовательности
Двадцать самок новозеландских кроликов-альбиносов, 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River Canada, предварительно отбирали с применением цельноклеточного анализа ELISA и 10 животных прошли отбор для этого исследования на основе их низких фоновых титров против испытываемых штаммов, представляющих варианты fHBP В02 (SEQ ID NO: 16) и B44 (SEQ ID NO: 21) (Таблица 11). Группы из трех животных внутримышечно иммунизировали 100 мкг каждого белка, рецептированного с 50 мкг ISCOMATRIX на 0,5 мл дозу на 0, 4 и 9 недели (Таблица 12). Группу 1 вакцинировали нелипидированным В44 (SEQ ID NO: 44). Включали контрольную группу, которую вакцинировали липидированным В01, рецептированным с АlР04 (250 мкг). Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 9 и 10 неделях. Отдельные образцы сыворотки 10-й недели подготавливали и анализировали с применением сывороточного бактерицидного анализа против многих штаммов менингококков серогруппы В из fHBP подсемейства В.
Протокол иммунизации: недели 0, 4, 9; протокол кровопускания: недели 0, 4, 9, 10
Сывороточный бактерицидный анализ (SBА): Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против многих штаммов менингококков серогруппы В (Таблица 13) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBА 4. Титр SBА <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBAA≥4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.
Активность бактериального антитела в сыворотке, измеряемая в SBA представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Способность иммунизации нелипидированным rfHBP к вызыванию выработки бактерицидных антител у кроликов определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 10-й неделе, анализировали с использованием SBА против штаммов с В44 fHBP или В02 fHBP. Как показано в Таблице 13, через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против обоих испытываемых штаммов. (Таблица 13). У новозеландских кроликов нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44) был более иммуногенным, чем нелипидированный В01 против этих штаммов. Нелипидированный В44 (SEQ ID NO: 44), рецептированный с адъювантом iscomatrix, против этих штаммов давал титры, сравнимые с показателями липидированного В01, рецептированного с фосфатом алюминия. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.
Пример 13: Иммуногенность шести нелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносов.
Группы из 5 кроликов подвергали иммунизации нелипидированными вариантами fHBP, как описано в Таблице 14. Вакцины вводили на 0, 4 и 9 неделях. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу с использованием SBA против штаммов с гомологичными и гетерологичными последовательностями fHBP. Таблица 14 показывает процент респондеров после третьей иммунизации. Через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) все образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP. Образцы сыворотки кроликов до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов.
Пример 14:
>нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55)
>pEB042 (SEQ ID NO: 65)
>нелипидированный A12 (SEQ ID NO: 66)
>pEB043 (SEQ ID NO: 67)
>нелипидированный А22 (SEQ ID NO: 68)
>pEB058 (SEQ ID NO: 69)
>A62 (SEQ ID NO: 70). GenBank: ACI46789.1
>нелипидированный A62 (SEQ ID NO: 71)
>pLA164 (SEQ ID NO: 72)
>pDK086 (SEQ ID NO: 73)
>A29 (SEQ ID NO: 74)
>нелипидированный В22 (SEQ ID NO: 75)
>нелипидированный A05 (SEQ ID NO: 76) (pPW102)
>нелипидированный A05 (SEQ ID NO: 77)
-Консенсус (SEQ ID NO: 78)
-Консенсус (SEQ ID NO: 79)
Пример 15: Образование нелипидированных вариантов подсемейства А rP2086
Клонирование нелипидированных генов fHBP
Кодирующую последовательность нелипидированного белка А05 fHBP (SEQ ID NO: 55) сопоставляли с последовательностью В44 с оптимизированной экспрессией (SEQ ID NO: 43). В местах, где их аминокислоты были идентичными, кодон из В44 (SEQ ID NO: 43) использовали для замещения в гене А05. Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 65) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Рекомбинантный нелипидированный A12 fHBP (SEQ ID NO: 66) экспрессировали из pEB043 (SEQ ID NO: 67). Экспрессию аллеля A12 оптимизировали с применением технологий Blue Heron. Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для А05 (рЕВ042). Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые ко доны В44 SGGGGSGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 11 SEQ ID NO: 44) заменяли природные кодоны А12 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 66). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и ВаmHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 67) субклонировали в рЕТ30a в этих сайтах.
Рекомбинантный нелипидированный А22 ffHBP (SEQ ID NO: 68) экспрессировали из рЕВ058 (SEQ ID NO: 69). Этот ген был оптимизирован с применением такого же процесса, как для рЕВ042. Кроме того, оптимизированные с применением Blue Heron амино-концевые кодоны В44 SGGGG (аминокислотные остатки с 2 по 6 SEQ ID NO: 44) заменяли природные кодоны А22 SSGGGG (аминокислотные остатки с 1 по 6 SEQ ID NO: 68). Оптимизированную последовательность синтезировали заново в Celtek Genes, добавляя сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 69) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Рекомбинантный А62 fHBP (SEQ ID NO: 71) экспрессировали из pLA164 (SEQ ID NO: 72). Аллель A62_002 из штамма 0167/03 подвергали ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими сайты рестрикционной эндонуклеазы NdeI и BamHI на N- и С-концах, соответственно. Полученный в результате ген (SEQ ID NO: 72) субклонировали в рЕТ30а в этих сайтах.
Пример 16: Экспрессия, ферментация и очистка белков rP2086 подсемейства А экспрессионных штаммов Е. coli
BLR(DE3) Ε. coli В recA-, трансформированный с использованием pLA164 (SEQ ID NO: 72), использовали для экспрессии А62 (SEQ ID NO: 71). Плазмиду pEB042 (SEQ ID NO: 65) преобразовывали в BD643 хозяина Ε. coli (W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA) для получения штамма BD660 для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55). Экспрессию A22 (SEQ ID NO: 68) осуществляли из штамма BD592, который состоит из плазмиды рЕВ058 (SEQ ID NO: 69), находящейся в BD559 хозяина (который также представляет W3110:DE3 ΔrеcА ΔfhuA ΔaraA). И наконец, плазмиду рЕВ043 (SEQ ID NO: 67) преобразовывали в BD483 хозяина (W3110:DE3 ΔrесА) для получения штамма BD540 для экспрессии А12 (SEQ ID NO: 66).
Ферментация
Экспрессионные штаммы ферментировали в минимальной среде на основе глюкозы. Суточную заквасочную культуру инокулировали в десятилитровые ферментаторы, работающие при 37°С, аэрация 1 vvm с контролем каскада dO при 20%. Когда порция глюкозы исчерпывалась из среды (при ~OD600=15), начинали ограничивающую линейную подачу глюкозы при 3,8 г/л/ч. Подачу продолжали до индукции 0,1 мМ IPTG и в течение последующего периода экспрессии белка. Для экспрессии А05 (SEQ ID NO: 55), штамм BD660 индуцировали при OD600=25 и ферментацию продолжали в течение 7 часов после индукции (HPI). Экспрессии А22 (SEQ ID NO: 68) и А12 (SEQ ID NO: 66) из штаммов BD592 и BD540, соответственно, достигали путем индукции при OD600=40 и ферментации в течение 24 HPI. В конце ферментации суспензию клеток собирали путем центрифугирования.
А62 (SEQ ID NO: 71)
Белки rP2086 получают как растворимые белки в цитоплазме штаммов Е. coli. Растворимый цитоплазматический экстракт обычно получают путем размораживания замороженных клеток, экспрессирующих конкретный вариант подсемейства А rP2086 в гипотоническом буфере (10 мМ Hepes-NaOH рН 7,4 с содержанием ингибиторов протеазы) и разрушения клеток в микрофлюидизаторе при ~20000 psi. РНКазу и ДНКазу добавляют для разложения нуклеиновых кислот и цитоплазматический экстракт собирают в виде супернатанта после центрифугирования с низкой скоростью для удаления любых неразрушенных клеток, а затем з высокой скоростью (≥100000 xg) для удаления мембран, стенок клеток и других крупных субклеточных компонентов. Цитоплазматический экстракт подвергают дальнейшему осветлению путем последовательного регулирования до 25%, а затем 50% насыщенного сульфата аммония и удаления осажденного материала после каждого регулирования путем центрифугирования на низкой скорости. Низкомолекулярные ионные компоненты клеток затем удаляют путем адсорбирования rР2086 в 50% насыщенном сульфате аммония в буфере из 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, 1 мМ Na2EDTA на колонку гидрофобного взаимодействия (фенилсефарозу приобретали у GE Healthcare) с последующим элюированием гР2086 путем линейного снижения концентрации сульфата аммония до 0% с использованием буфера 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, 1 мМ Na2EDTA. Большинство отрицательно заряженных белков затем удаляют путем регулирования содержащих rР2086 фракций до буфера прогона 10 мМ Tris-HCl, рН 8.6, 1 мМ Na2EDTA объединенных фракций через анионообменную колонку (ТМАЕ приобретали у EMD), уравновешенную тем же буфером. Затем rР2086 подвергают дальнейшей очистке путем хроматографии на керамическом гидроксиапатите (от BioRad) путем обмена буфера, содержащего rР2086, на 10 мМ Hepes-NaOH, pΗ 7,4, содержащего 1 мМ фосфата натрия, адсорбирующего белок в керамический гидроксиапатит, с дальнейшим элюированием с линейным градиентом фосфата натрия до 250 мМ при рН 7,4. Вышеперечисленные отдельные операции часто бывают достаточными для получения достаточного выхода представителей rР2086 подсемейства А. Однако, поскольку уровень экспрессии может колебаться в 10-кратных пределах при экспрессии rР2086 на нижнем конце диапазона или в случае необходимости в высокоочищенном rР2086 (при высокой концентрации для структурного определения ЯМР), добавляют следующие дополнительные отдельные операции: хроматофокусирование с последующей хроматографией на керамическом гидроксиапатите. Буфер, содержащий белок rР2086 с предыдущего гидроксиапатитного этапа меняют на 25 мМ Tris-ацетат, рН 8,3, и белок адсорбируют на колонку для хроматофокусирования РВЕ94 (от GE Healthcare), уравновешенную тем же буфером, а затем элюируют буфером полибуфер 94-ацетатом, рН 6. Белки rР2086 элюируются при ~pI, и фракции, содержащие белок, объединяют. Буфер содержащих rР2086 фракций затем меняют на 10 мМ Hepes-NaOH, рН 7,4, содержащий 1 мМ фосфата натрия, и адсорбируют и элюируют, как указано выше. Представители rР2086 подсемейства А, полученные с применением этого процесса, как правило, на >95% гомогенны согласно SDS-PAGE-анализу, чаще всего - на >99% гомогенны.
А05, А12 и А22 (SEQ ID NO: 55, 66 и 68, соответственно)
В конце ферментации суспензию клеток восстанавливают путем непрерывного центрифугирования и ресуспендируют до ~1/4 первоначального объема ферментации в 20 мМ Tris, 5 мМ EDTA, рН 6,0. Лизиса суспензии клеток достигают путем гомогенизации под высоким давлением (2 прогона, 4000-9000 psi). К гомогенату добавляют DADMAC до конечной концентрации 0,5%. Раствор перемешивают при 15-25°С в течение 60 минут, на протяжении которых образуется тяжелый осадок. Раствор осветляют путем непрерывного центрифугирования. Белки (А05, А12 и А22) очищают с применением двух этапов хроматографии с последующей окончательной заменой буфера. Уровень рН фугата регулируют до 5,5 и фугат подают на колонку GigaCap-S (СЕХ). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением градиента хлорида натрия. К пулу с колонки СЕХ добавляют цитрат натрия до конечной концентрации 1,5 M и растВор подают на колонку Phenyl-650M (HIC). Белок связывают со смолой, а затем элюируют с применением ступенчатого градиента цитрата натрия. Пул HIC, содержащий очищенный белок, меняют на буфер готового лекарственного вещества путем диафильтрации. Применяют ультрафильтрационную кассету 5 кДа регенерированного ацетата целлюлозы. Заданная концентрация белка составляет 1,5-2,0 мг/мл. Диафильтрованный ретентат фильтруют через фильтр 0,2 микрона перед помещением в бутылки для хранения. Лекарственное вещество хранят при -70°С.
Пример 17: Сывороточный бактерицидный анализ
Титры функционального антитела исследовали с применением сывороточного бактерицидного анализа (SBA) против штаммов Neisseria meningitidis дикого типа или подвергнутых инженерии серогруппы В, экспрессирующих fHBP, с последовательностями, гомологичными или гетерологичными содержащимся в вакцине. Бактерицидные антитела сыворотки у кроликов, иммунизированных вакцинами rР2086, определяли, используя SBA с комплементом человека. Иммунные сыворотки кроликов подвергали термоинактивации для устранения внутренней активности комплемента и последовательно подвергали серии разведений 1:2 в PBS Дульбекко с Са2+ и Mg2+ (D-PBS) в 96-луночном микротитровальном планшете для испытания бактерицидной активности сыворотки против штаммов N. meningitidis. Для комбинированных исследований подвергнутых инженерии штаммов соответствующие сыворотки смешивали в соотношении 1:1 перед описанными выше последовательными разведениями, таким образом, что эффективная концентрация каждого компонент составляла половину от той, которая была при испытании каждого в отдельности. Бактерии, используемые для анализа, выращивали в среде GC, дополненной добавкой Келлогга (GCK), и наблюдали по оптической плотности при 650 нм. Бактерии собирали для использования в анализе при конечном показателе оптической плотности OD650 0,50-0,55, разводили в D-PBS и к аналитической смеси добавляли 1000-3000 КОЕ. Сыворотку человека без обнаружимой бактерицидной активности использовали в качестве экзогенного источника комплемента. Источники комплементов испытывали на пригодность относительно каждого отдельного испытываемого штамма. Для изогенных штаммов одну сыворотку человека определяли и отбирали для SBА против всех изогенных штаммов. Источник комплемента использовали лишь в том случае, если количество бактерий, выживших в контрольных образцах без добавления иммунных сывороток, составляло >75%. После 30 минут инкубации при 37°С с 5% СO2 и перемешивания при 700 об/мин на вибростенде к реакционной смеси добавляли D-PBS и аликвоты переносили на микрофильтровальные планшеты, предварительно заполненные 50% среды GCK для штаммов дикого типа и 100% среды GCK для подвергнутых инженерии штаммов. Микрофильтровальные планшеты подвергали фильтрации, инкубировали в течение суток при 37°С с 5% СО2 и микроколонии окрашивали и подсчитывали. Бактерицидные титры сыворотки определяли как интерполированное обратное разбавление сыворотки, которое приводило к 50% снижению КОЕ по сравнению с КОЕ в контрольных лунках без иммунных сывороток. Склонность к цитолизу под действием иммунных сывороток против rР2086 устанавливали при наличии 4-кратного или более повышения титра SBA для иммунных сывороток против rР2086 по сравнению с соответствующим неиммунные сыворотки. Сыворотки, которые были отрицательными по отношению к анализируемому штамму в начальном разведении, относили к титру, соответствующему половине предела обнаружения для пробы.
Пример 18: Иммуногенность нелипидированных вариантов белков rР2086 подсемейства А
Самок новозеландского кролика-альбиноса (2,5-3,5 кг), полученных от Charles River (Канада), использовали в двух исследованиях. Для первого исследования группы из 3 кроликов подвергали иммунизации с использованием 30 мкг или 3 мкг каждой из композиций fHBP липидированного А05 или нелипидированного А05. Для второго исследования пять кроликов / группу внутримышечно иммунизировали в правую заднюю конечность вариантами rР2086А в количестве 20 мкг/мл с добавлением 500 мкг/мл AlPO4 (0,5 мл/дозу / два места). Животных вакцинировали на 0, 4 и 9 неделях, подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Титры специфического к LP2086 бактериального антитела определяли на 0, 6 и 10-й неделях.
Цель этих исследований состояла в моделировании сниженной реакции, которую наблюдали в иммунологически интактных популяциях, например, у новорожденных. Сначала сравнивали низкую и высокую дозу (30 vs 3 мкг каждого антигена на дозу) вакцин, содержащих липидированный А05 (SEQ ID NO: 13) или нелипидированный А05 (SEQ ID NO: 55) (Таблицы 15А и 15В). Низкие дозы применяли таким образом, чтобы были различимы отличия в скорости реакции между вакцинами. Анализ SBА проводили с использованием двух наборов штаммов. Первый набор состоял из штаммов дикого типа, вызывающих инвазивную болезнь. Второй набор представлял подвергнутый генной инженерии штамм с тем же фоном и отличающийся только последовательностью fHBP, которая экспресировалась следующим образом: штамм N. meningitidis РМВ3556, экспрессирующий вариант В24 fHBP, подвергали инженерии, таким образом, чтобы его эндогенный ген fhbp был заменен на гены, кодирующие другие варианты fHBP. Последовательности строили таким образом, чтобы "включен" был только участок, кодирующий ORF, а окружающий генетический фон оставался интактным. Таким образом, анализ SBA с использованием этого набора позволял оценить реакционную способность против различных белков fHBP подсемейства А, экспрессируемых на одинаковом уровне и с одинаковым генетическим фоном, с использованием одного источника человеческого комплемента. Все штаммы имели уровень экспрессии fHBP выше порога, определяемого согласно публикации Jiang et al. (2010). Как показано в Таблицах 15А и 15В, и высокие, и низкие дозы липидированной А05-содержащей вакцины обеспечивали широкую защиту по разным генетически различным вариантам подсемейства А, в то время как сниженная реакция наблюдалась при обеих дозах для вакцины, содержащей нелипидированный вариант А05. Таким образом, это непосредственное сравнение обнаружило, что, хотя нелипидированный вариант А05 обеспечивает перекрестную защиту по экспрессирующим подсемейство А штаммам, он не является настолько иммуногенным, как липидированный вариант, который с большей вероятностью образует естественную конфигурацию (Таблицы 15А и 15В).
Для следующего исследования уровень дозы повышали до 10 мкг для каждого нелипидированного варианта подсемейства А для оценки потенциала каждого в обеспечении широкой защиты против штаммов подсемейства А. Анализ SBA обнаружил, что все эти повышенные дозы сывороток кроликов, иммунизированных нелипидированными вариантами fHBP А05 (SEQ ID NO: 55), A62 (SEQ ID NO: 71), A12 (SEQ ID NO: 66) и A22 (SEQ ID NO: 68) индуцировали титры к штаммам дикого типа, экспрессирующим гомологичные и гетерологичные варианты подсемейства А, указывая, что все обеспечивали перекрестную защиту при этой низкой дозе в пределах подсемейства А. Таким образом, наблюдали, что вакцина N2C1 (А05) может генерировать антитела, способные убивать вариантные штаммы N1C2 (А22) и N2C2 (A12) и, подобным образом, вакцины из этих других групп могут убивать штаммы с противоположными вариантами. В этих условиях наблюдалось, что варианты А05 и А62 обеспечивали наивысшие показатели SBA-респондеров по штаммам (Таблица 16). Соответственно, демонстрируется защитный эффект по этим вариантам.
Таблицы 15А и 15В. Средние геометрические значения титров SBA против штаммов N. meningitidis группы В сывороток, взятых до и после (PD3 = 10 недель) иммунизации кроликов (n=3) с 30 или 3 мкг вакцин, содержащих липидированный или нелипидированный А05. Верхние строки (обозначение "штаммы дикого типа") Таблиц 15А и 15В представляют активность против клинических изолятов. Нижние строки (обозначение "изогенные штаммы") Таблиц 15А и 15В представляют активность против набора изогенных штаммов, которые были подвергнуты инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (РМВ3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP был заменен на варианты А05 (SEQ ID NO: 13), А22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или A12 (SEQ ID NO: 14).
Таблица 16. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение уровня SBA GMT относительно фона, из образцов 10-недельной сыворотки, взятой у кроликов, иммунизированных 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А против штаммов, экспрессирующих варианты fHBP А05, А62, А12 или А22.
Перекрестная защита также наблюдалась для всех вариантов при применении набора изогенных штаммов, как описано выше, в повышенной дозе 10 мкг, с образцами сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71), демонстрирующими наибольшую перекрестную реактивность, с последующим применением антисывороток А05 (Таблица 17). Кроме того, образцы сыворотки кроликов, иммунизированных вариантом А62 (SEQ ID NO: 71) демонстрировали способность к реакции как с исходным штаммом РМВ3556, так и с переключенным штаммом В09 (Таблица 18), что указывало на то, что перекрестная реактивность распространяется на белки подсемейства В. Оказалось, что А62 состоит из доменов подсемейства А (А22) и подсемейства В (В09) (Фигура 9).
Таблица 17. Изогенные "переключенные" штаммы подвергали инженерии на основе исходного штамма N. meningitidis (РМВ3556), таким образом, чтобы весь ORF его эндогенного fHBP (вариант В24) был заменен на варианты А05 (SEQ ID NO: 13), A22 (SEQ ID NO: 15), A29 (SEQ ID NO: 74) или A12 (SEQ ID NO: 14). KA3011 является отрицательным контрольным штаммом (т.е., исходным РМВ3556, ген fhbp которого был делетирован). Среднегеометрические титры SBА (n=5) образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизации кроликов тремя дозами по 10 мкг нелипидированных вариантов fHBP подсемейства А) против этих штаммов показаны в верхних строках. Процент респондеров, демонстрирующих по меньшей мере 4-кратное повышение реакции относительно фона, показан в нижних строках.
Таблица 18. Среднегеометрические титры SBA образцов сыворотки (взятых до или через 10 недель после иммунизация кроликов (n=5) с 10 мкг нелипидированных белков подсемейства А (А62 (SEQ ID NO: 71); А05 (SEQ ID NO: 55); A12 (SEQ ID NO: 66); A22 (SEQ ID NO: 68)) против двух изогенных штаммов подсемейства В.
Пример 19: Оценка влияния комбинирования образцов сыворотки против нелипидированных белков подсемейства А на SBA
Комбинации сыворотки исследовали для оценки влияния на охват защиты. Испытывали пары образцов сыворотки до и после вакцинации для подтверждения отсутствия неспецифического цитолиза, вызванного в результате комбинирования сыворотки. Кратность повышения GM рассчитывали для отдельных образцов сыворотки и для комбинаций сыворотки по 4-м изогенным штаммам, которые представляли разнообразие в пределах подсемейства А. Обнаруживали кратное повышение для некоторых из испытанных комбинаций, что свидетельствовало о том, что охват защиты может быть расширен путем включения большего количества вариантов подсемейства А (Таблица 19). Оптимальными комбинациями являются А05 (SEQ ID NO: 55) с А62 (SEQ ID NO: 71) или A62 (SEQ ID NO: 71) с A12 (SEQ ID NO: 66) (Таблица 20).
Таблица 19. Титры SBA образцов сыворотки респондеров с наивысшими показателями каждой вакцинной группы повторно испытывали по отношению к набору изогенных штаммов, как показано в Таблице 17. Образцы сыворотки испытывали в смесях 1:1 для определения степени синергетической активности.
Таблица 20. Кратность повышения для образцов сыворотки, испытываемых в комбинации по сравнению с каждым, испытываемым в отдельности (рассчитанная по Таблице 19).
Результаты, представленные выше в Примерах 18-19, показывают, что нелипидированные белки подсемейства А являются иммуногенными и могут обеспечивать защиту от инфицирования штаммами N. meningitidis с гомологичными или гетерологичными вариантами. Представленные здесь данные демонстрируют, что выбранные нелипидированные варианты подсемейства А сохраняют иммуногенность и обеспечивают перекрестную защиту от гетерологичных штаммов, хотя эти показатели реакции ниже, чем для липидированных вариантов. Авторами также было продемонстрировано, что антиген rP2086 А62 (SEQ ID NO: 71), имеющий подобие последовательности с подсемейством В (См., например, Фигура 9), может обеспечивать защиту от разных подсемейств, поскольку вакцина А62 (SEQ ID NO: 71) может убивать штаммы, экспрессирующие варианты В09 или В24 подсемейства В).
Представленные выше данные показывают, что нелипидированные варианты подсемейства А способны не только демонстрировать синергизм, наблюдаемый для комбинаций липидированных fHBP, но и могут обеспечивать защиту от вариантов подсемейства В.
Пример 20: Оценка иммуногенности комбинации фактор Н-связывающих белков и четырехвалентной вакцины менингококкового конъюгата у новозеландских кроликов-альбиносов
Исследование проводили на новозеландских кроликах-альбиносах, имеющих массу в пределах 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 21). Перед началом исследования 55 кроликов подвергали предварительному отбору на наличие антител с применением цельноклеточных анализов ELISA против штаммов А05 и В02. После отбора кроликов с относительно высокими титрами антитела (титры специфического IgG<350) вакцинировали внутримышечно в задние конечности, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 22) на 0, 4 и 9 неделях. Каждая группа включала три кролика. Кроликов подвергали кровопусканию на 0, 4, 6 и 9 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу на SBA. Конъюгатную менингококковую вакцину (MENVEO®, конъюгатная менингококковая вакцина (Группы А, С, Y и W-135) олигосахарида дифтерии CRM197, Novartis), двухвалентный rLP2086 и четырехвалентный нелипидированный варианты и их комбинации изготавливали согласно Таблицам 23-26.
План исследования показан в Таблице 22.
Сведения о композиции
Нелипидированный четырехвалентный белок (В22, В09, А05 и В44) наблюдали на устойчивость в течение 6 часов при 2-8°С после комбинирования с MENVEO®.
Пример 21: Сывороточный бактерицидный анализ (SBА)
Сывороточный бактерицидный анализ (SBA) на основе микроколоний против множественных менингококковых штаммов серогрупп В, С и Y (Таблица 27) проводили на отдельных образцах сыворотки. Человеческую сыворотку от доноров брали как источник комплемента для штамма, испытываемого при анализе. Опосредованные комплементом антителозависимые бактерицидные титры интерполировались и выражались как обратные показатели разбавления испытываемой сыворотки, убивающей 50% менингококковых клеток в пробе. Пределом обнаружения анализа был титр SBA 4. Титр SBA <4 получал номер 2. Рассчитывали и сравнивали повышение титров SBA≥4 раза в 10-недельных образцах сыворотки по сравнению с титрами до иммунизации.
Пример 22: Иммуногенность комбинации липидированных или нелипидированных фактор Н-связывающих белков и конъюгатной вакцины у новозеландских кроликов-альбиносов
Сывороточное бактериальное антитело представляет иммунологический имитатор защиты от менингококковой болезни. Вызывает ли иммунизация липидированными, нелипидированными rfHBP, четырехвалентными конъюгатными вакцинами, отдельно или в комбинации, выработку бактерицидных антител у кроликов, определяли по SBA. SBA измеряет уровень антител в образцах сыворотки путем имитации опосредованного комплементом бактериального лизиса, который происходит естественным путем. У человека титр SBA 1:4 считается обеспечивающим защиту; четырехкратное повышение титра в сравнении показателей до и после иммунизации также считается иммунологически релевантной иммунной реакцией. Образцы сыворотки кроликов, собранные на 0 и 10 неделях, подвергали анализу на SBА против штаммов разных менингококковых серогрупп. Как показано в Таблице 28 (высокая доза) и 29 (низкая доза), через неделю после третьей иммунизации (10-я неделя) четырехвалентные конъюгатные вакцины вызывали реакцию SBA только против испытываемых штаммов МnС и MnY. Все остальные образцы сыворотки демонстрировали бактерицидную активность против гомологичных штаммов, а также других испытываемых штаммов того же подсемейства fHBP, как в вакцинных композициях. Следует заметить, что иммунизация липидированными А05/В01 (SEQ ID NO: 13 и 58, соответственно) по отдельности в дозах по 30 мкг вызывала максимальную выработку бактерицидных антител против гомологичных штаммов, а также против других испытываемых штаммов обоих подсемейств fHBP (Таблица 28). Подобным образом иммунизация нелипидированными А05/В09/В22/В44 (SEQ ID NO: 55, 49, 75 и 44, соответственно) по отдельности также вызывала выработку бактерицидных антител против штаммов нескольких менингококковых серогруппа, даже несмотря на то, что титры SBA были в 3-15 раз ниже по сравнению с липидированной двухвалентной вакциной (Таблица 30). 100%-й показатель респондеров (≥ 4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех штаммов различных серогрупп для липидированного fHBP, высокой дозы нелипидированного fHBP и всех комбинаций.
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 недели с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Образцы сыворотки кроликов до иммунизации не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Кроликов NZW (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Кроликов NZQ (n=3) вакцинировали на 0, 4 и 8 неделях с применением 0,5 мл вакцины, внутримышечно; данные нед. 10
Липидированный fHBP вызывал более высокие титры SBA по сравнению с нелипидированным fHBP.
Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 3-15 раз более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал в 4-23 раза более высокие титры SBA ко всем испытываемым штаммам менингококков В, С и Y (Таблицы 28-29).
Титрование дозы достигали с применением fHBP, конъюгатной вакцины или комбинаций
При более высокой дозе конъюгатной вакцины fHBP или их комбинации повышали реакцию SBA по сравнению с более низкой дозой (Таблицы 28-30). Одна доза конъюгатной вакцины для человека вызывала 2-8-кратное повышение титров SBA против штаммов менингококков С и Y по сравнению с одной десятой дозы конъюгатной вакцины. Липидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 2-4-кратное повышение титров SBA против всех испытываемых штаммов по сравнению с 3 мкг на дозу. Нелипидированный fHBP при 30 мкг на дозу вызывал 4-15-кратное повышение титров SBА против всех штаммов менингококков серогрупп В, С и Y по сравнению с 3 мкг на дозу.
Синергетические реакции SBA при комбинации fHBP и конъюгатных вакцин
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y при применении комбинации конъюгатной вакцины и fHBP по сравнению с применением любого из компонентов в отдельности с добавлением более низкой дозы липидированного или нелипидированного fHBP (Таблица 29). В данном исследовании функциональную активность против штаммов нескольких менингококковых серогрупп оценивали с использованием сыворотки новозеландских кроликов-альбиносов, иммунизированных рекомбинантным липидированным или нелипидированным fHBP в композиции с AlPO4 и конъюгатной вакциной отдельно или в комбинации. Кролики, получавшие конъюгатную вакцину, демонстрировали реакцию SBA только против штаммов менингококков серогрупп С и Y, но не штаммов серогруппы В. Липидированный или нелипидированный fHBP в композиции с AlPO4 вызывали выработку сывороточных антител, которые были бактерицидными против штаммов всех испытываемых менингококковых серогрупп.
Новозеландские кролики-альбиносы, получавшие три дозы липидированного или нелипидированного fHBP в композиции с AlPO4, вырабатывали сывороточные антитела, которые были бактерицидными против испытываемых штаммов менингококков серогрупп В, С и Y. 100%-й показатель респондеров (≥ 4-кратное повышение титра SBA) достигался против всех испытываемых штаммов, за исключением низкодозовой нелипидированной группы.
Липидированный fHBP вызывал большие титры бактериального антитела по сравнению с нелипидированными формами. Явная реакция на дозу наблюдалась при липидированном или нелипидированном fHBP и конъюгатной вакцине отдельно или в комбинациях.
Существует тенденция в сторону повышения реакций SBA против штаммов менингококков серогрупп С и Y между конъюгатной вакциной и fHBP, в частности, при добавлении низких доз белков.
Пример 23: Оценка иммуногенности комбинаций нелипидированных фактор Н-связывающих белков у новозеландских кроликов-альбиносов
Исследования проводили на новозеландских кроликах-альбиносах весом 2,5-3,5 кг, полученных от Charles River, Канада (Таблица 31). Кроликов вакцинировали внутримышечно в заднюю конечность, 0,5 мл в каждое место (1,0 мл на дозу, см. Таблицу 32) на 0, 4 и 9 неделях. Идентификационные номера последовательностей для каждого из исследованных антигенов представлены в Таблице 33. Использовали 10 кроликов на группу. Кроликов подвергали кровопусканию на 0 и 6 неделях и обескровливали на 10-й неделе. Подготавливали образцы сыворотки и образцы сыворотки 0 и 10 недель подвергали анализу в SBA против ряда изолятов N. meningitidis.
В Таблице 34 представлены показатели иммунной реакции у кроликов на смеси нелипидированных белков fHBP по сравнению с иммунной реакцией на пару липидированных антигенов rLP2086-A05 и rLP2086-B01. Образцы сыворотки кролика до иммунизации, как правило, не демонстрировали ранее существовавшей бактерицидной активности против испытываемых штаммов. Иммунная реакция представлена как процент животных в каждой экспериментальной группе, которые реагировали на соответствующие комбинации антигенов fHBP после третьей иммунизации с повышением титра SBA ≥4 раза. Анализ SBA осуществляли, используя заданные штаммы N. meningitidis, которые либо экспрессируют варианты fHBP, идентичные иммуногену вакцины (А05, А12), либо экспрессируют гетерологичные варианты fHBP (А22, В16, В24). Сравнительная идентичность аминокислотной последовательности варианта А22 fHBP имеет до 15% отличия от исследованных вариантов подсемейства А. Подобным образом сравнительная идентичность аминокислотной последовательности вариантов fHBP В16 и В24 имеет до 12% отличия от вариантов подсемейства В, включенных в качестве антигенов.
В группах кроликов, иммунизированных 10 мкг каждого испытываемого варианта rР2086, образцы сыворотки животных, получавших комбинацию А05+А62+В09+В44, демонстрировали наивысший показатель бактерицидной реакции. Реакция SBA была несколько сниженной у животных, получавших только по 5 мкг той же смеси четырех нелипидированных вариантов fHBP. Другие 4-валентные группы антигенов fHBPb дозах 5 мкг проявляли себя так же, как и комбинация нелипидированных А05+А62+В09+В44. Из испытанных 4-валентных комбинаций образцы сыворотки из экспериментальной группы, включавшей по 5 мкг нелипидированных вариантов fHBP A12+А62+В09+В44, имели наилучшие показатели реакции SBA для выбранных анализируемых штаммов. Показатель реакции на пятивалентную нелипидированную комбинацию из А05+A12+А62+В09+В44 был несколько лучшим по сравнению с реакцией на любую из испытанных 4-валентных комбинаций.
Claims (15)
1. Рекомбинантный полипептид для индуцирования иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71, в которой первые двадцать аминокислотных остатков последовательности не содержат цистеина, где уровень экспрессии рекомбинантного полипептида составляет больше, чем уровень экспрессии соответствующей немутантного типа последовательности SEQ ID NO: 70.
2. Рекомбинантный полипептид по п.1, отличающийся тем, что полипептид является непирувилированным.
3. Рекомбинантный полипептид по п.1, отличающийся тем, что полипептид является нелипидированным.
4. Рекомбинантный полипептид по п.1, отличающийся тем, что полипептид является иммуногенным.
5. Иммуногенная композиция для индуцирования иммунной реакции против Neisseria meningitidis у млекопитающего, включающая эффективное количество полипептида по какому-либо из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.
6. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид А12, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66.
7. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид А05, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55.
8. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид В09, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49.
9. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид В44, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
10. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид А12, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, полипептид В09, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и полипептид В44, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
11. Иммуногенная композиция по п.5, отличающаяся тем, что дополнительно включает полипептид А05, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55, полипептид А12, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, полипептид В09, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и полипептид В44, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44.
12. Иммуногенная композиция по какому-либо из пп.6-11, отличающаяся тем, что каждый полипептид является нелипидированным.
13. Иммуногенная композиция по какому-либо из пп.6-11, отличающаяся тем, что каждый полипептид является непирувилированным.
14. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид, индуцирующий иммунную реакцию против Neisseria meningitidis у млекопитающего, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 71.
15. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.14, отличающаяся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты состоит из SEQ ID NO: 72.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261609257P | 2012-03-09 | 2012-03-09 | |
US61/609,257 | 2012-03-09 | ||
PCT/IB2013/051791 WO2013132452A2 (en) | 2012-03-09 | 2013-03-06 | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
Related Child Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018129163A Division RU2776310C2 (ru) | 2012-03-09 | 2013-03-06 | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения |
RU2017104529A Division RU2739504C2 (ru) | 2012-03-09 | 2017-02-13 | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014136401A RU2014136401A (ru) | 2016-05-10 |
RU2665841C2 true RU2665841C2 (ru) | 2018-09-04 |
Family
ID=48182966
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014136401A RU2665841C2 (ru) | 2012-03-09 | 2013-03-06 | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения |
RU2017104529A RU2739504C2 (ru) | 2012-03-09 | 2017-02-13 | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017104529A RU2739504C2 (ru) | 2012-03-09 | 2017-02-13 | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8986710B2 (ru) |
EP (3) | EP4043029A1 (ru) |
JP (2) | JP5925342B2 (ru) |
KR (5) | KR20160022402A (ru) |
CN (3) | CN107056901B (ru) |
AR (3) | AR090294A1 (ru) |
AU (5) | AU2013229063B2 (ru) |
BR (2) | BR112014021658A2 (ru) |
CA (4) | CA2865745C (ru) |
CO (1) | CO7061042A2 (ru) |
HK (1) | HK1206625A1 (ru) |
IL (4) | IL234555B (ru) |
MX (3) | MX359256B (ru) |
MY (2) | MY198910A (ru) |
NZ (2) | NZ628449A (ru) |
PE (2) | PE20142115A1 (ru) |
PH (2) | PH12014501887A1 (ru) |
RU (2) | RU2665841C2 (ru) |
SG (3) | SG11201404730XA (ru) |
TW (5) | TWI616455B (ru) |
WO (1) | WO2013132452A2 (ru) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
ES2850973T3 (es) | 2010-08-23 | 2021-09-01 | Wyeth Llc | Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis |
WO2012032489A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
NZ628449A (en) * | 2012-03-09 | 2016-04-29 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
CA2923129C (en) | 2013-09-08 | 2020-06-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
BR112016019735A2 (pt) | 2014-02-28 | 2017-10-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | fhbp, polipeptídeo, plasmídeo ou outro ácido nucleico, célula hospedeira, vesículas de membrana, e, composição imunogênica |
WO2016014719A1 (en) * | 2014-07-23 | 2016-01-28 | Children's Hospital & Research Center Oakland | Factor h binding protein variants and methods of use thereof |
BR112017017460A2 (pt) | 2015-02-19 | 2018-04-10 | Pfizer Inc. | composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas |
EP3334455A4 (en) * | 2015-08-11 | 2019-08-21 | Orbis Health Solutions LLC | STRATEGY FOR BACTERIAL AND VIRAL VACCINATION |
US20180228885A1 (en) * | 2016-03-04 | 2018-08-16 | Orbis Health Solutions Llc | Bacterial and viral vaccine strategy |
MX2019002489A (es) | 2016-09-02 | 2019-10-21 | Sanofi Pasteur Inc | Vacuna contra neisseria meningitidis. |
CN110234658B (zh) * | 2017-01-31 | 2024-03-12 | 辉瑞大药厂 | 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法 |
WO2020165711A1 (en) | 2019-02-11 | 2020-08-20 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidiscompositions and methods thereof |
EP4034157A1 (en) | 2019-09-27 | 2022-08-03 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
IL305313A (en) | 2021-02-19 | 2023-10-01 | Sanofi Pasteur | Recombinant meningococcal B vaccine |
WO2024030931A1 (en) | 2022-08-03 | 2024-02-08 | Sanofi Pasteur Inc. | Adjuvanted immunogenic composition against neisseria meningitidis b |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2223492C2 (ru) * | 1998-10-09 | 2004-02-10 | Чирон Корпорейшн | БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ neisseria meningitidis (ВАРИАНТЫ), ЕГО ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), ЗОНД, ПРАЙМЕР, КОМПОЗИЦИЯ |
WO2009104097A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
WO2011024072A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
Family Cites Families (227)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4554101A (en) | 1981-01-09 | 1985-11-19 | New York Blood Center, Inc. | Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity |
CH660375A5 (it) | 1983-02-08 | 1987-04-15 | Sclavo Spa | Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica. |
CA1247080A (en) | 1983-03-08 | 1988-12-20 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4650764A (en) | 1983-04-12 | 1987-03-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Helper cell |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
GB8424757D0 (en) | 1984-10-01 | 1984-11-07 | Pasteur Institut | Retroviral vector |
SE8405493D0 (sv) | 1984-11-01 | 1984-11-01 | Bror Morein | Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel |
FR2573436B1 (fr) | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
US4666829A (en) | 1985-05-15 | 1987-05-19 | University Of California | Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis |
EP0232262A4 (en) | 1985-08-15 | 1989-09-19 | Stauffer Chemical Co | MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE. |
US5078996A (en) | 1985-08-16 | 1992-01-07 | Immunex Corporation | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
DE3689123T2 (de) | 1985-11-01 | 1994-03-03 | Xoma Corp | Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung. |
US4861719A (en) | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
US5514581A (en) | 1986-11-04 | 1996-05-07 | Protein Polymer Technologies, Inc. | Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer |
US4980289A (en) | 1987-04-27 | 1990-12-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Promoter deficient retroviral vector |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
RU2023448C1 (ru) | 1987-07-30 | 1994-11-30 | Сентро Насьональ Де Биопрепарадос | Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в |
WO1989007150A1 (en) | 1988-02-05 | 1989-08-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of | Retroviral packaging cell lines and processes of using same |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
JP3082204B2 (ja) | 1988-09-01 | 2000-08-28 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 両栄養性および環境栄養性宿主域を持つ組換え体レトロウイルス |
US7118757B1 (en) | 1988-12-19 | 2006-10-10 | Wyeth Holdings Corporation | Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine |
US5124263A (en) | 1989-01-12 | 1992-06-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby |
WO1990010458A1 (en) | 1989-03-09 | 1990-09-20 | Praxis Biologics, Inc. | Vaccines for nontypable haemophilus influenzae |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
CA2017507C (en) | 1989-05-25 | 1996-11-12 | Gary Van Nest | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
US5585362A (en) | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
CA2039921A1 (en) | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
AU7906691A (en) | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
IE912559A1 (en) | 1990-07-19 | 1992-01-29 | Merck & Co Inc | The class ii protein of the outer membrane of neisseria¹meningitidis, and vaccines containing same |
EP0550553B1 (en) | 1990-09-25 | 2000-07-12 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral defective vaccine produced by transcomplementing cell line |
US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
IL101715A (en) | 1991-05-02 | 2005-06-19 | Amgen Inc | Recombinant dna-derived cholera toxin subunit analogs |
EP0625052A4 (en) | 1991-10-21 | 1995-07-19 | Medimmune Inc | SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR. |
US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
IT1253009B (it) | 1991-12-31 | 1995-07-10 | Sclavo Ricerca S R L | Mutanti immunogenici detossificati della tossina colerica e della tossina lt, loro preparazione ed uso per la preparazione di vaccini |
WO1993015115A1 (en) | 1992-01-24 | 1993-08-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | E. coli dna polymerase iii holoenzyme and subunits |
AU680459B2 (en) | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
ES2231770T3 (es) | 1993-03-05 | 2005-05-16 | Wyeth Holdings Corporation | Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica. |
WO1994021807A2 (en) | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Defective mutant non-retroviral virus (e.g. hsv) as vaccine |
EP0624376B1 (en) | 1993-05-13 | 2000-03-15 | American Cyanamid Company | Preparation and uses of LOS-depleted outer membrane proteins of gram-negative cocci |
FR2705361B1 (fr) | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
SK282843B6 (sk) | 1993-07-13 | 2002-12-03 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
CA2168202A1 (en) | 1993-07-30 | 1995-03-16 | Joseph Dougherty | Efficient gene transfer into primary lymphocytes |
FR2708622B1 (fr) | 1993-08-02 | 1997-04-18 | Raymond Hamers | Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides. |
US5550213A (en) | 1993-12-27 | 1996-08-27 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Inhibitors of urokinase plasminogen activator |
FR2714830B1 (fr) | 1994-01-10 | 1996-03-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
FR2715847B1 (fr) | 1994-02-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
FR2716459B1 (fr) | 1994-02-22 | 1996-05-10 | Univ Paris Curie | Système hôte-vecteur utilisable en thérapie génique. |
WO1995026411A2 (en) | 1994-03-25 | 1995-10-05 | The Uab Research Foundation | Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells |
US5739118A (en) | 1994-04-01 | 1998-04-14 | Apollon, Inc. | Compositions and methods for delivery of genetic material |
CA2187818A1 (en) | 1994-04-15 | 1995-10-26 | Robert W. Overell | Gene delivery fusion proteins |
US5571515A (en) | 1994-04-18 | 1996-11-05 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Compositions and methods for use of IL-12 as an adjuvant |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US5565204A (en) | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
US5837533A (en) | 1994-09-28 | 1998-11-17 | American Home Products Corporation | Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent |
GB9422096D0 (en) | 1994-11-02 | 1994-12-21 | Biocine Spa | Combined meningitis vaccine |
FR2727679B1 (fr) | 1994-12-05 | 1997-01-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
BE1008978A5 (fr) | 1994-12-27 | 1996-10-01 | Solvay | Adjuvants pour vaccins. |
IL116816A (en) | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
IL117483A (en) | 1995-03-17 | 2008-03-20 | Bernard Brodeur | MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K. |
WO1996039036A1 (en) | 1995-06-05 | 1996-12-12 | The University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells |
WO1996040718A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Connaught Laboratories, Inc. | Expression of lipoproteins |
FR2741358B1 (fr) | 1995-11-17 | 1998-01-02 | Centre Nat Rech Scient | Production de vecteurs retroviraux par l'intermediaire de vecteurs viraux a base de virus a adn |
US5846547A (en) | 1996-01-22 | 1998-12-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
US6355255B1 (en) | 1998-12-07 | 2002-03-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Streptococcal C5a peptidase vaccine |
PT939647E (pt) | 1996-08-27 | 2002-04-29 | Chiron Corp | Glicpconjugados do serogrupo b de neisseria meningitidis e metodos de utilizacao dos mesmos |
EP0922059B1 (en) | 1996-08-27 | 2003-10-22 | Chiron Corporation | Monoclonal antibodies that define unique meningococcal b epitopes and their use in the preparation of vaccine compositions |
US6472518B1 (en) | 1996-10-24 | 2002-10-29 | Centers For Disease Control And Prevention, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Invasion associated genes from Neisseria meningitidis serogroup B |
GB9622159D0 (en) | 1996-10-24 | 1996-12-18 | Solvay Sociutu Anonyme | Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization |
GB9622660D0 (en) | 1996-10-31 | 1997-01-08 | Biocine Spa | Immunogenic detoxified mutant toxin |
US6113918A (en) | 1997-05-08 | 2000-09-05 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
EP0991425B1 (fr) | 1997-06-30 | 2005-03-09 | Institut Gustave Roussy | Amelioration du transfert d'acide nucleique dans les cellules d'organismes eucaryotes pluricellulaires et combinaison permettant la mise en oeuvre du procede |
WO1999001175A1 (en) | 1997-06-30 | 1999-01-14 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Device for optimized electrotransfer of nucleic acid vectors to tissues in vivo |
BR9810369A (pt) | 1997-06-30 | 2000-09-05 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Processo de transferência de ácido nucleico para o interior de um ou mais músculos estriados, in vivo, composição, ácido mucleico e campo elétrico, e, produto de combinação |
JPH1144977A (ja) | 1997-07-25 | 1999-02-16 | Copyer Co Ltd | 画像形成装置 |
EP1007546B1 (en) | 1997-08-27 | 2009-01-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Molecular mimetics of meningococcal b epitopes |
CA2308606A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
AU1979599A (en) | 1998-01-14 | 1999-08-02 | Chiron S.P.A. | (neisseria meningitidis) antigens |
DE69941505D1 (de) | 1998-02-03 | 2009-11-19 | Ct Disease Contr & Prevention | Verfahren zur herstellung rekombinanter, lipid-modifizierter psaa proteine und deren verwendung |
GB9806456D0 (en) | 1998-03-25 | 1998-05-27 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
GB9808734D0 (en) | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
BR9910089A (pt) | 1998-05-01 | 2004-06-08 | Chiron Corp | Composições e antìgenos de neisseria meningitidis |
BR9910749A (pt) | 1998-05-29 | 2001-02-13 | Chiron Corp | Composições e vacinas imunogênicas combinadas para meningites b e c e método de induzir uma resposta imune por administração da mesma |
DK1117435T3 (da) | 1998-09-30 | 2008-03-17 | Wyeth Corp | Muteret cholera-holotoxin som adjuvans |
WO2000018355A2 (en) | 1998-09-30 | 2000-04-06 | Walter Reed Army Institute Of Research | Use of purified invaplex from gram negative bacteria as a vaccine |
JP2004511201A (ja) | 1998-10-09 | 2004-04-15 | カイロン コーポレイション | ナイセリアゲノム配列およびそれらの使用方法 |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
US6281337B1 (en) | 1998-11-12 | 2001-08-28 | Schering Corporation | Methods for conversion of protein isoforms |
EP1144645A1 (en) | 1999-01-15 | 2001-10-17 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | Neisseria meningitidis polypeptide basb052 |
CA2360658A1 (en) | 1999-01-22 | 2000-07-27 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Neisseria meningitidis antigenic polypeptides, corresponding polynucleotides and protective antibodies |
GB9902084D0 (en) | 1999-01-29 | 1999-03-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
DK1150712T3 (da) | 1999-02-05 | 2009-02-02 | Merck & Co Inc | Vaccineformuleringer mod human papillomavirus |
US8221761B1 (en) | 1999-02-26 | 2012-07-17 | Novartis Ag | Enhancement of bactericidal activity of neisseria antigens with oligonucleotides containing CG motifs |
US6245568B1 (en) | 1999-03-26 | 2001-06-12 | Merck & Co., Inc. | Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles |
US7115730B1 (en) | 1999-04-27 | 2006-10-03 | Chiron Srl | Immunogenic detoxified mutant E. coli LT-A-toxin |
DK1185691T3 (da) | 1999-04-30 | 2009-06-22 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Genomiske neisseriasekvenser og fremgangmåder til anvendelse deraf |
RU2245366C2 (ru) | 1999-04-30 | 2005-01-27 | Чирон С.Р.Л. | Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование |
GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
EP2270174A1 (en) | 1999-05-19 | 2011-01-05 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Combination neisserial compositions |
GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
US7384640B1 (en) | 1999-09-30 | 2008-06-10 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant |
EP2275552B1 (en) | 1999-10-29 | 2015-09-09 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Neisserial antigenic peptides |
GB9928196D0 (en) | 1999-11-29 | 2000-01-26 | Chiron Spa | Combinations of B, C and other antigens |
CN1433471A (zh) | 1999-11-29 | 2003-07-30 | 启龙股份公司 | 85kgDa奈瑟球菌的抗原 |
DK1233784T3 (da) | 1999-12-02 | 2008-09-01 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Præparater og fremgangsmåder til stabilisering af biologiske molekyler efter lyofilisering |
PT2289545T (pt) | 2000-01-17 | 2016-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacina de omv suplementada contra meningococos |
PT2270030E (pt) | 2000-02-28 | 2012-07-24 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Expressão heteróloga de proteínas de neisseria |
SK287689B6 (sk) | 2000-06-08 | 2011-06-06 | Intercell Ag | Použitie molekuly oligodeoxynukleovej kyseliny na výrobu imunostimulačnej farmaceutickej kompozície a farmaceutický prípravok |
AT410635B (de) | 2000-10-18 | 2003-06-25 | Cistem Biotechnologies Gmbh | Vakzin-zusammensetzung |
EA006947B1 (ru) | 2001-01-23 | 2006-06-30 | Авентис Пастер | Поливалентная менингококковая полисахаридно-белковая конъюгированная вакцина |
GB0103424D0 (en) | 2001-02-12 | 2001-03-28 | Chiron Spa | Gonococcus proteins |
CA2441327A1 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Geneprot, Inc. | Human arginine-rich protein-related compositions |
WO2002083710A2 (en) | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Wyeth Holdings Corporation | Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography |
RU2322451C2 (ru) | 2001-04-17 | 2008-04-20 | Новартис Вэксинс Энд Диагностикс, Инк. | Молекулярные миметики эпитопов менингококка в, которые вызывают выработку функционально активных антител |
IL159209A0 (en) | 2001-06-07 | 2004-06-01 | Wyeth Corp | Mutant forms of cholera holotoxin as an adjuvant |
CN1977971A (zh) | 2001-06-07 | 2007-06-13 | 惠氏控股有限公司 | 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式 |
GB0115176D0 (en) | 2001-06-20 | 2001-08-15 | Chiron Spa | Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines |
RU2323002C2 (ru) | 2001-07-26 | 2008-04-27 | Чирон Срл. | Вакцины, содержащие алюминиевые адъюванты и гистидин |
GB0121591D0 (en) | 2001-09-06 | 2001-10-24 | Chiron Spa | Hybrid and tandem expression of neisserial proteins |
US20070020622A1 (en) | 2001-09-14 | 2007-01-25 | Invitrogen Corporation | DNA Polymerases and mutants thereof |
MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
GB0129007D0 (en) | 2001-12-04 | 2002-01-23 | Chiron Spa | Adjuvanted antigenic meningococcal compositions |
ES2318117T3 (es) | 2002-03-26 | 2009-05-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Sacaridos modificados que tienen una estabilidad mejorada en agua. |
MXPA04011249A (es) | 2002-05-14 | 2005-06-06 | Chiron Srl | Vacunas mucosales con adyuvante de quitosano y antigenos meningococicos. |
GB0302218D0 (en) | 2003-01-30 | 2003-03-05 | Chiron Sri | Vaccine formulation & Mucosal delivery |
NZ536859A (en) | 2002-05-14 | 2007-11-30 | Chiron Srl | Mucosal combination vaccines for bacterial meningitis |
US6954446B2 (en) | 2002-06-25 | 2005-10-11 | Motorola, Inc. | Multiple mode RF communication device |
GB0220198D0 (en) | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Modified saccharides,conjugates thereof and their manufacture |
US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
GB0220194D0 (en) | 2002-08-30 | 2002-10-09 | Chiron Spa | Improved vesicles |
WO2004032958A1 (en) | 2002-10-11 | 2004-04-22 | Chiron Srl | Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages |
EP2279746B1 (en) | 2002-11-15 | 2013-10-02 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Surface proteins in neisseria meningitidis |
GB0227346D0 (en) | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
WO2004065603A2 (en) | 2003-01-15 | 2004-08-05 | Wyeth Holdings Corporation | Methods for increasing neisseria protein expression |
WO2004067030A2 (en) | 2003-01-30 | 2004-08-12 | Chiron Srl | Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups |
US20060251675A1 (en) | 2003-03-17 | 2006-11-09 | Michael Hagen | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein |
EP1618185A4 (en) | 2003-04-16 | 2009-05-27 | Wyeth Corp | NEW IMMUNOLOGICAL COMPOSITIONS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MENINGOCOCCOULAR DISEASE |
PL1631264T5 (pl) | 2003-06-02 | 2018-09-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Kompozycje immunogenne oparte na biodegradowalnych mikrocząstkach zawierających toksoid błonicy i tężca |
CA2530434A1 (en) | 2003-06-23 | 2005-01-06 | Aventis Pasteur, Inc. | Immunization method against neisseria meningitidis serogroups a and c |
GB0316560D0 (en) | 2003-07-15 | 2003-08-20 | Chiron Srl | Vesicle filtration |
GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
ATE506963T1 (de) | 2003-10-02 | 2011-05-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Kombinationsimpfstoffe gegen meningitis |
BRPI0417938A (pt) | 2003-12-30 | 2007-04-17 | Wyeth Corp | formulações de proteìnas hidrofóbicas em uma composição imunogênica que possui tolerabilidade aperfeiçoada |
GB0406013D0 (en) | 2004-03-17 | 2004-04-21 | Chiron Srl | Analysis of saccharide vaccines without interference |
GB0408978D0 (en) | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Meningococcal fermentation for preparing conjugate vaccines |
GB0408977D0 (en) | 2004-04-22 | 2004-05-26 | Chiron Srl | Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins |
BRPI0510315A (pt) | 2004-04-30 | 2007-10-16 | Chiron Srl | integração de vacinação com conjugado meningocócico |
GB0409745D0 (en) | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Compositions including unconjugated carrier proteins |
GB0500787D0 (en) | 2005-01-14 | 2005-02-23 | Chiron Srl | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
GB0410220D0 (en) | 2004-05-07 | 2004-06-09 | Kirkham Lea Ann | Mutant pneumolysin proteins |
GB0411387D0 (en) | 2004-05-21 | 2004-06-23 | Chiron Srl | Analysis of saccharide length |
GB0413868D0 (en) | 2004-06-21 | 2004-07-21 | Chiron Srl | Dimensional anlaysis of saccharide conjugates |
CN101014618B (zh) | 2004-07-23 | 2013-01-02 | 诺华疫苗和诊断有限公司 | 抗原的寡聚装配多肽 |
GB0419408D0 (en) | 2004-09-01 | 2004-10-06 | Chiron Srl | 741 chimeric polypeptides |
GB0419846D0 (en) | 2004-09-07 | 2004-10-13 | Chiron Srl | Vaccine adjuvants for saccharides |
GB0424092D0 (en) | 2004-10-29 | 2004-12-01 | Chiron Srl | Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins |
GB0428394D0 (en) | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
NZ555937A (en) | 2005-01-27 | 2009-05-31 | Childrens Hosp & Res Ct Oak | GNA1870-based vesicle vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis |
EP1855595A2 (en) | 2005-03-07 | 2007-11-21 | ID Biomedical Corporation of Quebec c.o.b. as Glaxosmithkline Biologicals North America | Pharmaceutical liposomal compositions |
RU2412944C2 (ru) | 2005-05-06 | 2011-02-27 | Новартис Вэксинз Энд Дайагностикс Срл | Иммуногены для вакцин против менингита а |
KR101408113B1 (ko) | 2005-06-27 | 2014-06-16 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 백신 제조 방법 |
BRPI0615420A2 (pt) | 2005-09-01 | 2011-05-17 | Novartis Vaccines & Diagnostic | vacinação múltipla que inclui meningococo do sorogrupo c |
EP1922546B1 (en) | 2005-09-05 | 2010-10-20 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Serum bactericidal assay for n. meningitidis specific antisera |
GB0524066D0 (en) | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Chiron Srl | 741 ii |
WO2007071786A2 (en) | 2005-12-23 | 2007-06-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conjugate vaccines |
NZ572054A (en) | 2006-03-22 | 2011-12-22 | Novartis Ag | Regimens for immunisation with meningococcal conjugates |
TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
WO2007127668A2 (en) | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Wyeth | Novel processes for coating container means which inhibit precipitation of polysaccharide-protein conjugate formulations |
JP5275983B2 (ja) | 2006-06-12 | 2013-08-28 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ワクチン |
GB0612854D0 (en) | 2006-06-28 | 2006-08-09 | Novartis Ag | Saccharide analysis |
CN101479293A (zh) | 2006-06-29 | 2009-07-08 | 诺华有限公司 | 脑膜炎奈瑟球菌多肽 |
SG174013A1 (en) | 2006-07-27 | 2011-09-29 | Wyeth Corp | High-cell density fed-batch fermentation process for producing recombinant protein |
AR064642A1 (es) * | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
GB0700562D0 (en) | 2007-01-11 | 2007-02-21 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Modified Saccharides |
JP5637848B2 (ja) | 2007-06-04 | 2014-12-10 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎ワクチンの製剤化 |
GB0713880D0 (en) | 2007-07-17 | 2007-08-29 | Novartis Ag | Conjugate purification |
GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
EP2185576A4 (en) | 2007-08-02 | 2011-01-12 | Childrens Hosp & Res Ct Oak | FHBP- AND LPXL1-BASED VESICIUM VACCINES FOR BROADBAND PROTECTION AGAINST NEISSERIA MENINGITIDIS-RELATED DISEASES |
JP5701058B2 (ja) | 2007-10-19 | 2015-04-15 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎菌ワクチン処方物 |
EP2589392B1 (en) | 2008-03-05 | 2016-11-30 | Sanofi Pasteur | Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition |
EP2631245A1 (en) | 2008-03-10 | 2013-08-28 | Children's Hospital & Research Center at Oakland | Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use |
EP2297578A2 (en) | 2008-05-19 | 2011-03-23 | Novartis AG | Vaccine assays |
BRPI0913268A2 (pt) | 2008-05-30 | 2016-03-15 | U S A As Represented By The Secretary Of The Army On Behalf Of Walter Reed Army | vacina de vesícula de membrana externa nativa multivalente meningocócica, métodos de fabricação e uso da mesma |
WO2010027872A1 (en) | 2008-08-27 | 2010-03-11 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Complement factor h-based assays for serum bactericidal activity against neisseria meningitidis |
AU2009288095A1 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Peptides presenting an epitope of a domain of factor H binding protein and methods of use |
IT1394288B1 (it) | 2008-09-12 | 2012-06-06 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogeni di proteine che legano il fattore h. |
US9393304B2 (en) | 2008-10-29 | 2016-07-19 | Ablynx N.V. | Formulations of single domain antigen binding molecules |
GB0822634D0 (en) | 2008-12-11 | 2009-01-21 | Novartis Ag | Meningitis vaccines |
AU2009329193A1 (en) | 2008-12-17 | 2011-07-14 | Novartis Ag | Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor |
NZ595234A (en) | 2009-03-24 | 2013-12-20 | Novartis Ag | Adjuvanting meningococcal factor h binding protein |
CA2756533A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Novartis Ag | Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates |
WO2010127172A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Chimeric factor h binding proteins (fhbp) and methods of use |
US9365885B2 (en) | 2009-06-16 | 2016-06-14 | Puiying Annie Mak | High-throughput complement-mediated antibody-dependent and opsonic bactericidal assays |
AU2010302344A1 (en) | 2009-09-30 | 2012-04-26 | Novartis Ag | Expression of meningococcal fhbp polypeptides |
GB0917647D0 (en) | 2009-10-08 | 2009-11-25 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Expression system |
BR112012010531A2 (pt) | 2009-10-27 | 2019-09-24 | Novartis Ag | "polipeptídeos de modificação meningocócica fhbp" |
WO2011080595A2 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Novartis Ag | Polysaccharide immunogens conjugated to e. coli carrier proteins |
GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
CN102869377A (zh) | 2010-03-10 | 2013-01-09 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
CN102802662A (zh) | 2010-03-18 | 2012-11-28 | 诺华有限公司 | 用于脑膜炎球菌血清组b的含佐剂疫苗 |
ES2910199T3 (es) | 2010-03-30 | 2022-05-11 | Childrens Hospital & Res Center At Oakland | Proteínas de unión al factor H (fHbp) con propiedades alteradas y métodos de uso de las mismas |
EP2585106A1 (en) | 2010-06-25 | 2013-05-01 | Novartis AG | Combinations of meningococcal factor h binding proteins |
ES2850973T3 (es) | 2010-08-23 | 2021-09-01 | Wyeth Llc | Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis |
ES2744471T3 (es) | 2010-09-04 | 2020-02-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Ensayos de anticuerpos bactericidas para evaluar la inmunogenia y la potencia de vacunas de sacárido capsular meningocócico |
CA2810971C (en) | 2010-09-10 | 2020-11-03 | Novartis Ag | Developments in meningococcal outer membrane vesicles |
US20120070457A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-22 | J. Craig Venter Institute, Inc. | Polypeptides from neisseria meningitidis |
GB201015132D0 (en) | 2010-09-10 | 2010-10-27 | Univ Bristol | Vaccine composition |
WO2012032489A1 (en) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
GB201101665D0 (en) | 2011-01-31 | 2011-03-16 | Novartis Ag | Immunogenic compositions |
NZ628449A (en) | 2012-03-09 | 2016-04-29 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
JP2016519160A (ja) * | 2013-05-22 | 2016-06-30 | パール セラピューティクス,インコーポレイテッド | 3つ以上の活性薬剤を呼吸性送達するための組成物、方法、及びシステム |
CA2923129C (en) | 2013-09-08 | 2020-06-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
-
2013
- 2013-03-06 NZ NZ628449A patent/NZ628449A/en unknown
- 2013-03-06 KR KR1020167003874A patent/KR20160022402A/ko not_active IP Right Cessation
- 2013-03-06 CA CA2865745A patent/CA2865745C/en active Active
- 2013-03-06 EP EP22154276.4A patent/EP4043029A1/en active Pending
- 2013-03-06 SG SG11201404730XA patent/SG11201404730XA/en unknown
- 2013-03-06 KR KR1020167020218A patent/KR101763625B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-06 CN CN201710129205.3A patent/CN107056901B/zh active Active
- 2013-03-06 CA CA2960030A patent/CA2960030C/en active Active
- 2013-03-06 SG SG10201602558UA patent/SG10201602558UA/en unknown
- 2013-03-06 CA CA3195971A patent/CA3195971A1/en active Pending
- 2013-03-06 KR KR1020177020887A patent/KR101784142B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-06 US US13/787,594 patent/US8986710B2/en active Active
- 2013-03-06 EP EP18207714.9A patent/EP3485906A1/en not_active Withdrawn
- 2013-03-06 MY MYPI2018001556A patent/MY198910A/en unknown
- 2013-03-06 BR BR112014021658A patent/BR112014021658A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-03-06 CN CN201610087738.5A patent/CN105693830B/zh active Active
- 2013-03-06 WO PCT/IB2013/051791 patent/WO2013132452A2/en active Application Filing
- 2013-03-06 BR BR122016004924-8A patent/BR122016004924A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-03-06 PE PE2014001352A patent/PE20142115A1/es active IP Right Grant
- 2013-03-06 PE PE2019000328A patent/PE20190458A1/es unknown
- 2013-03-06 KR KR1020147028160A patent/KR101716557B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-06 MX MX2017010632A patent/MX359256B/es unknown
- 2013-03-06 NZ NZ718108A patent/NZ718108A/en unknown
- 2013-03-06 SG SG10201911003QA patent/SG10201911003QA/en unknown
- 2013-03-06 JP JP2014560503A patent/JP5925342B2/ja active Active
- 2013-03-06 EP EP13718396.8A patent/EP2822583A2/en not_active Withdrawn
- 2013-03-06 MX MX2018011291A patent/MX2018011291A/es unknown
- 2013-03-06 MY MYPI2014702517A patent/MY167723A/en unknown
- 2013-03-06 KR KR1020167020217A patent/KR101784644B1/ko active IP Right Grant
- 2013-03-06 CA CA3066792A patent/CA3066792C/en active Active
- 2013-03-06 MX MX2014010156A patent/MX351993B/es active IP Right Grant
- 2013-03-06 RU RU2014136401A patent/RU2665841C2/ru active
- 2013-03-06 CN CN201380021485.6A patent/CN104334187B/zh active Active
- 2013-03-06 AU AU2013229063A patent/AU2013229063B2/en active Active
- 2013-03-08 TW TW106141437A patent/TWI616455B/zh active
- 2013-03-08 TW TW104131508A patent/TWI605827B/zh active
- 2013-03-08 TW TW104131506A patent/TWI600662B/zh active
- 2013-03-08 TW TW105134379A patent/TWI627181B/zh active
- 2013-03-08 TW TW102108333A patent/TWI570133B/zh active
- 2013-03-11 AR ARP130100772A patent/AR090294A1/es not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-08-20 PH PH12014501887A patent/PH12014501887A1/en unknown
- 2014-09-08 CO CO14198149A patent/CO7061042A2/es unknown
- 2014-09-09 IL IL234555A patent/IL234555B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-01-23 US US14/604,620 patent/US9561269B2/en active Active
- 2015-07-30 HK HK15107296.9A patent/HK1206625A1/xx unknown
- 2015-09-28 JP JP2015190399A patent/JP6250008B2/ja active Active
-
2016
- 2016-05-25 IL IL245852A patent/IL245852B/en active IP Right Grant
- 2016-08-15 US US15/237,005 patent/US9724402B2/en active Active
- 2016-09-19 AU AU2016228316A patent/AU2016228316B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-13 RU RU2017104529A patent/RU2739504C2/ru active
- 2017-08-04 AU AU2017210600A patent/AU2017210600B2/en active Active
-
2018
- 2018-06-19 IL IL260135A patent/IL260135B/en active IP Right Grant
- 2018-07-13 PH PH12018501517A patent/PH12018501517A1/en unknown
-
2019
- 2019-06-24 AU AU2019204425A patent/AU2019204425A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-06-03 IL IL275081A patent/IL275081B/en unknown
-
2021
- 2021-03-18 AU AU2021201721A patent/AU2021201721B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-08 AR ARP220100904A patent/AR125327A2/es unknown
- 2022-04-08 AR ARP220100903A patent/AR125326A2/es unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2223492C2 (ru) * | 1998-10-09 | 2004-02-10 | Чирон Корпорейшн | БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ neisseria meningitidis (ВАРИАНТЫ), ЕГО ФРАГМЕНТ, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ), ЗОНД, ПРАЙМЕР, КОМПОЗИЦИЯ |
WO2009104097A2 (en) * | 2008-02-21 | 2009-08-27 | Novartis Ag | Meningococcal fhbp polypeptides |
WO2011024072A2 (en) * | 2009-08-27 | 2011-03-03 | Novartis Ag | Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
SEQ ID NO: 76 из WO 2009104097. * |
база данных EPO Proteins: * |
база данных EPO Proteins: HC000003, 22.09.2009, SEQ ID NO: 76 из WO 2009104097. * |
база данных UniProtKB: C0JF81, 05.05.2009. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2021201721B2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof | |
US11472850B2 (en) | Neisseria meningitidis composition and methods thereof | |
RU2776310C2 (ru) | Композиции neisseria meningitidis и способы их применения | |
NZ747917B2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof | |
NZ731330B2 (en) | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |