TWI605827B - 腦膜炎雙球菌(neisseria meningitidis)組合物及其方法 - Google Patents
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Description
本案主張2012年3月9日申請之美國臨時專利申請案61/609,257之利益,該美國臨時專利申請案之全文係併入本案參考。
本發明係關於腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)組合物及其方法。
腦膜炎雙球菌為一種可能會引起敗血症、腦膜炎及死亡之革蘭氏陰性包膜細菌。腦膜炎雙球菌基於化學上及抗原性上獨特之多醣莢膜而可分為約13個血清群(包括血清群A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y及Z)。其中五個血清群(A、B、C、Y及W135)為大部分疾病之成因。
腦膜炎雙球菌性腦膜炎為一種儘管可使用抗生素,但可能在數小時內殺死兒童及年輕成人的毀滅性疾病。亟需針對腦膜炎雙球菌血清群A、B、C、Y及W135及/或X之經改良之免疫原性組合物。
為了滿足此等及其他需要,本發明係關於腦膜炎雙球菌組合物及其方法。
在一個態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括與SEQ ID NO:71至少95%一致之胺基酸序列,其中該序列之前二十個胺基酸殘基不含半胱胺酸。
在一個實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置1至184
之胺基酸序列。
在一個實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置158至185之胺基酸序列。在另一實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置159至186之胺基酸序列。
在一個實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置185至254之胺基酸序列中之至少6個連續胺基酸。
在一個實施例中,經分離多肽係未經丙酮酸化。
在一個實施例中,經分離多肽係未經脂化。
在一個實施例中,經分離多肽具免疫原性。
在一個實施例中,經分離多肽包括由SEQ ID NO:71中所闡述之序列組成的胺基酸序列。
在一個態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括與SEQ ID NO:76至少95%一致之胺基酸序列,其中該序列之前二十個胺基酸殘基不含半胱胺酸。
在一個實施例中,經分離多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:76。
在一個實施例中,經分離多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:76,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,經分離多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:76,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在一個實施例中,經分離多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:77。
在一個實施例中,經分離多肽係未經丙酮酸化。在一個實施例中,經分離多肽係未經脂化。在一個實施例中,經分離多肽具免疫原性。
在另一態樣中,本發明係關於一種免疫原性組合物,其包括如上述任何實施例中之多肽。在另一態樣中,本發明係關於一種免疫原性組合物,其包括如本文所述之任何實施例中之多肽。
在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核酸序列,其編碼由SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列組成的經分離多肽。
在一個實施例中,經分離核酸序列包括SEQ ID NO:72。
在一個態樣中,本發明係關於一種免疫原性組合物,其包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽,及選自以下之至少一種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括選自以下之至少兩種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括選自以下之至少三種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個實施例中,多肽為子族A多肽。
在一個實施例中,多肽為子族B多肽。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之A05。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之A12。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之A22。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之B01。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之B09。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之B44。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之B22。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之B24。
在一個實施例中,多肽為未經丙酮酸化且未經脂化之A62。
在一個實施例中,多肽包括選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。在一個實施例中,多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:77。
在一個態樣中,本發明係關於一種誘導哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌之免疫反應的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量之免疫原性組合物,該免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽,及選自以下之至少一種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌血清群C之殺細菌性抗體的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量之免疫原性組合物,該免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽。
在一個實施例中,該多肽由以下組成:SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例
中,該多肽包括SEQ ID NO:76中所闡述之胺基酸序列。在另一實施例中,該多肽之位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:77中所闡述之胺基酸序列。
在一個實施例中,免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌血清群Y之殺細菌性抗體的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量之免疫原性組合物,該免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽。
在一個實施例中,該多肽由以下組成:SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:76中所闡述之胺基酸序列。在另一實施例中,該多肽之位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:77中所闡述之胺基酸序列。
在一個實施例中,免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在另一態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌之殺細菌性抗體的方法,其包括投與該哺乳動物有效量之免疫原性組合物,該免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分
離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽,及至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
圖1A至1F:P2086變異體核酸序列。
圖2A至2C:P2086變異體胺基酸序列。各變異體之N端尾中之Gly/Ser莖部(stalk)加下劃線。
圖3:ORF2086蛋白質之結構。
圖4:N端Cys之移除引起於大腸桿菌中之表現喪失。
圖5:Gly/Ser莖部長度對未經脂化之ORF2086變異體表現之影響。與標記為B01之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:35中。與標記為B44之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:36中。與標記為A05之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:37中。與標記為A22之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:38中。與標記為B22之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:39中。與標記為A19之蛋白質變異體有關之序列闡述於SEQ ID NO:40中。
圖6:儘管Gly/Ser莖部較短而未脂化之B09之表現量較高。左邊兩個泳道表明在誘導之前及之後N端Cys刪除型B09變異體的表現。第三及第四泳道表明在誘導之前及之後N端Cys陽性B09變異體的表現。最右邊之泳道為分子量標準。影像下方所示之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO:41中。在圖中稱為「A22_001」之表示N端Cys刪除型A22變異體之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO:42中,其在圖中展示於SEQ ID NO:41下方。在圖中稱為「B22_001」之表示N端Cys刪除型B22變異體之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO:52中。在圖中稱為「B09_004」之
表示N端Cys刪除型B09變異體之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO:53中。
圖7:密碼子最佳化會增加未脂化之B22及A22變異體之表現。左側畫面表示在IPTG誘導之前(泳道1及3)及之後(泳道2及4)N端Cys刪除型B22變異體之表現。右側畫面表示在IPTG誘導之前(泳道7)及之後(泳道8)N端Cys刪除型A22變異體之表現。泳道5及6為分子量標準。
圖8A至8H:P2086變異體核酸及胺基酸序列。
圖9A至9B:實例15至19中所論述之所選野生型子族A與B fHBP變異體之序列比對。應注意,A62之N端與B09 100%一致且其C端與A22 100%一致。所示序列為A05(SEQ ID NO:13);A12(SEQ ID NO:14);A22(SEQ ID NO:15);A62(SEQ ID NO:70);B09(SEQ ID NO:18);B24(SEQ ID NO:20);及共同序列(SEQ ID NO:78)。
SEQ ID NO:1闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A04基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:2闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:3闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A12基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:4闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A12-2基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:5闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:6闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B02基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:7闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B03基因
之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:8闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:9闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:10闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B24基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:11闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44基因之DNA序列,其包括編碼N端Cys之密碼子。
SEQ ID NO:12闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A04之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:13闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:14闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A12之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:15闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:16闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B02之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:17闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B03之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:18闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:19闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:20闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B24之胺
基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:21闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:22闡述實例2中所示之正向引子之DNA序列。
SEQ ID NO:23闡述實例2中所示之反向引子的DNA序列。
SEQ ID NO:24闡述實例2表1中所示之正向引子的DNA序列。
SEQ ID NO:25闡述實例2表1中所示之反向引子的DNA序列。
SEQ ID NO:26闡述實例2表1中所示之正向引子的DNA序列。
SEQ ID NO:27闡述實例2表1中所示之反向引子的DNA序列。
SEQ ID NO:28闡述實例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
SEQ ID NO:29闡述由例如SEQ ID NO:28編碼之展示於實例4中之Gly/Ser莖部之胺基酸序列。
SEQ ID NO:30闡述實例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
SEQ ID NO:31闡述由例如SEQ ID NO:30編碼之展示於實例4中之Gly/Ser莖部之胺基酸序列。
SEQ ID NO:32闡述實例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
SEQ ID NO:33闡述由例如SEQ ID NO:32及SEQ ID NO:34編碼之Gly/Ser莖部之胺基酸序列。
SEQ ID NO:34闡述實例4中所示之Gly/Ser莖部之DNA序列。
SEQ ID NO:35闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B01之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:36闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:37闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:38闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086
變異體A22之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:39闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:40闡述展示於圖5中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A19之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:41闡述展示於圖6中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體之N端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:42闡述展示於圖6中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:43闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44基因之經密碼子最佳化之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:11,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。質體pDK087包括SEQ ID NO:43。
SEQ ID NO:44闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44之胺基酸序列。SEQ ID NO:44與SEQ ID NO:21一致,其中SEQ ID NO:21之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。SEQ ID NO:44由例如SEQ ID NO:43編碼。
SEQ ID NO:45闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09基因之經密碼子最佳化之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:8,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除,且其中該序列包括編碼另外之Gly/Ser區域之密碼子。質體pEB063包括SEQ ID NO:45。
SEQ ID NO:46闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09基因之經密碼子最佳化之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:8,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。質體pEB064包括SEQ ID NO:46。
SEQ ID NO:47闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09基因之經密碼子最佳化之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:8,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。質體pEB065包括SEQ ID NO:47。
SEQ ID NO:48闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09基因之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:8,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。質體pLA134包括SEQ ID NO:48。
SEQ ID NO:49闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09的胺基酸序列。SEQ ID NO:49與SEQ ID NO:18一致,其中SEQ ID NO:18之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。SEQ ID NO:49由例如選自由SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48組成之群的DNA序列編碼。
SEQ ID NO:50闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09之胺基酸序列,其中相較於SEQ ID NO:18編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除且其中該序列包括編碼另外之Gly/Ser區域之密碼子。SEQ ID NO:50由例如SEQ ID NO:45編碼。
SEQ ID NO:51闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B44基因之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:11,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。質體pLN056包括SEQ ID NO:51。
SEQ ID NO:52闡述展示於圖6中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:53闡述展示於圖6中之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B09之N端的DNA序列。
SEQ ID NO:54闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05基因之DNA序列,其中相較於SEQ ID NO:2,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。
SEQ ID NO:55闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05的胺基酸序列。SEQ ID NO:55與SEQ ID NO:13一致,其中SEQ ID NO:13之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。SEQ ID NO:55由例如SEQ ID NO:54編碼。
SEQ ID NO:56闡述展示於實例7中之絲胺酸-甘胺酸重複序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO:57闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B01的胺基酸序列。SEQ ID NO:57與SEQ ID NO:58一致,其中SEQ ID NO:58之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。
SEQ ID NO:58闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B01之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:59闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B15之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:60闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B16之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:61闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22之DNA序列,其中SEQ ID NO:19之胺基酸位置1之N端Cys之密碼子經甘胺酸之密碼子置換。
SEQ ID NO:62闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22之胺基酸序列,其中SEQ ID NO:19之胺基酸位置1之N端Cys經甘胺酸置換。
SEQ ID NO:63闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22之DNA序列,其中SEQ ID NO:15之胺基酸位置1之N端Cys的密碼子經甘胺酸之密碼子置換。
SEQ ID NO:64闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22之胺基酸序列,其中SEQ ID NO:15之胺基酸位置1之N端Cys經甘胺酸置換。
SEQ ID NO:65闡述編碼未脂化且未丙酮酸化之A05多肽的經密碼子最佳化之DNA序列(pEB042)。
SEQ ID NO:66闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異
體A12的胺基酸序列。SEQ ID NO:66與SEQ ID NO:14一致,其中SEQ ID NO:14之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。SEQ ID NO:66由例如SEQ ID NO:67編碼。
SEQ ID NO:67闡述未脂化且未丙酮酸化之A12多肽的經密碼子最佳化之DNA序列。
SEQ ID NO:68闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A22的胺基酸序列。SEQ ID NO:68與SEQ ID NO:15一致,其中SEQ ID NO:15之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。SEQ ID NO:68由例如SEQ ID NO:69編碼。
SEQ ID NO:69闡述未脂化且未丙酮酸化之A22多肽的經密碼子最佳化之DNA序列。
SEQ ID NO:70闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A62之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:71闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A62的胺基酸序列。SEQ ID NO:71與SEQ ID NO:70一致,其中SEQ ID NO:70之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。
SEQ ID NO:72闡述SEQ ID NO:71之經密碼子最佳化之DNA序列。
SEQ ID NO:73闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05基因之經密碼子最佳化之DNA序列(pDK086),其中相較於SEQ ID NO:2,編碼N端半胱胺酸之密碼子係經刪除。
SEQ ID NO:74闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A29之胺基酸序列,其在胺基酸位置1包括N端Cys。
SEQ ID NO:75闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B22的胺基酸序列。SEQ ID NO:75與SEQ ID NO:19一致,其中SEQ ID NO:19之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。
SEQ ID NO:76闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05的胺基酸序列。
SEQ ID NO:77闡述未脂化之腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體A05的胺基酸序列。SEQ ID NO:77與SEQ ID NO:19一致,其中SEQ ID NO:76之位置1之N端半胱胺酸不存在。
SEQ ID NO:78闡述展示於圖9A至9B中之共同序列之胺基酸序列。
SEQ ID NO:79與SEQ ID NO:78一致,例外為SEQ ID NO:78之位置1之Cys不存在。
SEQ ID NO:80闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B24的胺基酸序列。SEQ ID NO:80與SEQ ID NO:20一致,其中SEQ ID NO:20之位置1之N端半胱胺酸係經刪除。
SEQ ID NO:81闡述腦膜炎雙球菌血清群B之2086變異體B24的胺基酸序列。SEQ ID NO:81與SEQ ID NO:20一致,其中SEQ ID NO:20之位置1至3之殘基係經刪除。
除非另外定義,否則本文所用之所有技術及科學術語的意義與一般本發明所屬技術者通常所瞭解之意義相同。儘管在實踐或測試本發明時可使用類似於或等效於本文所述方法及物質的方法及物質,但在下文中描述適合之方法及物質。該等物質、方法及實例僅具說明性,而不意欲具限制性。本文提及之所有公開案、專利及其他文獻以全文引用方式併入本文中。
術語「抗原」一般係指含有同源抗體可選擇性結合之至少一個抗原決定基的生物分子,通常為蛋白質、肽、多醣、脂質或結合物;或在有些情況下係指在動物體內可刺激抗體或T細胞反應或兩者產生
之免疫原性物質,包括注射或吸收至動物體內之組合物。免疫反應可針對整個分子或該分子之一或多個各個部分(例如抗原決定基或半抗原)產生。該術語可用以指個別分子或抗原性分子之同質或異質群體。抗原由抗體、T細胞受體或特異性體液及/或細胞免疫之其他元件識別。術語「抗原」包括所有相關之抗原性抗原決定基。既定抗原之抗原決定基可使用此項技術中熟知之許多抗原決定基定位技術鑑別。
參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris編,1996)Humana Press,Totowa,N.J。舉例而言,線性抗原決定基可藉由例如在固體支撐物上同時合成大量肽,該等肽對應於蛋白質分子之部分,且使該等肽與抗體反應,同時使該等肽仍連接至支撐物來確定。該等技術在此項技術中為已知的且描述於例如美國專利第4,708,871號;Geysen等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002;Geysen等人,(1986)Molec.Immunol.23:709-715中,該等文獻皆以全文引用方式併入本文中。同樣,構形抗原決定基可藉由諸如X射線結晶學及2維核磁共振確定胺基酸之空間構形來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols(同上)。此外,出於本發明之目的,「抗原」亦可用以指相對於原生序列包括修飾(諸如刪除、加入及取代(一般在性質上為保守的,但其可為非保守的))的蛋白質,只要該蛋白質維持引發免疫反應之能力即可。此等修飾可為有意的,如經由定點突變誘發或經由特定合成程序或經由基因工程改造方法達成,或可為偶然的,諸如經由產生抗原之宿主突變所致。此外,抗原可自微生物(例如細菌)產生、獲得或分離或可為整個生物體。同樣,在定義中亦包括諸如在核酸免疫接種應用中表現抗原之寡核苷酸或聚核苷酸。亦包括合成抗原,例如多抗原決定基(polyepitope)、側接抗原決定基及其他重組或合成產生之抗原(Bergmann等人,(1993)Eur.J.Immunol.23:2777 2781;Bergmann等人,(1996)J.Immunol.
157:3242 3249;Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75:402 408;Gardner等人,(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日)。
術語「保守」胺基酸取代可基於所涉及殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩性性質方面之相似性來進行。舉例而言,非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、色胺酸及甲硫胺酸;極性/中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸;帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸;且帶負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。在一些實施例中,保守胺基酸變化會改變ORF2086多肽之一級序列,但不改變分子之功能。當產生此等突變體時,可考慮胺基酸之親水指數。胺基酸親水指數在賦予多肽以相互作用生物功能方面的重要性可在此項技術中大體上得到瞭解(Kyte及Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157(1):105-32)。已知某些胺基酸可經其他具有相似親水指數或得分之胺基酸取代且仍產生具有相似生物活性之多肽。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵指定親水指數。彼等指數為:異白胺酸(+4.5);纈胺酸(+4.2);白胺酸(+3.8);苯丙胺酸(+2.8);半胱胺酸/胱胺酸(+2.5);甲硫胺酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘胺酸(-0.4);蘇胺酸(-0.7);絲胺酸(-0.8);色胺酸(-0.9);酪胺酸(-1.3);脯胺酸(-1.6);組胺酸(-3.2);麩胺酸(-3.5);麩醯胺酸(-3.5);天冬胺酸(-3.5);天冬醯胺(-3.5);離胺酸(-3.9);及精胺酸(-4.5)。
咸信胺基酸殘基之相對親水特徵決定所得多肽之二級及三級結構,繼而確定多肽與其他分子(諸如酶、受質、受體、抗體、抗原及其類似分子)之相互作用。此項技術中已知胺基酸可經具有相似親水指數之另一胺基酸取代且仍獲得功能等效之多肽。在該等變化中,親水指數相差+/-2以內之胺基酸的取代為較佳的,親水指數相差+/-1以
內之胺基酸的取代為尤其較佳的,且親水指數相差+/-0.5以內之胺基酸的取代為甚至更尤其較佳的。
亦可基於親水性進行保守胺基酸取代或插入。如美國專利第4,554,101號(其以引用方式併入本文中)中所述,如取決於相鄰胺基酸之親水性的多肽最大局部平均親水性與其免疫原性及抗原性有關,亦即與多肽之生物學特性有關。美國專利第4,554,101號敍述已對胺基酸殘基指定下列親水性值:精胺酸(+3.0);離胺酸(+3.0);天冬胺酸(+3.0±1);麩胺酸(+3.0±1);絲胺酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);麩醯胺酸(+0.2);甘胺酸(0);脯胺酸(-0.5±1);蘇胺酸(-0.4);丙胺酸(-0.5);組胺酸(-0.5);半胱胺酸(-1.0);甲硫胺酸(-1.3);纈胺酸(-1.5);白胺酸(-1.8);異白胺酸(-1.8);酪胺酸(-2.3);苯丙胺酸(-2.5);色胺酸(-3.4)。應瞭解,胺基酸可經具有相似親水性值之另一胺基酸取代且仍獲得生物學上等效且尤其免疫學上等效之多肽。在該等變化中,親水性值相差±2以內之胺基酸的取代為較佳的;親水性值相差±1以內之胺基酸的取代為尤其較佳的;且親水性值相差±0.5以內之胺基酸的取代為甚至更尤其較佳的。考慮到上述各種特徵之例示性取代為熟習此項技術者所熟知且包括(不限於):精胺酸與離胺酸;麩胺酸與天冬胺酸;絲胺酸與蘇胺酸;麩醯胺酸與天冬醯胺;以及纈胺酸、白胺酸與異白胺酸。
如本文所用之術語「免疫原性有效量」係指多肽或包含多肽之組合物在脊椎動物宿主體內有效引發免疫反應之量。舉例而言,本發明rLP2086蛋白之免疫原性有效量為在脊椎動物宿主體內有效引發免疫反應之量。特定之「免疫原性有效劑量或量」將視宿主之年齡、體重及醫學病狀以及投藥方法而定。適合之劑量容易由熟習此項技術者確定。
如本文所用之術語「Gly/Ser莖部」係指與由ORF2086編碼之蛋
白質之N端Cys殘基緊鄰之下游處的一系列Gly及Ser殘基。在Gly/Ser莖部中可存在5至12個Gly及Ser殘基。因此,Gly/Ser莖部由ORF2086所編碼之蛋白質之胺基酸2至胺基酸7-13組成。較佳地,Gly/Ser莖部由ORF2086所編碼之蛋白質之胺基酸2至最多胺基酸7-13組成。本發明之P2086變異體之Gly/Ser莖部在圖2中(SEQ ID NO:12-21)由加下劃線之序列表示。如本文所示,Gly/Ser莖部之長度可能影響未脂化之P2086變異體之穩定性或表現量。在一例示性實施例中,將由影響Gly/Ser莖部之長度所產生之效應與相應之野生型變異體相比。
術語「免疫原性」係指抗原或疫苗引發體液或細胞介導之免疫反應或兩者的能力。
各自在本文中可互換使用之「免疫原性量」或「免疫有效量」或「劑量」一般係指如由為熟習此項技術者所知之標準分析所量測,抗原或免疫原性組合物足以引發免疫反應(細胞(T細胞)反應或體液(B細胞或抗體)反應或兩者)之量。
術語「免疫原性組合物」係關於任何含有抗原(例如微生物)或其組分之醫藥組合物,該組合物可用於引發個體之免疫反應。本發明之免疫原性組合物可用於藉助於經由全身性經皮或黏膜途徑投與該等免疫原性組合物來治療易患腦膜炎雙球菌感染之人類。此等投藥可包括經由肌肉內(i.m.)、腹膜內(i.p.)、皮內(i.d.)或皮下途徑注射;藉由貼片或其他經皮傳遞裝置施用;或經由黏膜投與至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一個實施例中,免疫原性組合物可用於製造疫苗或引發可用於被動地保護或治療個體之多株或單株抗體。
特定免疫原性組合物之組分之最佳量可藉由涉及觀測個體之適當免疫反應之標準研究來確定。在最初疫苗接種後,個體可接受一次或多次時間間隔足夠長之追加免疫接種。
術語「分離」意謂將物質自其原始環境移出(例如,若其為天然
存在的,則自自然環境移出,或若其為重組實體,則自其宿主生物體移出,或取自一個環境放入不同之環境)。舉例而言,「分離」之蛋白質或肽實質上不含來自產生該蛋白質之細胞或組織來源之細胞物質或其他污染蛋白,或實質上不含在化學合成時或以其他方式存在於作為化學反應之一部分之混合物中的化學前驅體或其他化學物質。在本發明中,可自細菌細胞或細胞碎片分離蛋白質,以使其以適用於製造免疫原性組合物之形式提供。術語「分離(isolated)」或「分離(isolating)」可包括純化(purifying)或純化(purification),包括例如如本文所述之純化蛋白質之方法。措辭「實質上不含細胞物質」包括多肽或蛋白質已與分離出其或重組產生其之細胞之細胞組分分離的多肽或蛋白質製劑。因此,實質上不含細胞物質之蛋白質或肽包括具有少於約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以乾重計)之污染蛋白或多醣或其他細胞物質的莢膜多醣、蛋白質或肽製劑。當重組產生多肽/蛋白質時,其亦較佳實質上不含培養基,亦即培養基佔蛋白質製劑之體積的少於約20%、10%或5%。當藉由化學合成產生多肽或蛋白質時,其較佳實質上不含化學前驅體或其他化學物質,亦即將其與涉及合成蛋白質或多醣之化學前驅體或其他化學物質分離。因此,該等多肽或蛋白質製劑具有少於約30%、20%、10%、5%(以乾重計)之除相關多肽/蛋白質或多醣片段以外的化學前驅體或化合物。
如本文所用之術語「N端尾」係指由ORF2086編碼之蛋白質之N端部分,其使蛋白質連接至細胞膜。N端尾在圖3中展示於側視圖結構之底部。N端尾通常包含由ORF2086編碼之蛋白質之N端16個胺基酸。在一些實施例中,N端尾為SEQ ID NO:12-21中任一者之胺基酸1至16。如本文所用之術語「ORF2086」係指奈瑟菌屬(Neisseria)細菌之開放閱讀框架2086。奈瑟菌屬ORF2086、由其編碼之蛋白質、彼等蛋白質之片段以及包含彼等蛋白質之免疫原性組合物在此項技術中為
已知的且描述於例如WO2003/063766及美國專利申請公開案第US 20060257413號及第US 20090202593號中,該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。
術語「P2086」一般係指由ORF2086編碼之蛋白質。「2086」之前的「P」為「蛋白質」的縮寫。本發明之P2086蛋白可經脂化或未經脂化。「LP2086」及「P2086」通常分別指2086蛋白質之脂化及未經脂化形式。本發明之P2086蛋白可為重組蛋白。「rLP2086」及「rP2086」通常分別指重組2086蛋白之脂化及未脂化形式。「2086」因其能夠結合於因子H而亦稱為因子H結合蛋白(fHBP)。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑及/或載劑」意欲包括與向人類或其他脊椎動物宿主投藥相容之任何及所有溶劑、分散介質、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。通常,醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑及/或載劑為經聯邦、州政府之管理機構或其他管理機構批准或列於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他公認之藥典中之用於動物(包括人類以及非人類哺乳動物)的稀釋劑、賦形劑及/或載劑。術語稀釋劑、賦形劑及/或「載劑」係指與醫藥組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。該等醫藥稀釋劑、賦形劑及/或載劑可為無菌液體,諸如水及油,包括石油、動物、植物或合成來源之油。水、生理食鹽水溶液及右旋糖及甘油水溶液可作為液體稀釋劑、賦形劑及/或載劑尤其用於可注射溶液。適合之醫藥稀釋劑及/或賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時,組合物亦可含有少量濕潤劑、增積劑、乳化劑或pH值緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、持續釋放調配物及其類似物的形式。適合之醫藥稀釋劑、賦形劑及/或載劑
之實例描述於E.W.Martin之「雷明登氏醫藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)」中。該調配物應適於投藥方式。適當之稀釋劑、賦形劑及/或載劑對於熟習此項技術者將為明顯的且在很大程度上將視投藥途徑而定。
「保護性」免疫反應係指免疫原性組合物引發體液或細胞介導之免疫反應用以保護個體免遭感染之能力。所提供之保護作用不需要為絕對保護作用,亦即不需要完全防止或消除感染,只要相較於對照個體群體(例如未接受疫苗或免疫原性組合物投藥之受感染動物),存在統計顯著性改良作用即可。保護作用可限於減輕感染症狀發病之嚴重度或快速性。一般而言,「保護性免疫反應」將包括誘導至少50%之個體體內針對特定抗原具特異性之抗體含量增加,包括針對各抗原某種程度之可量測功能性抗體反應。在特定情況下,「保護性免疫反應」可包括誘導至少50%個體體內對特定抗原具特異性之抗體含量增加至兩倍或抗體含量增加至四倍,包括針對各抗原某種程度之可量測功能性抗體反應。在某些實施例中,調理抗體(opsonising antibody)與保護性免疫反應有關。因此,可藉由在血清殺細菌活性(SBA)分析或調理吞噬作用分析(例如下文所述者)中量測細菌計數降低百分比來分析保護性免疫反應。該等分析在此項技術中亦為已知的。對於腦膜炎雙球菌疫苗,例如,SBA分析為確立之保護作用替代分析。在一些實施例中,相較於在不存在免疫原性組合物下之細菌計數,細菌計數降低至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或大於95%。
術語「蛋白質」、「多肽」及「肽」指胺基酸殘基之聚合物且不限於最小長度之產物。因此,在該定義內包括肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物。全長蛋白及其片段由該定義所涵蓋。該等術語亦包括相對於原生序列的修飾,諸如刪除、加入及取代(一般在性質上為
保守的,但其可為非保守的),較佳該蛋白質維持引發投與該蛋白質之動物體內之免疫反應的能力。亦包括表現後修飾,例如糖基化、乙醯化、脂化、磷酸化及其類似修飾。
在本文中亦描述所揭示之聚核苷酸及多肽之活性變異體及片段。「變異體」係指實質上相似之序列。如本文所用之「變異多肽」係指源自原生蛋白質之藉由對原生蛋白質之N端及/或C端處之一或多個胺基酸進行修飾所產生的多肽。修飾可包括刪除原生蛋白質之N端及/或C端處之一或多個胺基酸(所謂之截短);刪除蛋白質中之一或多個內部位點處一或多個胺基酸及/或加入一或多個胺基酸;或原生蛋白質中之一或多個位點處一或多個胺基酸之取代。變異多肽繼續具有原生多肽之所需生物活性,即其具免疫原性。本文揭示之多肽或聚核苷酸序列之變異體(亦即SEQ ID NO:1-25或39)通常將與參照序列具有至少約65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%之序列一致性。
術語「片段」係指包含指定數目之連續胺基酸或核苷酸殘基之一部分胺基酸或核苷酸序列。在特定實施例中,本文揭示之多肽之片段可保留全長多肽之生物活性且因此具免疫原性。聚核苷酸之片段可編碼保留蛋白質之生物活性且因此具免疫原性之蛋白質片段。或者,適用作PCR引子之聚核苷酸片段一般不保留生物活性。因此,本文揭示之核苷酸序列之片段可在至少約15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、150個、175個、200個、225個、250個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1000個、1100個、1200個、1300個、1400個或1500個連續核苷酸或直至全長聚核苷酸的範圍內。本文揭示之多肽序列之片段可包含至少10個、15個、20個、25個、30個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140
個、150個、160個、170個、180個、190個、200個、225個、250個、275個、300個、400個、425個、450個、475個或500個連續胺基酸,或直至全長多肽中存在之胺基酸總數。
如本文所用之術語「重組」係指藉由基因工程改造方法產生的任何蛋白質、多肽或表現相關基因之細胞。如對於蛋白質或多肽使用之術語「重組」意謂藉由使重組聚核苷酸表現所產生的多肽。本發明之蛋白質可自天然來源分離或藉由基因工程改造方法產生。如本文所用之「重組」進一步描述核酸分子,其因其來源或操作而不與其在自然界中所締合之全部或一部分聚核苷酸締合。如對於宿主細胞所使用之術語「重組」意謂宿主細胞包括重組聚核苷酸。
術語「個體」係指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或任何其他動物。術語「個體」亦包括人類。術語「個體」亦包括家庭寵物。家庭寵物之非限制性實例包括:狗、貓、豬、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、天竺鼠、雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、海龜及蛙。術語「個體」亦包括家畜動物。家畜動物之非限制性實例包括:羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、兔、馴鹿、犛牛、雞、鵝及火雞。
如本文所用之術語「哺乳動物」係指任何哺乳動物,諸如人類、小鼠、兔、非人類靈長類動物。在一較佳實施例中,哺乳動物為人類。
術語「疫苗」或「疫苗組合物」可互換使用且指醫藥組合物,該等醫藥組合物包含至少一種可誘導個體之免疫反應的免疫原性組合物。
本發明亦鑑別出先前未鑑別出之在表現未脂化之P2086變異體方面之困難且提供克服此等困難之方法以及由其產生之新穎組合物。雖
然編碼未脂化之P2086變異體的質體構築體會使得未脂化之變異體強烈表現,但此等變異體在N端Cys上經丙酮酸化。丙酮酸化會防礙或降低多肽之製造一致性或均一性的可能性。本發明者進一步發現使N端Cys自未脂化之P2086變異體序列中刪除可避免未脂化之P2086變異體丙酮酸化。試圖藉由刪除N端Cys之密碼子來克服丙酮酸化會消除表現或使得不可溶變異體表現。或者,自未脂化之P2086變異體移除N端Cys會減少一些變異體之表現。然而,令人驚奇的是,本發明者發現儘管N端Cys殘基經刪除,但至少未丙酮酸化且未脂化之A05、A12、A22、A62、B01、B09、B22及B44變異體可表現。一般而言,相較於相應野生型未脂化之序列,此等多肽可在不存在除Cys刪除以外之其他修飾的情況下表現。參見例如實例2及4。此外,本發明者發現未丙酮酸化且未脂化之變異體驚人地具免疫原性且其出人意料地引發殺細菌性抗體。
因此,本發明提供兩種克服在表現未脂化之變異體方面的此等困難或降低此等困難之可能性的方法。然而,本發明涵蓋其他方法。第一種方法為改變N端尾中與N端Cys緊鄰之下游處的Gly/Ser莖部之長度。第二種方法為在N端尾內進行密碼子最佳化。然而,對其他密碼子之最佳化由本發明涵蓋。此等方法使得可溶性未脂化之P2086變異體之表現有所增強。舉例而言,在一個實施例中,可溶性未脂化之P2086變異體之表現相較於相應野生型未脂化之變異體之表現有所增強。
本發明者驚人地發現經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽。本發明者進一步發現該等多肽出人意料地具免疫原性且能夠引發殺細菌性免疫反應。
如本文所用之術語「未丙酮酸化」係指多肽不具有丙酮酸內含
物。具有丙酮酸內含物之未脂化之ORF2086多肽相較於相應之野生型多肽通常展現+70之質量位移。在一個實施例中,在藉由質譜量測時,本發明多肽相較於相應之野生型未脂化之多肽未展現+70之質量位移。參見例如實例10。
在另一實施例中,相較於相應之野生型未脂化之ORF2086多肽,經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽包括N端半胱胺酸殘基之刪除。術語「N端半胱胺酸」係指多肽之N端或N端尾處之半胱胺酸(Cys)。更特定而言,如本文所用之「N端半胱胺酸」係指如下N端半胱胺酸,在該N端半胱胺酸上LP2086脂蛋白經三棕櫚醯基脂質尾脂化,如此項技術中所知。舉例而言,在提及SEQ ID NO:12-21中之任一者作為參照序列時,N端半胱胺酸位於位置1。作為另一實例,在提及SEQ ID NO:70作為參照序列時,N端半胱胺酸位於位置1。
如本文所用之術語「野生型未脂化之ORF2086多肽」或「野生型未脂化之2086多肽」或「野生型未脂化之多肽」係指胺基酸序列與在自然界中發現之相應脂化之成熟ORF2086多肽之胺基酸序列一致的ORF2086多肽。未脂化之分子與脂化之分子之間的唯一差異在於野生型未脂化之ORF2086多肽在N端半胱胺酸處未經三棕櫚醯基脂質尾脂化。
如此項技術中所知,未脂化之2086形式係藉由缺乏原始前導序列之蛋白質或藉由用未指定用於在宿主細胞中進行脂肪酸醯化之位點的一部分序列置換前導序列而產生。參見例如WO2003/063766,其以全文引用的方式併入本文。
未脂化之ORF2086之實例不僅包括剛才所描述之野生型未脂化之ORF2086多肽,且亦包括具有根據SEQ ID NO:12-21中之任一者之胺基酸序列的多肽,其中N端Cys係經刪除;以及具有根據SEQ ID NO:12-21中之任一者之胺基酸序列的多肽,其中N端Cys經不為Cys殘基
之胺基酸取代。未脂化之ORF2086多肽之另一實例包括具有根據SEQ ID NO:70之胺基酸序列的多肽,其中N端Cys係經刪除;以及具有根據SEQ ID NO:70之胺基酸序列的多肽,其中N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。未脂化之ORF2086多肽之其他實例包括選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO:44(B44)、SEQ ID NO:49(B09)、SEQ ID NO:55(A05)、SEQ ID NO:57(B01)、SEQ ID NO:58(B01)、SEQ ID NO:62(B22)、SEQ ID NO:64(A22)及SEQ ID NO:75(B22)。未脂化之ORF2086多肽之其他實例包括選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO:66(A12)、SEQ ID NO:68(A22)及SEQ ID NO:71(A62)。更多實例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ ID NO:81(B24)。未脂化之ORF2086多肽之其他實例包括闡述於SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77中之胺基酸序列。在一個實施例中,未脂化之多肽包括與編碼相應未經脂化之多肽的序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。舉例而言,在一例示性實施例中,未脂化之A62多肽包括與SEQ ID NO:71至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
野生型未脂化之ORF2086多肽之實例包括具有根據SEQ ID NO:12-21(展示於圖2中)、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59及SEQ ID NO:60中之任一者之胺基酸序列的多肽。野生型未脂化之ORF2086多肽之另一實例包括具有根據SEQ ID NO:70之胺基酸序列的多肽。此等例示性野生型未脂化之ORF2086多肽包括N端Cys。
如本文所用之例如「未脂化」之B44多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:21、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID
NO:21及SEQ ID NO:44。「野生型未脂化」之B44多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:21之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之B44多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:21以及SEQ ID NO:44。
作為另一實例,如本文所用之「未脂化」之B09多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:18、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:49以及SEQ ID NO:50。「野生型未脂化」之B09多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:18之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之B09包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:49及SEQ ID NO:50。
作為另一實例,如本文所用之「未脂化」之A05多肽包括具有選自以下之胺基酸序列之多肽:SEQ ID NO:13、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:55。「未脂化」之A05多肽之另一實例包括具有選自以下之胺基酸序列之多肽:SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。「未脂化」之A05多肽之其他實例包括具有SEQ ID NO:76中所闡述之胺基酸序列的多肽。「未脂化」之A05多肽之另一實例包括具有SEQ ID NO:77中所闡述之胺基酸序列的多肽。「野生型未脂化」之A05包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:13之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之A05包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO:55。「未丙酮酸化且未脂化」之A05之其他實例包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代;SEQ ID NO:76,其中位置1之Cys係經刪除;SEQ ID NO:76,其中位置1之Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代;以及SEQ ID NO:77。
如本文所用之「未脂化」之A62多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:70、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:70,以及SEQ ID NO:71。未脂化之A62多肽之另一實例包括具有SEQ ID NO:70之多肽,其中位置1之N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。「野生型未脂化」之A62多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:70之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之A62包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:70以及SEQ ID NO:71。未丙酮酸化且未脂化之A62多肽之另一實例包括具有SEQ ID NO:70之多肽,其中位置1之N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。
較佳地,「未丙酮酸化且未脂化」之A62包括具有SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列的多肽。
如本文所用之「未脂化」之A12多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:14、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:14,以及SEQ ID NO:66。「野生型未脂化」之A12多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:14之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之A12包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:66。
如本文所用之「未脂化」之A22多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:15、位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:64以及SEQ ID NO:68。「野生型未脂化」之A22多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:15之多肽。「未丙酮酸化且未脂化」之A22包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:位置1之N端Cys經刪除的SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:68。較佳地,「未丙酮酸化且未脂化」之A22包括具有SEQ ID NO:68中所闡述之胺基酸序列的多肽。
如本文所用之術語N端Cys「經刪除」包括相較於野生型未脂化
之多肽序列使N端Cys經刪除的突變。舉例而言,N端Cys「經刪除」係指自參照序列,例如自相應之野生型序列移除胺基酸Cys,從而使得胺基酸殘基相較於參照序列有所減少。除非另外描述,否則術語「N端Cys」、「位置1之N端Cys」、「位置1之Cys」為可互換的。
在另一實施例中,N端Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。舉例而言,在一例示性實施例中,SEQ ID NO:12-21之位置1之N端Cys包括位置1之C→G取代。參見例如SEQ ID NO:62相較於SEQ ID NO:19(B22野生型),以及SEQ ID NO:64相較於SEQ ID NO:15(A22野生型)。置換N端Cys之例示性胺基酸包括任何非Cys胺基酸,較佳為極性不帶電荷之胺基酸,諸如甘胺酸。在一較佳實施例中,用非保守性殘基對Cys進行取代。
本發明者驚人地發現表現N端Cys殘基經刪除之未脂化之ORF2086多肽會使得在藉由質譜量測時,相較於相應之野生型未脂化之ORF2086多肽,丙酮酸化不可偵測。未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之實例包括具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽:SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)、SEQ ID NO:21(B44)及SEQ ID NO:70(A62),其中位置1之半胱胺酸係經刪除。未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之另一實例包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:58(B01)之多肽,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之其他實例包括具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之另一實例包括具有胺基酸序列SEQ ID
NO:57(B01)之多肽。經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之另一實例包括具有SEQ ID NO:77(A05)之多肽;具有SEQ ID NO:76(A05)之多肽,其中位置1之Cys係經刪除;以及具有SEQ ID NO:76(A05)之多肽,其中位置1之Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代。未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之其他實例包括具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽:SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:58(B01)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)、SEQ ID NO:21(B44)及SEQ ID NO:70(A62),其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之2086多肽包括至少約250個、255個或260個連續胺基酸及至多約270個、269個、268個、267個、266個、265個、264個、263個、260個、259個、258個、257個、256個或255個連續胺基酸。任何最小值可與任何最大值組合以確定範圍。更佳地,多肽具有至少254個或262個連續胺基酸。
在一些實施例中,多肽具有至多262個連續胺基酸。在其他實施例中,多肽具有至多254個連續胺基酸。在一個實施例中,未丙酮酸化且未脂化之多肽包括與編碼相應之未丙酮酸化且未脂化之多肽的序列至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。舉例而言,在一例示性實施例中,未丙酮酸化且未脂化之A62多肽包括與SEQ ID NO:71至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一個實施例中,經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽係
由可操作地連接至表現系統之核苷酸序列編碼,其中該表現系統能夠於細菌細胞中表現。在一例示性實施例中,核苷酸序列連接至控制核苷酸序列表現之調節序列。
適合之表現系統、調節序列及細菌細胞在此項技術中為已知的。舉例而言,可使用任何質體表現載體,例如PETTM(Novogen,Madison Wis.)或PMALTM(New England Biolabs,Beverly,Mass.),只要該多肽能夠在細菌細胞中表現即可。較佳地,使用PETTM載體在大腸桿菌中選殖及表現重組蛋白。在PETTM系統中,所選殖之基因可在噬菌體T7啟動子控制下表現。例示性細菌細胞包括螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),且較佳為大腸桿菌。
在一個態樣中,本發明係關於一種可藉由該方法獲得之未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽。該多肽較佳經分離。本發明進一步係關於包括可藉由一種方法獲得之未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽的組合物。該組合物較佳為免疫原性組合物。該方法包括使編碼具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽的核苷酸序列表現:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:70,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,該方法包括使編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:76之多肽的核苷酸序列表現,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,該方法包括使編碼具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽的核苷酸序列表現:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:70,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。核苷酸序列可操作地連
接至表現系統,該表現系統能夠在細菌細胞中表現。
在一個實施例中,該方法包括使編碼具有選自由以下組成之群的胺基酸序列之多肽的核苷酸序列表現:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:75。在另一實施例中,該方法包括使編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO:77之多肽的核苷酸序列表現。在另一實施例中,核苷酸序列選自由以下組成之群:SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69及SEQ ID NO:72。較佳地,細菌細胞為大腸桿菌。
B09、B44、A05:在一個態樣中,本發明係關於一種組合物,其包括包含SEQ ID NO:49(B09)中所闡述之胺基酸序列的第一經分離多肽以及包含SEQ ID NO:44(B44)中所闡述之胺基酸序列的第二經分離多肽。在一較佳實施例中,多肽具免疫原性。在另一較佳實施例中,該組合物進一步包括來自血清群B腦膜炎雙球菌之ORF2086子族A多肽。較佳地,ORF2086子族A多肽為未丙酮酸化且未脂化之ORF2086子族A多肽。在一例示性實施例中,ORF2086子族A多肽為A05,其實例包括例如位置1之N端半胱胺酸經刪除的SEQ ID NO:13,以及SEQ ID NO:55。在另一例示性實施例中,該組合物包括具有以下胺基酸序列之未丙酮酸化且未脂化之A05多肽:位置1之Cys經刪除的SEQ ID NO:76;位置1之Cys經不為Cys殘基之胺基酸取代的SEQ ID NO:76;以及SEQ ID NO:77。
在另一態樣中,本發明係關於一種用於產生經分離多肽的方法。該方法包括在細菌細胞中使多肽表現,該多肽包括與SEQ ID
NO:21具有大於90%一致性的序列,該序列包括至少一個選自由以下組成之群的域:SEQ ID NO:21之胺基酸13至18、SEQ ID NO:21之胺基酸21至34,以及SEQ ID NO:21之胺基酸70至80或其組合,其中該多肽缺乏N端半胱胺酸。該方法進一步包括純化該多肽。其中產生之多肽包括未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽。較佳地,該多肽具免疫原性。在一較佳實施例中,細菌細胞為大腸桿菌。
包括至少一個選自由SEQ ID NO:21之胺基酸13-18、SEQ ID NO:21之胺基酸21-34及SEQ ID NO:21之胺基酸70-80或其組合組成之群的域之多肽的實例包括SEQ ID NO:12(A04)、SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:14(A12)、SEQ ID NO:15(A22)、SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44)。較佳地,此等多肽之位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。其他例示性多肽包括SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:62及SEQ ID NO:64。另一例示性多肽包括SEQ ID NO:70及SEQ ID NO:71。另一例示性多肽包括SEQ ID NO:76。另一例示性多肽包括SEQ ID NO:77。其他實例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ ID NO:81(B24)。
在一個例示性實施例中,經分離多肽序列進一步包括至少一個選自由以下組成之群的域:SEQ ID NO:21之胺基酸96-116、SEQ ID NO:21之胺基酸158-170、SEQ ID NO:21之胺基酸172-185、SEQ ID NO:21之胺基酸187-199、SEQ ID NO:21之胺基酸213-224、SEQ ID NO:21之胺基酸226-237、SEQ ID NO:21之胺基酸239-248或其組合。包括至少一個選自由SEQ ID NO:21之胺基酸13-18、SEQ ID NO:21之胺基酸21-34及SEQ ID NO:21之胺基酸70-80或其組合組成之群的
域且進一步包括至少一個選自由以下組成之群的域之多肽的實例包括SEQ ID NO:16(B02)、SEQ ID NO:17(B03)、SEQ ID NO:18(B09)、SEQ ID NO:19(B22)、SEQ ID NO:20(B24)及SEQ ID NO:21(B44):SEQ ID NO:21之胺基酸96-116、SEQ ID NO:21之胺基酸158-170、SEQ ID NO:21之胺基酸172-185、SEQ ID NO:21之胺基酸187-199、SEQ ID NO:21之胺基酸213-224、SEQ ID NO:21之胺基酸226-237、SEQ ID NO:21之胺基酸239-248或其組合。較佳地,此等多肽之位置1之半胱胺酸係經刪除。其他例示性多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50及SEQ ID NO:55以及SEQ ID NO:62。
在一個態樣中,本發明係關於一種藉由本文所述之方法產生的經分離多肽。在一個實施例中,經分離多肽為未丙酮酸化且未脂化之多肽。在另一態樣中,本發明係關於一種藉由本文所述之方法產生的免疫原性組合物。
B09:在一個態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括位置1之N端Cys經刪除之SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:49中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:49之例示性核苷酸序列包括選自以下之序列:SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48。較佳地,核苷酸序列為SEQ ID NO:46。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:46。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:47。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:48。
在一個態樣中,本發明係關於一種質體,其包括選自以下之核苷酸序列:SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:45,其中該質體能夠在細菌細胞中表現。適合之表現系統、
調節序列及細菌細胞在此項技術中為已知的,如上文所述。較佳地,細菌細胞為大腸桿菌。
在另一態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括SEQ ID NO:50中所闡述之胺基酸序列。在一例示性實施例中,SEQ ID NO:50由SEQ ID NO:45編碼。
B44:在另一態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括N端Cys經刪除之SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:44中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:44之例示性核苷酸序列包括選自以下之序列:SEQ ID NO:43及SEQ ID NO:51。較佳地,核苷酸序列為SEQ ID NO:43。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:43。
A05:在一個態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括位置1之N端Cys經刪除之SEQ ID NO:13(A05)或SEQ ID NO:55中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:55之例示性核苷酸序列包括選自以下之序列:SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:65及SEQ ID NO:73。較佳地,核苷酸序列為SEQ ID NO:65。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:54。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:65。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:73。
A12:在另一態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括N端Cys經刪除之SEQ ID NO:14(A12)或SEQ ID NO:66中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:66之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:67。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:67。
A22:在另一態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括N
端Cys經刪除之SEQ ID NO:15(A22)或SEQ ID NO:68中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:68之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:69。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:69。
A62:在一個態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其具有與SEQ ID NO:71至少95%一致之胺基酸序列,其中該序列之前20個胺基酸殘基不含半胱胺酸。較佳地,該多肽包括如SEQ ID NO:71之位置1至184處所示之胺基酸序列。該多肽較佳未脂化且未丙酮酸化。在另一實施例中,多肽具免疫原性。
在另一實施例中,經分離多肽包括A62之片段。A62之例示性片段包括來自SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71之任何數目之連續殘基。
在一個實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置158至185之胺基酸序列。在另一實施例中,經分離多肽包括SEQ ID NO:71之位置159至186之胺基酸序列。在一個實施例中,多肽包括SEQ ID NO:71之位置185至254之胺基酸序列中之至少6個連續胺基酸。
在另一態樣中,本發明係關於一種經分離核酸序列,其編碼經分離多肽,該經分離多肽具有與SEQ ID NO:71至少95%一致之胺基酸序列,其中該胺基酸序列之前20個胺基酸殘基不含半胱胺酸。較佳地,多肽由SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列組成。在一個實施例中,經分離核酸序列包括SEQ ID NO:72。
在另一態樣中,本發明係關於一種經分離多肽,其包括N端Cys經刪除之SEQ ID NO:70(A62)或SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列。編碼SEQ ID NO:71之例示性核苷酸序列包括SEQ ID NO:72。在一個態樣中,本發明係關於一種經分離核苷酸序列,其包括SEQ ID NO:72。
在一較佳實施例中,包括經分離未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽之本文所述之組合物具免疫原性。包括由來自腦膜炎雙球菌ORF2086之核苷酸序列編碼之蛋白質的免疫原性組合物在此項技術中為已知的。例示性免疫原性組合物包括WO2003/063766及美國專利申請公開案第US 20060257413號及第US 20090202593號中所述者,該等專利以全文引用方式併入本文中。其中所述之該等免疫原性組合物包括鑑別為ORF2086蛋白質之展現殺細菌活性之蛋白質、其免疫原性部分及/或其生物等效物。ORF2086蛋白質係指由奈瑟菌屬之開放閱讀框架2086編碼之蛋白質。
蛋白質可為重組蛋白或自原生奈瑟菌屬之經分離蛋白質。舉例而言,奈瑟菌屬ORF2086蛋白可自諸如以下之細菌菌株分離:奈瑟菌屬之彼等細菌菌株,包括腦膜炎雙球菌(血清群A、B、C、D、W-135、X、Y、Z及29E)、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)及乳糖奈瑟菌(Neisseria lactamica)之菌株,以及該等蛋白質之免疫原性部分及/或生物等效物。
ORF2086蛋白質包括2086子族A蛋白及子族B蛋白、其免疫原性部分及/或其生物等效物。2086子族A蛋白及2086子族B蛋白在此項技術中為已知的,參見例如上文所引用之Fletcher等人,2004及Murphy等人,J Infect Dis.2009年8月1日;200(3):379-89。亦參見WO2003/063766,其揭示代表與2086子族A之蛋白質有關之胺基酸序列的SEQ ID NO:260至278。另外,WO2003/063766中揭示代表與2086子族B之蛋白質有關之胺基酸序列的SEQ ID NO:279至299。WO2003/063766係以全文引用之方式併入本文中。ORF2086蛋白質或其等效物等可經脂化或未經脂化。較佳地,奈瑟菌屬ORF2086蛋白質未經脂化。或者,免疫原性組合物可為脂化ORF2086蛋白質與未經脂化之ORF2086蛋白質的組合。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括一種經分離蛋白質,該蛋白質與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性。在另一實施例中,免疫原性組合物包括一種經分離蛋白質,該蛋白質與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之蛋白質具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%胺基酸序列一致性。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括一種經分離蛋白質,該蛋白質與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之子族A蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性。較佳地,免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的經分離子族A蛋白質。在一些實施例中,ORF2086子族A多肽為A05、A04、A12、A62或A22變異體。在一些實施例中,ORF2086子族A多肽為A05、A12或A22變異體。
子族A多肽之組合:在一個實施例中,組合物包括ORF2086子族A多肽之任何組合。ORF2086子族A多肽之例示性組合包括例如A05與A12;A05與A22;A05與A62;A12與A62;A12與A22;A22與A62;A05、A12與A22;A05、A12與A62;A12、A22與A62;及A05、A22與A62。較佳地,ORF2086子族A多肽係為未經脂化且未經丙酮酸化。
在另一實施例中,免疫原性組合物包括一種經分離蛋白質,該蛋白質與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之子族B蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性。較佳地,免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的經分離子族B蛋白質。在一些實施例中,ORF2086子族B蛋白質為B44、B02、B03、B22、B24或B09變異體。在一些實施例中,ORF2086子族B蛋白質為B44、B22或
B09變異體。
子族B多肽之組合:在一個實施例中,組合物包括ORF2086子族B多肽之任何組合。ORF2086子族B多肽之例示性組合包括例如B09與B22;B22與B44;B44與B09;B01與B09;B01與B22;B01與B44;及B09、B22與B44;B09與B24;B22與B24;B24與B44;B01與B24;B02與B24;B02與B01;B02與B09;B02與B44;B01、B09與B24;B01、B24與B44。
在一較佳實施例中,免疫原性組合物包括一種經分離未丙酮酸化且未脂化之多肽,該多肽與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的子族B蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性。舉例而言,在一些實施例中,ORF2086子族B蛋白質為選自以下之序列:具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列的B44;具有如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列的B02;具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列的B03;具有如SEQ ID NO:19中所示之胺基酸序列的B22;具有如SEQ ID NO:2O中所示之胺基酸序列的B24;具有如SEQ ID NO:58中所示之胺基酸序列的B01;或具有如SEQ ID NO:18中所示之胺基酸序列的B09變異體,其中N端Cys係經刪除,或其組合。
更佳地,免疫原性組合物包括未丙酮酸化且未脂化之B09多肽、未丙酮酸化且未脂化之B44多肽或其組合。在一個實施例中,組合物包括具有如SEQ ID NO:18中所示之胺基酸序列的未丙酮酸化且未脂化之B09變異體(其中N端Cys經刪除)、具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列的未丙酮酸化且未脂化之B44(其中N端Cys經刪除)或其組合。在另一實施例中,免疫原性組合物包括具有SEQ ID NO:49之未丙酮酸化且未脂化之B09、具有SEQ ID NO:44之未丙酮酸化且未脂化之B44,或其組合。
在一個態樣中,本發明係關於一種免疫原性組合物,其包括來
自血清群B腦膜炎雙球菌之ORF2086子族B多肽,其中該多肽為未丙酮酸化且未脂化之B44。B44可包括如N端Cys經刪除之SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:44中所示之胺基酸序列。在一個實施例中,該組合物進一步包括來自血清群B腦膜炎雙球菌之第二ORF2086子族B多肽,其中該第二多肽為未丙酮酸化且未脂化之B09。B09可包括如N端Cys經刪除之SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:49中所示之胺基酸序列。在一個實施例中,免疫原性組合物為疫苗。
在另一實施例中,組合物包括至多3種ORF2086子族B多肽。在另一實施例中,組合物包括至多2種ORF2086子族B多肽。
在另一實施例中,組合物包括至多1、2或3種ORF2086子族B變異體。在另一實施例中,組合物包括至多1、2或3種ORF2086子族A變異體。
包括子族B多肽及子族A多肽之組合物:在一個實施例中,組合物進一步包括一或多種ORF2086子族A多肽。在一較佳實施例中,組合物包括A05子族A多肽。更佳地,A05子族A多肽未經脂化且未經丙酮酸化。在另一較佳實施例中,組合物包括A62子族A多肽。更佳地,A62子族A多肽未經脂化且未經丙酮酸化。
在另一實施例中,免疫原性組合物包括與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之子族A蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性的經分離蛋白質以及與由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼之子族B蛋白質具有至少95%胺基酸序列一致性的經分離蛋白質。
較佳地,免疫原性組合物包括由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的經分離子族A蛋白質以及由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的經分離子族B蛋白質。更佳地,免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之子族A ORF2086多肽以及經分離未丙酮酸
化且未脂化之子族B ORF2086多肽。
組合:涵蓋ORF2086多肽之任何組合。在一個實施例中,組合物在不存在子族B多肽下包括至少一種子族A多肽。舉例而言,組合物僅包括子族A多肽。在另一實施例中,組合物在不存在子族A多肽下包括至少一種子族B多肽。舉例而言,組合物僅包括子族A多肽。
免疫原性組合物可包括任何子族A多肽或其組合。在一些實施例中,ORF2086子族A多肽為A05、A04、A12或A22變異體。在另一實施例中,ORF2086子族A多肽包括A62。在一較佳實施例中,ORF2086子族A多肽為具有如SEQ ID NO:13中所示之胺基酸序列的A05;具有如SEQ ID NO:12中所示之胺基酸序列的A04;具有如SEQ ID NO:14中所示之胺基酸序列的A12;或具有如SEQ ID NO:15中所示之胺基酸序列的A22變異體,其中N端Cys係經刪除,或其任何組合。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05與A62子族A ORF2086多肽之組合。舉例而言,免疫原性組合物可包括具有SEQ ID NO:55之多肽及具有SEQ ID NO:71之多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05與A12子族A ORF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A12與A62子族A ORF2086多肽之組合。
免疫原性組合物可包括任何子族B多肽或其組合。在一些實施例中,ORF2086子族B蛋白質為B44、B02、B03、B22、B24或B09變異體。在一較佳實施例中,ORF2086子族B蛋白質為具有如SEQ ID NO:21中所示之胺基酸序列的B44;具有如SEQ ID NO:16中所示之胺基酸序列的B02;具有如SEQ ID NO:17中所示之胺基酸序列的B03;具有如SEQ ID NO:19中所示之胺基酸序列的B22;具有如SEQ ID NO:20中所示之胺基酸序列的B24;或具有如SEQ ID NO:18中所示之胺基酸序列的B09變異體,其中N端Cys係經刪除,或其組合。另一例示性免
疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之B09與B44子族B ORF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之B09與B22子族B ORF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之B22與B44子族B ORF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之B09、B22與B44子族B ORF2086多肽之組合。
在一個實施例中,組合物在不存在脂化之ORF2086多肽下包括未脂化之ORF2086多肽。在另一實施例中,組合物包括未脂化之ORF2086多肽及至少一種脂化之ORF2086多肽。
在一個實施例中,組合物在不存在脂化之ORF2086多肽下包括未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽。在另一實施例中,組合物包括脂化之ORF2086多肽以及未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽。舉例而言,組合物可包括具有SEQ ID NO:76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO:77之未丙酮酸化且未脂化之A05。另一例示性組合物包括具有SEQ ID NO:76之脂化之A05多肽以及具有SEQ ID NO:71之未丙酮酸化且未脂化之A62。另一例示性組合物包括具有SEQ ID NO:58之脂化之B01多肽以及具有SEQ ID NO:71之未丙酮酸化且未脂化之A62。
例示性組合:一種例示性免疫原性組合物包括經分離未脂化之A05、B09、B22及B44 ORF2086多肽之組合。舉例而言,免疫原性組合物可包括未丙酮酸化且未脂化之A05(SEQ ID NO:55)子族A ORF2086多肽以及經分離未丙酮酸化且未脂化之B09(SEQ ID NO:49)、B22(SEQ ID NO:75)及B44(SEQ ID NO:44)子族B ORF2086多肽。
另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05及A12子族A ORF2086多肽以及經分離未丙酮酸化且未脂化之B22及B44子族B ORF2086多肽之組合。另一例示性免疫原性組合物包括
經分離未丙酮酸化且未脂化之A05、A12、B09及B44多肽。另一實例包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A12、A62、B09及B44多肽。另一實例包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05、A12、A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A62及B09多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A62及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A62、B09及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05、A62及B44多肽。另一例示性免疫原性組合物包括經分離未丙酮酸化且未脂化之A05、A62、B09及B44多肽。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括1:1比率之子族A蛋白質與子族B蛋白質。在另一實施例中,免疫原性組合物包括以下子族A多肽對子族B多肽之任一比率:1:1;1:2;1:3;1:4;1:5;1:6;1:7;1:8;1:9;或1:10。在另一實施例中,免疫原性組合物包括以下子族B多肽對子族A多肽之任一比率:1:1;1:2;1:3;1:4;1:5;1:6;1:7;1:8;1:9;或1:10。
在一個態樣中,本文所述之經分離多肽及組合物引發哺乳動物對抗由腦膜炎雙球菌之任何血清群所致之感染的殺細菌性免疫反應,該任何血清群為諸如選自血清群A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y及Z之血清群。在一較佳實施例中,本文所述之經分離多肽及組合物引發哺乳動物對抗由血清群A、B、C、W-135、Y及/或X所致之感染的殺細菌性免疫反應。
在另一態樣中,本文所述之經分離多肽及組合物引發哺乳動物對抗來自血清群B腦膜炎雙球菌之ORF2086多肽的殺細菌性免疫反應。該等組合物能夠在投與哺乳動物之後誘導殺細菌性抗腦膜炎雙球
菌抗體,且在較佳實施例中,可誘導針對具有各別子族之菌株具殺細菌性的抗體。關於殺細菌性反應之其他資訊在下文中給出。參見例如實例6、11、12及13。
在一個實施例中,組合物引發針對腦膜炎雙球菌血清群B之異源子族的殺細菌性免疫反應。舉例而言,包括未脂化之子族A多肽之組合物可引發針對腦膜炎雙球菌血清群B之子族A變異體及/或針對腦膜炎雙球菌血清群B之子族B變異體的殺細菌性免疫反應。參見例如實例18至19。
在另一態樣中,本文所述之經分離多肽及組合物引發針對以下至少一者的殺細菌性免疫反應:腦膜炎雙球菌之血清群A、血清群B、血清群C、血清群W135及/或血清群Y菌株。在一較佳實施例中,組合物引發至少針對腦膜炎雙球菌之血清群B、血清群C及血清群Y的殺細菌性免疫反應。參見例如實例21。
殺細菌性抗體為在人類及臨床前研究中用作替代物之保護作用指示物,且本文所述之任何新免疫原性組合物候選者應引發此等功能性抗體。
B09:在一個態樣中,經分離未脂化之B09多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在一例示性實施例中,具有SEQ ID NO:18(其中位置1之N端Cys經刪除)或SEQ ID NO:49之經分離未丙酮酸化且未脂化之B09多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A或較佳子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之B09多肽及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:A05變異體(SEQ ID NO:13);B44變異體(SEQ ID NO:21);B 16變異體(SEQ ID NO:60);B24變異體(SEQ ID NO:20);B09變異體(SEQ ID NO:18)或其組合。在一
例示性實施例中,未丙酮酸化且未脂化之B09多肽及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:B44變異體(SEQ ID NO:21);B16變異體(SEQ ID NO:60);B24變異體(SEQ ID NO:20);B09變異體(SEQ ID NO:18)或其組合。參見例如實例11、實例12及實例13。
B44:在一個態樣中,經分離未脂化之B44多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在另一例示性實施例中,具有SEQ ID NO:21(其中位置1之N端Cys經刪除)或SEQ ID NO:44之經分離未丙酮酸化且未脂化之B44多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之B44多肽及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:B44變異體(SEQ ID NO:21);B16變異體(SEQ ID NO:60);B24變異體(SEQ ID NO:20);B09變異體(SEQ ID NO:18)或其組合。參見例如實例11。另外,未丙酮酸化且未脂化之B44多肽及其免疫原性組合物亦可引發結合於B02變異體(SEQ ID NO:16)之殺細菌性抗體。參見例如實例12及實例13。此外,未丙酮酸化且未脂化之B44多肽及其免疫原性組合物亦可引發結合於B03變異體(SEQ ID NO:17)及B 15變異體(SEQ ID NO:59)之殺細菌性抗體。參見例如實例6。
B22:在一個態樣中,經分離未脂化之B22多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在另一例示性實施例中,具有SEQ ID NO:19(其中位置1之N端Cys經刪除)之經分離未丙酮酸化且未脂化之B22多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之B22多肽引發針對以下之殺細菌性抗體:B44變異體
(SEQ ID NO:21);B16變異體(SEQ ID NO:60);B24變異體(SEQ ID NO:20);B09變異體(SEQ ID NO:18)或其組合。參見例如實例13。
A05:在一個態樣中,經分離未脂化之A05多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實施例中,具有SEQ ID NO:13(其中N端Cys經刪除)或SEQ ID NO:55之經分離未丙酮酸化且未脂化之A05多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實施例中,經分離A05多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:76,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,經分離A05多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:76,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在一個實施例中,經分離A05多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:77。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之A05及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:A05變異體(SEQ ID NO:13)、A22變異體(SEQ ID NO:15)、A12變異體(SEQ ID NO:14)或其組合。參見例如實例6及13。
A62:在一個態樣中,經分離未脂化之A62多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。在一個實施例中,經分離A62多肽包括胺基酸序列SEQ ID NO:70,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在另一實施例中,具有SEQ ID NO:70(其中N端Cys係經刪除)或SEQ ID NO:71之經分離未丙酮酸化且未脂化之A62多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A及/或子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。舉例而言,未丙酮酸化且未脂化之A62及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:A05變異體(SEQ ID NO:13)、A12變異體(SEQ ID NO:14)、
A22變異體(SEQ ID NO:15)及A62變異體(SEQ ID NO:70)。作為另一實例,未丙酮酸化且未脂化之A62及其免疫原性組合物引發針對A29變異體、B09變異體及B24變異體之殺細菌性抗體。參見例如實例18至19。在另一實施例中,未丙酮酸化且未脂化之A62及其免疫原性組合物引發針對B16變異體之殺細菌性抗體。
A12:在一個實施例中,具有SEQ ID NO:14(其中N端Cys係經刪除)或SEQ ID NO:66之經分離未丙酮酸化且未脂化之A12多肽及其免疫原性組合物引發針對來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A及/或子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之A12及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:A05變異體(SEQ ID NO:13)、A22變異體(SEQ ID NO:15)、A12變異體(SEQ ID NO:14)、A62變異體(SEQ ID NO:70)、A29變異體、B09變異體。參見例如實例18至19。
在一個實施例中,具有SEQ ID NO:15(其中N端Cys係經刪除)或SEQ ID NO:68之經分離未丙酮酸化且未脂化之A22多肽及其免疫原性組合物引發針對(例如可結合於)來自血清群B腦膜炎雙球菌子族A及/或子族B之ORF2086多肽的殺細菌性抗體。較佳地,未丙酮酸化且未脂化之A22及其免疫原性組合物引發針對以下之殺細菌性抗體:A05變異體(SEQ ID NO:13)、A22變異體(SEQ ID NO:15)、A62變異體(SEQ ID NO:70)、A29變異體。參見例如實例18至19。
在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群A腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群C腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群W135腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一
個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群X腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群Y腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群A、B、C、W-135、X及/或Y腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一個態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的方法。在一例示性實施例中,該方法包括引發對ORF2086子族B血清群B腦膜炎雙球菌、ORF2086子族A血清群B腦膜炎雙球菌或其組合具特異性之殺細菌性抗體。
該方法包括投與該哺乳動物有效量的如上文所述之經分離未丙酮酸化且未脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見例如實例18至19及22。
在一較佳實施例中,該方法包括引發對ORF2086子族B血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體。經分離多肽或免疫原性組合物包括未丙酮酸化且未脂化之B44多肽。在另一較佳實施例中,組合物進一步包括未丙酮酸化且未脂化之B09多肽。在一例示性實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:44或其組合。在另一例示性實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:18,其中位置1之N端Cys係經刪除;SEQ ID NO:21,其中位置1之N端Cys係經刪除;或其組合。在另一例示性實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:19,其中位置1之N端Cys係經刪除。在一個實施例中,用於引發對ORF2086子族B血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的免疫原性組合物包括未丙酮酸化且未脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。參見例如實例19。
在一較佳實施例中,該方法包括引發對ORF2086子族A血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體。經分離多肽或免疫原性組合物包括未丙酮酸化且未脂化之A05多肽。在一較佳實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys係經刪除。在另一較佳實施例中,組合物進一步包括未丙酮酸化且未脂化之B44多肽。參見例如實例6及13。在一例示性實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:44或其組合。在一較佳實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys係經刪除;SEQ ID NO:21,其中位置1之N端Cys係經刪除;或其組合。在另一例示性實施例中,經分離多肽或免疫原性組合物包括SEQ ID NO:77(A05)、SEQ ID NO:44(B44)或其組合。在一個實施例中,用於引發對ORF2086子族A血清群B腦膜炎雙球菌具特異性之殺細菌性抗體的免疫原性組合物包括未丙酮酸化且未脂化之A05、A12及A62多肽中之至少一者。參見例如實例18至19。
當向哺乳動物投與包括至少兩種如上文所述之未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽的例示性免疫原性組合物時,本發明者驚人地發現相較於包括一種各別未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽的免疫原性組合物,可引發針對腦膜炎雙球菌之血清群B的協同殺細菌性免疫反應。參見例如實例19。因此,在一個實施例中,免疫原性組合物包括至少一種第一未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽,其與至少一種第二未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽協同作用以引發針對腦膜炎雙球菌之血清群B的免疫反應。
在另一態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群C具特異性之殺細菌性抗體的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量的如上文所述之來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離
未丙酮酸化且未脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見例如實例22。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在另一實施例中,免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。例示性免疫原性組合物包括至少一種經分離未丙酮酸化且未脂化之A62多肽及a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在另一態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群Y具特異性之殺細菌性抗體的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量的如上文所述之來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未丙酮酸化且未脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見例如實例22。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID
NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在另一實施例中,免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在另一態樣中,本發明係關於一種引發哺乳動物之對腦膜炎雙球菌之血清群X具特異性之殺細菌性抗體的方法。該方法包括投與該哺乳動物有效量的如上文所述之來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未丙酮酸化且未脂化之2086多肽或其免疫原性組合物。參見例如實例22。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在一個實施例中,該多肽包括SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。在另一實施例中,免疫原性組合物進一步包括至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A
之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
當向哺乳動物投與如上文所述包括四種未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽及腦膜炎雙球菌血清群A、C、W135及Y中之每一者之莢膜醣之結合物的例示性免疫原性組合物時,本發明者驚人地發現相較於不存在莢膜醣之結合物且包括ORF2086多肽之免疫原性組合物且相較於不存在ORF2086多肽且包括腦膜炎雙球菌血清群A、C、W135及Y中之每一者之莢膜醣之結合物的免疫原性組合物,可引發至少針對腦膜炎雙球菌之血清群B、C及Y之協同殺細菌性免疫反應。參見例如實例22。因此,在一個實施例中,免疫原性組合物包括至少一種未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽,其與腦膜炎雙球菌血清群A、C、W135及Y之莢膜醣之至少一種結合物協同作用以引發針對腦膜炎雙球菌之免疫反應。所引發之免疫反應可針對腦膜炎雙球菌之血清群B、C及Y中之至少一者。免疫原性組合物可包括由來自奈瑟菌屬ORF2086之核苷酸序列編碼的蛋白質、其聚核苷酸或等效物作為該免疫原性組合物中之唯一活性免疫原。或者,免疫原性組合物可進一步包括活性免疫原,包括其他奈瑟菌屬免疫原性多肽,或一或多種其他微生物病原體(例如(不限於)病毒、朊病毒、細菌或真菌)之免疫活性蛋白或莢膜多醣。該等組合物可包含所選適應症所需之一或多種所需蛋白質、片段或醫藥化合物。
本發明涵蓋任何多抗原或多價免疫原性組合物。舉例而言,免疫原性組合物可包括兩種或兩種以上ORF2086蛋白之組合、ORF2086蛋白與一或多種Por A蛋白之組合、ORF2086蛋白與腦膜炎雙球菌血清群A、C、Y及W135多醣及/或多醣結合物之組合、ORF2086蛋白與腦膜炎雙球菌及肺炎球菌(pneumococcus)組合之組合,或上述任一者
之組合,呈適於所需投藥,例如適於黏膜傳遞之形式。熟習此項技術者將能夠容易地調配該等多抗原或多價免疫組合物。
在一個態樣中,本發明係關於一種免疫原性組合物,其包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽,及選自以下之至少一種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽及該等結合物中之至少兩者。在另一實施例中,該組合物包括該等結合物中之至少三者。舉例而言,組合物可包括來自以下之醣:血清群A及C;血清群A及W135;血清群A及Y;血清群C及W135;血清群W135及Y;血清群A、C及W135;血清群A、C及Y;血清群A、W135及Y;血清群C及W135及Y。包括至少一種血清群C醣之組合物為較佳的(例如C及Y)。
在另一實施例中,免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽及四種結合物,例如腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
在一較佳實施例中,結合物為莢膜醣與載體蛋白之結合物。適合之載體蛋白在此項技術中為已知的。較佳地,載體蛋白為細菌毒素,諸如白喉或破傷風毒素,或其類毒素或突變體。最佳地,載體蛋白為CRM197。舉例而言,在一個實施例中,組合物包括至少一種選自以下之結合物:(a)(i)血清群A腦膜炎雙球菌之莢膜醣與(ii)CRM197之結合物;(b)(i)血清群C腦膜炎雙球菌之莢膜醣與(ii)CRM197之結合
物;(c)(i)血清群W135腦膜炎雙球菌之莢膜醣與(ii)CRM197之結合物;及(d)(i)血清群Y腦膜炎雙球菌之莢膜醣與(ii)CRM197之結合物。
血清群A、C、W135及Y之莢膜醣在此項技術中已加以表徵且為已知的。舉例而言,血清群A腦膜炎雙球菌之莢膜醣為(α 1→6)連接型N-乙醯基-D-甘露糖胺-1-磷酸鹽之均聚物,其中在C3及C4位置經部分O-乙醯化。C3位置之乙醯化可佔70%至95%。用於純化醣之條件可引起去O-乙醯化(例如在鹼性條件下),但保留此C3位置之OAc為有用的。在一些實施例中,血清群A醣中至少50%(例如至少60%、70%、80%、90%、95%或大於95%)之甘露糖胺殘基在C3位置經O-乙醯化。
可用阻隔基置換乙醯基以防止水解,且該等經修飾之醣仍為本發明之含義內的血清群A醣。
血清群C莢膜醣為(α 2→9)連接型唾液酸(N-乙醯基神經胺糖酸)之均聚物。大部分血清群C菌株在唾液酸殘基之C7及/或C8處具有O-乙醯基,但一些臨床分離株缺乏此等O-乙醯基。
血清群W135醣為唾液酸-半乳糖二醣單元之聚合物。如同血清群C醣,其具有可變之O-乙醯化,但在唾液酸7位及9位上經O-乙醯化。結構係寫為:→4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。
血清群Y醣類似於血清群W135醣,例外為二醣重複單元包括葡萄糖而非半乳糖。血清群Y結構係寫為:→4)-D-NeupNAc(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。如同血清群W135,其在唾液酸7位及9位上具有可變之O-乙醯化。
根據本發明使用之醣可如上文所述經O-乙醯化,例如,具有與在原生莢膜醣中所見之O-乙醯化型態相同的O-乙醯化型態,或其可在醣環之一或多個位置部分或完全地經去O-乙醯化,或其相對於原生莢膜醣可經高度O-乙醯化。
在一個實施例中,免疫原性組合物包括來自腦膜炎雙球菌血清
群B之經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽,及選自以下之至少一種結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物,及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物,其中該未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽包括以下至少一者:B44、B09、A05、B22、A12、A22、A62、B24、B16、B15及B03。在一個實施例中,多肽包括選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。在另一實施例中,多肽包括選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:20,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一實施例中,多肽包括選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60及SEQ ID NO:20,其中位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代。
本發明亦涵蓋多免疫接種方案,其中可將任何適用於針對病原體之組合物組合於本發明之組合物中或與本發明之組合物組合。舉例而言(不限於),可投與患者本發明之免疫原性組合物及另一用於針對人類乳頭狀瘤病毒(HPV)進行免疫接種之免疫組合物(諸如HPV疫苗GARDASIL®)作為多免疫接種方案之一部分。熟習此項技術者將能夠容易地選擇連同本發明之免疫原性組合物一起使用之免疫原性組合物以達成產生及執行多免疫接種方案之目的。
可使用ORF2086多肽、片段及等效物作為結合物免疫原性組合物之一部分;其中一或多種蛋白質或多肽結合於載體以產生針對多種血清型或腦膜炎雙球菌之血清型,尤其針對腦膜炎雙球菌血清群(尤其為血清群B)及/或針對多種疾病具有免疫原性特性的組合物。或者,可使用一種ORF2086多肽作為其他免疫原性多肽之載體蛋白。該等免
疫原性組合物之調配為此領域之技術人員所熟知。
本發明之免疫原性組合物較佳包括醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑。適合之醫藥學上可接受之賦形劑、載劑及/或稀釋劑包括任何及所有習知之溶劑、分散介質、填充劑、固體載劑、水溶液、包覆劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。適合之醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑包括例如水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物中之一或多者以及其組合。
醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑可進一步包括少量輔助物質,諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑,其增強抗體之存放期或有效性。醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑之製備及使用在此項技術中為熟知的。除任何習知介質或試劑與活性成分不相容之外,預期將其用於本發明之免疫原性組合物中。
免疫原性組合物可非經腸,例如藉由皮下注射或肌肉內注射,以及經口或鼻內投與。肌肉內免疫接種之方法由Wolff等人,Biotechniques;11(4):474-85,(1991)及Sedegah等人,PNAS第91卷,第9866-9870頁,(1994)描述。其他投藥方式使用例如(不限於)口服調配物、肺部調配物、栓劑及經皮施用。口服調配物包括例如常用之賦形劑,諸如(不限於)醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂及其類似物。較佳地,肌肉內投與免疫原性組合物。
本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種其他「免疫調節劑」,其為干擾或改變免疫系統,以使得可觀測到體液及/或細胞介導免疫上調或下調的藥劑。在一個特定實施例中,免疫系統之體液及/或細胞介導分支上調為較佳的。某些免疫調節劑之實例尤其包括例如佐劑或細胞激素,或美國專利第5,254,339號中所述之
ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)。
可用於本發明之疫苗中之佐劑之非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、明礬、礦物凝膠(諸如氫氧化鋁凝膠)、水包油乳液、油包水乳液(諸如弗氏(Freund's)完全佐劑及不完全佐劑)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、AMPHIGEN®佐劑、皂素、Quil A或其他皂素部分、單磷醯基脂質A及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。適用於本發明疫苗中之水包油乳液之非限制性實例包括經改質SEAM62及SEAM 1/2調配物。經改質SEAM62為含有以下之水包油乳液:5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)SPAN® 85清潔劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)polysorbate® 80清潔劑(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml膽固醇及0.5%(v/v)卵磷脂。經改質SEAM 1/2為包含以下之水包油乳液:5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)SPAN® 85清潔劑、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80清潔劑、2.5%(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A及50μg/ml膽固醇。
可包括在疫苗中之其他「免疫調節劑」包括例如一或多種介白素、干擾素或其他已知細胞激素或趨化因子。在一個實施例中,佐劑可為環糊精衍生物或聚陰離子性聚合物,諸如美國專利第6,165,995號及第6,610,310號中所分別描述者。應瞭解,欲使用之免疫調節劑及/或佐劑將視將接受疫苗或免疫原性組合物投藥之個體、注射途徑及欲給與之注射次數而定。
在一些實施例中,佐劑為皂素。在一些實施例中,皂素濃度為1μg/ml至250μg/ml;5μg/ml至150μg/ml;或10μg/ml至100μg/ml。在一些實施例中,皂素濃度為約1μg/ml;約5μg/ml;約10μg/ml;約20μg/ml;約30μg/ml;約40μg/ml;約50μg/ml;約60μg/ml;約70μg/ml;約80μg/ml;約90μg/ml;約100μg/ml;約110μg/ml;約120
μg/ml;約130μg/ml;約140μg/ml;約150μg/ml;約160μg/ml;約170μg/ml;約180μg/ml;約190μg/ml;約200μg/ml;約210μg/ml;約220μg/ml;約230μg/ml;約240μg/ml;或約250μg/ml。
在某些較佳實施例中,將本發明之蛋白質用於經口投與之免疫原性組合物中,該組合物包括黏膜佐劑且用於治療或預防人類宿主之腦膜炎雙球菌感染。該黏膜佐劑可為霍亂毒素;然而,較佳地,除霍亂毒素以外的可根據本發明使用之黏膜佐劑包括霍亂全毒素之無毒衍生物(其中A次單位經突變誘發)、經化學修飾之霍亂毒素或藉由修飾霍亂毒素胺基酸序列所產生之相關蛋白質。對於可尤其適用於製備本發明之免疫原性組合物的特定霍亂毒素,參見突變霍亂全毒素E29H,如國際公開申請案WO 00/18434中所揭示,該申請案以全文引用的方式併入本文。可將此等佐劑添加至本發明多肽中或與本發明多肽結合。相同技術可應用於其他具有黏膜佐劑或傳遞特性之分子,諸如大腸桿菌熱不穩定性毒素(LT)。
可使用具有黏膜佐劑或傳遞活性之其他化合物,諸如膽汁;聚陽離子,諸如DEAE-聚葡萄糖及聚鳥胺酸;清潔劑,諸如十二烷基苯硫酸鈉;結合脂質之物質;抗生素,諸如鏈黴素(streptomycin);維生素A;及其他可改變黏膜表面之結構或功能完整性的化合物。其他黏膜活性化合物包括微生物結構之衍生物,諸如MDP;吖啶及西咪替丁(cimetidine)。亦可使用如上文所述之STIMULONTM QS-21、MPL及IL-12。
本發明之免疫原性組合物可以ISCOMS(免疫刺激複合物)、含有CTB之ISCOMS、脂質體或囊封於諸如丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)之化合物中形成具有適於吸附之尺寸的微球體形式傳遞。本發明之蛋白質亦可併入油性乳液中。
投與患者之免疫原性組合物之量(亦即劑量)可根據為一般技術者
所知之標準技術,在考慮諸如特定抗原、佐劑(若存在)、特定患者之年齡、性別、體重、物種、病狀及投藥途徑之因素下來確定。
舉例而言,用於青年人類患者之劑量可包括至少0.1μg、1μg、10μg或50μg奈瑟菌屬ORF2086蛋白質及至多80μg、100μg、150μg或200μg奈瑟菌屬ORF2086蛋白質。任何最小值與任何最大值可組合以確定適合範圍。
如本文所述之免疫原性組合物在某些實施例中亦包含一或多種佐劑。佐劑為在連同免疫原或抗原一起投與時增強免疫反應之物質。
多種細胞激素或淋巴介質已經展示具有免疫調節活性,且因此適用作佐劑,包括(但不限於)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如美國專利第5,723,127號)、13、14、15、16、17及18(及其突變形式);干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ;顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)(參見例如美國專利第5,078,996號及ATCC寄存編號39900);巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF);顆粒球群落刺激因子(G-CSF);及腫瘤壞死因子α及β。
適於與本文所述之免疫原性組合物一起使用之其他佐劑包括趨化因子,包括(不限於)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES;黏附分子,諸如選擇素,例如L-選擇素、P-選擇素及E-選擇素;黏蛋白樣分子,例如CD34、GlyCAM-1及MadCAM-1;整合素家族之成員,諸如LFA-1、VLA-1、Mac-1及p150.95;免疫球蛋白超家族之成員,諸如PECAM、ICAM,例如ICAM-1、ICAM-2及ICAM-3,CD2及LFA-3;共刺激分子,諸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L;生長因子,包括血管生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL-1及血管內皮生長因子;受體分子,包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、
NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2及DR6;及卡斯蛋白酶(Caspase)(ICE)。
其他例示性佐劑包括(但不限於)氫氧化鋁;磷酸鋁;STIMULONTM QS-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,Mass.);MPLTM(3-O-去醯化單磷醯基脂質A;Corixa,Hamilton,Mont.)、529(胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物,Corixa,Hamilton,Mont.)、IL-12(Genetics Institute,Cambridge,Mass.);GM-CSF(Immunex Corp.,Seattle,Wash.);N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP);N-乙醯基-去甲基-胞壁醯-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637,稱為nor-MDP);N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧基-乙胺)(CGP 19835A,稱為MTP-PE);及霍亂毒素。在某些較佳實施例中,佐劑為QS-21。
其他例示性佐劑包括霍亂毒素之無毒衍生物,包括其A次單位,及/或腦膜炎雙球菌多肽與霍亂毒素或其B次單位(「CTB」)之結合物或遺傳工程改造融合物、霍亂前原類毒素(procholeragenoid)、真菌多醣,包括裂襇菌素(schizophyllan)、胞壁醯二肽、胞壁醯二肽(「MDP」)衍生物、佛波醇酯、大腸桿菌之熱不穩定毒素、嵌段聚合物或皂素。
磷酸鋁已作為佐劑用於1期臨床試驗中,其濃度為每劑0.125mg,比由美國聯邦法規(US Code of Federal Regulations)[610.15(a)]規定之極限每劑0.85mg低得多。含鋁佐劑廣泛用於人類以在肌肉內或皮下投與時增強抗原之免疫反應。在一些實施例中,免疫原性組合物中鋁之濃度為0.125μg/ml至0.5μg/ml;0.20μg/ml至0.40μg/ml;或0.20μg/ml至0.30μg/ml。在一些實施例中,免疫原性組合物中鋁之濃度為約0.125μg/ml;約0.15μg/ml;約0.175μg/ml;約0.20μg/ml;約
0.225μg/ml;約0.25μg/ml;約0.275μg/ml;約0.30μg/ml;約0.325μg/ml;約0.35μg/ml;約0.375μg/ml;約0.40μg/ml;約0.425μg/ml;約0.45μg/ml;約0.475μg/ml;或約0.50μg/ml。
在一較佳實施例中,免疫原性組合物中鋁之濃度為0.125mg/ml至0.5mg/ml;0.20mg/ml至0.40mg/ml;或0.20mg/ml至0.30mg/ml。
在一些實施例中,免疫原性組合物中鋁之濃度為約0.125mg/ml;約0.15mg/ml;約0.175mg/ml;約0.20mg/ml;約0.225mg/ml;約0.25mg/ml;約0.275mg/ml;約0.30mg/ml;約0.325mg/ml;約0.35mg/ml;約0.375mg/ml;約0.40mg/ml;約0.425mg/ml;約0.45mg/ml;約0.475mg/ml;或約0.50mg/ml。
適用於增強免疫反應之佐劑進一步包括(不限於)MPLTM(3-O-去醯化單磷醯基脂質A,Corixa,Hamilton,MT),其描述於美國專利第4,912,094號中。合成脂質A類似物或胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物亦適用作佐劑,其可自Corixa(Hamilton,MT)獲得且描述於美國專利第6,113,918號中。一種該AGP為2-[(R)-3-十四醯氧基十四醯胺基]乙基2-去氧-4-O-膦醯基-3-O-[(R)-3-十四醯氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯氧基十四醯基-胺基]-b-D-葡萄哌喃糖苷,其亦稱為529(原先稱作RC529)。此529佐劑係調配成水性形式(AF)或穩定乳液(SE)。
其他佐劑包括胞壁醯肽,諸如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲基胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE);水包油乳液,諸如MF59(美國專利第6,299,884號)(含有5%角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80及0.5%斯潘(SPAN)85(視情況含有各種量之MTP-PE),使用微流化床(諸如型號110Y之微流化床(Microfluidics,Newton,MA))調配成次微米粒子);及SAF(含有10%角鯊烯、0.4%聚山梨醇酯80、5%普洛
尼克(PLURONIC)-嵌段聚合物L121及thr-MDP,微流體化成次微米乳液或渦旋產生較大粒度之乳液);不完全弗氏佐劑(IFA);鋁鹽(明礬),諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁;愛菲金(AMPHIGEN);阿夫立定;L121/角鯊烯;D-丙交酯-聚乳酸交酯/醣苷;普洛尼克多元醇;殺死之博德氏桿菌(Bordetella);皂素,諸如StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA.)(描述於美國專利第5,057,540號中)、ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)(描述於美國專利第5,254,339號中)及免疫刺激複合物(ISCOMATRIX);結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis);細菌脂多醣;合成聚核苷酸,諸如含有CpG基元之寡核苷酸(例如美國專利第6,207,646號);IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria),描述於歐洲專利第1,296,713號及第1,326,634號中;百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如美國專利第7,285,281號、第7,332,174號、第7,361,355號及第7,384,640號);或大腸桿菌熱不穩定性毒素(LT)或其突變體,尤其為LT-K63、LT-R72(例如美國專利第6,149,919號、第7,115,730號及第7,291,588號)。
在一個態樣中,本發明係關於一種產生未丙酮酸化且未脂化之ORF2086多肽的方法。該方法包括使編碼ORF2086多肽之核苷酸序列表現,在該ORF2086多肽中,相較於相應之野生型序列,N端半胱胺酸係經刪除,且其中該核苷酸序列可操作地連接至能夠在細菌細胞中表現之表現系統。藉由該方法產生之例示性多肽包括本文所述之任何多肽。舉例而言,較佳地,多肽具有以下所闡述之胺基酸序列:SEQ ID NO:12;SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:14;SEQ ID NO:15;SEQ ID NO:16;SEQ ID NO:17;SEQ ID NO:18;SEQ ID NO:19;SEQ ID NO:20;SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:58;SEQ ID NO:70,其中相較於相應之野生型序列,位置1之半胱胺酸係經刪除。在另一較佳
實施例中,多肽具有SEQ ID NO:76中所闡述之胺基酸序列,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。其他例示性多肽包括具有選自以下之胺基酸序列的多肽:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:75。
另一例示性多肽包括具有胺基酸序列SEQ ID NO:77之多肽。其他實例包括SEQ ID NO:80(B24)及SEQ ID NO:81(B24)。該方法進一步包括純化該多肽。
在一些實施例中,本發明提供一種產生可溶性未脂化之P2086抗原的方法,其包含以下步驟:將ORF2086變異體核酸序列選殖至無脂化控制序列之大腸桿菌表現載體中,用ORF2086表現載體將大腸桿菌細菌轉型,誘導表現及分離表現之P2086蛋白。在一些實施例中,用IPTG誘導表現。
在一些實施例中,ORF2086變異體之N端Cys之密碼子係經刪除。該等密碼子之實例包括TGC。在一些實施例中,藉由點突變誘發使ORF2086變異體之N端Cys之密碼子突變以產生Ala、Gly或Val密碼子。在一些實施例中,將Ser及Gly密碼子添加至ORF2086變異體之N端尾中以延伸與N端Cys緊鄰之下游處的Gly/Ser莖部。在一些實施例中,Gly/Ser莖部內Gly及Ser殘基之總數為至少7、8、9、10、11或12。在一些實施例中,N端Cys之密碼子係經刪除。在一些實施例中,N端7個、8個、9個、10個、11個或12個殘基為Gly或Ser。
在一些實施例中,藉由點突變誘發將未脂化之ORF2086變異體之N端尾之密碼子最佳化。在一些實施例中,將未脂化之ORF2086變異體之N端尾最佳化以匹配B09變異體之N端尾。在一些實施例中,藉由點突變誘發將ORF2086變異體之N端尾之密碼子最佳化,從而使得編碼ORF2086變異體之第五個胺基酸之密碼子與SEQ ID NO:8之核苷酸
13至15 100%一致,且編碼ORF2086變異體之第十三個胺基酸之密碼子與SEQ ID NO:8之核苷酸37至39 100%一致。在一些實施例中,將未脂化之ORF2086變異體之N端尾最佳化,以使得5'端45個核酸與SEQ ID NO:8之核酸1至45 100%一致。在一些實施例中,將未脂化之ORF2086變異體之N端尾最佳化,以使得5'端42個核酸與SEQ ID NO:8之核酸4至45 100%一致。在一些實施例中,將未脂化之ORF2086變異體之N端尾最佳化,以使得5'端39個核酸與SEQ ID NO:8之核酸4至42 100%一致。在一些實施例中,未脂化之P2086變異體之N端尾相較於SEQ ID NO:18之胺基酸1至15包含至少一處胺基酸取代。在一些實施例中,未脂化之P2086變異體之N端尾相較於SEQ ID NO:18之胺基酸1至15包含兩處胺基酸取代。在一些實施例中,未脂化之P2086變異體之N端尾相較於SEQ ID NO:18之胺基酸2至15包含至少一處胺基酸取代。在一些實施例中,未脂化之P2086變異體之N端尾相較於SEQ ID NO:18之胺基酸2至15包含兩處胺基酸取代。在一些實施例中,胺基酸取代為保守胺基酸取代。
在一些實施例中,未脂化之變異體之密碼子已經最佳化以使表現增加。密碼子最佳化在此項技術中為已知的。參見例如Sastalla等人,Applied and Environmental Microbiology,第75(7)卷:2099-2110(2009)及Coleman等人,Science,第320卷:1784(2008)。在一些實施例中,密碼子最佳化包括將胺基酸序列之密碼子利用率與所選擇而包括及/或不包括特定DNA序列之宿主生物體之密碼子頻率相匹配。在一些實施例中,密碼子最佳化進一步包括最小化相應二級mRNA結構以減少轉譯障礙。在一些實施例中,N端尾已經密碼子最佳化而包含SEQ ID NO:28、30、32及34中之任一者。在一些實施例中,Gly/Ser莖部已經密碼子最佳化而包含SEQ ID NO:28、30、32及34中之任一者。
為了可更好地理解本發明,闡述以下實例。該等實例僅出於說明之目的而不視作限制本發明範疇。
在某些實施例中,本發明之免疫原性組合物進一步包含以下至少一者:佐劑、緩衝劑、低溫保護劑、鹽、二價陽離子、非離子型清潔劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載劑。
本發明之免疫原性組合物除複數種腦膜炎雙球菌蛋白質抗原及莢膜多醣-蛋白質結合物之外亦可進一步包含一或多種防腐劑。FDA要求多劑量(多劑量)小瓶中之生物產品含有防腐劑,僅有少數例外。
含有防腐劑之疫苗產品包括含有以下之疫苗:苄索氯銨(benzethonium chloride)(炭疽)、2-苯氧乙醇(DTaP、HepA、萊姆病(Lyme)、脊髓灰質炎(Polio)(非經腸))、苯酚(肺炎球菌(Pneumo)、傷寒(非經腸)、牛痘)及硫柳汞(thimerosal)(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、腦膜炎(Mening)、肺炎球菌、狂犬病)。批准用於可注射藥物之防腐劑包括例如氯丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯銨、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
本發明調配物可進一步包含以下一或多者:緩衝劑、鹽、二價陽離子、非離子型清潔劑、低溫保護劑(諸如糖)及抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑),或其任何多重組合。對任一種組分(例如螯合劑)之選擇可決定是否需要另一組分(例如清除劑)。調配用於投藥之最終組合物應為無菌及/或無熱原的。熟練技術人員可憑經驗確定將最佳用於納入含有防腐劑之本發明免疫原性組合物中之此等及其他組分之組合,視多種因素而定,諸如所需之特定儲存及投藥條件。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種選自(但不限於)以下之生理學上可接受之緩衝劑:參(三甲胺)、
磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸及丁二酸鹽。
在某些實施例中,將調配物緩衝至約6.0至約9.0,較佳約6.4至約7.4之pH值範圍內。
在某些實施例中,可能需要調節本發明之免疫原性組合物或調配物之pH值。可使用此項技術中之標準技術調節本發明之調配物之pH值。可將調配物之pH值調節至3.0至8.0。在某些實施例中,調配物之pH值可為,或可調節至3.0至6.0、4.0至6.0或5.0至8.0。在其他實施例中,調配物之pH值可為,或可調節至約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約5.8、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。在某些實施例中,pH值可為,或可調節至以下範圍內:4.5至7.5,或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5或7.5至8.0。在一特定實施例中,調配物之pH值為約5.8。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種二價陽離子,包括(但不限於)MgCl2、CaCl2及MnCl2,濃度在約0.1mM至約10mM範圍內,至多約5mM為較佳的。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種鹽,包括(但不限於)氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉及硫酸鉀,以在非經腸投與時對於個體而言在生理學上可接受之離子濃度存在且以在最終調配物中產生所選離子濃度或容積莫耳滲透濃度的最終濃度納入。
調配物之最終離子濃度或重量莫耳滲透濃度將由多種組分(例如來自緩衝化合物及其他非緩衝鹽之離子)決定。較佳之鹽,即NaCl在至多約250mM之範圍內存在,其中鹽濃度經選擇以補充其他組分(例如糖),因此調配物之最終總容積莫耳滲透濃度與非經腸投與(例如肌肉內或皮下注射)相容且將促進免疫原性組合物調配物之免疫原性組分在各種溫度範圍內之長期穩定性。無鹽調配物將容許一或多種所選低
溫保護劑之範圍增加以維持所需之最終容積莫耳滲透濃度水準。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種選自(但不限於)以下之低溫保護劑:二醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)及聚羥基烴(例如半乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇)。
在某些實施例中,調配物之容積莫耳滲透濃度在約200mOs/L至約800mOs/L範圍內,其中較佳範圍為約250mOs/L至約500mOs/L或約300mOs/L至約400mOs/L。無鹽調配物可含有例如約5%至約25%蔗糖,且較佳含有約7%至約15%或約10%至約12%蔗糖。或者,無鹽調配物可含有例如約3%至約12%山梨糖醇,且較佳含有約4%至7%或約5%至約6%山梨糖醇。若添加諸如氯化鈉之鹽,則相對減少蔗糖或山梨糖醇之有效範圍。此等及其他該等重量莫耳滲透濃度及容積莫耳滲透濃度考慮完全處於此項技術之技能範圍內。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種自由基氧化抑制劑及/或螯合劑。多種自由基清除劑及螯合劑在此項技術中為已知的且適用於本文所述之調配物及使用方法。實例包括(但不限於)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露糖醇、組胺酸、甘油、檸檬酸鈉、肌醇六磷酸、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、丁二酸/丁二酸鹽、蘋果酸/順丁烯二酸鹽、甲碘酸去鐵銨、EDDHA及DTPA,以及上述兩者或兩者以上之各種組合。在某些實施例中,可以有效增強調配物之長期穩定性的濃度添加至少一種非還原性自由基清除劑。亦可以各種組合(諸如清除劑與二價陽離子)形式添加一或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑。螯合劑之選擇將決定是否需要添加清除劑。
在某些實施例中,與非經腸投與相容之本發明調配物包含一或多種非離子型界面活性劑,包括(但不限於)聚氧化乙烯脫水山梨糖醇
脂肪酸酯、聚山梨醇酯-80(吐溫(TWEEN)80)、聚山梨醇酯-60(吐溫60)、聚山梨醇酯-40(吐溫40)及聚山梨醇酯-20(吐溫20);聚氧乙烯烷基醚,包括(但不限於)玻雷吉(BRIJ)58、玻雷吉35以及其他者,諸如曲通(TRITON)X-100;曲通X-114、NP40、斯潘85及普洛尼克系列之非離子型界面活性劑(例如普洛尼克121),其中較佳組分為約0.001%至約2%(至多約0.25%為較佳的)之濃度的聚山梨醇酯-80或約0.001%至1%(至多約0.5%為較佳的)之濃度的聚山梨醇酯-40。
在某些實施例中,本發明之調配物包含一或多種適用於非經腸投與之其他穩定劑,例如包含至少一個硫醇(-SH)基團之還原劑(例如半胱胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、還原之麩胱甘肽、硫代乙醇酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物)。或者或視情況,可進一步藉由自儲存容器中移除氧氣、將調配物遮光保護(例如藉由使用琥珀玻璃容器)來使本發明之含防腐劑之免疫原性組合物調配物穩定。
本發明之含防腐劑之免疫原性組合物調配物可包含一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑,其包括本身不誘導免疫反應之任何賦形劑。適合之賦形劑包括(但不限於)巨分子,諸如蛋白質、醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、蔗糖(Paoletti 等人,2001,Vaccine,19:2118)、海藻糖、乳糖及脂質聚集物(諸如油滴或脂質體)。該等稀釋劑、賦形劑及/或載劑為熟練技術人員所熟知。醫藥學上可接受之賦形劑論述於例如Gennaro,2000,Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,ISBN:0683306472中。
本發明之組合物可經凍乾或呈水性形式,亦即溶液或懸浮液。液體調配物可有利地自其包裝形式直接投與且因此對於注射而言為理想的而不需要為本發明之凍乾組合物另外所需之在水性介質中進行復原。
可藉由非經腸投與(肌肉內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內投與
或投與至組織之間質間隙);或藉由經直腸、經口、經陰道、局部、經皮、鼻內、眼部、經耳、肺部或其他黏膜投藥來向個體直接傳遞本發明之免疫原性組合物。在一較佳實施例中,非經腸投與係藉由肌肉內注射例如於個體之大腿或上臂來達成。注射可經由針(例如皮下注射針)來達成,但或者可使用無針注射。典型肌肉內劑量為0.5mL。
本發明之組合物可以例如用於注射之各種形式製備成液體溶液或懸浮液。在某些實施例中,組合物可製備成用於肺部投藥(例如於吸入器中)之粉末或噴霧劑。在其他實施例中,組合物可製備成栓劑或子宮托,或對於經鼻、經耳或眼部投藥,例如製備成噴霧劑、滴劑、凝膠劑或粉末。
特定免疫原性組合物之組分之最佳量可藉由涉及觀測個體之適當免疫反應之標準研究來確定。在最初疫苗接種後,個體可接受一次或多次時間間隔足夠長之追加免疫接種。
本發明之免疫原性組合物可包裝成單位劑量或多劑量形式(例如2劑、4劑或4劑以上)。對於多劑量形式,相較於預裝藥品之注射器,小瓶通常但未必為較佳的。適合之多劑量形式包括(但不限於):每個容器2至10次劑量,每劑0.1至2mL。在某些實施例中,劑量為0.5mL劑量。參見例如國際專利申請案WO2007/127668,其以引用方式併入本文中。
組合物可存在於小瓶或其他適合之儲存容器中,或可存在於預裝藥品之傳遞裝置中,例如單組分或多組分注射器,該等注射器可提供有針或未提供針。注射器通常但未必容納單一劑量之本發明之含防腐劑免疫原性組合物,但亦設想多劑量預裝藥品之注射器。同樣,小瓶可包括單一劑量,但另外可包括多個劑量。
可常規地確立有效之劑量體積,但用於注射之組合物之典型劑
量具有0.5mL之體積。在某些實施例中,劑量經調配以向人類個體進行投藥。在某些實施例中,劑量經調配以向成人、青少年、青年、幼童或嬰兒(亦即至多一歲大)人類個體進行投藥且在較佳實施例中可藉由注射投與。
本發明之液體免疫原性組合物亦適用於復原以凍乾形式存在之其他免疫原性組合物。在免疫原性組合物用於該臨時復原時,本發明提供一種套組,該套組具有兩個或兩個以上小瓶、兩個或兩個以上已填充注射器或各一或多個小瓶及已填充注射器,其中在注射前使用注射器之內容物復原小瓶之內容物,或反之亦然。
或者,可例如使用此項技術中熟知之多種用於冷凍乾燥之方法中之一者將本發明之免疫原性組合物凍乾且復原以形成乾燥之形狀規則(例如球形)之粒子,諸如小粒或微球體,該等粒子具有可藉由改變用於製備其之精確方法來選擇及控制之諸如平均直徑尺寸之粒子特徵。免疫原性組合物可進一步包含佐劑,該佐劑可視情況用各別乾燥之形狀規則(例如球形)之粒子(諸如小粒或微球體)製備或含於該等粒子中。在該等實施例中,本發明進一步提供一種免疫原性組合物套組,其包含第一組分,該第一組分包括本發明之視情況進一步包含一或多種防腐劑之穩定化之乾燥免疫原性組合物;及第二組分,該第二組分包含用於復原第一組分之無菌水性溶液。在某些實施例中,水性溶液包含一或多種防腐劑,且可視情況包含至少一種佐劑(參見例如WO2009/109550(以引用方式併入本文中))。
在另一實施例中,多劑量形式之容器係選自(但不限於)由以下組成之群的一或多者:一般實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、醱酵器、生物反應器、管、管道、袋、罐、小瓶、小瓶扣合物(例如橡膠塞、螺旋蓋)、安瓿、注射器、雙腔室或多腔室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡膠扣合物、塑膠扣合物、玻璃扣合物、藥筒及拋棄式
筆及其類似物。本發明之容器不受製造材料限制,且包括諸如玻璃、金屬(例如鋼、不鏽鋼、鋁等)及聚合物(例如熱塑性聚合物、彈性體、熱塑性彈性體)之材料。在一特定實施例中,該形式之容器為具有丁基橡膠塞之5mL肖特(Schott)1型玻璃小瓶。熟練技術人員將瞭解,上述形式絕非詳盡清單,而僅用作在可用於本發明之形式種類方面對技術人員的指導。預期用於本發明中之其他形式可見於來自實驗室設備供應商及製造商(諸如United States Plastic Corp.(Lima,OH)、VWR)之公開目錄中。
用吸附於AlPO4之rLP2086或rP2086(A+B)蛋白質經肌肉內對食蟹獼猴(n=5隻/組)進行免疫接種。食蟹獼猴為非人類靈長類動物之一個實例。在第0週、第4週及第24週對動物進行疫苗接種,且在第0週、第4週、第6週及第26週測定ORF2086特異性IgG及功能性抗體力價。測定針對rLP2086A及rLP2086B之血清ORF2086特異性IgG力價。
藉由血清殺細菌分析(SBA)研究針對腦膜炎雙球菌菌株之功能性抗體力價,該等腦膜炎雙球菌菌株表現具有與疫苗中所含之序列同源或異源之序列的LP2086。
使用SBA用人類補體測定用ORF2086疫苗進行免疫接種之獼猴或兔中之血清殺細菌性抗體。將兔免疫血清或獼猴免疫血清熱不活化以移除固有補體活性且隨後在96孔微量滴定盤中於含Ca2+及Mg2+之杜氏PBS(Dulbecco's PBS)(D-PBS)中1:2連續稀釋以測試針對腦膜炎雙球菌菌株之血清殺細菌活性。使分析中使用之細菌在補充有凱洛格氏補充劑(Kellogg's supplement,GCK)之GC培養基中生長且藉由在650nm下之光密度進行監測。在0.50-0.55之最終OD650下收集細菌以用於分
析中,在D-PBS中稀釋且將1000-3000 CFU添加至具有20%人類補體之分析混合物中。
使用殺細菌活性不可偵測之人類血清作為外源補體來源。測試補體來源對於各個別測試菌株之適合性。只有當在未添加免疫血清下對照組中存活之細菌數>75%時才使用補體來源。需要十種獨特之補體來源來進行此研究中所述之SBA。
在37℃、5%CO2下培育30分鐘之後,將D-PBS添加至反應混合物中且將等分試樣轉移至填充有50%GCK培養基之微量過濾盤中。過濾微量過濾盤,在37℃、5%CO2下培育隔夜且對微菌落進行染色且定量。血清殺細菌力價係定義為相較於在無免疫血清下對照孔中之CFU,使CFU減少50%之血清稀釋度之內插倒數。SBA力價係定義為在37℃下培育30分鐘之後使細菌計數減少50%之測試血清之內插稀釋度之倒數。若ORF2086免疫血清之SBA力價為相應免疫前血清之4倍或大於4倍,則確定對利用ORF2086免疫血清之殺死作用具敏感性。
在起始稀釋度下針對分析菌株呈陰性之血清的力價係指定為分析之偵測極限的一半(亦即4)。
最初藉由自基因組DNA進行PCR擴增來獲得對應於來自腦膜炎雙球菌菌株M98250771(A05)之殘基27至286的成熟P2086胺基酸序列。具有序列TGCCATATGAGCAGCGGAAGCGGAAG(SEQ ID NO:22)之正向引子黏接至5'端序列且含有用於選殖之NdeI位點。具有序列CGGATCCCTACTGTTTGCCGGCGATGC(SEQ ID NO:23)之反向引子黏接至基因之3'端且含有終止密碼子TAG,後面是限制性位點BamHI。首先將799bp擴增片段選殖至中間載體PCR2.1(Invitrogen,Carlesbac,CA)中。用NdeI及BamHI裂解此質體,且將其接合至表現載體pET9a(Novagen,Madison,WI)中,該表現載體已經NdeI及BamHI
裂解。所得載體pLA100(其包括SEQ ID NO:54)表現無N端半胱胺酸之來自菌株M98250771之成熟子族A05 P2086(參見SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys係經刪除;或SEQ ID NO:55),該N端半胱胺酸應存在於脂化之蛋白質中。使用BLR(DE3)大腸桿菌宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm△(srl-recA)306::Tn10(TetR)(DE3)](Novagen)使fHBP表現。
使用相同選殖步驟來製備B02、B03、B09、B22、B24、B44、A04、A12及A22之N端Cys刪除型變異體。亦藉由此相同方法,使用亦包括Cys密碼子(例如SEQ ID NO:1-11之第一個密碼子)之正向引子來製備含有N端Cys之變異體。基於本文提供之序列,技術人員將能夠設計用於此等變異體中之每一者的正向引子及反向引子。舉例而言,使用以下引子擴增B44未脂化之變異體,繼而使用NdeI及BlpI將其選殖至pET9a中。
未脂化之質體構築體強烈表現,但未脂化之蛋白質變異體在N端Cys殘基處經丙酮酸化。參見實例8及9,其描述例如用於表現構築體之方法。為克服此丙酮酸化,使N端Cys密碼子經刪除。參見例如實例10。然而,使N端Cys經刪除會消除A22及B22變異體之表現。參見例如圖4。然而,雖然N端Cys殘基經刪除,但A05、B01及B44變異體
仍表現。參見例如位置1之N端Cys經刪除之SEQ ID NO:13(A05)、SEQ ID NO:35(B01 N端),及位置1之N端Cys經刪除之SEQ ID NO:21(B44)。參見例如圖5。另外,未脂化之B09變異體之表現不受N端Cys殘基刪除影響。參見例如實例4。
為了確定A05、B01及B44變異體在N端Cys不存在下表現而A22及B22變異體則不表現的原因,比對此等變異體之序列。A05、B01及B44變異體皆具有緊鄰N端Cys之後的一系列延伸之10或11個Gly及Ser殘基(亦即Gly/Ser莖部)。然而,A22及B22變異體僅具有由6個Gly及Ser殘基組成之Gly/Ser莖部。因此,藉由插入另外之Gly及Ser殘基使A22及B22變異體之Gly/Ser莖部延伸。
藉由實例2中所述之方法,使用編碼具有10個或11個Gly及Ser殘基之Gly/Ser莖部之正向引子製備長Gly/Ser莖部變異體。
相較於N端Cys刪除型A22及B22短Gly/Ser莖部(6個Gly/Ser殘基)變異體,N端Cys刪除型長Gly/Ser莖部(10至11個Gly/Ser殘基)A22及B22變異體展示出表現增加。然而,相較於A05、B01及B44變異體表現量,此等表現量仍有所降低。
未脂化之B09變異體之表現不受N端Cys殘基刪除影響(參見位置1之半胱胺酸經刪除的SEQ ID NO:18,或SEQ ID NO:49)。參見例如圖6。對B09變異體進行序列評估表明,B09變異體具有由6個Gly及Ser殘基組成之Gly/Ser莖部,該Gly/Ser莖部類似於A22及B22變異體之Gly/Ser莖部。實際上,B09與A22變異體之N端尾在胺基酸層面上為一致的。然而,B09與A22變異體(分別為SEQ ID NO:53與42)之N端尾在核酸層面上有2個核酸不同:SEQ ID NO:8之核酸15及39。參見例如圖6。B22變異體之N端尾之前14個胺基酸與B09及A22變異體一
致,且B22變異體之N端尾僅在第15個胺基酸處不同。B22變異體之核酸1至42與A22變異體之核酸1至42一致。B22變異體(參見SEQ ID NO:52)之核酸1至42與B09(參見SEQ ID NO:53)之核酸1至42一致,但在最佳比對時,於核酸15及39處存在差異。因此,B22變異體與B09變異體之不同之處在於SEQ ID NO:8之胺基酸15及39。此最後一句含有打字錯誤且應表述為B22變異體與B09變異體的不同之處在於SEQ ID NO:8之核酸15及39。
為了確定核酸差異是否影響B09變異體相較於A22及B22變異體之表現量,藉由點突變使A22及B22變異體突變以將核酸15及39併入Gly5及Gly 13之相應密碼子中。併入此等沉默核酸突變會使得A22及B22 N端Cys刪除型變異體之表現顯著增加至類似於N端Cys刪除型B09變異體之表現量。參見例如圖7。因此,進行密碼子最佳化以匹配B09變異體可使N端Cys刪除型未脂化之P2086變異體之表現增加。
對未脂化之變異體序列進行進一步分析表明在Gly/Ser莖部中進行另外之密碼子最佳化會改良表現。因此,藉由實例2之方法,使用包含該等經密碼子最佳化之序列的正向引子建構另外之未脂化之變異體。用於產生經最佳化之Gly/Ser莖部的正向引子包括以下任何序列:
ISCOMATRIX調配疫苗產生快速之免疫反應,使得達成大於4倍反應率所需之劑量數有所減少,如在血清殺細菌分析中所量測。用二價未脂化之rP2086疫苗之不同調配物對各組五隻恆河猴進行免疫接種。疫苗包括未丙酮酸化且未脂化之A05變異體(SEQ ID NO:13(其中位置1之N端Cys係經刪除)或由SEQ ID NO:54編碼之SEQ ID NO:55)及未丙酮酸化且未脂化之B44變異體(SEQ ID NO:21(其中位置1之N端Cys係經刪除)或由SEQ ID NO:51編碼之SEQ ID NO:44)。佐劑單位如下:AlPO4為250mcg,ISCOMATRIX為10mcg至100mcg。表2至5中所示之AlPO4之佐劑單位係展示為毫克單位,且因此與250mcg相對而展示為0.25(毫克)。
免疫接種時程為第0週、第4週及第24週,其中在第0週、第4週、第6週及第26週取血。在第一次給藥後,任一組之SBA力價均未增加。在第二次給藥後,對於含有ISCOMATRIX佐劑之調配物觀測到SBA力價增加及反應者數目增加,反應者係如由SBA力價高於基線增加至4倍所定義。表2及3分別提供對於fHBP子族A及B菌株所觀測到的SBA GMT。ISCOMATRIX調配物之SBA GMT分別為對於A及B子族菌株之AIPO4調配物所觀測到之SBA GMT的3至19倍及4至24倍。在第三次給藥後,對於ISCOMATRIX調配物亦觀測到力價增強,fHBP子族A及B菌株之ISCOMATRIX調配物分別為AIPO4調配物的13至95倍及2至10倍。對如由SBA力價較基線增加至四倍或大於四倍所定義的反應者比率之分析揭露相似之趨勢(表4及5)。
重組表現之未脂化之P2086變異體(B44)針對呈現不同之fHBP變異體(約85%至約<92%一致性)LP2086序列之菌株誘導如由SBA所量測之廣泛之保護作用。對於用AlPO4調配之未脂化之疫苗獲得此等反應率。參見表6,其展示由二價fHBP疫苗產生之對子族B fHBP MnB菌株的SBA反應率。未脂化之疫苗(在「脂化」行下由「-」表示)包括每種蛋白質1mcg之未丙酮酸化且未脂化之A05變異體(SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys係經刪除)及未丙酮酸化且未脂化之B44變異體(SEQ ID NO:21,其中位置1之N端Cys係經刪除)。
或者,如由SBA力價所量測重組表現之未脂化之P2086變異體(B44)針對帶有相似(>92%一致性)及不同(<92%一致性)LP2086序列之菌株所誘導之免疫反應大於脂化之變異體(B01)。相較於脂化之rLP2086 B01疫苗,對於含有未脂化之rP2086 B44之疫苗觀測到較高反應率(如由SBA力價較基線增加至四倍或大於四倍所定義)(表6)。
根據表6,未脂化之B44為針對多種LP2086變異菌株(例如引發針對多種LP2086變異菌株之殺細菌性抗體)提供廣泛作用譜的組合物中較佳之fHBP子族B組分。
令人驚奇的是,本發明者注意到LP2086 B09變異菌株尤其不可能對於異源(非B09)ORF2086多肽具有陽性SBA反應率。特定而言,本發明者發現就分析菌株而言,LP2086 B09為一例外,表6中所述之A05/B44免疫原性組合物針對該分析菌株可引發殺細菌性抗體。因此,在一較佳實施例中,本發明之免疫原性組合物包括B09多肽,尤其在組合物包括超過一種ORF2086子族B多肽的情況下。在一較佳實施例中,包括未脂化之B44之免疫原性組合物亦可包括未脂化之B09多肽。
雖然在前述實例中所達成之表現量足以用於許多應用,但需要進一步最佳化,因此製備在蛋白質之全長範圍內含有額外密碼子最佳化的大腸桿菌表現構築體並加以測試。發現用於表現非Cys B44蛋白質之一個經改良序列為SEQ ID NO:43中所闡述之核酸序列。如實例9中所示,含有SEQ ID NO:43之表現構築體相較於未經最佳化之野生型序列會呈現出增強之表現。
藉由將上述經最佳化之B44(SEQ ID NO:43)構築體中之密碼子變化應用於B09(SEQ ID NO:48)來改良N端Cys刪除型B09蛋白質之表
現。為了產生經最佳化之B09序列,首先將B44經最佳化之DNA序列(SEQ ID NO:43)與B09對偶基因之DNA序列(SEQ ID NO:48)比對。無論B44(SEQ ID NO:44)與B09(SEQ ID NO:49)之間的胺基酸是否一致,將B09對偶基因之整個未脂化之編碼序列(SEQ ID NO:48)最佳化,以反映出在B44經最佳化之對偶基因(SEQ ID NO:43)所觀察到之密碼子變化。改變B09對偶基因中對應於B09對偶基因與B44對偶基因之間的一致胺基酸之密碼子序列,以反映出B44經最佳化序列(SEQ ID NO:43)中所用之密碼子。不改變B09 DNA序列中B09(SEQ ID NO:49)與B44(SEQ ID NO:44)之間不同的胺基酸之密碼子序列。
另外,未脂化之B44胺基酸序列(SEQ ID NO:44)在其N端處含有兩個連續之絲胺酸-甘胺酸重複序列(S-G-G-G-G)(SEQ ID NO:56)(亦參見SEQ ID NO:44之胺基酸2至6),而B09對偶基因在N端僅含有一個絲胺酸-甘胺酸重複序列(參見SEQ ID NO:49之胺基酸2至6及胺基酸7至11)。B44之N端上之兩個絲胺酸-甘胺酸重複序列(SEQ ID NO:44之胺基酸2至6及胺基酸7至11)亦具有不同之密碼子使用(參見SEQ ID NO:43之核苷酸4至18及核苷酸19至33),且將經最佳化之B44絲胺酸-甘胺酸重複序列之不同組合(例如SEQ ID NO:43之核苷酸4至18或SEQ ID NO:43之核苷酸19至33,或其組合)應用於B09 DNA序列(SEQ ID NO:48,例如應用於SEQ ID NO:48之核苷酸4至18)以研究對重組蛋白表現之影響。
建構經最佳化之B09之三種不同型式:SEQ ID NO:45含有經最佳化之B44中之兩個絲胺酸-甘胺酸重複序列(GS1及GS2)(SEQ ID NO:43之核酸4至33),SEQ ID NO:46含有GS1(SEQ ID NO:43之核酸4至18),且SEQ ID NO:47含有GS2(SEQ ID NO:43之核酸19至33)。使用此項技術中之標準化學方法以化學方式合成上述所有經密碼子最佳化之序列的DNA。如實例8及9中所述,將所得DNA選殖至適當質體表
現載體中且測試在大腸桿菌宿主細胞中之表現。
用以下質體將大腸桿菌K-12菌株細胞(野生型W3110之衍生物(CGSC4474),recA、fhuA及araA刪除)轉型:質體pEB063,其包括SEQ ID NO:45;質體pEB064,其包括SEQ ID NO:46;質體pEB065,其包括SEQ ID NO:47;或質體pLA134,其包括SEQ ID NO:48。對K-12菌株之較佳修飾有助於達成醱酵目的,但並非為蛋白質表現所需。
將細胞接種於葡萄糖-鹽合成培養基中。在37℃下培育8小時之後,施加線性葡萄糖進料且再繼續培育3小時。將異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至培養物中達0.1mM之最終濃度,繼而在37℃下培育12小時。藉由以16,000×g離心10分鐘收集細胞且藉由添加來自Lienco Technologies(St.Louis,MO)之Easy-LyseTM細胞溶解套組及上樣緩衝液來使其溶解。藉由對SDS-PAGE凝膠進行庫馬斯染色(Coomassie staining)及/或西方墨點分析(Western blot analysis)(藉由掃描密度計進行定量)來分析澄清之溶胞物中B09之表現。掃描密度測定術之結果於下表7中:
用包括SEQ ID NO:51之質體pLN056將大腸桿菌B菌株細胞
(BLR(DE3),Novagen)轉型。用包括SEQ ID NO:43之質體pDK087將大腸桿菌K-12菌株細胞(野生型W3110之衍生物)轉型。將細胞接種於葡萄糖-鹽合成培養基中。在37℃下培育8小時之後,施加線性葡萄糖進料且再繼續培育3小時。將異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至培養物中達0.1mM之最終濃度,繼而在37℃下培育12小時。藉由以16,000×g離心10分鐘收集細胞且藉由添加來自Lienco Technologies(St.Louis,MO)之Easy-LyseTM細胞溶解套組及上樣緩衝液來使其溶解。藉由對SDS-PAGE凝膠進行庫馬斯染色及/或西方墨點分析(藉由掃描密度計進行定量)來分析上清液中B09之表現。掃描密度測定術之結果於下表8中:
本實例表明在表現於例如大腸桿菌中時,未脂化之ORF2086蛋白質之N端Cys殘基可經丙酮酸化。
使用逆相高效液相層析(RP-HPLC)監測在產生變異體A05(SEQ ID NO:13)及B44(SEQ ID NO:21)期間的異源蛋白質積聚。此分離與四極飛行時間質譜儀(QTOF-MS)接合以提供監測產物相關變異體形成的手段。
在大腸桿菌B及/或K-12宿主細胞中表現之後,對由此等醱酵獲得之產物進行純化程序,期間觀測到產物修飾。對質譜進行解卷積(deconvolution)將變異體表徵為相較於分別具有27640Da及27572Da之A05及B44原生產物,展現+70Da之質量位移。
公開之文獻指示+70Da質量位移先前已在蛋白質中觀測到且已歸因於胺基端殘基之丙酮酸化。
使用質譜份化資料(MS/MS)確定丙酮酸酯基之存在及位置。資料指示修飾處於胺基端半胱胺酸殘基處,亦即根據A05及B44之位置1之胺基酸處。對於A05,相較於A05多肽之總數(SEQ ID NO:13),丙酮酸化之多肽的百分比為約30%。對於B44,相較於B44多肽之總數(SEQ ID NO:21),丙酮酸化之多肽的百分比為約25%。
在純化不含胺基端半胱胺酸之A05(SEQ ID NO:13,其中位置1之N端Cys係經刪除;或SEQ ID NO:55)及B44變異體(SEQ ID NO:21,其中位置1之N端Cys係經刪除;或SEQ ID NO:44)時,不存在可偵測之丙酮酸化(+70Da)。
用每劑以250mcg AlPO4調配之B09變異體(由SEQ ID NO:48編碼之SEQ ID NO:49)或B44變異體(由SEQ ID NO:43編碼之SEQ ID NO:44)或A05、B09及B44(分別為SEQ ID NO:55、由SEQ ID NO:48編碼之SEQ ID NO:49,及由SEQ ID NO:43編碼之SEQ ID NO:44)對5至10組恆河猴進行免疫接種。在第0週、第4週及第8週經由肌肉內途徑用如表9及10中所列之10mcg各未脂化之fHBP單獨或以組合形式對猴進行疫苗接種。在SBA中針對具有子族A或子族B fHBP變異體之MnB菌株分析第0週及第12週血清樣品。將反應者記錄為力價4×升高之動物。所測試之B44變異體為經最佳化之構築體(SEQ ID NO:43)且經最佳化之構築體(表9)B44疫苗單獨或與B09組合維持在先前研究(上表)中所觀測到之廣泛反應率。B09疫苗單獨(表10)亦可產生廣泛交叉反應性免疫反應(表10)。
在第0週、第4週及第8週以含250mcg AlPO4之調配物形式用如疫苗行中所列之10mcg各未脂化之fHBP單獨或以組合形式對恆河猴(n=10)進行肌肉內免疫接種。在SBA中針對表中所列之MnB菌株分析第0週及第10週血清樣品。將反應者記錄為力價4×升高之動物。
表9例如指示相較於單獨包括B44之組合物的交叉作用譜,包括未丙酮酸化且未脂化之B44、B09及A05之組合的組合物針對測試變異體展示出較高交叉作用譜。鑒於本申請案中所展示之結果(尤其包括表6及表9),包括單獨或呈組合形式之B44、B09及A05的組合物為本發明之較佳實施例。特定而言,揭示包括B44及B09之組合物。該組合物較佳進一步包括子族A多肽,尤其諸如A05。
在第0週、第4週及第8週以含250mcg AlPO4之調配物形式用如疫苗行中所列之10mcg各未脂化之fHBP單獨或以組合形式對恆河猴(n=5)進行肌肉內免疫接種。在SBA中針對表中所列之MnB菌株分析第0週及第10週血清樣品。將反應者記錄為力價4×升高之動物。
藉由全細胞ELISA對獲自Charles River Canada之20隻雌性紐西蘭
白兔(New Zealand white rabbit)(2.5kg至3.5kg)進行預篩選且基於針對呈現fHBP變異體B02(SEQ ID NO:16)及B44(SEQ ID NO:21)之測試菌株的背景力價較低而將10隻動物選用於此研究(表11)。在第0週、第4週及第9週用以50μg ISCOMATRIX調配之100μg各蛋白質以每次0.5ml劑量對各組三隻動物進行肌肉內免疫接種(表12)。用未脂化之B44(SEQ ID NO:44)對組1進行疫苗接種。包括對照組,用以AlPO4(250mcg)調配之脂化之B01對對照組進行疫苗接種。在第0週、第4週、第9週及第10週對兔進行取血。製備自第10週之個別血清且藉由血清殺細菌分析針對來自fHBP B子族之多種血清群B腦膜炎雙球菌菌株進行分析。
免疫接種時程:第0週、第4週、第9週;取血時程:第0週、第4週、第9週、第10週
血清殺細菌分析(SBA):對個別血清樣品進行針對多種血清群B腦膜炎雙球菌菌株之基於微群落之血清殺細菌分析(SBA)(表13)。來自捐獻者之人類血清有資格作為用於分析中所測試之菌株的補體來源。內插補體介導之抗體依賴性殺細菌力價且表示為在分析中殺死
50%之腦膜炎雙球菌細胞之測試血清之稀釋度的倒數。分析之偵測極限為4之SBA力價。SBA力價<4係指定為2之數值。計算第10週血清中之SBA力價相較於免疫接種前取血樣品(pre-bleed)中之力價升高至4倍且進行比較。
如在SBA中所量測之血清殺細菌性抗體活性為針對腦膜炎雙球菌疾病之保護作用的免疫替代物。用未脂化之rfHBP進行免疫接種以引發兔之殺細菌性抗體的能力係藉由SBA來測定。SBA藉由模擬天然存在之補體介導之細菌溶解來量測血清樣品中抗體之含量。藉由SBA針對具有B44 fHBP或B02 fHBP之菌株分析自第10週收集之兔血清樣品。如表13中所示,在第三次免疫接種之後一週(第10週),所有血清樣品針對兩種測試菌株皆顯示出殺細菌性活性。(表13)。在紐西蘭兔中未脂化之B44(SEQ ID NO:44)針對此等菌株之免疫原性大於未脂化之B01。用iscomatrix佐劑調配之未脂化之B44(SEQ ID NO:44)針對此等菌株所提供之力價類似於以磷酸鋁調配之脂化之B01。兔免疫接種前取血樣品血清一般未展示先前存在針對所測試菌株之殺細菌性活性。
用如表14中所述之未脂化之fHBP變異體對各組5隻兔進行免疫接
種。在第0週、第4週及第9週投與疫苗。藉由SBA針對具有同源及異源fHBP序列之菌株分析自第0週及第10週收集之兔血清樣品。表14展示第三次免疫接種後反應者之百分比。在第三次免疫接種之後一週(第10週),所有血清樣品針對同源菌株以及來自相同fHBP子族之其他測試菌株均顯示出殺細菌性活性。兔免疫接種前取血樣品血清一般未展示先前存在針對所測試菌株之殺細菌性活性。
>未脂化之A05(SEQ ID NO:55)
>pEB042(SEQ ID NO:65)
>未脂化之A12(SEQ ID NO:66)
>pEB043(SEQ ID NO:67)
>未脂化之A22(SEQ ID NO:68)
>nEB058(SEQ ID NO:69)
>A62(SEQ ID NO:70)。GenBank:ACI46789.1
>未脂化之A62(SEQ ID NO:71)
>pLA164(SEQ ID NO:72)
>pDK086(SEQ ID NO:73)
>A29(SEQ ID NO:74)
>未脂化之B22(SEQ ID NO:75)
>未脂化之A05(SEQ ID NO:76)(pPW102)
>未脂化之A05(SEQ ID NO:77)
>共同序列(SEQ ID NO:78)
>共同序列(SEQ ID NO:79)
將未脂化之A05 fHBP蛋白之編碼序列(SEQ ID NO:55)與表現最佳化之B44序列(SEQ ID NO:43)進行比對。在兩者之間的胺基酸一致處,使用B44(SEQ ID NO:43)中之密碼子在A05基因中進行取代。在Celtek Genes處重新合成經最佳化之序列,在N端及C端分別添加限制性核酸內切酶位點NdeI及BamHI。將所得基因(SEQ ID NO:65)在彼等
位點處次選殖至pET30a中。
由pEB043(SEQ ID NO:67)表現重組未脂化之A12 fHBP(SEQ ID NO:66)。藉由Blue Heron Technologies對A12對偶基因進行表現最佳化。藉由與用於A05(pEB042)之方法相同的方法將此基因最佳化。另外,用經Blue Heron最佳化之B44 SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:44之胺基酸殘基2至11)胺基端密碼子置換原生A12 SSGGGG(SEQ ID NO:66之胺基酸殘基1至6)密碼子。在Celtek Genes處重新合成經最佳化之序列,在N端及C端分別添加限制性核酸內切酶位點NdeI及BamHI。將所得基因(SEQ ID NO:67)在彼等位點處次選殖至pET30a中。
由pEB058(SEQ ID NO:69)表現重組未脂化之A22 fHBP(SEQ ID NO:68)。藉由與用於pEB042之方法相同的方法將此基因最佳化。另外,用經Blue Heron最佳化之B44 SGGGG(SEQ ID NO:44之胺基酸殘基2至6)胺基端密碼子置換原生A22 SSGGGG(SEQ ID NO:68之胺基酸殘基1至6)密碼子。在Celtek Genes處重新合成經最佳化之序列,在N端及C端分別添加限制性核酸內切酶位點NdeI及BamHI。將所得基因(SEQ ID NO:69)在彼等位點處次選殖至pET30a中。
由pLA 164(SEQ ID NO:72)表現重組A62 fHBP(SEQ ID NO:71)。
用在N端及C端分別含有限制性核酸內切酶位點NdeI及BamHI之引子對來自菌株0167/03之A62_002對偶基因進行PCR擴增。將所得基因(SEQ ID NO:72)在彼等位點處次選殖至pET30a中。
使用經pLA164(SEQ ID NO:72)轉型之BLR(DE3)大腸桿菌B recA表現A62(SEQ ID NO:71)。將質體pEB042(SEQ ID NO:65)轉型至大腸桿菌宿主BD643(W3110:DE3△recA△fhuA△araA)中,得到用於表現A05(SEQ ID NO:55)之菌株BD660。由菌株BD592表現A22(SEQ ID NO:68),該菌株BD592由位於宿主BD559(其亦為W3110:DE3△recA
△fhuA△araA)中之質體pEB058(SEQ ID NO:69)組成。最後,將質體pEB043(SEQ ID NO:67)轉型至宿主BD483(W3110:DE3△recA)中,得到用於表現A12(SEQ ID NO:66)之菌株BD540。
在基於葡萄糖之基本培養基中使表現菌株醱酵。將隔夜菌元培養物接種於10公升醱酵器中,該醱酵器在37℃、1 vvm通氣下操作,其中級聯dO控制在20%。當分批葡萄糖自培養基耗盡(在約OD600=15下)時,開始以3.8公克/公升/小時進行限制性線性葡萄糖進料。繼續進料直至用0.1mM IPTG進行誘導為止且貫穿整個後繼蛋白質表現時段。為了使A05(SEQ ID NO:55)表現,在OD600=25下誘導菌株BD660且在誘導後7小時(HPI)期間繼續醱酵。藉由在OD600=40下誘導且醱酵24 HPI使得菌株BD592及BD540分別表現A22(SEQ ID NO:68)及A12(SEQ ID NO:66)。在醱酵結束時,藉由離心收集細胞糊狀物。
rP2086蛋白在大腸桿菌菌株之細胞質中以可溶性蛋白質形式產生。通常藉由在低滲緩衝液(10mM Hepes-NaOH,pH 7.4,含有蛋白酶抑制劑)中使表現rP2086之子族A之特定變異體之冷凍細胞融化且在微流化床中在約20,000psi下破壞細胞來獲得可溶性細胞質提取物。添加RNase及DNAse以消化核酸且在低速離心以移除任何未破裂之細胞且接著高速離心(100,000×g)以移除膜、細胞壁及其他較大之次細胞組分後收集呈上清液形式之細胞質提取物。藉由以25%飽和硫酸銨,接著以50%飽和硫酸銨進行連續調節且在各次調節後藉由低速離心移除沈澱物質來進一步澄清細胞質提取物。接著藉由使含10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)、1mM Na2EDTA之緩衝液中之50%飽和硫酸銨中之rP2086吸附於疏水性相互作用管柱(購自GE Healthcare之苯基瓊脂糖),接著藉由用含10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)、1mM Na2EDTA之
緩衝液使硫酸銨濃度線性降低至0%來溶離rP2086以移除低分子量離子性細胞組分。接著藉由用含10mM Tris-HCl(pH 8.6)、1mM Na2EDTA之緩衝液調節含有rP2086之溶離份並使彙集之溶離份通過用相同緩衝液平衡之陰離子交換管柱(購自EMD之TMAE)來移除大部分帶負電荷之蛋白質。接著藉由在陶瓷羥基磷灰石(獲自BioRad)上藉由使含有rP2086之緩衝液交換成含有1mM磷酸鈉之10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)以使蛋白質吸附於陶瓷羥基磷灰石,接著在pH 7.4下用線性梯度之磷酸鈉溶離至250mM來進行層析以進一步純化rP2086。
上列之單元操作常足以產生純化之rP2086子族A成員。然而,由於表現量可能變化超過10倍,所以當所表現之rP2086處於範圍下限時或當需要超純rP2086(以高濃度用於NMR結構測定)時,添加以下另外之單元操作:層析聚焦,繼而陶瓷羥基磷灰石層析。使來自早先羥基磷灰石步驟之含有rP2086蛋白之緩衝液交換成25mM Tris-乙酸鹽(pH 8.3)且使蛋白質吸附於用相同緩衝液平衡之層析聚焦PBE94管柱(獲自GE Healthcare)且接著用特種多緩衝液(polybuffer)94-乙酸鹽(pH 6)之緩衝液溶離。將rP2086蛋白質在其約pI下溶離且彙集含有蛋白質之溶離份。接著使含有rP2086之溶離份的緩衝液交換成含有1mM磷酸鈉之10mM Hepes-NaOH(pH 7.4)且如上吸附並溶離。藉由SDS-PAGE分析測定藉由此方法製備之rP2086子族A成員通常>95%均質且最常>99%均質。
在醱酵結束時,藉由連續離心回收細胞漿料且將其以約1/4之原始醱酵體積再懸浮於20mM Tris、5mM EDTA(pH 6.0)中。藉由高壓均質化(2次通過,4000-9000psi)使細胞懸浮液溶解。向勻漿中添加DADMAC達0.5%之最終濃度。在15℃至25℃下攪拌溶液60分鐘,期間形成重沈澱物。藉由連續離心使溶液澄清。使用兩個層析步驟,繼
而最終緩衝液交換來純化蛋白質(A05、A12及A22)。將離心濾液之pH值調節至5.5且加載於GigaCap-S管柱(CEX)上。使蛋白質結合於樹脂且隨後使用氯化鈉梯度溶離。向來自CEX管柱之彙集物中添加檸檬酸鈉達1.5M之最終濃度,且將溶液加載於苯基-650M管柱(HIC)上。使蛋白質結合於樹脂且隨後使用檸檬酸鈉階段梯度溶離。藉由透濾使含有純化之蛋白質的HIC彙集物交換成最終藥物物質緩衝液。使用5kD再生乙酸纖維素超濾卡匣。蛋白質濃度之目標為1.5至2.0mg/mL。經0.2微米過濾器過濾經透濾之保留物,之後填充於儲存瓶中。將藥物物質儲存於-70℃下。
藉由血清殺細菌分析(SBA)針對表現具有與疫苗中所含之序列同源或異源之序列的fHBP之野生型或經工程改造腦膜炎雙球菌血清群B菌株研究功能性抗體力價。使用SBA用人類補體測定用rP2086疫苗進行免疫接種之兔之血清殺細菌性抗體。將兔免疫血清熱不活化以移除固有補體活性且隨後在96孔微量滴定盤中於含Ca2+及Mg2+之杜氏PBS(D-PBS)中兩倍連續稀釋以測試針對腦膜炎雙球菌菌株之血清殺細菌性活性。對於用經工程改造之菌株進行的組合研究,在上文所述之連續稀釋之前將相關血清以1:1比率混合,因此各組分之有效濃度為在個別地測試各者時的一半。使分析中使用之細菌生長在補充有凱洛格氏補充劑(GCK)之GC培養基中且藉由650nm下之光密度來監測。
在0.50-0.55之最終OD650下收集細菌以用於分析中,在D-PBS中稀釋且將1000-3000 CFU添加至分析混合物中。使用殺細菌性活性不可偵測之人類血清作為外源性補體來源。測試補體來源針對各個別測試菌株之適合性。對於同基因菌株,鑑別單一人類血清且使其適於針對所有同基因菌株進行SBA。只有當在未添加免疫血清下對照組中存活之細菌數>75%時才使用補體來源。在37℃、5%CO2下且在振盪器上以
700rpm攪動下培育30分鐘後,將D-PBS添加至反應混合物中且將等分試樣轉移至預先填充有50%GCK培養基(用於野生型菌株)及100%GCK培養基(用於經工程改造之菌株)的微量過濾盤中。過濾微量過濾盤,在37℃、5%CO2下培育隔夜且對微群落進行染色且定量。血清殺細菌力價係定義為相較於在無免疫血清下對照孔中之CFU,使得CFU減少50%的血清稀釋度之內插倒數。若相較於相應免疫前血清,抗rP2086免疫血清使SBA力價升高至4倍或大於4倍,則確定對由抗rP2086免疫血清所產生之殺死作用具敏感性。在起始稀釋度下針對分析菌株呈陰性之血清的力價係指定為分析之偵測極限的一半。
在兩個研究中使用獲自Charles River(Canada)之白色紐西蘭雌性兔(2.5kg至3.5kg)。對於第一個研究,用30mcg或3mcg經脂化之A05或未脂化之A05 fHBP調配物中之每一者對每組3隻兔進行免疫接種。
對於第二個研究,在右後腿處用含500μg/mL AlPO4佐劑之20μg/mL rP2086A變異體經肌肉內對每組5隻兔進行免疫接種(0.5毫升/劑/兩個部位)。在第0週、第4週及第9週對動物進行疫苗接種,在第0週及第6週取血,且在第10週放血。在第0週、第6週及第10週測定LP2086特異性殺細菌抗體力價。
此等研究之目的在於模擬對於未經免疫學處理之群體(諸如嬰兒)所觀測到的反應降低。首先,吾人比較了含有脂化之A05(SEQ ID NO:13)或未脂化之A05(SEQ ID NO:55)之低劑量及高劑量(每劑每種抗原30mcg相對於3mcg)疫苗(表15A及15B)。使用低劑量以便能辨別各疫苗之間在反應率方面的差異。使用兩個菌株組進行SBA分析。第一組由引起侵襲性疾病之野生型菌株組成。第二組為如下經遺傳工程改造之菌株組,該菌株組具有相同之菌株背景且不同之處僅在於所表現之fHBP序列:表現fHBP之B24變異體之腦膜炎雙球菌菌株
PMB3556經工程改造以使其內源性fhbp基因經編碼其他fHBP變異體之基因置換。構築體經設計以使僅「變換」編碼ORF之區域而周圍遺傳背景保持完整。因此,使用此菌株組進行之SBA分析允許使用一種人類補體來源評估針對以相同量且在相同遺傳背景下表現之不同子族A fHBP蛋白質之反應性。所有菌株之fHBP表現量均高於由Jiang等人(2010)所鑑別之臨限值。如表15A及15B中所示,高劑量及低劑量之含有脂化之A05的疫苗引發針對全部遺傳學上不同之子族A變異體之廣泛保護作用,而在兩種劑量下對於含有未脂化之A05變異體之疫苗觀測到降低之反應。因此,此並行比較揭露,雖然未脂化之A05變異體針對全部子族A表現菌株具交叉保護作用,但其免疫原性不如脂化之變異體,後者很可能形成原生組態(表15A及15B)。
對於後續研究,將劑量升高至每種未脂化之子族A變異體10mcg以評定其各自針對子族A菌株提供廣泛作用譜的潛能。SBA分析揭露,在此升高之劑量下,來自用未脂化之A05(SEQ ID NO:55)、A62(SEQ ID NO:71)、A12(SEQ ID NO:66)及A22(SEQ ID NO:68)fHBP變異體進行免疫接種之兔的血清針對表現同源及異源子族A變異體之野生型菌株均誘導力價,指示全部在此低劑量下於子族A內具交叉保護性。因此,吾人觀測到,N2C1疫苗(A05)可產生可殺死N1C2(A22)及N2C2(A12)變異菌株之抗體且同樣,來自此等其他群之疫苗可殺死具有相對變異體之菌株。在此等條件下,觀測到A05及A62變異體針對各菌株誘導最高之SBA反應者比率(表16)。因此,此展示針對此等變異體具保護作用。
表15A及15B.在用含有脂化或未脂化之A05之30mcg或3mcg疫苗對兔(n=3)進行免疫接種之前及之後(PD3=第10週)獲得之血清針對腦膜炎雙球菌群B菌株之幾何平均SBA力價。表15A及15B之上部表格(標記為「野生型菌株」)概述針對臨床分離株之活性。表15A及15B之下部表格(標記為「同基因菌株」)概述針對一組同基因菌株之活性,該等同基因菌株係自親本腦膜炎雙球菌菌株(PMB3556)工程改造,以使得其內源性fHBP之整個ORF經A05(SEQ ID NO:13)、A22(SEQ ID
NO:15)、A29(SEQ ID NO:74)或A 12(SEQ ID NO:14)變異體置換。
表16.獲自用10mcg未脂化之A子族fHBP變異體進行免疫接種之兔的第10週血清針對表現A05、A62、A12或A22 fHBP變異體之菌株的SBA GMT水準較背景升高至至少4倍的反應者之百分比
使用上文所述之同基因菌株組在10mcg之增加之劑量下對於所有變異體亦皆觀測到交叉保護作用,其中用A62變異體(SEQ ID NO:71)進行免疫接種之兔的血清展示出最大之交叉反應性,其次是A05抗血清(表17)。另外,用A62變異體(SEQ ID NO:71)進行免疫接種之兔的血清對親本PMB3556菌株及B09變換菌株展示出反應性(表18),指示交叉反應性活性擴大至子族B蛋白質。A62看似由子族A(A22)域及子族B(B09)域構成(圖9)。
表17.同基因「變換」菌株係自親本腦膜炎雙球菌菌株(PMB3556)工程改造,以使得其內源性fHBP(B24變異體)之整個ORF經A05(SEQ ID NO:13)、A22(SEQ ID NO:15)、A29(SEQ ID NO:74)或A12(SEQ ID NO:14)變異體置換。KA3011為陰性對照菌株(亦即fhbp基因經刪除之親本PMB3556)。血清(在用10mcg未脂化之A子族fHBP變異體之三次給藥對兔進行免疫接種之前或之後第10週獲得)針對此等菌株之幾何平均SBA力價(n=5)展示於上部表格中。反應較背景升高至至少4倍之反應者的百分比展示於下部表格中。
表18.血清(在用10mcg未脂化之子族A蛋白質(A62(SEQ ID NO:71);A05(SEQ ID NO:55);A12(SEQ ID NO:66);A22(SEQ ID NO:68))對兔(n=5)進行免疫接種之前或之後第10週獲得)針對兩種子族B同基因菌株之幾何平均SBA力價。
評定血清之組合以評估對作用譜寬度的影響。測試配對之疫苗接種前血清與疫苗接種後血清以確定不存在因組合血清而誘導之非特異性殺死作用。針對呈現子族A內之多樣性的4種同基因菌株計算個別血清及血清組合之GM升高至之倍數。對於所測試之一些組合偵測到升高至之倍數增加,提供證據表明作用譜之寬度可能因納入較多子族A變異體而增加(表19)。最佳組合看似為A05(SEQ ID NO:55)與A62(SEQ ID NO:71)或A62(SEQ ID NO:71)與A12(SEQ ID NO:66)(表20)。
表19.針對如表17中所示之同基因菌株組再測試來自各疫苗組之最高反應者之血清的SBA力價。在1:1混合物中測試血清以確定協同活性之程度。
表20.以組合形式測試之血清的升高至之倍數相較於單獨測試之各者的增加(根據表19計算)。
上文在實例18至19中所呈現之結果展示未脂化之子族A蛋白質具免疫原性且可針對帶有同源或異源變異體之腦膜炎雙球菌菌株所致之感染提供保護作用。此處所呈現之資料說明所選之未脂化之子族A變異體保留免疫原性且針對異源菌株提供交叉保護作用,但此等反應低於脂化之變異體。吾人亦證明與子族B具有序列相似性(參見例如圖9)之A62(SEQ ID NO:71)rP2086抗原可針對各子族進行保護,這是因為A62(SEQ ID NO:71)疫苗可殺死表現子族B變異體B09或B24之菌株。
上文所呈現之資料展示未脂化之子族A變異體不僅能夠提供對於脂化之fHBP之組合所觀測到之類型的協同作用,其亦可提供針對B子族變異體之作用譜。
在獲自Charles River,Canada之2.5kg至3.5kg範圍內之紐西蘭白兔中進行研究(表21)。在進入研究前,針對菌株A05及B02使用全細胞ELISA針對存在抗體對55隻兔進行預篩選。在篩選後,在第0週、第4週及第9週,在後腿處對抗體力價相對低之兔(特異性IgG力價<350)進
行肌肉內疫苗接種(每個部位0.5mL)(每劑1.0mL,參見表22)。每組有三隻兔。在第0週、第4週、第6週、第9週對兔進行取血且在第10週放血。製備血清樣品且藉由SBA分析第0週及第10週血清樣品。根據表23-26製備腦膜炎雙球菌結合物疫苗(MENVEO®,腦膜炎雙球菌(群A、C、Y及W-135)寡醣白喉CRM197結合物疫苗,Novartis)、二價rLP2086及四價未脂化之變異體以及其組合。
研究之設計展示於表22中。
在與MENVEO®組合後在2℃至8℃下監測未脂化之四價蛋白質(B22、B09、A05及B44)之穩定性6小時。
對個別血清樣品進行針對多種血清群B、C及Y腦膜炎雙球菌菌株(表27)之基於微群落之血清殺細菌分析(SBA)。來自捐獻者之人類血清有資格作為用於分析中所測試之菌株的補體來源。內插補體介導之抗體依賴性殺細菌力價且表示為在分析中殺死50%之腦膜炎雙球菌細胞之測試血清之稀釋度的倒數。分析之偵測極限為4之SBA力價。
SBA力價<4係指定為2之數值。計算第10週血清中之SBA力價相較於免疫接種前取血樣品中之力價升高至4倍且進行比較。
血清殺細菌性抗體為針對腦膜炎雙球菌疾病之保護作用的免疫替代物。藉由SBA測定用脂化、未脂化之rfHBP、四價結合之疫苗單獨或以組合形式進行免疫接種是否會引發兔之殺細菌性抗體。SBA藉由模擬天然存在之補體介導之細菌溶解來量測血清樣品中抗體之含量。在人類中,免疫接種前之SBA力價:免疫接種後之SBA力價為1:4則視作具保護性;力價升高至四倍亦視為免疫學相關免疫反應。藉由SBA針對多種腦膜炎雙球菌血清群之菌株分析自第0週及第10週收集之兔血清樣品。如表28(較高劑量)及29(較低劑量)中所示,在第三次免疫接種後一週(第10週),四價結合物疫苗僅針對所測試之MnC及MnY菌株引發SBA反應。所有其他血清樣品針對同源菌株以及來自與疫苗調配物相同之fHBP子族的其他測試菌株均顯示出殺細菌性活性。應注意,單獨用各自30mcg劑量之脂化之A05/B01(分別為SEQ ID NO:13及58)進行免疫接種針對同源菌株以及針對來自兩個fHBP子族之其他測試菌株引發最高殺細菌性抗體(表28)。同樣,單獨用未脂化之A05/B09/B22/B44(分別為SEQ ID NO:55、49、75及44)進行免疫
接種亦針對多種腦膜炎雙球菌血清群之菌株引發殺細菌性抗體,雖然SBA力價為脂化之二價疫苗的1/3至1/15(表30)。脂化之fHBP、高劑量之未脂化之fHBP及所有組合針對各種血清群之所有菌株皆達成100%反應者比率(SBA力價升高至4倍)。
兔免疫接種前取血樣品血清未展示先前存在針對測試菌株之殺細菌性活性。在第0週、第4週及第8週用0.5mL疫苗對NZW兔(n=3)進行肌肉內疫苗接種;資料第10週
表29:使用來自以較低劑量之fHBP與結合物疫苗之組合進行免疫接種之兔的血清針對腦膜炎雙球菌血清群B、C及Y菌株之SBA力價升高至之倍數的增加
兔免疫接種前取血樣品血清未展示先前存在針對測試菌株之殺細菌性活性。在第0週、第4週及第8週用0.5mL疫苗對NZW兔(n=3)進行肌肉內疫苗接種;資料第10週
在第0週、第4週及第8週用0.5mL疫苗對NZQ兔(n=3)進行肌肉內疫苗接種;第10週資料
每劑各30mcg之脂化之fHBP針對所測試之所有腦膜炎雙球菌B、C及Y菌株引發之SBA力價為3至15倍。每劑各30mcg之未脂化之fHBP針對所測試之所有腦膜炎雙球菌B、C及Y菌株引發之SBA力價為4至23倍(表28至29)。
相較於較低劑量,較高劑量之結合物疫苗、fHBP或其組合使得SBA反應增加(表28至30)。1倍人類劑量之結合物疫苗針對腦膜炎雙球菌C及Y菌株引發之SBA力價為十分之一劑量之結合物疫苗的2至8倍。每劑各30mcg之脂化之fHBP針對所測試之所有菌株引發之SBA力價為每劑各3mcg之脂化之fHBP的2至4倍。每劑各30mcg之未脂化之fHBP針對所有腦膜炎雙球菌血清群B、C及Y菌株引發之SBA力價為每劑各3mcg未脂化之fHBP的4至15倍。
存在以下趨勢:相較於單獨使用任一組分,當使用結合物疫苗與fHBP之組合時,針對腦膜炎雙球菌血清群C及Y菌株之SBA反應較高,尤其在添加較低劑量之脂化或未脂化之fHBP的情況下(表29)。在本研究中,使用來自用呈含AlPO4之調配物形式的重組脂化或未脂化之fHBP及結合物疫苗單獨或以組合形式進行免疫接種之紐西蘭白兔的血清針對多種腦膜炎雙球菌血清群之菌株評估功能性活性。接受結合物疫苗之兔僅針對腦膜炎雙球菌血清群C及Y菌株引發SBA反應,但不針對血清群B菌株引發SBA反應。呈含AlPO4之調配物形式的脂化或未脂化之fHBP引發針對所測試之所有腦膜炎雙球菌血清群之菌株具殺細菌性的血清抗體。
接受三種劑量之呈含AlPO4之調配物形式的脂化或未脂化之fHBP的紐西蘭白兔引發針對所測試之腦膜炎雙球菌血清群B、C及Y菌株具殺細菌性的血清抗體。除較低劑量之未脂化疫苗組之外,針對所測試之所有菌株皆達成100%之反應者比率(SBA力價升高至4倍)。
脂化之fHBP引發之殺細菌性抗體力價大於未脂化之形式。在單獨或呈組合形式之脂化或未脂化之fHBP及結合物疫苗下觀測到明顯之劑量反應。
存在以下趨勢:結合物疫苗與fHBP之間尤其在添加較低劑量之蛋白質時針對腦膜炎雙球菌血清群C及Y菌株有協同性SBA反應。
在獲自Charles River,Canada之2.5kg至3.5kg範圍內之紐西蘭白兔中進行研究(表31)。在第0週、第4週及第9週在後腿處以每個部位0.5mL對兔進行肌肉內疫苗接種(每劑1.0mL,參見表32)。所測試之各抗原的序列標識符列於表33中。每組有10隻兔。在第0週、第6週對兔進行取血且在第10週放血。製備血清樣品且在SBA中針對一組腦膜炎雙球菌分離株分析第0週及第10週血清樣品。
a根據確立之實驗動物照護及使用委員會準則飼養兔
a對兔進行肌肉內疫苗接種(第0週、第4週及第9週)且取血(第0週、第6週及第10週)以製備用於SBA分析之血清樣品。
表34概述相較於對脂化抗原之rLP2086-A05與rLP2086-B01對的免疫反應兔對未脂化之fHBP蛋白質之混合物的免疫反應。兔免疫接種前取血樣品血清一般未展示先前存在針對所測試菌株之殺細菌性活性。免疫反應呈現為各處理組中在第三次免疫接種後對各別fHBP抗原組合有反應且SBA力價增加至4倍的動物之百分比。使用表現與疫苗免疫原一致之fHBP變異體(A05、A12)的目標腦膜炎雙球菌菌株或表現異源fHBP變異體(A22、B16、B24)的菌株進行SBA分析。在所測試之子族A變異體中A22 fHBP變異體之比較胺基酸序列一致性偏差至多15%。同樣,在包括作為抗原之子族B變異體中B16及B24 fHBP變
異體之比較胺基酸序列一致性偏差至多12%。
a每個處理組10隻動物;所有處理劑皆用AlPO4佐劑(250mcg/劑)調配
在彼等用10mcg之各測試rP2086變異體進行免疫接種之兔組中,來自用組合A05+A62+B09+B44處理之動物的血清樣品具有最高之殺細菌性反應率。僅用各自5mcg之四種未脂化之fHBP變異體之相同混合物處理之動物的SBA反應略微降低。以5mcg進行給藥之其他4價fHBP抗原組與未脂化之A05+A62+B09+B44之組合的表現一樣好。在所測試之4價組合中,來自包括各自5mcg未脂化之fHBP變異體A12+A62+B09+B44的處理組之血清樣品針對所選分析菌株的SBA反應率最佳。對五價未脂化組合A05+A12+A62+B09+B44之反應率略優於對所測試之任何4價組合的反應。
<110> 安美納商麗輝莎瑞 大S藥 廠安德森 凱蘇珊薩琳 K U何 塞詹斯森 馬克 E 魯賓 賈斯汀 K 摩蘭
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<212> DNA
<213> 腦膜炎雙球菌(B群)
<400> 1
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
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<400> 2
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<211> 765
<212> DNA
<213> 腦膜炎雙球菌(B群)
<400> 3
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<212> DNA
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<220>
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<223> 合成胺基酸序列
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<223> 合成核苷酸序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成胺基酸序列
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<223> 合成胺基酸序列
<400> 81
Claims (23)
- 一種免疫原性組合物,其包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體A62的經分離未脂化且未丙酮酸化之ORF2086多肽(SEQ ID NO:71),及至少一種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
- 如請求項1之免疫原性組合物,其中該組合物包含至少兩種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
- 如請求項1之免疫原性組合物,其中該組合物包含至少三種選自以下之結合物:a)腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物,b)腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物,c)腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及d)腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
- 如請求項1之免疫原性組合物,其中該組合物包含腦膜炎雙球菌血清群A之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群C之莢膜醣之結合物;腦膜炎雙球菌血清群W135之莢膜醣之結合物;及腦膜炎雙球菌血清群Y之莢膜醣之結合物。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含子族B多肽。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體A05之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:77)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體A12之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:66)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體A22之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:68)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B01之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:57)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B03之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:17,其中位置1之半胱胺酸係經刪除,或位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B09之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B15之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:59,其中位置1之半胱胺酸係經刪除,或位置1之半胱胺酸經不為Cys殘基之胺基酸取代)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B16之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:60,其中位置1之半胱胺酸係經刪除,或位置1之半胱胺酸經不 為Cys殘基之胺基酸取代)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B22之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:75)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B24之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含來自腦膜炎雙球菌血清群B變異體B44之未丙酮酸化且未脂化之多肽(SEQ ID NO:44)。
- 如請求項1之免疫原性組合物,進一步包含一多肽,該多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:75。
- 一種如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物的用途,其係用於製造用以誘導哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌之免疫反應的藥物。
- 一種如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物的用途,其係用於製造用以引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌血清群C之殺細菌性抗體的藥物。
- 如請求項19之用途,其中該組合物進一步包含一多肽,該多肽由SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列組成:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO: 21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。
- 一種如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物的用途,其係用於製造用以引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌血清群Y之殺細菌性抗體的藥物。
- 如請求項21之用途,其中該組合物進一步包含一多肽,該多肽由SEQ ID NO:71中所闡述之胺基酸序列或選自由以下組成之群的胺基酸序列組成:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21,其中位置1之半胱胺酸係經刪除。
- 一種如請求項1至17中任一項之免疫原性組合物的用途,其係用於製造用以引發哺乳動物對抗腦膜炎雙球菌之殺細菌性抗體的藥物。
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