ES2334185T3 - Proteina psaa lipidada recombinante, procedimientos de preparacion y uilizacion. - Google Patents

Abstract

Molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína distinta a PsaA y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura PsaA, o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico.

Description

Proteína PsaA lipidada recombinante, procedimientos de preparación y utilización.

Antecedentes de la invención

El microorganismo Streptococcus pneumoniae es una importante causa de otitis media, meningitis, bacteriemia y neumonía, y uno de los principales causantes de infecciones mortales en personas mayores o en personas con afecciones médicas subyacentes, tales como enfermedad pulmonar, enfermedad hepática, alcoholismo, célula falciforme, fisuras de líquido cerebroespinal, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), y pacientes sometidos a una terapia de inmunodepresión. También es una de las principales causas de morbilidad en niños de corta edad. Las infecciones neumocócicas provocan aproximadamente 40.000 muertes anuales en los Estados Unidos (CDC. Prevention of Pneumococcal Disease. MMWR 1997;46:1-25). Las infecciones neumocócicas más graves implican meningitis invasiva e infecciones de bacteriemia, con 3.000 y 50.000 casos anuales, respectivamente.

A pesar de la utilización de antibióticos y vacunas, la prevalencia de infecciones neumocócicas ha disminuido poco en los últimos 25 años; el índice de letalidad de la bacteriemia es del 15-20% en la población general, del 30-40% en los ancianos y del 36% en la población afroamericana de zonas urbanas deprimidas. Otras formas menos graves de enfermedad neumocócica son la neumonía, con 500.000 casos anuales en Estados Unidos, y la otitis media en niños, con unos 7.000.000 casos anuales en Estados Unidos causados por el S. pneumoniae. Las cepas de S. neumoniae resistentes a fármacos se están haciendo cada vez más frecuentes tanto en Estados Unidos como en el resto del mundo. En algunas zonas, la proporción de aislados neumocócicos resistentes a la penicilina llega a ser del 30%. El aumento de neumococos resistentes a antimicróbicos enfatiza aún más la necesidad de prevenir infecciones
neumocócicas.

El neumococo coloniza de forma asintomática las vías respiratorias altas de individuos normales. La enfermedad suele ser el resultado de la proliferación de organismos desde la nasofaringe a otros tejidos durante acontecimientos oportunistas. La incidencia de portadores humanos varía dependiendo de la edad y las circunstancias. Las tasas de portadores suelen ser más elevadas en niños que en adultos. Diversos estudios han demostrado que la proporción de niños portadores de neumococos es del 38-60% en niños de preescolar, del 29-35% en niños de primaria y del 9-25% en niños de los primeros años de secundaria. En los adultos, la proporción de portadores cae hasta el 6% para aquellos que no conviven con niños y oscila entre el 18 y el 29% en los que sí conviven con niños. No es de extrañar que la mayor proporción de portadores en niños que en adultos vaya en paralelo con la incidencia de enfermedad neumocócica en estos grupos de población.

Una objetivo atractivo en la vacunación estreptocócica es la reducción del número de portadores en las poblaciones vacunadas y, en consecuencia, disminuir la incidencia de la enfermedad neumocócica. Se especula sobre la posibilidad de que una disminución en las tasas de portadores neumocócicos mediante vacunación pueda reducir la incidencia de la enfermedad tanto en individuos sin vacunar como vacunados. Esta "inmunidad de grupo" inducida por la vacunación contra patógenos bacterianos de las vías respiratorias altas se ha observado usando las vacunas Haemophilus influenzae tipo b conjugadas (Takala, A.K. et al., J. Infect. Dis., 1991, 164: 982-986; Takala, A.K. et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 1993, 12: 593-599; Ward, J. y col, Vaccines, S.A. Plotkin y E.A. Mortimer eds., 1994, 337-386; Murphy, T.V. et al., J. Pediatr., 1993, 122; 517-523; y Mohle-Boetani, J.C. et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 1993, 12: 589-593).

En general, se acepta que la inmunidad contra el Streptococcus pneumoniae puede ser mediada por anticuerpos específicos contra la cápsula de polisacáridos del neumococo. Sin embargo, los neonatos y los niños pequeños no son capaces de dar una respuesta inmune adecuada contra la mayoría de antígenos capsulares de polisacáridos y pueden sufrir infecciones reiteradas que impliquen el mismo serotipo capsular. Un enfoque para inmunizar niños contra una serie de bacterias encapsuladas consiste en conjugar los antígenos capsulares de polisacáridos con proteínas para hacerlos inmunógenos. Este enfoque ha funcionado, por ejemplo, con la bacteria Haemophilus influenzae de tipo b (véase la patente de Estados Unidos n.º 4.496.538 concedida a nombre de Gordon y la patente de Estados Unidos n.º 4.673.574 concedida a nombre de Anderson).

Sin embargo, se conocen más de 90 serotipos capsulares de S. pneumoniae, 23 de los cuales son responsables de entre el 85 y el 90% de la enfermedad. Para que un conjugado neumocócico de polisacárido-proteína funcione, los tipos capsulares responsables de la mayoría de las infecciones deberían hacerse convenientemente inmunogénicos. Este enfoque puede resultar difícil debido a que no todos los 23 polisacáridos incluidos en la vacuna actualmente disponible pueden hacerse inmunogénicos de forma óptima, ni siquiera en adultos.

La protección mediada por respuestas de anticuerpos de polisacáridos anticapsulares se restringe al tipo de polisacárido. Distintos tipos de polisacárido facilitan la virulencia en humanos y en otras especies de forma diferenciada. Las vacunas neumocócicas se han desarrollado mediante la combinación de los 23 polisacáridos capsulares diferentes que son representativos de los tipos prevalentes de la enfermedad neumocócica humana. Estos 23 tipos de polisacárido han sido utilizados en una vacuna neumocócica autorizada desde 1983 (D.S. Fedson, M. Musher, Vaccines, S.A. Plotkin y J.E.A. Montimer eds., 1994, 517-564). La vacuna polivalente autorizada a base de 23 polisacáridos tiene una eficacia probada de aproximadamente el 60% en la prevención de bacteriemia causada por neumococos del tipo de la vacuna en adultos sanos.

Sin embargo, la eficacia de la vacuna ha suscitado polémica y, en ocasiones, se ha cuestionado si la utilización recomendada de la misma está justificada. Se ha especulado sobre la posibilidad de que la eficacia de esta vacuna se vea afectada negativamente por el hecho de tener que combinar 23 antígenos distintos. Una cantidad elevada de antígenos combinados en una única formulación podría tener un efecto negativo en las respuestas de los anticuerpos a los tipos individuales dentro de la mezcla debido a la competencia antigénica. La eficacia también se ve afectada por el hecho de que los 23 serotipos abarcan todos los tipos serológicos asociados a portadores e infecciones humanas.

Un enfoque alternativo para proteger a los niños, y también a los ancianos, de una infección neumocócica sería la identificación de antígenos proteicos que pudieran desencadenar respuestas inmunes protectoras. Dichas proteínas podrían servir por sí mismas como vacunas o podrían ser usadas junto a conjugados satisfactorios de polisacárido-proteína o como vehículos de polisacáridos.

Russell et al. han descrito una proteína inmunógenica, común a distintas especies, a partir de la bacteria S. pneumoniae, designada "proteína neumocócica de pili A" (J. Clin. Microbiol. 28: 2191-95). Este antígeno proteico de 37 kDa también se describe en la patente US nº 5.422.427, cuyas explicaciones se incluyen íntegramente en la presente memoria. La proteína de 37 kDa, denominada anteriormente "proteína neumocócica de pili A", ha sido designada más recientemente "proteína neumocócica de superficie A" (PsaA). Para los propósitos de la presente solicitud, cada vez que se utilicen las expresiones "PsaA", "proteína neumocócica de superficie A", "proteína neumocócica de pili A" o "antígeno de 37 kDa" se entenderá que se hace referencia al antígeno proteico de S. pneumoniae caracterizado por Russell et al. (1990) y descrito en la patente de US n.º 5.422.427.

Los análisis por transferencia de puntos con un anticuerpo monoclonal dirigido a PsaA demuestran que la proteína PsaA es común a los 23 serotipos neumocócicos de la vacuna (Russel et al., 1990). El gen que codifica la proteína PsaA ha sido clonado y secuenciado (Sampson et al. [1994], "Cloning and nucleotide sequence analysis of psaA, the Streptococcus pneumoniae gene encoding a 37-kilodalton protein homologous to previously reported Streptococcus sp. adhesins", Infect. Immun., 62:319-324). Desgraciadamente, la cepa desde la que se clonó el gen, R36A, es una cepa de poca virulencia sin encapsular, y estudios posteriores han demostrado que no es representativa de los genes de PsaA de serotipos de cepas relevantes clínicamente. Por ejemplo, los cebadores de oligonucleótidos basados en la secuencia publicada de PsaA desde R36A no fueron capaces de dirigir la amplificación de la PCR del gen de PsaA desde la cepa D39, una cepa capsular virulenta de tipo 2 (Berry y Paton, Infect. Immun. 64: 5255-62, 1996).

El gen de PsaA ha sido clonado de la cepa encapsulada 6B y es el objeto de la patente en tramitación 08/222,179. Este gen es más representativo de cepas relevantes clínicamente. Este gen fue clonado inicialmente en pUC18 e insertado posteriormente en un vector de expresión, pQE30 (Quiagen, CA), que contiene el promotor T5. Sin embargo, mientras las células huésped de E. coli transformadas con este constructo e inducidas mediante IPTG sí expresaron PsaA recombinante, las células recombinantes eran inestables y sus rendimientos bajos. Esta inestabilidad podría deberse a la toxicidad de las proteínas recombinantes lipidadas de forma natural hacia las células huésped de E. coli, y hace que la utilización de dichos sistemas de expresión sea limitada en la preparación de cantidades suficientes de PsaA recombinante para su utilización en composiciones inmunológicas.

Para provocar una infección, S. pneumoniae debe acceder primero al huésped a través de las superficies mucosas. El determinante principal de inmunidad específica en superficies mucosas es la inmunoglobulina A secretora (S-IgA), que se encuentra fisiológica y funcionalmente separada de los componentes del sistema inmune circulatorio. Las respuestas mucosas de la S-IgA son generadas principalmente por el sistema inmune común de mucosas (CMIS) (Mestecky, J. Clin. Immunol. [1987], 7:265-276), en el que los inmunógenos son absorbidos por estructuras linfoepiteliales especializadas, denominadas conjuntamente como "tejido linfático asociado a mucosas" (MALT). La expresión sistema inmune común de mucosas hace referencia al hecho de que la inmunización en cualquier zona mucosa puede desencadenar una respuesta inmune en todas las demás zonas mucosas. Por lo tanto, la inmunización del intestino puede provocar inmunidad mucosa en las vías respiratorias altas, y viceversa.

Además, es importante destacar que la inmunización oral puede inducir una respuesta de IgG específica de antígeno en el compartimento sistémico además de anticuerpos de IgA de mucosa (McGhee, J.R. et al., [1993], Infect. Agents and Disease, 2:55-73).

La mayoría de antígenos solubles que no se replican no son buenos inmunógenos de mucosa, especialmente por vía peroral, lo que probablemente se deba a que las enzimas digestivas degradan tales antígenos, los cuales disponen de poco tropismo o carecen de él para el tejido linfático asociado al intestino (GALT). De esta forma, sería deseable un procedimiento para la producción de inmunógenos efectivos de mucosa, así como vacunas y composiciones inmunógenicas que los contengan.

Los antígenos proteicos innatos como el PsaA, o los fragmentos inmunógenicos del mismo, estimulan una respuesta inmune cuando son administrados a un huésped. Las proteínas recombinantes son prometedoras candidatas a composiciones inmunogénicas o de vacunas debido a que se pueden producir a un alto nivel de rendimiento y pureza y se pueden manipular con el fin de maximizar las actividades deseadas y minimizar las que no se deseen. Sin embargo, teniendo en cuenta que pueden tener un efecto inmunogénico pobre, los procedimientos para potenciar la respuesta inmune a proteínas recombinantes son importantes a la hora de desarrollar composiciones inmunogénicas o vacunas. Es posible que dichos antígenos, en particular si se han producido de forma recombinante, provoquen una respuesta más fuerte cuando se administren junto con un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que potencia la inmunogenia de un antígeno. Los adyuvantes pueden actuar reteniendo el antígeno localmente cerca de la zona de administración con el fin de producir un efecto de depósito, lo que facilita la liberación sostenida y lenta del antígeno a células del sistema inmune. Los adyuvantes también pueden atraer células del sistema inmune, y pueden atraer células inmunes a un depósito de antígenos y estimularlas para desencadenar una respuesta inmune.

Durante muchos años, se han utilizado adyuvantes o agentes inmunoestimulantes para mejorar la respuesta inmune a vacunas, por ejemplo. Los adyuvantes intrínsecos, como los lipopolisacáridos, suelen ser componentes de las bacterias muertas o atenuadas usadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que suelen estar unidos de forma no covalente a antígenos y que se formulan para potenciar la respuesta inmune del huésped. El hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (conocidos conjuntamente como alumbre) se usan rutinariamente como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias. Actualmente, el alumbre es el único adyuvante autorizado para utilización humana, aunque se está experimentando con cientos de adyuvantes experimentales como la toxina B de cólera. Pero estos adyuvantes tienen deficiencias. Por ejemplo, aunque la toxina B de cólera no es tóxica en el sentido de provocar cólera, existe una inquietud generalizada a la hora de administrar una toxina asociada a una enfermedad de la gravedad del cólera, especialmente si hay alguna posibilidad, por muy remota que sea, de impureza menor. Además, existe una creencia generalizada de que, para que la toxina B de cólera actúe eficazmente como adyuvante, debe darse cierta actividad de la toxina de cólera.

Por lo tanto, sería deseable potenciar la inmunogenia de los antígenos mediante procedimientos diferentes a la utilización de un adyuvante, en particular en preparaciones monovalentes; y, en preparaciones multivalentes, tener la capacidad de emplear tales procedimientos para potenciar la inmunogenia con un adyuvante, para así obtener una respuesta inmunológica aún mayor.

Un estimulador inmune muy prometedor es la región de lípidos N-palmitoil-S-(2RS)-2,3-bis-(palmitoiloxi)propil cisteína, Pam_{3}Cys de forma abreviada. Esta región se encuentra en el extremo amino de las lipoproteínas bacterianas que son sintetizadas con una secuencia señal que especifica la fijación y escisión lipídicas por la peptidasa señal II. Los péptidos sintéticos que no son inmunogénicos por sí mismos inducen una fuerte respuesta de anticuerpos cuando se acoplan de forma covalente a Pam_{3}Cys (Bessler et al., Research Immunology [1992] 143:548-552).

Además de la respuesta de anticuerpos, a menudo se necesita inducir una respuesta celular inmune, en particular linfocitos T citotóxicos (CTL). Los péptidos sintéticos acoplados a Pam_{3}Cys son inductores de CTL extremadamente potentes, pero todavía no se ha informado de inducción de CTL por lipoproteínas recombinantes grandes.

Tal y como se describe en el documento WO 90/04411, un análisis de la secuencia de ADN para la cepa B31 de B. burgdorferi muestra que la proteína OspA está codificada por un marco de lectura abierto de 819 nucleótidos que comienza en la posición 151 de la secuencia de ADN y termina en la posición 970 de la secuencia de ADN (véase la figura 1 del mismo).

Los primeros dieciséis residuos de aminoácido de OspA constituyen una secuencia señal hidrofóbica de OspA. El producto de traducción primario del gen B. burgdorferi de longitud completa contiene una secuencia señal hidrofóbica N-terminal que es un sustrato para la fijación de un diacil glicerol a la cadena lateral de sulfhidrilo del residuo adyacente de cisteína. Siguiendo esta fijación, tiene lugar la escisión mediante peptidasa señal II y la fijación de un tercer ácido graso al extremo N. La región completa de lípidos se denomina Pam_{3}Cys. Se ha demostrado que la lipidación de OspA es necesaria para la inmunogenia, ya que la lipoproteína OspA con una región Pam_{3}Cys N-terminal estimula una fuerte respuesta de anticuerpos, mientras que si OspA carece del lípido acoplado, no induce anticuerpos detectables (Erdile et al., Infect. Immun., [1993], 61:81-90).

La solicitud de patente internacional publicada WO 93/10238 describe la secuencia de ADN del gen psaA de la cadena S. pneumoniae (tipo 6B) y la proteína PsaA codificada así con peso molecular de 37 kDa. Esta secuencia revela que PsaA es una lipoproteína que emplea una secuencia señal similar a la utilizada para OspA. Sobre la base de los descubrimientos relativos a OspA, podría esperarse que la lipidación de PsaA recombinante sería útil para potenciar su inmunogenia; pero, tal como se trata a continuación, los solicitantes experimentaron dificultades en la obtención de la expresión detectable de PsaA recombinante.

El documento WO 96/40718 describe una proteína lipidada heteróloga que contiene una secuencia líder, que no se produce de forma natural con la porción de proteína de una proteína lipidada. La secuencia líder puede tener la secuencia líder OspA de Borrelia. La porción de proteína puede ser OspC, PspA, UreA, UreB, o un fragmento de los mismos.

Talkington DF et al., Microbial Pathogenesis, 1996, vol 21, p. 17-22 describe la proteína de la adhesina de superficie neumocócica A (PsaA) presente en Streptococcus pneumoniae. Inmunización de ratones Xid CBA/CaHNJ con ratones protegidos de PsaA contra inoculación intravenosa heteróloga con cepas neumocócicas de tipo 3 WU2 a dosis de hasta 45 veces la DL_{50}.

Sampson J et al., Infection and Immunity, May 1997, vol 21, p. 1967-1971 examina el polimorfismo de PsaA entre 23 serotipos de vacuna encapsulados mediante análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción por PCR. Los resultados indicaron que el gen psaA está conservado genéticamente.

Sampson et al., 1997, Infection and Immunity, vol. 65, no. 5, páginas 1967-1971,describe la secuencia de ADN y proteína de PsaA del serotipo 6B de S. pneumoniae y su relación con ortólogos de PsaA de otras cepas.

Becker et al., 1997, Vaccines, vol. 97, páginas 39-44, describe la lipidación de un fragmento no inmunógeno de PspA fusionado a la secuencia señal de lipidación de OspA.

Sampson et al., 1994, Infection and Immunity, vol. 62, n.º 1 páginas 319-324, describe una secuencia de nucleótido y proteína del gen PsaA aislado de la cepa R36A.

Bessler et al., 1992, Research in Immunology, vol. 143, n.º 5, páginas 548-553, describe un procedimiento para la conjugación química de péptidos o proteínas con Pam3Cys.

Erdile et al., 1997, Vaccine, vol. 15, no. 9, páginas 988-995, describe un estudio comparativo aplicando OspA lipidada en contraposición con OspA truncada y no lipidada como vacuna mucosa.

Ades et al., 1998, Centers for Disease Control and Prevention, International Conference on Emerging Infectious Diseases, Atlanta, GA (USA), 8-11, describe una aplicación intranasal de PsaA de longitud completa.

La patente de US n.º 4.624.926 concedida a nombre de Inouye se refiere a vectores de clonación plasmídicos, incluyendo una secuencia de ADN que codifica un polipéptido deseado unido a uno o más fragmentos funcionales derivados de un gen de lipoproteína de membrana externa de una bacteria gramnegativa. El polipéptido expresado por las células huésped de E. coli transformadas comprende el péptido señal de la lipoproteína, seguido de los ocho primeros residuos de aminoácidos de la lipoproteína, que son seguidos por la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada. El péptido señal puede ser translocado de forma natural a través de la membrana citoplasmática y los ocho primeros aminoácidos de la lipoproteína pueden entonces seguir siendo procesados e insertados en la membrana exterior de la célula de una forma análoga a la inserción normal de la lipoproteína en la membrana exterior. No se demostró la inmunogenia de las proteínas expresadas.

La solicitud de patente internacional publicada W091/09952 describe plásmidos para la expresión de proteínas lipidadas. Dichos plásmidos implican una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de lipoproteína unido a los codones para uno de los tetrapéptidos de giro \beta QANY o IEGR, que está unido, a su vez, a la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada. De nuevo, no se demostró la inmunogenia de las proteínas expresadas.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una lipoproteína neumocócica recombinante en la que la lipidación de la misma es de la expresión de una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal de una lipoproteína diferente al PsaA, y la porción proteica de la misma proviene de la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína madura de PsaA, o un fragmento inmunógeno de la misma, y las secuencias primera y segunda no se producen juntas de forma natural; en particular, una lipoproteína en la que la primera secuencia codifica una secuencia líder de lipoproteína Borrelia, preferentemente una secuencia líder OspA y, más preferentemente, en la que la segunda secuencia codifica una porción de proteína que comprende PsaA o un fragmento inmunogénico del mismo.

Otro objetivo de la invención es proporcionar la expresión de genes y/o secuencias que codifique dichas lipoproteínas recombinantes, sus vectores y procedimientos para llevar a cabo dicha expresión.

Otro objetivo de la invención es proporcionar composiciones inmunogénicas, incluyendo vacunas, que contienen las lipoproteínas recombinantes de la invención y/o vectores para expresión de las mismas.

Los documentos citados en la presente exposición, incluyendo las solicitudes mencionadas anteriormente, proporcionan ingredientes adicionales habituales para dichas composiciones, de forma que el experto en la materia no requiere experimentación excesiva para formular una composición a partir de la presente exposición. Dichas composiciones deben contener preferentemente una cantidad suficiente de la lipoproteína PsaA recombinante de la invención o del vector que la expresa para provocar una respuesta adecuada. Dicha cantidad de lipoproteína recombinante de la invención o de vector puede basarse en cantidades conocidas de antígenos administrados. Por ejemplo, si en una cantidad conocida para la administración de un antígeno correspondiente a la segunda secuencia expresada para la lipoproteína recombinante de invención, la cantidad de lipoproteína de PsaA recombinante de la invención puede alcanzar esa cantidad conocida, y la cantidad de vector puede ser tal que produzca un número suficiente de unidades formadoras de colonia (cfu) para dar como resultado la expresión in vivo de la lipoproteína recombinante en aproximadamente esa cantidad conocida. De la misma forma, la cantidad de lipoproteína de PsaA recombinante de la invención puede basarse en las cantidades de antígeno administradas a animales en los ejemplos citados a continuación y en los documentos mencionados en la presente memoria, sin necesidad de experimentación excesiva.

La presente invención se refiere además, en otros aspectos, a procedimientos para la producción de la lipoproteína de PsaA recombinante de la invención, mediante la reunión de un vector de expresión, la expresión de la lipoproteína recombinante de PsaA de la invención de un organismo huésped que contiene el vector de expresión y, opcionalmente, el aislamiento y/o la purificación de la lipoproteína de PsaA recombinante expresada de la invención. Los procesos de aislamiento y purificación pueden ser de tal forma que se obtenga la mencionada lipoproteína de PsaA recombinante libre de impurezas como lipopolisacáridos y otras proteínas de bacterias. La presente invención también incluye composiciones inmunogénicas, tales como vacunas que contienen la lipoproteína de PsaA recombinante de la invención al igual que procedimientos para inducir una respuesta inmunológica.

La presente invención se refiere a la ingeniería genética destinada a llevar a cabo la expresión de lipoproteínas neumocócicas según la invención a partir de vectores que contienen moléculas de ácidos nucleicos que codifican lipoproteínas. Más particularmente, la presente invención se refiere a la expresión de una lipoproteína de PsaA recombinante en la que la lipidación de la misma proviene de la expresión de una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal de una lipoproteína diferente de PsaA y cuya proteína proviene de la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de PsaA madura, o un fragmento inmunogénico de la misma, de forma que las secuencias de ácidos nucleicos primera y segunda, que de forma natural no se dan juntas, son contiguas. La invención hace referencia a la expresión de tales lipoproteínas en las que la primera secuencia de ácidos nucleicos codifica una secuencia líder de lipoproteína de Borrelia (OspA). La invención también hace referencia a proteínas de PsaA lipidadas recombinantes de la invención expresadas usando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia líder OspA, a procedimientos para hacer y usar las mismas composiciones de la misma y a procedimientos para utilizar las composiciones. La invención hace referencia, adicionalmente, a secuencias de ácidos nucleicos que codifican las lipoproteínas PsaA recombinantes de la invención, a vectores que contienen y/o expresan las secuencias, a procedimientos para expresar las lipoproteínas PsaA de la invención y a procedimientos para producir las secuencias de ácidos nucleicos y los vectores; las composiciones que emplean las lipoproteínas PsaA de la invención, incluyendo composiciones inmunógenas o de vacunas, de forma que, preferentemente, dichas composiciones dispongan de una inmunogenia mejorada; y procedimientos para utilizar dichas composiciones para provocar una respuesta inmunológica o de protección.

A lo largo de la presente memoria, se hace referencia a diversos documentos para describir de forma más detallada el estado de la técnica a la que pertenece la presente invención. Cada uno de estos documentos se incorpora a la presente memoria como referencia.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento de la presente invención permite que se obtengan grandes cantidades de proteínas PsaA puras, recombinantes, inmunogénicas y lipidadas, según la invención, y porciones de las mismas, lo que hasta el momento no había sido posible.

Las proteínas lipidadas formadas de forma recombinante que se proporcionan en la presente memoria son significativamente más inmunogénicas que sus análogas recombinantes no lipidadas.

Por lo tanto, en una forma de realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico híbrida aislada, preferentemente ADN, que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia señal de, preferentemente, una proteína OspA de una especie Borrelia, acoplada mediante una relación de marco de lectura abierto traduccional con una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína PsaA madura, o un fragmento inmunológicamente activo de la misma.

La secuencia señal de la proteína OspA de una cepa Borrelia codificada por la primera secuencia de ácidos nucleicos es, preferentemente, de una cepa de B. burgdoferi y, más preferentemente, una cepa de B. burgdoferi seleccionada de entre las familias de cepas B31, ACAI e Ip90, o de otras cepas con secuencias señal comparables.

El gen híbrido proporcionado en la presente memoria puede ser ensamblado en un vector de expresión, preferentemente bajo el control de un promotor adecuado para la expresión de la lipoproteína madura, según otro aspecto más de la invención, que, en un organismo huésped adecuado como E. coli, provoca la traducción inicial de una molécula quimérica que comprende la secuencia líder y la proteína PsaA en forma lipidada, seguido de la escisión de la molécula quimérica por peptidasa señal II y la fijación de regiones lipídicas al nuevo extremo de la proteína PsaA, por la cual la lipoproteína madura se expresa en el organismo huésped.

La presente invención proporciona, por primera vez, una molécula híbrida de ácidos nucleicos que permite la producción de cantidades comercialmente útiles de proteína PsaA recombinante lipidada, o de fragmentos inmunológicamente activos de la misma.

Se prefieren los procedimientos recombinantes ya que se desea un rendimiento elevado. Las etapas básicas en la producción recombinante de PsaA lipidada de la invención incluyen:

construir un ADN sintético o semisintético que codifique la lipoproteína PsaA heteróloga de la invención,

integrar dicho ADN a un vector de expresión de una forma adecuada para la expresión de la lipoproteína PsaA de la invención, sola o como proteína de fusión,

transformar una célula huésped procariótica o eucariótica adecuada con el mencionado vector de expresión,

cultivar la mencionada célula huésped transformada o transfectada, y

recuperar y purificar la lipoproteína PsaA producida de forma recombinante.

Para la expresión recombinante, la secuencia que codifica una lipoproteína PsaA de la invención puede ser completamente sintética, semisintética o el resultado de la modificación de gen nativo psaA.

Los genes sintéticos, cuya traducción y transcripción in vivo o in vitro resultará en la producción de polipéptidos de tipo PsaA, pueden ser construidos mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Debido a la degeneración natural del código genético, el experto en la materia sabrá que puede construirse un número considerable, y definitivo, de secuencias de ADN que codifiquen lipoproteínas PsaA de la invención. El gen que codifica la lipoproteína PsaA de la invención puede crearse mediante metodología sintética. Dicha metodología de construcción de genes sintéticos es bien conocida en la técnica. Véase Brown, E.L., Belagaje, R., Ryan, MJ., y Khorana, H.G. (1979) en "Methods in Enzymology", Academic Press, N.Y., Vol. 68, pgs. 109-151, cuyas enseñanzas se incorporan totalmente a la presente memoria como referencia. Los segmentos de ADN que corresponden al gen psaA de la invención, o fragmentos de los mismos, son generados usando aparatos convencionales para la sintetización de ADN, tales como los modelos 380A o 380B de Applied Biosystems (que se pueden adquirir de Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404). El gen psaA sintético de la invención puede diseñarse para poseer sitios de fijación de la endonucleasa de restricción en cualquier extremo del transcrito, para facilitar el aislamiento y la integración en plásmidos de amplificación y expresión. Los sitios de restricción se seleccionan de forma que orienten adecuadamente la secuencia que codifica la lipoproteína PsaA de la invención con secuencias de control para lograr una lectura en marco y una expresión adecuadas de la lipoproteína PsaA de la invención. Puede incorporase una variedad de otros sitios de escisión similares dependiendo de los constructos recombinantes particulares empleados y puede generarse mediante técnicas conocidas en la técnica.

La "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" hace referencia a un procedimiento o técnica en la que se amplifican cantidades de una parte preseleccionada de ácido nucleico, ARN y/o ADN, tal y como se describe en la patente US n.º 4.683.195. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá de ellos se emplea para diseñar cebadores de oligonucleótidos. Estos cebadores serán idénticos o similares en su secuencia a cepas opuestas de la plantilla que se vaya a amplificar. La PCR puede ser usada para amplificar secuencias específicas de ARN, secuencias específicas de ADN genómico total, y ADNc transcrito de ARN celular total, secuencias plasmídicas o bacteriófagas, y similares. Véase en general Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). La PCR también puede ser usada para introducir convenientemente cualquier gen de modificación de secuencia de interés. Véase en general Ausubel et al., eds, "Current Protocols in Molecular Biology", \NAK 8.5.1 (John Wiley & Sons, 1995).

En la construcción de vectores adecuados que contengan las secuencias de control y codificación deseadas se emplean técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son escindidos, adaptados y religados en la forma deseada para formar los plásmidos requeridos.

Para lograr la traducción de la secuencia de lipoproteína de PsaA deseada de la invención, se inserta la secuencia modificada de ADN que codifica la lipoproteína PsaA de la invención en cualquiera de la plétora de vectores de expresión adecuados de ADN recombinante mediante la utilización de endonucleasas de restricción apropiadas. Una versión sintética de la secuencia de codificación de ADN está diseñada para poseer sitios de fijación de la endonucleasa de restricción en cualquier extremo del transcrito, para facilitar el aislamiento y la integración en estos plásmidos de amplificación y expresión. La secuencia de codificación puede modificarse fácilmente mediante la utilización de ligadores sintéticos para facilitar la incorporación de esta secuencia en los vectores de clonación deseados mediante técnicas conocidas por los expertos. Las endonucleasas particulares empleadas se establecerán por medio de la pauta de escisión de la endonucleasa de restricción del vector de expresión precursor que se vaya a emplear. Los sitios de restricción se seleccionan de forma que orienten adecuadamente la secuencia de codificación de ADN con secuencias de control para lograr una lectura en marco y una expresión adecuadas de la lipoproteína PsaA de la invención.

En general, con estos huéspedes se usan vectores plasmídicos que contienen promotores y secuencias de control derivadas de especies compatibles con la célula huésped. Normalmente, el vector porta un sitio de replicación así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene 2:95 [1977]), que contiene genes para la resistencia a tetraciclina y ampicilina y proporciona así un medio fácil para la identificación de células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano, también debe contener o ser modificado para contener promotores y otros elementos de control usados habitualmente en la construcción de ADN recombinante.

La secuencia de ADN que codifica la lipoproteína de PsaA de la invención debe estar colocada de forma que esté en el marco de lectura adecuado con el promotor y el sitio de unión del ribosoma del vector de expresión, siendo ambos funcionales en la célula huésped en la que la secuencia de codificación de ADN para la lipoproteína de PsaA de la invención va a ser expresada. En una práctica preferida en la presente invención, la región promotor-operador se encuentra en la misma orientación secuencial con respecto al codón de iniciación ATG de la secuencia de ADN que codifica la lipoproteína PsaA de la invención que la que ocupa el promotor-operador con respecto al codón de iniciación ATG del gen del que se derivó. Las regiones promotor-operador sintéticas o modificadas como el promotor "tac" son bien conocidas por los expertos en la materia. Al emplear dichas regiones promotor-operador sintéticas o modificadas, deben estar orientadas con respecto al codón de iniciación ATG de la secuencia de ADN que codifica la lipoproteína PsaA de la invención conforme a la dirección de sus creadores.

En general, los organismos procariotas son usados para clonar secuencias de ADN en la construcción de vectores útiles para la invención. Por ejemplo, la cepa de E. coli K12 294 (ATCC n.º 31446) es particularmente útil. Otras cepas microbianas que pueden ser usadas incluyen E. coli B y E. coli X1776 (ATCC n.º 31537), E. coli W3110 (prototrófica, ATCC n.º 27325), bacilos como el Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae como Salmonella typhimurium o Serratia marcescans, y pueden ser usadas diversas especies de pseudomonas. Entre los promotores adecuados para su utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas de promotor de lactosa (Chang et al., [1978] Nature, 275:615; y Goeddel et al., [1979] Nature 281:544) y \beta-lactamasa (el vector pGX2907 [ATCC 39344] contiene el gen de \beta-lactamasa y el replicón), la fosfatasa alcalina, el sistema de promotor de triptófano (trp) (el vector pATH1 [ATCC 37695] está diseñado para facilitar la expresión de un marco de lectura abierto como proteína de fusión trpE bajo el control del promotor trp) y promotores híbridos como el promotor tac (que puede aislarse del plásmido pDR540 ATCC-37282). Sin embargo, otros promotores bacterianos funcionales, cuyas secuencias de nucleótidos en general se conocen, permiten al experto en la materia ligarlos a polipéptidos de tipo PspA codificantes de ADN usando ligadores o adaptadores que proporcionen los sitios de restricción requeridos. Los promotores para su utilización en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo ligada al ADN que codifica el polipéptido de tipo PspA. Estos ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo.

Mientras que la discusión anterior y los ejemplos que se proporcionan en la presente memoria se refieren a la expresión procariótica, los expertos en la materia podrán apreciar con facilidad que las lipoproteínas PsaA recombinantes de la invención también pueden producirse de forma recombinante en sistemas eucarióticos de expresión capaces de efectuar las modificaciones lipídicas postraduccionales necesarias.

Las células huésped pueden ser transformadas con los vectores de expresión de la presente invención y cultivadas en medio nutritivo convencional modificado de forma adecuada para inducir promotores, seleccionando genes de amplificación o transformantes. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el PH y similares, son las que se utilizaron previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y resultarán evidente para el experto ordinario en la materia. Las técnicas de transformación de células con los vectores mencionados anteriormente son bien conocidas por los expertos en la materia y pueden encontrarse en referencias generales como Maniatis et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York o en Current Protocols in Molecular Biology (1989) y sus suplementos.

Las lipoproteínas PsaA recombinantes de la presente invención pueden producirse mediante expresión directa o como proteína de fusión que comprenda la lipoproteína PsaA seguida de escisión enzimática o química. En la producción de ciertos péptidos en sistemas recombinantes se observa a menudo que la expresión como proteína de fusión prolonga la vida útil y/o aumenta el rendimiento del péptido deseado. Se conoce una variedad de peptidasas (por ejemplo, la tripsina) que escinden un polipéptido en sitios específicos o digieren los péptidos de los extremos amino o carboxi (por ejemplo, la diaminopeptidasa) de la cadena peptídica. Además, determinadas sustancias químicas (por ejemplo, el bromuro de cianógeno) escinden una cadena polipeptídica en sitios específicos. El experto en la materia tendrá en cuenta las modificaciones necesarias de la secuencia de aminoácidos (y la secuencia de codificación sintética o semisintética, si se emplean medios recombinantes) para incorporar sitios de escisión internos específicos del sitio. Véase, por ejemplo, Carter P., "Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins, Ch. 13 in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes", American Chemical Soc., Washington, D.C. (1990).

Tal y como se describe anteriormente, el gen híbrido puede ensamblarse a un vector de expresión bajo el control de un promotor adecuado para la expresión de la lipoproteína PsaA de la invención, que, en un organismo huésped adecuado, como E. coli, provoca la expresión de la lipoproteína PsaA heteróloga de la invención del organismo huésped.

La presente invención también proporciona una lipoproteína PsaA recombinante expresada por un gen híbrido o quimérico que comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal o líder de una lipoproteína distinta a PsaA contigua a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una porción proteica inmunogénica de la lipoproteína PsaA, y las secuencias primera y segunda no se dan juntas de forma natural. Las secuencias primera y segunda se acoplan preferentemente en una relación traduccional de marco de lectura
abierto.

Las secuencias primera y segunda pueden estar presentes en un gen y el gen y/o las secuencias primera y segunda pueden encontrarse en un vector adecuado para su expresión. El vector puede ser un ácido nucleico en forma, por ejemplo, de plásmido, bacteriófagos y ADN integrado, en bacterias, más preferentemente, en una usada para expresión, por ejemplo, E. coli. Bacillus subtilis, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, etc, o como vector vivo, por ejemplo, Lactobacillus, Mycobacterium, Salmonella, Streptococcus, etc. Cuando se usa un huésped de expresión, la lipoproteína PsaA recombinante de la invención puede obtenerse mediante el cultivo del producto expresado in vitro; por ejemplo, mediante el aislamiento de la lipoproteína PsaA recombinante de la invención de un extracto bacteriano. El gen puede encontrarse preferentemente bajo el control de y, por tanto, unido a un promotor adecuado y el promotor puede ser endógeno al vector o estar insertado en el vector con el gen.

La invención también proporciona vectores que contienen el ácido nucleico que codifica las lipoproteínas PsaA recombinantes de la invención y procedimientos para obtener las lipoproteínas recombinantes y procedimientos para preparar los vectores.

Como se ha mencionado, las lipoproteínas PsaA recombinantes de la presente invención pueden tener una inmunogenia potenciada. Por lo tanto, otras formas de realización adicionales de la presente invención proporcionan composiciones inmunogénicas o de vacunas para la inducción de una respuesta inmunológica, que comprenden la lipoproteína recombinante de la invención, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma, o ambos, y un vehículo adecuado, así como procedimientos para provocar una respuesta inmunológica o de protección que comprende la administración a un huésped de la lipoproteína PsaA recombinante de la invención, el vector que expresa la lipoproteína PsaA recombinante de la invención o una composición que contiene la lipoproteína recombinante de la invención o el vector, en una cantidad suficiente para provocar la respuesta.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que contiene polipéptidos recombinantes derivados de cepa(s) neumocócica(s) conforme a la invención y un diluyente o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición inmunológica que contiene la lipoproteína PsaA de la invención provoca una respuesta inmunológica, local o sistémica. La respuesta puede ser de protección, aunque no es necesario. Una composición inmunogénica que contiene la lipoproteína PsaA de la invención provoca de la misma forma una respuesta inmunológica local o sistémica que puede ser protectora, aunque no necesariamente. Una composición de vacuna provoca una respuesta de protección local o sistémica. En consecuencia, las expresiones "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" incluyen una "composición de vacuna" (ya que los otros dos términos pueden ser composiciones de protección).

La invención también proporciona, por tanto, la utilización de una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende una lipoproteína PsaA recombinante de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una composición inmunológica destinada a inducir una respuesta inmunológica en un mamífero huésped.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona la utilización de la PsaA lipidada recombinante de la invención para la preparación de una composición inmunológica destinada al tratamiento o a la prevención de una enfermedad neumocócica.

La invención también proporciona la utilización de PsaA lipidado recombinante de la invención para la preparación de una composición inmunológica para inmunizar a un huésped contra la infección neumocócica. En una forma de realización preferida, dicha composición inmunológica se administra de forma intranasal.

La determinación de la cantidad de antígeno de lipoproteína PsaA recombinante de la invención y de adyuvante opcional adicional en las composiciones inventivas y la preparación de dichas composiciones debe ser conocida, de acuerdo con las técnicas estándar, para los expertos en las técnicas farmacéutica o veterinaria. En particular, la cantidad de antígeno y adyuvante en las composiciones inventivas y las dosificaciones administradas se determinan mediante técnicas bien conocidas para los expertos en las técnicas médica y veterinaria, teniendo en cuenta factores tales como el antígeno particular, el adyuvante (si está presente), la edad, el sexo, el peso, la especie y la condición del animal o el paciente en particular, y la vía de administración. Por ejemplo, a partir de la presente exposición, los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las dosificaciones de antígenos de lipoproteína PsaA particulares de la invención para huéspedes adecuados en los que se desea una respuesta inmunológica, así como la cantidad de cualquier adyuvante que normalmente se administre con las mismas. Por lo tanto, el experto en la materia puede determinar fácilmente la cantidad de antígeno y adyuvante opcional en composiciones y para ser administrados en procedimientos de la invención. Típicamente, un adyuvante se usa comúnmente como solución de 0,001 al 50% en peso en solución salina de tamponado con fosfato, y el antígeno está presente en el orden de microgramos a miligramos, como de un 0,0001 a un 5% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1% en peso, más preferentemente de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,05% en peso (véase, por ejemplo, ejemplos proporcionados a continuación o en solicitudes citadas en la presente memoria). Típicamente, sin embargo, el antígeno está presente en una cantidad en un orden de microgramos a miligramos, o, aproximadamente 0,001 a aproximadamente 20% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10% en peso y, más preferentemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5% en peso.

Naturalmente, para que cualquier composición sea administrada a un animal o un humano, incluyendo los componentes de la misma y para cualquier procedimiento particular de administración, se prefiere determinar por tanto: la toxicidad, mediante la determinación de la dosis letal (DL) y DL_{50} en un modelo animal adecuado, por ejemplo, un roedor, tal como un ratón; y la dosificación de la(s) composición(es), concentración de los componentes de la misma y ritmo de administración de la(s) composición(es), que provoca una respuesta inmunológica adecuada, como mediante análisis de sueros y análisis de los mismos para anticuerpos o antígenos, por ejemplo, mediante, por ejemplo, análisis ELISA. Dichas determinaciones no requieren excesiva experimentación a partir del conocimiento del experto en la materia, de la presente exposición y de los documentos citados en la presente memoria. Y, el tiempo para las administraciones secuenciales se puede determinar sin necesidad de experimentación excesiva.

Entre los ejemplos de composiciones de la invención se incluyen preparaciones líquidas para la administración por orificio, por ejemplo, oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, mucosa (por ejemplo, mucosa perlingual, alveolar, gingival, olfativa o respiratoria), etc., como suspensiones, jarabes o elixires; y, preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), como suspensiones estériles o emulsiones. Dichas composiciones pueden estar mezcladas con un vehículo, diluyente o excipiente apropiado como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similares. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como humectantes o emulsionantes, amortiguadores de pH, aditivos de potenciación de la viscosidad o la gelificación, conservadores, aromatizantes, colores y similares, dependiendo de la vía de administración y la preparación deseada. Pueden consultarse textos estándar como Remington's Pharmaceutical Science, 17ª edición, 1985, incorporado a la presente memoria como referencia para producir preparaciones adecuadas sin necesidad de una experimentación excesiva.

Las composiciones de la invención son convenientemente suministradas como preparaciones líquidas, por ejemplo, composiciones viscosas, emulsiones, suspensiones, soluciones isotónicas acuosas que pueden ser amortiguadas a un pH seleccionado. Si se prefiere la absorción mediante el tracto digestivo, las composiciones de la invención pueden darse en la forma "sólida" de píldoras, comprimidos, cápsulas, comprimidos ovalados (Caplet) y similares, incluyendo preparaciones "sólidas" liberadas con el tiempo que tienen un relleno líquido, por ejemplo, líquido cubierto de gelatina, mientras que la gelatina se disuelve en el estómago para su transporte al intestino. Si se desea una administración nasal o respiratoria (mucosa), las composiciones pueden estar en una forma y ser dispensadas por un dispensador de spray, de bombeo o aerosol. Los aerosoles suelen estar bajo presión mediante un hidrocarbono. Los dispensadores de bombeo pueden dispensar preferentemente una dosis medida o una dosis con un tamaño concreto de partículas.

Las composiciones de la invención pueden contener aromatizantes farmacéuticamente aceptables y/o colores para que resulten más atractivas, especialmente si se administran oralmente. Las composiciones viscosas pueden ser en forma de gel, loción, pomada, crema y similares y normalmente contendrán una cantidad suficiente de espesante, de forma que la viscosidad estará comprendida entre 2.500 y 6.500 cps, aunque pueden emplearse composiciones más viscosas, incluso de hasta 10.000 cps. Preferentemente, las composiciones viscosas tienen una viscosidad de 2.500 a 5.000 cps, ya que, por encima de este intervalo se hacen más difíciles de administrar. Sin embargo, por encima de dicho intervalo, las composiciones pueden alcanzar formas sólidas o gelatinosas que pueden administrarse como píldora para la ingestión oral.

Las preparaciones de líquido son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Adicionalmente, las composiciones líquidas son algo más convenientes de administrar, especialmente mediante inyección u oralmente, a animales, niños (niños pequeños, en particular) y otros pacientes que puedan tener dificultad a la hora de tragar una píldora, un comprimido, una cápsula o similares, o en el caso de situaciones de multidosis. Las composiciones viscosas, por otro lado, pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad apropiado para proporcionar periodos de contacto más largos con la mucosa, como las paredes del estómago o la mucosa nasal.

Obviamente, la elección de vehículos adecuados y otros aditivos dependerá de la vía exacta de administración y la naturaleza de la forma de dosificación en particular, por ejemplo, forma de dosificación líquida (por ejemplo, si la composición va a formularse en una solución, una suspensión, un gel u otra forma líquida) o forma de dosificación sólida (por ejemplo, si la composición va a formularse en forma de píldora, cápsula, cápsula ovalada [Caplet], liberación sostenida o en forma de relleno líquido).

Las soluciones, suspensiones y geles suelen contener una mayor cantidad de agua (preferentemente agua purificada) además del antígeno, y un adyuvante opcional. También pueden estar presentes cantidades menores de otros ingredientes como reguladores del pH (por ejemplo, una base del tipo NaOH), emulsionantes, agentes de dispersión, amortiguadores, conservadores, humectantes, gelificantes (por ejemplo, metil celulosa), colores y/o aromatizantes. Las composiciones pueden ser isotónicas, es decir, pueden tener la misma presión osmótica que el fluido sanguíneo y lagrimal.

La isotonía deseada de las composiciones de la presente invención puede lograrse utilizando cloruro de sodio u otro agente farmacéuticamente aceptable como la dextrosa, el ácido bórico, el tartrato de sodio, el glicol propileno u otros solutos orgánicos o inorgánicos. El cloruro de sodio se prefiere particularmente para amortiguadores que contengan iones de sodio.

La viscosidad de las composiciones puede mantenerse al nivel seleccionado utilizando un espesante farmacéuticamente aceptable. Se prefiere la metil celulosa porque es fácil de adquirir y económica y se puede trabajar fácilmente con ella. Otros espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, la goma xantana, la carboximetilcelulosa, la hidroxipropilcelulosa, el carbómero y similares. La concentración preferida del espesante dependerá del agente seleccionado. Lo importante es usar una cantidad que alcance la viscosidad seleccionada. Las composiciones viscosas se preparan normalmente a partir de soluciones mediante la adición de dichos espesantes.

Un conservador farmacéuticamente aceptable puede emplearse para aumentar la duración de almacenamiento de las composiciones. El alcohol bencílico puede ser apropiado, aunque también puede emplearse una variedad de conservadores que incluyen, por ejemplo, parabenos, timerosal, clorobutanol, o cloruro de benzalconio. Una concentración apropiada del conservador estará comprendida entre el 0,02% y el 2% en base al peso total, aunque puede darse una variación considerable dependiendo del agente seleccionado.

Los expertos en la materia sabrán que los componentes de las composiciones deben seleccionarse para ser químicamente inertes con respecto al antígeno de la lipoproteína PsaA y el adyuvante opcional adicional.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Derivación de la secuencia de codificación de PsaA

En un procedimiento de PCR, se usaron cebadores de oligonucleótidos especialmente diseñados para amplificar la secuencia de codificación de psaA de S. pneumoniae de tipo 6B. Los cebadores se basaron en la secuencia psaA publicada (Sampson et al., Infect. Immun. [1994] 62:319-324). El cebador DE09 (SEC ID nº 1) cubre 26 pares de base en el extremo 5' del gen psaA, finalizando en el sitio Sph1. El cebador DE11 (SEC ID nº 2) abarca 26 pares de base en el extremo 3' de la secuencia de codificación de PsaA y un sitio BamH1.

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SEC ID nº: 1

5' GGGCATGCGCTAGCGGAAAAAAAGAT

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SEC ID nº: 2

3' GGGGATCCTTATTTTGCCAATCCTTC

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Los pares de cebador DE09 y DE11 se usaron en una reacción PCR utilizando el primer ADN en cadena como plantilla para amplificar un fragmento de par de base 870. La amplificación PCR se efectuó en un termociclador e ADN (Perkin-Elmer Cetus) para 35 ciclos, con desnaturalización durante 30 segundos a 94ºC, seguido de una reacción de fijado a 55ºC durante 30 segundos, con una extensión a 72ºC durante 2 minutos. El fragmento de psaA amplificado por PCR se digirió con Sph1 y BamH1 y se ligó al plásmido pLF100 (n.º de registro de ATCC 69750) que dirige la inserción en dirección 3' y en el marco de lectura traduccional con la secuencia señal ospA y que había sido digerida con las mismas enzimas y purificada por electroforesis en gel La ligación del fragmento psaA amplificado por PCR que había sido digerido con Sph1 y BamH1 en el plásmido pLF100 digerido con las mismas enzimas resultó en la generación de pOPsaA.1 plasmídico.

La presencia del gen psaA de interés en este recombinante se confirmó mediante análisis de secuencia cíclica y de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), usando técnicas convencionales. La secuencia de la PsaA lipidada recombinante se presenta en la secuencia SEC ID nº: 3. Los primeros 52 residuos se derivan de la secuencia señal OspA de Borrelia burdorferi: los residuos restantes se derivan de PsaA maduro de tipo 6B de S. pneumoniae (sin la secuencia señal PsaA nativa).

Las células estables recombinantes de E. coli que expresan rPsaA recombinante se prepararon mediante transformación de células HMS174-DE3 competentes (Novagen Inc., Madison, Wl) con pOPsaA.1, utilizando técnicas estándar de choque térmico (Novagen). La expresión de PsaA recombinante se confirmó mediante análisis por transferencia de puntos con anticuerpos anti-PsaA policlonales de conejo. Uno de los muchos recombinantes que expresó niveles altos de PsaA recombinante se designó HOPsaA.7.3 y fue sometido a más análisis. HopsAA fue depositado en la American Type Culture Collection (ATCC) el 20 de enero de 1998 con el número de registro 209590.

Se cultivó durante la noche una colonia única de HOPsaA.7.3 recombinante (DE3. F'' recA, hsdR) (12-14 h) a 34ºC en 25 ml de caldo Luria con un 0,8% de NaCl y 100 \mug/ml of carbenicilina. A continuación, 5 ml del cultivo de fase logarítmica inicial (~ O.D.600: 0,7) se mezcló con 20 ml del mismo caldo fresco y se incubó en vigorosa agitación a 34ºC durante 2-3 h. Siguiendo la inducción con IPTG (0,4 mM) durante 4-5 h., las células inducidas se sedimentaron mediante centrifugación a 3000 rpm/25 min, se volvieron a suspender en Triton X114/67 mM PBS (7,5) al 2%, dejándose durante la noche. Este proceso produjo dos fracciones: una fase de detergente y una fase acuosa. Las proteínas de ambas fases se analizaron mediante SDS-PAGE al 12% y se visualizaron mediante tinción de plata. También se efectuó un análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-PsaA para detectar rPsaA en estas fases. Estos experimentos indicaron que la fase de detergente contenía en su mayor parte dos tipos de rPsaA con masas moleculares de 37 ka y 38 ka. No es infrecuente que las proteínas lipidadas recombinantes aparezcan como doblete en geles de SDS-PAGE. Las ligeras variaciones en el grado de lipidación de estas proteínas recombinantes pueden dar como resultado las sutiles diferencias en el peso molecular aparente observado en geles SDS-PAGE. Estas dos proteínas constituyeron más del 50% del total de proteínas presentes en la fase de detergente, como se reveló tras la tinción con plata.

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Ejemplo 2

Purificación de PsaA recombinante

Para purificar cantidades suficientes de PsaA lipidado recombinante para su utilización en estudios de vacunas, se usó un HOPsaA.7.3 estable recombinante para preparar 1.000 ml de cultivo con las siguientes modificaciones. Brevemente, se cultivó durante la noche una colonia única recombinante en 25 ml de caldo Terrific^{TM} (GIBCO BRL) con NaCl al 0,8% y 100 \mug/ml de carbenicilina. El cultivo de fase logarítmica inicial (25 ml) se añadió a 1000 ml del mismo medio, se continuó la incubación durante 8 h a 34ºC y se indujo a continuación con IPTG (0,4 mM) durante la noche (12 -14 h). Las células se cultivaron y se volvieron a suspender en 100 ml de tampón de fosfato (pH 7.6) de Triton X-114/67 mM frío al 2%. Después de la sonicación para lograr la lisis, las células lisadas se repartieron durante la noche a 4ºC. A continuación, el lisado se clarificó por centrifugación a 10.000 rpm durante 25 min a 4ºC y el sobrenadante claro se incubó a 37ºC durante 20-25 min. para permitir la separación de fase. La fase de detergente se separó de la fase acuosa por centrifugación a 2500 rpm durante 15 min a 25ºC y la solución viscosa (10-12 ml) se lavó tres veces con 100 ml de PBS frío de 67 mM (pH 7.6). La fase de Triton^{TM} X-114 altamente concentrada (-8-10 ml), que contenía la PsaA recombinante, se volvió a suspender en 100 ml de tampón de fosfato (pH 6.5) de 10 mM frío y se dializó exhaustivamente contra el mismo tampón de fosfato de 10 mM. La centrifugación del dialisado a 5000 rpm durante 20 min a 4ºC produjo una solución clara y un sedimento visible. El sobrenadante claro, muy enriquecido para la PsaA recombinante, se diluyó hasta -200 ml con tampón de fosfato de 10 mM (pH 6,5) y se cargó directamente en un filtro de intercambio de iones D100 equilibrado previamente con 10 mM de fosfato (pH 6,5) con Triton X-100 al 0,1% (tasa de caudal de 30 - 40 ml/h por gravedad). Después de efectuar exhaustivos lavados del filtro con un total de 250 ml de los mismos 10 mM de tampón de fosfato (pH 6,5)/0,1% de Triton X-100 (tasa de caudal de 50 - 60 ml/h), el filtro se eluyó entonces con 50 ml de buffer A (100 mM de fosfato/0,1% de Triton X-100, pH 6.5) seguidos de 50 ml de tampón B (100 mM de fosfato/0,1% de Triton X100/100 mM de NaCl, pH 6,5). 10 ml de fracciones de los eluyentes resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción de nitrato de plata. También se efectuó un análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-PsaA para detecta PsaA recombinante. La fase de detergente contenía dos proteínas PsaA recombinante estrechamente relacionadas. (1) una fracción principal que migró conjuntamente con la proteína nativa de -37 kDa eluída con las tres primeras fracciones de tampón A y (2) una proteína recombinante de migración lenta (-38 kDa) eluída con las primeras dos fracciones del amortiguador B. Estas dos PsaA recombinantes constituían más del 50% del total de proteínas bacterianas que se repartieron en la fase de detergente, tal y como se reveló mediante la SDS-PAGE con tinción de nitrato de plata. Había varias proteínas de E. coli contaminantes menores de bajo peso molecular, también visualizadas en todas las fracciones mediante tinción de nitrato de plata, pero no fueron detectadas por análisis de transferencia Western. Usando el ensayo Pierce BCA, el contenido proteico total de la fase de detergente se estimó en 10 -12 mg/L de cultivo E. coli; la cantidad de PsaA recombinante purificado eluido con tampón A es de 700-750 \mug/l, utilizado BSA como estándar (nota: la concentración aproximada del rPsaA de fase de detergente total es mayor de 2,5 mg/l de cultivo de E. coli).

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Ejemplo 3

Inmunogenia de PsaA lipidado recombinante

Una fracción de alta concentración de sal de PsaA recombinante purificado (DP2) se usó como inmunógeno en dos dosis con alumbre. El primer día se administraron 5 \mug de DP2 a ratones Webster suizos y el 14º día se estimuló con la misma cantidad de rPsaA con alumbre. El día 21 se sangró a los animales y se analizó la presencia de anticuerpos anti-PsaA en el suero mediante ELISA, usando PsaA/rPsaA nativo purificado como fase sólida. Todos los animales probados produjeron anticuerpos ante PsaA (>1,5 x 10^{6} título).

En otro experimento, PsaAs recombinantes expresados por High Five y Sf9 se usaron como inmunógenos a dos niveles de dosis con o sin adyuvante (Freund incompletos). El primer día se administraron 20 \mug o 5 \mug de PsaAs parcialmente purificados a ratones Webster suizos adultos y se realizó una estimulación el día 14 con la misma cantidad de PsaAs sin adyuvante. El día 21 se sangró a los animales y se analizó la presencia de anticuerpos anti-PsaA en el suero mediante análisis por transferencia de puntos usando células enteras (serotipo 6B), PsaAs purificadas nativas y recombinantes además de títulos de PsaA nativas.

Todos los animales produjeron anticuerpos que reaccionaron de forma cruzada con las PsaAs nativas y adecuadamente recombinantes, a excepción del anticuerpo a PsaA expresado por Sf9, que mostró reactividad cruzada limitada con la PsaA expresada por H5. El título de anticuerpo de los animales que no recibieron adyuvante fue reducido (es necesaria la realización de estudios que determinen el calendario de inmunización idóneo) en comparación al los que sí se administró adyuvante.

Se realizó un experimento de protección pasiva usando crías de animales. Se administró 20 \mul del suero de control (no inmunógeno) o del suero de animales inmunizados en 100 \muL de PBS a crías de ratones 24 horas antes de la inoculación con serotipo 6B (10xBD_{100}). 24 horas después de la inoculación, el 30% de los animales del grupo de protección Sf9 había muerto. 48 horas después de la inoculación, había muerto el 80% del grupo de suero de control, el 60% del grupo Sf9 y el 30% del grupo H5. El décimo día después de la inoculación, había muerto el 100% del grupo Sf9 y del grupo de control, y sólo el 40% del grupo H5.

También se investigó la capacidad de PsaA lipidada recombinante de conferir protección activa. Se inmunizaron ratones adultos y crías, con y sin adyuvante (alumbre), usando PsaAs recombinantes expresadas bien por Sf9 o por H5. A todas las crías de ratón a las que se administró antígeno PsaA expresado por Sf9 (sin o con alumbre) murieron durante las 24 horas posteriores a la inmunización (tal vez debido a la toxicidad de TritonX-114), mientras que todos los adultos (inmunizados con PsaA expresado por Sf9) sobrevivieron.

El día 14 se estimuló a todos los animales sólo con inmunógeno. El día 21 se analizó la respuesta de anticuerpos en todos los animales mediante análisis por transferencia de puntos usando PsaAs recombinantes y nativas y todos los resultados fueron positivos para el anticuerpo. El mismo día, se les inoculó cepa de tipo 6B (700CFU). 24 y 48 horas después, todos los animales seguían vivos. El 80% de los animales de control era bacteriémico el 2º día, mientras que sólo el 20% de las crías (inmunizadas con H5-rPsaA) era bacteriémica. No se obtuvieron datos concluyentes de los datos de los adultos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Ades, Edwin W. Carlone, George M. De, Barun K. Huebner, Robert C. Sampson, Jacque- {}\hskip2.4cm line S.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína PsaA lipidada recombinante, procedimientos de preparación y {}\hskip4.7cm utilización

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Connaught Laboratories, Inc.

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(B)

CALLE: Route 611, P.O. Box 187

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(C)

CIUDAD: Swiftwater

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(D)

ESTADO: PA

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 18370

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(v)

FORMULARIO DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:

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(A)

NOMBRE: Howe, Timothy R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 39,228

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE ETIQUETA/REFERENCIA: TH-005

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(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

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(A)

TELÉFONO: 717-839-5027

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 717-839-0619

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID N.º 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 26 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: única

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCATGCGC TAGCGGAAAA AAAGAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 26 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: única

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGATCCTT ATTTTGCCAA TCCTTC

\hfill

26

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 921 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3

1

Claims (22)

1. Molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína distinta a PsaA y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína madura PsaA, o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico.

2. Molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia señal es la secuencia señal de una proteína OspA de una especie de Borrelia.

3. Molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están acopladas en una relación de traducción de marco de lectura abierto.

4. Vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico según la reivindicación 1 unida funcionalmente a un promotor para la expresión de la proteína madura PsaA.

5. Procedimiento de preparación de la proteína PsaA lipidada recombinante, cuyo procedimiento comprende: introducir el vector de expresión según la reivindicación 4 en un organismo huésped; y efectuar la expresión de la proteína PsaA madura desde el organismo huésped.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el organismo huésped es E. coli.

7. Procedimiento para la producción de proteína PsaA lipidada recombinante, cuyo procedimiento comprende: construir una molécula híbrida de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia señal de una lipoproteína de Borrelia y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína PsaA madura, o un fragmento inmunogénico de la misma, siendo la secuencia señal de la lipoproteína de Borrelia contigua a la segunda secuencia de ácido nucleico; formar un vector de expresión que contiene la molécula híbrida de ácido nucleico unida funcionalmente a un promotor para la expresión de la proteína madura; introducir el vector de expresión en un organismo huésped; provocar la expresión de la proteína PsaA lipidada recombinante por el organismo huésped; lisar las células del organismo huésped; tratar las células lisadas con un agente tensoactivo que solubiliza de forma selectiva la lipoproteína recombinante antes que proteínas bacterianas u otras proteínas y que es capaz de lograr la separación de fase de una fase de detergente en condiciones suaves; provocar la separación de fase en una fase de detergente que contiene proteína PsaA lipidada recombinante solubilizada, una fase acuosa que contiene proteínas bacterianas y otras proteínas y una fase sólida que contiene residuo celular; separar y recuperar la fase de detergente de la fase sólida y la fase acuosa; poner en contacto la fase de detergente con una primera columna cromatográfica en condiciones que conducen a la unión de una proteína diferente a la proteína PsaA lipidada recombinante a la columna para proporcionar una proteína PsaA lipidada que contiene corriente paralela de la primera columna cromatográfica y recuperar la corriente paralela de la primera columna cromatográfica; poner en contacto la corriente paralela de la primera columna cromatográfica con una segunda columna cromatográfica en condiciones que conducen a la unión de la proteína PsaA lipidada recombinante con preferencia a proteínas contaminantes y lipopolisacáridos que fluyen a través de la segunda columna cromatográfica; eluir la proteína PsaA lipidada recombinante de la segunda columna cromatográfica para proporcionar un eluyente sustancialmente libre de lipopolisacáridos y proteínas contaminantes; y recuperar el eluyente.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el agente tensoactivo es TRITON^{TM} X-114.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el tratamiento de células lisadas se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y aproximadamente 10ºC, la mezcla resultante es tratada a una temperatura ligeramente elevada comprendida entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 40ºC para lograr la separación de la fase de detergente, y la fase de detergente se separa de la fase acuosa mediante centrifugación.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la primera columna cromatográfica es una columna de intercambio de iones.

11. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la lisis de las células huésped se lleva a cabo mediante congelación-descongelación.

12. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la lisis de las células huésped se lleva a cabo mediante sonicación.

13. Proteína PsaA lipidada recombinante codificada por la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. Composición inmunológica que comprende la proteína PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13.

15. Composición inmunológica según la reivindicación 14, que comprende además un adyuvante.

16. Composición inmunológica según la reivindicación 15, en la que el adyuvante es alumbre.

17. Utilización de la PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13 para la preparación de una composición inmunológica destinada al tratamiento o a la prevención de una enfermedad neumocócica.

18. Utilización de la PsaA lipidada recombinante según la reivindicación 13 para la preparación de una composición inmunológica destinada a inmunizar un huésped contra una infección neumocócica.

19. Utilización según la reivindicación 18, en la que dicha composición inmunológica se administra intranasalmente.

20. Composición inmunogénica para la administración intranasal a un huésped susceptible de ser portador neumocócico para provocar una respuesta inmunológica de protección contra la colonización con Streptococcus pneumoniae en la nasofaringe, que comprende una cantidad de inmunización de PsaA lipidada recombinante, o un fragmento inmunogénico de la misma.

21. Composición según la reivindicación 20 que comprende además un adyuvante.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que el adyuvante es alumbre.