KR101784142B1 - 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

수막염균 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 71과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 수막염균(Neisseria meningitidis) 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 수막염균 혈청군으로부터의 하나 이상의 접합된 캡슐 사카라이드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

수막염균 조성물 및 이의 사용 방법{NEISSERIA MENINGITIDIS COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF}
본 발명은 수막염균(Neisseria meningitidis) 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호참고
본원은 2012년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제61/609,257호(이는 본원에 참고로 그의 전체가 혼입됨)를 우선권 주장한다.
수막염균은 패혈증, 뇌수막염 및 사망을 야기할 수 있는 그람 음성 캡슐화된 세균이다. 수막염균은 화학적 성질 및 항원성 면에서 구별되는 폴리사카라이드 캡슐을 기초로 약 13개의 혈청군(혈청군 A, B, C, E29, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z)으로 분류될 수 있다. 상기 혈청군 중 5개의 혈청군(A, B, C, Y 및 W135)은 대다수의 질환의 원인이다.
수막염균성 뇌수막염(meningococcal meningitis)은 항생제의 이용가능성에도 불구하고 수시간 이내에 소아 및 청소년을 사망시킬 수 있는 치명적인 질환이다. 수막염균 혈청군 A, B, C, Y 및 W135 및/또는 X에 대한 개선된 면역원성 조성물에 대한 필요성이 있다.
이들 필요성 및 다른 필요성을 충족시키기 위해, 본 발명은 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 71과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 이때 상기 서열의 처음 20개 아미노산 잔기는 시스테인을 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 1 내지 184의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 158 내지 185의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 159 내지 186의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 185 내지 254의 아미노산 서열로부터의 6개 이상의 인접 아미노산을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 비-피루빌화(non-pyruvylating)되어 있다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 비-지질화(non-lipidating)되어 있다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 면역원성을 갖는다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 서열로 구성된 아미노산 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 76과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 이때 상기 서열의 처음 20개 아미노산 잔기는 시스테인을 함유하지 않는다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 비-피루빌화되어 있다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 비-지질화되어 있다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 면역원성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술된 실시양태들 중 임의의 실시양태의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 실시양태들 중 임의의 실시양태의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 서열은 서열번호 72를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드(capsular saccharide)의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 2개 이상의 접합체를 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 3개 이상의 접합체를 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서브패밀리 A 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서브패밀리 B 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A12이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A22이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B01이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B22이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B24이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71 및 서열번호 75로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균 혈청군 C에 대한 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열, 또는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드의 위치 1의 시스테인은 결실되어 있다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 추가로 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균 혈청군 Y에 대한 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열, 또는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드의 위치 1의 시스테인은 결실되어 있다. 추가 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 추가로 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
또 다른 양태에서, 본 발명은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 수막염균에 대한 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체; b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체; c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
본 발명은 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다.
도 1은 P2086 변이체 핵산 서열을 보여준다.
도 2는 P2086 변이체 아미노산 서열을 보여준다. 각각의 변이체의 N-말단 꼬리에서 Gly/Ser 줄기(stalk)가 밑줄로 표시되어 있다.
도 3은 ORF2086 단백질의 구조를 보여준다.
도 4는 N-말단 Cys의 제거가 에스케리치아 콜라이(또는 이. 콜라이: Escherichia coli)에서 발현의 손실을 초래한다는 것을 보여준다.
도 5는 비-지질화된 ORF2086 변이체 발현에 대한 Gly/Ser 줄기 길이의 효과를 보여준다. B01로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 35에 기재되어 있다. B44로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 36에 기재되어 있다. A05로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 37에 기재되어 있다. A22로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 38에 기재되어 있다. B22로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 39에 기재되어 있다. A19로 표지된 단백질 변이체와 관련된 서열은 서열번호 40에 기재되어 있다.
도 6은 짧은 Gly/Ser 줄기에도 불구하고 높은 수준의 비-지질화된 B09 발현을 보여준다. 좌측 2개의 레인은 유도 전 및 후 N-말단 Cys-결실된 B09 변이체의 발현을 입증한다. 제3 및 제4 레인은 유도 전 및 후 N-말단 Cys 양성 B09 변이체의 발현을 입증한다. 가장 우측 레인은 분자량 표준물이다. 사진 아래에 제시된 아미노산 서열은 서열번호 41에 기재되어 있다. 이 도면에서 "A22_001"로서 지칭된 N-말단 Cys-결실된 A22 변이체를 대표하는 뉴클레오티드 서열은 이 도면에서 서열번호 41의 아래에 제시된 서열번호 42에 기재되어 있다. 이 도면에서 "B22_001"로서 지칭된 N-말단 Cys-결실된 B22 변이체를 대표하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52에 기재되어 있다. 이 도면에서 "B09_004"로서 지칭된 N-말단 Cys-결실된 B09 변이체를 대표하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 53에 기재되어 있다.
도 7은 코돈 최적화가 비-지질화된 B22 및 A22 변이체들의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 좌측 패널은 IPTG 유도 전(레인 1 및 3) 및 후(레인 2 및 4) N-말단 Cys-결실된 B22 변이체의 발현을 입증한다. 우측 패널은 IPTG 유도 전(레인 7) 및 후(레인 8) N-말단 Cys-결실된 A22 변이체의 발현을 입증한다. 레인 5 및 6은 분자량 표준물이다.
도 8은 P2086 변이체 핵산 및 아미노산 서열을 보여준다.
도 9a 및 9b는 실시예 15 내지 19에서 논의되어 있는 선택된 야생형 서브패밀리 A 및 B fHBP 변이체들의 서열 정렬을 보여준다. A62의 N-말단은 B09와 100% 동일하고 그의 C-말단은 A22와 100% 동일하다는 것을 주목한다. 제시된 서열들은 A05(서열번호 13); A12(서열번호 14); A22(서열번호 15); A62(서열번호 70); B09(서열번호 18); B24(서열번호 20); 및 컨센서스(서열번호 78)이다.
서열번호
서열번호 1에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A04 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 2에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 3은 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A12 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 4에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A12-2 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 5에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 6에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B02 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 7에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B03 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 8에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 9에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 10에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B24 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 11에는 N-말단 Cys을 코딩하는 코돈을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 12에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A04에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 13에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 14에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A12에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 15에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 16에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B02에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 17에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B03에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 18에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 19에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 20에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B24에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 21에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 22에는 실시예 2에 제시되어 있는, 정방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 23에는 실시예 2에 제시되어 있는, 역방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 24에는 실시예 2의 표 1에 제시되어 있는, 정방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 25에는 실시예 2의 표 1에 제시되어 있는, 역방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 26에는 실시예 2의 표 1에 제시되어 있는, 정방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 27에는 실시예 2의 표 1에 제시되어 있는, 역방향 프라이머에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 28에는 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 29에는 예를 들면, 서열번호 28에 의해 코딩되는, 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 30에는 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 31에는 예를 들면, 서열번호 30에 의해 코딩되는, 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 32에는 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 33에는 예를 들면, 서열번호 32 및 서열번호 34에 의해 코딩되는, Gly/Ser 줄기에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 34에는 실시예 4에 제시되어 있는, Gly/Ser 줄기에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 35에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B01의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 36에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 37에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 38에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 39에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 40에는 도 5에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A19의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 41에는 도 6에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체의 N-말단에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 42에는 도 6에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22의 N-말단에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 43에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44 유전자에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 11에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다. 플라스미드 pDK087은 서열번호 43을 포함한다.
서열번호 44에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 44는 서열번호 21과 동일하되, 서열번호 21의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다. 서열번호 44는 예를 들면, 서열번호 43에 의해 코딩된다.
서열번호 45에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 8에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있고 상기 서열이 추가 Gly/Ser 영역을 코딩하는 코돈을 포함한다. 플라스미드 pEB063은 서열번호 45를 포함한다.
서열번호 46에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 8에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다. 플라스미드 pEB064는 서열번호 46을 포함한다.
서열번호 47에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09 유전자에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 8에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다. 플라스미드 pEB065는 서열번호 47을 포함한다.
서열번호 48에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 8에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다. 플라스미드 pLA134는 서열번호 48을 포함한다.
서열번호 49에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 49는 서열번호 18과 동일하되, 서열번호 18의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다. 서열번호 49는 예를 들면, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해 코딩된다.
서열번호 50에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 18에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있고 상기 서열이 추가 Gly/Ser 영역을 코딩하는 코돈을 포함한다. 서열번호 50은 예를 들면, 서열번호 45에 의해 코딩된다.
서열번호 51에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B44 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 11에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다. 플라스미드 pLN056은 서열번호 51을 포함한다.
서열번호 52에는 도 6에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22의 N-말단에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 53에는 도 6에 제시되어 있는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B09의 N-말단에 대한 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 54에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05 유전자에 대한 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 2에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다.
서열번호 55에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 55는 서열번호 13과 동일하되, 서열번호 13의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다. 서열번호 55는 예를 들면, 서열번호 54에 의해 코딩된다.
서열번호 56에는 실시예 7에 제시되어 있는, 세린-글리신 반복부 서열의 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 57에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B01에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 57은 서열번호 58과 동일하되, 서열번호 58의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다.
서열번호 58에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B01에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 59에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B15에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 60에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B16에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 61에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22에 대한 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 19의 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys에 대한 코돈이 글리신에 대한 코돈으로 치환되어 있다.
서열번호 62에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 19의 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys이 글리신으로 치환되어 있다.
서열번호 63에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22에 대한 DNA 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 15의 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys에 대한 코돈이 글리신에 대한 코돈으로 치환되어 있다.
서열번호 64에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있고, 이때 서열번호 15의 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys이 글리신으로 치환되어 있다.
서열번호 65에는 비-지질화된 및 비-피루빌화된 A05 폴리펩티드를 코딩하는 코돈-최적화된 DNA 서열(pEB042)이 기재되어 있다.
서열번호 66에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A12에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 66은 서열번호 14와 동일하되, 서열번호 14의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다. 서열번호 66은 예를 들면, 서열번호 67에 의해 코딩된다.
서열번호 67에는 비-지질화된 및 비-피루빌화된 A12 폴리펩티드에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 68에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 68은 서열번호 15와 동일하되, 서열번호 15의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다. 서열번호 68은 예를 들면, 서열번호 69에 의해 코딩된다.
서열번호 69에는 비-지질화된 및 비-피루빌화된 A22 폴리펩티드에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 70에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A62에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 71에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A62에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 71은 서열번호 70과 동일하되, 서열번호 70의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다.
서열번호 72에는 서열번호 71에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열이 기재되어 있다.
서열번호 73에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05 유전자에 대한 코돈-최적화된 DNA 서열(pDK086)이 기재되어 있고, 이때 서열번호 2에 비해 N-말단 시스테인을 코딩하는 코돈이 결실되어 있다.
서열번호 74에는 아미노산 위치 1에서 N-말단 Cys을 포함하는, 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A29에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 75에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B22에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 75는 서열번호 19와 동일하되, 서열번호 19의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다.
서열번호 76에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 77에는 비-지질화된 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 A05에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 77은 서열번호 19와 동일하되, 서열번호 76의 위치 1의 N-말단 시스테인이 존재하지 않는다.
서열번호 78에는 도 9a 및 9b에 제시된 컨센서스 서열에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다.
서열번호 79는 서열번호 78의 위치 1의 Cys이 존재하지 않는다는 점을 제외하고 서열번호 78과 동일하다.
서열번호 80에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B24에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 80은 서열번호 20과 동일하되, 서열번호 20의 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있다.
서열번호 81에는 수막염균 혈청군 B의 2086 변이체 B24에 대한 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열번호 81은 서열번호 20과 동일하되, 서열번호 20의 위치 1 내지 3의 잔기가 결실되어 있다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사한 또는 균등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 후술되어 있다. 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이고, 한정하기 위한 것이 아니다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 다른 문헌은 전체적으로 참고로 도입된다.
정의
용어 "항원"은 동족 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 생물학적 분자, 통상적으로 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질 또는 접합체를 지칭하거나; 일부 경우 동물에서 항체의 생성 또는 T 세포 반응, 또는 이들 둘다를 자극할 수 있는 면역원성 물질(동물 내로 주사되거나 흡수되는 조성물을 포함함)을 지칭한다. 면역 반응은 전체 분자에 대해 발생될 수 있거나, 분자의 하나 이상의 다양한 부분들(예를 들면, 에피토프 또는 햅텐)에 대해 발생될 수 있다. 상기 용어는 개별 분자를 지칭하는 데에 사용될 수 있거나, 항원성 분자의 균질한 또는 불균질한 집단을 지칭하는 데에 사용될 수 있다. 항원은 항체, T 세포 수용체, 또는 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역의 다른 요소에 의해 인식된다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프들을 포함한다. 주어진 항원의 에피토프는 당분야에서 잘 공지되어 있는 임의의 수의 에피토프 맵핑 기법의 이용을 통해 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J.)을 참조한다. 예를 들면, 선형 에피토프는 예를 들면, 단백질 분자의 부분에 상응하는 많은 수의 펩티드들을 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고 상기 펩티드들이 여전히 상기 지지체에 부착되어 있는 동안 상기 펩티드들을 항체와 반응시킴으로써 확인될 수 있다. 이러한 기법은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,708,871호; 문헌(Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002); 및 문헌(Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715)에 기재되어 있다. 유사하게, 입체구조형 에피토프는 예를 들면, X-선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명으로 아미노산의 공간적 입체구조를 결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌(Epitope Mapping Protocols)을 참조한다. 나아가, 본 발명의 목적을 위해, 단백질이 면역 반응을 이끌어내는 능력을 유지하는 한, "항원"은 천연 서열에 대한 변경, 예컨대, 결실, 추가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만, 비-보존적 치환일 수 있음)을 포함하는 단백질을 지칭하는 데에도 사용될 수 있다. 이들 변경은 부위-지정된 돌연변이유발, 특정 합성 절차 또는 유전공학적 방법을 통한 의도적 변경일 수 있거나, 예컨대, 항원을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적 변경일 수 있다. 나아가, 항원은 미생물, 예를 들면, 세균으로부터 유래될 수 있거나, 수득될 수 있거나 단리될 수 있거나; 전체 유기체일 수 있다. 유사하게, 예컨대, 핵산 면역화 적용에서 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드도 이 정의에 포함된다. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹 에피토프 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원도 포함된다(Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28 - Jul. 3, 1998).
용어 "보존적" 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성을 기초로 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비-극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성/중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 변화는 ORF2086 폴리펩티드의 1차 서열을 변경시키지만, 이 분자의 기능을 변경시키지는 않는다. 이들 돌연변이체를 발생시킬 때, 아미노산의 소수성 지수를 고려할 수 있다. 상호활성 생물학적 기능을 폴리펩티드에 부여하는 데에 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 당분야에서 일반적으로 이해되어 있다(Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157(1):105 32). 특정 아미노산이 유사한 소수성 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다는 것은 공지되어 있다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특성을 기초로 소수성 지수를 배정받았다. 이들 지수는 다음과 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
아미노산 잔기의 상대적인 소수성 특성은 발생된 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 결정하고, 이 2차 및 3차 구조는 폴리펩티드와 다른 분자, 예컨대, 효소, 기질, 수용체, 항체, 항원 등의 상호작용을 한정한다. 아미노산이 유사한 소수성 지수를 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 기능적으로 균등한 폴리펩티드를 수득할 수 있다는 것은 당분야에서 공지되어 있다. 이러한 변화에서, 소수성 지수가 +/-2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, 소수성 지수가 +/-1 이내에 있는 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, 소수성 지수가 +/-0.5 이내에 있는 아미노산의 치환이 훨씬 더 특히 바람직하다.
보존적 아미노산 치환 또는 삽입은 친수성을 기초로 만들어질 수도 있다. 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,554,101호에 기재된 바와 같이, 그의 인접 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는, 폴리펩티드의 가장 큰 국소 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원성, 즉 폴리펩티드의 생물학적 성질과 상관관계를 갖는다. 미국 특허 제4,554,101호는 하기 친수성 값이 아미노산 잔기들에 배정되었다고 언급한다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 프롤린(-0.5±1); 쓰레오닌(-0.4); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산이 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 생물학적으로 균등한, 특히 면역학적으로 균등한 폴리펩티드를 수득할 수 있다는 것이 이해된다. 이러한 변화에서, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 치환이 바람직하고, 친수성 값이 ±1 이내에 있는 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, 친수성 값이 ±0.5 이내에 있는 아미노산의 치환이 훨씬 더 특히 바람직하다. 다양한 상기 특징들을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 쓰레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효 면역원성 양"은 척추동물 숙주에서 면역 반응을 이끌어내는 데에 효과적인 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 양을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 rLP2086 단백질의 유효 면역원성 양은 척추동물 숙주에서 면역 반응을 이끌어내는 데에 효과적인 양이다. 구체적인 "유효 면역원성 복용량 또는 양"은 숙주의 연령, 체중 및 의학적 상태뿐만 아니라 투여 방법에 의해서도 좌우될 것이다. 적합한 용량은 당업자에게 의해 용이하게 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Gly/Ser 줄기"는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 Cys 잔기의 바로 하류에 있는 일련의 Gly 및 Ser 잔기를 지칭한다. Gly/Ser 줄기에는 5개 내지 12개의 Gly 및 Ser 잔기가 존재할 수 있다. 따라서, Gly/Ser 줄기는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 2부터 아미노산 7 내지 13까지 걸쳐 있다. 바람직하게는, Gly/Ser 줄기는 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 2부터 최대 아미노산 7 내지 13까지 걸쳐 있다. 본 발명의 P2086 변이체의 Gly/Ser 줄기는 도 2에서 밑줄로 표시된 서열(서열번호 12 내지 21)로 표시되어 있다. 본원에서 밝혀진 바와 같이, Gly/Ser 줄기의 길이는 비-지질화된 P2086 변이체의 안정성 또는 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다. 예시적인 실시양태에서, Gly/Ser 줄기의 길이에 영항을 미치는 것으로부터의 효과는 상응하는 야생형 변이체로부터의 효과와 비교된다.
용어 "면역원성"은 체액성 또는 세포 매개 면역 반응, 또는 이들 둘다를 이끌어내는 항원 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "면역원성 양", "면역학적 효과량" 또는 "용량"은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있는 표준 분석에 의해 측정될 때 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응, 또는 이들 둘다인 면역 반응을 이끌어내기에 충분한 항원 또는 면역원성 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "면역원성 조성물"은 항원, 예를 들면, 미생물 또는 이의 성분을 함유하는 임의의 약학 조성물로서, 대상체에서 면역 반응을 이끌어내는 데에 사용될 수 있는 약학 조성물을 지칭한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 전신 경피 또는 점막 경로를 통해 이 면역원성 조성물을 투여함으로써 수막염균 감염에 민감한 인간을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내(i.m.), 복강내(i.p.), 피내(i.d.) 또는 피하 경로를 통한 주사; 패치 또는 다른 경피 전달 장치에 의한 적용; 또는 구강/소화관, 호흡관 또는 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신의 제조에 사용될 수 있거나, 대상체를 수동적으로 보호하거나 치료하는 데에 사용될 수 있는 다중클론 또는 단일클론 항체의 유도에 사용될 수 있다.
특정 면역원성 조성물을 위한 성분의 최적 양은 대상체에서 적절한 면역 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 1회의 부스터 면역화 또는 적절하게 간격을 둔 수회의 부스터 면역화를 제공받을 수 있다.
용어 "단리된"은 물질이 그의 원래의 환경(예를 들면, 물질이 천연 발생 물질인 경우 천연 환경, 또는 물질이 재조합 물질인 경우 그의 숙주 유기체)으로부터 제거되어 있거나, 한 환경으로부터 상이한 환경으로 이동되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, "단리된" 단백질 또는 펩티드는 단백질의 기원이 되는 세포 또는 조직 공급원으로부터 유래된 세포 물질 또는 다른 오염 단백질을 실질적으로 갖지 않거나, 화학적으로 합성될 때 존재하거나 화학 반응의 일부로서 혼합물에 존재하는 화학 전구체 또는 다른 화합물을 실질적으로 갖지 않는다. 본 발명에서, 단백질은 면역원성 조성물의 제조에 유용한 형태로 제공되도록 세균 세포 또는 세포 데브리스로부터 단리될 수 있다. 용어 "단리된" 또는 "단리하는"은 예를 들면, 단백질의 정제 방법을 포함하는, 본원에 기재된 "정제하는" 또는 "정제"를 포함할 수 있다. 표현 "세포 물질을 실질적으로 갖지 않는"은 폴리펩티드 또는 단백질의 단리 및/또는 재조합 제조에 사용된 세포의 세포 성분으로부터 분리되어 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질을 실질적으로 갖지 않는 단백질 또는 펩티드는 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만의 오염 단백질, 폴리사카라이드 또는 다른 세포 물질을 갖는 캡슐 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드의 제제를 포함한다. 또한, 폴리펩티드/단백질은 재조합적으로 제조되는 경우 바람직하게는 배양 배지를 실질적으로 갖지 않는다(즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 차지한다). 폴리펩티드 또는 단백질은 화학적 합성에 의해 제조되는 경우 바람직하게는 화학 전구체 또는 다른 화합물을 실질적으로 갖지 않는다(즉, 단백질 또는 폴리사카라이드의 합성에 관여하는 화학 전구체 또는 다른 화합물로부터 분리되어 있다). 따라서, 이러한 폴리펩티드 또는 단백질 제제는 관심있는 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드 단편 이외에 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만의 화학 전구체 또는 화합물을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "N-말단 꼬리"는 단백질을 세포막에 부착시키는, ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 부분을 지칭한다. N-말단 꼬리는 도 3의 측면도 구조의 바닥에 표시되어 있다. N-말단 꼬리는 전형적으로 ORF2086에 의해 코딩된 단백질의 N-말단 16개 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 꼬리는 서열번호 12 내지 21 중 어느 하나의 아미노산 1 내지 16이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ORF2086"은 네이세리아 종 세균의 개방 판독 프레임 2086을 지칭한다. 이 판독 프레임으로부터 코딩된 단백질인 네이세리아 ORF2086, 이 단백질의 단편 및 이 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호, 및 미국 특허출원공개 제20060257413호 및 제20090202593호(이들 각각은 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
용어 "P2086"은 일반적으로 ORF2086에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. "2086" 앞의 "P"는 "단백질"의 약어이다. 본 발명의 P2086 단백질은 지질화될 수 있거나 비-지질화될 수 있다. "LP2086" 및 "P2086"은 전형적으로 2086 단백질의 각각 지질화된 형태 및 비-지질화된 형태를 지칭한다. 본 발명의 P2086 단백질은 재조합 단백질일 수 있다. "rLP2086" 및 "rP2086"은 전형적으로 재조합 2086 단백질의 각각 지질화된 형태 및 비-지질화된 형태를 지칭한다. "2086"은 인자 H에 결합하는 그의 능력으로 인해 인자 H 결합 단백질(fHBP)로서도 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 및/또는 담체"는 인간 또는 다른 척추동물 숙주에 투여하기에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함하기 위한 것이다. 전형적으로, 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 및/또는 담체는 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 동물에서의 사용에 대해 연방정부 또는 주정부의 규제 관청 또는 다른 규제 관청에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열된 희석제, 부형제 및/또는 담체이다. 용어 "희석제", "부형제" 및/또는 "담체"는 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학 희석제, 부형제 및/또는 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 멸균 액체를 비롯한 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일일 수 있다. 물, 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 특히 주사가능한 용액을 위한 액체 희석제, 부형제 및/또는 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학 희석제 및/또는 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우 조성물은 소량의 습윤화제, 증량제, 유화제 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학 희석제, 부형제 및/또는 담체의 예는 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin)에 기재되어 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 적합한 희석제, 부형제 및/또는 담체는 당업자에게 명확할 것이고 주로 투여 경로에 의해 좌우될 것이다.
"보호" 면역은 감염으로부터 대상체를 보호하는 데에 기여하는 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 이끌어내는 면역원성 조성물의 능력을 지칭한다. 대상체, 예를 들면, 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받지 않은 감염된 동물의 대조군 집단에 비해 통계적으로 유의한 개선이 있는 경우, 제공된 보호가 절대적일 필요는 없다(즉, 감염이 완전히 예방되거나 박멸될 필요는 없다). 보호는 감염의 증상 발병의 중증도 또는 신속성을 경감시키는 것으로 한정될 수 있다. 일반적으로, "보호 면역 반응"은 대상체의 50% 이상에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 증가의 유도(각각의 항원에 대한 일정 수준의 측정가능한 기능성 항체 반응을 포함함)를 포함할 것이다. 특정 상황에서, "보호 면역 반응"은 대상체의 50% 이상에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 2배 증가 또는 4배 증가의 유도(각각의 항원에 대한 일정 수준의 측정가능한 기능성 항체 반응을 포함함)를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 옵소닌화 항체는 보호 면역 반응과 상관관계를 갖는다. 따라서, 보호 면역 반응은 혈청 살균 활성(SBA) 분석 또는 옵소닌식세포작용(opsonophagocytosis) 분석, 예를 들면, 후술된 분석에서 세균 수의 % 감소를 측정함으로써 분석될 수 있다. 이러한 분석들도 당분야에서 공지되어 있다. 수막염균 백신의 경우, 예를 들면, SBA 분석은 보호에 대한 확립된 대용 분석이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물의 부재 하에서의 세균 수에 비해 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세균 수 감소가 존재한다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 지칭하고 생성물의 최소 길이로 한정되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 이 정의에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘다가 이 정의에 포함된다. 상기 용어들은 바람직하게는, 단백질이 이 단백질을 투여받은 동물 내에서 면역 반응을 이끌어내는 능력을 유지하도록 천연 서열에 대한 변경, 예컨대, 결실, 추가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만, 비-보존적 치환일 수 있음)도 포함한다. 발현 후 변경, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 지질화, 인산화 등도 포함된다.
개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 활성 변이체 및 단편도 본원에 기재되어 있다. "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "변이체 폴리펩티드"는 천연 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하는 하나 이상의 아미노산의 변경에 의해 천연 단백질로부터 유도된 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 변경은 천연 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치하는 하나 이상의 아미노산의 결실(소위 절두); 천연 단백질의 하나 이상의 내부 부위에 위치하는 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 추가; 또는 천연 단백질의 하나 이상의 부위에 위치하는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성을 계속 보유한다(즉, 이들은 면역원성을 갖는다). 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 서열번호 1 내지 25 또는 39)의 변이체는 전형적으로 기준 서열과 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.
용어 "단편"은 특정된 수의 인접 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기들을 포함하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드의 단편은 전장 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유할 수 있으므로 면역원성을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 단편은 단백질의 생물학적 활성을 보유하여 면역원성을 갖는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 다르게는, PCR 프라이머로서 유용한 폴리뉴클레오티드의 단편은 일반적으로 생물학적 활성을 보유하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 단편은 약 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 175개, 200개, 225개, 250개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개 또는 1500개 이상의 인접 뉴클레오티드 또는 심지어 전장 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드 서열의 단편은 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 225개, 250개, 275개, 300개, 400개, 425개, 450개, 475개 또는 500개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있거나, 심지어 전장 폴리펩티드에 존재하는 전체 수의 아미노산을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 유전공학적 방법에 의해 제조된 임의의 단백질, 폴리펩티드, 또는 관심있는 유전자를 발현하는 세포를 지칭한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 대하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조된 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 단백질은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합"은 그의 기원 또는 조작에 의해, 천연 상태에서 그 자신과 회합되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되어 있지 않은 핵산 분자도 의미한다. 숙주 세포에 대하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 의미한다.
용어 "대상체"는 포유동물, 조류, 어류, 파충류 또는 임의의 다른 동물을 지칭한다. 용어 "대상체"는 인간도 포함한다. 용어 "대상체"는 가정 애완동물도 포함한다. 가정 애완동물의 비-한정적 예에는 개, 고양이, 돼지, 토끼, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 기니아 피그, 흰담비, 조류, 뱀, 도마뱀, 어류, 거북이 및 개구리가 포함된다. 용어 "대상체"는 가축 동물도 포함한다. 가축 동물의 비-한정적 예에는 알파카, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 말, 라마, 노새, 당나귀, 양, 염소, 토끼, 순록, 야크, 닭, 거위 및 칠면조가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물, 예를 들면, 인간, 마우스, 래트, 비-인간 영장류를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
상호교환적으로 사용된 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 조성물을 지칭한다.
일반적인 설명
본 발명은 비-지질화된 P2086 변이체를 발현하는 데에 있어서 종래 미확인된 어려움도 확인하고 이들 어려움을 극복하고 신규 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 비-지질화된 P2086 변이체를 코딩하는 플라스미드 구축물이 상기 비-지질화된 변이체의 강한 발현을 제공하였지만, 이 변이체는 N-말단 Cys 상에서 피루빌화되어 있었다. 피루빌화는 폴리펩티드의 제조 일관성 또는 균일성의 가능성을 방해하거나 감소시킨다. 본 발명자들은 비-지질화된 P2086 변이체 서열로부터의 N-말단 Cys의 결실이 비-지질화된 P2086 변이체의 피루빌화를 피한다는 것도 발견하였다. N-말단 Cys에 대한 코돈의 결실로 피루빌화를 극복하고자 하는 시도는 발현을 방해하였거나 불용성 변이체의 발현을 초래하였다. 다르게는, 비-지질화된 P2086 변이체로부터의 N-말단 Cys의 제거는 일부 변이체들에서 발현을 감소시켰다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 적어도 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A12, A22, A62, B01, B09, B22 및 B44 변이체가 N-말단 Cys 잔기의 결실에도 불구하고 발현될 수 있다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 이들 폴리펩티드들은 상응하는 야생형 비-지질화된 서열에 비해 Cys 결실 이외의 추가 변경 없이 발현될 수 있었다. 예를 들면, 실시예 2 및 4를 참조한다. 나아가, 본 발명자들은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 변이체가 놀랍게도 면역원성을 갖고 예상외로 살균 항체를 이끌어낸다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 비-지질화된 변이체의 발현에 있어서 이들 어려움의 가능성을 극복하거나 감소시키는 2종의 방법들을 제공한다. 그러나, 추가 방법이 본 발명에 의해 고려된다. 제1 방법은 N-말단 Cys의 바로 하류에 위치하는, N-말단 꼬리 내의 Gly/Ser 줄기의 길이를 변화시키는 것이었다. 제2 방법은 N-말단 꼬리 내에서의 코돈 최적화이었다. 그러나, 추가 코돈의 최적화가 본 발명에 의해 고려된다. 이들 방법들은 가용성 비-지질화된 P2086 변이체의 향상된 발현을 제공한다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 가용성 비-지질화된 P2086 변이체의 향상된 발현은 상응하는 야생형 비-지질화된 변이체의 발현과 비교된다.
단리된 폴리펩티드
본 발명자들은 놀랍게도 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 발견하였다. 본 발명자들은 상기 폴리펩티드가 예상외로 면역원성을 갖고 살균 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 것도 발견하였다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-피루빌화된"은 피루베이트 함량을 갖지 않는 폴리펩티드를 지칭한다. 피루베이트 함량을 갖는 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 전형적으로 상응하는 야생형 폴리펩티드에 비해 +70의 질량 변동을 나타내었다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 질량 분광측정에 의해 측정될 때 상응하는 야생형 비-지질화된 폴리펩티드에 비해 +70의 질량 변동을 나타내지 않는다. 예를 들면, 실시예 10을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 N-말단 시스테인 잔기의 결실을 포함한다. 용어 "N-말단 시스테인"은 폴리펩티드의 N-말단 또는 N-말단 꼬리에 위치하는 시스테인(Cys)을 지칭한다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, "N-말단 시스테인"은 LP2086 지단백질이 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 트라이팔미토일 지질 꼬리로 지질화되는 N-말단 시스테인을 지칭한다. 예를 들면, 서열번호 12 내지 21 중 어느 한 서열번호를 기준 서열로서 지칭할 때, N-말단 시스테인은 위치 1에 위치한다. 또 다른 예로서, 서열번호 70을 기준 서열로서 지칭할 때, N-말단 시스테인은 위치 1에 위치한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드", "야생형 비-지질화된 2086 폴리펩티드" 또는 "야생형 비-지질화된 폴리펩티드"는 천연 상태에서 발견된 상응하는 성숙 지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 ORF2086 폴리펩티드를 지칭한다. 비-지질화된 분자와 지질화된 분자 사이의 유일한 차이점은 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드가 N-말단 시스테인에서 트라이팔미토일 지질 꼬리로 지질화되어 있지 않다는 점이다.
당분야에서 공지되어 있는 바와 같이, 비-지질화된 2086 형태는 원래의 리더 서열을 결여하는 단백질에 의해 생성되거나, 숙주 세포에서 지방산 아실화 부위를 특정하지 않는 서열의 부분으로 대체되어 있는 리더 서열에 의해 생성된다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호를 참조한다.
비-지질화된 ORF2086의 예에는 전술된 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드뿐만 아니라, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 12 내지 21 중 어느 한 서열번호에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12 내지 21 중 어느 한 서열번호에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 또 다른 예에는 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 70에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 70에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 44(B44), 서열번호 49(B09), 서열번호 55(A05), 서열번호 57(B01), 서열번호 58(B01), 서열번호 62(B22), 서열번호 64(A22) 및 서열번호 75(B22)로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된다. 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 66(A12), 서열번호 68(A22) 및 서열번호 71(A62)로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된다. 추가 예에는 서열번호 80(B24) 및 서열번호 81(B24)이 포함된다. 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 76 및 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열이 포함된다. 한 실시양태에서, 비-지질화된 폴리펩티드는 상응하는 비-지질화된 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 예시적인 실시양태에서, 비-지질화된 A62 폴리펩티드는 서열번호 71과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 예에는 도 2에 제시된 서열번호 12 내지 21, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60 중 어느 한 서열번호에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 또 다른 예에는 서열번호 70에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 이들 예시적인 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드들은 N-말단 Cys을 포함한다.
예를 들면, 본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" B44 폴리펩티드는 서열번호 21, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21 및 서열번호 44로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" B44 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" B44 폴리펩티드는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21, 및 서열번호 44로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 예로서, 본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" B09 폴리펩티드는 서열번호 18, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18, 서열번호 49 및 서열번호 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" B09 폴리펩티드는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" B09는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18, 서열번호 49 및 서열번호 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
추가 예로서, 본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" A05 폴리펩티드는 서열번호 13, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 및 서열번호 55로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-지질화된" A05 폴리펩티드의 또 다른 예에는 위치 1의 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. "비-지질화된" A05 폴리펩티드의 또 다른 예에는 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. "비-지질화된" A05 폴리펩티드의 또 다른 예에는 서열번호 77에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. "야생형 비-지질화된" A05는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A05는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 및 서열번호 55로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A05의 추가 예에는 위치 1의 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 13, 위치 1의 Cys이 결실되어 있는 서열번호 76, 위치 1의 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 76 및 서열번호 77로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" A62 폴리펩티드는 서열번호 70, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 70, 및 서열번호 71로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 비-지질화된 A62 폴리펩티드의 추가 예에는 위치 1의 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 70을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. "야생형 비-지질화된" A62 폴리펩티드는 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A62는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 70, 및 서열번호 71로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 폴리펩티드의 또 다른 예에는 위치 1의 N-말단 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는, "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A62는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" A12 폴리펩티드는 서열번호 14, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 14, 및 서열번호 66으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" A12 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A12는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 14, 및 서열번호 66으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-지질화된" A22 폴리펩티드는 서열번호 15, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 15, 서열번호 64 및 서열번호 68로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "야생형 비-지질화된" A22 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A22는 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 15, 서열번호 64 및 서열번호 68로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, "비-피루빌화된 및 비-지질화된" A22는 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 N-말단 Cys의 "결실"은 야생형 비-지질화된 폴리펩티드 서열에 비해 N-말단 Cys을 결실시키는 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, N-말단 Cys의 "결실"은 기준 서열, 예를 들면, 상응하는 야생형 서열로부터 아미노산 Cys을 제거함으로써, 상기 기준 서열에 비해 아미노산 잔기의 감소를 초래하는 것을 지칭한다. 달리 기재되어 있지 않은 한, 용어 "N-말단 Cys", "위치 1의 N-말단 Cys" 및 "위치 1의 Cys"은 상호교환적으로 사용된다.
또 다른 실시양태에서, N-말단 Cys은 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환된다. 예를 들면, 예시적인 실시양태에서, 서열번호 12 내지 21의 위치 1의 N-말단 Cys은 위치 1에서 C→G 치환을 포함한다. 예를 들면, 서열번호 19(B22 야생형)와 비교된 서열번호 62, 및 서열번호 15(A22 야생형)와 비교된 서열번호 64를 참조한다. N-말단 Cys을 치환시키는 예시적인 아미노산은 임의의 비-Cys 아미노산, 바람직하게는 비-하전된 극성 아미노산, 예를 들면, 글리신을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, Cys에 대한 비-보존적 잔기로 치환시킨다.
본 발명자들은 놀랍게도 N-말단 Cys 잔기의 결실을 갖는 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 발현이 질량 분광측정에 의해 측정될 때 상응하는 야생형 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 비해 검출가능한 피루빌화를 초래하지 않는다는 것을 발견하였다. 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 예에는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12(A04), 서열번호 13(A05), 서열번호 14(A12), 서열번호 15(A22), 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24), 서열번호 21(B44) 및 서열번호 70(A62)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 또 다른 예에는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 58(B01)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71 및 서열번호 75로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 서열번호 57(B01)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 또 다른 예에는 서열번호 77(A05)을 갖는 폴리펩티드, 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 76(A05)을 갖는 폴리펩티드, 및 위치 1의 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 76(A05)을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 추가 예에는 위치 1의 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12(A04), 서열번호 13(A05), 서열번호 14(A12), 서열번호 15(A22), 서열번호 58(B01), 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24), 서열번호 21(B44) 및 서열번호 70(A62)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 2086 폴리펩티드는 약 250개, 255개 또는 260개 이상의 연속 아미노산 내지 약 270개, 269개, 268개, 267개, 266개, 265개, 264개, 263개, 260개, 259개, 258개, 257개, 256개 또는 255개 이하의 연속 아미노산을 포함한다. 임의의 최소 값은 임의의 최대 값과 조합되어 범위를 한정할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 254개 또는 262개 이상의 연속 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 262개 이하의 연속 아미노산을 갖는다. 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 254개 이하의 연속 아미노산을 갖는다. 한 실시양태에서, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 폴리펩티드는 상응하는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 예시적인 실시양태에서, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 폴리펩티드는 서열번호 71과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드는 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 예시적인 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 조절 서열에 연결되어 있다.
적합한 발현 시스템, 조절 서열 및 세균 세포는 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드가 세균 세포에서 발현될 수 있는 한, 임의의 플라스미드 발현 벡터, 예를 들면, PET™(노보겐(Novogen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 PMAL™(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리 소재)이 사용될 수 있다. 바람직하게는, PET™ 벡터가 에스케리치아 콜라이에서의 재조합 단백질의 클로닝 및 발현을 위해 사용된다. PET™ 시스템에서, 클로닝된 유전자는 파지 T7 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다. 예시적인 세균 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 및 바람직하게는 에스케리치아 콜라이를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 방법에 의해 수득될 수 있는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 단리되어 있다. 또한, 본 발명은 방법에 의해 수득될 수 있는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 면역원성 조성물이다. 상기 방법은 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 58 및 서열번호 70으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 방법은 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 58 및 서열번호 70으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결되어 있다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71, 서열번호 57 및 서열번호 75로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43, 서열번호 51, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 45, 서열번호 54, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69 및 서열번호 72로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.
B09, B44, A05: 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 49(B09)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제1 단리된 폴리펩티드, 및 서열번호 44(B44)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드들은 면역원성을 갖는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 혈청군 B 수막염균으로부터의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드이다. 예시적인 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05이고, 이의 예에는 예를 들면, 위치 1의 N-말단 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 13, 및 서열번호 55가 포함된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 상기 조성물은 위치 1의 Cys이 결실되어 있는 서열번호 76, 위치 1의 Cys이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 76 및 서열번호 77로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 폴리펩티드를 포함한다.
폴리펩티드 도메인
또 다른 양태에서, 본 발명은 단리된 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 서열번호 21과 90% 초과의 동일성을 갖고 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인, 또는 이들의 조합물을 포함하는 서열을 포함하고 N-말단 시스테인을 결여하는 폴리펩티드를 세균 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 방법에 의해 제조된 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 면역원성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.
서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인, 또는 이들의 조합물을 포함하는 폴리펩티드의 예에는 서열번호 12(A04), 서열번호 13(A05), 서열번호 14(A12), 서열번호 15(A22), 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24) 및 서열번호 21(B44)이 포함된다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드들의 위치 1의 시스테인은 결실되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 위치 1의 시스테인은 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있다. 추가 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 62 및 서열번호 64를 포함한다. 또 다른 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 70 및 서열번호 71을 포함한다. 추가 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 76을 포함한다. 또 다른 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 77을 포함한다. 추가 예에는 서열번호 80(B24) 및 서열번호 81(B24)이 포함된다.
한 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 서열은 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함한다. 서열번호 21의 아미노산 13 내지 18, 서열번호 21의 아미노산 21 내지 34 및 서열번호 21의 아미노산 70 내지 80으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 포함하고, 서열번호 21의 아미노산 96 내지 116, 서열번호 21의 아미노산 158 내지 170, 서열번호 21의 아미노산 172 내지 185, 서열번호 21의 아미노산 187 내지 199, 서열번호 21의 아미노산 213 내지 224, 서열번호 21의 아미노산 226 내지 237 및 서열번호 21의 아미노산 239 내지 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 도메인 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하는 폴리펩티드의 예에는 서열번호 16(B02), 서열번호 17(B03), 서열번호 18(B09), 서열번호 19(B22), 서열번호 20(B24) 및 서열번호 21(B44)이 포함된다. 바람직하게는, 이들 폴리펩티드들의 위치 1의 시스테인은 결실되어 있다. 추가 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55 및 서열번호 62로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 폴리펩티드이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 면역원성 조성물에 관한 것이다.
폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
B09: 한 양태에서, 본 발명은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18, 또는 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 49를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 46을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 47을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 48을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48 및 서열번호 45로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 세균 세포에서 발현될 수 있는 플라스미드에 관한 것이다. 적합한 발현 시스템, 조절 서열 및 세균 세포는 전술된 바와 같이 당분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는, 세균 세포는 에스케리치아 콜라이이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 예시적인 실시양태에서, 서열번호 50은 서열번호 45에 의해 코딩된다.
B44: 또 다른 양태에서, 본 발명은 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21, 또는 서열번호 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 44를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43 및 서열번호 51로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 43이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 43을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
A05: 한 양태에서, 본 발명은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13(A05), 또는 서열번호 55에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 55를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 54, 서열번호 65 및 서열번호 73으로부터 선택된 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 65이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 54를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 65를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 73을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
A12: 또 다른 양태에서, 본 발명은 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 14(A12), 또는 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 66을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 67을 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 67을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
A22: 또 다른 양태에서, 본 발명은 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 15(A22), 또는 서열번호 68에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 68을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 69를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 69를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
A62: 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 71과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 이때 상기 서열의 처음 20개 아미노산 잔기는 시스테인을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 1 내지 184에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 비-지질화되어 있고 비-피루빌화되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 면역원성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 A62의 단편을 포함한다. A62의 예시적인 단편은 서열번호 70 또는 서열번호 71로부터의 임의의 수의 인접 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 158 내지 185의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 159 내지 186의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71의 위치 185 내지 254의 아미노산 서열로부터의 6개 이상의 인접 아미노산을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 71과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것으로서, 이때 상기 서열의 처음 20개 아미노산 잔기는 시스테인을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열로 구성된다. 한 실시양태에서, 상기 단리된 핵산 서열은 서열번호 72를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 70(A62), 또는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 서열번호 71을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 72를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 72를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
면역원성 조성물
바람직한 실시양태에서, 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기재된 조성물은 면역원성을 갖는다. 수막염균 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질을 포함하는 면역원성 조성물은 당분야에서 공지되어 있다. 예시적인 면역원성 조성물은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호, 및 미국 특허출원공개 제20060257413호 및 제20090202593호에 기재된 면역원성 조성물을 포함한다. 본원에 기재된 이러한 면역원성 조성물은 ORF2086 단백질로서 확인된 살균 활성을 나타내는 단백질 또는 이의 면역원성 부분, 및/또는 이의 생물학적 균등물을 포함한다. ORF2086 단백질은 네이세리아 종의 개방 판독 프레임 2086에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다.
상기 단백질은 재조합 단백질, 또는 천연 네이세리아 종으로부터 단리된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 네이세리아 ORF2086 단백질은 세균 균주, 예컨대, 수막염균(혈청군 A, B, C, D, W 135, X, Y, Z 및 29E), 네이세리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 락타미카(Neisseria lactamica)의 균주를 비롯한 네이세리아 종의 균주로부터 단리될 수 있을 뿐만 아니라 상기 단백질의 면역원성 부분 및/또는 생물학적 균등물일 수 있다.
ORF2086 단백질은 2086 서브패밀리 A 단백질, 서브패밀리 B 단백질, 이들의 면역원성 부분 및/또는 이들의 생물학적 균등물을 포함한다. 2086 서브패밀리 A 단백질 및 2086 서브패밀리 B 단백질은 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 상기 인용된 문헌(Fletcher et al., 2004) 및 문헌(Murphy et al., J Infect Dis. 2009 Aug 1;200(3):379-89) 참조). 2086 서브패밀리 A의 단백질과 관련된 대표적인 아미노산 서열들로서 서열번호 260 내지 278을 개시하는 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호도 참조한다. 추가로, 2086 서브패밀리 B의 단백질과 관련된 대표적인 아미노산 서열들로서 서열번호 279 내지 299는 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호에 개시되어 있다. 국제 특허출원공개 제WO2003/063766호는 전체적으로 본원에 참고로 도입된다. ORF2086 단백질 또는 이의 균등물 등은 지질화될 수 있거나 비-지질화될 수 있다. 바람직하게는, 네이세리아 ORF2086 단백질은 비-지질화되어 있다. 다르게는, 면역원성 조성물은 지질화된 ORF2086 단백질과 비-지질화된 ORF2086 단백질의 조합물일 수 있다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12, A62 또는 A22 변이체이다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A12 또는 A22 변이체이다.
서브패밀리 A 폴리펩티드들의 조합물: 한 실시양태에서, 상기 조성물은 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드들의 임의의 조합물을 포함한다. ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드들의 예시적인 조합물은 예를 들면, A05 및 A12; A05 및 A22; A05 및 A62; A12 및 A62; A12 및 A22; A22 및 A62; A05, A12 및 A22; A05, A12 및 A62; A12, A22 및 A62; 및 A05, A22 및 A62를 포함한다. 바람직하게는, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 비-지질화되어 있고 비-피루빌화되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B22 또는 B09 변이체이다.
서브패밀리 B 폴리펩티드들의 조합물: 한 실시양태에서, 조성물은 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드들의 임의의 조합물을 포함한다. ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드들의 예시적인 조합물은 예를 들면, B09 및 B22; B22 및 B44; B44 및 B09; B01 및 B09; B01 및 B22; B01 및 B44; B09, B22 및 B44; B09 및 B24; B22 및 B24; B24 및 B44; B01 및 B24; B02 및 B24; B02 및 B01; B02 및 B09; B02 및 B44; B01, B09 및 B24; 및 B01, B24 및 B44를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B44, 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B02, 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B03, 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B22, 서열번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B24, 서열번호 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B01 및 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B09 변이체로부터 선택된 서열, 또는 이들의 조합물이고, 이때 N-말단 Cys이 결실되어 있다.
보다 바람직하게는, 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 폴리펩티드, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 변이체, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 서열번호 49를 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09, 서열번호 44를 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 혈청군 B 수막염균으로부터의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로서, 이때 상기 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44이다. 상기 B44는 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호 44에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 혈청군 B 수막염균으로부터의 제2 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 이때 상기 제2 폴리펩티드는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09이다. 상기 B09는 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열, 또는 서열번호 49에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신이다.
또 다른 실시양태에서, 조성물은 3개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 2개 이하의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다.
추가 실시양태에서, 조성물은 최대 1종, 2종 또는 3종의 ORF2086 서브패밀리 B 변이체를 포함한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 최대 1종, 2종 또는 3종의 ORF2086 서브패밀리 A 변이체를 포함한다.
서브패밀리 B 폴리펩티드 및 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함하는 조성물: 한 실시양태에서, 이 조성물은 하나 이상의 ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 A05 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다. 보다 바람직하게는, A05 서브패밀리 A 폴리펩티드는 비-지질화되어 있고 비-피루빌화되어 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 A62 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다. 보다 바람직하게는, A62 서브패밀리 A 폴리펩티드는 비-지질화되어 있고 비-피루빌화되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 A 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질, 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서브패밀리 B 단백질과 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단리된 단백질을 포함한다.
바람직하게는, 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 A 단백질 및 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단리된 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는, 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드 및 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드를 포함한다.
조합물: ORF2086 폴리펩티드들의 임의의 조합물이 고려된다. 한 실시양태에서, 조성물은 서브패밀리 B 폴리펩티드의 부재 하에서 하나 이상의 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 서브패밀리 A 폴리펩티드만을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 서브패밀리 A 폴리펩티드의 부재 하에서 하나 이상의 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 서브패밀리 B 폴리펩티드만을 포함한다.
면역원성 조성물은 임의의 서브패밀리 A 폴리펩티드 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A05, A04, A12 또는 A22 변이체이다. 또 다른 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 A62를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 폴리펩티드는 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 A05, 서열번호 12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 A04, 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 A12 또는 서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 A22, 또는 이들의 임의의 조합물이고, 이때 N-말단 Cys이 결실되어 있다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 및 A62 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 예를 들면, 면역원성 조성물은 서열번호 55를 갖는 폴리펩티드 및 서열번호 71을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 추가 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 및 A12 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A12 및 A62 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다.
면역원성 조성물은 임의의 서브패밀리 B 폴리펩티드 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 B44, B02, B03, B22, B24 또는 B09 변이체이다. 바람직한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 단백질은 서열번호 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B44, 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B02, 서열번호 17에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B03, 서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B22, 서열번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B24 또는 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B09 변이체, 또는 이들의 조합물이고, 이때 N-말단 Cys이 결실되어 있다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 및 B44 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 추가 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 및 B22 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B22 및 B44 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 추가 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09, B22 및 B44 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 부재 하에서 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드 및 하나 이상의 지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 조성물은 지질화된 ORF2086 폴리펩티드의 부재 하에서 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 지질화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 서열번호 76을 갖는 지질화된 A05 폴리펩티드, 및 서열번호 77을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 조성물은 서열번호 76을 갖는 지질화된 A05 폴리펩티드, 및 서열번호 71을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62를 포함한다. 추가 예시적인 조성물은 서열번호 58을 갖는 지질화된 B01 폴리펩티드, 및 서열번호 71을 갖는 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62를 포함한다.
예시적인 조합물: 한 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-지질화된 A05, B09, B22 및 B44 ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 예를 들면, 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05(서열번호 55) 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드, 및 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09(서열번호 49), B22(서열번호 75) 및 B44(서열번호 44) 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 및 A12 서브패밀리 A ORF2086 폴리펩티드들과 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B22 및 B44 서브패밀리 B ORF2086 폴리펩티드들의 조합물을 포함한다. 추가 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A12, B09 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A12, A62, B09 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 추가 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A12, A62, B09 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 및 B09 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62, B09 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A62 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다. 또 다른 예시적인 면역원성 조성물은 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A62, B09 및 B44 폴리펩티드들을 포함한다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 1:1 비의 서브패밀리 A 단백질 대 서브패밀리 B 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 비들 중 어느 한 비의 서브패밀리 A 폴리펩티드 대 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함한다: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; 또는 1:10. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 하기 비들 중 어느 한 비의 서브패밀리 B 폴리펩티드 대 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함한다: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7; 1:8; 1:9; 또는 1:10.
살균 면역 반응
한 양태에서, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드 및 조성물은 포유동물에서 수막염균의 임의의 혈청군, 예컨대, 혈청군 A, B, C, E29, H, I, K, L, W135, X, Y 및 Z로부터 선택된 혈청군으로부터의 감염에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드 및 조성물은 포유동물에서 혈청군 A, B, C, W135, Y 및/또는 X로부터의 감염에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드 및 조성물은 포유동물에서 혈청군 B 수막염균으로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다. 상기 조성물은 포유동물에게 투여된 후 살균 항-수막염균 항체를 유도하는 능력을 갖고, 바람직한 실시양태에서 각각의 서브패밀리를 갖는 균주에 대한 살균성을 나타내는 항체를 유도할 수 있다. 살균 반응에 대한 추가 정보는 하기 제공되어 있다. 예를 들면, 실시예 6, 11, 12 및 13을 참조한다.
한 실시양태에서, 조성물은 수막염균 혈청군 B의 이종 서브패밀리에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다. 예를 들면, 비-지질화된 서브패밀리 A 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 수막염균 혈청군 B의 서브패밀리 A 변이체 및/또는 수막염균 혈청군 B의 서브패밀리 B 변이체에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 예를 들면, 실시예 18 및 19를 참조한다.
추가 양태에서, 본원에 기재된 단리된 폴리펩티드 및 조성물은 수막염균의 혈청군 A, 혈청군 B, 혈청군 C, 혈청군 W135 및/또는 혈청군 Y 균주 중 하나 이상에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 수막염균의 혈청군 B, 혈청군 C 및 혈청군 Y에 대한 살균 면역 반응을 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 21을 참조한다.
살균 항체는 인간에서 보호의 표시자이고, 임상전 연구는 대용 연구로서 이용되고, 본원에 기재된 임의의 신규 면역원성 조성물 후보자는 이들 기능성 항체들을 이끌어낼 것이다.
B09: 한 양태에서, 단리된 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균의 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 예시적인 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18을 갖거나 서열번호 49를 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균의 서브패밀리 A 또는 바람직하게는 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18), 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예시적인 실시양태에서, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18), 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 11, 12 및 13을 참조한다.
B44: 한 양태에서, 단리된 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21을 갖거나 서열번호 44를 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18), 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 11을 참조한다. 추가로, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B02 변이체(서열번호 16)에 결합하는 살균 항체도 이끌어낼 수 있다. 예를 들면, 실시예 12 및 13을 참조한다. 게다가, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 B03 변이체(서열번호 17) 및 B15 변이체(서열번호 59)에 결합하는 살균 항체도 이끌어낼 수 있다. 예를 들면, 실시예 6을 참조한다.
B22: 한 양태에서, 단리된 비-지질화된 B22 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 추가 예시적인 실시양태에서, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 19를 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B22 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B22 폴리펩티드는 B44 변이체(서열번호 21), B16 변이체(서열번호 60), B24 변이체(서열번호 20), B09 변이체(서열번호 18) 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 13을 참조한다.
A05: 한 양태에서, 단리된 비-지질화된 A05 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 한 실시양태에서, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13을 갖거나 서열번호 55를 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 한 실시양태에서, 단리된 A05 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 A05 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 A05 폴리펩티드는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), A22 변이체(서열번호 15), A12 변이체(서열번호 14), 또는 이들의 조합물에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 6 및 13을 참조한다.
A62: 한 양태에서, 단리된 비-지질화된 A62 폴리펩티드 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 한 실시양태에서, 단리된 A62 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 70을 갖거나 서열번호 71을 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A 및/또는 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62, 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), A12 변이체(서열번호 14), A22 변이체(서열번호 15) 및 A62 변이체(서열번호 70)에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 또 다른 예로서, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62, 및 이의 면역원성 조성물은 A29 변이체, B09 변이체 및 B24 변이체에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 18 및 19를 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62, 및 이의 면역원성 조성물은 B16 변이체에 대한 살균 항체를 이끌어낸다.
A12: 한 실시양태에서, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 14를 갖거나 서열번호 66을 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A12 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A 및/또는 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A12, 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), A22 변이체(서열번호 15), A12 변이체(서열번호 14), A62 변이체(서열번호 70), A29 변이체 및 B09 변이체에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 예를 들면, 실시예 18 및 19를 참조한다.
한 실시양태에서, N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 15를 갖거나 서열번호 68을 갖는 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A22 폴리펩티드, 및 이의 면역원성 조성물은 혈청군 B 수막염균 서브패밀리 A 및/또는 서브패밀리 B로부터의 ORF2086 폴리펩티드에 대한(예를 들면, 이러한 폴리펩티드에 결합할 수 있는) 살균 항체를 이끌어낸다. 바람직하게는, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A22, 및 이의 면역원성 조성물은 A05 변이체(서열번호 13), A22 변이체(서열번호 15), A62 변이체(서열번호 70) 및 A29 변이체에 대한 살균 항체를 이끌어낸다. 실시예 18 및 19를 참조한다.
살균 항체를 이끌어내는 방법
한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 A 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 C 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 W135 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 X 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 Y 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 A, B, C, W135, X 및/또는 Y 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 혈청군 B 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 예시적인 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 수막염균, ORF2086 서브패밀리 A 혈청군 B 수막염균, 또는 이들의 조합물에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다.
상기 방법은 전술된 바와 같이 효과량의 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 2086 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 실시예 18, 19 및 22를 참조한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다. 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B09 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 서열번호 49, 서열번호 44 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 18, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 19를 포함한다. 한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 B 혈청군 B 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A12 및 A62 폴리펩티드 중 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 실시예 19를 참조한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 ORF2086 서브패밀리 A 혈청군 B 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 단계를 포함한다. 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들면, 실시예 6 및 13을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 서열번호 55, 서열번호 44, 또는 이의 조합물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21 또는 이들의 조합물을 포함한다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물은 서열번호 77(A05), 서열번호 44(B44) 또는 이들의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, ORF2086 서브패밀리 A 혈청군 B 수막염균에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 면역원성 조성물은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05, A12 및 A62 폴리펩티드들 중 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 실시예 18 및 19를 참조한다.
전술된 2개 이상의 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 예시적인 면역원성 조성물이 포유동물에게 투여되었을 때, 본 발명자들은 놀랍게도 각각 1개의 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물에 비해 수막염균의 혈청군 B에 대한 상승작용적 살균 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들면, 실시예 19를 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균의 혈청군 B에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위해 하나 이상의 제2 피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드와 상승작용적으로 작용하는 하나 이상의 제1 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균의 혈청군 C에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 전술된 바와 같이 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 2086 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 실시예 22를 참조한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 추가로 포함한다. 예시적인 면역원성 조성물은 하나 이상의 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A62 폴리펩티드, 및 a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체를 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균의 혈청군 Y에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 전술된 바와 같이 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 2086 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 실시예 22를 참조한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 추가로 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 수막염균의 혈청군 X에 대한 특이적 살균 항체를 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 전술된 바와 같이 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-피루빌화된 및 비-지질화된 2086 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 조성물의 효과량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 실시예 22를 참조한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 71에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 면역원성 조성물은 a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 추가로 포함한다.
전술된 바와 같이 4개의 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드들 및 수막염균 혈청군 A, C, W135 및 Y 각각의 캡슐 사카라이드의 접합체를 포함하는 예시적인 면역원성 조성물이 포유동물에게 투여되었을 때, 본 발명자들은 놀랍게도 캡슐 사카라이드의 접합체 없이 ORF2086 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물, 및 ORF2086 폴리펩티드 없이 수막염균 혈청군 A, C, W135 및 Y 각각의 캡슐 사카라이드의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 비해 수막염균의 혈청군 B, C 및 Y에 대한 상승작용적 살균 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들면, 실시예 22를 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위해 수막염균 혈청군 A, C, W135 및 Y의 캡슐 사카라이드의 하나 이상의 접합체와 상승작용적으로 작용하는 하나 이상의 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 포함한다. 수막염균의 혈청군 B, C 및 Y 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 면역원성 조성물은 네이세리아 ORF2086으로부터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질, 이의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 균등물을 면역원성 조성물 중의 단독 활성 면역원으로서 포함할 수 있다. 다르게는, 면역원성 조성물은 다른 네이세리아 종 면역원성 폴리펩티드, 하나 이상의 다른 미생물 병원체(예를 들면, 바이러스, 프리온, 세균 또는 진균(그러나, 이들로 한정되지 않음))의 면역학적 활성 단백질 또는 캡슐 폴리사카라이드를 비롯한 활성 면역원을 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 원하는 경우 선택된 징후에 대한 하나 이상의 원하는 단백질, 단편 또는 약학 화합물을 포함할 수 있다.
임의의 다중 항원 또는 다가 면역원성 조성물이 본 발명에 의해 고려된다. 예를 들면, 면역원성 조성물은 원하는 투여, 예를 들면, 점막 전달에 적합한 형태로 2개 이상의 ORF2086 단백질들의 조합물, ORF2086 단백질과 하나 이상의 Por A 단백질의 조합물, ORF2086 단백질과 수막염균 혈청군 A, C, Y 및 W135 폴리사카라이드 및/또는 폴리사카라이드 접합체의 조합물, ORF2086 단백질과 수막염균 및 뉴모코커스 조합물의 조합물, 또는 이들 조합물들 중 임의의 조합물들의 조합물을 포함할 수 있다. 당업자는 이러한 다중 항원 또는 다가 면역학적 조성물을 용이하게 제제화할 수 있을 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드 및 상기 접합체들 중 2개 이상의 접합체들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 접합체들 중 3개 이상의 접합체들을 포함한다. 예를 들면, 상기 조성물은 혈청군 A 및 C; 혈청군 A 및 W135; 혈청군 A 및 Y; 혈청군 C 및 W135; 혈청군 W135 및 Y; 혈청군 A, C 및 W135; 혈청군 A, C 및 Y; 혈청군 A, W135 및 Y; 및 혈청군 C, W135 및 Y로부터의 사카라이드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 혈청군 C 사카라이드를 포함하는 조성물이 바람직하다(예를 들면, C 및 Y).
또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 4개의 접합체들, 예를 들면, 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체, 및 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 접합체는 캡슐 사카라이드와 담체 단백질의 접합체이다. 적합한 담체 단백질은 당분야에서 공지되어 있다. 바람직하게는, 담체 단백질은 세균 독소, 예컨대, 디프테리아 또는 파상풍 독소, 또는 이들의 변성독소 또는 돌연변이체이다. 가장 바람직하게는, 담체 단백질은 CRM197이다. 예를 들면, 한 실시양태에서, 조성물은 (a) (i) 혈청군 A 수막염균의 캡슐 사카라이드와 (ii) CRM197의 접합체; (b) (i) 혈청군 C 수막염균의 캡슐 사카라이드와 (ii) CRM197의 접합체; (c) (i) 혈청군 W135 수막염균의 캡슐 사카라이드와 (ii) CRM197의 접합체; 및 (d) (i) 혈청군 Y 수막염균의 캡슐 사카라이드와 (ii) CRM197의 접합체로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함한다.
혈청군 A, C, W135 및 Y의 캡슐 사카라이드는 당분야에서 특징규명되어 있고 공지되어 있다. 예를 들면, 혈청군 A 수막염균의 캡슐 사카라이드는 C3 및 C4 위치에서 부분적인 O-아세틸화를 갖는 (α1→6)-연결된 N-아세틸-D-만노스아민-1-포스페이트의 단독중합체이다. C-3 위치에서의 아세틸화는 70% 내지 95%일 수 있다. 사카라이드를 정제하는 데에 이용되는 조건은 (예를 들면, 염기성 조건 하에서) 탈-O-아세틸화를 초래할 수 있지만, 이 C-3 위치에서 OAc를 보유하는 데에 유용하다. 일부 실시양태에서, 혈청군 A 사카라이드에서 만노스아민 잔기의 50% 이상(예를 들면, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상)이 C-3 위치에서 O-아세틸화되어 있다. 아세틸 기는 가수분해를 방지하기 위해 차단기로 치환될 수 있고, 이러한 변경된 사카라이드는 여전히 본 발명의 의미 내의 혈청군 A 사카라이드이다.
혈청군 C 캡슐 사카라이드는 (α2→9)-연결된 시알산(N-아세틸 뉴라민산)의 단독중합체이다. 대다수의 혈청군 C 균주들은 시알산 잔기의 C-7 및/또는 C-8에서 O-아세틸 기를 갖지만, 일부 임상 단리물들은 이들 O-아세틸 기를 결여한다.
혈청군 W135 사카라이드는 시알산-갈락토스 다이사카라이드 유닛의 중합체이다. 이 사카라이드는 혈청군 C 사카라이드처럼 가변성 O-아세틸화를 갖지만 시알산 7 및 9 위치에서 이러한 O-아세틸화를 갖는다. 구조는 다음과 같이 기재된다: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→.
혈청군 Y 사카라이드는 다이사카라이드 반복 유닛이 갈락토스 대신에 글루코스를 포함한다는 점을 제외하고 혈청군 W135 사카라이드와 유사하다. 혈청군 Y 구조는 다음과 같이 기재된다: →4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→. 이 사카라이드는 혈청군 W135처럼 시알산 7 및 9 위치에서 가변성 O-아세틸화를 갖는다.
본 발명에 따라 사용되는 사카라이드는 예를 들면, 천연 캡슐 사카라이드에서 관찰된 O-아세틸화 패턴과 동일한 O-아세틸화 패턴을 가지면서 전술된 바와 같이 O-아세틸화될 수 있거나, 사카라이드 고리들 중 하나 이상의 위치에서 부분적으로 또는 전체적으로 탈-O-아세틸화될 수 있거나, 천연 캡슐 사카라이드에 비해 상대적으로 과다-O-아세틸화될 수 있다.
한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하고, 이때 상기 비-지질화된 및 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드는 B44, B09, A05, B22, A12, A22, A62, B24, B16, B15 및 B03 중 하나 이상을 포함한다: a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체, b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체, c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체 및 d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 55, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71 및 서열번호 75로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 17, 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 Cys 잔기가 아닌 아미노산으로 치환되어 있는 서열번호 17, 서열번호 59, 서열번호 60 및 서열번호 20으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 병원체에 대한 유용한 임의의 조성물이 본 발명의 조성물 내에서 또는 본 발명의 조성물과 조합될 수 있는 다중 면역화 요법도 고려한다. 예를 들면(그러나, 한정되지 않음), 환자는 다중 면역화 요법의 일부로서 본 발명의 면역원성 조성물 및 인간 유두종바이러스(HPV)에 대해 면역화하는 또 다른 면역학적 조성물, 예컨대, HPV 백신 가다실(GARDASIL)®을 투여받을 수 있다. 당업자는 다중 면역화 요법을 개발하고 실시할 목적으로 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용될 면역원성 조성물을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
ORF2086 폴리펩티드, 단편 및 균등물은 접합체 면역원성 조성물의 일부로서 사용될 수 있고, 이때 여러 혈청형, 또는 수막염균의 혈청형, 구체적으로 수막염균 혈청군, 구체적으로 혈청군 B, 및/또는 여러 질환들에 대한 면역원성을 갖는 조성물을 발생시키기 위해 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드가 담체와 접합된다. 다르게는, ORF2086 폴리펩티드들 중 하나는 다른 면역원성 폴리펩티드에 대한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 이러한 면역원성 조성물의 제제는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제는 임의의 모든 통상적인 용매, 분산 매질, 충전제, 고체 담체, 수성 용액, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체는 예를 들면, 물, 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중 하나 이상뿐만 아니라 이들의 조합물도 포함한다.
약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체는 항체의 저장 수명 또는 효능을 향상시키는 소량의 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 유화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체의 제조 및 용도는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 본 발명의 면역원성 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다.
면역원성 조성물은 비경구, 예를 들면, 피하 또는 근육내 주사뿐만 아니라 경구 또는 비강내로 투여될 수 있다. 근육내 면역화 방법은 문헌(Wolff et al. Biotechniques; 11(4):474-85, (1991)) 및 문헌(Sedegah et al. PNAS Vol. 91, pp. 9866-9870, (1994))에 기재되어 있다. 다른 투여 방식은 예를 들면(그러나 한정되지 않음), 경구 제제, 폐 제제, 좌약제, 및 경피 도포를 이용한다. 예를 들면, 경구 제제는 예를 들면, 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등(그러나, 이들로 한정되지 않음)과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 근육내로 투여된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 체액성 및/또는 세포 매개 면역의 상향 조절 또는 하향 조절이 관찰되도록 면역 시스템을 방해하거나 변경시키는 물질인 하나 이상의 추가 "면역조절제"를 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 면역 시스템의 체액성 및/또는 세포 매개 아암(arm)의 상향 조절이 바람직하다. 특정 면역조절제의 예에는 예를 들면, 항원보강제 또는 사이토카인, 또는 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)(씨에스엘 리미티드(CSL Limited), 호주 파크빌 소재)가 포함된다.
본 발명의 백신에서 사용될 수 있는 항원보강제의 비-한정적인 예에는 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.), 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 유화액, 유중수 유화액, 예컨대, 프로인트 완전 항원보강제 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(CytRx, 미국 조지아주 아틀란타 소재), QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), SAF-M(키론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), 암피젠(AMPHIGEN)® 항원보강제, 사포닌, 퀼(Quil) A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 아브리딘 지질-아민 항원보강제가 포함된다. 본 발명의 백신에서 유용한 수중유 유화액의 비-한정적인 예에는 변경된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제제가 포함된다. 변경된 SEAM62는 5%(부피/부피) 스쿠알렌(시그마), 1%(부피/부피) 스판(SPAN)® 85 세제(아이씨아이 서팩턴츠(ICI Surfactants)), 0.7%(부피/부피) 폴리소르베이트® 80(아이씨아이 서팩턴츠), 2.5%(부피/부피) 에탄올, 200 ㎍/㎖ 퀼 A, 100 ㎍/㎖ 콜레스테롤 및 0.5%(부피/부피) 레시틴을 함유하는 수중유 유화액이다. 변경된 SEAM 1/2은 5%(부피/부피) 스쿠알렌, 1%(부피/부피) 스판® 85 세제, 0.7%(부피/부피) 폴리소르베이트 80 세제, 2.5%(부피/부피) 에탄올, 100 ㎍/㎖ 퀼 A 및 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤을 포함하는 수중유 유화액이다.
백신에 포함될 수 있는 다른 "면역조절제"는 예를 들면, 하나 이상의 인터류킨, 인터페론, 또는 다른 공지된 사이토카인 또는 케모카인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원보강제는 사이클로덱스트린 유도체 또는 다가음이온성 중합체, 예컨대, 각각 미국 특허 제6,165,995호 및 제6,610,310호에 기재된 사이클로덱스트린 유도체 또는 다가음이온성 중합체일 수 있다. 사용되는 면역조절제 및/또는 항원보강제는 백신 또는 면역원성 조성물이 투여되는 대상체, 주사 경로 및 제공된 주사의 횟수에 의해 좌우될 것임이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 항원보강제는 사포닌이다. 일부 실시양태에서, 사포닌 농도는 1 ㎍/㎖ 내지 250 ㎍/㎖; 5 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖; 또는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다. 일부 실시양태에서, 사포닌 농도는 약 1 ㎍/㎖; 약 5 ㎍/㎖; 약 10 ㎍/㎖; 약 20 ㎍/㎖; 약 30 ㎍/㎖; 약 40 ㎍/㎖; 약 50 ㎍/㎖; 약 60 ㎍/㎖; 약 70 ㎍/㎖; 약 80 ㎍/㎖; 약 90 ㎍/㎖; 약 100 ㎍/㎖; 약 110 ㎍/㎖; 약 120 ㎍/㎖; 약 130 ㎍/㎖; 약 140 ㎍/㎖; 약 150 ㎍/㎖; 약 160 ㎍/㎖; 약 170 ㎍/㎖; 약 180 ㎍/㎖; 약 190 ㎍/㎖; 약 200 ㎍/㎖; 약 210 ㎍/㎖; 약 220 ㎍/㎖; 약 230 ㎍/㎖; 약 240 ㎍/㎖; 또는 약 250 ㎍/㎖이다.
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 점막 항원보강제를 포함하고 인간 숙주에서 수막염균 감염의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 경구 투여용 면역원성 조성물에서 사용된다. 점막 항원보강제는 콜레라 독소일 수 있으나, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용될 수 있는 콜레라 독소 이외의 점막 항원보강제는 A 서브유닛이 돌연변이되어 있는 콜레라 홀로독소의 무독성 유도체, 화학적으로 변경된 콜레라 독소, 또는 콜레라 독소 아미노산 서열의 변경에 의해 제조된 관련 단백질을 포함한다. 본 발명의 면역원성 조성물의 제조에 특히 유용할 수 있는 구체적인 콜레라 독소에 대해서는 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원공개 제WO 00/18434호에 개시된 돌연변이체 콜레라 홀로독소 E29H를 참조한다. 이들은 본 발명의 폴리펩티드에 추가될 수 있거나 본 발명의 폴리펩티드와 접합될 수 있다. 동일한 기법이 점막 항원보강제 또는 전달 성질을 갖는 다른 분자, 예컨대, 에스케리치아 콜라이 열 불안정성 독소(LT)에 적용될 수 있다.
점막 항원보강제 또는 전달 활성을 갖는 다른 화합물, 예컨대, 담즙; 다가양이온, 예컨대, DEAE 덱스트란 및 폴리오르니틴; 세제, 예컨대, 나트륨 도데실 벤젠 설페이트; 지질-접합된 물질; 항생제, 예컨대, 스트렙토마이신; 비타민 A; 및 점막 표면의 구조적 또는 기능적 통합성을 변경시키는 다른 화합물이 사용될 수 있다. 다른 점막 활성 화합물은 미생물 구조물의 유도체, 예컨대, MDP; 아크리딘; 및 시메티딘을 포함한다. 전술된 바와 같은 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21, MPL 및 IL-12도 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 ISCOMS(면역 자극 복합체), ISCOMS 함유 CTB 또는 리포좀의 형태로 전달될 수 있거나, 흡수에 적합한 크기의 미세구를 형성하기 위해 화합물, 예컨대, 아크릴레이트 또는 폴리(DL-락타이드-코-글리코사이드) 내에 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 단백질은 유성 유화액 내로 도입될 수도 있다.
환자에게 투여되는 면역원성 조성물의 양(즉, 용량)은 구체적인 항원, 항원보강제(존재하는 경우), 구체적인 환자의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로를 고려하여 당업자에게 공지된 표준 기법에 따라 결정될 수 있다.
예를 들면, 성인 인간 환자를 위한 용량은 0.1 ㎍, 1 ㎍, 10 ㎍ 또는 50 ㎍ 이상의 네이세리아 ORF2086 단백질 내지 80 ㎍, 100 ㎍, 150 ㎍ 또는 200 ㎍ 이하의 네이세리아 ORF2086 단백질을 포함할 수 있다. 임의의 최소 값과 임의의 최대 값이 조합되어 적합한 범위를 한정할 수 있다.
항원보강제
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원보강제도 포함한다. 항원보강제는 면역원 또는 항원과 함께 투여될 때 면역 반응을 향상시키는 물질이다. 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들면, 미국 특허 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체 형태); 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(예를 들면, 미국 특허 제5,078,996호 및 ATCC 등록번호 39900호 참조); 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF); 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF); 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 사이토카인 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 갖는 것으로 밝혀져 있으므로, 항원보강제로서 유용하다.
본원에 기재된 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있는 다른 항원보강제는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하나 이들로 한정되지 않는 케모카인; 부착 분자, 예컨대, 셀렉틴, 예를 들면, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴; 뮤신 유사 분자, 예를 들면, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 패밀리의 구성원, 예컨대, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대, PECAM, ICAM, 예를 들면, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3; 보조자극 분자, 예컨대, B7-1, B7-2, CD40 및 CD40L; 혈관 성장인자, 신경 성장인자, 섬유모세포 성장인자, 표피 성장인자, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장인자를 포함하는 성장인자; Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 포함하는 수용체 분자; 및 캐스파제(ICE)를 포함한다.
다른 예시적인 항원보강제는 수산화알루미늄; 인산알루미늄; 스티뮬론™ QS-21(아퀼라 바이오파마슈티칼스 인코포레이티드(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), 미국 매사추세츠주 프라밍감 소재); MPL™(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 코릭사(Corixa), 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 529(아미노 알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물, 코릭사, 미국 몬타나주 해밀톤 소재), IL-12(제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); GM-CSF(이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.), 미국 워싱톤주 시애틀 소재); N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서도 지칭됨); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시-에틸아민)(CGP 19835A, MTP-PE로서도 지칭됨); 및 콜레라 독소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 항원보강제는 QS-21이다.
추가 예시적인 항원보강제는 콜레라 독소의 무독성 유도체(이의 A 서브유닛을 포함함), 및/또는 수막염균 폴리펩티드와 콜레라 독소 또는 이의 B 서브유닛의 접합체 또는 유전적으로 조작된 융합체("CTB"), 프로콜레라게노이드, 진균 폴리사카라이드(시조필란을 포함함), 뮤라밀 다이펩티드, 뮤라밀 다이펩티드("MDP") 유도체, 포볼 에스터, 에스케리치아 콜라이의 열 불안정성 독소, 블록 중합체 또는 사포닌을 포함한다.
인산알루미늄은 미국 연방규정집[610.15(a)]에 의해 특정된 0.85 mg/용량의 한계보다 훨씬 더 낮은 농도인 0.125 mg/용량으로 임상 1기 시험에서 항원보강제로서 사용되고 있다. 알루미늄 함유 항원보강제는 근육내 또는 피하 투여될 때 항원의 면역 반응을 증강시키기 위해 인간에서 널리 사용된다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 ㎍/㎖ 내지 0.5 ㎍/㎖; 0.20 ㎍/㎖ 내지 0.40 ㎍/㎖; 또는 0.20 ㎍/㎖ 내지 0.30 ㎍/㎖이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 약 0.125 ㎍/㎖; 약 0.15 ㎍/㎖; 약 0.175 ㎍/㎖; 약 0.20 ㎍/㎖; 약 0.225 ㎍/㎖; 약 0.25 ㎍/㎖; 약 0.275 ㎍/㎖; 약 0.30 ㎍/㎖; 약 0.325 ㎍/㎖; 약 0.35 ㎍/㎖; 약 0.375 ㎍/㎖; 약 0.40 ㎍/㎖; 약 0.425 ㎍/㎖; 약 0.45 ㎍/㎖; 약 0.475 ㎍/㎖; 또는 약 0.50 ㎍/㎖이다.
바람직한 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 0.125 mg/㎖ 내지 0.5 mg/㎖; 0.20 mg/㎖ 내지 0.40 mg/㎖; 또는 0.20 mg/㎖ 내지 0.30 mg/㎖이다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 알루미늄의 농도는 약 0.125 mg/㎖; 약 0.15 mg/㎖; 약 0.175 mg/㎖; 약 0.20 mg/㎖; 약 0.225 mg/㎖; 약 0.25 mg/㎖; 약 0.275 mg/㎖; 약 0.30 mg/㎖; 약 0.325 mg/㎖; 약 0.35 mg/㎖; 약 0.375 mg/㎖; 약 0.40 mg/㎖; 약 0.425 mg/㎖; 약 0.45 mg/㎖; 약 0.475 mg/㎖; 또는 약 0.50 mg/㎖이다.
면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 적합한 항원보강제는 미국 특허 제4,912,094호에 기재된 MPL™(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, 코릭사, 미국 몬타나주 해밀톤 소재)을 추가로 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 코릭사(미국 몬타나주 해밀톤 소재)로부터 입수가능하고 미국 특허 제6,113,918호에 기재되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체도 항원보강제로서 사용되기에 적합하다. 한 이러한 AGP는 529(이전에 RC529로서 공지됨)로서도 공지되어 있는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이다. 이 529 항원보강제는 수성 제형(AF) 또는 안정한 유화액(SE)으로서 제제화된다.
다른 항원보강제는 뮤라밀 펩티드, 예컨대, N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE); 수중유 유화액, 예컨대, MF59(미국 특허 제6,299,884호)(미세유동화기, 예컨대, 모델 110Y 미세유동화기(마이크로플루이딕스(Microfluidics), 미국 매사추세츠주 뉴톤 소재)를 이용하여 서브마이크론 입자로 제제화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.5% 스판 85(임의적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)를 함유함), 및 SAF(서브마이크론 유화액으로 미세유동화되었거나 보다 큰 입자 크기 유화액을 발생시키도록 볼텍싱된 10% 스쿠알렌, 0.4% 폴리소르베이트 80, 5% 플루로닉(PLURONIC)-차단된 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유함); 불완전 프로인트 항원보강제(IFA); 알루미늄 염(명반), 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄; 암피겐; 아브리딘; L121/스쿠알렌; D-락타이드-폴리락타이드/글리코사이드; 플루로닉 폴리올; 사멸된 보르데텔라(Bordetella); 사포닌, 예컨대, 미국 특허 제5,057,540호에 기재된 스티뮬론™ QS-21(안티게닉스(Antigenics), 미국 매사추세츠주 프라밍감 소재), 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스(씨에스엘 리미티드, 호주 파크빌 소재), 및 면역자극 복합체(이스코매트릭스); 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosi); 세균 리포폴리사카라이드; 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 미국 특허 제6,207,646호); 유럽 특허 제1,296,713호 및 제1,326,634호에 기재된 IC-31(인터셀 아게(Intercell AG), 오스트리아 비엔나 소재); 백일해 독소(PT) 또는 이의 돌연변이체, 콜레라 독소 또는 이의 돌연변이체(예를 들면, 미국 특허 제7,285,281호, 제7,332,174호, 제7,361,355호 및 제7,384,640호); 또는 에스케리치아 콜라이 열 불안정성 독소(LT) 또는 이의 돌연변이체, 특히 LT-K63, LT-R72(예를 들면, 미국 특허 제6,149,919호, 제7,115,730호 및 제7,291,588호)를 포함한다.
비- 지질화된 P2086 항원을 제조하는 방법
한 양태에서, 본 발명은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 ORF2086 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 N-말단 시스테인이 상응하는 야생형 서열에 비해 결실되어 있는 ORF2086 폴리펩티드를 코딩하고 세균 세포에서 발현될 수 있는 발현 시스템에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 방법에 의해 제조된 예시적인 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 상응하는 야생형 서열에 비해 결실되어 있는 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 58 또는 서열번호 70에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 76에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 추가 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 44, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 62, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 68, 서열번호 71 및 서열번호 75로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 예시적인 폴리펩티드는 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 추가 예는 서열번호 80(B24) 및 서열번호 81(B24)을 포함한다. 상기 방법은 폴리펩티드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 ORF2086 변이체 핵산 서열을 지질화 조절 서열을 갖지 않는 에스케리치아 콜라이 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계, 에스케리치아 콜라이 세균을 ORF2086 발현 벡터로 형질전환시키는 단계, 발현을 유도하는 단계 및 발현된 P2086 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 가용성 비-지질화된 P2086 항원을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 발현은 IPTG로 유도된다.
일부 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys에 대한 코돈이 결실되어 있다. 이러한 코돈의 예에는 TGC가 포함된다. 일부 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 Cys에 대한 코돈은 점 돌연변이유발에 의해 돌연변이되어 Ala, Gly 또는 Val 코돈을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, Ser 및 Gly 코돈이 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리에 추가되어 N-말단 Cys의 바로 하류에 위치하는 Gly/Ser 줄기를 연장시킨다. 일부 실시양태에서, Gly/Ser 줄기 내의 Gly 및 Ser 잔기의 총 수는 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 이상이다. 일부 실시양태에서, N-말단 Cys에 대한 코돈은 결실되어 있다. 일부 실시양태에서, N-말단 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개 잔기는 Gly 또는 Ser이다.
일부 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 점 돌연변이유발에 의해 최적화된다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 B09 변이체의 N-말단 꼬리와 일치하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서, ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리의 코돈은 상기 ORF2086 변이체의 5번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 13 내지 15와 100% 동일하고 상기 ORF2086 변이체의 13번째 아미노산을 코딩하는 코돈이 서열번호 8의 뉴클레오티드 37 내지 39와 100% 동일하도록 점 돌연변이에 의해 최적화된다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 45개 핵산이 서열번호 8의 핵산 1 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 42개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 45와 100% 동일하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 ORF2086 변이체의 N-말단 꼬리는 5' 39개 핵산이 서열번호 8의 핵산 4 내지 42와 100% 동일하도록 최적화된다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 1 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-지질화된 P2086 변이체의 N-말단 꼬리는 서열번호 18의 아미노산 2 내지 15에 비해 2개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, 비-지질화된 변이체의 코돈은 증가된 발현을 위해 최적화되어 있다. 코돈 최적화는 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Sastalla et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 75(7): 2099-2110 (2009)) 및 문헌(Coleman et al., Science, vol. 320: 1784 (2008))을 참조한다. 일부 실시양태에서, 코돈 최적화는 특정 DNA 서열을 포함하고/하거나 배제하면서 아미노산 서열의 코돈 이용을 선택된 숙주 유기체의 코돈 빈도와 일치시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코돈 최적화는 번역 방해를 감소시키도록 상응하는 2차 mRNA 구조를 최소화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 꼬리는 서열번호 28, 30, 32 및 34 중 어느 하나를 포함하도록 코돈 최적화되어 있다. 일부 실시양태에서, Gly/Ser 줄기는 서열번호 28, 30, 32 및 34 중 어느 하나를 포함하도록 코돈 최적화되어 있다.
본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 기재되어 있다. 실시예는 단지 예시하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
면역원성 조성물 제제
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 항원보강제, 완충제, 냉동보호제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 계면활성제, 자유 라디칼 산화의 억제제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 다수의 수막염균 단백질 항원 및 캡슐 폴리사카라이드-단백질 접합체 이외에 하나 이상의 방부제를 추가로 포함할 수 있다. FDA는 단지 소수의 경우만을 제외하고 다회 용량(다회-용량) 바이알 내의 생물학적 제품이 방부제를 함유할 것을 요구한다. 방부제를 함유하는 백신 제품은 벤즈에토늄 클로라이드(탄저병), 2-페녹시에탄올(DTaP, HepA, 라임(Lyme), 소아마비(비경구)), 페놀(폐렴, 장티푸스(비경구), 백시니아) 및 티메로살(DTaP, DT, Td, HepB, Hib, 인플루엔자, JE, 수막염, 폐렴, 광견병)을 함유하는 백신을 포함한다. 주사가능한 약물에서의 사용에 대해 승인받은 방부제는 예를 들면, 클로로부탄올, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-페녹시에탄올, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 페놀, 티메로살 및 페닐머큐릭 니트레이트를 포함한다.
본 발명의 제제는 완충제, 염, 2가 양이온, 비-이온성 세제, 냉동보호제, 예컨대, 당, 및 항산화제, 예컨대, 자유 라디칼 스카벤저(scavenger) 또는 킬레이팅제 중 하나 이상, 또는 이들 중 다수의 물질들의 임의의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 어느 한 성분, 예를 들면, 킬레이터의 선택은 또 다른 성분(예를 들면, 스카벤저)이 바람직한지 아니면 바람직하지 않은지를 결정할 수 있다. 투여를 위해 제제화된 최종 조성물은 멸균되어야 하고/하거나 발열원을 갖지 않아야 한다. 당업자는 다양한 인자들, 예컨대, 요구되는 구체적인 저장 및 투여 조건에 따라 이들 및 다른 성분들의 어떤 조합물이 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물에 포함되기에 최적일 것인지를 실험적으로 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 트라이스(트라이메타민), 포스페이트, 아세테이트, 보레이트, 시트레이트, 글리신, 히스티딘 및 석시네이트(그러나, 이들로 한정되지 않음)로부터 선택된 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제제는 약 6.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 6.4 내지 약 7.4의 pH 범위 내로 완충된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 제제의 pH를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 당분야의 표준 기법을 이용하여 본 발명의 제제의 pH를 조절할 수 있다. 상기 제제의 pH는 3.0 내지 8.0로 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 6.0, 또는 5.0 내지 8.0일 수 있거나 이러한 값으로 조절될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.8, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5 또는 약 8.0일 수 있거나 이러한 값으로 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 pH는 4.5 내지 7.5, 4.5 내지 6.5, 5.0 내지 5.4, 5.4 내지 5.5, 5.5 내지 5.6, 5.6 내지 5.7, 5.7 내지 5.8, 5.8 내지 5.9, 5.9 내지 6.0, 6.0 내지 6.1, 6.1 내지 6.2, 6.2 내지 6.3, 6.3 내지 6.5, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5, 또는 7.5 내지 8.0일 수 있거나 이러한 값으로 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 5.8이다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도(이때, 약 5 mM 이하가 바람직함)로 하나 이상의 2가 양이온(MgCl2, CaCl2 및 MnCl2를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 비경구 투여 시 대상체에게 생리학적으로 허용가능한 이온 강도로 존재하고 최종 제제에서 선택된 이온 강도 또는 오스몰농도를 생성하는 최종 농도로 포함되는 하나 이상의 염(염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨 및 황산칼륨을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다. 제제의 최종 이온 강도 또는 오스몰농도는 다수의 성분들(예를 들면, 완충 화합물(들) 및 다른 비-완충 염으로부터의 이온)에 의해 결정될 것이다. 바람직한 염인 NaCl은 제제의 최종 총 오스몰농도가 비경구 투여(예를 들면, 근육내 또는 피하 주사)에 적합하고 다양한 온도 범위에 걸쳐 면역원성 조성물 제제의 면역원성 성분들의 장기간 안정성을 촉진하도록 약 250 mM 이하의 농도로 존재하고, 이때 염 농도는 다른 성분들(예를 들면, 당)을 보충하도록 선택된다. 염 무함유 제제는 원하는 최종 오스몰농도 수준을 유지하기 위해 증가된 범위의 하나 이상의 선택된 냉동보호제를 견딜 것이다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 다이사카라이드(예를 들면, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 트레할로스) 및 폴리하이드록시 탄화수소(예를 들면, 둘시톨, 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨)로부터 선택된(그러나, 이들로 한정되지 않는) 하나 이상의 냉동보호제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제의 오스몰농도는 약 200 mOs/ℓ 내지 약 800 mOs/ℓ의 범위 내에 있고, 이때 약 250 mOs/ℓ 내지 약 500 mOs/ℓ, 또는 약 300 mOs/ℓ 내지 약 400 mOs/ℓ의 범위가 바람직하다. 염 무함유 제제는 예를 들면, 약 5% 내지 약 25%의 수크로스, 바람직하게는 약 7% 내지 약 15% 또는 약 10% 내지 약 12%의 수크로스를 함유할 수 있다. 다르게는, 염 무함유 제제는 예를 들면, 약 3% 내지 약 12%의 소르비톨, 바람직하게는 약 4% 내지 7% 또는 약 5% 내지 약 6%의 소르비톨을 함유할 수 있다. 염, 예컨대, 염화나트륨이 첨가되는 경우, 수크로스 또는 소르비톨의 유효 범위는 상대적으로 감소된다. 이들 및 다른 이러한 오스몰농도 및 오스몰농도 고려사항은 당분야의 기술 내에 있다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 하나 이상의 자유 라디칼 산화 억제제 및/또는 킬레이팅제를 포함한다. 다양한 자유 라디칼 스카벤저 및 킬레이터가 당분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 제제 및 사용 방법에 적용된다. 그 예에는 에탄올, EDTA, EDTA/에탄올 조합물, 트라이에탄올아민, 만니톨, 히스티딘, 글리세롤, 나트륨 시트레이트, 이노시톨 헥사포스페이트, 트라이폴리포스페이트, 아스코르브산/아스코르베이트, 석신산/석시네이트, 말산/말레에이트, 데스페랄, EDDHA 및 DTPA, 및 이들 중 둘 이상의 다양한 조합물들이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 비-환원 자유 라디칼 스카벤저는 제제의 장기간 안정성을 효과적으로 향상시키는 농도로 첨가될 수 있다. 하나 이상의 자유 라디칼 산화 억제제/킬레이터도 다양한 조합물, 예컨대, 스카벤저와 2가 양이온의 조합물로 첨가될 수 있다. 킬레이터의 선택은 스카벤저의 첨가가 필요한지 아닌지를 결정할 것이다.
특정 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터, 폴리소르베이트 80(트윈(TWEEN) 80), 폴리소르베이트 60(트윈 60), 폴리소르베이트 40(트윈 40), 폴리소르베이트 20(트윈 20) 및 (BRIJ 58 및 BRIJ 35를 포함하나 이들로 한정되지 않는) 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르뿐만 아니라, 다른 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 트라이톤(TRITON) X-100, 트라이톤 X-114, NP40, 스판-85 및 플루로닉 계열의 비-이온성 계면활성제(예를 들면, 플루로닉 121)도 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 비-이온성 계면활성제를 포함하고, 이때 바람직한 성분은 약 0.001% 내지 약 2% 농도(이때, 약 0.25% 이하가 바람직함)의 폴리소르베이트 80, 또는 약 0.001% 내지 1% 농도(이때, 약 0.5% 이하가 바람직함)의 폴리소르베이트 40이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제제는 비경구 투여에 적합한 하나 이상의 추가 안정화제, 예를 들면, 하나 이상의 티올(-SH) 기를 포함하는 환원제(예를 들면, 시스테인, N-아세틸 시스테인, 환원된 글루타티온, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오설페이트, 모노티오글리세롤 또는 이들의 혼합물)를 포함한다. 다르게는 또는 임의적으로, 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 저장 용기로부터 산소를 제거하고 (예를 들면, 앰버 유리 용기의 사용에 의해) 광으로부터 상기 제제를 보호함으로써 더 안정화될 수 있다.
본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 그 자체가 면역 반응을 유도하지 않는 임의의 부형제를 포함하는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 거대분자, 예컨대, 단백질, 사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 수크로스(Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19:2118), 트레할로스, 락토스 및 지질 응집체(예컨대, 오일 소적 또는 리포좀)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 희석제, 부형제 및/또는 담체는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들면, 문헌(Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472)에 논의되어 있다.
본 발명의 조성물은 동결건조될 수 있거나 수성 제형, 즉 용액 또는 현탁액일 수 있다. 액체 제제는 유리하게는 그들의 포장된 제형으로부터 직접적으로 투여될 수 있으므로, 본 발명의 동결건조된 조성물에 대해 요구되는 수성 매질에서의 재구성을 필요로 하지 않으면서 주사되기에 이상적이다.
본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 직접적으로 전달하는 것은 비경구(근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내 또는 조직의 간질 공간으로의) 투여; 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비강내, 안, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비경구 투여는 예를 들면, 대상체의 넓적다리 또는 상부 팔에의 근육내 주사에 의해 달성된다. 주사는 바늘(예를 들면, 피하 바늘)을 통해 달성될 수 있으나, 다르게는 바늘 부재 주사도 이용될 수 있다. 전형적인 근육내 용량은 0.5 ㎖이다. 본 발명의 조성물은 다양한 제형, 예를 들면, 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사되도록 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물은 예를 들면, 흡입기 내의 폐 투여용 산제 또는 분무제로서 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 좌약제 또는 페사리(pessary)로서 제조될 수 있거나, 예를 들면, 분무제, 점적제, 겔 또는 산제로서 코, 귀 또는 안 투여용으로 제조될 수 있다.
특정 면역원성 조성물을 위한 성분의 최적 양은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절하게 이격된 1회 또는 수회의 부스터 면역화를 제공받을 수 있다.
포장 및 투약 제형
본 발명의 면역원성 조성물은 유닛 용량 또는 다회 용량 제형(예를 들면, 2회 용량, 4회 용량 또는 그 이상의 용량)으로 포장될 수 있다. 다회 용량 제형의 경우, 바이알이 전형적이지만 반드시 예비충전된 주사기에 비해 바람직한 것은 아니다. 적합한 다회 용량 포맷은 용량 당 0.1 ㎖ 내지 2 ㎖로 용기 당 2회 내지 10회 용량을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.5 ㎖ 용량이다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원공개 제WO2007/127668호를 참조한다.
조성물은 바이알 또는 다른 적합한 저장 용기 내에 제공될 수 있거나, 바늘과 함께 또는 바늘 없이 공급될 수 있는 예비충전된 전달 장치, 예를 들면, 단회 또는 다회 성분 주사기 내에 제공될 수 있다. 주사기가 전형적이지만, 반드시 단회 용량의 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물을 함유할 필요는 없고, 다회 용량의 예비충전된 주사기도 예상된다. 마찬가지로, 바이알은 단회 용량을 포함할 수 있으나, 다르게는 다회 용량을 포함할 수 있다.
유효 용량 부피는 상용적으로 확립될 수 있으나, 주사를 위한 조성물의 전형적인 용량은 0.5 ㎖의 부피를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 용량은 인간 대상체에게의 투여를 위해 제제화된다. 특정 실시양태에서, 상기 용량은 성인, 십대, 청소년, 소아 또는 유아(즉, 1살 이하)의 인간 대상체에게의 투여를 위해 제제화되고, 바람직한 실시양태에서 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 액체 면역원성 조성물은 동결건조된 형태로 존재하는 다른 면역원성 조성물을 재구성하는 데에도 적합하다. 면역원성 조성물이 이러한 즉석 재구성을 위해 사용되어야 하는 경우, 본 발명은 2개 이상의 바이알, 2개 이상의 충전 준비된 주사기, 또는 하나 이상의 이들 각각을 갖는 키트를 제공하는데, 이때 상기 주사기의 내용물은 주사 전에 바이알의 내용물을 재구성하는 데에 사용되거나, 역으로 바이알의 내용물은 주사 전에 주사기의 내용물을 재구성하는 데에 사용된다.
다르게는, 입자의 제조를 위해 이용된 정확한 방법을 변경시킴으로써 선택되고 조절될 수 있는 입자 특성, 예컨대, 평균 직경 크기를 갖는 건조된 규칙적인 모양(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 미세펠렛 또는 미세구를 형성하기 위해 예를 들면, 당분야에서 잘 공지되어 있는 다수의 동결건조 방법들 중 하나를 이용하여 본 발명의 면역원성 조성물을 동결하고 재구성할 수 있다. 면역원성 조성물은 임의적으로 별개의 건조된 규칙적인 모양(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 미세펠렛 또는 미세구와 함께 제조될 수 있거나 이러한 입자 내에 함유될 수 있는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명은 임의적으로 하나 이상의 본 발명의 방부제를 추가로 포함하는 안정화된 및 건조된 면역원성 조성물을 포함하는 제1 구성요소, 및 제1 구성요소의 재구성을 위한 멸균 수성 용액을 포함하는 제2 구성요소를 포함하는 면역원성 조성물 키트를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 수성 용액은 하나 이상의 방부제를 포함하고, 임의적으로 하나 이상의 항원보강제를 포함할 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원공개 제WO2009/109550호(본원에 참고로 도입됨) 참조).
또 다른 실시양태에서, 다회 용량 포맷의 용기는 일반적인 실험실 유리그릇, 플라스크, 비이커, 눈금이 새겨진 실린더, 발효기, 생물반응기, 튜빙, 파이프, 백, 항아리, 바이알, 바이알 밀폐기(예를 들면, 고무 마개, 캡 상의 나사), 앰플, 주사기, 이중 또는 다중 챔버 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 고무 밀폐기, 플라스틱 밀폐기, 유리 밀폐기, 카트리지 및 일회용 펜 등으로 구성되나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 용기는 제조 재료에 의해 한정되지 않고, 유리, 금속(예를 들면, 강철, 스테인레스 강철, 알루미늄 등) 및 중합체(예를 들면, 열가소성 중합체, 탄성중합체, 열가소성 탄성중합체)와 같은 재료를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 포맷의 용기는 부틸 마개를 갖는 5 ㎖ 쇼트(Schott) 1형 유리 바이알이다. 당업자는 전술된 포맷이 결코 배타적인 목록이 아니고, 단지 본 발명을 위해 이용될 수 있는 다양한 포맷들에 대한 지침으로서 당업자에게 기여한다는 것을 인식할 것이다. 본 발명에서 사용될 것으로 고려되는 추가 포맷은 실험실 장치 공급자 및 제조자, 예컨대, 유나이티드 스테이트 플라스틱 코포레이션(United States Plastic Corp.)(미국 오하이오주 리마 소재), VWR 등으로부터 공개된 카탈로그에서 발견될 수 있다.
실시예
실시예 1 : 실험 절차
혈청 살균 분석
사이노몰구스 마카크(n=5/군)를 AlPO4에 흡착된 rLP2086 또는 rP2086(A + B) 단백질로 근육내로 면역화하였다. 사이노몰구스 마카크는 비-인간 영장류의 일례이다. 동물들을 0주, 4주 및 24주에 백신접종하였고, ORF2086 특이적 IgG 및 기능성 항체 역가를 0주, 4주, 6주 및 26주에 측정하였다. rLP2086A 및 B에 대한 혈청 ORF2086 특이적 IgG 역가를 측정하였다.
백신에 함유된 서열에 대한 동종성 또는 이종성을 나타내는 서열을 갖는 LP2086을 발현하는 수막염균 균주에 대한 혈청 살균 분석(SBA)으로 기능성 항체 역가를 조사하였다.
SBA를 인간 보체와 함께 사용하여 ORF2086 백신으로 면역화된 마카크 또는 토끼에서 혈청 살균 항체를 측정하였다. 고유의 보체 활성을 제거하기 위해 토끼 면역 혈청 및 마카크 면역 혈청을 열 불활성화시킨 후, 수막염균 균주에 대한 혈청 살균 활성에 대해 시험하기 위해 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Ca2 + 및 Mg2 +를 갖는 둘베코의 PBS(D-PBS)로 연속적으로 1:2 희석하였다. 분석에서 사용되는 세균을 켈로그의 보충제(GCK)로 보충된 GC 배지에서 생장시키고 650 nm에서 광학 밀도로 모니터링하였다. 분석에서 사용하기 위해 세균을 0.50 내지 0.55의 최종 OD650에서 수거하고 D-PBS로 희석하고, 1000 CFU 내지 3000 CFU를 20% 인간 보체를 갖는 분석 혼합물에 첨가하였다.
검출가능한 살균 활성을 갖지 않는 인간 혈청을 외부 보체 공급원으로서 사용하였다. 보체 공급원을 각각의 개별 시험 균주에 대한 적합성에 대해 시험하였다. 첨가된 면역 혈청을 갖지 않는 대조군에서 생존하는 세균의 수가 75% 초과인 경우에만 보체 공급원을 사용하였다. 이 연구에 기재된 SBA를 수행하기 위해서는 10개의 독특한 보체 공급원들이 요구되었다.
37℃에서 5% CO2와 함께 30분 동안 항온처리한 후, D-PBS를 반응 혼합물에 첨가하고, 분취물을 50% GCK 배지로 충전된 마이크로필터 플레이트로 옮겼다. 상기 마이크로필터 플레이트를 여과하고 37℃에서 5% CO2와 함께 밤새 항온처리하고, 마이크로콜로니를 염색하고 정량하였다. 혈청 살균 역가는 면역 혈청을 갖지 않는 대조군 웰에서의 CFU에 비해 CFU의 50% 감소를 발생시킨 내삽된 역수 혈청 희석비로서 정의되었다. SBA 역가는 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후 세균 수의 50% 감소를 야기하는 시험 혈청의 내삽된 희석비의 역수로서 정의된다. ORF2086 면역 혈청에 의한 사멸에 대한 민감성은 상응하는 면역 전 혈청에 비해 ORF2086 면역 혈청에 대한 SBA 역가의 4배 이상의 상승이 있는 경우 확립되었다. 출발 희석비에서 분석 균주에 대한 음성을 나타내는 혈청은 분석에 대한 검출 한계의 절반의 역가(즉, 4)를 배정받았다.
실시예 2 : 비- 지질화된 ORF2086 변이체의 클로닝 및 발현
수막염균 균주 M98250771(A05)로부터의 잔기 27 내지 286에 상응하는 성숙 P2086 아미노산 서열은 원래 게놈 DNA의 PCR 증폭으로부터 유도되었다. TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG(서열번호 22)의 서열을 갖는 정방향 프라이머는 5' 서열에 어닐링되었고 클로닝을 위한 NdeI 부위를 함유하였다. CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(서열번호 23)의 서열을 갖는 역방향 프라이머는 유전자의 3' 말단에 어닐링되었고 종결 코돈 TAG에 이어서 제한 부위 BamHI을 함유하였다. 799 bp의 증폭된 단편을 먼저 중간 벡터 PCR2.1(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 찰스박 소재) 내로 클로닝하였다. 이 플라스미드를 NdeI 및 BamHI로 절단하고, NdeI 및 BamHI로 절단된 발현 벡터 pET9a(노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 내로 연결시켰다. 발생된 벡터 pLA100(서열번호 54를 포함함)은 지질화된 단백질에 존재할 N-말단 시스테인을 갖지 않는 성숙 서브패밀리 A05 P2086(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 또는 서열번호 55 참조)을 균주 M98250771로부터 발현시켰다. BLR(DE3) 에스케리치아 콜라이 숙주 균주[F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm Δ(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)](노바겐)를 사용하여 fHBP의 발현을 수득하였다.
동일한 클로닝 단계를 이용하여 B02, B03, B09, B22, B24, B44, A04, A12 및 A22 N-말단 Cys-결실된 변이체를 제조하였다. N-말단 Cys 함유 변이체도 Cys 코돈(예를 들면, 서열번호 1 내지 11의 첫 번째 코돈)을 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 제조하였다. 본원에서 제공된 서열을 기초로, 당업자는 이들 변이체들 각각에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 디자인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하기 프라이머들을 사용하여 B44 비-지질화된 변이체를 증폭한 후, NdeI 및 BlpI을 사용하여 pET9a 내로 클로닝하였다.
[표 1]
Figure 112017071703505-pat00001
결과
비-지질화된 플라스미드 구축물이 강하게 발현되었지만, 비-지질화된 단백질 변이체들이 N-말단 Cys 잔기에서 피루빌화되었다. 예를 들면, 상기 구축물을 발현시키는 방법을 기술하는 실시예 8 및 9를 참조한다. 이 피루빌화를 극복하기 위해, N-말단 Cys 코돈을 결실시켰다. 예를 들면, 실시예 10을 참조한다. 그러나, N-말단 Cys의 결실은 A22 및 B22 변이체들의 발현을 방해하였다. 예를 들면, 도 4를 참조한다. 그러나, A05, B01 및 B44 변이체들은 N-말단 Cys 잔기의 결실에도 불구하고 여전히 발현되었다. 예를 들면, 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13(A05), 서열번호 35(B01 N-말단), 및 위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21(B44)을 참조한다. 예를 들면, 도 5를 참조한다. 추가로, 비-지질화된 B09 변이체의 발현은 N-말단 Cys 잔기의 결실에 의해 영향을 받지 않았다. 예를 들면, 실시예 4를 참조한다.
실시예 3 : 비- 지질화된 변이체 발현에 대한 Gly / Ser 줄기의 영향
A05, B01 및 B44 변이체들이 N-말단 Cys의 부재 하에서 발현되고 A22 및 B22 변이체들이 발현되지 않은 이유를 확인하기 위해, 이들 변이체들의 서열들을 정렬하였다. A05, B01 및 B44 변이체들은 모두 N-말단 Cys 바로 다음에 연장된 일련의 10개 또는 11개의 Gly 및 Ser 잔기들(즉, Gly/Ser 줄기)을 보유한다. 그러나, A22 및 B22 변이체들만이 6개의 Gly 및 Ser 잔기들로 구성된 Gly/Ser 줄기를 가졌다. 따라서, 추가 Gly 및 Ser 잔기를 삽입하여 A22 및 B22 변이체들의 Gly/Ser 줄기를 확장시켰다.
10개 또는 11개의 Gly 및 Ser 잔기들을 갖는 Gly/Ser 줄기를 코딩하는 정방향 프라이머를 사용하여 실시예 2에 기재된 방법으로 긴 Gly/Ser 줄기 변이체를 제조하였다.
N-말단 Cys-결실된 긴 Gly/Ser 줄기(10개 또는 11개의 Gly/Ser 잔기들) A22 및 B22 변이체들은 N-말단 Cys-결실된 A22 및 B22 짧은 Gly/Ser 줄기(6개의 Gly/Ser 잔기들) 변이체들에 비해 증가된 발현을 보였다. 그러나, 이들 발현 수준은 A05, B01 및 B44 변이체 발현 수준에 비해 여전히 감소되었다.
실시예 4 : 코돈 최적화
비-지질화된 B09 변이체의 발현은 N-말단 Cys 잔기의 결실에 의해 영향을 받지 않았다(위치 1의 시스테인이 결실되어 있는 서열번호 18, 또는 서열번호 49 참조). 예를 들면, 도 6을 참조한다. B09 변이체의 서열 평가는 B09 변이체가 A22 및 B22 변이체들의 Gly/Ser 줄기와 유사한, 6개의 Gly 및 Ser 잔기들로 구성된 Gly/Ser 줄기를 갖는다는 것을 입증하였다. 실제로, B09 및 A22 변이체들의 N-말단 꼬리는 아미노산 수준에서 동일하다. 그러나, B09 및 A22 변이체들의 N-말단 꼬리(각각 서열번호 53 및 42)는 서열번호 8의 2개의 핵산, 즉 핵산 15 및 39에 의해 핵산 수준에서 상이하다. 도 6을 참조한다. B22 변이체의 N-말단 꼬리의 처음 14개 아미노산은 B09 및 A22 변이체들과 동일하고, B22 변이체의 N-말단 꼬리는 15번째 아미노산에서만 상이하다. B22 변이체의 핵산 1 내지 42는 A22 변이체의 핵산 1 내지 42와 동일하다. B22 변이체의 핵산 1 내지 42(서열번호 52 참조)는 최적으로 정렬되었을 때 핵산 15 및 39에서의 차이를 제외하고 B09의 핵산 1 내지 42(서열번호 53 참조)와 동일하다. 따라서, B22 변이체는 서열번호 8의 아미노산 15 및 39에서 B09 변이체와 상이하다. 이 마지막 문장은 오타를 함유하고, B22 변이체가 서열번호 8의 핵산 15 및 39에서 B09 변이체와 상이하다고 기재되어야 한다.
핵산 차이가 A22 및 B22 변이체들에 비해 B09 변이체의 발현 수준에 영향을 미쳤는지를 확인하기 위해, 핵산 15 및 39를 Gly5 및 Gly13에 대한 상응하는 코돈 내로 도입하도록 A22 및 B22 변이체들을 점 돌연변이로 돌연변이시켰다. 이들 침묵 핵산 돌연변이의 도입은 A22 및 B22 N-말단 Cys-결실된 변이체들의 발현을 N-말단 Cys-결실된 B09 변이체와 유사한 수준까지 유의하게 증가시켰다. 예를 들면, 도 7을 참조한다. 따라서, B09 변이체와 일치시키기 위한 코돈 최적화는 N-말단 Cys-결실된 비-지질화된 P2086 변이체의 발현을 증가시킬 수 있다.
비-지질화된 변이체 서열의 추가 분석은 발현을 개선하기 위한 Gly/Ser 줄기에서의 추가 코돈 최적화를 암시하였다. 따라서, 이러한 코돈 최적화된 서열을 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 실시예 2의 방법으로 추가 비-지질화된 변이체들을 구축하였다. 최적화된 Gly/Ser 줄기를 발생시키는 데에 사용된 정방향 프라이머는 하기 서열들 중 임의의 서열을 포함한다:
Figure 112017071703505-pat00002
실시예 5 : 면역원성 조성물 제제 최적화
이스코매트릭스로 제제화된 백신은 혈청 살균 분석에서 측정되었을 때 4배 이상 더 큰 반응률을 달성하기 위해 요구되는 투약 횟수를 감소시키는 신속한 면역 반응을 발생시킨다. 5마리의 붉은털 마카크들로 구성된 군들을 2가 비-지질화된 rP2086 백신의 상이한 제제들로 면역화시켰다. 상기 백신은 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 또는 서열번호 54에 의해 코딩된 서열번호 55) 및 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21, 또는 서열번호 51에 의해 코딩된 서열번호 44)를 포함하였다. 항원보강제 유닛은 다음과 같다: AlPO4는 250 mcg이고, 이스코매트릭스는 10 mcg 내지 100 mcg이다. 표 2 내지 5에 제시된 AlPO4에 대한 항원보강제 유닛은 mg 유닛으로서 제시되어 있으므로, 250 mcg와 대조적으로 0.25 mg으로서 제시되어 있다.
면역화 스케쥴은 0주, 4주 및 24주이었고, 이때 0주, 4주, 6주 및 26주에서 채혈하였다. 상기 군들 중 어느 군에서도 1회 용량 후 SBA 역가의 증가는 없었다. 2회 용량 후, 이스코매트릭스 항원보강제를 함유하는 제제의 경우 SBA 역가, 및 기준에 비해 SBA 역가의 4배 증가로 정의된 반응자 수의 증가가 관찰되었다. 표 2 및 3은 fHBP 서브패밀리 A 및 B 균주 각각에 대해 관찰된 SBA GMT를 제공한다. A 및 B 서브패밀리 균주들의 경우 이스코매트릭스 제제에 대한 SBA GMT는 AIPO4 제제에 대해 관찰된 SBA GMT보다 각각 3배 내지 19배 및 4배 내지 24배 더 높았다. A 및 B 서브패밀리 균주들의 경우 3회 용량 후 AlPO4 제제에 비해 이스코매트릭스 제제에 대한 각각 13 내지 95 및 2 내지 10의 향상된 역가도 관찰되었다. 기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상의 증가로 정의된 반응률의 분석은 유사한 경향을 보여주었다(표 4 및 5).
[표 2]
Figure 112017071703505-pat00003
[표 3]
Figure 112017071703505-pat00004
[표 4]
Figure 112017071703505-pat00005
[표 5]
Figure 112017071703505-pat00006
실시예 6 : 지질화된 변이체 및 비- 지질화된 변이체에 의해 부여된 면역보호
재조합적으로 발현된 비-지질화된 P2086 변이체(B44)는 SBA에 의해 측정되었을 때 다양한 fHBP 변이체들(약 85% 내지 약 <92% ID) LP2086 서열들을 나타내는 균주들에 대한 넓은 보호를 유도하였다. 이들 반응률은 AlPO4로 제제화된 비-지질화된 백신의 경우 수득되었다. 2가 fHBP 백신에 의해 발생된, 서브패밀리 B fHBP MnB 균주에 대한 SBA 반응률을 보여주는 표 6을 참조한다. 비-지질화된 백신("지질화" 칸 아래에 "-"로 표시되어 있음)은 단백질 당 1 mcg의 비-피루빌화된 및 비-지질화된 A05 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13) 및 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21)를 포함하였다.
다르게는, 재조합적으로 발현된 비-지질화된 P2086 변이체(B44)는 SBA 역가에 의해 측정되었을 때 유사한(>92% ID) 및 상이한(<92% ID) LP2086 서열들을 보유하는 균주들에 대해 지질화된 변이체(B01)보다 더 큰 면역 반응을 유도한다. (기준에 비해 SBA 역가의 4배 이상의 증가로 정의된) 보다 높은 반응률은 지질화된 rLP2086 B01 백신에 비해 비-지질화된 rLP2086 B44를 함유하는 백신의 경우 관찰되었다(표 6).
표 6에 따르면, 비-지질화된 B44는 다수의 LP2086 변이체 균주들에 대한 넓은 보호범위를 제공하기 위한(예를 들면, 살균 항체를 이끌어내기 위한) 조성물에서 fHBP의 바람직한 서브패밀리 B 성분이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 LP2086 B09 변이체 균주가 특히 이종(비-B09) ORF2086 폴리펩티드에 대한 양성 SBA 반응률을 가질 가능성이 없다는 것을 주목하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 표 6에 기재된 A05/B44 면역원성 조성물이 살균 항체를 이끌어낸 분석 균주의 관점에서 LP2086 B09가 예외라는 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물, 특히 하나 초과의 ORF2086 서브패밀리 B 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 B09 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 비-지질화된 B44를 포함하는 면역원성 조성물은 비-지질화된 B09 폴리펩티드도 포함할 수 있다.
[표 6]
Figure 112017071703505-pat00007
실시예 7 : B44 및 B09 변이체의 코돈 최적화
이전 실시예들에서 달성된 발현 수준이 많은 적용에 적절하였지만, 추가 최적화가 바람직하였고, 단백질의 전체 길이에 걸친 추가 코돈 최적화를 함유하는 에스케리치아 콜라이 발현 구축물을 제조하여 시험하였다. 비-Cys B44 단백질의 발현을 위한 이러한 한 개선된 서열은 서열번호 43에 기재된 핵산 서열인 것으로 발견되었다. 실시예 9에 나타낸 바와 같이, 서열번호 43을 함유하는 발현 구축물은 비-최적화된 야생형 서열의 발현에 비해 향상된 발현을 보였다.
상기 최적화된 B44(서열번호 43) 구축물로부터의 코돈 변화를 B09(서열번호 48)에 적용하여 N-말단 Cys-결실된 B09 단백질의 발현을 개선하였다. 최적화된 B09 서열을 발생시키기 위해, B44 최적화된 DNA 서열(서열번호 43)을 먼저 B09 대립형질(서열번호 48)의 DNA 서열과 정렬하였다. B09 대립형질(서열번호 48)의 전체 비-지질화된 코딩 서열을, B44 최적화된 대립형질(서열번호 43)에서 관찰된 코돈 변화를 반영하도록 최적화하였는데, 어떤 경우에도 아미노산은 B44(서열번호 44)와 B09(서열번호 49) 사이에 동일하였다. B09 대립형질과 B44 대립형질 사이의 동일한 아미노산들에 상응하는 B09 대립형질의 코돈 서열을, B44 최적화된 서열(서열번호 43)에서 사용된 코돈을 반영하도록 변화시켰다. B09(서열번호 49)와 B44(서열번호 44) 사이에 상이한 아미노산들에 대한 코돈 서열은 B09 DNA 서열에서 변화되지 않았다.
추가로, 비-지질화된 B44 아미노산 서열(서열번호 44)은 그의 N-말단에서 2개의 순차적인 세린-글리신 반복부 서열(S-G-G-G-G)(서열번호 56)(서열번호 44의 아미노산 2 내지 6도 참조)을 함유하는 반면, B09 대립형질은 N-말단에서 단지 1개의 세린-글리신 반복부를 함유한다(서열번호 49의 아미노산 2 내지 6 및 아미노산 7 내지 11 참조). 또한, B44의 N-말단에 위치하는 2개의 세린-글리신 반복부(서열번호 44의 아미노산 2 내지 6 및 아미노산 7 내지 11)는 상이한 코돈 용법을 가지므로(서열번호 43의 뉴클레오티드 4 내지 18 및 뉴클레오티드 19 내지 33 참조), 재조합 단백질 발현에 대한 영향을 조사하기 위해 최적화된 B44 세린-글리신 반복부의 상이한 조합(예를 들면, 서열번호 43의 뉴클레오티드 4 내지 18, 서열번호 43의 뉴클레오티드 19 내지 33, 또는 이들의 조합)을 B09 DNA 서열(서열번호 48, 예를 들면, 서열번호 48의 뉴클레오티드 4 내지 18)에 적용하였다.
최적화된 B09의 3개 상이한 버전들을 구축하였다: 서열번호 45는 최적화된 B44로부터의 2개 세린-글리신 반복부(GS1 및 GS2)(서열번호 43의 핵산 4 내지 33)를 함유하고, 서열번호 46은 GS1(서열번호 43의 핵산 4 내지 18)을 함유하고, 서열번호 47은 GS2(서열번호 43의 핵산 19 내지 33)를 함유한다. 상기 코돈 최적화된 서열들 전부에 대한 DNA를 당분야의 표준 화학반응을 이용하여 화학적으로 합성하였다. 생성된 DNA를 적절한 플라스미드 발현 벡터 내로 클로닝하고 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같이 에스케리치아 콜라이 숙주 세포에서의 발현에 대해 시험하였다.
실시예 8 : ORF2086 B09 변이체를 발현시키는 방법
에스케리치아 콜라이 K-12 균주(recA, fhuA 및 araA에서 결실을 갖는 야생형 W3110(CGSC4474)의 유도체)의 세포를 서열번호 45를 포함하는 플라스미드 pEB063, 서열번호 46을 포함하는 pEB064, 서열번호 47을 포함하는 플라스미드 pEB065 또는 서열번호 48을 포함하는 플라스미드 pLA134로 형질전환시켰다. 상기 K-12 균주에 대한 바람직한 변경은 발효 목적에 도움을 주지만 단백질의 발현을 위해 요구되지는 않는다.
세포를 글루코스-염 한정된 배지에 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 항온처리한 후, 연속적 글루코스 공급을 적용하였고, 항온처리를 추가 3시간 동안 계속하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1 mM의 최종 농도까지 배양물에 첨가한 후 37℃에서 12시간 동안 항온처리하였다. 16,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 리엔코 테크놀로지스(Lienco Technologies)(미국 미조리주 세인트루이스 소재)의 이지-라이스(Easy-Lyse)™ 세포 용해 키트 및 적재 완충제를 첨가하여 용해시켰다. 맑아진 용해물을 스캐닝 밀도측정기로 정량하면서 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색 및/또는 웨스턴 블롯 분석으로 B09의 발현에 대해 분석하였다. 스캐닝 밀도측정으로부터의 결과는 하기 표 7에 기재되어 있다.
[표 7]
Figure 112017071703505-pat00008
실시예 9 : ORF2086 B44 변이체를 발현시키는 방법
에스케리치아 콜라이 B 균주(BLR(DE3), 노바겐)의 세포를, 서열번호 51을 포함하는 플라스미드 pLN056으로 형질전환시켰다. 에스케리치아 콜라이 K-12 균주(야생형 W3110의 유도체)의 세포를, 서열번호 43을 포함하는 플라스미드 pDK087로 형질전환시켰다. 세포를 글루코스-염 한정된 배지에 접종하였다. 37℃에서 8시간 동안 항온처리한 후, 연속적 글루코스 공급을 적용하였고, 항온처리를 추가 3시간 동안 계속하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1 mM의 최종 농도까지 배양물에 첨가한 후 37℃에서 12시간 동안 항온처리하였다. 16,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고 리엔코 테크놀로지스(미국 미조리주 세인트루이스 소재)의 이지-라이스™ 세포 용해 키트 및 적재 완충제를 첨가하여 용해시켰다. 상청액을 스캐닝 밀도측정기로 정량하면서 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색 및/또는 웨스턴 블롯 분석으로 B09의 발현에 대해 분석하였다. 스캐닝 밀도측정으로부터의 결과는 하기 표 8에 기재되어 있다.
[표 8]
Figure 112017071703505-pat00009
실시예 10 : 피루빌화
본 실시예는 비-지질화된 ORF2086 단백질의 N-말단 Cys 잔기가 예를 들면, 에스케리치아 콜라이에서 발현되었을 때 피루빌화될 수 있다는 것을 입증한다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 변이체 A05(서열번호 13) 및 B44(서열번호 21)의 생성 동안 이종 단백질 축적을 모니터링하였다. 이 분리를 사중극자 비행시간(time-of-flight) 질량 분광측정기(QTOF-MS)와 접속시켜 생성물 관련 변이체의 형성을 모니터링하는 수단을 제공하였다.
에스케리치아 콜라이 B 및/또는 K-12 숙주 세포에서 발현된 후, 이들 발효로부터 유래된 생성물은 생성물 변경이 관찰되는 동안 정제 절차를 거쳤다. 질량 스펙트럼의 데콘볼루션(Deconvolution)은 변이체를, A05 및 B44에 대한 각각 27640 Da 및 27572 Da의 천연 생성물에 비해 +70 Da의 질량 변동을 나타내는 변이체로서 특징규명하였다.
공개된 문헌은 +70 Da의 질량 변동이 이전에 단백질에서 관찰되었고 아미노-말단 잔기의 피루빌화에 기인한다는 것을 보여주었다.
질량 스펙트럼 단편화 데이터(MS/MS)를 이용하여 피루베이트 기의 존재 및 위치를 확인하였다. 상기 데이터는 상기 변경이 A05 및 B44에 따른 아미노-말단 시스테인 잔기, 즉 위치 1의 아미노산 상에 존재한다는 것을 보여주었다. A05의 경우, 피루빌화된 폴리펩티드의 백분율은 A05 폴리펩티드(서열번호 13)의 총 수에 비해 약 30%이었다. B44의 경우, 피루빌화된 폴리펩티드의 백분율은 B44 폴리펩티드(서열번호 21)의 총 수에 비해 약 25%이었다.
아미노-말단 시스테인을 함유하지 않는 A05 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 13, 또는 서열번호 55) 및 B44 변이체(위치 1의 N-말단 Cys이 결실되어 있는 서열번호 21, 또는 서열번호 44)가 정제되었을 때, 검출가능한 피루빌화(+70 Da)는 없었다.
실시예 11 : 개별적으로 또는 조합물로 사용된 B09 및 B44의 면역원성
붉은털 마카크 원숭이들로 구성된 5개 내지 10개 군을 용량 당 250 mcg의 AlPO4로 제제화된 B09 변이체(서열번호 48에 의해 코딩된 서열번호 49) 또는 B44 변이체(서열번호 43에 의해 코딩된 서열번호 44), 또는 A05, B09 및 B44(각각 서열번호 55; 서열번호 48에 의해 코딩된 서열번호 49; 및 서열번호 43에 의해 코딩된 서열번호 44)로 면역화시켰다. 0주, 4주 및 8주에, 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 표 9 및 10에 나열된 바와 같이 단독으로 또는 조합물로 사용하여 근육내 경로를 통해 상기 원숭이들을 백신접종하였다. 0주 및 12주에 서브패밀리 A 또는 서브패밀리 B fHBP 변이체를 갖는 MnB 균주들에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자를 역가에서의 4배 상승을 갖는 동물로서 기록하였다. 시험된 B44 변이체는 최적화된 구축물(서열번호 43)이었고, 이전 연구(상기 표)에서 관찰된 넓은 반응률은 단독으로 또는 B09와의 조합물로 사용된 최적화된 구축물(표 9) B44 백신의 경우 유지되었다. B09 백신 단독(표 10)도 넓은 교차-반응성 면역 반응을 발생시킬 수 있었다(표 10).
[표 9]
Figure 112017071703505-pat00010
0주, 4주 및 8주에, 250 mcg의 AlPO4로 제제화된 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 백신 칸에 나열된 바와 같이 단독으로 또는 조합물로 사용하여 붉은털 마카크(n=10)를 근육내로 면역화시켰다. 0주 및 10주에, 표에 나열된 MnB 균주들에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자를 역가에서의 4배 상승을 갖는 동물로서 기록하였다.
표 9는 예를 들면, 비-피루빌화된 및 비-지질화된 B44, B09 및 A05의 조합물을 포함하는 조성물이 B44만을 포함하는 조성물로부터의 교차-보호범위에 비해 시험 변이체에 대한 보다 높은 교차-보호범위를 보였다는 것을 보여준다. 특히 표 6 및 9를 함께 포함하는. 본원에 나타낸 결과에 비추어 볼 때, B44, B09 및 A05를 단독으로 또는 조합물로 포함하는 조성물은 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 특히, B44 및 B09 둘다를 포함하는 조성물이 개시된다. 이러한 조성물은 바람직하게는 서브패밀리 A 폴리펩티드, 예컨대, 특히 A05를 추가로 포함한다.
[표 10]
Figure 112017071703505-pat00011
0주, 4주 및 8주에, 250 mcg의 AlPO4로 제제화된 각각 10 mcg의 비-지질화된 fHBP를 백신 칸에 나열된 바와 같이 단독으로 또는 조합물로 사용하여 붉은털 마카크(n=5)를 근육내로 면역화시켰다. 0주 및 10주에, 표에 나열된 MnB 균주들에 대한 SBA에서 혈청 샘플을 분석하였다. 반응자를 역가에서의 4배 상승을 갖는 동물로서 기록하였다.
실시예 12 : 지질화된 변이체 및 비- 지질화된 변이체 구축물에 의해 부여된 면역보호
찰스 리버(Charles River, 캐나다 소재)로부터 입수된 2.5 kg 내지 3.5 kg의 20마리 암컷 뉴질랜드 백색 토끼들을 전체 세포 ELISA로 예비스크리닝하였고, fHBP 변이체 B02(서열번호 16) 및 B44(서열번호 21)를 나타내는 시험 균주들에 대한 그들의 낮은 배경 역가를 기초로 이 연구를 위해 10마리의 동물들을 선택하였다(표 11). 0주, 4주 및 9주에, 0.5 ㎖ 용량 당 50 ㎍의 이스코매트릭스로 제제화된 100 ㎍의 각각의 단백질을 사용하여 3마리 동물들로 구성된 군을 근육내로 면역화시켰다(표 12). 군 1을 비-지질화된 B44(서열번호 44)로 백신접종하였다. AlP04(250 mcg)로 제제화된 지질화된 B01로 백신접종된 대조군을 포함시켰다. 0주, 4주, 9주 및 10주에 토끼를 채혈하였다. 10주부터 개별 혈청을 준비하고 fHBP B 서브패밀리로부터의 다수의 혈청군 B 수막염균 균주들에 대한 혈청 살균 분석으로 분석하였다.
[표 11]
Figure 112017071703505-pat00012
[표 12]
Figure 112017071703505-pat00013
혈청 살균 분석( SBA ): 다수의 혈청군 B 수막염균 균주들에 대한 마이크로콜로니 기초 혈청 살균 분석(SBA)(표 13)을 개별 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 공여자로부터의 인간 혈청을 상기 분석에서 시험된 균주에 대한 보체 공급원으로서 적합하게 하였다. 보체-매개된 항체 의존적 살균 역가를 내삽하고, 상기 분석에서 수막염균 세포의 50%를 사멸시킨 시험 혈청의 희석비의 역수로서 표현하였다. 상기 분석의 검출 한계는 4의 SBA 역가이었다. 4 미만의 SBA 역가는 2의 숫자를 배정받았다. 채혈 전 역가에 비해 10주 혈청에서의 SBA 역가의 4배 이상 상승을 계산하고 비교하였다.
SBA에서 측정된 혈청 살균 항체 활성은 수막염균 질환에 대한 보호의 면역학적 대용물이다. 토끼에서 살균 항체를 이끌어내는 비-지질화된 rfHBP를 사용한 면역화의 능력을 SBA로 측정하였다. SBA는 천연적으로 일어나는 보체-매개된 세균 용해를 모방함으로써 혈청 샘플에서 항체의 수준을 측정한다. 10주부터 채취된 토끼 혈청 샘플을, B44 fHBP 또는 B02 fHBP를 갖는 균주에 대한 SBA로 분석하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 3차 면역화로부터 1주 후(10주), 모든 혈청 샘플들은 시험 균주들 둘다에 대한 살균 활성을 나타내었다(표 13). 비-지질화된 B44(서열번호 44)는 뉴질랜드 토끼에서 이들 균주들에 대해 비-지질화된 B01보다 더 높은 면역원성을 나타내었다. 이스코매트릭스 항원보강제로 제제화된 비-지질화된 B44(서열번호 44)는 이들 균주들에 대해 인산알루미늄으로 제제화된 지질화된 B01에 필적할만한 역가를 제공하였다. 토끼의 채혈 전 혈청은 시험된 균주들에 대한 기존 살균 활성을 일반적으로 보이지 않았다.
[표 13]
Figure 112017071703505-pat00014
실시예 13 : 뉴질랜드 백색 토끼에서 6개의 비- 지질화된 인자 H 결합 단백질의 면역원성
5마리의 토끼들로 구성된 군을 표 14에 기재된 비-지질화된 fHBP 변이체로 면역화시켰다. 0주, 4주 및 9주에 백신을 투여하였다. 0주 및 10주부터 채취된 토끼 혈청 샘플을, 동종 fHBP 서열 및 이종 fHBP 서열을 갖는 균주들에 대한 SBA로 분석하였다. 표 14는 3차 면역화 후 % 반응자를 보여준다. 3차 면역화로부터 1주 후(10주), 모든 혈청 샘플들은 동종 균주들에 대한 살균 활성뿐만 아니라 동일한 fHBP 서브패밀리로부터의 다른 시험 균주들에 대한 살균 활성도 나타내었다. 토끼의 채혈 전 혈청은 시험된 균주들에 대한 기존 살균 활성을 일반적으로 보이지 않았다.
[표 14]
Figure 112017071703505-pat00015
Figure 112017071703505-pat00016
Figure 112017071703505-pat00017
실시예 14 :
>비-지질화된 A05(서열번호 55)
Figure 112017071703505-pat00018
>pEB042(서열번호 65)
Figure 112017071703505-pat00019
>비-지질화된 A12(서열번호 66)
Figure 112017071703505-pat00020
>pEB043(서열번호 67)
Figure 112017071703505-pat00021
>비-지질화된 A22(서열번호 68)
Figure 112017071703505-pat00022
>pEB058(서열번호 69)
Figure 112017071703505-pat00023
>A62(서열번호 70) 진뱅크: ACI46789.1
Figure 112017071703505-pat00024
>비-지질화된 A62(서열번호 71)
Figure 112017071703505-pat00025
>pLA164(서열번호 72)
Figure 112017071703505-pat00026
>pDK086(서열번호 73)
Figure 112017071703505-pat00027
>A29(서열번호 74)
Figure 112017071703505-pat00028
>비-지질화된 B22(서열번호 75)
Figure 112017071703505-pat00029
>비-지질화된 A05(서열번호 76)(pPW102)
Figure 112017071703505-pat00030
>비-지질화된 A05(서열번호 77)
Figure 112017071703505-pat00031
>컨센서스(서열번호 78)
Figure 112017071703505-pat00032
>컨센서스(서열번호 79)
Figure 112017071703505-pat00033
실시예 15 : 서브패밀리 A rP2086 의 비- 지질화된 변이체의 발생 - 비- 지질화된 fHBP 유전자의 클로닝
비-지질화된 A05 fHBP 단백질의 코딩 서열(서열번호 55)을 발현-최적화된 B44 서열(서열번호 43)과 정렬하였다. 이들 2개의 서열들 사이에 아미노산들이 동일한 경우, B44(서열번호 43)로부터의 코돈을 A05 유전자에서 치환하는 데에 사용하였다. N-말단 및 C-말단에서 각각 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위 NdeI 및 BamHI을 추가하면서 상기 최적화된 서열을 셀텍 진스(Celtek Genes)에서 드 노보(de novo)로 합성하였다. 생성된 유전자(서열번호 65)를 이들 부위들에서 pET30a 내로 서브클로닝하였다.
재조합 비-지질화된 A12 fHBP(서열번호 66)를 pEB043(서열번호 67)으로부터 발현시켰다. A12 대립형질은 블루 헤론 테크놀로지스(Blue Heron Technologies)에 의해 발현-최적화되었다. 이 유전자를 A05(pEB042)에 대한 과정과 동일한 과정으로 최적화하였다. 또한, 블루 헤론에 의해 최적화된 B44 SGGGGSGGGG(서열번호 44의 아미노산 잔기 2 내지 11) 아미노-말단 코돈은 천연 A12 SSGGGG(서열번호 66의 아미노산 잔기 1 내지 6) 코돈을 대체하였다. N-말단 및 C-말단에서 각각 제한 엔도뉴클레아제 부위 NdeI 및 BamHI을 추가하면서 상기 최적화된 서열을 셀텍 진스에서 드 노보로 합성하였다. 생성된 유전자(서열번호 67)를 이들 부위들에서 pET30a 내로 서브클로닝하였다.
재조합 비-지질화된 A22 fHBP(서열번호 68)를 pEB058(서열번호 69)로부터 발현시켰다. 이 유전자를 pEB042에 대한 과정과 동일한 과정으로 최적화하였다. 또한, 블루 헤론에 의해 최적화된 B44 SGGGG(서열번호 44의 아미노산 잔기 2 내지 6) 아미노-말단 코돈은 천연 A22 SSGGGG(서열번호 68의 아미노산 잔기 1 내지 6) 코돈을 대체하였다. N-말단 및 C-말단에서 각각 제한 엔도뉴클레아제 부위 NdeI 및 BamHI을 추가하면서 상기 최적화된 서열을 셀텍 진스에서 드 노보로 합성하였다. 생성된 유전자(서열번호 69)를 이들 부위들에서 pET30a 내로 서브클로닝하였다.
재조합 A62 fHBP(서열번호 71)를 pLA164(서열번호 72)로부터 발현시켰다. N-말단 및 C-말단에서 각각 제한 엔도뉴클레아제 부위 NdeI 및 BamHI을 함유하는 프라이머를 사용하여 균주 0167/03으로부터의 A62_002 대립형질을 PCR 증폭하였다. 생성된 유전자(서열번호 72)를 이들 부위들에서 pET30a 내로 서브클로닝하였다.
실시예 16 : 서브패밀리 A rP2086 단백질의 발현, 발효 및 정제
에스케리치아 콜라이 발현 균주
pLA164(서열번호 72)로 형질전환된 BLR(DE3) 에스케리치아 콜라이 B recA-를 A62(서열번호 71)의 발현을 위해 사용하였다. 에스케리치아 콜라이 숙주 BD643(W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA)을 플라스미드 pEB042(서열번호 65)로 형질전환시켜 A05(서열번호 55)의 발현용 균주 BD660을 제공하였다. A22(서열번호 68)는 숙주 BD559(W3110:DE3 ΔrecA ΔfhuA ΔaraA)에 존재하는 플라스미드 pEB058(서열번호 69)로 구성된 균주 BD592로부터 발현되었다. 마지막으로, 숙주 BD483(W3110:DE3 ΔrecA)을 플라스미드 pEB043(서열번호 67)으로 형질전환시켜 A12(서열번호 66)의 발현용 균주 BD540을 제공하였다.
발효
발현 균주를 글루코스 기초 최소 배지에서 발효시켰다. 20%에서의 단계적 dO 조절을 이용하면서 37℃ 및 1 vvm 통기에서 작동되는 10 ℓ 발효기에 밤새 출발 배양물을 접종시켰다. 일괄 배합된 글루코스가 (약 OD600=15에서) 배지로부터 고갈되었을 때, 제한 연속적 글루코스 공급을 3.8 g/ℓ/hr의 속도로 개시하였다. 0.1 mM IPTG로 유도할 때까지 및 후속 단백질 발현 기간 전체에 걸쳐 상기 공급을 계속하였다. A05(서열번호 55)의 발현을 위해, 균주 BD660을 OD600=25에서 유도하고 발효를 유도 후 7시간(7 HPI)에 걸쳐 계속하였다. OD600=40에서 유도하고 유도 후 24시간(24 HPI) 동안 발효시킴으로써 균주 BD592 및 BD540으로부터 각각 A22(서열번호 68) 및 A12(서열번호 66)의 발현을 달성하였다. 발효의 말기에 세포 페이스트를 원심분리로 수집하였다.
A62(서열번호 71)
rP2086 단백질은 에스케리치아 콜라이 균주의 세포질에서 가용성 단백질로서 제조된다. 전형적으로 rP2086의 서브패밀리 A의 특정 변이체를 발현하는 동결된 세포를 저긴장성 완충제(프로테아제 억제제를 함유하는 10 mM 헤페스(Hepes)-NaOH(pH 7.4))에서 해동시키고 상기 세포를 약 20,000 psi 하에서 미세유동화기에서 파괴함으로써 가용성 세포질 추출물을 수득한다. RNase 및 DNAse를 첨가하여 핵산을 분해하고, 저속에서 원심분리하여 임의의 파괴되지 않은 세포를 제거한 후 고속(>100,000xg)에서 원심분리하여 막, 세포벽 및 다른 보다 큰 하위세포 구성요소를 제거한 후 상청액으로서 세포질 추출물을 수집한다. 25% 포화된 황산암모늄에 이어서 50% 포화된 황산암모늄으로의 순차적인 조절, 및 각각의 조절 후 저속 원심분리에 의한 침전된 물질의 제거를 통해 세포질 추출물을 더 정화한다. 그 다음, 10 mM 헤페스-NaOH(pH 7.4) 및 1 mM Na2EDTA로 구성된 완충제 중의 50% 포화된 황산암모늄 중의 rP2086을 소수성 상호작용 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터 구입된 페닐 세파로스)에 흡착시킨 후, 10 mM 헤페스-NaOH(pH 7.4) 및 1 mM Na2EDTA로 구성된 완충제를 사용하여 황산암모늄 농도를 0%까지 연속적으로 감소시켜 rP2086을 용출함으로써 저분자량 이온성 세포 구성요소들을 제거한다. 그 다음, rP2086 함유 분획을 10 mM 트라이스-HCl(pH 8.6) 및 1 mM Na2EDTA로 구성된 완충제로 조절한 후 모은 분획들을 동일한 완충제로 평형화된 음이온 교환 컬럼(이엠디(EMD)로부터 구입된 TMAE) 상에 통과시킴으로써 대다수의 음으로 하전된 단백질들을 제거한다. 그 다음, rP2086을 함유하는 완충제를, 1 mM 인산나트륨을 함유하는 10 mM 헤페스-NaOH(pH 7.4)로 교환하고, 상기 단백질을 세라믹 하이드록시아파타이트에 흡착시킨 후 pH 7.4에서 250 mM까지의 인산나트륨 선형 구배를 이용하여 용출함으로써 세라믹 하이드록시아파타이트(바이오라드(BioRad)로부터 입수됨) 상에서의 크로마토그래피로 rP2086을 더 정제한다. 상기 나열된 유닛 작업들은 정제된 rP2086 서브패밀리 A 구성원을 제공하는 데에 종종 충분하다. 그러나, rP2086이 범위의 하한 수준으로 발현될 때 또는 초순수 rP2086이 (NMR 구조 확인을 위해 고농도로) 필요할 때 발현 수준이 10배 이상 달라질 수 있기 때문에, 하기 추가 유닛 작업들이 추가된다: 크로마토포커싱(chromatofocusing)에 이어서 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피. 앞선 하이드록시아파타이트 단계로부터 수득된 rP2086 단백질을 함유하는 완충제를 25 mM 트라이스-아세테이트(pH 8.3)로 교환하고, 상기 단백질을 동일한 완충제로 평형화된 크로마토포커싱 PBE94 컬럼(지이 헬쓰케어로부터 입수됨)에 흡착시킨 후, 폴리완충제 94-아세테이트(pH 6)로 구성된 완충제로 용출한다. rP2086 단백질들은 대략 그들의 pI에서 용출될 것이고, 상기 단백질을 함유하는 분획을 모은다. 그 다음, rP2086 함유 분획의 완충제를, 1 mM 인산나트륨을 함유하는 10 mM 헤페스-NaOH(pH 7.4)로 교환하고 전술된 바와 같이 흡착시키고 용출한다. 이 과정에 의해 제조된 rP2086 서브패밀리 A 구성원은 SDS-PAGE 분석에 의해 확인될 때 전형적으로 95% 초과의 균질성, 가장 빈번하게는 99% 초과의 균질성을 갖는다.
A05, A12 및 A22(각각 서열번호 55, 66 및 68)
발효 말기에, 세포 슬러리를 연속적 원심분리로 회수하고 20 mM 트라이스 및 5 mM EDTA로 구성된 완충제(pH 6.0)에 원래 발효 부피의 약 1/4까지 재현탁한다. 세포 현탁액의 용해를 고압 균질화(2회 통과, 4000 psi 내지 9000 psi)로 달성한다. DADMAC를 균질화물에 0.5%의 최종 농도까지 첨가한다. 무거운 침전물이 형성되는 시간인 60분 동안 용액을 15℃ 내지 25℃에서 교반한다. 용액을 연속적 원심분리로 정화한다. 2개의 크로마토그래피 단계에 이어서 최종 완충제 교환을 이용하여 단백질(A05, A12 및 A22)을 정제한다. 농축물의 pH를 5.5로 조절하고 기가캡(GigaCap)-S 컬럼(CEX) 상에 적재한다. 단백질이 수지에 결합한 후, 염화나트륨 구배를 이용하여 상기 단백질을 용출한다. 시트르산나트륨을 CEX 컬럼으로부터 수득된 풀(pool)에 1.5 M의 최종 농도까지 첨가하고, 용액을 페닐-650M 컬럼(HIC) 상에 적재한다. 단백질이 수지에 결합한 후, 시트르산나트륨 단계 구배를 이용하여 상기 단백질을 용출한다. 정제된 단백질을 함유하는 HIC 풀을 정용여과로 최종 약물 완충제로 교환한다. 5 kD의 재생된 셀룰로스 아세테이트 한외여과 카세트를 이용한다. 목표 단백질 농도는 1.5 mg/㎖ 내지 2.0 mg/㎖이다. 정용여과된 보유물을 저장 병 내에 충전시키기 전에 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 약물을 -70℃에서 저장한다.
실시예 17 : 혈청 살균 분석
백신에 함유된 서열에 대한 동종성 또는 이종성을 나타내는 서열을 갖는 fHBP를 발현하는 야생형 또는 조작된 수막염균 혈청군 B 균주에 대한 혈청 살균 분석(SBA)으로 기능성 항체 역가를 조사하였다. 인간 보체를 사용하는 SBA를 이용하여 rP2086 백신으로 면역화된 토끼에서 혈청 살균 항체를 측정하였다. 고유의 보체 활성을 제거하기 위해 토끼 면역 혈청을 열 불활성화시킨 후, 수막염균 균주에 대한 혈청 살균 활성에 대해 시험하기 위해 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 Ca2 + 및 Mg2 +를 갖는 둘베코의 PBS(D-PBS)로 연속적으로 2배 희석하였다. 조작된 균주를 사용한 조합 연구를 위해, 각각의 성분의 유효 농도가 각각의 성분을 개별적으로 시험하였을 때의 농도의 절반이도록 관심있는 혈청을 전술된 연속적 희석 전에 1:1 비로 혼합하였다. 분석에서 사용되는 세균을 켈로그 보충제(GCK)로 보충된 GC 배지에서 생장시키고, 650 nm에서 광학 밀도로 모니터링하였다. 세균을 분석에서 사용하기 위해 0.50 내지 0.55의 최종 OD650에서 수집하고 D-PBS로 희석하고, 1000 CFU 내지 3000 CFU를 분석 혼합물에 첨가하였다. 검출가능한 살균 활성을 갖지 않는 인간 혈청을 외부 보체 공급원으로서 사용하였다. 보체 공급원을 각각의 개별 시험 균주에 대한 적합성에 대해 시험하였다. 동질유전자형(isogenic) 균주들을 위해, 단일 인간 혈청을 확인하고 모든 동질유전자형 균주들에 대한 SBA에 적합하게 하였다. 보체 공급원은 첨가된 면역 혈청을 갖지 않는 대조군에서 생존하는 세균의 수가 75% 초과의 수준인 경우에만 사용되었다. 37℃에서 5% CO2와 함께 30분 동안 항온처리하고 진탕기 상에서 700 rpm으로 교반한 후, D-PBS를 반응 혼합물에 첨가하고, 야생형 균주의 경우 분취물을 50% GCK 배지로 예비충전된 마이크로필터 플레이트로 옮기고, 조작된 균주의 경우 분취물을 100% GCK 배지로 예비충전된 마이크로필터 플레이트로 옮겼다. 마이크로필터 플레이트를 여과하고 37℃에서 5% CO2와 함께 밤새 항온처리하고 마이크로콜로니를 염색하고 정량하였다. 혈청 살균 역가는 면역 혈청을 갖지 않는 대조군 웰에서의 CFU에 비해 CFU에서의 50% 감소를 발생시키는 내삽된 역수 혈청 희석비로서 정의되었다. 항-rP2086 면역 혈청에 의해 사멸에 대한 민감성은 상응하는 면역 전 혈청에 비해 항-rP2086 면역 혈청에 대한 SBA 역가의 4배 이상의 상승이 있는 경우 확립되었다. 출발 희석비에서 분석 균주에 대한 음성을 나타내는 혈청은 상기 분석에 대한 검출 한계의 절반의 역가를 배정받았다.
실시예 18 : rP2086 서브패밀리 A 단백질의 비- 지질화된 변이체의 면역원성
찰스 리버(캐나다 소재)로부터 입수된 백색 뉴질랜드 암컷 토끼(2.5 kg 내지 3.5 kg)를 2개의 연구에서 사용하였다. 제1 연구를 위해, 3마리의 토끼들로 구성된 군들을 각각 30 mcg 또는 3 mcg의 지질화된 A05 또는 비-지질화된 A05 fHBP 제제로 면역화시켰다. 제2 연구를 위해, 500 ㎍/㎖의 AlPO4로 항원보강된 20 ㎍/㎖의 rP2086A 변이체(0.5 ㎖/용량/2개 부위)를 사용하여 군 당 5마리의 토끼들을 우측 뒷다리에서 근육내로 면역화시켰다. 동물을 0주, 4주 및 9주에 백신접종하고 0주 및 6주에 채혈하고 10주에 방혈하였다. LP2086 특이적 살균 항체 역가를 0주, 6주 및 10주에서 측정하였다.
이들 연구들의 목표는 면역학적 무경험 집단, 예컨대, 유아의 경우 관찰되는 감소된 반응을 모방하기 위한 것이었다. 먼저, 본 발명자들은 지질화된 A05(서열번호 13) 또는 비-지질화된 A05(서열번호 55)를 함유하는 저용량의 백신과 고용량의 백신(용량 당 항원 당 30 mcg 대 3 mcg)을 비교하였다(표 15A 및 15B). 반응률의 차이가 각각의 백신 사이에 식별될 수 있도록 저용량을 사용하였다. 2개의 균주 세트를 사용하여 SBA 분석을 수행하였다. 제1 세트는 침습성 질환을 야기하는 야생형 균주로 구성되었다. 제2 세트는 동일한 균주 배경을 갖고 fHBP의 서열이 다음과 같이 발현된다는 점에 의해서만 상이한 유전적으로 조작된 균주 세트이었다: fHBP의 B24 변이체를 발현하는 수막염균 균주 PMB3556을, 그의 내생성 fhbp 유전자가 다른 fHBP 변이체를 코딩하는 유전자로 치환되도록 조작하였다. ORF를 코딩하는 영역만이 "전환되고" 주위 유전적 배경은 온전한 상태로 남아있도록 구축물을 디자인하였다. 따라서, 이 균주 세트를 사용하는 SBA 분석은 인간 보체의 한 공급원을 사용하여 동일한 유전적 배경에서 동일한 수준으로 발현된 상이한 서브패밀리 A fHBP 단백질들에 대한 반응성을 평가할 수 있게 하였다. 모든 균주들이 문헌(Jiang et al (2010))에 의해 확인된 역치 초과의 fHBP 발현 수준을 가졌다. 표 15A 및 15B에 제시된 바와 같이, 고용량 수준의 지질화된 A05 함유 백신 및 저용량 수준의 지질화된 A05 함유 백신 둘다가 유전적으로 상이한 서브패밀리 A 변이체들에 걸쳐 넓은 보호를 이끌어낸 반면, 비-지질화된 A05 변이체를 함유하는 백신의 경우 상기 두 용량에서 감소된 반응이 관찰되었다. 따라서, 이 병렬 비교는 비-지질화된 A05 변이체가 서브패밀리 A 발현 균주들에 걸쳐 교차-보호를 제공하지만 천연 입체구조를 형성할 가능성이 더 높은 지질화된 변이체만큼 높은 면역원성을 나타내지는 않는다는 것을 보여주었다(표 15A 및 15B).
후속 연구를 위해, 용량 수준을 비-지질화된 서브패밀리 A 변이체 당 10 mcg까지 상승시켜 서브패밀리 A 균주들에 대한 넓은 보호범위를 제공하는 그의 잠재력에 대해 각각을 평가하였다. SBA 분석은 이 상승된 용량 수준에서 비-지질화된 A05(서열번호 55), A62(서열번호 71), A12(서열번호 66) 및 A22(서열번호 68) fHBP 변이체들로 면역화된 토끼들의 모든 혈청이 동종 서브패밀리 A 변이체 및 이종 서브패밀리 A 변이체 둘다를 발현하는 야생형 균주들에 대한 역가를 유도하였다는 것을 보여주는데, 이것은 상기 모든 혈청이 이 저용량에서 서브패밀리 A 내에서 교차-보호를 제공하였다는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명자들은 N2C1 백신(A05)이 N1C2(A22) 및 N2C2(A12) 변이체 균주들을 사멸시킬 수 있는 항체를 발생시킬 수 있었고, 마찬가지로 이들 다른 군들로부터의 백신이 대립되는 변이체들을 갖는 균주들을 사멸시킬 수 있었다는 것을 관찰하였다. 이들 조건들 하에서 A05 및 A62 변이체들이 균주들에 걸쳐 가장 높은 SBA 반응률을 유도하였다는 것을 관찰하였다(표 16). 따라서, 이것은 이들 변이체들에 걸쳐 보호 효과를 보여준다.
[표 15A]
Figure 112017071703505-pat00034
[표 15B]
Figure 112017071703505-pat00035
표 15A 및 15B: 지질화된 또는 비-지질화된 A05를 함유하는 30 mcg 또는 3 mcg의 백신을 사용한 토끼(n=3)의 면역화 전 및 후(PD3=10주) 채취된 혈청의 수막염균 군 B 균주에 대한 기하 평균 SBA 역가. 표 15A 및 15B의 상부 패널("야생형 균주"로 표지됨)은 임상 단리물에 대한 활성을 요약한다. 표 15A 및 15B의 하부 패널("동질유전자형 균주"로 표지됨)은 그의 내생성 fHBP의 전체 ORF가 A05(서열번호 13), A22(서열번호 15), A29(서열번호 74) 또는 A12(서열번호 14) 변이체로 치환되도록 모 수막염균 균주(PMB3556)로부터 조작된 동질유전자형 균주 세트에 대한 활성을 요약한다.
[표 16]
Figure 112017071703505-pat00036
표 16: 10 mcg의 비-지질화된 A 서브패밀리 fHBP 변이체로 면역화된 토끼로부터 10주에 채취된 혈청이 A05, A62, A12 또는 A22 fHBP 변이체를 발현하는 균주에 대해 나타내는 SBA GMT 수준이 배경에 비해 4배 이상 상승되었음을 보이는 반응자의 백분율.
전술된 동질유전자형 균주 세트를, 가장 높은 교차-반응성을 나타내는 A62 변이체(서열번호 71)로 면역화된 토끼로부터 채취된 혈청에 이어서 A05 항-혈청과 함께 사용하였을 때 10 mcg의 증가된 용량에서 모든 변이체들에 대한 교차-보호도 관찰되었다(표 17). 또한, A62 변이체(서열번호 71)로 면역화된 토끼로부터 채취된 혈청은 모 PMB3556 균주 및 B09 전환된 균주 둘다에 대한 반응성을 보였는데(표 18), 이것은 교차-반응 활성이 서브패밀리 B 단백질로 확장된다는 것을 암시한다. A62는 서브패밀리 A(A22) 도메인 및 서브패밀리 B(B09) 도메인 둘다로 구성되는 듯하다(도 9).
[표 17]
Figure 112017071703505-pat00037
표 17: 동질유전자형 "전환된" 균주를, 그의 내생성 fHBP(B24 변이체)의 전체 ORF가 A05(서열번호 13), A22(서열번호 15), A29(서열번호 74) 또는 A12(서열번호 14) 변이체로 치환되도록 모 수막염균 균주(PMB3556)로부터 조작하였다. KA3011은 음성 대조군 균주(즉, fhbp 유전자가 결실되어 있는 모 PMB3556)이다. 이들 균주들에 대한 (3회 용량의 10 mcg 비-지질화된 A 서브패밀리 fHBP 변이체를 사용한 토끼의 면역화 전 및 10주 후 채취된) 혈청의 기하 평균 SBA 역가(n=5)가 상부 패널에 제시되어 있다. 배경에 비해 반응의 4배 이상의 상승을 나타내는 반응자의 백분율은 하부 패널에 제시되어 있다.
[표 18]
Figure 112017071703505-pat00038
표 18: 2개의 서브패밀리 B 동질유전자형 균주들에 대한 (10 mcg의 비-지질화된 서브패밀리 A 단백질(A62(서열번호 71), A05(서열번호 55), A12(서열번호 66) 및 A22(서열번호 68))을 사용한 토끼(n=5)의 면역화 전 또는 10주 후 채취된) 혈청의 기하 평균 SBA 역가.
실시예 19 : 비- 지질화된 서브패밀리 A 단백질에 대해 발생된 혈청 조합의 SBA에 대한 효과의 평가
보호범위에 대한 효과를 평가하기 위해 혈청의 조합물들을 평가하였다. 혈청 조합의 결과로서 유도된 비-특이적 사멸이 없다는 것을 확인하기 위해, 짝지어진 백신접종 전 대 후 혈청을 시험하였다. 개별 혈청, 및 서브패밀리 A 내의 다양성을 대표하는 4개의 동질유전자형 균주들에 걸친 혈청의 조합물에 대한 GM 배수 상승을 계산하였다. 시험된 조합물들 중 일부의 경우 배수 상승 증가가 검출되었는데, 이것은 보다 많은 서브패밀리 A 변이체들을 포함시킴으로써 보호범위를 증가시킬 수 있다는 증거를 제공한다(표 19). 최적 조합물은 A05(서열번호 55)와 A62(서열번호 71)의 조합물 또는 A62(서열번호 71)와 A12(서열번호 66)의 조합물인 듯하다(표 20).
[표 19]
Figure 112017071703505-pat00039
표 19: 각각의 백신 군의 가장 높은 반응자로부터 채취된 혈청의 SBA 역가를 표 17에 제시된 동질유전자형 균주에 대해 재시험하였다. 혈청을 1:1 혼합물에서 시험하여 상승작용적 활성의 정도를 측정하였다.
[표 20]
Figure 112017071703505-pat00040
표 20: 단독으로 시험된 각각의 혈청에 비해 조합물로 시험된 혈청에 대한 배수 상승 증가(표 19로부터 계산됨).
상기 실시예 18 및 19에 제공된 결과는 비-지질화된 서브패밀리 A 단백질이 면역원성을 갖고 동종 또는 이종 변이체를 보유하는 수막염균 균주에 의한 감염으로부터 보호를 제공할 수 있다는 것을 보여준다. 여기서 제공된 데이터는 선택된 비-지질화된 서브패밀리 A 변이체가 면역원성을 보유하고 이종 균주에 대한 교차-보호를 제공하지만, 이들 반응들이 지질화된 변이체보다 더 낮다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 A62(서열번호 71) 백신이 서브패밀리 B 변이체 B09 또는 B24를 발현하는 균주를 사멸시킬 수 있기 때문에 서브패밀리 B와 서열 유사성을 갖는 A62(서열번호 71) rP2086 항원(예를 들면, 도 9 참조)이 서브패밀리들에 걸쳐 보호를 제공할 수 있다는 것도 입증한다.
상기 제공된 데이터는 비-지질화된 서브패밀리 A 변이체가 지질화된 fHBP의 조합물을 사용한 경우 관찰된 종류의 상승작용을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 서브패밀리 B 변이체에 대한 보호범위도 제공할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 20 : 뉴질랜드 백색 토끼에서 인자 H 결합 단백질과 4가 수막염균 접합체 백신의 조합물의 면역원성의 평가
찰스 리버(캐나다 소재)로부터 입수된 2.5 kg 내지 3.5 kg의 뉴질랜드 백색 토끼에서 연구를 수행하였다(표 21). 연구에 들어가기 전, 균주 A05 및 B02에 대한 전체 세포 ELISA를 이용하여 55마리의 토끼들을 기존 항체에 대해 예비스크리닝하였다. 스크리닝 후, 상대적으로 낮은 항체 역가(특이적 IgG 역가 <350)를 갖는 토끼들을 0주, 4주 및 9주에 부위 당 0.5 ㎖(용량 당 1.0 ㎖, 표 22 참조)로 뒷다리에서 근육내로 백신접종하였다. 군 당 3마리의 토끼들이 있었다. 0주, 4주, 6주 및 9주에 토끼들을 채혈하고 10주에 방혈하였다. 혈청 샘플을 준비하고 0주 및 10주에 혈청 샘플을 SBA로 분석하였다. 수막염균 접합체 백신(멘베오(MENVEO)®, 수막염균(군 A, C, Y 및 W135) 올리고사카라이드 디프테리아 CRM197 접합체 백신, 노바티스), 2가 rLP2086 및 4가 비-지질화된 변이체, 및 이들의 조합물을 표 23 내지 26에 따라 제조하였다.
[표 21]
Figure 112017071703505-pat00041
연구의 디자인은 표 22에 제시되어 있다.
[표 22]
Figure 112017071703505-pat00042
[표 23]
Figure 112017071703505-pat00043
Figure 112017071703505-pat00044
[표 24]
Figure 112017071703505-pat00045
Figure 112017071703505-pat00046
[표 25]
Figure 112017071703505-pat00047
[표 26]
Figure 112017071703505-pat00048
비-지질화된 4가 단백질(B22, B09, A05 및 B44)을 멘베로®와의 조합 시 2℃ 내지 8℃에서 6시간 동안 안정성에 대해 모니터링하였다.
실시예 21 : 혈청 살균 분석( SBA )
다수의 혈청군 B, C 및 Y 수막염균 균주들에 대한 마이크로콜로니 기초 혈청 살균 분석(SBA)(표 27)을 개별 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 공여자로부터의 인간 혈청을 이 분석에서 시험된 균주에 대한 보체 공급원으로서 적합하게 하였다. 보체-매개된 항체 의존적 살균 역가를 내삽하고 이 분석에서 수막염균 세포의 50%를 사멸시키는 시험 혈청의 희석비의 역수로서 표현하였다. 이 분석의 검출 한계는 4의 SBA 역가이었다. 4 미만의 SBA 역가는 2의 숫자를 배정받았다. 채혈 전 역가에 비해 10주 혈청에서의 SBA 역가의 4배 이상 상승을 계산하고 비교하였다.
[표 27]
Figure 112017071703505-pat00049
실시예 22 : 뉴질랜드 백색 토끼에서 지질화된 또는 비- 지질화된 인자 H 결합 단백질과 접합된 백신의 조합물의 면역원성
혈청 살균 항체는 수막염균 질환에 대한 보호의 면역학적 대용물이다. 지질화된 또는 비-지질화된 rfHBP 4가 접합체 백신들을 단독으로 또는 조합물로 사용하는 면역화가 토끼에서 살균 항체를 이끌어내었는지를 SBA로 확인하였다. SBA는 천연에서 일어나는 보체-매개된 살균 용해를 모방함으로써 혈청 샘플에서 항체의 수준을 측정한다. 인간에서 1:4의 SBA 역가는 보호성 역가로서 간주되고; 면역화 전 대 후 역가의 4배 상승도 면역학적으로 적절한 면역 반응인 것으로 간주된다. 0주 및 10주부터 채취된 토끼 혈청 샘플을 여러 수막염균 혈청군의 균주들에 대한 SBA로 분석하였다. 표 28(고용량) 및 29(저용량)에 나타낸 바와 같이, 3차 면역화로부터 1주 후(10주), 4가 접합체 백신만이 시험된 MnC 및 MnY 균주들에 대한 SBA 반응을 이끌어내었다. 모든 다른 혈청 샘플들은 동종 균주들에 대한 살균 활성뿐만 아니라 상기 백신 제제 중의 fHBP 서브패밀리와 동일한 fHBP 서브패밀리로부터의 다른 시험 균주들에 대한 살균 활성도 나타내었다. 지질화된 A05/B01(각각 서열번호 13 및 58)을 각각 30 mcg 용량으로 단독으로 사용한 면역화가 동종 균주들에 대한 가장 높은 살균 항체뿐만 아니라 두 fHBP 서브패밀리들로부터의 다른 시험된 균주들에 대한 살균 항체도 이끌어내었다는 것을 주목한다(표 28). 유사하게, SBA 역가가 지질화된 2가 백신보다 3배 내지 15배 더 낮았지만, 비-지질화된 A05/B09/B22/B44(각각 서열번호 55, 49, 75 및 44)를 단독으로 사용한 면역화도 여러 수막염균 혈청군의 균주들에 대한 살균 항체를 이끌어내었다(표 30). 지질화된 fHBP, 고용량의 비-지질화된 fHBP 및 모든 조합물들의 경우 다양한 혈청군들의 모든 균주들에 대한 100% 반응률(SBA 역가의 4배 이상의 상승)이 달성되었다.
[표 28]
Figure 112017071703505-pat00050
토끼의 채혈 전 혈청은 시험된 균주들에 대한 기존 살균 활성을 보이지 않았다. 0주, 4주 및 8주에 0.5 ㎖ 백신을 사용하여 NZW 토끼(n=3)를 근육내로 백신접종하였다(데이터 10주).
[표 29]
Figure 112017071703505-pat00051
토끼의 채혈 전 혈청은 시험된 균주들에 대한 기존 살균 활성을 보이지 않았다. 0주, 4주 및 8주에 0.5 ㎖ 백신을 사용하여 NZW 토끼(n=3)를 근육내로 백신접종하였다(데이터 10주).
[표 30]
Figure 112017071703505-pat00052
0주, 4주 및 8주에 0.5 ㎖ 백신을 사용하여 NZQ 토끼(n=3)를 근육내로 백신접종하였다(데이터 10주).
지질화된 fHBP 는 비- 지질화된 fHBP 보다 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다.
용량 당 각각 30 mcg의 지질화된 fHBP는 시험된 모든 수막염균 B, C 및 Y 균주들에 대한 3배 내지 15배 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다. 용량 당 각각 30 mcg의 비-지질화된 fHBP는 시험된 모든 수막염균 B, C 및 Y 균주들에 대한 4배 내지 23배 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다(표 28 및 29).
fHBP , 접합체 백신 또는 조합물을 사용하여 용량 적정을 달성하였다.
고용량의 접합체 백신, fHBP 또는 이들의 조합물의 사용은 저용량을 사용한 경우보다 SBA 반응을 증가시켰다(표 28 내지 30). 1회 인간 용량의 접합체 백신은 수막염균 C 및 Y 균주에 대하여 10분의 1 용량의 접합체 백신보다 2배 내지 8배 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다. 용량 당 각각 30 mcg의 지질화된 fHBP는 시험된 모든 균주들에 대하여 용량 당 각각 3 mcg보다 2배 내지 4배 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다. 용량 당 각각 30 mcg의 비-지질화된 fHBP는 모든 수막염균 혈청군 B, C 및 Y 균주들에 대하여 용량 당 각각 3 mcg보다 4배 내지 15배 더 높은 SBA 역가를 이끌어내었다.
fHBP 와 접합체 백신의 조합물에 의한 상승작용적 SBA 반응
접합체 백신과 fHBP의 조합물을 사용하였을 때 수막염균 혈청군 C 및 Y 균주들에 대한 SBA 반응은 각각의 성분을 단독으로 사용하였을 때, 특히 저용량의 지질화된 또는 비-지질화된 fHBP를 첨가하였을 때보다 더 높은 경향이 있다(표 29). 본 연구에서, AlPO4로 제제화된 재조합 지질화된 또는 비-지질화된 fHBP 및 접합체 백신을 단독으로 또는 조합물로 사용하여 면역화시킨 뉴질랜드 백색 토끼로부터 채취된 혈청을 사용하여 여러 수막염균 혈청군의 균주들에 대한 기능적 활성을 평가하였다. 접합체 백신을 제공받은 토끼는 수막염균 혈청군 C 및 Y 균주들에 대한 SBA 반응만을 이끌어내었고 혈청군 B 균주에 대한 SBA 반응을 이끌어내지 못하였다. AlPO4로 제제화된 지질화된 또는 비-지질화된 fHBP는 시험된 모든 수막염균 혈청군의 균주들에 대한 살균 혈청 항체를 이끌어내었다.
AlPO4로 제제화된 3회 용량의 지질화된 또는 비-지질화된 fHBP를 제공받은 뉴질랜드 백색 토끼는 시험된 수막염균 혈청군 B, C 및 Y 균주들에 대한 살균 혈청 항체를 이끌어내었다. 저용량의 비-지질화된 군을 제외하고 시험된 모든 균주들에 대한 100%의 반응률(SBA 역가의 4배 이상의 상승)을 달성하였다.
지질화된 fHBP는 비-지질화된 형태보다 더 높은 살균 항체 역가를 이끌어내었다. 지질화된 또는 비-지질화된 fHBP 및 접합체 백신을 단독으로 또는 조합물로 사용하였을 때 명확한 용량 반응이 관찰되었다.
특히 저용량 단백질의 첨가 시 접합체 백신과 fHBP 사이에 수막염균 혈청군 C 및 Y에 대한 상승작용적 SBA 반응의 경향이 있다.
실시예 23 : 뉴질랜드 백색 토끼에서 비- 지질화된 인자 H 결합 단백질들의 조합물의 면역원성의 평가
찰스 리버(캐나다 소재)로부터 입수된 2.5 kg 내지 3.5 kg의 뉴질랜드 백색 토끼에서 연구를 수행하였다(표 31). 0주, 4주 및 9주에 토끼를 부위 당 0.5 ㎖(용량 당 1.0 ㎖, 표 32 참조)로 뒷다리에서 근육내로 백신접종하였다. 시험된 항원들 각각에 대한 서열번호는 표 33에 나열되어 있다. 군 당 10마리의 토끼가 있었다. 0주 및 6주에 토끼를 채혈하고 10주에 방혈하였다. 혈청 샘플을 준비하고 0주 및 10주에 혈청 샘플을 수막염균 단리물 집단에 대한 SBA에서 분석하였다.
[표 31]
Figure 112017071703505-pat00053
[표 32]
Figure 112017071703505-pat00054
[표 33]
Figure 112017071703505-pat00055
표 34는 rLP2086-A05 및 rLP2086-B01 쌍의 지질화된 항원에 대한 면역 반응에 비해 비-지질화된 fHBP 단백질들의 혼합물에 대한 토끼에서의 면역 반응을 요약한다. 토끼의 채혈 전 혈청은 일반적으로 시험된 균주들에 대한 기존 살균 활성을 보이지 않았다. 면역 반응은 3차 면역화 후 4배 이상의 SBA 역가의 증가로 fHBP 항원들의 각각의 조합물에 반응하는 각각의 처리군 내의 동물의 %로서 제공되어 있다. 백신 면역원(A05, A12)과 동일한 fHBP 변이체를 발현하는 표적 수막염균 균주, 또는 이종 fHBP 변이체(A22, B16, B24)를 발현하는 균주를 사용하여 SBA 분석을 수행하였다. A22 fHBP 변이체의 비교 아미노산 서열 동일성은 시험된 서브패밀리 A 변이체들과 최대 15%까지 상이하다. 유사하게, B16 및 B24 fHBP 변이체의 비교 아미노산 서열 동일성은 항원으로서 포함된 서브패밀리 B 변이체들과 최대 12%까지 상이하다.
[표 34]
Figure 112017071703505-pat00056
10 mcg의 각각의 시험 rP2086 변이체로 면역화된 토끼 군들에서, A05 + A62 + B09 + B44의 조합물로 처리된 동물의 혈청 샘플은 가장 높은 살균 반응률을 가졌다. SBA 반응은 각각 5 mcg의 4개 비-지질화된 fHBP 변이체들의 동일한 혼합물로 처리된 동물에서 다소 감소되었다. 5 mcg 용량으로 사용된 fHBP 항원들의 다른 4가 군뿐만 아니라 비-지질화된 A05 + A62 + B09 + B44의 조합물도 마찬가지였다. 시험된 4가 조합물들 중 각각 5 mcg의 비-지질화된 fHBP 변이체 A12 + A62 + B09 + B44를 포함하는 처리군으로부터의 혈청 샘플은 선택된 분석 균주들에 대한 가장 우수한 SBA 반응률을 가졌다. A05 + A12 + A62 + B09 + B44의 5가 비-지질화된 조합물에 대한 반응률은 시험된 4가 조합물들 중 임의의 조합물에 대한 반응률보다 다소 더 우수하다.
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. <120> NEISSERIA MENINGITIDIS COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF <130> PC071917 <140> PCT/IB2013/051791 <141> 2013-03-06 <150> US 61/609,257 <151> 2012-03-09 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 780 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 1 tgcagcagcg gaggcggagg cggcggtgtc gccgccgaca tcggcacggg gcttgccgat 60 gcactaactg cgccgctcga ccataaagac aaaggtttga aatccctgac attggaagac 120 tccattcccc aaaacggaac actgaccctg tcggcacaag gtgcggaaaa aactttcaaa 180 gccggcgaca aagacaacag cctcaacacg ggcaaactga agaacgacaa aatcagccgc 240 ttcgacttcg tgcaaaaaat cgaagtggac ggacaaacca tcacactggc aagcggcgaa 300 tttcaaatat acaaacagga ccactccgcc gtcgttgccc tacagattga aaaaatcaac 360 aaccccgaca aaatcgacag cctgataaac caacgctcct tccttgtcag cggtttgggc 420 ggagaacata ccgccttcaa ccaactgccc ggcgacaaag ccgagtatca cggcaaagca 480 ttcagctccg acgatgccgg cggaaaactg acctatacca tagattttgc cgccaaacag 540 ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600 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taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720 ataagggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765 <210> 6 <211> 792 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 6 tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60 cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120 ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180 actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240 atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300 agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360 caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420 gacatagtgg gcgaacatac atcttttgac aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480 cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540 gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgcctgaact caatgttgac 600 ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660 ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720 gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca tacgccatat cggtcttgcc 780 gccaagcaat aa 792 <210> 7 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 7 tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag aacaagatcc agagcattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccggttcaaa atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccaaaga cgtcatggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgccggcg gaaaactgac ctatactata gattttgctg ccaaacaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600 gatgaaaaac accatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaatcaaga cgagaaaggc 660 agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcaataa 768 <210> 8 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 8 tgcagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc cgaactcaat gtcgagcttg ccaccgccta tatcaagccg 600 gatgaaaaac gccatgccgt tatcagcggt tccgtccttt acaaccaaga cgagaaaggc 660 agttactccc tcggtatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 gaaaccgcaa acggcataca ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768 <210> 9 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 9 tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggtgcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagattc ggagcattca 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgata tagcgggtga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcatt cggttcagac 480 gatgccagtg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg acacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gttgacctgg ccgcctccga tatcaagccg 600 gataaaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660 agttactctc taggcatctt tggcgggcaa gcccaggaag ttgccggcag cgcagaagtg 720 gaaaccgcaa acggcatacg ccatatcggt cttgccgcca agcagtaa 768 <210> 10 <211> 768 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 10 tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180 gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240 caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540 atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600 gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660 agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720 aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768 <210> 11 <211> 792 <212> DNA <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 11 tgcagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtcg ccgccgacat cggcgcgggg 60 cttgccgatg cactaaccgc accgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120 ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaga 180 actttcaaag ccggcgacaa agacaacagt ctcaacacag gcaaactgaa gaacgacaaa 240 atcagccgct tcgactttat ccgtcaaatc gaagtggacg ggcagctcat taccttggag 300 agcggagagt tccaagtgta caaacaaagc cattccgcct taaccgccct tcagaccgag 360 caagtacaag actcggagca ttccgggaag atggttgcga aacgccagtt cagaatcggc 420 gacatagtgg gcgaacatac atcttttggc aagcttccca aagacgtcat ggcgacatat 480 cgcgggacgg cgttcggttc agacgatgcc ggcggaaaac tgacctacac catagatttc 540 gccgccaagc agggacacgg caaaatcgaa catttgaaat cgccagaact caatgttgac 600 ctggccgccg ccgatatcaa gccggatgaa aaacaccatg ccgtcatcag cggttccgtc 660 ctttacaacc aagccgagaa aggcagttac tctctaggca tctttggcgg gcaagcccag 720 gaagttgccg gcagcgcgga agtggaaacc gcaaacggca 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180 aaagtcggcg acaaagacaa cagtctcaat acaggcaaat tgaagaacga caaaatcagc 240 cgcttcgact ttgtgcaaaa aatcgaagtg gacggacaaa ccatcacgct ggcaagcggc 300 gaatttcaaa tatacaaaca ggaccactcc gccgtcgttg ccctacagat tgaaaaaatc 360 aacaaccccg acaaaatcga cagcctgata aaccaacgct ccttccttgt cagcggtttg 420 ggcggagaac ataccgcctt caaccaactg cccagcggca aagccgagta tcacggcaaa 480 gcattcagct ccgacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ccatagattt tgccgccaaa 540 cagggacacg gcaaaatcga acacctgaaa acacccgagc agaatgtcga gcttgcctcc 600 gccgaactca aagcagatga aaaatcacac gccgtcattt tgggcgacac gcgctacggc 660 agcgaagaaa aaggcactta ccacctcgct cttttcggcg accgagccca agaaatcgcc 720 ggctcggcaa ccgtgaagat aagggaaaag gttcacgaaa tcggcatcgc cggcaaacag 780 tag 783 <210> 55 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 55 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly 1 5 10 15 Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 20 25 30 Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile 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cactattcca ttgactttac caaaaaacaa 540 ggatacggca gaattgaaca tttaaaaacg cccgaacaga acgtagagct cgcatccgca 600 gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgca gtcattttgg gtgacacgcg ctacggcggc 660 gaagaaaaag gtacttacca cttagccctt tttggcgacc gcgctcaaga aatcgcaggt 720 agcgcaaccg taaagataag ggaaaaggtt cacgaaattg ggatcgcggg caaacaataa 780 <210> 68 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 68 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln 85 90 95 Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys 100 105 110 Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 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240 caaatcgaag tagatggcca acttattaca ttagaaagcg gtgaattcca aatatataaa 300 caagaccatt cagcagtcgt tgcattgcaa attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360 gacagcctga taaaccaacg ttccttcctt gtcagcggtt tgggcggtga acatacagcc 420 ttcaaccaat taccaagcgg caaagcggag tatcacggta aagcatttag ctcagatgat 480 gcaggcggta aattaactta tacaattgac tttgcagcaa aacaaggaca tggcaaaatt 540 gaacatttaa aaacacccga acagaacgta gagctcgcat ccgcagaact caaagcagat 600 gaaaaatcac acgcagtcat tttgggtgac acgcgctacg gcggcgaaga aaaaggtact 660 taccacttag ctctttttgg cgaccgagct caagaaatcg caggtagcgc aaccgtaaag 720 ataagggaaa aggttcacga aattgggatc gcgggcaaac aataa 765 <210> 70 <211> 255 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 70 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln 115 120 125 Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu 180 185 190 Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile 195 200 205 Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu 210 215 220 Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val 225 230 235 240 Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 255 <210> 71 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 71 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln 85 90 95 Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln 100 105 110 Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe 115 120 125 Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro 130 135 140 Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp 145 150 155 160 Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175 His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 72 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid sequence <400> 72 atgagcagcg gagggggcgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60 accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt taacgctgga tcagtccgtc 120 aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180 gacagcctta atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240 caaatcgaag tggacgggaa gctcattacc ttggagagcg gagagttcca agtgtacaaa 300 caaagccatt ccgccttaac cgcccttcag accgagcaag tacaagactc ggaggattcc 360 gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420 tttgacaagc ttcccaaagg cggcagtgcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480 gatgctggcg gaaaactgac ctatactata gatttcgccg ccaaacaggg acacggcaaa 540 atcgaacact tgaaaacacc cgagcaaaat gtcgagcttg cctccgccga actcaaagca 600 gatgaaaaat cacacgccgt cattttgggc gacacgcgct acggcggcga agaaaaaggc 660 acttaccacc tcgccctttt cggcgaccgc gcccaagaaa tcgccggctc ggcaaccgtg 720 aagataaggg aaaaggttca cgaaatcggc atcgccggca aacagtaa 768 <210> 73 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid sequence <400> 73 atgtccagcg gttcaggcag cggcggtgga ggcgtggcag cagatatcgg aacaggttta 60 gcagatgctc tgacagcacc cttagatcac aaagacaaag gacttaaatc actgacattg 120 gaagattcta tctcgcaaaa tggtactctc actctttcag cccaaggcgc agaaaaaaca 180 tttaaagtag gcgataaaga taactcctta aatacaggta aattaaaaaa tgacaaaatc 240 tcacggtttg atttcgttca gaaaattgaa gtagatggac aaacgattac attagcaagc 300 ggcgaattcc aaatttataa acaagaccat tcagcagtag tagcattaca aatcgaaaaa 360 attaacaacc cggacaaaat tgattctctt attaaccaac gctcttttct cgtatcagga 420 cttggtggtg aacatacagc gtttaatcaa ctgccgtcag gaaaagcaga atatcatggt 480 aaagcatttt catcagacga cgcaggtggc aaactgacct atactattga ctttgcagca 540 aaacagggac atggaaaaat tgaacattta aaaacacccg aacagaacgt agaactggcc 600 tcagcagaat tgaaagctga tgaaaaatcc catgcagtaa ttttaggcga tacacgttac 660 ggtagcgaag aaaaaggtac atatcactta gctctttttg gcgatcgtgc tcaagaaatt 720 gctggttccg caacagttaa aatccgtgaa aaagtacatg aaatcggcat tgcaggtaaa 780 caataa 786 <210> 74 <211> 262 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis (group B) <400> 74 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala 50 55 60 Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr 85 90 95 Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser 100 105 110 Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile 115 120 125 Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly 130 135 140 Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Asp Lys Ala Glu Tyr His 145 150 155 160 Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Thr 165 170 175 Ile Asp Phe Thr Asn Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys 180 185 190 Thr Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp 195 200 205 Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu 210 215 220 Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile 245 250 255 Gly Ile Ala Gly Lys Gln 260 <210> 75 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 75 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Val Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln 85 90 95 Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln 100 105 110 Val Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe 115 120 125 Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro 130 135 140 Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp 145 150 155 160 Ala Ser Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175 His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu 180 185 190 Ala Ala Ser Asp Ile Lys Pro Asp Lys Lys Arg His Ala Val Ile Ser 195 200 205 Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly 210 215 220 Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu 225 230 235 240 Thr Ala Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 <210> 76 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 76 Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly 1 5 10 15 Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu 20 25 30 Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr 35 40 45 Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp 50 55 60 Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe 65 70 75 80 Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala 85 90 95 Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala 100 105 110 Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile 115 120 125 Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala 130 135 140 Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe 145 150 155 160 Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala 165 170 175 Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln 180 185 190 Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His 195 200 205 Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr 210 215 220 Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly 245 250 255 Lys Gln <210> 77 <211> 257 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 77 Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu 35 40 45 Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn 50 55 60 Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp 65 70 75 80 Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser 85 90 95 Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu 100 105 110 Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn 115 120 125 Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe 130 135 140 Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser 145 150 155 160 Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala 165 170 175 Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn 180 185 190 Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala 195 200 205 Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr 210 215 220 His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala 225 230 235 240 Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys 245 250 255 Gln <210> 78 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 78 Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln 20 25 30 Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45 Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg 65 70 75 80 Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95 Gln Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu 100 105 110 Gln Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125 Phe Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140 Pro Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp 145 150 155 160 Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln 165 170 175 Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu 180 185 190 Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile 195 200 205 Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu 210 215 220 Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val 225 230 235 240 Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 255 <210> 79 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 79 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln 85 90 95 Ile Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Val Ala Leu Gln Thr Glu Gln 100 105 110 Ile Asn Asn Ser Asp Lys Ser Gly Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe 115 120 125 Arg Ile Ser Gly Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro 130 135 140 Lys Gly Gly Lys Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Ser Ser Asp Asp 145 150 155 160 Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175 His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190 Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205 Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys 225 230 235 240 Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250 <210> 80 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 80 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr 50 55 60 Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln 65 70 75 80 Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln 85 90 95 Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln 100 105 110 Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe 115 120 125 Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro 130 135 140 Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp 145 150 155 160 Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175 Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu 180 185 190 Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser 195 200 205 Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly 210 215 220 Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys 225 230 235 240 Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250 <210> 81 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic amino acid sequence <400> 81 Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala 1 5 10 15 Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr 20 25 30 Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln 35 40 45 Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys 50 55 60 Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu 65 70 75 80 Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr 85 90 95 Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln 100 105 110 Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile 115 120 125 Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly 130 135 140 Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly 145 150 155 160 Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly 165 170 175 Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala 180 185 190 Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser 195 200 205 Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe 210 215 220 Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245 250

Claims (15)

  1. 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    지질화된 단리된 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    비-지질화된 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    비-피루빌화된 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서,
    비-지질화되고 비-피루빌화된 단리된 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서,
    면역원성을 갖는 단리된 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  8. 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  9. 제8항에 있어서,
    서열번호 67의 핵산 서열로 구성된 단리된 핵산.
  10. 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물에서 수막염균(Neisseria meningitidis)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  11. 서열번호 66에 기재된 아미노산 서열로 구성된 단리된 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 효과량을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물에서 수막염균에 대한 살균 항체를 이끌어내는 방법.
  12. 수막염균 혈청군 B로부터 단리된 비-지질화되고 비-피루빌화된 ORF2086 폴리펩티드로서 서열번호 66의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 및 하기 a) 내지 d)로부터 선택된 하나 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물:
    a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드(capsular saccharide)의 접합체;
    b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및
    d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
  13. 제12항에 있어서,
    하기 a) 내지 d)로부터 선택된 2개 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물:
    a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및
    d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
  14. 제12항에 있어서,
    하기 a) 내지 d)로부터 선택된 3개 이상의 접합체를 포함하는 면역원성 조성물:
    a) 수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    b) 수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    c) 수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및
    d) 수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체.
  15. 제12항에 있어서,
    수막염균 혈청군 A의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    수막염균 혈청군 C의 캡슐 사카라이드의 접합체;
    수막염균 혈청군 W135의 캡슐 사카라이드의 접합체; 및
    수막염균 혈청군 Y의 캡슐 사카라이드의 접합체
    를 포함하는 면역원성 조성물.
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