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VACUNAS MUCOSALES EN COMBINACION PARA LA MENINGITIS
BACTERIANA
CAMPO DE LA INVENCION Esta solicitud se refiere a las vacunas mucosales para la meningitis, especialmente vacunas intranasales .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La meningitis es la inflamación de los tejidos que cubren el cerebro y la médula espinal. Esta puede tener una causa bacteriana o una causa viral, con la meningitis bacteriana que es en general la más seria. El patógeno principal responsable de la meningitis bacteriana es la Neisseria meningitidis (meníngococos) , pero otros patógenos relevantes incluyen Stjreptococcus pneumoniae (pneumococos) , Haemophilus influenzae (Hib) , y Streptococcus agalactiae (GBS) . N. meningitidis también provoca septicemia meningocócica, la cual es el principal aspecto de infección que amenaza la vida. Las vacunas para proteger contra la infección con
Hib han estado disponibles por muchos años. Una vacuna que protege contra meníngococos del serogrupo C (*MenC) fue introducida en varios países Europeos en 1999-2000. Una vacuna neumocócica fue introducida en uso rutinario en América en el año 2000.
Ref . : 160169 2
Las vacunas contra estos tres patógenos están basadas en polisacáridos capsulares antigénicos, con la conjugación a proteínas portadoras que se utiliza para mejorar la inmunogenicidad de los polisacáridos. Estas vacunas son administradas mediante inyección, aunque las investigaciones dentro de la administración mucosal han sido descritas para ratones, por ejemplo la referencia 1 describe la administración intranasal de las vacunas conjugadas de Hib y la referencia 2 describe la administración intranasal de las vacunas conjugadas de MenC (ver también ref . 3) . La administración mucosal de las vacunas representa un procedimiento atractivo para superar el problema del alto número de inyecciones administradas a niños pequeños. Además, ya que la mayoría de los patógenos inicialmente infecta en las superficies mucosales, la inducción de la inmunidad mucosal en el sitio de infección podría de igual modo contribuir a la inmunidad protectora óptima. Ha sido también descrita la administración intranasal y orofaríngea de las vacunas basadas en vesículas, contra meningococos de los serogrupos B ('MenB') [por ejemplo ref. 4], como lo ha sido la administración intranasal de las bacterias B. pertussis que expresan la proteína B de enlace a la transferrina de N. meningitidis [5] . La referencia 6 describe la administración intranasal de las vacunas conjugadas para neumococos [ver también refs . 7 y 8] .
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Un objetivo de la invención es proporcionar los mejoramientos en la administración mucosal de las vacunas contra la meningitis. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención proporciona una composición para la administración mucosal, que comprende dos o más de lo siguiente: (a) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Haemophilus influenzae; (b) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis; y (c) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Streptococcus pneumoniae . La combinación de los diferentes antígenos reduce el número de diferentes dosis que necesitan ser administradas con el fin de inmunizar contra patógenos múltiples. Esto es típicamente observado como una ventaja para las vacunas inyectables, donde se reduce el número de inyecciones dolorosas, pero es menos importante en vacunas mucosales (por ejemplo vacunas intranasales) debido a los menores niveles de incomodidad asociados con la administración. No obstante, las composiciones de antígenos combinados son ventajosas incluso para la administración mucosal debido a que se mejora el cumplimiento del paciente, y el transporte/almacenamiento de las medicinas es facilitado. Aunque la combinación de antígenos en una dosis simple es atractiva [por ejemplo refs. 9 a 12], ésta presenta 4
dificultades debido a las interacciones entre los diversos componentes una vez combinados, particularmente en formulaciones líquidas [13] . Los problemas que surgen incluyen interferencia de antígeno, competencia de antígeno [14, 15] , degradación de antígeno, supresión de epitopo y compatibilidad de adyuvante. El control de calidad de las mezclas es también más difícil. Además, el conocimiento existente sobre la combinación de antígenos se enfoca a las vacunas inyectables, no mucosales. A pesar de estas dificultades, los inventores han encontrado sorprendentemente que los antígenos de Haemophilus influenzae, Neisseria meningi idis y/o Streptococcus pneumoniae pueden ser combinados para la administración mucosal sin las consecuencias negativas que podrían haber sido esperadas. La combinación de los antígenos a partir de estos tres organismos es también ventajosa debido a que ésta permite que una dosis simple trate tres causas separadas de una enfermedad común, a saber la meningitis bacteriana. Las vacunas combinadas para la meningitis, de este tipo, han sido previamente reportadas [16] , pero no se reportó la administración mucosal. Administración mucosal La composición de la invención es para la administración mucosal . De las diversas opciones de administración mucosal disponibles, la ruta intranasal es la más práctica ya que 5
ésta ofrece fácil acceso con dispositivos relativamente simples que han sido ya producidos en masa. Además, la inmunización intranasal parece ser más potente que las rutas alternativas. De este modo, la ruta preferida para la administración mucosal es la ruta intranasal, y la composición de la invención es preferentemente adaptada para la administración intranasal, tal como mediante rocío nasal, gotas nasales, gel o polvo [por ejemplo refs. 17 y 18] . Las rutas alternativas para la administración mucosal son las rutas oral, intragástrica, pulmonar, intestinal, rectal, ocular y vaginal. (a) Antígeno de Haemophilus influenzae El antígeno de H. influenzae en la composición será típicamente un antígeno sacárido capsular. Los antígenos sacáridos de H. influenzae b son bien conocidos. Ventajosamente, el sacárido Hib es covalentemente enlazado a una proteína portadora, con el fin de mejorar su inmunogenicidad, especialmente en niños. Está bien documentada la preparación de los conjugados de polisacárido en general, y en particular del polisacárido capsular de Hib [por ejemplo referencias 19 a 27, etc.] . La invención puede utilizar cualquier conjugado de Hib adecuado. La porción sacárida del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo, el fosfato de polirribosilrribitol de longitud completa (PRP) ) , pero se prefiere hidrolizar 6
polisacáridos (por ejemplo mediante hidrólisis ácida) para formar los oligosacáridos (por ejemplo, peso molecular de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 kDa) . Si la hidrólisis es realizada, el hidrolizado puede ser clasificado por tamaño con el fin de eliminar los oligosacáridos que son demasiado cortos para ser útilmente inmunogénicos . Los oligosacáridos separados por tamaño son antígenos sacáridos preferidos . Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoides de la difteria o del tétanos. Estos son comúnmente utilizados en vacunas conjugadas. El toxoide diftérico CR 197 es particularmente preferido [28] . Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana exterior de N. meningitidis [29], péptidos sintéticos [30, 31], proteínas de choque térmico [32, 33], proteínas de pertussis [34, 35], proteína D de H. influenzae [36] , citocinas [37] , linfocinas [37] , hormonas [37] , factores del crecimiento [37] , toxina A o B de C. difficile [38] , proteínas de captación de hierro [39], etc. Es posible utilizar mezclas de proteínas portadoras. La porción sacárida puede ser conjugada a la proteína portadora directamente o vía un enlazador. El enlace directo puede ser logrado mediante la oxidación del polisacárido, seguido por la aminación reductiva con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las refs. 40 y 7
41. El enlace vía un grupo enlazador puede ser realizado utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las refs. 42 y 43. Los enlazadores adecuados incluyen carbonilo, ácido adípico, B-propionamido [44] , nitrofenil -etilamina [45] , haluros de haloacilo [46] , enlaces glucosídicos [47] , ácido 6-aminocaproico [48] , ADH [49] , porciones de 4 a 12 átomos de carbono [50], etc. El sacárido será típicamente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridinio) [51, 52] . Otras técnicas adecuadas utilizan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico , N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia 53) . La aminación reductiva es una técnica preferida. Un conjugado preferido comprende el sacárido de Hib covalentemente enlazado a CRM197 vía el diéster succínico del ácido adípico [54, 55] . Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno de Hib. (b) Antígeno de Neisseria meningitidis El antígeno de N. meningitidis en la composición será típicamente un antígeno sacárido capsular (por ejemplo 8
de los serogrupos A, C, 135 o Y. Los antígenos sacáridos de N. meningitidis son bien conocidos. Donde el antígeno es del serogrupo B, no obstante, se prefiere que el antígeno sea un antígeno proteico. Esto es debido a que el polisacárido capsular nativo de MenB contiene autoantígenos . Si un antígeno sacárido va a ser utilizado del serogrupo B, se prefiere utilizar un antígeno sacárido modificado [por ejemplo refs. 56, 57, 58] por ejemplo uno modificado por N-propionilación . Es también posible la modificación química de los sacáridos de otros serogrupos. El sacárido es preferentemente un oligosacárido , por ejemplo un fragmento de un polisacárido capsular. Los pol isacáridos pueden ser manipulados para dar oligosacáridos más cortos y éstos pueden ser obtenidos mediante purificación y/o separación por tamaño del polisacárido nativo (por ejemplo mediante hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, mediante cromatografía de exclusión de tamaño, etc.). Los oligosacáridos MenC preferidos son descritos en las referencias 59 y 60. El sacárido es preferentemente conjugado a una proteína portadora como se describió anteriormente. Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno meningocócico. Puede ser preferido el incluir antígenos sacáridos capsulares de al menos dos (por ejemplo 2, 3 ó 4) de los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis [61] .
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Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares de los serogrupos A y C, se prefiere que la proporción (p/p) del sacárido MenA : sacárido MenC sea mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Sorprendentemente, la inmunogenicidad mejorada del componente MenA ha sido observada cuando éste está presente en exceso (masa/dosis) al componente MenC [61] . Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo W135 y al menos uno de los serogrupos A, C e Y, se ha encontrado sorprendentemente que la inmunogenicidad del sacárido MenW135 es mayor cuando se administra en combinación con el o los sacáridos provenientes de los otros serogrupos que cuando se administra solo (a la misma dosis etc.) [61] . De este modo, la capacidad del antígeno MenW135 para promover una respuesta inmune es mayor que la respuesta inmune promovida por una cantidad equivalente del mismo antígeno, cuando se administra sin asociación con los antígenos provenientes de los otros serogrupos. Tal inmunogenicidad aumentada puede ser determinada mediante la administración del antígeno Men 135 a los animales control, y la mezcla a los animales de prueba, y comparando los títulos de anticuerpo contra los dos, utilizando ensayos estándares tales como los títulos bacterianos, radioinmunoensayo y ELISA, etc. Las vacunas que comprenden combinaciones sinérgicas de sacáridos del serogrupo 135 y otros 10
serogrupos, son inmunológicamente ventajosas ya que éstas permiten respuestas anti-W135 mejoradas, y/o menores dosis de W135. Donde un antígeno proteico del serogrupo B es utilizado, se prefiere utilizar una de las proteínas descritas en las referencias 62 a 71. Los antígenos proteicos preferidos comprenden la proteína ?287' o derivados (por ejemplo AG287) . Es también posible utilizar un antígeno de la vesícula de membrana exterior (OMV) para el serogrupo B [por ejemplo 72, 73] . Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno meningocócico . (c) Antígeno de Streptococcus pneumoniae El antígeno de s. pneumoniae en la composición será típicamente un antígeno sacárido capsular el cual es preferentemente conjugado a una proteína portadora como se describió anteriormente [por ejemplo 74, 75, 76] . Se prefiere incluir sacáridos de más de un serotipo de S. pneumoniae . Por ejemplo, son ampliamente utilizadas mezclas de polisacáridos de 23 diferentes serotipos, como lo son las vacunas conjugadas con los polisacáridos de entre 5 y 11 diferentes serotipos [77] . Por ejemplo, PrevNarMR contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido individualmente conjugado a CRM197 mediante aminación reductiva.
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Las composiciones de la invención pueden de este modo comprender más de un antígeno neumocócico. Componentes-adyuvantes adicionales Las composiciones de la invención comprenderán usualmente un adyuvante mucosal . Los adyuvantes mucosales incluyen, pero no están limitados a, (A) enterotoxina lábil al calor de E. coli ( "LT" ) , o mutantes destoxificados de la misma, tales como los mutantes K63 o R72 [por ejemplo Capítulo 5 de la ref . 78] ; (B) toxina del cólera ( "CT" ) , o mutantes destoxificados de la misma [por ejemplo Capítulo 5 de la ref. 78] ; o (C) micropartículas (por ejemplo una partícula de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 µt? de diámetro, más preferentemente aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 µt? de diámetro, y lo más preferentemente aproximadamente 500nm a aproximadamente 10 µt? de diámetro) formados a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (a-hidroxiácido) , un ácido polihidroxibutírico , un poliortoéster , un polianhídrido, una policaprolactona, etc.) ; (D) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [79] ; (E) un surfactante de éster de polioxietilensorbitan en combinación con un octoxinol [80] o un surfactante de éster o éter alquílico de polioxietileno, en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol [81] ; (F) quitosano [por 12
ejemplo 82] ; (G) un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo un oligonucleótido CpG) , (H) AR de doble hebra; (I) una saponina [83] ; (J) miméticos del monofosforí1 -lípido A, tales como los derivados de fosfato de aminoalquilglucosaminida por ejemplo RC-529 [84] ; o (K) polifosfazeno (PCPP) . Otros adyuvantes mucosales son también disponibles [por ejemplo ver Capítulo 7 de la ref. 85] . Los adyuvantes mucosales preferidos son toxinas bacterianas de ribosilación de ADP o sus mutantes. Por ejemplo, la toxina del cólera (CT) o la toxina lábil al calor de E. coli (LT) son potentes adyuvantes mucosales, como lo son sus contrapartes destoxificadas [86] . CT y LT son homólogos y son típicamente intercambiables. La destoxificación de CT o LT puede ser mediante medios químicos o, preferentemente, por medios genéticos. Los ejemplos adecuados incluyen LT que tiene un residuo de lisina en el aminoácido 63 [ x LT-K63 ' -ref . 87], y LT que tiene un residuo de arginina en el aminoácido 72 [ * LT-R72 ' -ref . 88] . Otros mutantes adecuados incluyen LT con una tirosina en el residuo 63 [lY63'-ref. 89] y los diversos mutantes descritos en la referencia 90, a saber D53, K97, K104 y S106, así como combinaciones de los mismos (por ejemplo LT con una mutación D53 y una mutación L63) . La composición puede comprender un bioadhesivo [91, 92] tales como microesferas de ácido hialurónico esterificado 13
[93] o, en modalidades preferidas, un mucoadhesivo seleccionado del grupo que consiste de derivados reticulados de poli (ácido acrílico) , alcohol poliviní lico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa . Las composiciones de la invención pueden comprender más de un adyuvante mucosal . Componentes -antígenos adicionales La combinación de antígenos de H. influenzae, N. meningitidis y S. pneumoniae es ventajosa debido a que todos ellos provocan meningitis bacteriana. Los antígenos que inducen respuestas inmunes contra organismos adicionales pueden también ser incluidos en las composiciones de la invención, por ejemplo. antígenos de Helicobacter pylori tales como CagA [94 a 97], VacA [98, 99], NAP [100, 101, 102] , HopX [por ejemplo 103], HopY (por ejemplo 103] y/o ureasa. un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 104, 105] . un antígeno del virus de la hepatitis B, tales como los antígenos de la superficie y/o del núcleo [por ejemplo 105, 106] . un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo 107] . un antígeno de Bordetella pertussis , tal como la holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, refs. 108 y 109]. un antígeno de la difteria, tal como el toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la ref . 117] por ejemplo el mutante CRM197 [por ejemplo 83] . un antígeno tetánico, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo capítulo 4 de la ref. 114] . un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo 62 a 65] . un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo refs.
110, 111, 112, 113, 114, 115, 116] . un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo 117] . un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo 118] . antígeno (s) de la polio [por ejemplo 119, 120] tal como IPV u OPV. antígeno (s) de la rabia [por ejemplo 121] tal como el virus inactivado liofilizado [por ejemplo 122, RabAvertMR] . antígenos del sarampión, las paperas y/o la rubéola [por ejemplo capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 123] . antigeno (s) de la influenza [por ejemplo capítulo 19 de la ref. 123], tales como las proteínas superficiales hemaglutinina y/o neuraminidasa . antígeno (s) proveniente de un paramyxovirus tal como 15
virus sincitial respiratorio (RSV [124, 125]) y/o virus de la parainfluenza (PIV3 [126] ) . un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo 127] . un antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococos grupo B) [por ejemplo 128, 129] . un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococos grupo A) [por ejemplo 129, 130, 131] . un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo 132] .
La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Donde está presente un conjugado, la composición puede comprender la proteína portadora libre [133] . Se prefiere que la composición no incluya bacterias completas (ya sea intactas o lizadas) . Las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan a los antígenos sacáridos por ejemplo mimótopos [134] o anticuerpos anti-idiotipo . Estos pueden reemplazar los componentes de sacarina individuales, o pueden suplementarios. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un mimético peptídico del polisacárido MenC [135] o MenA [136] en lugar del sacárido mismo. Las composiciones de la invención pueden comprender ácido nucleico para la 'inmunización genética' [por ejemplo 137] . El ácido nucleico codificará para un componente 16
proteico de la composición y puede reemplazar a los componentes proteicos individuales (incluyendo aquellos del párrafo previo), o puede suplementarios. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender ADN que codifica para una toxina tetánica. Componentes-formulación adicional La composición de la invención incluye preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable. Los 'portadores farmacéuticamente aceptables' incluyen cualquier portador que por sí mismo no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, trehalosa [138] , agregados lipidíeos (tales como gotitas de aceite o liposomas) , y partículas virales inactivas. Tales portadores son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Las vacunas pueden también contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente , las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes , sustancias amortiguadoras del pH, y similares, pueden estar también presentes. El portador será compatible con la administración mucosal . Una discusión más completa de los 17
excipientes farmacéuticamente aceptables, está disponible en Remington' s Pharmaceutical Sciences . La composición de la invención es preferentemente estéril . La composición de la invención es preferentemente amortiguada. La composición de la invención es preferentemente libre de pirógenos. La composición de la invención puede ser envasada con sus componentes (a), (b) y/o (c) en mezcla, o estos componentes pueden permanecer separados hasta que éstos sean administrados a un paciente, etapa en la cual éstos serán combinados. Donde están separados, los componentes individuales pueden cada uno estar en la forma liofilizada o en solución/suspensión. Donde se mezclan, los componentes estarán todos en la forma liofilizada, o todos en solución/suspensión. Los componentes liofilizados serán re-suspendidos (por ejemplo en amortiguador) antes de la administración a un paciente. Los componentes tales como adyuvantes pueden estar presentes en el amortiguador o en el material liofilizado. Composiciones inmunogénicas La composición de la invención es preferentemente una composición inmunogénica (por ejemplo una vacuna) . La formulación de las vacunas basadas en sacaridos o en conjugados de sacárido-proteína es bien conocida en la técnica.
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Las composiciones inmunogénicas comprenden cantidades inmunológicamente efectivas de antígenos, así como cualquier otro de los componentes especificados, como sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente efectiva' , se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y de la condición física del individuo que va a ser tratado, de la edad, del grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo el primate no humano, primate, etc.) la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado deseado de protección, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del médico que atiende, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias. Métodos de tratamiento Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente a un paciente, que será en general un humano. El humano es preferentemente un niño o un adolescente. Una clase preferida adicional de paciente es una mujer adulta en particular una mujer de edad reproductiva o una mujer embarazada. Las composiciones de la invención son 19
particularmente adecuadas para la inmunización pasiva de niños, vía la ruta materna. Los antígenos en la composición inducen respuestas inmunes contra ciertas bacterias. Estas respuestas inmunes son preferentemente protectoras, por ejemplo, éstas protegen al paciente de la infección posterior por las bacterias. De este modo, las composiciones de la invención son preferentemente utilizadas para la profilaxis (por ejemplo para prevenir la infección) , aunque éstas pueden también ser utilizadas para fines terapéuticos (por ejemplo para tratar la enfermedad después de la infección) . Las respuestas inmunes preferentemente involucran la producción de anticuerpos bactericidas en el paciente. La invención proporciona un método para producir una respuesta inmune en un paciente, que comprende administrarle a un paciente una vacuna de acuerdo a la invención vía una ruta mucosal (por ejemplo intranasalmente). La respuesta inmune es preferentemente protectora contra meningitis bacteriana y/o bacteremia provocadas por Ha.emoph.ilus influenzae, Neisseria meningitidis. y/o Streptococcus pneu oniae. Los componentes antigénicos individuales de las composiciones son preferentemente administrados simultáneamente y en combinación. En otras modalidades, no obstante, éstos pueden ser administrados simultáneamente, o bien simultánea o secuencialmente . Cuando 20
éstos son administrados separadamente, los componentes son preferentemente distribuidos a la misma superficie mucosal . La invención también proporciona una composición para el uso como un medicamento. La invención también proporciona: el uso de (a) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Haemophilus influenzae; (b) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis; y (c) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Streptococcus pneumoníae, en la fabricación de un medicamento para inmunizar un paciente. Estos métodos y usos de la invención pueden involucrar el régimen de aprestamiento/refuerzo . Los métodos y usos de la invención pueden ser una dosis de aprestamiento que será seguida por una dosis de refuerzo, donde la dosis de refuerzo puede ser mediante una ruta mucosal o parenteral. Similarmente, los métodos y usos de la invención pueden producir una respuesta de refuerzo en un paciente que ha sido ya inmunológicamente aprestado, donde la dosis de aprestamiento puede haber sido mediante una ruta mucosal o parenteral. Las dosis de refuerzo pueden comprender menos antígenos que las dosis de aprestamiento, por ejemplo éstas pueden utilizar un antígeno simple. El tratamiento de dosificación en el aprestamiento y/o en el refuerzo puede ser una dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Las composiciones de la invención pueden ser presentadas en forma de dosis unitaria.
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Métodos de fabricación La invención proporciona un método para producir una composición de la invención, que comprende los pasos de mezclar dos o más de los siguientes: (a) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Haemophilus influenzae; (b) un antígeno que induce una respuesta inmune contra Neisseria meningitidis; y (c) un antígenos que induce una respuesta inmune contra Streptococcus pneumonia , y formulando la mezcla para la administración mucosal. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1B muestran los títulos de anticuerpo IgG en suero, como la media geométrica, contra MenC. La etiqueta sobre el eje X muestra el adyuvante que se utilizó. La columna plana a mano izquierda en cada par muestra los datos obtenidos después de la administración del antígeno sacárido por sí solo, mientras que la columna sombreada a mano derecha muestra los datos obtenidos después de la administración de los antígenos sacáridos combinados. La Figura 1A muestra las respuestas anti-MenC y la Figura IB muestra las respuestas anti-Hib. Las barras de error son desviaciones estándares dentro de un error estándar. La Figura 2 muestra los títulos de anticuerpo bactericida contra MenC. Como en la Figura 1, los datos sombreados fueron obtenidos utilizando antígenos sacáridos combinados.
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La Figura 3 muestra los títulos de IgA anti-MenC provenientes de lavado nasal. Como se describió anteriormente, los datos sombreados fueron obtenidos utilizando antígenos sacáridos combinados . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Composición Hib/MenC combinada Fue producido oligosacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C, mediante activación selectiva de grupo reductor final del oligosacárido clasificado por tamaño. Se utilizó el mismo método para Haemophilus influenzae tipo B. Los sacáridos fueron conjugados a la proteína portadora CRM197 a través de un espaciador hidrocarburo [139] (Chiron Siena, Italia) . Los conjugados fueron diluidos en solución salina amortiguada con fosfato (PBS9 y combinados con (i) enterotoxina lábil al calor LTK63 o LTR72 de E. coli mutante, (ii) hidróxido de aluminio (Superfos Biosector a/s) o (iii) toxina del cólera (CT) de Sigma. Para la administración combinada, estas formulaciones fueron mezcladas antes del uso. Adminis ración mucosal de la composición Se realizaron dos estudios de administración idénticos simultáneamente. Grupos de 10 ratones hembra BALB/C de 6 a 10 semanas de edad fueron inmunizados intranasalmente con 10 µg de MenC o Hib solos, combinados con 23
CT (1 o con los mutantes LT (1 µ9 y 10 . Para comparación, un grupo adicional de ratones fue inmunizado IM con 10 µ9 de MenC o Hib adsorbido al alumbre. Las composiciones fueron preparadas en el mismo día que la inmunización, y los ratones fueron inmunizados en los días 0, 21 y 35. 50 µ? de las composiciones fueron inyectadas en el muslo o instiladas hacia las fosas nasales alternadas en ratones no anestesiados. Se tomaron muestras de sangre en el día 49 junto con muestras de lavado nasal terminal (NW) . Para evaluar si la inmunogenicidad de los conjugados fue deteriorada cuando los dos fueron mezclados, se realizó un tercer estudio concurrentemente en el cual las dos vacunas fueron administradas simultáneamente a los mismos grupos de ratones, a las mismas dosis y régimen anteriormente descrito. Respuestas inmunologicas a las composiciones Respuestas anticuerpo contra el conjugado MenC fueron medidas mediante ELISA utilizando un procedimiento modificado como se describió previamente [140] . En resumen, las placas de ELISA fueron recubiertas con el sacárido MenC derivatizado con dihidrazida adipídica toda la noche a 4°C. Los anticuerpos específicos fueron desarrollados con conjugado de IgG de cabra-peroxidasa de rábano, anti -ratón. Los títulos de anticuerpo IgG de MenC para las muestras de prueba y el control interno fueron expresados como el 24
recíproco de la dilución en suero que da DO = 1.0. Cada muestra en suero fue evaluada por duplicado, y el valor promedio se utilizó para calcular la media geométrica y la desviación estándar dentro de un error estándar. Las respuestas de anticuerpo contra PRP de Hib fueron determinadas similarmente a la ELISA de MenC, excepto que las placas fueron recubiertas con PRP conjugada con BSA (PRP-BSA) . Los títulos fueron expresados como D045onm para el suero diluido 1:50. Los lavados nasales fueron evaluados para IgA anti- MenC utilizando un ensayo bioluminiscente (BIA) [141] . En resumen, se utilizaron reactivos y procedimientos de recubrimiento idénticos, para medir la IgG en suero contra MenC. Luego, se agregó una IgA de cabra anti-ratón, biotinilada, específica, como un primer anticuerpo. Los títulos representan los valores de la dilución logarítmica, extrapolados a partir de los datos de log RLU al valor de corte calculado al menos dos desviaciones estándares por arriba del antecedente medio. La actividad bactericida mediada por el complemento contra las bacterias de MenC fue medida en muestras de suero combinadas como se describió previamente [140] . Los títulos fueron determinados mediante el cálculo de la dilución en suero que muestra una reducción de 50% en el número de CFU después de 1 hora de incubación.
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La Figura 1A muestra los títulos de anticuerpo IgG en suero, como la media geométrica, contra MenC, ya sea solo (columnas planas) o en combinación con el antígeno Hib (columnas sombreadas) . Las respuestas de anticuerpo en suero promovidas por ambos mutantes LT fueron significativamente mayores que aquellas obtenidas con el antígeno solo. LTR72 mostró una capacidad adyuvante mayor que LTK63 a dosis menores. De manera más notable, las respuestas de anticuerpo inducidas por la inmunización intranasal con ambos mutantes de LT, fueron comparables a aquellas logradas con CT de tipo silvestre, o aquellas inducidas por la inmunización intramuscular con vacuna adyuvada con alumbre . De manera importante, la adición de un segundo antígeno sacárido conjugado no afectó de manera adversa las respuestas de anticuerpo a cualquier antígeno. La Figura IB muestra los títulos de anticuerpo IgG en suero, como la media geométrica, contra el sacárido PRP de Hib. Como para MenC, las respuestas de anticuerpo inducidas por el mutante de LT fueron mayores que aquellas logradas con el antígeno solo. Nuevamente, LTR72 mostró una mejor capacidad adyuvante. Los títulos comparables fueron inducidos en ratones inmunizados intranasalmente con mutantes de LT y por la vacuna adyuvada con alumbre, mediante inmunización intramuscular. Además, no existió evidencia de competencia después de la inmunización intranasal combinada 26
con las dos vacunas conjugadas de sacárído, con las respuestas inducidas contra Hib cuando están en combinación con MenC, que es comparable a las respuestas inducidas por la inmunización con Hib solo. Los niveles de anticuerpos bactericidas inducidos por la inmunización intranasal con mutantes de LT correlacionan estrechamente con las respuestas de IgG en suero por ELISA, y fueron nuevamente comparables a las respuestas inducidas por CT, o la inmunización intramuscular con vacuna adsorbida en alumbre (Figura 2) . Las muestras obtenidas del lavado nasal después de la inmunización intranasal con MenC ya sea con cualquier mutante de LT, mostraron títulos de IgA mayores que aquellos obtenidos por la inmunización intranasal en ausencia de adyuvantes (Figura 3) . Como se esperaba, la inmunización intramuscular produjo títulos de IgA muy bajos. Conclusión Pueden ser inducidas respuestas potentes de anticuerpo en suero contra N. meningitidis y H. influenzae, mediante la inmunización intranasal con vacunas conjugadas en combinación con adyuvantes mucosales. Además, para el antígeno MenC, los anticuerpos inducidos por la inmunización intranasal tuvieron una potente actividad bactericida, la cual se sabe que correlaciona con la inmunidad protectora [142] . Además, las respuestas de IgA en la cavidad nasal 27
fueron inducidas únicamente en animales inmunizados a través de la ruta intranasal . La inducción de la inmunidad secretora es importante debido a que el tracto respiratorio superior es el portal de entrada para varios patógenos, incluyendo N. meningitidis y H. influenzae. Con base en los títulos de anticuerpo obtenidos con vacunas conjugadas dadas solas y en combinación, y en la actividad bactericida medida contra MenC, la combinación de dos vacunas co-administradas con el adyuvante ucosal, no influyó de manera negativa con las respuestas de anticuerpo contra MenC o Hib. Los resultados sugieren de este modo que la inmunización intranasal es una ruta efectiva de inmunización para las vacunas conjugadas polisacárido-proteína en combinación con adyuvantes mucosales tales como mutantes de LT. La misma dosis de los mutantes de LT fue suficiente para aumentar significativamente la inmunogenicidad de las vacunas conjugadas administradas simultáneamente. Esto es particularmente importante ya que esto podría reducir la cantidad de adyuvante necesario y los riesgos asociados con la toxicidad potencial. De manera importante, la inmunidad pre-existente contra el mutante de LTK63 no afecta la habilidad del mutante para actuar como un adyuvante para un segundo antígeno [2] . Además, la potencia de las vacunas mucosalmente administradas puede ser adicionalmente mejorada 28
mediante la formulación de las vacunas en sistemas de distribución bioadhesivos [91] . En conclusión, la combinación de las vacunas conjugadas de polisacárido-proteína con los mutantes de LT para la inmunización intranasal, es un procedimiento efectivo para la inmunización mucosal para uso pediátrico. Se entenderá que la invención es descrita anteriormente a manera de ejemplo únicamente, y pueden ser realizadas modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención. REFERENCIAS (los contenidos de las cuales son incorporados en la presente en su totalidad) [I] Bergquist et al (1998) AP IS 106:800-806. [2] Ugozzoli et al. (2001) J. Infect . Dis. 183:351-354. [3] Wenzel et al. (1973) J. Infect Dis, 128:31-40. [4] Katial et al. (2002) Infect. Immun. 70:702-707. [5] Coppens et al. (2001) Infect. Immun. 69:5440-5446. [6] Solicitud de patente Internacional O00/53221. [7] Yamamoto et al. (1998) J. Immunol . 161:4115-4121. [8] Wu et al. (1997) J. Infect. Dis. 175:839- [9] Corbel (1994) Biologicals 22:353-360. [10] Rappuoli et al. European Commission COST/STD Initiative, Report of Expert Panel VIII [II] Pichichero (2000) Pediatr Clin North Am 47:407-426. [12] Solicitud de patente Internacional W002/00249.
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